natgillin/translations-raw huggingface dataset:
The solvent should be chosen to optimise the solubility of the test chemicals without adversely impacting the conduct of the assay, i.e. changing cell growth, affecting integrity of the test chemical, reacting with culture vessels, impairing the metabolic activation system.
În studiile fără citoB este necesar să se demonstreze că celulele în culturi s-au divizat, astfel încât o parte substanțială din celule examinate au efectuat diviziunea în timpul sau ulterior tratamentului cu substanța chimică de testat, în caz contrar existând riscul de producere a unor răspunsuri fals negative.
Well established solvents are water or dimethyl sulfoxide (DMSO).
Măsurarea dublării relative a populației (RPD) sau a creșterii relative a numărului de celule (RICC) se recomandă pentru estimarea activității citotoxice și citostatice a unui tratament (17) (68) (69) (70) (71) (a se vedea formulele din apendicele 2).
Generally organic solvents should not exceed 1 % (v/v).
În perioade de prelevare extinse (de exemplu, tratamente de 1,5-2 ori durata ciclului celular normal și recoltare după un ciclu celular normal de 1,52 ori suplimentar, conducând la perioade de prelevare mai mari cu de 3-4 ori durata ciclului celular normal în total, astfel cum sunt descrise la punctele 38 și 39), RPD ar putea subestima citotoxicitatea (71).
If cytoB is dissolved in DMSO, the total amount of organic solvent used for both the test chemical and cytoB should not exceed 1 % (v/v); otherwise, untreated controls should be used to ensure that the percentage of organic solvent has no adverse effect.
În aceste circumstanțe, RICC ar putea fi o măsură mai potrivită sau evaluarea citotoxicității după o perioadă de 1,5-2 ori durata ciclului celular normal ar fi o estimare utilă.
Aqueous solvents (saline or water) should not exceed 10 % (v/v) in the final treatment medium.
Evaluarea altor markeri de citotoxitate sau citostază (de exemplu, integritatea celulară, apoptoză, necroză, numărarea celulelor în metafază, indicele de proliferare (PI), ciclul celular, punțile nucleoplasmice sau mugurii nucleari) ar putea furniza informații suplimentare utile, dar nu trebuie să înlocuiască nici RPD, nici RICC.
If other than well-established solvents are used (e.g. ethanol or acetone), their use should be supported by data indicating their compatibility with the test chemical, the test system and their lack of genetic toxicity at the concentration used.
Utilizarea de culturi unice este deosebit de relevantă atunci când se evaluează mai mult de 3 concentrații (a se vedea punctele 44-45).
In the absence of that supporting data, it is important to include untreated controls (see Appendix 1), as well as solvent controls to demonstrate that no deleterious or chromosomal effects (e.g. aneuploidy or clastogenicity) are induced by the chosen solvent.
Rezultatele obținute din culturi replici independente la o anumită concentrație pot fi reunite în vederea analizei datelor.
Use of cytoB as a cytokinesis blocker
În prezența citotoxicității, concentrațiile de testat selectate trebuie să acopere o plajă de valori de la producerea citotoxicității astfel cum este descris la punctul 29 și să includă concentrații la care există citotoxicitate moderată și ușoară sau nu există citotoxicitate.
One of the most important considerations in the performance of the MNvit test is ensuring that the cells being scored have completed mitosis during the treatment or the post-treatment incubation period, if one is used.
Multe substanțe chimice de testat prezintă curbe concentrație-răspuns cu pante puternice, iar pentru a obține date la un nivel scăzut și moderat de citotoxicitate sau pentru a studia în detaliu relația doză-răspuns, va fi necesară utilizarea concentrațiilor cu spațiu de separare redus și/sau mai mult de trei concentrații (culturi unice sau replici), în special în situațiile în care este necesară repetarea experimentului (a se vedea punctul 60).
Micronucleus scoring, therefore, should be limited to cells that have gone through mitosis during or after treatment.
În cazul în care concentrația maximă se bazează pe citotoxicitate, cea mai mare concentrație trebuie să vizeze atingerea unui nivel de citotoxicitate 55 ± 5 % utilizând parametrii de citotoxicitate recomandați (și anume, reducerea RICC și RPD pentru linii celulare atunci când nu se utilizează citoB și reducerea CBPI sau RI atunci când se utilizează citoB la 45 ± 5 % a martorului negativ testat în paralel) (72).
CytoB is the agent that has been most widely used to block cytokinesis because it inhibits actin assembly, and thus prevents separation of daughter cells after mitosis, leading to the formation of binucleate cells (6) (66) (67).
Se acordă atenție deosebită interpretării rezultatelor pozitive care se găsesc numai la limita superioară a acestei plaje de valori de toxicitate de 55 ± 5 % (71).
The effect of the test chemical on cell proliferation kinetics can be measured simultaneously, when cytoB is used.
Chiar dacă se manifestă citototoxicitate la un nivel sub concentrația minimă de insolubilitate, se recomandă testarea la o singură concentrație care produce turbiditate sau cu un precipitat vizibil deoarece pot rezulta efecte date de artefacte din precipitat.
CytoB should be used as a cytokinesis blocker when human lymphocytes are used because cell cycle times will be variable among donors and because not all lymphocytes will respond to PHA stimulation.
În cazul în care nu se constată citotoxicitate sau precipitat, concentrația maximă de testare trebuie să corespundă cu 10 mM, 2 mg/ml sau 2 μl/ml, fiind reținută cea mai mică valoare (73) (74) (75).
CytoB is not mandatory for other cell types if it can be established they have undergone division as described in paragraph 27.
În cazul în care substanța chimică de testat nu are o compoziție definită, de exemplu, o substanță cu compoziție necunoscută sau variabilă, produse de reacție complexă sau materii biologice (UVCB) (76), extract de mediu etc., concentrația maximă ar trebui să fie mai mare (de exemplu, 5 mg/ml) în absența citotoxicității suficiente, pentru a crește concentrația fiecărei componente.
Moreover CytoB is not generally used when samples are evaluated for micronuclei using flow cytometric methods.
Cu toate acestea, trebuie remarcat faptul că aceste cerințe pot fi diferite de cele pentru produsele farmaceutice umane (93).
The appropriate concentration of cytoB should be determined by the laboratory for each cell type to achieve the optimal frequency of binucleate cells in the solvent control cultures and should be shown to produce a good yield of binucleate cells for scoring.
La fiecare moment de recoltare se includ martori negativi testați în paralel (a se vedea punctul 21) constituiți dintr-un solvent singur în mediul de tratare și care se tratează în aceleași condiții precum culturile de tratare.
The appropriate concentration of cytoB is usually between 3 and 6 μg/ml (19).
Martorii pozitivi testați în paralel sunt necesari pentru a demonstra abilitatea laboratorului în identificarea substanțelor clastogene și aneugene în condițiile prevăzute în protocolul de testare utilizat și eficacitatea sistemului exogen de activare metabolică (după caz).
When determining the highest test chemical concentration, concentrations that have the capability of producing artifactual positive responses, such as those producing excessive cytotoxicity (see paragraph 29), precipitation in the culture medium (see paragraph 30), or marked changes in pH or osmolality (see paragraph 9), should be avoided.
Tabelul 1 de mai jos prezintă exemple de martori pozitivi.
Measurements of cell proliferation are made to assure that sufficient treated cells have undergone mitosis during the test and that the treatments are conducted at appropriate levels of cytotoxicity (see paragraph 29).
În prezent, niciun aneugen cunoscut nu necesită activare metabolică pentru a prezenta activitate genotoxică (17).
Cytotoxicity should be determined in the main experiment with and without metabolic activation using an appropriate indication of cell death and growth (see paragraphs 26 and 27).
Întrucât testele in vitro de genotoxicitate pe celule de mamifere sunt suficient de standardizate pentru tratamentele pe termen scurt efectuate concomitent cu și fără activare metabolică utilizând aceeași durată de tratament, utilizarea de martori pozitivi poate fi limitată la un clastogen care necesită activare metabolică.
While the evaluation of cytotoxicity in an initial preliminary test may be useful to better define the concentrations to be used in the main experiment, an initial test is not mandatory.
În acest caz, un singur rezultat clastogenic al martorului pozitiv va demonstra atât activitatea sistemului de activare metabolică, cât și capacitatea de reacție a sistemului de testare.
Treatment of cultures with cytoB and measurement of the relative frequencies of mononucleate, binucleate, and multi-nucleate cells in the culture provides an accurate method of quantifying the effect on cell proliferation and the cytotoxic or cytostatic activity of a treatment (6), and ensures that only cells that divided during or after treatment are microscopically scored.
Cu toate acestea, tratamentul de lungă durată (fără S9) necesită propriul martor pozitiv deoarece durata tratamentului va fi diferită față de testul care utilizează activare metabolică.
The cytokinesis-block proliferation index (CBPI) (6) (27) (68) or the Replication Index (RI) from at least 500 cells per culture (see Appendix 2 for formulas) are recommended to estimate the cytotoxic and cytostatic activity of a treatment by comparing values in the treated and control cultures.
În cazul în care un clastogen este selectat ca unicul martor pozitiv pentru tratamentul pe termen scurt cu și fără activare metabolică, se selectează un aneugen pentru tratamentul pe termen lung fără activare metabolică.
Assessment of other indicators of cytotoxicity (e.g. cell integrity, apoptosis, necrosis, metaphase counting, cell cycle) could provide useful information, but should not be used in place of CBPI or RI.
Martorii pozitivi atât pentru clastogenitate, cât și pentru aneugenitate se utilizează pentru celulele competente din punct de vedere metabolic care nu necesită S9.
In studies without cytoB, it is necessary to demonstrate that the cells in culture have divided, so that a substantial proportion of the cells scored have undergone division during or following treatment with the test chemical, otherwise false negative responses may be produced.
Fiecare martor pozitiv se utilizează în una sau mai multe concentrații susceptibile să determine creșteri reproductibile și detectabile ale frecvenței de fond pentru a demonstra sensibilitatea sistemului de testare (și anume, efectele sunt clare, dar nu dezvăluie imediat examinatorului identitatea lamelor codate) și rezultatul nu trebuie să fie compromis de citotoxicitatea care depășește limitele specificate în prezenta metoda de testare.
The measurement of Relative Population Doubling (RPD) or Relative Increase in Cell Count (RICC) is recommended to estimate the cytotoxic and cytostatic activity of a treatment (17) (68) (69) (70) (71) (see Appendix 2 for formulas).
Substanțe chimice de referință recomandate pentru evaluarea competenței de laborator și pentru selectarea de martori pozitivi
At extended sampling times (e.g. treatment for 1,5-2 normal cell cycle lengths and harvest after an additional 1,5-2 normal cell cycle lengths, leading to sampling times longer than 3-4 normal cell cycle lengths in total as described in paragraphs 38 and 39), RPD might underestimate cytotoxicity (71).
Aneugeni
Under these circumstances RICC might be a better measure or the evaluation of cytotoxicity after a 1,5-2 normal cell cycle lengths would be a helpful estimate.
Colchicină
Assessment of other markers for cytotoxicity or cytostasis (e.g. cell integrity, apoptosis, necrosis, metaphase counting, Proliferation index (PI), cell cycle, nucleoplasmic bridges or nuclear buds) could provide useful additional information, but should not be used in place of either the RPD or RICC.
Vinblastină
The use of single cultures is particularly relevant when more than 3 concentrations are assessed (see paragraphs 44-45).
Schema de tratament
The results obtained from the independent replicate cultures at a given concentration can be pooled for the data analysis.
Pentru a maximiza probabilitatea detectării unei acțiuni aneugene sau clastogene într-un stadiu specific al ciclului celular, este important ca un număr suficient de celule reprezentând toate etapele diferite ale ciclului celular să fie tratate cu substanța chimică de testat.
Where cytotoxicity occurs, the test concentrations selected should cover a range from that producing cytotoxicity as described in paragraph 29 and including concentrations at which there is moderate and little or no cytotoxicity.
Toate tratamentele trebuie să înceapă și să se încheie în timpul etapei de creștere exponențială a celulelor, iar celulele trebuie să continue să crească până la momentul prelevării de probe.
If the maximum concentration is based on cytotoxicity, the highest concentration should aim to achieve 55 ± 5 % cytotoxicity using the recommended cytotoxicity parameters (i.e. reduction in RICC and RPD for cell lines when cytoB is not used, and reduction in CBPI or RI when cytoB is used to 45± 5 % of the concurrent negative control) (72).
În cazul limfocitelor, cea mai eficientă abordare constă în inițierea tratamentului cu substanța chimică de testat la 44-48 de ore după stimularea cu PHA, atunci când celulele se vor împărți asincron (6).
Care should be taken in interpreting positive results only found in the higher end of this 55 ± 5 % cytotoxicity range (71).
Datele publicate (19) indică faptul că majoritatea substanțelor aneugene și clastogene sunt detectate în urma unui tratament de scurtă durată, de 3 până la 6 ore, în prezența și în absența preparatului S9, urmat de îndepărtarea substanței chimice de testat și prelevarea de probe la un timp echivalent cu aproximativ de 1,5-2,0 ori durata ciclului celular normal de la inițierea tratamentului (7).
Even if cytotoxicity occurs above the lowest insoluble concentration, it is advisable to test at only one concentration inducing turbidity or with visible precipitate because artifactual effects may result from the precipitate.
Se recomandă expunerea celulelor la substanța de testat în prezența activării metabolice, timp de 3-6 ore, și prelevarea de probe după un timp echivalent cu aproximativ de 1,5-2,0 ori durata ciclului celular normal de la inițierea tratamentului (19),
If no precipitate or limiting cytotoxicity is observed, the highest test concentration should correspond to 10 mM, 2 mg/ml or 2 μl/ml, whichever is the lowest (73) (74) (75).
Celulele se expun continuu fără activare metabolică până în momentul prelevării probelor după un timp echivalent cu aproximativ de 1,5-2,0 ori durata ciclului celular normal.
When the test chemical is not of defined composition, e.g. a substance of unknown or variable composition, complex reaction products or biological materials (UVCB) (76), environmental extract, etc., the top concentration may need to be higher (e.g. 5 mg/ml) in the absence of sufficient cytotoxicity, to increase the concentration of each of the components.
În cazul în care se cunoaște sau se presupune că substanța chimică de testat afectează durata ciclului celular (de exemplu, dacă se testează nucleotide analoage), în special pentru celule competente cu p53 (35) (36) (77), perioadele de prelevare sau recuperare pot fi extinse cu o perioadă suplimentară de 1,5-2,0 ori durata ciclului celular normal (și anume, totalul de 3,0 până la 4,0 ori durata ciclului celular după inițierea tratamentelor pe termen scurt și pe termen lung).
It should be noted however that these requirements may differ for human pharmaceuticals (93).
Aceste opțiuni vizează situațiile în care pot exista preocupări referitoare la posibilele interacțiuni dintre substanța chimică de testat și citoB.
Concurrent negative controls (see paragraph 21), consisting of solvent alone in the treatment medium and processed in the same way as the treatment cultures, should be included for every harvest time.
În cazul în care se utilizează perioade extinse de prelevare (și anume, timp total de cultură de 3,0 până la 4,0 ori durata ciclului celular), se acordă atenție deosebită pentru a se asigura că celulele sunt încă în diviziune activă.
Concurrent positive controls are needed to demonstrate the ability of the laboratory to identify clastogens and aneugens under the conditions of the test protocol used and the effectiveness of the exogenous metabolic activation system (when applicable).
De exemplu, în cazul limfocitelor, creșterea exponențială poate să intre în declin la 96 de ore după stimulare și culturile monostrat de celule ar putea deveni confluente.
Examples of positive controls are given in Table 1 below.
În tabelul 2 se rezumă schemele de tratament celular propuse.
At the present time, no aneugens are known that require metabolic activation for their genotoxic activity (17).
Aceste scheme de tratament generale pot fi modificate (și trebuie justificate) în funcție de stabilitatea sau de reactivitatea substanței chimice de testat sau de caracteristicile de creștere particulare ale celulelor utilizate.
Because in vitro mammalian cell tests for genetic toxicity are sufficiently standardised for the short-term treatments done concurrently with and without metabolic activation using the same treatment duration, the use of positive controls may be confined to a clastogen requiring metabolic activation.
Tratamentul celulelor și timpii de recoltă pentru testul MNvit
In this case a single clastogenic positive control response will demonstrate both the activity of the metabolic activation system and the responsiveness of the test system.
Limfocite, celule primare și linii celulare tratate cu citoB
However, long term treatment (without S9) should have its own positive control, as the treatment duration will differ from the test using metabolic activation.
Tratament de scurtă durată
If a clastogen is selected as the single positive control for short-term treatment with and without metabolic activation, an aneugen should be selected for the long-term treatment without metabolic activation.
Se tratează timp de 3-6 ore în prezența S9;
Positive controls for both clastogenicity and aneugenicity should be used in metabolically competent cells that do not require S9.
se înlătură S9 și mediul de tratare;
Each positive control should be used at one or more concentrations expected to give reproducible and detectable increases over background in order to demonstrate the sensitivity of the test system (i.e. the effects are clear but do not immediately reveal the identity of the coded slides to the reader), and the response should not be compromised by cytotoxicity exceeding the limits specified in this test method.
se adaugă mediu proaspăt și citoB;
Reference chemicals recommended for assessing laboratory proficiency and for the selection of positive controls
se recoltează timp de 1,5-2,0 cicluri celulare normale după inițierea tratamentului.
Aneugens
Se tratează timp de 3-6 ore;
Colchicine
se înlătură mediul de tratare;
Vinblastine
Tratament pe perioadă avansată
Treatment Schedule
Se tratează timp de 1,5-2 cicluri celulare normale în prezența citoB;
In order to maximise the probability of detecting an aneugen or clastogen acting at a specific stage in the cell cycle, it is important that sufficient numbers of cells representing all of the various stages of their cell cycles are treated with the test chemical.
se recoltează la sfârșitul perioadei de tratament.
All treatments should commence and end while the cells are growing exponentially and the cells should continue to grow up to the time of sampling.
Linii celulare tratate fără citoB
The treatment schedule for cell lines and primary cell cultures may, therefore, differ somewhat from that for lymphocytes which require mitogenic stimulation to begin their cell cycle (17).
(Schemă de tratament identică cu schemele de tratament descrise mai sus, cu excepția faptului că nu se adaugă citoB)
For lymphocytes, the most efficient approach is to start the treatment with the test chemical at 44-48 hours after PHA stimulation, when cells will be dividing asynchronously (6).
Pentru culturile monostrat, celule mitotice (recunoscute după forma rotundă a acestora și după faptul că se detașează de pe suprafață) pot fi prezente la sfârșitul perioadei de tratament de 3-6 ore.
Published data (19) indicate that most aneugens and clastogens will be detected by a short term treatment period of 3 to 6 hours in the presence and absence of S9, followed by removal of the test chemical and sampling at a time equivalent to about 1,5 - 2,0 normal cell cycle lengths after the beginning of treatment (7).
În cazul în care există dovezi privind o creștere substanțială a numărului de celule mitotice în comparație cu martorii, indicând probabil inhibarea fazei mitotice, celulele se colectează prin centrifugare și se adaugă înapoi la culturi pentru a evita pierderea de celule în mitoză și a celor cu risc de micronuclee/ aberație cromozomială la momentul recoltării.
However, for thorough evaluation, which would be needed to conclude a negative outcome, all three following experimental conditions should be conducted using a short term treatment with and without metabolic activation and long term treatment without metabolic activation (see paragraphs 56, 57 and 58): Cells should be exposed to the test chemical without metabolic activation for 3-6 hours, and sampled at a time equivalent to about 1,5 - 2,0 normal cell cycle lengths after the beginning of treatment (19),
Recoltarea celulelor și pregătirea lamelor
Cells should be exposed to the test chemical with metabolic activation for 3-6 hours, and sampled at a time equivalent to about 1,5 - 2,0 normal cell cycle lengths after the beginning of treatment (19),
Fiecare cultură se recoltează și se prelucrează în mod separat.
Cells should be continuously exposed without metabolic activation until sampling at a time equivalent to about 1,5 - 2,0 normal cell cycle lengths.
Prepararea celulelor poate implica tratament hipotonic, dar această etapă nu este necesară dacă celulele sunt răspândite în mod corespunzător în alt mod.
If it is known or suspected that the test chemical affects the cell cycling time (e.g. when testing nucleoside analogues), especially for p53 competent cells (35) (36) (77), sampling or recovery times may be extended by up to a further 1,5 - 2,0 normal cell cycle lengths (i.e. total 3,0 to 4,0 cell cycle lengths after the beginning of short-term and long-term treatments).
Pot fi utilizate diferite tehnici pentru prepararea lamelor, cu condiția ca preparatele celulare obținute pentru examinare să fie de foarte bună calitate.
These options address situations where there may be concern regarding possible interactions between the test chemical and cytoB.
Celulele cu membrană celulară intactă și cu citoplasmă intactă se păstrează pentru a permite detectarea de micronuclee și ( în metoda de blocare a citocinezei) identificarea fiabilă a celulelor binucleate.
When using extended sampling times (i.e. total 3,0 to 4,0 cell cycle lengths culture time), care should be taken to ensure that the cells are still actively dividing.
Lamele pot fi colorate prin metode diferite precum Giemsa sau coloranți fluorescenți specifici ai ADN.
For example, for lymphocytes exponential growth may be declining at 96 hours following stimulation and monolayer cultures of cells may become confluent.
Utilizarea unor coloranți fluorescenți adecvați [de exemplu, oranj de acridină (78) sau Hoechst 33258 plus pironină-Y (79)] poate elimina o parte dintre artefactele asociate utilizării unui colorant nespecifice al ADN.