natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Therefore, data generated with the present test method should be considered in the context of integrated approaches, such as IATA, combining them with other complementary information e.g. derived from in vitro assays addressing other key events of the skin sensitisation AOP as well as non-testing methods including read-across from chemical analogues.
Martorul negativ (solvent) utilizat în testul KeratinoSensTM este DMSO (Nr.
Examples on how to use the ARE-Nrf2 luciferase test method in combination with other information are reported in literature (13) (16) (17) (18) (19).
CAS 67-68-5, puritate ≥ 99 %), pentru care se pregătesc șase godeuri pentru fiecare placă.
This test method can be used to support the discrimination between skin sensitisers (i.e. UN GHS/CLP Category 1) and non-sensitisers in the context of IATA.
Acesta suferă aceeași diluție descrisă pentru concentrațiile de bază de la punctul 22, astfel încât concentrația finală de martor negativ (solvent) este de 1 %, despre care se știe că nu afectează viabilitatea celulară și este corespunzătoare cu aceeași concentrație de DMSO a substanței chimice de testat și a martorului pozitiv.
This test method cannot be used on its own, neither to sub-categorise skin sensitisers into subcategories 1A and 1B as defined by the UN GHS/CLP nor to predict potency for safety assessment decisions.
În cazul unei substanțe chimice de testat care nu este solubilă în DMSO, pentru care se efectuează diluții în apă, nivelul de DMSO în toate godeurile soluției finale de testat trebuie ajustat la 1 %, la fel ca pentru celelalte substanțe chimice de testat și substanțe martor.
However, depending on the regulatory framework, a positive result may be used on its own to classify a chemical into UN GHS/CLP category 1.
Martorul pozitiv utilizat în cazul testului KeratinoSensTM este aldehida cinamică ( Nr.
Based on the dataset from the validation study and in-house testing used for the independent peer-review of the test method, the KeratinoSensTM assay proved to be transferable to laboratories experienced in cell culture.
CAS 14371-10-9, puritate ≥ 98 %), pentru care o serie de 5 concentrații de bază variind de la 0,4 la 6,4 mM se pregătesc în DMSO (de la soluție mamă de 6,4 mM) și se diluează astfel cum este descris pentru concentrațiile de bază de la punctul 22, astfel încât concentrația finală a martorului pozitiv să se încadreze într-o plajă de valori de la 4 la 64 μM.
The level of reproducibility in predictions that can be expected from the test method is in the order of 85 % within and between laboratories (14).
Se pot utiliza alți martori pozitivi adecvați, de preferință care să furnizeze valori medii CE1,5 în cazul în care sunt disponibile date anterioare pentru a obține criterii de acceptare a utilizării comparabile.
The accuracy (77 % - 155/201), sensitivity (78 % - 71/91) and specificity (76 % - 84/110) of the KeratinoSensTM assay for discriminating skin sensitisers (i.e. UN GHS/CLP Cat.
Aplicarea substanței chimice de testat și a substanțelor martor
1) from non-sensitisers when compared to LLNA results were calculated by considering all of the data submitted to EURL ECVAM for evaluation and peer-review of the test method (14).
Pentru fiecare substanță chimică de testat și substanță martor pozitiv este necesar un experiment pentru a obține o estimare (pozitivă sau negativă), constituită din cel puțin două repetări independente, fiecare conținând trei replici (și anume, n = 6).
These figures are similar to those recently published based on in-house testing of about 145 substances (77 % accuracy, 79 % sensitivity, 72 % specificity) (13).
În cazul unor rezultate discordante între cele două repetiții, se efectuează o a treia repetare conținând trei replici (și anume, n = 9).
The KeratinoSensTM assay is more likely to under predict chemicals showing a low to moderate skin sensitisation potency (i.e. UN GHS/CLP subcategory 1B) than chemicals showing a high skin sensitisation potency (i.e. UN GHS/CLP subcategory 1A) (13) (14).
Fiecare repetiție independentă se efectuează în altă zi, cu soluții mamă proaspete de substanțe chimice de testat și celule recoltate în mod independent.
Taken together, this information indicates the usefulness of the KeratinoSensTM assay to contribute to the identification of skin sensitisation hazard.
Cu toate acestea, celulele pot să provină din același pasaj.
However, the accuracy values given here for the KeratinoSensTM assay as a stand-alone test method are only indicative since the test method should be considered in combination with other sources of information in the context of an IATA and in accordance with the provisions of paragraph 9 above.
În urma însămânțării, astfel cum este descris la punctul 20, se cultivă celulele timp de 24 de ore în plăcile de microtitrare cu 96 de godeuri.
Furthermore when evaluating non-animal methods for skin sensitisation, it should be kept in mind that the LLNA as well as other animal tests, may not fully reflect the situation in the species of interest i.e. humans.
Mediul este apoi îndepărtat și înlocuit cu un mediu de cultură proaspăt (150 μl mediu de cultură fără ser, conținând geneticină în cazul KeratinoSensTM), la care se adaugă 50 μl de substanță chimică de testat și substanțe martor diluate de 25 ori.
The term “test chemical” is used in this test method to refer to what is being tested and is not related to the applicability of the ARE-Nrf2 luciferase test method to the testing of substances and/or mixtures.
Cel puțin un godeu la fiecare placă de mictotitrare se lasă gol (fără celule și fără tratament) pentru a evalua valori de bază.
The test method is nevertheless technically applicable to the testing of multi-constituent substances and mixtures.
Măsurători de activitate ale luciferazei
However, before use of this test method on a mixture for generating data for an intended regulatory purpose, it should be considered whether, and if so why, it may provide adequate results for that purpose.
Trei factori sunt esențiali pentru a asigura citiri adecvate ale luminiscenței:
Moreover, when testing multi-constituent substances or mixtures, consideration should be given to possible interference of cytotoxic constituents with the observed responses.
alegerea unui luminometru sensibil,
The test method is applicable to test chemicals soluble or that form a stable dispersion (i.e. a colloid or suspension in which the test chemical does not settle or separate from the solvent into different phases) either in water or DMSO (including all of the test chemical components in the case of testing a multi-constituent substance or a mixture).
utilizarea unui format de placă de mictotitrare cu o înălțime suficientă pentru a evita contaminarea încrucișată cu lumina și
In general substances with a LogP of up to 5 have been successfully tested whereas extremely hydrophobic substances with a LogP above 7 are outside the known applicability of the test method (14).
După expunerea timp de 48 de ore la substanța chimică de testat și substanțele martor în testul KeratinoSensTM, se spală celulele cu o soluție salină tamponată cu fosfat și se adaugă tamponul de lizare pentru citirile luminiscenței în fiecare godeu timp de 20 minute la temperatura camerei.
Furthermore, because of the limited metabolic capability of the cell line used (21) and because of the experimental conditions, pro-haptens (i.e. chemicals requiring enzymatic activation for example via P450 enzymes) and pre-haptens (i.e. chemicals activated by auto-oxidation) in particular with a slow oxidation rate may also provide negative results.
În plus, un substrat de preîncălzire poate fi utilizat, de asemenea, cu condiția ca experimentul de control al calității dinapendicele3 să fie îndeplinit cu succes.
Test chemicals that do not act as a sensitiser but are nevertheless chemical stressors may lead on the other hand to false positive results (14).
Evaluarea citotoxicității
Furthermore, highly cytotoxic test chemicals cannot always be reliably assessed.
În cazul testului ce viabilitate celulară KeratinoSensTM, mediul se înlocuiește după expunerea timp de 48 de ore cu mediu proaspăt care conține MTT[bromură de 3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difeniltetrazoliu, bromură de tiazolil albastru tetrazoliu; nr.
Finally, test chemicals that interfere with the luciferase enzyme can confound the activity of luciferase in cell-based assays causing either apparent inhibition or increased luminescence (22).
CAS 298-93-1)] și se incubează celulele timp de 4 ore la 37 °C în prezența a 5 % CO2.
For example, phytoestrogen concentrations higher than 1 μM were reported to interfere with the luminescence signals in other luciferase-based reporter gene assays due to over-activation of the luciferase reporter gene (23).
Se îndepărtează ulterior mediul cu MTT și se lizează celulele (de exemplu, prin adăugarea a 10 % soluție SDS la fiecare godeu) peste noapte.
As a consequence, luciferase expression obtained at high concentrations of phytoestrogens or similar chemicals suspected of producing phytoestrogen-like over-activation of the luciferase reporter gene needs to be examined carefully (23).
După agitare, se măsoară absorbția și anume, la 600 nm cu ajutorul unui fotometru.
In cases where evidence can be demonstrated on the non-applicability of the test method to other specific categories of test chemicals, the test method should not be used for those specific categories.
În cadrul testului KeratinoSensTM se calculează următorii parametrii:
In addition to supporting discrimination between skin sensitisers and non-sensitisers, the KeratinoSensTM assay also provides concentration-response information that may potentially contribute to the assessment of sensitising potency when used in integrated approaches such as IATA (19).
coeficientul de inducție medie maximă a valorii activității luciferazei (Imax) observat la orice concentrație de substanță chimică de testat și martor pozitiv;
However, further work preferably based on reliable human data is required to determine how KeratinoSensTM assay results can contribute to potency assessment (24) and to sub-categorisation of sensitisers according to UN GHS/CLP.
valoarea CE1,5 care reprezintă concentrația la care inducția activității luciferazei este peste pragul de 1,5 de ori (și anume, activitatea luciferazei cu 50 % mai mare); și
The ARE-Nrf2 luciferase test method makes use of an immortalised adherent cell line derived from HaCaT human keratinocytes stably transfected with a selectable plasmid.
concentrațiile valorilor CI50 și CI30 pentru reducerea cu 50 % și 30 % a viabilității celulare.
The cell line contains the luciferase gene under the transcriptional control of a constitutive promoter fused with an ARE element from a gene that is known to be up-regulated by contact sensitisers (25) (26).
Coeficientul de inducție a activității luciferazei se calculează prin ecuația 1, iar coeficientul de inducție maximă generală (Imax) se calculează ca medie a repetițiilor individuale.
The luciferase signal reflects the activation by sensitisers of endogenous Nrf2 dependent genes, and the dependence of the luciferase signal in the recombinant cell line on Nrf2 has been demonstrated (27).
Ecuația 1:
This allows quantitative measurement (by luminescence detection) of luciferase gene induction, using well established light producing luciferase substrates, as an indicator of the activity of the Nrf2 transcription factor in cells following exposure to electrophilic substances.
Coeficientul de inducție
Test chemicals are considered positive in the KeratinoSens™ assay if they induce a statistically significant induction of the luciferase activity above a given threshold (i.e. > 1,5 fold or 50 % increase), below a defined concentration which does not significantly affect cell viability (i.e. below 1000 μM and at a concentration at which the cellular viability is above 70 % (9) (12)).
Lprobă
For this purpose, the maximal fold induction of the luciferase activity over solvent (negative) control (Imax) is determined.
Lalb
Furthermore, since cells are exposed to series of concentrations of the test chemicals, the concentration needed for a statistically significant induction of luciferase activity above the threshold (i.e. EC1,5 value) should be interpolated from the dose-response curve (see paragraph 32 for calculations).
unde
Finally, parallel cytotoxicity measurements should be conducted to assess whether luciferase activity induction levels occur at sub-cytotoxic concentrations.
L probă
Prior to routine use of the ARE-Nrf2 luciferase assay that adheres to this test method, laboratories should demonstrate technical proficiency, using the ten Proficiency Substances listed in Appendix 2.
este valoarea citirii luminiscenței în godeul cu substanță chimică de testat
Performance standards (PS) (28) are available to facilitate the validation of new or modified in vitro ARE-Nrf2 luciferase test methods similar to the KeratinoSens™ assay and allow for timely amendment of this test method for their inclusion.
L gol
Mutual Acceptance of Data (MAD) according to the OECD agreement will only be guaranteed for test methods validated according to the PS, if these test methods have been reviewed and included in the corresponding test guideline by OECD.
este valoarea citirii luminiscenței în godeul gol care nu conține nici celule, nici tratament
Currently, the only method covered by this test method is the scientifically valid KeratinoSensTM assay (9) (12) (13) (14).
este media valorilor citirilor luminiscenței în godeurile care conțin celule și martorul solvent (negativ)
The Standard Operating Procedures (SOP) for the KeratinoSensTM assay is available and should be employed when implementing and using the test method in the laboratory (15).
,5 se calculează prin interpolare liniară, conform ecuației 2 și CE1,5 generală se calculează ca media geometrică a repetițiilor individuale.
Laboratories willing to implement the test method can obtain the recombinant cell line used in the KeratinoSensTM assay by establishing a licence agreement with the test method developer.
Ecuația 2:
The following paragraphs provide with a description of the main components and procedures of the ARE-Nrf2 luciferase test method.
este concentrația minimă în μM cu inducție > 1,5 ori
Preparation of the keratinocyte cultures
este concentrația maximă în μM cu inducție < 1,5 ori
A transgenic cell line having a stable insertion of the luciferase reporter gene under the control of the ARE-element should be used (e.g. the KeratinoSens™ cell line).
este coeficientul de inducție măsurat la concentrația minimă cu inducție > 1,5 ori (media a trei godeuri replici)
Upon receipt, cells are propagated (e.g. 2 to 4 passages) and stored frozen as a homogeneous stock.
este coeficientul de inducție la concentrația maximă cu inducție < 1,5 ori (media a trei godeuri replici)
Cells from this original stock can be propagated up to a maximum passage number (i.e. 25 in the case of KeratinoSensTM) and are employed for routine testing using the appropriate maintenance medium (in the case of KeratinoSensTM this represents DMEM containing serum and Geneticin).
Viabilitatea se calculează prin ecuația 3:
For testing, cells should be 80-90 % confluent, and care should be taken to ensure that cells are never grown to full confluence.
Ecuația 3:
One day prior to testing cells are harvested, and distributed into 96-well plates (10000 cells/well in the case of KeratinoSensTM).
Viabilitate
Attention should be paid to avoid sedimentation of the cells during seeding to ensure homogeneous cell number distribution across wells.
Vprobă
If this is not the case, this step may give raise to high well-to-well variability.
Valb
For each repetition, three replicates are used for the luciferase activity measurements, and one parallel replicate used for the cell viability assay.
unde
Preparation of the test chemical and control substances
V probă
The test chemical and control substances are prepared on the day of testing.
V gol
For the KeratinoSensTM assay, test chemicals are dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) to the final desired concentration (e.g. 200 mM).
este valoarea citirii absornanței MTT în godeul gol care nu conține celule sau tratament
The DMSO solutions can be considered self-sterilising, so that no sterile filtration is needed.
V solvent este media valorilor citirii absorbanței MTT în godeurile care conțin celule și martor solvent (negativ)
Test chemical not soluble in DMSO is dissolved in sterile water or culture medium, and the solutions sterilised by e.g. filtration.
and CI30 se calculează prin interpolare liniară, conform ecuației 4 și CI50 and CI30 generale se calculează ca medie geometrică a repetițiilor individuale.
For a test chemical which has no defined molecular weight (MW), a stock solution is prepared to a default concentration (40 mg/mL or 4 % (w/v)) in the KeratinoSensTM assay.
X este % de reducere la concentrația care urmează să fie calculată (50 și 30 pentru CI50 and CI30)
In case solvents other than DMSO, water or the culture medium are used, sufficient scientific rationale should be provided.
este concentrația minimă în μm cu > x % reducere în ceea ce privește viabilitatea
Based on the stock DMSO solutions of the test chemical, serial dilutions are made using DMSO to obtain 12 master concentrations of the chemical to be tested (from 0,098 to 200 mM in the KeratinoSensTM assay).
este concentrația maximă în μm cu < x % reducere în ceea ce privește viabilitatea
For a test chemical not soluble in DMSO, the dilutions to obtain the master concentrations are made using sterile water or sterile culture medium.
este % de viabilitate la concentrația minimă cu > x % reducere în ceea ce privește viabilitatea
Alternative concentrations may be used upon justification (e.g. in case of cytotoxicity or poor solubility).
Pentru fiecare concentrație care prezintă > 1,5 ori inducție a activității luciferazei, se calculează semnificația statistică [de exemplu, printr-un test t student cu două eșantioane], comparând valorile luminiscenței pentru cele trei probe replici cu valorile luminiscenței în godeurile care conțin martor solvent (negativ) pentru a determina dacă inducția activității luciferazei este semnificativă din punct de vedere statistic (p < 0,05).
The negative (solvent) control used in the KeratinoSensTM assay is DMSO (CAS No. 67-68-5, ≥ 99 % purity), for which six wells per plate are prepared.
Concentrația minimă cu > 1,5 ori inducție a activității luciferazei este valoarea care determină valoarea CE1,5.
It undergoes the same dilution as described for the master concentrations in paragraph 22, so that the final negative (solvent) control concentration is 1 %, known not to affect cell viability and corresponding to the same concentration of DMSO found in the tested chemical and in the positive control.
Aceasta se verifică în fiecare caz indiferent dacă valoarea este inferioară valorii CI30, indicând o reducere mai mică de 30 % a viabilității celulare la concentrația determinantă CE1,5.
For a test chemical not soluble in DMSO, for which the dilutions were made in water, the DMSO level in all wells of the final test solution must be adjusted to 1 % as for the other test chemicals and control substances.
Se recomandă verificarea vizuală a datelor cu ajutorul graficelor.
The positive control used in the case of the KeratinoSensTM assay is cinnamic aldehyde (CAS No. 14371-10-9, ≥ 98 % purity), for which a series of 5 master concentrations ranging from 0,4 to 6,4 mM are prepared in DMSO (from a 6,4 mM stock solution) and diluted as described for the master concentrations in paragraph 22, so that the final concentration of the positive control range from 4 to 64 μM.
În cazul în care nu se observă în mod clar o curbă doză-răspuns sau în cazul în care curba doză-răspuns obținută este bifazică (și anume, depășirea de două ori a pragului de 1,5) experimentul se repetă pentru a verifica dacă acestea sunt specifice substanței chimice de testat sau sunt cauzate de artefacte experimentale.
Application of the test chemical and control substances
În cazurile rare în care se observă o inducție nesemnificativă din punct de vedere statistic de peste 1,5 ori urmată de o concentrație mai mare cu o inducție semnificativă din punct de vedere statistic, rezultatele obținute din această repetare sunt considerate valabile și pozitive doar în cazul în care inducția semnificativă din punct de vedere static care depășește pragul de 1,5 a fost obținută pentru o concentrație necitotoxică.
For each test chemical and positive control substance, one experiment is needed to derive a prediction (positive or negative), consisting of at least two independent repetitions containing each three replicates (i.e. n = 6).
În cele din urmă, în cazul substanțelor chimice de testat care deja generează o inducție de 1,5 de ori sau mai mare la concentrația minimă de testare de 0,98 μm, valoarea CE1,5< 0,98 se stabilește pe baza inspecției vizuale a curbei doză-răspuns.
In case of discordant results between the two independent repetitions, a third repetition containing three replicates should be performed (i.e. n = 9).
Criteriile de acceptare menționate în continuare trebuie îndeplinite la utilizarea testului KeratinoSensTM.
Each independent repetition is performed on a different day with fresh stock solution of test chemicals and independently harvested cells.
În primul rând, inducția activității luciferazei obținută cu martorul pozitiv, aldehida cinamică, trebuie să fie semnificativă din punct de vedere statistic peste pragul de 1,5 (de exemplu, utilizând un test t) în cel puțin una dintre concentrațiile testate (de la 4 la 64 μM).
Cells may come from the same passage however.
În al doilea rând, valoarea CE1,5 trebuie să se încadreze între două deviații standard ale valorii medii anterioare ale instalației de testare (de exemplu, între 7 μM și 30 μM pe baza setului de date de validare), care trebuie să fie actualizată în mod regulat.
After seeding as described in paragraph 20, cells are grown for 24 hours in the 96-wells microtiter plates.
În plus, rata medie de inducție în cele trei replici pentru aldehida cinamică la 64 μM trebuie să fie între 2 și 8.
The medium is then removed and replaced with fresh culture medium (150 μl culture medium containing serum but without Geneticin in the case of KeratinoSensTM) to which 50 μl of the 25 fold diluted test chemical and control substances are added.
În cazul în care ultimul criteriu nu este îndeplinit, se verifică cu atenție relația dozărăspuns a aldehidei cinamice și testele pot fi acceptate numai în cazul în care există în mod clar o relație doză-răspuns cu inducție crescută a activității luciferazei la concentrații mărite a martorului pozitiv.
At least one well per plate should be left empty (no cells and no treatment) to assess background values.
În cele din urmă, coeficientul mediu al variației citirilor de luminiscență pentru martorul negativ (solvent) DMSO trebuie să fie sub 20 % pentru fiecare repetare care constă în 6 godeuri testate în triplicat.
The treated plates are then incubated for about 48 hours at 37 ± 1 °C in the presence of 5 % CO2 in the KeratinoSensTM assay.
În cazul în care variabilitatea este mai mare, rezultatele se elimină.
Care should be taken to avoid evaporation of volatile test chemicals and cross-contamination between wells by test chemicals by e.g. covering the plates with a foil prior to the incubation with the test chemicals.
Interpretarea rezultatelor și modelul predictiv
Luciferase activity measurements
O estimare KeratinoSensTM este considerat pozitivă în cazul în care următoarele 4 condiții sunt îndeplinite în 2 din 2 sau în aceleași 2 din 3 repetări; în caz contrar, estimarea KeratinoSensTM este considerată negativă (figura 1):
Three factors are critical to ensure appropriate luminescence readings:
Imax este mai mare (>) de 1,5 ori și în mod semnificativ diferită din punct de vedere statistic în comparație cu martorul solvent (negativ) (astfel cum este determinată cu ajutorul unui test t Student cu două eșantioane, neîmperecheate);
the use of a plate format with sufficient height to avoid light-cross-contamination; and
valoarea CE1,5 este mai mică (<) de 1000 μM (sau < 200 μg/ml pentru substanțele chimice fără MW definită);