natgillin/translations-raw huggingface dataset:
The incorporation rate for sitosterol is 600 g of at least 90 % pure sitosterol per tonne of concentrated butter, i.e. 540 mg/kg
Miera vstrebávania pre sitosterol je 600 g najmenej 90 % čistého sitosterolu na tonu masla, t. j. 540 mg/kg.
480,9 mg/kg (95 % of the minimum incorporation rate for 90 % pure sitosterol),
480,9 mg/kg (95 % minimálnej miery vstrebávania pre 90 % čistý sitosterol),
345,9 mg/kg (70 % of the minimum incorporation rate for 90 % pure sitosterol).
345,9 mg/kg (70 % minimálnej miery vstrebávania pre 90 % čistý sitosterol).
The tracer concentration in the sample giving the lowest result is used in conjunction with interpolation between 480,9 mg/kg and 345,9 mg/kg.
Koncentrácia značkovacej látky vo vzorke s najnižším výsledkom sa používa v spojení s interpoláciou medzi 480,9 mg/kg a 345,9 mg/kg.
Chromatogram of resolution test mixture
Chromatogram rozlíšenia testovacej zmesi
Complete resolution is preferable, i.e. the peak trace for lanosterol should return to baseline before leaving for the sitosterol peak although incomplete resolution is tolerable.
Uprednostňuje sa úplné rozlíšenie, t. j. pík lanosterolu sa musí vrátiť k základnej línii predtým, ako sa vyznačí pík sitosterolu, neúplné rozlíšenie je však prijateľné tiež.
FID Detector response
reakcia detektora FID
Time (mins)
čas (minúty)
Note: Integration of the stigmasterol peak should include any tailing as defined by points 1, 2 and 3.
Poznámka: Integrácia píkov stigmasterolu by mala obsahovať všetky prípadné „chvosty píku“ (tailings) znázornené v bodoch 1, 2 a 3.
Figure 2a
Obrázok 2a
Figure 2b
Obrázok 2b
Stigmasterol standard
Štandardný roztok stigmasterolu
Butter sample denatured with stigmasterol
Vzorka masla denaturovaná stigmasterolom
FID detector response
reakcia detektoru FID
Betulin (internal standard)
Betulin (interný štandard
(mins)
0čas (minúty)
Note: β-sitosterol often contains an impurity (identified as stigmastanol) which elutes immediately after β-sitosterol.
Poznámka: β-sitosterol často obsahuje nečistotu (určuje sa ako stigmastanol), ktorá sa eluuje bezprostredne po β-sitosterole.
The areas of these two peaks should be summed when evaluating the total β-sitosterol present.
Plochy týchto dvoch píkov by sa pri posúdení zastúpeného β-sitosterolu mali spočítať.
Figure 3a
Obrázok 3a
Figure 3b
Obrázok 3b
Sitosterol standard
Štandardný roztok sitosterolu
Butter sample denatured with β-Sitosterol
Vzorka masla denaturovaná β-sitosterolom
(Article 6)
(Článok 6)
REFERENCE METHOD FOR THE DETECTION OF COWS’ MILK AND CASEINATE IN CHEESES FROM EWES’ MILK, GOATS’ MILK OR BUFFALOS’ MILK OR MIXTURES OF EWES’, GOATS’ AND BUFFALOS’ MILK
REFERENČNÁ METÓDA ZISŤOVANIA KRAVSKÉHO MLIEKA A KAZEINÁTU V SYROCH VYROBENÝCH Z OVČIEHO MLIEKA, KOZIEHO MLIEKA ALEBO BYVOLIEHO MLIEKA, ALEBO ZO ZMESÍ KOZIEHO, OVČIEHO A BYVOLIEHO MLIEKA
Detection of cows’ milk and caseinate in cheeses made from ewes’ milk, goats’ milk, buffalos’ milk or mixtures of ewes’, goats’ and buffalos’ milk by isoelectric focusing of γ-caseins after plasminolysis.
Zisťovanie kravského mlieka a kazeinátu v syroch vyrobených z ovčieho mlieka, kozieho mlieka alebo byvolieho mlieka, alebo zo zmesí kozieho, ovčieho a byvolieho mlieka izoelektrickým zaostrovaním γ-kazeínov po plazminolýze.
The method is suitable for sensitive and specific detection of native and heat-treated cows’ milk and caseinate in fresh and ripened cheeses made from ewes’ milk, goats’ milk, buffalos’ milk or mixtures of ewes’, goats’ and buffalos’ milk.
Metóda je vhodná na citlivé a špecifické zisťovanie prírodného a tepelne upraveného mlieka a kazeinátu v čerstvých a zrejúcich syroch vyrobených z ovčieho mlieka, kozieho mlieka alebo byvolieho mlieka a zo zmesí kozieho, ovčieho a byvolieho mlieka.
It is not suitable for the detection of milk and cheese adulteration by heat-treated bovine whey protein concentrates.
Nie je vhodná na zisťovanie falšovania mlieka a syra koncentrátmi tepelne upravených srvátkových proteínov z kravského mlieka.
PRINCIPLE OF THE METHOD
PRINCÍP METÓDY
Isolation of caseins from cheese and the reference standards
Izolácia kazeínov zo syra a referenčných štandardných vzoriek
Dissolving of the isolated caseins and submitting to plasmin (EC.3.4.21.7) cleavage
Rozpustenie izolovaných kazeínov a vystavenie plazmínovému (EC.3.4.21.7) oddeľovaniu
Isoelectric focusing of plasmin-treated caseins in the presence of urea and staining of proteins
Izoelektrické zaostrovanie plazmínovaných kazeínov za prítomnosti močoviny a farbenie proteínov
Evaluation of stained γ3 and γ2-casein patterns (evidence of cows’ milk) by comparison of the pattern obtained from the sample with those obtained in the same gel from the reference standards containing 0 % and 1 % cows’ milk.
Hodnotenie zafarbených γ3 a γ2-kazeínových vzorov (dôkaz prítomnosti kravského mlieka) porovnaním vzoru získaného zo vzorky s vzormi získanými z rovnakého gélu z referenčných štandardných roztokov obsahujúcich 0 % a 1 % kravského mlieka
Unless otherwise indicated, analytical grade chemicals must be used.
Ak nie je uvedené inak, musia sa použiť chemikálie analytickej kvality.
Water must be double-distilled or of equivalent purity.
Voda musí byť dvojnásobne destilovaná alebo ekvivalentnej čistoty.
Note: The following details apply to laboratory prepared polyacrylamide gels containing urea, of dimensions 265 × 125 × 0,25 mm. Where other sizes and types of gel are used, the separation conditions may have to be adjusted.
Poznámka: Tieto údaje sa vzťahujú na laboratórne vyrobené polyakrylamidové gély obsahujúce močovinu z rozmermi 265 × 125 × 0,25 mm. Ak sa použije iná veľkosť a typ gélov, môže byť potrebná úprava podmienok separácie.
Isoelectric focusing
Izoelektrické zaostrovanie
Reagents for production of the urea containing polyacrylamide gels
Reagenty pre výrobu polyakrylamidových gélov obsahujúcich močovinu
Stock gel solution
Zásobný gélový roztok
Dissolve:
Rozpusťte:
4,85 g acrylamide
4,85 g akrylamidu
0,15 g N, N'-methylene-bis-acrylamide (BIS)
0,15 g N, N'-metyléndiakrylamidu
48,05 g urea
48,05 g močoviny
15,00 g glycerol (87 % w/w),
15 g glycerolu (87 % w/w)
in water and make up to 100 ml and store in a brown glass bottle in the refrigerator.
vo vode, doplňte vodou do 100 ml a uskladnite vo fľaši z hnedého skla v chladničke.
Note: A commercially available preblended acrylamide/BIS solution can be used in preference to the quoted fixed weights of the neurotoxic acrylamides.
Poznámka: Namiesto uvedených pevne stanovených hmotností neurotoxických akrylamidov možno použiť predmiešaný roztok akrylamidu/BIS dostupný v predaji.
Where such a solution contains 30 % w/v acrylamide and 0,8 % w/v BIS, a volume of 16,2 ml must be used for the formulation instead of the fixed weights.
Ak takýto roztok obsahuje 30 % w/v akrylamidu a 0,8 % w/v BIS, namiesto uvedených presne stanovených hmotností sa na vytvorenie roztoku musí použiť 16,2 ml.
The shelf life of the stock solution is a maximum of 10 days; if its conductivity is more than 5 μS, de-ionize by stirring with 2 g Amberlite MB-3 for 30 minutes, then filter through a 0,45 μm membrane.
Trvanlivosť zásobného roztoku je maximálne 10 dní; ak je jeho vodivosť väčšia ako 5 μS, deionizujte ho miešaním s 2 g amberlitu MB-3 počas 30 minút, a potom ho prefiltrujte cez membránu s hrúbkou 0,45 μm.
Gel solution
Gélový roztok
Prepare a gel solution by mixing additives and ampholytes with the stock gel solution (see 4.1.1).
Gélový roztok pripravte zmiešaním aditív a amfolytov so zásobným gélovým roztokom (pozri 4.1.1)
9,0 ml stock solution
9,0 ml zásobného roztoku
24 mg β-alanine
24 mg β-alanínu
500 μl ampholyte pH 3,5-9,5 [1]
500 μl amfolytu pH 3,5 – 9,5 [1]
250 μl ampholyte pH 5-7 [1] The produce Ampholine® pH 3,5-9,5 (Pharmacia) and Resolyte® pH 5-7 and pH 6-8 (BDH, Merck) have proved particularly suitable for obtaining the required separation of γ-caseins.
250 μl amfolytu pH 5 – 7 [1] Výrobky Ampholine® pH 3,5 – 9,5 (Pharmacia) a Resolyte® pH 5 – 7 a pH 6 – 8 (BDH, Merck) sa ukázali ako mimoriadne vhodné na dosiahnutie požadovanej separácie γ-kaezínov.
Mix the gel solution and de-gas for two to three minutes in an ultrasonic bath or in vacuum.
Gélový roztok zmiešajte a odplyňujte počas dvoch až troch minút v ultrazvukovom kúpeli alebo vo vákuu.
Note: Prepare the gel solution immediately prior to pouring it (see 6.2).
Poznámka: Gélový roztok pripravujte tesne pred použitím (pozri 6.2).
Catalyst solutions
Katalytické roztoky
N, N, N' N' — tetramethylethylenediamine (Temed)
N, N, N', N'-tetrametyletyléndiamín (Temed)
40 % w/v ammonium persulphate (PER):
40 % w/v peroxodisíran diamónny (PER):
Dissolve 800 mg PER in water and make up to 2 ml.
Rozpusťte 800 g PER vo vode a pridajte vodu do 2 ml.
Note: Always use freshly prepared PER solution.
Poznámka: Vždy používajte čerstvo pripravený roztok PER.
Contact fluid
Kontaktná kvapalina
Kerosene or liquid paraffin
Kerozín alebo kvapalný parafín
Anode solution
Anódový roztok
Dissolve 5,77 g phosphoric acid (85 % w/w) in water and dilute to 100 ml.
Vo vode rozpusťte 5,77 g kyseliny trihydrogenfosforečnej (85 % w/w) a pridajte vodu do 100 ml.
Cathode solution
Katódový roztok
Dissolve 2,00 g sodium hydroxide in water and dilute to 100 ml with water.
Vo vode rozpusťte 2,00 g hydroxidu sodného a pridajte vodu do 100 ml.
Reagents for protein isolation
Reagenty na izoláciu proteínu
Dilute acetic acid (25,0 ml of glacial acetic acid made up to 100 ml with water)
Rozpusťte kyselinu octovú (25,0 ml ľadovej kyseliny octovej doplňte vodou do 100 ml)
Dichloromethane
Dichlórometán
Protein dissolving buffer
Tlmivý roztok rozpúšťajúci proteíny
Dissolve
Rozpusťte
5,75 g glycerol (87 % w/w)
5,75 g glycerolu (87 % w/w)
24,03 g urea
24,03 g močoviny
250 mg dithiothreitol,
250 mg (+-)-(R*,R*)-1,4-disulfanylbután-2,3-diolu
in water and make up to 50 ml
vo vode a doplňte do 50 ml.
Note: Store in a refrigerator, maximum shelf-life one week.
Poznámka: Skladujte v chladničke, maximálna trvanlivosť je jeden týždeň.
Reagents for plasmin cleavage of caseins
Reagenty pre plazmínové oddelenie kazeínov
Ammonium carbonate buffer
Tlmivý roztok uhličitanu amónneho
Titrate a 0,2 mol/l ammonium hydrogencarbonate solution (1,58 g/100 ml water) containing 0,05 mol/l ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 1,46 g/100 ml with a 0,2 mol/l ammonium carbonate solution (1,92 g/100 ml water) containing 0,05 mol/l EDTA to ph 8.
Titrujte roztok 0,2 mol/l hydrogénuhličitanu amónneho (1,58 g/100 ml vody) obsahujúci 0,05 mol/l kyseliny etyléndiamíntetraoctovej (EDTA, 1,46 g/100 ml) s 0,2 mol/l roztokom uhličitanu amónneho (1,92 g/100 ml vody) obsahujúcim 0,05 mol/l EDTA na pH 8.
Bovine plasmin (EC.
Plazmín z kravského mlieka (EC.
3.4.21.7), activity at least 5 U/ml
3.4.21.7), činnosť minimálne 5 U/ml
ε-Aminocaproic acid solution for enzyme inhibition
Roztok kyseliny ε-aminohexánovej na inhibíciu enzýmov
Dissolve 2,624 g ε-aminocaproic acid (6 amino-n-hexanoic acid) in 100 ml of 40 % (v/v) ethanol.
Rozpusťte 2,624 kyseliny ε-aminohexánovej (kyselina 6-amino-n-hexánová) v 100 ml 40 % (v/v) etanolu.
Standards
Štandardné roztoky
Certified reference standards of a mixture of renneted ewes’ and goats’ skimmed milk containing 0 % and 1 % of cows’ milk are available from the Commission’s Institute for Reference Materials and Measurements, B-2440 Geel, Belgium
Certifikované referenčné štandardné roztoky zmesi syridlom upraveného odstredeného ovčieho a kozieho mlieka obsahujúceho 0 % a 1 % kravského mlieka sú dostupné v Inštitúte Komisie pre referenčné materiály a merania (Commission's Institute for Reference Materials and Measurements, B-2440 Geel, Belgicko).
Preparation of laboratory interim-standards of buffalos’ renneted milk containing 0 % and 1 % of cows’ milk
Príprava dočasných laboratórnych štandardných roztokov pre syridlom upravené byvolie mlieko obsahujúce 0 % a 1 % kravského mlieka.
Skimmed milk is prepared by centrifuging of either buffalo or bovine raw bulk milk at 37 °C at 2500 g for 20 minutes.
Odstredené mlieko sa pripraví odstredením buď byvolieho, alebo kravského surového mlieka pri parametroch 37 °C, 2500 g, 20 minút.
After cooling the tube and contents rapidly to 6 to 8 °C, the upper fat layer is removed completely.
Po rýchlom ochladení skúmavky a jej obsahu na 6 až 8 °C sa úplne odstráni horná vrstva tuku.
For the preparation of the 1 % standard add 5,00 ml of bovine skimmed milk to a 495 ml of buffalos’ skimmed milk in a 1 l beaker, adjust the pH to 6,4 by the addition of dilute lactic acid (10 % w/v).
Na prípravu 1 % štandardného roztoku pridajte do 495 ml byvolieho odstredeného mlieka 5,00 ml kravského odstredeného mlieka v 1 l vaničke, pridaním roztoku kyseliny mliečnej (10 % w/v) upravte pH na 6,4.
Adjust the temperature to 35 °C and add 100 μl of calf rennet (rennet activity 1: 10000, c. 3000 U/ml), stir for 1 minute and then leave the beaker covered with an aluminium foil at 35 °C for one hour to allow formation of the curd.
Teplotu nastavte na 35 °C a pridajte 100 μl syridla z teľacích žalúdkov (činnosť syridla 1: 10000, c. 3000 U/ml), miešajte 1 minútu a potom banku prikryte hliníkovou fóliou a nechajte stáť pri teplote 35 °C jednu hodinu, aby sa vytvoril tvaroh.
After the curd has formed, the whole renneted milk is freeze-dried without prior homogenization or draining of the whey.
Po vytvorení tvarohu celé syridlom upravené mlieko vysušte mrazom bez predošlej homogenizácie alebo zliatia srvátky.
After freeze-drying it is finely ground to produce a homogeneous powder.
Po sušení je roztok vhodný na vytvorenie homogénneho prášku.
For the preparation of the 0 % standard, carry out the same procedure using genuine buffalo skimmed milk.
Na prípravu 0 % štandardného roztoku uskutočnite rovnaký postup s použitím pravého byvolieho odstredeného mlieka.
The standards must be stored at –20 °C.
Štandardné roztoky sa musia skladovať pri teplote –20 °C.
Note: It is advisable to check the purity of the buffalos’ milk by isoelectric focusing of the plasmin-treated caseins before preparation of the standards.
Poznámka: Pred prípravou štandardného roztoku je vhodné skontrolovať čistotu byvolieho mlieka izoelektrickým zaostrením kazeínov ošetrených plazmínom.
Reagents for protein staining
Reagenty na farbenie proteínov
Fixative
Ustaľovač
Dissolve 150 g trichloroacetic acid in water and make up to 1000 ml.
Vo vode rozpusťte 150 g kyseliny trichlóroctovej a doplňte na 1000 ml.
Destaining solution
Roztok na odfarbovanie
Dilute 500 ml methanol and 200 ml glacial acetic acid to 2000 ml with distilled water.
Rozrieďte destilovanou vodou 500 ml metanolu a 200 ml ľadovej kyseliny octovej na 2000 ml.
Note: Prepare the destaining solution fresh every day; it can be prepared by mixing equal volumes of stock solutions of 50 % (v/v) methanol and 20 % (v/v) glacial acetic acid.
Poznámka: Roztok na odfarbovanie pripravte každý deň čerstvý; dá sa pripraviť zmiešaním rovnakých objemov zásobných roztokov 50 % (v/v) metanolu a 20 % (v/v) ľadovej kyseliny octovej.
Staining solutions
Roztoky na farbenie
Staining solution (stock solution 1)
Roztok na farbenie (zásobný roztok 1)
Staining solution (stock solution 2)
Roztok na farbenie (zásobný roztok 2)
Dissolve 5,0 g copper sulphate pentahydrate in 1000 ml 20 % (v/v) acetic acid.
V 1000 ml 20 % (v/v) kyseliny octovej rozpusťte 5,0 g pentahydrátu síranu meďnatého.
Staining solution (working solution)
Roztok na farbenie (pracovný roztok)
Mix together 125 ml of each of the stock solutions (4.11.1, 4.11.2) immediately prior to staining.
Bezprostredne pred farbením zmiešajte 125 ml z oboch zásobných roztokov (4.11.1, 4.11.2).
Note: The staining solution should be prepared on the day that it is used.
Poznámka: Roztok na farbenie by mal byť pripravený v deň použitia.
EQUIPMENT
VYBAVENIE
Glass plates (265 × 125 × 4 mm); rubber roller (width 15 cm); levelling table
Sklenené doštičky (265 × 125 × 4 mm); gumený valček (šírka 15 cm); vyrovnávacia tabuľka
Gel carrier sheet (265 × 125 mm)
Fólia na gél (265 × 125 mm)
Covering sheet (280 × 125 mm).
Krycia fólia (280 × 125 mm).
Stick on strip of adhesive tape (280 × 6 × 0,25 mm) to each long edge (see Figure 1)
Na oba dlhé konce upevnite pás lepiacej pásky (280 × 6 × 0,25 mm) (pozri obrázok 1).
Electrofocusing chamber with cooling plate (e.g. 265 × 125 mm) and suitable power supply (≥ 2,5 kV) or automatic electrophoresis device
Elektrozaostrovacia komora s chladiacou doskou (napr. 265 × 125 mm) a vhodným zdrojom energie (≥ 2,5 kV) alebo automatické elektroforézne zariadenie
Circulation cryostat, thermostatically controlled at 12 ± 0,5 °C
Cirkulačný kryostat s termostatickou kontrolou na 12 ± 0,5 °C
Centrifuge, adjustable to 3000 g
Odstredivka nastaviteľná na 3000 g
Electrode strips (≥ 265 mm long)
Elektródy (≥ 265 mm dlhé)
Plastic dropping bottles for the anode and cathode solutions
Plastické ponorné fľaše na anódový a katódový roztok
Sample applicators (10 × 5 mm, viscose or low protein-adsorption filter paper)
Aplikátory vzoriek (10 × 5 mm, viskózový papier alebo papier s nízkou absorpciou proteínov)
Stainless steel scissors, scalpels and tweezers
Nerezové nožnice, skalpely a pinzety
Stainless steel or glass staining and destaining dishes (e.g. 280 × 150 mm instrument trays)
Nerezové alebo sklené misky na farbenie a odfarbovanie (napr. 280 × 150 mm podnosy na nástroje)
Adjustable rod homogenizer (10 mm shaft diameter), rpm range 8000 to 20000
Nastaviteľný tyčový homogenizér (priemer hriadeľa 10 mm), 8000 až 20000 ot/min
Magnetic stirrer
Magnetický miešač
Ultrasonic bath
Ultrazvukový kúpeľ
Film welder
Zváračka filmu
25 μl micropipettes
25 μl mikropipety
Vacuum concentrator or freeze-dryer
Vákuový koncentrátor alebo lyofilizátor
Thermostatically controlled water bath adjustable to 35 and 40 ± 1 °C with shaker
Termostaticky kontrolovaný vodný kúpeľ nastaviteľný na 35 a 40 ± 1 °C, s možnosťou pretrepania
Densitometer equipment reading at λ = 634 nm
Denzitometer na hodnoty λ = 634 nm
Isolation of caseins
Izolácia kazeínov
Weigh the amount equivalent to 5 g dry mass of cheese or the reference standards into a 100 ml centrifuge tube, add 60 ml distilled water and homogenize with a rod homogenizer (8000 to 10000 rpm).
Odvážte 5 g suchého syra alebo referenčných roztokov do 100 ml odstreďovacej skúmavky, pridajte 60 ml destilovanej vody a homogenizujte tyčovým homogenizérom (8000 až 10000 ot/min).
Adjust to pH 4,6 with dil. acetic acid (4.5.1) and centrifuge (5 minutes, 3000 g).
Hodnotu pH upravte na 4,6 rozriedenou kyselinou octovou (4.5.1) a odstreďte (5 minút, 3000 g).
Decant the fat and whey, homogenize the residue at 20000 rpm in 40 ml distilled water adjusted to pH 4,5 with dil. acetic acid (4.5.1), add 20 ml dichloromethane (4.5.2), homogenize again and centrifuge (5 minutes, 3000 g).
Zlejte tuk a srvátku, rezíduum homogenizujte pri 20000 ot/min v 40 ml destilovanej vody s pH upraveným na 4,5 rozriedenou kyselinou octovou (4.5.1), pridajte 20 ml dichlórmetánu (4.5.2), opäť homogenizujte a odstreďte (5 minút, 3000 g).
Remove the casein layer that lies between the aqueous and organic phases (see Figure 2) with a spatula and decant off both phases.
Stierkou odstráňte vrstvu kazeínu, ktorá sa nachádza medzi vodnou a organickou vrstvou (pozri obrázok 2) a zlejte obe vrstvy.
Rehomogenize the casein in 40 ml distilled water (see above) and 20 ml dichloromethane (4.5.2) and centrifuge.
Kazeín opäť zhomogenizujte v 40 ml destilovanej vody (pozri vyššie) a 20 ml dichlórmetánu (4.5.2) a odstreďte.
Repeat this procedure until both extraction phases are colourless (two to three times).
Tento postup opakujte, pokým nebudú obe extrakčné vrstvy bezfarebné (dva až trikrát).
Homogenize the protein residue with 50 ml acetone (4.5.3) and filter through a medium-speed folded filter paper.
Proteínové rezíduum homogenizujte s 50 ml acetónu (4.5.3) a prefiltrujte cez stredne rýchly zložený filtračný papier.
Wash the residue on the filter with two separate 25 ml portions of acetone each time and allow to dry in the air or a stream of nitrogen, then pulverize finely in a mortar.
Rezíduum z filtra zmyte dvoma osobitnými 25 ml dávkami acetónu a nechajte vyschnúť na vzduchu alebo pod prúdom dusíka, a potom ho rozdrvte na jemný prášok v mažiari.
Note: Dry casein isolates should be kept at –20 °C.
Poznámka: Suché izoláty kazeínu treba skladovať pri –20 °C.
Plasmin cleavage of β-caseins to intensify γ-caseins
Plazmínové delenie β-kazeínov na intenzifikáciu γ-kazeínov
Disperse 25 mg of isolated caseins (6.1.1) in 0,5 ml ammonium carbonate buffer (4.7.1) and homogenize for 20 minutes by e.g. using ultrasonic treatment.
V 0,5 ml tlmivého roztoku uhličitanu amónneho (4.7.1) rozpusťte 25 mg izolovaných kazeínov (6.1.1) a 20 minút homogenizujte napr. použitím ultrazvuku.
Heat to 40 °C and add 10 μl plasmin (4.7.2), mix and incubate for one hour at 40 °C with continuous shaking.
Zohrejte na 40 °C a pridajte 10 μl plazmínu (4.7.2), zmiešajte a inkubujte 1 hodinu pri teplote 40 °C za stáleho pretrepávania.
To inhibit the enzyme add 20 μl ε-aminoproic acid solution (4.7.3), then add 200 mg of solid urea and 2 mg of dithiothreitol.
Na inhibovanie enzýmu pridajte 20 μl roztoku kyseliny ε-aminohexánovej (4.7.3), pridajte 200 mg pevnej močoviny a 2 mg (+-)-(R*,R*)-1,4-disulfanylbután-2,3-diolu.
Note: To obtain more symmetry in the focused casein bands it is advisable to freeze-dry the solution after adding the ε-aminocaproic acid and then dissolving the residues in 0,5 ml protein dissolving buffer (4.6).
Poznámka: Na dosiahnutie väčšej symetrie v zaostrených kazeínových pásmach je vhodné roztok po pridaní kyseliny ε-aminohexánovej mrazom vysušiť a rezíduá potom rozpustiť v 0,5 ml tlmivého roztoku rozpúšťajúceho proteíny (4.6).
Preparation of the urea containing polyacrylamide gels
Príprava močoviny obsahujúcej polyakrylamidové gély
With the aid of a few drops of water roll the gel carrier sheet (5.2) onto a glass plate (5.1), removing any extraneous water with paper towel or tissue.
Pomocou niekoľkých kvapiek vody rozbaľte fóliu s gélom (5.2) na sklenenú doštičku (5.1) a prebytočnú vodu odstráňte papierovým obrúskom.
Roll the cover sheet (5.3) with spacers (0,25 mm) onto another glass plate in the same way.
Na ďalšiu doštičku rozložte rovnakým spôsobom kryciu fóliu (5.3) s rozpernými vložkami (0,25 mm).
Lay the plate horizontally on a levelling table.
Doštičku horizontálne položte na vyrovnávaciu tabuľku.
Add 10 μl Temed (4.1.3.1) to the prepared and de-aerated gel solution (4.1.2), stir and add 10 μl PER-solution (4.1.3.2), mix thoroughly and immediately pour out evenly onto the centre of the cover sheet.
Do pripraveného a odvzdušneného gélového roztoku (4.1.2) pridajte 10 μl Temedu (4.1.3.1), premiešajte a pridajte 10 μl roztoku PER (4.1.3.2), dôkladne premiešajte a ihneď rovnomerne nalejte na stred krycej fólie.
Place one edge of the gel carrier plate (sheet side down) on the cover sheet plate and lower it slowly so that a gel film forms between the sheets and spreads out regularly and free of bubbles (Figure 3).
Jeden okraj fólie na gél položte na kryciu fóliu a pomaly ju spustite tak, aby sa medzi doštičkami vytvoril rovnomerný gélový film bez bubliniek (obrázok 3).
Carefully lower the gel carrier plate completely using a thin spatula and place three more glass plates on top of it to act as weights.
Opatrne spustite fóliu na gél použitím tenkej stierky a na vrch ako závažie umiestnite ďalšie tri sklenené doštičky.
After polymerization is complete (about 60 minutes) remove the gel polymerized onto the gel carrier sheet along with the cover sheet by tipping the glass plates.
Po ukončení polymerizácie (približne 60 minút) presuňte polymerizovaný gél na fóliu na gél spolu s krycou fóliou naklonením sklenených doštičiek.
Clean the reverse of the carrier sheet carefully to remove gel residues and urea.
Opačnú stranu fólie na gél pozorne očistite, aby ste odstránili gélové rezíduá a močovinu.
Weld the gel sandwich into a film tube and store in a refrigerator (maximum six weeks).
Gélový „sendvič“ zavarte do filmovej rúrky a uskladnite v chladničke (maximálne šesť týždňov).
Note: The cover sheet with the spacers can be re-used.
Poznámka: Krycia fólia s rozpernými vložkami sa dá znovu použiť.