natgillin/translations-raw huggingface dataset:
However, it may also potentially contribute to the assessment of sensitising potency (11) when used in integrated approaches such as IATA.
Incubarea substanței chimice de testat cu soluțiile de peptidă lizină și cisteină
However further work, preferably based on human data, is required to determine how DPRA results may possibly inform potency assessment.
Soluțiile de peptidă cisteină și lizină se incubează în flacoane de sticlă cu autoprelevare de probe cu substanța chimică de testat la raport 1:10 și, respectiv, 1:50.
The DPRA is an in chemico method which quantifies the remaining concentration of cysteine- or lysine-containing peptide following 24 hours incubation with the test chemical at 25 ± 2,5 °C.
Dacă se observă un precipitat imediat după adăugarea soluției de substanță chimică de testat în soluția de peptidă din cauza gradului redus de solubilitate în apă a substanței chimice de testat, atunci nu se poate cunoaște în mod sigur cantitatea de substanță chimică de testat rămasă în soluție pentru a reacționa cu peptida.
The synthetic peptides contain phenylalanine to aid in the detection.
Prin urmare, într-un astfel de caz, un rezultat pozitiv ar putea fi încă utilizat, dar un rezultat negativ este incert și se interpretează cu prudență [a se vedea, de asemenea, prevederile de la punctul 11 pentru testarea substanțelor chimice care nu sunt solubile până la o concentrație de 100 mM].
Relative peptide concentration is measured by high-performance liquid chromatography (HPLC) with gradient elution and UV detection at 220 nm.
Soluția de reacție se lasă la întuneric, la 25 ± 2,5 °C, timp de 24±2 ore, înainte de a efectua analiza HPLC.
Cysteine- and lysine peptide percent depletion values are then calculated and used in a prediction model (see paragraph 29) which allows assigning the test chemical to one of four reactivity classes used to support the discrimination between sensitisers and non-sensitisers.
Fiecare substanță chimică de testat se analizează în triplicat pentru ambele peptide.
Prior to routine use of the method described in this test method, laboratories should demonstrate technical proficiency, using the ten proficiency substances listed in Appendix 2.
Probele se inspectează vizual înainte de analiza HPLC.
This test method is based on the DPRA DB-ALM protocol no 154 (20) which represents the protocol used for the EURL ECVAM-coordinated validation study.
În cazul în care se observă un precipitat sau o separare a fazelor, probele se pot supune centrifugării la viteză redusă (100-400xg) pentru a forța precipitatul la fundul flaconului ca măsură de precauție, deoarece cantitățile mari de precipitat pot bloca tuburile sau coloanele HPLC.
It is recommended that this protocol is used when implementing and using the method in the laboratory.
În cazul în care se observă un precipitat sau o separare a fazelor după perioada de incubație, depleția peptidei ar putea fi subestimată, iar o concluzie privind lipsa de reactivitate nu poate fi stabilită cu suficientă încredere în cazul unui rezultat negativ.
The following is a description of the main components and procedures for the DPRA.
Pregătirea curbei standard de etalonare HPLC
If an alternative HPLC set-up is used, its equivalence to the validated set-up described in the DB-ALM protocol should be demonstrated (e.g. by testing the proficiency substances in Appendix 2).
Se generează o curbă de etalonare standard atât pentru peptida cisteină, cât și pentru cea lizină.
Preparation of the cysteine or lysine-containing peptides
Standardele de peptide se prepară într-o soluție de 20 % sau 25 % acetonitril: se tamponează utilizând soluție tampon fosfată (pH 7,5) pentru peptida cisteină și soluția tampon de acetat de amoniu (pH 10,2) pentru peptida lizină.
Stock solutions of cysteine (Ac-RFAACAA-COOH) and lysine (Ac-RFAAKAA-COOH) containing synthetic peptides of purity higher than 85 % and preferably in the range of 90-95 %, should be freshly prepared just before their incubation with the test chemical.
Utilizând standarde de diluție în serie a soluției mamă de peptidă (0,667 mM), se prepară 6 soluții de calibrare pentru a acoperi plaja de valori de la 0,534 până la 0,0167 mM.
The final concentration of the cysteine peptide should be 0,667 mM in pH 7,5 phosphate buffer whereas the final concentration of the lysine peptide should be 0,667 mM in pH 10,2 ammonium acetate buffer.
Un martor al tamponului de diluție se include, de asemenea, în curba standard de etalonare.
The HPLC run sequence should be set up in order to keep the HPLC analysis time less than 30 hours.
Curbele de etalonare corespunzătoare trebuie să aibă r2> 0,99.
For the HPLC set up used in the validation study and described in this test method, up to 26 analysis samples (which include the test chemical, the positive control and the appropriate number of solvent controls based on the number of individual solvents used in the test, each tested in triplicate), can be accommodated in a single HPLC run.
Pregătirea și analiza HPLC
All of the replicates analysed in the same run should use the identical cysteine and lysine peptide stock solutions.
Caracterul adecvat al sistemului HPLC se verifică înainte de efectuarea analizei.
It is recommended to prove individual peptide batches for proper solubility prior to their use.
Depleția de peptidă este monitorizată prin HPLC cuplată cu un detector UV (detector cu grup de fotodiode sau detector cu lungime de undă fixă de absorbanță cu un semnal de 220 nm).
Preparation of the test chemical
Coloana corespunzătoare este instalată în sistemul HPLC.
Solubility of the test chemical in an appropriate solvent should be assessed before performing the assay following the solubilisation procedure described in the DPRA DB-ALM protocol (20).
Dispozitivul HPLC descris în protocoalele validate utilizează, de preferință, o coloană Zorbax SB-C-18 2,1 mm x 100 mm x 3,5 microni.
An appropriate solvent will dissolve the test chemical completely.
În cazul în care dimerizarea pare să fi avut loc, acest lucru se menționează întrucât procentul de depleție de peptidă poate fi supraestimat, ceea ce conduce la estimări fals pozitive și/sau încadrarea într-o clasă de reactivitate mai ridicată (a se vedea punctele 29 și 30).
Since in the DPRA the test chemical is incubated in large excess with either the cysteine or the lysine peptides, visual inspection of the forming of a clear solution is considered sufficient to ascertain that the test chemical (and all of its components in the case of testing a multi-constituent substance or a mixture) is dissolved.
Analiza HPLC pentru peptidele cisteină și lizină poate fi efectuată simultan (în cazul în care sunt disponibile două sisteme HPLC) sau în zile diferite.
Cinnamic aldehyde (CAS 104-55-2; ≥ 95 % food-grade purity) should be used as positive control (PC) at a concentration of 100 mM in acetonitrile.
valoarea medie a procentului de depleție de peptidă a celor trei duplicate pentru aldehida cinamică martor pozitiv trebuie să fie cuprins între 60,8 % și 100 % pentru peptida cisteină și între 40,2 % și 69,0 % pentru peptida lizină, iar deviația standard maximă (DS) pentru duplicatele martor pozitiv trebuie să fie <14,9 % pentru procentul de depleție de cisteină și <11,6 % pentru procentul de depleție de lizină și
Other suitable positive controls preferentially providing mid-range depletion values may be used if historical data are available to derive comparable run acceptance criteria.
concentrația medie de peptidă a martorilor de referință A trebuie să fie de 0,50± 0,05 mM și coeficientul de variație (CV) a ariile picurilor peptidei celor nouă martori de referință B și C în acetonitril trebuie să fie < 15,0 %.
In addition, reference controls (i.e. samples containing only the peptide dissolved in the appropriate solvent) should also be included in the HPLC run sequence and these are used to verify the HPLC system suitability prior to the analysis (reference controls A), the stability of the reference controls over time (reference controls B) and to verify that the solvent used to dissolve the test chemical does not impact the percent peptide depletion (reference controls C) (see Appendix 3).
În cazul în care unul sau mai multe dintre aceste criterii nu este îndeplinit, determinarea se repetă.
The appropriate reference control for each chemical is used to calculate the percent peptide depletion for that chemical (see paragraph 26).
Următoarele criterii trebuie îndeplinite pentru ca rezultatele unei substanțe chimice de testat să fie considerate valabile:
In addition a co-elution control constituted by the test chemical alone for each of the test chemicals analysed should be included in the run sequence to detect possible co-elution of the test chemical with either the lysine or the cysteine peptide.
deviația standard maximă pentru probele duplicat ale substanței chimice de testat trebuie să fie <14,9 % pentru procentul de depleție de cisteină și <11,6 % pentru procentul de depleție de lizină,
Incubation of the test chemical with the cysteine and lysine peptide solutions
concentrația medie de peptidă a celor trei martori de referință C în solvent adecvat trebuie să fie de 0,50±0,05 nM.
Cysteine and lysine peptide solutions should be incubated in glass autosampler vials with the test chemical at 1:10 and 1:50 ratio respectively.
În cazul în care aceste criterii nu sunt îndeplinite, datele se resping și determinarea se repetă pentru respectiva substanță chimică de testat.
If a precipitate is observed immediately upon addition of the test chemical solution to the peptide solution, due to low aqueous solubility of the test chemical, in this case one cannot be sure how much test chemical remained in the solution to react with the peptide.
Model predictiv
Therefore, in such a case, a positive result could still be used, but a negative result is uncertain and should be interpreted with due care (see also provisions in paragraph 11 for the testing of chemicals not soluble up to a concentration of 100 mM).
Valoarea medie a procentului de depleție de cisteină și lizină se calculează pentru fiecare substanță chimică de testat.
The reaction solution should be left in the dark at 25 ± 2,5 °C for 24 ± 2 hours before running the HPLC analysis.
Depleția negativă este considerată ca fiind „0” atunci când se calculează valoarea medie.
Each test chemical should be analysed in triplicate for both peptides.
Prin utilizarea modelului predictiv cisteină 1: 10/lizină 1: 50 prezentat în tabelul 1, pragul de 6,38 % de depleție medie de peptidă se utilizează pentru a sprijini diferențierea între substanțele sensibilizante pentru piele și cele nesensibilizante în cadrul unei IATA.
Samples have to be visually inspected prior to HPLC analysis.
Aplicarea modelului predictiv pentru încadrarea unei substanțe chimice de testat într-o clasă de reactivitate (de exemplu, reactivitate redusă, moderată și ridicată) se poate dovedi utilă pentru a furniza informații cu privire la evaluarea potenței în cadrul unei IATA.
If a precipitate or phase separation is observed, samples may be centrifuged at low speed (100-400 xg) to force precipitate to the bottom of the vial as a precaution since large amounts of precipitate may clog the HPLC tubing or columns.
Model predictiv cisteină 1:10/lizină 1:50 [14]
If a precipitation or phase separation is observed after the incubation period, peptide depletion may be underestimated and a conclusion on the lack of reactivity cannot be drawn with sufficient confidence in case of a negative result.
Valoarea medie a % de depleție de cisteină și lizină
Preparation of the HPLC standard calibration curve
Clasa de reactivitate
A standard calibration curve should be generated for both the cysteine and the lysine peptides.
Estimare DPRA [15]
Peptide standards should be prepared in a solution of 20 % or 25 % acetonitrile:buffer using phosphate buffer (pH 7,5) for the cysteine peptide and ammonium acetate buffer (pH 10,2) for the lysine peptide.
0 % ≤ % depleție medie ≤ 6,38 %
Using serial dilution standards of the peptide stock solution (0,667 mM), 6 calibration solutions should be prepared to cover the range from 0,534 to 0,0167 mM.
Reactivitatea zero sau minimă
A blank of the dilution buffer should also be included in the standard calibration curve.
Negativ
Suitable calibration curves should have an r2 > 0,99.
6,38 % < % depleție medie ≤ 22,62 %
HPLC preparation and analysis
Reactivitate scăzută
The suitability of the HPLC system should be verified before conducting the analysis.
Pozitiv
Peptide depletion is monitored by HPLC coupled with an UV detector (photodiode array detector or fixed wavelength absorbance detector with 220 nm signal).
22,62 % < % depleție medie ≤ 42,47 %
The appropriate column is installed in the HPLC system.
Reactivitate moderată
The HPLC set-up described in the validated protocol uses a Zorbax SB-C-18 2,1 mm × 100 mm × 3,5 micron as preferred column.
42,47 % < % depleție medie ≤ 100 %
With this reversed-phase HPLC column, the entire system should be equilibrated at 30 °C with 50 % phase A (0,1 % (v/v) trifluoroacetic acid in water) and 50 % phase B (0,085 % (v/v) trifluoroacetic acid in acetonitrile) for at least 2 hours before running.
Reactivitate ridicată
The HPLC analysis should be performed using a flow rate of 0,35 ml/min and a linear gradient from 10 % to 25 % acetonitrile over 10 minutes, followed by a rapid increase to 90 % acetonitrile to remove other materials.
Pot exista cazuri în care substanța chimică de testat (substanța sau unul sau mai multe dintre componentele unei substanțe multicomponentă sau un amestec) absoarbe în mod semnificativ la 220 nm și are același timp de retenție ca peptida (coeluție).
Equal volumes of each standard, sample and control should be injected.
Coeluția poate fi soluționată printr-o ușoară ajustare a dispozitivului HPLC pentru a separa în continuare timpul de eluție al substanței chimice de testat și al peptidei.
The column should be re-equilibrated under initial conditions for 7 minutes between injections.
În cazul în care se utilizează alt dispozitiv HPLC pentru a încerca soluționarea coeluției, este necesară demonstrarea echivalenței acestuia cu dispozitivul validat (de exemplu, prin testarea substanțelor de verificare din apendicele 2).
If a different reversed-phase HPLC column is used, the set-up parameters described above may need to be adjusted to guarantee an appropriate elution and integration of the cysteine and lysine peptides, including the injection volume, which may vary according to the system used (typically in the range from 3-10 μl).
Atunci când se produce coeluția, picul peptidei nu poate fi integrat și calcularea procentului de depleție a peptidei nu este posibilă.
Importantly, if an alternative HPLC set-up is used, its equivalence to the validated set-up described above should be demonstrated (e.g. by testing the proficiency substances in Appendix 2).
În cazul în care coeluția unor astfel de substanțe chimice de testat se produce cu peptidele cisteină și lizină, analiza se raportează ca „neconcludentă”.
Absorbance is monitored at 220 nm.
În cazurile în care coeluția se produce numai cu peptida lizină, se poate utiliza modelul predictiv cisteină 1:10 raportat în tabelul 2.
If a photodiode array detector is used, absorbance at 258 nm should also be recorded.
Model predictiv cisteină 1:10 [16]
It should be noted that some supplies of acetonitrile could have a negative impact on peptide stability and this has to be assessed when a new batch of acetonitrile is used.
% de depleție de cisteină (cis)
The ratio of the 220 peak area and the 258 peak area can be used as an indicator of co-elution.
Clasa de reactivitate
For each sample a ratio in the range of 90 % < mean [13] area ratio of control samples < 100 % would give a good indication that co-elution has not occurred.
Estimare DPRA [17]
There may be test chemicals which could promote the oxidation of the cysteine peptide.
0 % ≤ % depleție cis ≤ 13,89 %
The peak of the dimerised cysteine peptide may be visually monitored.
23,09 % < % depleție cis ≤ 98,24 % Reactivitatea moderată 98,24 % < % depleție cis ≤ 100 % Reactivitate ridicată
If dimerisation appears to have occurred, this should be noted as percent peptide depletion may be over-estimated leading to false positive predictions and/or assignment to a higher reactivity class (see paragraphs 29 and 30).
Substanță mono-constituent
HPLC analysis for the cysteine and lysine peptides can be performed concurrently (if two HPLC systems are available) or on separate days.
Identificare chimică, precum denumirea (denumirile) IUPAC sau CAS, numărul (numerele) SMILES sau codul InChI, formula structurală și/sau alți identificatori;
If analysis is conducted on separate days then all test chemical solutions should be freshly prepared for both assays on each day.
Identificare chimică, precum denumirea (denumirile) IUPAC sau CAS, numărul (numerele) SMILES sau codul InChI, formula structurală și/sau alți identificatori;
The analysis should be timed to assure that the injection of the first sample starts 22 to 26 hours after the test chemical was mixed with the peptide solution.
Puritatea, identitatea chimică a impurităților, după cum este adecvat și fezabil din punct de vedere practic etc.;
For the HPLC set up used in the validation study and described in this test method, up to 26 analysis samples can be accommodated in a single HPLC run (see also paragraph 17).
Tratamentul înainte de efectuarea testului, dacă este cazul (de exemplu, încălzire, măcinare);
An example of HPLC analysis sequence is provided in Appendix 3.
Concentrația (concentrațiile) testată(e);
Data evaluation
Condițiile de depozitare și stabilitatea, în măsura în care este posibil.
The concentration of cysteine or lysine peptide is photometrically determined at 220 nm in each sample by measuring the peak area (area under the curve, AUC) of the appropriate peaks and by calculating the concentration of peptide using the linear calibration curve derived from the standards.
substanță multicomponentă, UVCB și amestec:
The percent peptide depletion is determined in each sample by measuring the peak area and dividing it by the mean peak area of the relevant reference controls C (see Appendix 3) according to the formula described below.
Caracterizarea, în măsura în care este posibil, de exemplu identitatea chimică (a se vedea mai sus), puritatea, apariția cantitativă și proprietățile fizico-chimice relevante (a se vedea mai sus) ale componentelor, în măsura în care este posibil;
Percent peptide depletion
Caracterizarea, în măsura în care este posibil, de exemplu, identitatea chimică (a se vedea mai sus), puritatea, apariția cantitativă și proprietățile fizico-chimice relevante (a se vedea mai sus) ale componentelor, în măsura în care este posibil;
Peptide peak area in replicate injection
Masa moleculară sau masa moleculară aparentă în cazul amestecurilor/polimerilor cu compoziții cunoscute sau alte informații relevante pentru efectuarea studiului;
ean peptide peak area in reference controls C
Condițiile de depozitare și stabilitatea, în măsura în care este posibil;
Acceptance criteria
Trimitere la rezultatele anterioare ale martorilor pozitivi care să demonstreze criterii adecvate de acceptare a determinării, dacă este cazul.
the mean peptide concentration of the three reference controls C in the appropriate solvent should be 0,50 ± 0,05 mM.
Caracterizarea soluțiilor de peptidă (furnizor, lot, greutatea exactă a peptidei, volumul de soluție mamă adăugat);
Prediction model
Caracterizarea soluțiilor de substanță chimică de testat (greutatea exactă a substanței chimice de testat, volumul de soluție de testat adăugat).
The mean percent cysteine and percent lysine depletion value is calculated for each test chemical.
Reglajele instrumentelor și analiza HPLC
Negative depletion is considered as “0” when calculating the mean.
Tipul de instrument HPLC, coloane HPLC și de protecție, detector, dispozitiv cu prelevare automată a probelor;
By using the cysteine 1:10/lysine 1:50 prediction model shown in Table 1, the threshold of 6,38 % average peptide depletion should be used to support the discrimination between skin sensitisers and non-sensitisers in the framework of an IATA.
Adecvarea sistemului
Application of the prediction model for assigning a test chemical to a reactivity class (i.e. low, moderate and high reactivity) may perhaps prove useful to inform potency assessment within the framework of an IATA.
Aria picului peptidei la 220 nm a fiecărui replicat standard și martor de referință A;
Cysteine 1:10/lysine 1:50 prediction model [14]
Curbă de etalonare liniară reprezentată grafic și r2 raportată;
Mean of cysteine and lysine % depletion
Concentrația de peptidă a fiecărui replicat de martor de referință A;
Reactivity Class
Concentrația medie de peptidă (mM) a celor trei martori de referință, DS și CV;
DPRA Prediction [15]
Concentrația de peptidă a martorilor de referință A și C.
0 % ≤ mean % depletion ≤ 6,38 %
Secvența de analiză
No or minimal reactivity
Pentru martorii de referință:
Negative
Aria picului de peptidă la 220 nm a fiecărui replicat B și C;
6,38 % < mean % depletion ≤ 22,62 %
Aria medie a picului de peptidă la 220 nm a celor nouă martori de referință B și C în acetonitril, DS și CV (pentru stabilitatea martorilor de referință pe timpul analizei);
Low reactivity
Pentru fiecare solvent utilizat, aria medie a picului de peptidă la 220 nm a celor trei martori de referință C corespunzători (pentru calcularea procentului de depleție de peptidă);
Positive
Pentru fiecare solvent utilizat, concentrația de peptidă (mM) a celor trei martori de referință corespunzători C;
22,62 % < mean % depletion ≤ 42,47 %
Pentru fiecare solvent utilizat, concentrația medie de peptidă (mM) a celor trei martori de referință corespunzători C, DS și CV.
Moderate reactivity
Pentru martorul pozitiv:
42,47 % < mean % depletion ≤ 100 %
Aria picului de peptidă la 220 nm a fiecărei replici;
High reactivity
Procentul de depleție de peptidă a fiecărei replici;
There might be cases where the test chemical (the substance or one or several of the components of a multi-constituent substance or a mixture) absorbs significantly at 220 nm and has the same retention time of the peptide (co-elution).
Procentul mediu de depleție a celor trei replici, DS și CV.
Co-elution may be resolved by slightly adjusting the HPLC set-up in order to further separate the elution time of the test chemical and the peptide.
Pentru fiecare substanță chimică de testat:
If an alternative HPLC set-up is used to try to resolve co-elution, its equivalence to the validated set-up should be demonstrated (e.g. by testing the proficiency substances in Appendix 2).
Aspectul precipitatului în amestecul de reacție la sfârșitul perioadei de incubație, dacă se observă.
When co-elution occurs the peak of the peptide cannot be integrated and the calculation of the percent peptide depletion is not possible.
Dacă precipitatul a fost resolubilizat sau centrifugat;
If co-elution of such test chemicals occurs with both the cysteine and the lysine peptides then the analysis should be reported as “inconclusive”.
Prezența coeluției;
In cases where co-elution occurs only with the lysine peptide, then the cysteine 1:10 prediction model reported in Table 2 can be used.
O descriere a oricăror alte observații relevante, dacă este cazul;
Cysteine 1:10 prediction model [16]
Procentul mediu de depleție de peptidă a celor trei replici, DS și CV;
Cysteine (Cys) % depletion
Valorile medii a procentului de depleție de cisteină și depleție de lizină;
Reactivity class
Modelul predictiv utilizat și estimarea DPRA.
DPRA prediction [17]
Verificarea competenței
0 % ≤ Cys % depletion ≤ 13,89 %
Dacă este cazul, procedura utilizată pentru a demonstra performanțele de laborator la efectuarea metodei de testare (de exemplu, prin testarea unor substanțe de verificare) sau pentru a demonstra performanța de reproductibilitate a metodei de testare în timp.
13,89 % < Cys % depletion ≤ 23,09 %
Discutarea rezultatelor
23,09 % < Cys % depletion ≤ 98,24 %
Discutarea rezultatelor obținute cu ajutorul metodei de testare DPRA;
98,24 % < Cys % depletion ≤ 100 %
Discutarea rezultatelor metodei de testare în contextul unei IATA, în cazul în care sunt disponibile alte informații relevante.