natgillin/translations-raw huggingface dataset:
A minimum of three test concentrations in at least four replicates should be used.
Fără aerare, cu excepția cazului în care concentrația OD scade sub 70 % din saturație
The curve relating LC50 to period of exposure in the acute studies available should be considered when selecting the range of test concentrations.
Apă curată de suprafață, din puțuri sau reconstituită
Five test concentrations are recommended if the data are to be used for risk assessment.
Durata expunerii la substanța chimică testată
Concentrations of the chemical higher than 10 % of the acute adult LC50 or 10 mg/l, whichever is the lower, need not be tested.
Succesul eclozării, supraviețuire, morfologie macroscopică, VTG histologia gonadală, sexul genetic, raportul sexelor
The maximum test concentration should be 10 % of the LC50 on the larval/juvenile life-stage.
Succesul eclozării, supraviețuire Morfologie macroscopică, VTG histologie gonadală, raportul sexelor
Controls
Criteriile de acceptabilitate a testului pentru replicile comasate ale controalelor
A dilution water control (≥ 4 replicates) and, if relevant, a solvent control (≥ 4 replicates) should be run in addition to the test concentrations.
Succesul eclozării > 80 %
Only solvents that have been investigated not to have any statistical significant influence on the test endpoints should be used in the test.
Supraviețuirea ulterioară eclozării ≥ 70 %
Where a solvent is used, its final concentration should not be greater than 0,1 ml/l (36) and it should be the same concentration in all test chambers, except the dilution water control.
creșterea (greutatea umedă peștilor uscați prin tamponare) > 150 mg
However, every effort should be made to avoid the use of such solvent or keep solvent's concentrations to a minimum.
creșterea (greutatea umedă peștilor uscați prin tamponare) > 75 mg
Frequency of Analytical Determinations and Measurements
creșterea (greutatea umedă peștilor uscați prin tamponare) > 120 mg
Chemical analysis of the test chemical concentration should be performed before initiation of the test to check compliance with the acceptance criteria.
Lungime (lungime standard) > 20mm
All replicates should be analysed individually at the beginning and termination of the test.
Lungime (lungime standard) > 14 mm
One replicate per test concentration should be analysed at least once per week during the test, changing systematically between replicates (1,2,3,4,1,2…).
Lungime (lungime standard) > 20 mm
If samples are stored to be analysed at a later time, the storage method of the samples should be previously validated.
Raportul sexelor (% masculi sau femele) 30 % – 70 %
Samples should be filtered (e.g. using a 0,45 μm pore size) or centrifuged to ensure that the determinations are made on the chemical in true solution.
Caracteristici chimice ale unei ape de diluție acceptabile
During the test, dissolved oxygen, pH, total hardness, conductivity, salinity (if relevant), and temperature should be measured in all test chambers.
CONCENTRAȚIE
As a minimum dissolved oxygen, salinity (if relevant), and temperature should be measured weekly, and pH, conductivity and hardness at the beginning and at the end of the test.
Materie sub formă de particule
Temperature should preferably be monitored continuously in at least one test chamber.
Din metoda de testare C.14/Orientări privind concentrațiile de testare
Results should be based on measured concentrations.
Coloană (numărul de concentrații între 100 și 10, sau între 10 și 1) [1]
However, if the concentration of the test chemical in solution has been satisfactorily maintained within ± 20 % of the nominal concentration throughout the test, then the results can either be based on nominal or measured values.
Dintr-o coloană poate fi aleasă o serie de trei (sau mai multe) concentrații succesive.
Observations and measurements
Punctele de mijloc dintre concentrațiile din coloana (x) se găsesc în coloana (2x + 1).
Stage of embryonic development
Valorile enumerate pot să reprezinte concentrații exprimate ca procent per volum sau greutate (mg/l sau μg/l).
The exposure should begin as soon as possible after fertilisation and before cleavage of the blastodisc commences and no later than 12 h post fertilisation to ensure exposure during early embryonic development.
Valorile pot fi înmulțite sau împărțite cu orice putere a lui 10, după caz.
Hatching and survival
Coloana 1 poate fi folosită dacă exista o incertitudine semnificativă asupra nivelului de toxicitate.
Observations on hatching and survival should be made at least once daily and numbers recorded.
Orientări privind omogenizarea capului și a cozii la exemplarele tinere din speciile pește-zebră, Pimephales promelas, ghidrin și Oryzias latipes
Dead embryos, larvae and juvenile fish should be removed as soon as observed since they can decompose rapidly and may be broken up by the actions of the other fish.
Scopul acestei secțiuni este de a descrie procedurile care au loc înainte de cuantificarea concentrației VTG.
Extreme care should be taken when removing dead individuals not to knock or physically damage adjacent eggs/larvae, these being extremely delicate and sensitive.
Pot fi utilizate alte proceduri care conduc la cuantificarea comparabilă a VTG.
Criteria for death vary according to life stage:
Determinarea concentrației de VTG în plasma sanguină sau ficat în loc de omogenatul din cap/coadă este o opțiune.
for eggs:
Capul și coada peștelui sunt tăiate conform descrierii testului.
particularly in the early stages, a marked loss of translucency and change in coloration, caused by coagulation and/or precipitation of protein, leading to a white opaque appearance;
Toate instrumentele de disecție și planșa pentru efectuarea inciziilor trebuie clătite și curățate în mod corespunzător (de exemplu, cu etanol 96 %) între fiecare operațiune de manipulare a peștilor pentru a preveni «poluarea cu VTG» de la femele sau de la masculii la care aceasta a fost indusă la masculii la care nu a fost indusă.
for larvae and juvenile fish:
Atunci când se obține o masă omogenă, se adaugă o cantitate de tampon de omogenizare înghețat reprezentând de 4 – 10 ori greutatea țesutului (a se nota diluția).
immobility and/or absence of respiratory movement and/or absence of heart-beat and/or white opaque coloration of central nervous system and/or lack of reaction to mechanical stimulus.
Eșantioanele sunt așezate pe gheață până în momentul centrifugării la o temperatură de 4 °C și la 50000 g timp de 30 de minute.
Abnormal appearance
Se utilizează o pipetă pentru a repartiza părți de 20 – 50 μl (a se nota cantitatea) de supernatant în cel puțin două eprubete introducând vârful pipetei sub stratul de grăsime de la suprafață și aspirând cu grijă supernatantul fără fracțiuni de grăsime sau de granule.
The number of larvae or fish showing abnormality of body form should be recorded, and the appearance and the nature of the abnormality described.
Se așează pe gheață în timpul utilizării
It should be noted that abnormal embryos and larvae occur naturally and can be of the order of several per cent in the control(s) in some species.
Tampon de omogenizare:50 mM de Tris-HCl cu pH 7,4;
Abnormal animals should only be removed from the test chambers on death.
1 % amestec de inhibitori de protează (Sigma):
However, in accordance with Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes, if abnormalities result in pain, suffering and distress or lasting harm, and death can be reliably predicted, animals should be anaesthetised and euthanised according to the description in paragraph 44 and treated as mortality for data analysis..
12 ml Tris-HCl cu pH 7,4 + 120 μl amestec de inhibitori de protează (sau amestecuri de inhibitori de protează echivalente).TRIS:
Abnormal behaviour
TRIS-ULTRA PURE (ICN)Amestec de inhibitori de protează:
Abnormalities, e.g. hyperventilation, uncoordinated swimming, atypical quiescence and atypical feeding behaviour should be recorded at appearance.
De la Sigma (pentru țesut de mamifer) Numărul produsului P 8340.
Weight
Orientări privind cuantificarea vitelogeninei din omogenatul din cap și coadă la peștele-zebră (Danio rerio) (modificat după Holbech et al., 2001). pot fi utilizate alte proceduri care utilizează anticorpi și standarde omoloage
At the end of the test all surviving fish should be euthanised (anaesthetised if blood samples should be taken), and individual wet weight (blotted dry) should be measured.
Plăci de microtitrare (certificate Maxisorp F96, Nunc, Roskilde Danemarca) acoperite în prealabil cu 5 μ g/ml IgG antilipovitelină de pește-zebră sunt decongelate și spălate de 3 ori cu tampon de spălare (*).
Length
Standardul de vitelogenină de pește-zebră purificat [1] este diluat în serie la 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10 și 20 ng/ml în tampon de diluare (**), iar eșantioanele sunt diluate de cel puțin de 200 ori (pentru a preveni efectul de matrice) în tampon de diluare și sunt aplicate pe plăci.
At the end of the test, individual lengths (standard length) should be measured.
Un control al testului este aplicat în duplicat.
These observations will result in some or all of the following data being available for reporting:
150 μl se aplică în fiecare godeu.
cumulative mortality;
Standardele sunt aplicate în duplicat, iar eșantioanele în triplicat.
numbers of healthy fish at end of test;
Se lasă la incubat pe timpul nopții la 4 °C pe un agitator.
time to start of hatching and end of hatching;
Plăcile sunt spălate de 5 ori cu tampon de spălare (*)
length and weight of surviving animals;
HRP cuplat la un lanț dextran (de exemplu, AMDEX A/S, Danemarca) și anticorpi conjugați se diluează în tamponul de spălare;
numbers of deformed larvae;
diluarea efectivă diferă în funcție de lot și de vârstă.
numbers of fish exhibiting abnormal behaviour.
150 μl se aplică în fiecare godeu, iar plăcile sunt incubate timp de 1 oră la temperatura camerei pe un agitator.
Sampling of fish
Plăcile sunt spălate de 5 ori cu tampon de spălare (*), iar partea de jos a plăcilor este curățată cu grijă cu etanol.
Fish sampling is performed at termination of the test.
150 μl TMB plus (***) se aplică în fiecare godeu.
Sampled fish should be euthanised with e.g. MS-222 (100-500 mg per l buffered with 200 mg NaHCO3 per l) or FA-100 (4-allyl-2-methoxyphenol: eugenol) and individually measured and weighed as wet weight (blotted dry) or anaesthetised if a blood sample should be taken (see paragraph 49).
Se protejează placa împotriva luminii cu staniol și se urmărește apariția culorii pe un agitator.
Sampling for VTG analysis and sex determination via histological evaluation
Atunci când curba standard este pe deplin dezvoltată, activitatea enzimei este oprită prin adăugarea a 150 μl 0,2 M H2SO4 în fiecare godeu.
All fish should be sampled and prepared for analysis of sex and VTG.
Tampon de spălare:
All fish should be analysed histologically to determine sex.
stoc PBS (****)
For the VTG measurements, a sub-sampling of at least 16 fish from each replicate is accepted.
Se ajustează pH-ul la 7,3 și se umple până la 5 l cu H2O millipore.
More fish should be analysed for VTG if the results of the sub-sampling turn out to be unclear.
Se depozitează la 4 °C.
The sampling procedure for VTG and sex determination is dependent on the VTG analysis method:
Tampon de diluție:
Head/tail homogenate method for VTG analysis
Stoc PBS (****)
The fish is euthanised.
Se ajustează pH-ul la 7,3 și se umple până la 1 l cu H2O millipore.
Head and tail of each fish are separated from the body of the fish by cuts made right behind the pectoral fins, and right behind the dorsal fin, using a scalpel (See Figure 1).
TMB plus este un substrat «gata de utilizare» produs de KemEnTec (Danemarca).
The head and tail part from each fish are pooled, weighed and individually numbered, frozen in liquid nitrogen and stored at – 70° or less for VTG analysis.
Este sensibil la lumină.
The body part of the fish is numbered and fixed in an appropriate fixative for histological evaluation (22).
Stoc PBS
By use of this method VTG and histopathology are evaluated on each individual and a possible change in the VTG level can thus be related to the phenotypic sex of the fish or genetic sex (Japanese medaka and the three-spined stickleback) of the fish.
HPO4.2H2O
For further information see guidance for homogenisation (Appendix 5) and guidance for VTG quantification (Appendix 6).
Se ajustează pH-ul la 6,8 și se umple cu H2O millipore până la 2 l.
Liver homogenate method for VTG analysis
Se depozitează la temperatura camerei.
The liver is dissected out and stored at – 70 °C or below.
Battelle AP4.6.04 (1.18 mg/ml (AAA)), purificare conform:
Recommended procedures for liver excision and pre-treatment are available in OECD TG 229 (37) or Chapter C.37 of this Annex (38).
Orientări privind pregătirea secțiunilor tisulare pentru determinarea sexului și stadializarea gonadelor
Livers are then individually homogenised as described in OECD TG 229 or Chapter C.37 of this Annex.
Scopul acestei secțiuni este de a descrie procedurile care au loc înainte de evaluarea secțiunilor histologice.
The supernatant collected is used for measuring VTG with a homologous ELISA technique (see Appendix 6 for an example of quantification in zebrafish or OECD TG 229 (37) for Japanese medaka).
Pot fi utilizate și alte proceduri care au ca rezultat o determinare a sexului și stadializarea gonadală similare.
Following this approach, it is also possible to have individual fish data on both VTG and gonad histology.
Cu câteva excepții, aceste proceduri sunt similare pentru Oryzias latipes (Japanese medaka – JMD) și peștele-zebră (zebrafish – ZF).
Blood plasma method for VTG analysis
Eutanasierea, necropsia și fixarea tisulară
Blood is collected from the anaesthetised fish by cardiac puncture, caudal vein or tail cutting, and centrifuged at 4 °C for plasma collection.
Obiective:
The plasma is stored at – 70 °C or below until use.
Peștele este eutanasiat.
The whole fish is euthanised and fixed for histology.
Se obține greutățile și se efectuează măsurătorile necesare.
Both plasma samples and fish are numbered individually to relate VTG levels to the sex of the fish.
Se evaluează caracteristicile sexuale secundare.
A detailed description is given in Appendix 9 including tissue sampling and sex determination by a PCR-method.
Prin urmare, cu excepția cazului în care sunt disponibile mai multe persoane pentru a efectua disecții, peștii nu trebuie să fie sacrificați simultan.
Equally, for the three spined stickleback, a description of tissue sampling and a sex determining PCR-method is given in Appendix 10.
Folosind plase de mici dimensiuni, peștele este îndepărtat din camera experimentală și transportat în zona de necropsie în recipientul de transport.
VTG measurement
Peștele este introdus în soluția de eutanasiere.
The measurement of VTG should be based upon a quantitative and analytically validated method.
Peștele este îndepărtat din soluție atunci când peștele încetează să respire și să răspundă la stimuli externi.
Information should be available upon the intra-assay and inter-assay variability of the method used in a given laboratory.
Peștele este cântărit umed.
Considering the variability of VTG measurement, NOECs based on this endpoint alone should be treated with great care.
a.
Different methods are available to assess VTG production in the fish species considered in this assay.
Pentru peștele-zebră, capul este tăiat chiar în spatele înotătoarei pectorale, iar coada este tăiată chiar în spatele înotătoarei dorsale.
A measurement technique that is both relatively sensitive and specific is the determination of protein concentrations via enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
b.
Homologous antibodies (raised against VTG of the same species) and most important homologous standards should be used.
Pentru Oryzias latipes, abdomenul este deschis printr-o incizie efectuată cu grijă, care se extinde de-a lungul liniei mediane ventrale de la centura pectorală la un punct situat imediat cranial față de anus.
Sex determination
Cu ajutorul forcepsului fin și a unei foarfeci mici, ficatul este îndepărtat cu grijă.
Dependent on the VTG sampling procedure, whole fish or the remaining mid-section of each fish is placed in a pre-labelled processing cassette and fixed in an appropriate fixative for histological determination of sex (optionally also for evaluation of gonadal staging).
Eșantionul pentru analiza VTG este plasat în tuburi Eppendorf și congelat imediat în azot lichid.
Guidance on fixation and embedding is provided in Appendix 7 as well as in the OECD Guidance Document on the Diagnosis of Endocrine-Related Histopathology of Fish Gonads (22).
Carcasa care include gonadele este introdusă într-o casetă din plastic pentru țesut preetichetată, care este transferată într-un fixator Davidson sau Bouin.
The individuals should be placed longitudinally in the paraffin block.
Recipientul fixator este agitat ușor timp de cinci secunde pentru dislocarea bulelor de aer din casetă.
At least six longitudinal sections (3-5 μm in thickness) in a frontal plane including gonadal tissue from both gonads are taken from each individual.
a.
The interval between these sections should be approximately 50 μm for males and 250 μm for females.
Toate țesuturile rămân în timpul nopții în fixatorul Davidson, a doua zi fiind transferate în recipiente individuale conținând formol 10 % tamponat neutru.
However, since each block will often contain males and females (if more than one individual are embedded in each block), the interval between sections from these blocks should be approximately 50 μm until at least six sections of the gonads from each male are obtained.
Recipientele cu casete sunt agitate ușor timp de 5 secunde pentru a asigura penetrarea adecvată a formolului în casete.
Thereafter, the interval between sections can be increased to approximately 250 μm for the females.
b.
Sections are stained with haematoxylin and eosin and examined by light-microscopy with focus on sex (male, female, intersex or undifferentiated).
Țesuturile rămân în fixatorul Bouin timp de 24 de ore, fiind transferate în etanol 70 %.
Intersex is defined as presence of more than one oocyte in testis per six sections analysed or spermatogenic cells (yes/no) in ovaries.
Procesarea țesuturilor
Histopathology and staging of ovaries and testis is optional but if investigated, the results should be statistically analyzed and reported.
Se deshidratează țesutul pentru penetrarea adecvată a parafinei.
It should be noted that some fish species naturally lack a fully developed pair of gonads and only one gonad may be present (e.g. Japanese medaka and occasionally zebrafish).
Se impregnează țesutul cu parafină pentru a menține integritatea țesuturilor și pentru a crea o suprafață fermă pentru microtomie.
All such observations should be recorded.
Casetele de țesut etichetate sunt îndepărtate din mediul de stocare cu formol/etanol și sunt introduse în coșul (coșurile) de procesare.
Genetic sex determination in individual Japanese medaka is based on the presence or absence of the medaka male-sex determining gene, DMY, which is located on the Y chromosome.
Coșul de procesare este încărcat în procesatorul tisular.
The genotypic sex of medaka can be identified by sequencing the DMY gene from DNA extracted from for instance a piece of anal fin or dorsal fin.
Se selectează calendarul de procesare.
The presence of DMY indicates a XY (male) individual regardless of phenotype, while the absence of DMY indicates a XX (female) individual regardless of phenotype (23).
După ce procesatorul tisular a finalizat ciclul de procesare, coșul (coșurile) poate (pot) fi transferat(e) în stația integrată.
Guidance for tissue preparation and PCR method is given in Appendix 9.
Integrare
The genetic sex determination in individual three-spined stickleback is also performed via a PCR method, described in Appendix 10.
Obiectiv:
The occurrence of intersex (for definition, see Appendix 1) should be reported.
Orientarea corectă a eșantionului în parafină solidificată pentru microtomie.
Secondary sexual characteristics
Coșul (coșurile) de casete este (sunt) îndepărtat(e) din procesator și este (sunt) scufundat(e) în camera frontală umplută cu parafină a consolei termică a stației de integrare sau casetele sunt mutate într-un încălzitor de parafină separat.
Secondary sexual characteristics are under endocrine control in species like the Japanese medaka;
Prima casetă care urmează să fie integrată este îndepărtată din camera frontală a consolei termice sau din încălzitorul de parafină.
therefore observations of physical appearance of the fish should if possible be made at the end of the exposure.
Capacul casetei este îndepărtat și eliminat, iar eticheta casetei este verificată în ceea ce privește înregistrările privind animalul pentru a soluționa potențialele discrepanțe înainte de integrare.
In the Japanese medaka, the papillary formation on the posterior part of the anal fin in females is androgen sensitive.
Se alege o matriță de dimensiuni corespunzătoare pentru integrare.
Chapter C.37 of this Annex (38) provides relevant photographs of male secondary sex characteristics and androgenised females.
Matrița este ținută sub duza consolei de distribuire și umplută cu parafină topită.
It is important that the strongest valid statistical test determine the endpoint.
Eșantionul este îndepărtat din casetă și introdus în parafina topită din matriță.
The replicate is the experimental unit but intra-replicate variability should be included in the statistical testing.
Aceasta operațiune se repetă cu 4 – 8 eșantioane pentru fiecare matriță cu parafină.
A decision flow-chart is available in Appendix 8 to help with the most appropriate statistical test to use based on the characteristic of the data obtained from the test.
Poziția fiecărui pește este marcată prin plasarea peștelui nr.
Statistical significance level is 0,05 for all endpoints included.
1 la 180 de grade față de peștii 2-4/8.
The proportions of sex should be analysed for significant effect (NOEC/LOEC approach) of exposure by Jonckheere-Terpstra (Trend test) if a monotone dose-response exists.
Matrița și baza casetei se plasează pe placa de răcire a crioconsolei.
If non-monotonicity is found then a pair wise test should be applied:
După ce parafina s-a solidificat, blocul (adică, parafina întărită care conține țesuturile și baza casetei) este îndepărtată din matriță
Use Dunnett's test if normality and homogenous variance can be obtained.
Microtomie
Use Tamhane-Dunnett if heterogeneous variance is present.
Se taie și se montează secțiunile histologice pentru colorare.
Otherwise use exact Mann-Whitney test with Bonferroni-Holm adjustment.
Faza inițială a microtomiei, denumită «facing» se desfășoară astfel:
A flow chart describing the statistics of the proportions of sex is placed in Appendix 8.
a.
The proportions of sex should be presented in tables as concentration proportions ± SD of males, females, intersex and undifferentiated.
Blocul de parafină este plasat în mandrina microtomului.
Examples are presented in the FSDT Phase 2 validation report (42).
Mandrina este avansată prin rotirea roții microtomului, iar secțiuni groase sunt tăiate de la suprafața blocului de parafină până când cuțitul ajunge la țesuturile integrate.
Genetic sex should be reported as percentage of phenotypic sex reversal of males, females, intersex and undifferentiated.
c.
VTG concentrations
Grosimea secțiunii pe microtom este stabilită la 3 – 5 microni.
VTG concentrations should be analysed for significant effect (NOEC/LOEC approach) of exposure.
Mandrina este avansată și din bloc se taie secțiuni multiple pentru a se elimina orice artefacte create pe suprafața tăiată a țesutului în cursul tăierii grosiere.
The Dunnett test is preferable to the t-test with Bonferroni correction.
d.
Where a Bonferroni correction is used, the Bonferroni-Holm correction is preferable.
Blocul poate fi îndepărtat din mandrină și plasat cu fața în jos pe gheață pentru înmuierea țesutului.
Allowance should be made for log-transformation of VTG to achieve normality and variance homogeneity.
Următoarea fază a microtomiei este secționarea finală și montarea secțiunilor de țesut pe lame.