natgillin/translations-raw huggingface dataset:
The amount of fluorescein leakage that occurs is proportional to the chemical-induced damage to the tight junctions, desmosomal junctions and cell membranes, and can be used to estimate the ocular toxicity potential of a test chemical.
Se evaluează solubilitatea substanței chimice la 250 mg/ml în HBSS înainte de testare.
Appendix 1 provides a diagram of MDCK cells grown on an insert membrane for the FL test method.
În cazul în care, la această concentrație, substanța chimică formează o suspensie sau o emulsie stabilă (și anume, se menține în mod uniform și nu se decantează sau se separă în mai mult de o fază) timp de 30 minute, HBSS poate fi utilizată în continuare ca solvent.
Definitions are provided in Appendix 2.
Cu toate acestea, în cazul în care substanța chimică este insolubilă în HBSS la această concentrație, se ia în considerare utilizarea altor metode de testare în loc de FL.
This test method is based on the INVITTOX protocol No. 71 (6) that has been evaluated in an international validation study by the European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM), in collaboration with the US Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the Japanese Center for the Validation of Alternative Methods (JaCVAM).
Utilizarea uleiului mineral ușor ca solvent în cazurile în care substanța chimică se dovedește a fi insolubilă în HBSS se ia în considerare cu prudență, având în vedere faptul că nu există suficiente date disponibile pentru a extrage concluzii cu privire la performanța testului FL în astfel de condiții.
The FL test method is not recommended for the identification of chemicals which should be classified as mild/moderate irritants or of chemicals which should not be classified for ocular irritation (substances and mixtures) (i.e. GHS Cat.
Toate substanțele chimice se pregătesc în HBSS sterilă, care conține calciu (cu o concentrație de 1,0- 1,8 mM), fără roșu fenol din soluția mamă, la cinci concentrații fixe diluate în greutate pe volum: 1, 25, 100, 250 mg/ml și o soluție pură sau saturată.
2A/2B, no category; EU CLP Cat.
Atunci când se testează o substanță chimică solidă, se include o concentrație foarte ridicată de 750 mg/ml.
2, no category; US EPA Cat.
Această concentrație a substanței chimice ar putea necesita aplicarea pe celulele utilizând o pipetă cu deplasare.
II/III/IV), as demonstrated by the validation study (3) (7).
În cazul în care toxicitatea se situează între 25 și 100 mg/ml, se testează de două ori următoarele concentrații suplimentare: 1, 25, 50, 75, 100 mg/ml.
The test method is only applicable to water soluble chemicals (substances and mixtures).
Se obține valoarea FL20 din concentrațiile respective cu condiția îndeplinirii criteriilor de acceptare.
The ocular severe irritation potential of chemicals that are water soluble and/or where the toxic effect is not affected by dilution is generally predicted accurately using the FL test method (7).
Se aplică substanțele chimice de testat la monostraturile celulare confluente după îndepărtarea mediului de cultură celulară și spălarea de două ori cu HBSS sterilă, caldă (37 °C), care conține calciu (cu o concentrație de 1,0-1,8 mM), fără roșu fenol.
To categorise a chemical as water soluble, under experimental conditions, it should be soluble in sterile calcium-containing (at a concentration of 1,0-1,8 mM), phenol red-free, Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) at a concentration ≥ 250 mg/ml (one dose above the cut-off of 100 mg/ml).
Până în prezent, filtrele au fost verificate vizual pentru orice leziune pre-existentă care ar putea fi atribuită în mod fals potențialelor incompatibilități cu substanțele chimice de testat.
However, if the test chemical is soluble below the concentration 100 mg/ml, but already induces a FL induction of 20 % at that concentration (meaning FL20 < 100 mg/ml), it can still be classified as GHS Cat.
Se utilizează cel puțin trei replici pentru fiecare concentrație de substanță chimică de testat și pentru martori la fiecare determinare.
1 or EPA Cat.
După expunerea de 1 minut la temperatura camerei, se îndepărtează cu grijă substanța chimică de testat prin aspirație, se spală de două ori monostratul cu HBSS sterilă, caldă (37 °C), care conține calciu (cu o concentrație de 1,01,8 MM), fără roșu fenol și se măsoară imediat scurgerea de fluoresceină.
I.
La fiecare determinare se utilizează martori negativi (MN) și martori pozitivi (MP) testați în paralel pentru a demonstra faptul că integritatea monostratului (MN) și sensibilitatea celulelor (MP) se încadrează într-o plajă definită de valori de acceptare din teste anterioare.
The identified limitations for this test method exclude strong acids and bases, cell fixatives and highly volatile chemicals from the applicability domain.
Substanța chimică MP recomandată este Brij 35 (Nr.
These chemicals have mechanisms that are not measured by the FL test method, e.g. extensive coagulation, saponification or specific reactive chemistries.
CAS 9002-92-0) la 100 mg/ml.
Other identified limitations for this method are based upon the results for the predictive capacity for coloured and viscous test chemical (7).
Această concentrație furnizează aproximativ 30 % scurgere de fluoresceină (plajă de valori acceptabile 20-40 % scurgere de fluoresceină, și anume, leziuni la nivelul stratului celular).
It is suggested that both types of chemicals are difficult to remove from the monolayer following the short exposure period and that predictivity of the test method could be improved if a higher number of washing steps was used.
Substanța chimică MN recomandată este HBSS (netratată, martor alb), care conține calciu (cu o concentrație de 1,0-1,8 mM), fără roșu fenol.
Solid chemicals suspended in liquid have the propensity to precipitate out and the final concentration to cells can be difficult to determine.
La fiecare determinare se include, de asemenea, un martor pentru scurgerea maximă pentru a permite calcularea valorilor FL20.
When chemicals within these chemical and physical classes are excluded from the database, the accuracy of FL across the EU, EPA, and GHS classification systems is substantially improved (7).
Scurgerea maximă se determină utilizând o inserție martor, fără celule.
Based on the purpose of this test method (i.e. to identify ocular corrosives/severe irritants only), false negative rates (see Paragraph 13) are not critical since such chemicals would be subsequently tested with other adequately validated in vitro tests or in rabbits, depending on regulatory requirements, using a sequential testing strategy in a weight of evidence approach (5) (see also paragraphs 3 and 4).
Determinarea permeabilității fluoresceinei
Other identified limitations of the FL test method are based on false negative and false positive rates.
Se efectuează măsurători cu un spectrofluorimetru la lungimi de undă cu excitație și emisie de 485 nm și respectiv, 530 nm.
When used as an initial step within a Top-Down approach to identify water soluble ocular corrosive/severe irritant substances and mixtures (UN GHS Category 1; EU CLP Category 1; U.S. EPA Category I), the false positive rate for the FL test method ranged from 7 % (7/103; UN GHS and EU CLP) to 9 % (9/99; U.S. EPA) and the false negative rate ranged from 54 % (15/28; U.S. EPA) to 56 % (27/48; UN GHS and EU CLP) when compared to in vivo results.
Se fixează sensibilitatea spectrofluorimetrului astfel încât să existe cea mai mare diferență numerică între nivelul maxim de FL (inserție fără celule) și nivelul minim de FL (inserție cu monostrat confluent tratat cu MN).
Chemical groups showing false positive and/or false negative results in the FL test method are not defined here.
Din cauza diferențelor în ceea ce privește spectrofluorimetrul utilizat, se sugerează utilizarea unei sensibilități care să furnizeze un nivel de intensitate al fluorescenței > 4000 la martorul cu nivel maxim de scurgere.
Certain technical limitations are specific to the MDCK cell culture.
Valoarea maximă FL nu trebuie să depășească 9999.
The tight junctions that block the passage of the sodium-fluorescein dye through the monolayer are increasingly compromised with increasing cell passage number.
Intensitatea scurgerii maxime de fluorescență trebuie să se încadreze în plaja de valori lineară a spectrofluorimetrului utilizat.
Incomplete formation of the tight junctions results in increased FL in the non-treated control.
Interpretarea rezultatelor și modelul predictiv
Therefore, a defined permissible maximal leakage in the non-treated controls is important (see paragraph 38: 0 % leakage).
Cantitatea de FL este proporțională cu leziunile provocate de substanța chimică la nivelul joncțiunilor strânse.
As with all in vitro assays there is the potential for the cells to become transformed over time, thus it is vital that passage number ranges for the assays are stated.
Se calculează procentul de FL pentru fiecare concentrație testată de substanță chimică din valorilor FL obținute pentru substanța chimică de testat cu referire la valori FL din MN (citire din monostratul confluent de celule tratate cu MN) și un martor cu nivel maxim de scurgere (citire pentru cantitatea de FL printr-o inserție fără celule).
The current applicability domain might be increased in some cases, but only after analysing an expanded data set of studied test chemicals, preferably acquired through testing (3).
Intensitatea medie a scurgerii maxime de fluorescență = x
This test method will be updated accordingly as new information and data are considered.
Intensitatea medie pentru 0 % scurgere de fluorescență (MN)= y
For any laboratory initially establishing this assay, the proficiency chemicals provided in Appendix 3 should be used.
Se obține valoarea medie pentru 100 % scurgere scăzând valoarea medie pentru 0 % scurgere din valoarea medie maximă de scurgere,
Laboratories can use these chemicals to demonstrate their technical competence in performing the FL test method prior to submitting FL assay data for regulatory hazard classification purposes.
și anume, x – y = z
The FL test method is a cytotoxicity and cell-function based in vitro assay that is performed on a confluent monolayer of MDCK CB997 tubular epithelial cells that are grown on semi-permeable inserts and model the non-proliferating state of the in vivo corneal epithelium.
Se obține procentul de scurgere pentru fiecare doză fixă prin scăderea scurgerii de 0 % din intensitatea medie de fluorescență a celor trei citiri replici (m) și împărțind această valoare la scurgerea de 100 % și anume, %FL = [(m-y)/ z] x 100 %, unde:
The MDCK cell line is well established and forms tight junctions and desmosomal junctions similar to those found on the apical side of conjunctival and corneal epithelia.
m intensitatea medie de fluorescență a celor trei măsurători ale replicilor pentru concentrația implicată
Tight and desmosomal junctions in vivo prevent solutes and foreign materials penetrating the corneal epithelium.
%FL procentul de fluoresceină care se scurge prin stratul celular
Loss of trans-epithelial impermeability, due to damaged tight junctions and desmosomal junctions, is one of the early events in chemical-induced ocular irritation.
Se aplică următoarea ecuație pentru calcularea concentrației substanței chimice care provoacă 20 % FL:
The test chemical is applied to the confluent layer of cells grown on the apical side of the insert.
FLD = [(A-B) / (C-B)] x (MC –MB) + MB
A short 1 min exposure is routinely used to reflect the normal clearance rate in human exposures.
Unde:
An advantage of the short exposure period is that water-based substances and mixtures can be tested neat, if they can be easily removed after the exposure period.
D % de inhibare
This allows more direct comparisons of the results with the chemical effects in humans.
A % de lezare (20 % scurgere de fluoresceină)
The test chemical is then removed and the non-toxic, highly fluorescent sodium-fluorescein dye is added to the apical side of the monolayer for 30 minutes.
B % de scurgere de fluoresceină < A
The damage caused by the test chemical to the tight junctions is determined by the amount of fluorescein which leaks through the cell layer within a defined period of time.
C % de scurgere de fluoresceină > A
The amount of sodium-fluorescein dye that passes through the monolayer and the insert membrane into a set volume of solution present in the well (to which the sodium-fluorescein dye leaks in) is determined by measuring spectrofluorometrically the fluorescein concentration in the well.
Concentrația C (mg/ml)
The amount of fluorescein leakage (FL) is calculated with reference to fluoresence intensity (FI) readings from two controls: a blank control, and a maximum leakage control.
Concentrația B (mg/ml)
The percentage of leakage and therefore amount of damage to the tight junctions is expressed, relative to these controls, for each of the set concentrations of the test chemical.
Valoarea limită a FL20 pentru estimarea substanțelor chimice ca substanțe având un caracter coroziv/potențial iritant sever este prezentată mai jos:
Then the FL20 (i.e. concentration that causes 20 % FL relative to the value recorded for the untreated confluent monolayer and inserts without cells), is calculated.
C&E: clasificare și etichetare
The FL20 (mg/ml) value is used in the prediction model for identification of ocular corrosives and severe irritants (see paragraph 35).
GHS al ONU C&E
Preparation of the cellular monolayer
Categoria I
The monolayer of MDCK CB997 cells is prepared using sub-confluent cells growing in cell culture flasks in DMEM/Nutrient Mix F12 (1x concentrate with L-glutamine, 15 mM HEPES, calcium (at a concentration of 1,0-1,8 mM) and 10 % heat-inactivated FCS/FBS).
Metoda de testare FL se recomandă doar pentru identificarea substanțelor având un caracter coroziv și un potențial iritant sever la nivel ocular solubile în apă (categoria 1 din GHS al ONU, categoria 1 din Regulamentul CLP al UE, categoria I EPA SUA) (a se vedea punctele 1 și 10).
Importantly, all media/solutions used throughout the FL assay should contain calcium at a concentration between 1,8 mM (200 mg/l) and 1,0 mM (111 mg/l) to ensure tight junction formation and integrity.
Pentru a identifica substanțele chimice (substanțe si amestecuri) solubile în apă (3) (6) (7) ca „provocând lezarea oculară gravă” (categoria 1 din GHS al ONU/Regulamentul CLP al UE) sau ca „substanțe cu caracter coroziv sau potențial iritant sever la nivel ocular” (categoria I EPA SUA), substanța chimică de testat trebuie să inducă o valoare FL20 ≤ 100 mg/ml.
Cell passage number range should be controlled to ensure even and reproducible tight junctions formation.
Acceptarea rezultatelor
Preferably, the cells should be within the passage range 3-30 from thawing because cells within this passage range have similar functionality, which aids assay results to be reproducible.
Valoarea medie maximă a scurgerii de fluoresceină (x) trebuie să fie mai mare de 4000 (a se vedea punctul 31), media scurgerii de 0 % (y) trebuie să fie mai mică sau egală cu 300, iar media scurgerii de100 % (z) trebuie să se situeze între 3700 și 6000.
Prior to performing the FL test method, the cells are detached from the flask by trypsinisation, centrifuged and an appropriate amount of cells is seeded into the inserts placed in 24-well plates (see Appendix 1).
Un test este considerat acceptabil în cazul în care martorul pozitiv produce leziuni la nivelul stratului celular de la 20 % la 40 % (măsurate în % de scurgere de fluoresceină).
Twelve mm diameter inserts with membrane of mixed cellulose esters, a thickness of 80-150 μm and a pore size of 0,45 μm, should be used to seed the cells.
Date
In the validation study, Millicell-HA 12 mm inserts were used.
Pentru fiecare determinare se înregistrează, sub formă de tabel, datele obținute pentru fiecare godeu replică (de exemplu, valorile intensității fluorescenței și date cu privire la procentele calculate de FL pentru fiecare substanță chimică de testat, inclusiv clasificarea).
The properties of the insert and membrane type are important as these may affect cell growth and chemical binding.
În plus, se înregistrează valorile medii ± DS ale fiecărei măsurători replică la fiecare determinare.
Certain types of chemicals may bind to the Millicell-HA insert membrane, which could affect the interpretation of results.
Numărul CAS al substanței chimice, dacă se cunoaște;
Proficiency chemicals (see Appendix 3) should be used to demonstrate equivalency if other membranes are used.
Puritatea și compoziția substanței sau a amestecului [în procent(e) pe greutate], în măsura în care această informație este disponibilă;
Chemical binding to the insert membrane is more common for cationic chemicals, such as benzalkonium chloride, which are attracted to the charged membrane (7).
Proprietățile fizico-chimice relevante pentru desfășurarea studiului (de exemplu, starea fizică, volatilitatea, pH-ul, stabilitatea, solubilitatea în apă, clasă chimică);
Chemical binding to the insert membrane may increase the chemical exposure period, leading to an over-estimation of the toxic potential of the chemical, but can also physically reduce the leakage of fluorescein through the insert by binding of the dye to the cationic chemical bound to the insert membrane, leading to an under-estimation of the toxic potential of the chemical.
Tratamentul la care a fost supusă substanța chimică de testat/martor înainte de efectuarea testului, dacă este cazul (de exemplu, încălzire, măcinare);
This can be readily monitored by exposing the membrane alone to the top concentration of the chemical tested and then adding sodium-fluorescein dye at the normal concentration for the standard time (no cell control).
Condiții de depozitare;
If binding of the sodium-fluorescein dye occurs, the insert membrane appears yellow after the test material has been washed-off.
Justificarea metodei de testare și a protocolului utilizat
Thus, it is essential to know the binding properties of the test chemical in order to be able to interpret the effect of the chemical on the cells.
Trebuie să includă considerații cu privire la domeniul de aplicabilitate și limitările metodei de testare;
Cell seeding on inserts should produce a confluent monolayer at the time of chemical exposure.
Descrierea sistemului celular utilizat, inclusiv certificatul de autenticitate și statusul micoplasmei liniei celulare;
1,6 × 105 cells should be added per insert (400 μl of a cell suspension with a density of 4 × 105 cells / ml).
Detalii privind procedura de testare utilizată;
Under these conditions, a confluent monolayer is usually obtained after 96 hours in culture.
Concentrația (concentrațiile) de substanță chimică de testat utilizată(e);
Inserts should be examined visually prior to seeding, so as to ensure that any damages recorded at the visual control described at paragraph 30 is due to handling.
Durata expunerii la substanța chimică de testat;
The MDCK cell cultures should be kept in incubators in a humidified atmosphere, at 5 % ± 1 % CO2 and 37 ± 1 °C.
Durata de incubație cu fluoresceină;
The cells should be free of contamination by bacteria, viruses, mycoplasma and fungi.
Descrierea criteriilor de evaluare utilizate;
Application of the Test and Control Chemicals
Trimiteri la date anterioare ale modelului (de exemplu, martori negativi și pozitivi, substanțe de referință, dacă este cazul);
A fresh stock solution of test chemical should be prepared for each experimental run and used within 30 minutes of preparation.
Informații cu privire la performanțele tehnice demonstrate de laborator;
Test chemicals should be prepared in calcium-containing (at a concentration of 1,0-1,8 mM), phenol red-free, HBSS to avoid serum protein binding.
Prezentarea în formă tabelară a datelor cu privire la substanțele chimice de testat și martor individuale pentru fiecare determinare și fiecare măsurătoare a unei replici (inclusiv rezultate individuale, valori medii și DS);
Solubility of the chemical at 250 mg/ml in HBSS should be assessed prior to testing.
Clasificarea (clasificările) derivată(e), cu trimitere la modelul predictiv și/sau criteriile de decizie utilizate;
If at this concentration the chemical forms a stable suspension or emulsion (i.e. maintains uniformity and does not settle or separate into more than one phase) over 30 minutes, HBSS can still be used as solvent.
Trebui să includă considerații cu privire la un rezultat neconcludent (punctul 35: FL20> 100 mg/ml) și testarea suplimentară.
However, if the chemical is found to be insoluble in HBSS at this concentration, the use of other test methods instead of FL should be considered.
Concluzii
The use of light mineral oil as a solvent, in cases where the chemical is found to be insoluble in HBSS, should be considered with caution as there is not enough data available to conclude on the performance of the FL assay under such conditions.
Disponibil la: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev03/03files_e.html]
All chemicals to be tested are prepared in sterile calcium-containing (at a concentration of 1,0-1,8 mM), phenol red-free, HBSS from the stock solution, at five fixed concentrations diluted on a weight per volume basis: 1, 25, 100, 250 mg/ml and a neat or a saturated solution.
Capitolul B.5 din prezenta anexă, Toxicitate acută: iritație/ coroziune oculară
When testing a solid chemical, a very high concentration of 750 mg/ml should be included.
Disponibil la: [http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu
This concentration of chemical may have to be applied on the cells using a positive displacement pipette.
DIAGRAMA CELULELOR MDCK CULTIVATE PE O INSERȚIE CU MEMBRANĂ PENTRU METODA DE TESTARE FL
If the toxicity is found to be between 25 and 100 mg/ml, the following additional concentrations should be tested twice: 1, 25, 50, 75, 100 mg/ml.
Se cultivă un strat confluent de celule MDCK pe membrana semipermeabilă a unei inserții.
The FL20 value should be derived from these concentrations provided the acceptance criteria were met.
Se introduc inserțiile în godeurile plăcilor de microtitrare cu 24 de godeuri.
The test chemicals are applied to the confluent cell monolayers after removal of the cell culture medium and washing twice with sterile, warm (37 °C), calcium-containing (at a concentration of 1,0-1,8 mM), phenol red-free, HBSS.
Figură preluată din: Wilkinson, P.J.
Previously, the filters have been visually checked for any pre-existing damages that could be falsely attributed to potential incompatibilities with test chemicals.
Categoria I EPA
At least three replicates should be used for each concentration of the test chemical and for the controls in each run.
Substanțe chimice care produc implicație corozivă (distrugerea ireversibilă a țesutului ocular) sau corneană sau iritație care persistă mai mult de 21 de zile (2).
After 1 min of exposure at room temperature, the test chemical should be carefully removed by aspiration, the monolayer should be washed twice with sterile, warm (37 °C), calcium-containing (at a concentration of 1,0-1,8 mM), phenol red-free, HBSS, and the fluorescein leakage should be immediately measured.
Regulamentul CLP al UE
Concurrent negative (NC) and positive controls (PC) should be used in each run to demonstrate that monolayer integrity (NC) and sensitivity of the cells (PC) are within a defined historical acceptance range.
Poate fi estimată prin determinarea concentrației la care substanța chimică testată provoacă 20 % scurgere de fluoresceină prin stratul celular.
The suggested PC chemical is Brij 35 (CAS No. 9002-92-0) at 100 mg/ml.
Scurgere de fluoresceină
This concentration should give approximately 30 % fluorescein leakage (acceptable range 20-40 % fluorescein leakage, i.e. damage to cell layer).
Cantitatea de fluoresceină care trece prin stratul celular, măsurată cu ajutorul unui spectrofluorimetru.
The suggested NC chemical is calcium-containing (at a concentration of 1,0-1,8 mM), phenol red-free, HBSS (untreated, blank control).
GHS [Sistemul global armonizat de clasificare și etichetare a substanțelor chimice al Națiunilor Unite (ONU)]