natgillin/translations-raw huggingface dataset:
At the selected sampling time(s), the tissues of interest are dissected and single cells/nuclei suspensions are prepared (in situ perfusion may be performed where considered useful e.g. liver) and embedded in soft agar so as to immobilize them on slides.
În acest caz, ar fi adecvat să se efectueze un studiu pe ambele sexe, de exemplu, ca parte dintr-un studiu de toxicitate la doze repetate.
Cells/nuclei are treated with lysis buffer to remove cellular and/or nuclear membrane, and exposed to strong alkali e.g. pH ≥13 to allow DNA unwinding and release of relaxed DNA loops and fragments.
Se stabilește dimensiunea grupurilor la începutul studiului (și în timpul stabilirii competenței) cu scopul de a furniza cel puțin 5 animale analizabile de același sex sau din fiecare sex, în cazul în care se utilizează ambele sexe, pentru fiecare grup (mai puțin pentru grupul martor pozitiv testat în paralel – a se vedea punctul 29).
The nuclear DNA in the agar is then subjected to electrophoresis.
Ca îndrumare pentru cerințe maxime tipice animalelor, un studiu efectuat în conformitate cu parametrii stabiliți la punctul 33 cu trei grupuri de dozare și martori pozitivi și negativi testați în paralel (fiecare grup compus din cinci animale de același sex) ar necesita între 25 și 35 de animale.
Normal non-fragmented DNA molecules remain in the position where the nuclear DNA had been in the agar, while any fragmented DNA and relaxed DNA loops would migrate towards the anode.
SCHEMĂ DE TRATAMENT
After electrophoresis, the DNA is visualized using an appropriate fluorescent stain.
Se administrează tratament zilnic animalelor timp de 2 sau mai multe zile (și anume, două sau mai multe tratamente la intervale de 24 de ore) și se colectează probe o dată la 2-6 h (sau la Tmax) după ultimul tratament (12).
Preparations should be analysed using a microscope and full or semi-automated image analysis systems.
Se acceptă probe provenite din regimuri de dozare prelungite (de exemplu, dozare zilnică timp de 28 de zile).
The extent of DNA that has migrated during electrophoresis and the migration distance reflects the amount and size of DNA fragments.
Combinarea cu succes a testul in vivo de micronucleu pe eritrocite cu testul Comet a fost demonstrată (10) (19).
There are several endpoints for the comet assay.
Cu toate acestea, trebuie acordată atenție deosebită logisticii implicate în prelevarea țesutului pentru analiza Comet, alături de cerințele de prelevare de țesuturi pentru alte tipuri de evaluări toxicologice.
The DNA content in the tail ( % tail DNA or % tail intensity) has been recommended to assess DNA damage (12) (40) (41) (42).
Recoltarea la 24 de ore după ultima doză, care este specifică pentru un studiu de toxicitate generală, nu este adecvată în majoritatea cazurilor (a se vedea punctul 40 cu privire la perioada de prelevare).
After analysis of a sufficient number of nuclei, the data are analysed with appropriate methods to judge the assay results.
Utilizarea altor scheme de tratament și prelevare se justifică (a se vedea apendicele 3).
It should be noted that altering various aspects of the methodology, including sample preparation, electrophoresis conditions, visual analysis parameters (e.g. stain intensity, microscope bulb light intensity, and use of microscope filters and camera dynamics) and ambient conditions (e.g. background lighting), have been investigated and may affect DNA migration (43) (44) (45) (46).
De exemplu, se poate utiliza tratament unic cu prelevare multiplă, cu toate acestea, se remarcă faptul că vor fi necesare mai multe animale pentru un studiu cu administrare unică din cauza necesității unor perioade de prelevare multiple, dar în unele cazuri acest lucru poate fi preferabil, de exemplu, atunci când substanța chimică de testat induce toxicitate excesivă în urma administrărilor repetate.
Each laboratory should establish experimental competency in the comet assay by demonstrating the ability to obtain single cell or nuclei suspensions of sufficient quality for each target tissue(s) for each species used.
Indiferent de modalitatea în care testul este efectuat, acesta este acceptabil atât timp cât substanța chimică de testat furnizează un răspuns pozitiv sau, în cazul unui studiu negativ, atât timp cât s-au demonstrat probe directe sau indirecte ale expunerii sau toxicității țesutului (țesuturilor) țintă sau în cazul în care doza limită a fost atinsă (a se vedea punctul 36).
The quality of the preparations will be evaluated firstly by the % tail DNA for vehicle treated animals falling within a reproducible low range.
Substanțele chimice de testat se pot administra, de asemenea, în doză fracționată, și anume două tratamente în aceeași zi la distanță de nu mai mult de 2-3 ore, pentru a facilita administrarea unui volum mare.
Current data suggest that the group mean % tail DNA (based on mean of medians — see paragraph 57 for details of these terms) in the rat liver should be preferably not exceed 6 %, which would be consistent with the values in the JaCVAM validation trial (12) and from other published and proprietary data.
În aceste condiții, perioada de prelevare a probelor se programează în funcție de ultima administrare a dozei (a se vedea punctul 40).
There are not enough data at this time to make recommendations about optimum or acceptable ranges for other tissues.
Doze
This does not preclude the use of other tissues if justified.
În cazul în care se efectuează un studiu preliminar de stabilire a dozelor din cauza faptului că nu există date adecvate disponibile din alte studii relevante pentru a contribui la selectarea dozei, acesta se efectuează în același laborator, utilizând aceeași specie, sușă, sex și regimul de tratament care urmează să fie utilizate în studiul principal, în conformitate cu abordările actuale pentru efectuarea de studii de stabilire a dozelor.
The test report should provide appropriate review of the performance of the comet assay in these tissues in relation to the published literature or from proprietary data.
Studiul trebuie să aibă ca obiectiv identificarea dozei maxime tolerate (DMT), definită ca doza care induce efecte toxice ușoare în raport cu durata perioadei de studiu (de exemplu, semne clinice clare precum comportament sau reacții anormale sau scăderea ușoară a greutății corporale sau citotoxicitate în țesutul țintă ), dar nu decesul sau semne de durere, suferință sau stres care necesită eutanasiere.
Firstly, a low range of % tail DNA in controls is desirable to provide sufficient dynamic range to detect a positive effect.
În cazul unei substanțe chimice de testat netoxică cu o perioadă de administrare de 14 zile sau mai mult, doza maximă (limită) este de 1000 mg/kg greutate corporală/zi.
Secondly, each laboratory should be able to reproduce expected responses for direct mutagens and pro-mutagens, with different modes of action as suggested in Table 1 (paragraph 29).
În cazul perioadelor de administrare de mai puțin de 14 zile, doza maximă (limită) este de 2000 mg/kg greutate corporală/zi.
Positive substances may be selected, for example from the JaCVAM validation trial (12) or from other published data (see paragraph 9), if appropriate, with justification, and demonstrating clear positive responses in the tissues of interest.
În cazul anumitor tipuri de substanțe chimice de testat (de exemplu, produsele farmaceutice umane) care fac obiectul unor reglementări specifice, aceste limite pot varia.
The ability to detect weak effects of known mutagens e.g. EMS at low doses, should also be demonstrated, for example by establishing dose-response relationships with appropriate numbers and spacing of doses.
Substanțele chimice care prezintă saturația proprietăților toxicocinetice sau care provoacă procese de detoxifiere care pot conduce la o diminuare a expunerii după administrare pe termen lung pot face excepție de la criteriile de stabilire a dozelor și se evaluează de la caz la caz.
Initial efforts should focus on establishing proficiency with the most commonly used tissues e.g. the rodent liver, where comparison with existing data and expected results may be made (12).
Atât pentru versiunea acută, cât și pentru cea subacută a testului Comet, în plus față de doza maximă (DMT, doza maximă posibilă, expunerea maximă sau doza limită), se selectează o serie derivată de cel puțin două doze suplimentare, spațiate în mod corespunzător (de preferință separate cu mai puțin de 10) pentru fiecare moment de prelevare pentru a demonstra răspunsuri legate de doză.
Data from other tissues e.g. stomach/duodenum/jejunum, blood etc. could be collected at the same time.
Cu toate acestea, dozele utilizate acoperă, de asemenea, de preferință, o plajă de valori de la valoarea maximă până la valoarea care provoacă toxicitate mică sau nu provoacă toxicitate.
The laboratory needs to demonstrate proficiency with each individual tissue in each species they are planning to study, and will need to demonstrate that an acceptable positive response with a known mutagen (e.g. EMS) can be obtained in that tissue.
Atunci când se observă toxicitate în țesutul țintă la toate dozele testate, se recomandă efectuarea unui studiu suplimentar la doze netoxice (a se vedea punctele 54-55).
Vehicle/negative control data should be collected so as to demonstrate reproducibility of negative data responses, and to ensure that the technical aspects of the assay were properly controlled or to suggest the need to re-establish historical control ranges (see paragraph 22).
Studiile care au ca scop investigarea suplimentară completă a formei curbei doză-răspuns pot necesita un grup (grupuri) de dozaj suplimentar(e).
It should be noted, that whilst multiple tissues can be collected at necropsy and processed for comet analysis, the laboratory needs to be proficient in harvesting multiple tissues from a single animal, thereby ensuring that any potential DNA lesion is not lost and comet analysis is not compromised.
Administrarea dozelor
The length of time from euthanasia to removal of tissues for processing may be critical (see paragraph 44).
În orice caz, calea se alege pentru a asigura expunerea adecvată a țesutului (țesuturilor) țintă.
Animal welfare must be considered whilst developing proficiency in this test and therefore tissues from animals used in other tests can be used when developing competence in the various aspects of the test.
Injecția intraperitoneală nu se recomandă, în general, deoarece nu este o cale tipică relevantă de expunere umană și se utilizează doar cu justificare specifică (de exemplu, unele substanțe martor pozitiv, în scop investigativ sau pentru anumite medicamente care se administrează pe calea intraperitoneală).
Furthermore, it may not be necessary to conduct a full study during the stages of establishing a new test method in a laboratory and fewer animals or test concentrations can be used when developing the necessary skills.
Volumul nu trebuie să depășească 1 ml/100 g greutate corporală, exceptând cazul soluțiilor apoase, când se pot utiliza 2 ml/100g greutate corporală.
During the course of the proficiency investigations, the laboratory should build a historical database to establish positive and negative control ranges and distributions for relevant tissues and species.
Se justifică utilizarea unor volume mai mari decât această valoare (dacă acest lucru este permis de legislația privind bunăstarea animalelor).
Recommendations on how to build and use the historical data (i.e. criteria for inclusion and exclusion of data in historical data and the acceptability criteria for a given experiment) can be found in the literature (47).
Ori de câte ori este posibil, se realizează diferite niveluri de dozare prin ajustarea concentrației formulei de dozare pentru a asigura un volum constant în raport cu greutatea corporală la toate nivelurile de dozare.
Different tissues and different species, as well as different vehicles and routes of administrations, may give different negative control % tail DNA values.
Prelevarea de probe
It is therefore important to establish negative control ranges for each tissue and species.
Prelevarea de probe este o variabilă esențială deoarece este determinată de perioada necesară pentru ca substanțele chimice de testat să atingă concentrația maximă în țesutul țintă și pentru provocarea întreruperilor lanțului ADN, dar înainte ca aceste întreruperi să fie îndepărtate, reparate sau să conducă la moarte celulară.
Laboratories should use quality control methods, such as control charts (e.g. C-charts or X-bar charts (48)), to identify how variable their data are, and to show that the methodology is ‘under control’ in their laboratory.
Persistența unor leziuni care conduc la întreruperile lanțului ADN detectate de testul Comet poate fi foarte scurtă, cel puțin în cazul unor substanțe chimice testate in vitro (52) (53).
Selection of appropriate positive control substances, dose ranges and experimental conditions (e.g. electrophoresis conditions) may need also to be optimised for the detection of weak effects (see paragraph 17).
Momentul (momentele) de prelevare optim(e) poate (pot) fi specific(e) substanței chimice sau căii de administrare, având ca rezultat, de exemplu, expunerea rapidă a țesutului cu administrare intravenoasă sau expunere prin inhalare.
Common laboratory strains of healthy young adult rodents (6-10 weeks old at start of treatment though slightly older animals are also acceptable) are normally used.
Se recomandă efectuarea și înregistrarea observațiilor clinice generale referitoare la sănătatea animalelor cel puțin o dată pe zi, de preferat la aceeași (aceleași) oră (ore) în fiecare zi, luând în considerare perioada de vârf a efectelor anticipate după administrare (54).
The choice of rodent species should be based on (i) species used in other toxicity studies (to be able to correlate data and to allow integrated studies), (ii) species that developed tumours in a carcinogenicity study (when investigating the mechanism of carcinogenesis), or (iii) species with the most relevant metabolism for humans, if known.
Cel puțin de două ori pe zi, se examinează toate animalele pentru a se determina morbiditatea sau mortalitatea.
Rats are routinely used in this test.
Pentru studii pe durată mai mare, se cântăresc toate animalele cel puțin o dată pe săptămână și la finalizarea perioadei de testare.
However, other species can be used if ethically and scientifically justified.
Se măsoară consumul de hrană la fiecare schimbare de alimente și cel puțin o dată pe săptămână.
For rodents, the temperature in the experimental animal room ideally should be 22 °C (± 3 °C).
Animalele care prezintă indicatori neletali de toxicitate excesivă se eutanasiază înaintea de finalizarea perioadei de testare și, în general, nu se utilizează pentru analiza Comet.
The relative humidity ideally should be 50-60 %, being at least 30 % and preferably not exceeding 70 % other than during room cleaning.
Colectarea de țesuturi
Rodents should be housed in small groups (usually no more than five) of the same sex if no aggressive behaviour is expected.
Întrucât este posibil să se studieze inducția întreruperilor lanțului ADN (comete) în aproape orice țesut, justificarea alegerii țesutului (țesuturilor) care urmează a fi colectat(e) trebuie să fie clar definită și să fie bazată la motivele efectuării studiului, împreună cu orice date ADME, de genotoxicitate, de carcinogenitate și alte date toxicologice existente referitoare la substanțele chimice de testat care fac obiectul studiului.
Solid floors should be used wherever possible as mesh floors can cause serious injury (49).
Factorii importanți de luat în considerare includ calea de administrare [pe baza căii (căilor) de expunere umană], distribuția și absorbția preconizată în țesuturi, rolul metabolismului și eventualele mecanisme de acțiune ale substanțelor chimice de testat.
Appropriate environmental enrichment must be provided.
Țesutul cel mai frecvent studiat a fost ficatul, pentru care există cele mai multe date.
Animals are randomly assigned to the control and treatment groups.
Prin urmare, în lipsa oricăror informații generale și în cazul în care nu se identifică anumite țesuturi de interes, prelevarea de probe din ficat ar fi justificată, având în vedere faptul că aceasta este un loc principal de metabolism xenobiotic și deseori este extrem de expus atât la substanța (substanțe) mamă, cât și la metabolit (metaboliți).
The animals are identified uniquely and acclimated to the laboratory conditions for at least five days before the start of treatment.
În unele cazuri, examinarea unui loc de contact direct (de exemplu, în cazul substanțelor chimice cu administrare orală, stomacul glandular sau duodenul/ jejunul sau în cazul substanțelor chimice inhalate, plămânii) poate fi cea mai relevantă.
The least invasive method of uniquely identifying animals must be used.
Se selectează țesuturi suplimentare sau alternative pe baza motivelor specifice pentru care se efectuează testul, dar examinarea de țesuturi multiple de la aceleași animale ar putea fi utilă, cu condiția ca laboratorul să fi demonstrat competența pentru țesuturile respective și competența în manipularea de țesuturi multiple în același timp.
Appropriate methods include ringing, tagging, micro-chipping and biometric identification.
Pregătirea specimenelor
Toe and ear clipping are not scientifically justified in these tests.
Pentru procesele descrise la punctele următoare (44-49), este important ca toate soluțiile sau suspensiile stabile să fie utilizate înainte de data expirării sau să fie proaspăt preparate, dacă este necesar.
Cages should be arranged in such a way that possible effects due to cage placement are minimized.
De asemenea, în următoarele paragrafe, timpii necesari pentru (i) îndepărtarea fiecărui țesut după necropsie, (ii) procesarea fiecărui țesut în suspensii celulare/de nuclee și (iii) procesarea suspensiei și pregătirea lamelor sunt considerați variabile critice (a se vedea secțiunea Definiții, apendicele 1) și trebuie să fi fost determinate intervale de timp acceptabile pentru fiecare dintre aceste etape în timpul stabilirii metodei și al demonstrării competențelor.
At the commencement of the study, the weight variation of animals should be minimal and not exceed ± 20 %.
Animalele vor fi eutanasiate în conformitate cu legislația aplicabilă privind bunăstarea animalelor și principiile celor 3R, la momentul (momentele) oportun(e) de la ultimul tratament cu substanța chimică de testat.
Solid test chemicals should be dissolved or suspended in appropriate vehicles or admixed in diet or drinking water prior to dosing of the animals.
Se înlătură și se disecă țesutul (țesuturile) selectat(e) și o parte se colectează pentru testul Comet, iar în același timp, se secționează o porțiune din aceeași parte de țesut și se introduce în soluție de formaldehidă sau într-un fixator adecvat pentru o posibilă analiză histopatologică (a se vedea punctul 55) în conformitate cu metodele standard (12).
For inhalation exposures, test chemicals can be administered as gas, vapour, or a solid/liquid aerosol, depending on their physicochemical properties (50) (51).
Se pune în tampon de mărunțire țesutul pentru testul Comet, se spală suficient în tampon de mărunțire rece pentru a îndepărta sângele rezidual și se depozitează în tampon de mărunțire răcit cu gheață până la procesare.
Vehicle
Se poate efectua, de asemenea, perfuzarea in situ, de exemplu, pentru ficat, rinichi.
The vehicle should not produce toxic effects at the dose volumes used, and should not be suspected of chemical reaction with the test chemicals.
Există mai multe metode publicate pentru izolarea celulelor/nucleelor.
If other than well-known vehicles are used, their inclusion should be supported with reference data indicating their compatibility in terms of test animals, route of administration and endpoint.
Printre acestea se numără mărunțirea țesuturilor precum ficatul și rinichii, răzuirea suprafețelor mucoase în cazul tractului gastrointestinal, omogenizarea și digestia enzimatică.
It should be noted that some vehicles (particularly viscous vehicles) can induce inflammation and increase background levels of DNA strand breaks at the site of contact, particularly with multiple administrations.
Studiul de validare JaCVAM a studiat numai celule izolate și, prin urmare, în ceea ce privește stabilirea metodei și posibilitatea de a face trimitere la datele generate de studiul JaCVAM pentru demonstrarea performanțelor, se preferă celule izolate.
At this time, a group of a minimum of 3 analysable animals of one sex, or of each sex if both are used (see paragraph 32), treated with a positive control substance should normally be included with each test.
Cu toate acestea, s-a constatat faptul că nu există nicio diferență esențială în ceea ce privește rezultatele testului, indiferent dacă s-au utilizat celule izolate sau nuclee (8).
In future, it may be possible to demonstrate adequate proficiency to reduce the need for positive controls.
De asemenea, diferite metode pentru izolarea celulelor/nucleelor (de exemplu, omogenizare, mărunțire, digestie enzimatică și filtrare prin plasă) au furnizat rezultate comparabile (55).
If multiple sampling times are used (e.g. with a single administration protocol) it is only necessary to include positive controls at one of the sampling times, but a balanced design should be ensured (see paragraph 48).
În consecință, se pot utiliza fie celule izolate, fie nuclee izolate.
It is not necessary to administer concurrent positive control substances by the same route as the test chemical, although it is important that the same route should be used when measuring site-of-contact effects.
Un laborator trebuie să evalueze cu atenție și să valideze metodele specifice țesuturilor de izolare a celulelor/nucleelor unice.
The positive control substances should be shown to induce DNA strand breaks in all of the tissues of interest for the test chemical, and EMS is likely to be the positive control of choice since it has produced DNA strand breaks in all tissues that have been studied.
Astfel cum s-a discutat la punctul 40, persistența unor leziuni care conduc la întreruperi ale lanțului ADN detectate de testul Comet poate fi foarte scurtă (52) (53).
The doses of the positive control substances should be selected so as to produce moderate effects that critically assess the performance and sensitivity of the assay and could be based on dose-response curves established by the laboratory during the demonstration of proficiency.
Prin urmare, indiferent de metoda utilizată pentru a pregăti suspensiile de celule/nuclee unice, este important că țesuturile să fie prelucrate cât mai curând posibil după ce animalele au fost eutanasiate și să fie depozitate în condiții care să reducă îndepărtarea leziunilor (de exemplu, prin menținerea țesutului la temperatură scăzută).
Substances other than those given in Table 1 can be selected if scientifically justified.
Pregătirea lamelor se realizează cât mai curând posibil (în mod ideal, în termen de o oră) după prepararea celulei unice/nucleelor, dar intervalul de timp între decesul animalului și pregătirea lamelor se controlează în mod strict și se validează conform condițiilor laboratorului.
Ethyl methanesulfonate (CAS RN 62-50-0) for any tissue
Liză
Ethyl nitrosourea (CAS RN 759-73-9) for liver and stomach, duodenum or jejunum
Condițiile de liză, de asemenea, sunt variabile esențiale și pot interacționa cu întreruperile lanțului rezultate din anumite tipuri de modificări de ADN (anumite alchinări ale ADN-ului și aducții de bază).
Methyl methanesulfonate (CAS RN 66-27-3) for liver, stomach, duodenum or jejunum, lung and bronchoalveolar lavage (BAL) cells, kidney, bladder, lung, testis and bone marrow/blood
Prin urmare, se recomandă menținerea cât mai constantă posibil a condițiilor de liză pentru toate lamele în cadrul unui experiment.
N-Methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (CAS RN: 70-25-7) for stomach, duodenum or jejunum
Odată preparate, se imersează lamele în soluție de liză răcită timp de cel puțin o oră (sau peste noapte) la aproximativ 2-8 °C în condiții de iluminare redusă, de exemplu lumină galbenă (sau ferite de lumină), evitând expunerea la lumină albă care ar putea conține componente UV.