natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Fifty ml from the combined stock solution (II) and the amounts of each macro nutrient stock solution which are given in Table 2 are made up to 1 litre of deionised water to prepare the “M7” medium.
Cu toate acestea, în conformitate cu Directiva 2010/63/UE a Parlamentului European și a Consiliului din 22 septembrie 2010 privind protecția animalelor utilizate în scopuri științifice, dacă anomaliile duc la durere, suferință și stres sau vătămări de durată, iar moartea poate fi prezisă în mod fiabil, animalele trebuie anesteziate și eutanasiate în conformitate cu descrierea de la punctul 44 și considerate a contribui la mortalitate în analiza datelor.
A vitamin stock solution is prepared by adding three vitamins to deionised water as indicated in Table 3, and 0,1 ml of the combined vitamin stock solution are added to the final “M7” medium shortly before use.
Comportamentul anormal
The vitamin stock solution is stored frozen in small aliquots.
Anomaliile, de exemplu hiperventilarea, înotul necoordonat, imobilitatea sau hrănirea atipice trebuie înregistrate la capitolul aspect.
The medium is aerated and stabilised.
Greutate
Stock solutions of trace elements for medium M4 and M7
La sfârșitul testului, toți peștii supraviețuitori trebuie eutanasiați (anesteziați dacă trebuie prelevate de eșantioane de sânge), iar greutatea umedă individuală (uscare prin tamponare) trebuie măsurată.
Stock solutions (I)
Lungime
Amount (mg) made up to 1 litre of deionised water
La sfârșitul testului, lungimile individuale (lungimea standard) trebuie măsurate.
To prepare the combined stock solution (II):
Aceste observații vor face ca o parte sau toate datele următoare să fie disponibile pentru raportare.
mix the following amounts (ml) of stock solutions (I) and make up to 1 litre of deionised water
mortalitatea cumulată;
Final concentrations in test solutions (mg/l)
numărul de pești sănătoși la sfârșitul testului;
MnCl2·4H2O [1]
timpul până la începerea eclozării și până la sfârșitul eclozării;
SrCl2·6H2O [1]
lungimea și greutatea animalelor supraviețuitoare;
MoO4·2H2O [1]
numărul larvelor deformate;
CuCl2·2H2O [1]
numărul peștilor care prezintă un comportament anormal.
CaCl2·6H2O
Eșantionarea peștilor
EDTA·2H2O [1] [2]
Eșantionarea peștilor se realizează la terminarea testului.
FeSO4·7H2O [1] [2]
Peștii eșantionați trebuie eutanasiați cu, de exemplu, MS-222 (100 – 500 mg per l tamponat cu 200 mg NaHCO3 per l) sau FA-100 (4-alil-2-metoxifenol: eugenol) și măsurați și cântăriți individual ca greutate umedă (uscare prin tamponare) sau anesteziați dacă un eșantion de sânge trebuie prelevat (a se vedea punctul 49).
Macro nutrient stock solutions for medium M4 and M7
Selectarea pentru analiza VTG și determinarea sexului prin evaluarea histologică
Amount made up to 1 litre of deionised water
Toți peștii trebuie eșantionați și pregătiți pentru analiza sexului și a VTG.
Amount of macro nutrient stock solutions added to prepare medium M4 and M7
Toți peștii trebuie analizați histologic în vederea determinării sexului.
(ml/l)
Pentru măsurarea VTG, se acceptă un subeșantion de cel puțin 16 pești din fiecare replică.
Final concentrations in test solutions M4 and M7
Mai mulți pești trebuie analizați pentru a determina VTG dacă rezultatele obținute în urma subeșantionării sunt neclare.
Vitamin stock solution for medium M4 and M7
Procedura de eșantionare pentru VTG și determinarea sexului depinde de metoda de analiză a VTG:
All three vitamin solutions are combined to make a single vitamin stock solution.
Metoda cu omogenat cap/coadă pentru analiza VTG
Amount of vitamin stock solution added to prepare medium M4 and M7
Peștele este eutanasiat.
Thiamine hydrochloride
Capul și coada fiecărui pește se separă de corpul peștelui prin incizii imediat înapoia înotătoarelor pectorale și imediat înaintea înotătoarei dorsale, cu ajutorul unui bisturiu (a se vedea figura 1).
Cyanocobalamin (B12)
Capul și coada fiecărui pește sunt comasate, cântărite și numerotate individual, congelate în azot lichid și depozitate la – 70° sau mai puțin, pentru analiza VTG.
Biotine
Corpul peștelui este numerotat și fixat într-un fixativ adecvat pentru evaluarea histologică (22).
These substances differ in M4 and M7, as indicated above.
Prin utilizarea acestei metode sunt evaluate VTG și histopatologia pentru fiecare individ și o posibilă modificare a nivelului VTG poate fi astfel corelată cu sexul fenotipic al peștilor sau cu sexul genetic (Oryzias latipes și ghidrin) al peștilor.
These solutions are prepared individually, then poured together and autoclaved immediately.
Pentru informații suplimentare a se vedea orientările privind omogenizarea (apendicele 5) și orientările privind cuantificarea VTG (apendicele 6).
Preparation of formulated sediment
Metoda cu omogenat din ficat pentru analiza VTG
SEDIMENT COMPOSITION
Ficatul este excizat și depozita la o temperatură de – 70 °C sau mai mică.
The composition of the formulated sediment should be as follows:
Procedurile recomandate pentru excizia ficatului și pretratarea sunt disponibile în Orientarea TG nr.
Sphagnum moss peat, as close to pH 5,5-6,0 as possible, no visible plant remains, finely ground (particle size ≤ 1 mm) and air dried
229 a OCDE (37) sau în capitolul C.37 din prezenta anexă (38).
4 - 5
Ficații sunt apoi omogenizați individual, astfel cum se descrie în Orientarea TG nr.
> 50 % of the particles should be in the range of 50-200 μm
229 a OCDE sau în capitolul C.37 din prezenta anexă.
CaCO3, pulverised, chemically pure
Supernatantul colectat este folosit pentru măsurarea VTG cu o tehnică ELISA omoloagă [a se vedea apendicele 6 pentru un exemplu de cuantificare la peștele-zebră sau Orientarea TG nr.
0,05 - 0,1
229 a OCDE (37) pentru Oryzias latipes].
Conductivity ≤ 10 μS/cm
Pe baza acestei metode, este posibil, de asemenea, să se obțină date individuale privind peștii atât în ceea ce privește VTG, cât și în ceea ce privește histologia gonadelor.
PREPARATION
Metoda cu plasmă sanguină pentru analiza VTG
The suspension is conditioned for at least two days with gentle stirring at 20 ± 2 °C, to stabilise pH and establish a stable microbial component. pH is measured again and should be 6,0 ± 0,5.
Sângele este colectat de la peștii anesteziați prin puncție cardiacă, din venă caudală sau prin tăierea cozii și este centrifugat la 4 °C pentru colectarea de plasmă.
The pH of the final mixture is measured once again and is adjusted to 6,5 to 7,5 with CaCO3 if necessary.
Plasma este depozitată la maximum – 70 °C, până la utilizare.
Then, before it is used in the chironomid toxicity test, it is recommended that the formulated sediment be conditioned for seven days under the same conditions which prevail in the subsequent test.
Peștele întreg este eutanasiat și fixat pentru histologie.
STORAGE
Atât eșantioanele de plasmă, cât și peștii, sunt numerotați individual pentru a corela nivelurile de VTG cu sexul peștelui.
The dry constituents for preparation of the artificial sediment may be stored in a dry and cool place at room temperature.
Modul de incizare a unui pește pentru măsurarea VTG în omogenat din cap/coadă și evaluarea histologică a secțiunii mijlocii.
The formulated (wet) sediment should not be stored prior to its use in the test.
Determinarea sexului genetic
It should be used immediately after the 7 days conditioning period that ends its preparation.
Un eșantion biologic pentru determinarea sexului genetic este prelevat din pești aparținând speciilor care posedă markeri corespunzători.
OECD (1984), Earthworm, Acute Toxicity Test, Test Guideline No. 207, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris.
Pentru Oryzias latipes, se colectează înotătoarea anală sau înotătoarea dorsală.
Meller, M., Egeler, P., Roembke, J., Schallnass, H., Nagel, R. and B. Streit (1998), Short-term toxicity of lindane, hexachlorobenzene and copper sulfate on tubificid sludgeworms (Oligochaeta) in artificial media, Ecotox.
O descriere detaliată este furnizată în apendicele 9 incluzând prelevarea de eșantioane de țesut și determinarea sexului printr-o metodă PCR.
Environ.
De asemenea, pentru ghidrin, o descriere a prelevării de țesut și a determinării sexului prin metoda PCR este furnizată în apendicele 10.
Safety, 39:
Măsurarea VTG
10-20.
Măsurarea VTG trebuie să se bazeze pe o metodă cantitativă, validată din punct de vedere analitic.
Chemical Characteristics of an Acceptable Dilution water
Informațiile trebuie să fie disponibile pe baza variabilității intra- și interteste a metodei utilizate într-un anumit laborator.
CONSTITUENT
Sursa variabilității intra- și interlaboratoare este (cel mai probabil) bazată pe diferitele stadii de dezvoltare a populației de pești.
CONCENTRATIONS
Luând în considerare variabilitatea măsurării VTG, NOEC bazate doar pe acest parametru studiat trebuie tratate cu multă atenție.
Hardness as CaCO3
Sunt disponibile diferite metode pentru evaluarea producerii de VTG în speciile de pești avute în vedere în acest test.
However, it should be noted that if there is an interaction suspected between hardness ions and the test chemical, lower hardness water should be used (and thus, Elendt Medium M4 should not be used in this situation).
O tehnică de măsurare care este relativ sensibilă și specifică este determinarea concentrațiilor de proteine prin intermediul unui test de imunoadsorbție cu anticorpi marcați enzimatic (ELISA).
Guidance for test performance
Anticorpi omologi (formați împotriva VTG de la aceeași specie) și cele mai importante standarde omoloage trebuie utilizate.
A gauze on the top and at least one side of the cage (mesh size ca.
În funcție de procedura de eșantionare a VTG, întregul pește sau secțiunea mijlocie rămasă a fiecărui pește se plasează într-o casetă de procesare etichetată în prealabil și fixată într-un fixator corespunzător pentru determinarea histologică a sexului (opțional și pentru evaluare stadializării gonadale).
1 mm)
Orientări privind fixarea și integrarea sunt furnizate în apendicele 7, precum și în documentul intitulat OECD Guidance Document on the Diagnosis of Endocrine-Related Histopathology of Fish Gonads (Document OCDE de orientare privind diagnosticul histopatologiei influențate endocrin a gonadelor de pește) (22).
B aperture for placing the emerged adults inside the breeding cage and to remove the laid egg ropes from the crystallisation dishes (not shown in this graphic)
După procesare, peștele este integrat în blocuri de parafină.
C breeding cage size minimum 30 cm length, 30 cm height and 30 cm width
Indivizii trebuie plasați în blocurile de parafină în poziție longitudinală.
Example of a test vessel:
Cel puțin șase secțiuni longitudinale (cu o grosime de 3 – 5 μm) într-un plan frontal incluzând țesut gonadal de la ambele gonade sunt realizate pentru fiecare individ.
A pasteur pipette for air supply of the overlying water
Intervalul dintre aceste secțiuni trebuie să fie de aproximativ 50 μm pentru masculi și de 250 μm pentru femele.
B glass lid to prevent emerged midges from escaping
Totuși, având în vedere că fiecare bloc va conține adesea masculi și femele (dacă în fiecare bloc sunt integrați mai mulți indivizi), intervalul dintre secțiunile acestor blocuri trebuie să fie de aproximativ 50 μm până la obținerea a cel puțin șase secțiuni ale gonadelor pentru fiecare mascul.
C water surface layer
Prin urmare, intervalul dintre secțiuni poate fi crescut până la aproximativ 250 μm pentru femele.
D test vessel (glass beaker minimum 600 ml)
Secțiunile sunt colorate cu hematoxilină și eozină și examinate la microscop optic cu o atenție deosebită acordată sexului (mascul, femelă, hermafrodit sau exemplar nediferențiat).
E sediment layer
Hermafrodit înseamnă prezența mai multor ovocite în testicul per șase secțiuni analizate sau celule spermatogenetice (da/nu) în ovare.
Example of an exhauster for capturing adult midges (arrows indicate air flow direction):
Histopatologia și stadializarea ovarelor și a testiculelor este opțională, însă dacă sunt investigate, rezultatele trebuie analizate statistic și raportate.
A glass tube (inner diameter ca.
Trebuie remarcat faptul că unora dintre speciile de pești le lipsește în mod natural o pereche de gonade complet dezvoltate și poate fi prezentă doar o singură gonadă (de exemplu Oryzias latipesși, ocazional, peștele-zebră).
5 mm) connected to a self-priming pump B cork of vulcanised rubber, perforated with glass tube (A).
Toate aceste observațiile trebuie înregistrate.
On the inside, the opening of glass tube (A) is covered with some cotton and a gauze (mesh size ca.
Determinarea sexului genetic pentru exemplarele de Oryzias latipes se bazează pe prezența sau pe absența genei care determină sexul masculin la Oryzias latipes, DMY, care este situată pe cromozomul Y.
1 mm) to prevent damaging the midges when they are sucked into the exhauster
Sexul genotipic al Oryzias latipes poate fi identificat prin secvențierea genei DMY din ADN-ul extras din, de exemplu, o bucată de înotătoare anală sau dorsală.
C transparent container (plastic or glass, length ca.
Prezența DMY indică un exemplar XY (mascul) indiferent de fenotip, în timp ce absența DMY indică un exemplar XX (femelă), indiferent de fenotip (23).
15 cm) for captured midges
Orientări privind pregătirea țesutului și metoda PCR sunt furnizate în apendicele 9.
D cork of vulcanised rubber, perforated with tube (E).
Determinarea sexului genetic în exemplarele de ghidrin se realizează, de asemenea, printr-o metodă PCR, descrisă în apendicele 10.
To release midges into the breeding cage, cork D is released from container C
Apariția de exemplare hermafrodite (pentru definiție, a se vedea apendicele 1) trebuie înregistrată.
E tube (plastic or glass, inner diameter ca.
Caracteristici sexuale secundare
8 mm) to collect adult midges from vessel
Caracteristicile sexuale secundare se află sub controlul endocrin la specii precum Oryzias latipes;
Schematic presentation of a life-cycle test:
prin urmare, dacă este posibil, observațiile privind aspectul fizic al peștelui trebuie să fie efectuate la sfârșitul expunerii.
A 1st generation — test vessels containing a sediment-water system, eight replicates, 20 first instar larvae per vessel
În ceea ce privește Oryzias latipes, formarea papilară a părții posterioare a înotătoarei anale la femele este sensibilă la androgen.
B four test vessels for each breeding cage, A and B
Capitolul C. 37 din prezenta anexă (38) furnizează fotografii relevante ale caracteristicilor sexuale secundare masculine și ale femelelor androgenizate.
C breeding cages (A and B) for swarming, mating and oviposition
Replica este unitatea experimentală, însă variabilitatea între replici trebuie inclusă în testarea statistică O organigramă a deciziilor este disponibilă în apendicele 8 pentru a ajuta cu testul statistic cel mai potrivit pentru a fi utilizat pe baza caracteristicilor datelor obținute în test.
D crystallising dishes for deposition of egg ropes
Nivelul de semnificație statistică este de 0,05 pentru toți parametri studiați incluși.
E micro plates, one well for each egg rope
Proporțiile sexelor și sexul genetic
F 2nd generation — test vessels containing a sediment-water system, eight replicates, 20 first instar larvae per vessel
Proporțiile sexelor ar trebui să fie analizate din punctul de vedere al efectului semnificativ (metoda NOEC/LOEC) al expunerii prin Jonckheere-Terpstra (testul Trend), în cazul în care există o relație doză-răspuns monotonă.
C.41.
Dacă se constată absența monotonicității, trebuie aplicat un teste pe perechi:
FISH SEXUAL DEVELOPMENT TEST
Dacă se poate obține normalitate și varianță omogenă se utilizează testul Dunnett.
This test method is equivalent to OECD test guideline (TG) 234 (2011).
Dacă este prezentă o varianță eterogenă, se utilizează testul Tamhane-Dunnett.
It is based on a decision from 1998 to develop new or update existing test methods for the screening and testing of potential endocrine disrupters.
Altfel, se utilizează testul exact Mann-Whitney cu ajustare Bonferroni-Holm.
The Fish Sexual Development Test (FSDT) was identified as a promising test method covering a sensitive fish life stage responsive to both oestrogen and androgen-like chemicals.
O organigramă care descrie statistica proporțiilor sexelor este furnizată în apendicele 8.
The test method went through an inter-laboratory validation exercise from 2006 to 2010, where Japanese medaka (Oryzias latipes), zebrafish (Danio rerio) and three spined stickleback (Gasterosteus aculeatus) were validated and fathead minnow (Pimephales promelas) was partially validated (41) (42) (43).
Proporțiile sexelor trebuie prezentate în tabele ca proporții de concentrații ± SD pentru masculi, femele, hermafrodiți și exemplare nediferențiate.
This protocol includes Japanese medaka, the three-spined stickleback and zebrafish.
Semnificația statistică trebuie evidențiată.
The protocol is in principle an enhancement of OECD TG 210 Fish, Early Life Stage Toxicity Test (1), where the exposure is continued until the fish are sexually differentiated, i.e. about 60 days post-hatch (dph) for Japanese medaka, the three-spined stickleback and zebrafish (the exposure period can be shorter or longer for other species that are validated in the future), and endocrine-sensitive endpoints are added.
În raportul de validare a fazei 2 a FSDT sunt prezentate exemple (42).
The combination of the two core endocrine endpoints, vitellogenin (VTG) concentration and phenotypic sex ratio enable the test to indicate the mode of action of the test chemical.
Concentrațiile VTG
Due to the population-relevant change in phenotypic sex ratio, the FSDT can be used for hazard and risk assessment.
Concentrațiile VTG trebuie analizate din punctul de vedere al efectului semnificativ (metoda NOEC/LOEC) al expunerii.
However, if the test is used for hazard or risk assessment, the stickleback should not be used because the validation data available so far showed that in this species the alterations of phenotypic sex ratio by the test chemicals were uncommon.
Testul Dunnett este preferabil testului t cu corecție Bonferroni.
The protocol is based on fish exposed via water to chemicals during the sex labile period in which the fish is expected to be most sensitive to the effects of endocrine disrupting chemicals that interfere with sexual development.
În cazul aplicării unei corecții Bonferroni, se recomandă corecția Bonferroni-Holm.
Two core endpoints are measured as indicators of endocrine-associated developmental aberrations, the VTG concentrations and sex ratios (proportions of sex) determined via gonad histology.
Trebuie realizată o ajustare pentru transformarea logaritmică a VTG pentru a obține normalitate și omogenitatea varianței.
Gonadal histopathology (evaluation and staging of oocytes and spermatogenetic cells) is optional.
Apoi, dacă relația concentrație-răspuns este compatibilă cu monotonicitatea, se preferă testul Jonckheere Terpstra față de oricare dintre cele de mai sus.
Additionally, the genetic sex is determined whenever possible (e.g. in Japanese medaka and the three spined stickleback).
În cazul în care sunt utilizate teste t sau testul Dunnett, nu este necesară efectuarea unui test F de semnificație ANOVA pentru a continua.
The presence of a genetic sex marker is a considerable advantage as it increases the power of the sex ratio statistics and enables the detection of individual phenotypic sex reversal.
Pentru detalii, a se vedea organigrama din apendicele 8.
Other apical endpoints that should be measured include hatching rate, survival, length and body weight.
Rezultatele trebuie raportate în tabele ca medii de concentrații ± SD separat pentru masculi, femele, hermafrodiți și exemplarele nediferențiate.
The test method might be adaptable to other species than those mentioned above provided that the other species undergo a validation equal to the one accomplished for Japanese medaka, the three-spined stickleback and zebrafish, that the control fish are sexually differentiated at the end of the test, that VTG levels are sufficiently high to detect significant chemical-related variations, and that sensitivity of the test system is established using endocrine active reference chemicals ((anti)-oestrogens, (anti)-androgens, aromatase inhibitors etc).
Semnificativitatea statistică pentru femelele fenotipice și masculii fenotipici trebuie evidențiată.
In addition, any validation report(s) referring to FSDT data using other species should be reviewed by the OECD, and the validation outcome should be considered as satisfactory.
Concentrațiile efective ale substanței chimice testate
Initial considerations and limitations
Concentrațiile efective din cameră ale substanței chimice testate trebuie analizate cu frecvențele descrise la punctul 34.
VTG is normally produced by the liver of female oviparous vertebrates in response to circulating endogenous oestrogen (2).
Rezultatele trebuie raportate în tabele sub formă de concentrații medii ± SD per replică, precum și per concentrație, împreună cu informații privind numărul de eșantioane și cu valorile aberante pentru concentrația medie de tratament ± 20 % evidențiată.
The VTG synthesis is very limited, though detectable, in immature fish and adult male fish because they lack sufficient circulating oestrogen.
Exemple pot fi găsite în raportul de validare a fazei 2 a FSDT (42).
However, the liver is capable of synthesising and secreting VTG in response to exogenous oestrogen stimulation (3) (4) (5).
Rezultatele testului se interpretează cu precauție atunci când concentrațiile măsurate ale substanței chimice testate apar la niveluri apropiate de limitele de detecție ale metodei analitice.
The measurement of VTG serves for the detection of chemicals with oestrogenic, anti-oestrogenic, androgenic modes of action and chemicals that interfere with steroidogenesis as for example aromatase inhibitors.
Proprietățile fizico-chimice relevante;
The detection of oestrogenic chemicals is possible via the measurement of VTG induction in male fish, and it has been abundantly documented in the scientific peer-reviewed literature.
datele de identificare chimică, inclusiv puritatea și metoda analitică pentru cuantificare a substanței chimice testate.
VTG induction has also been demonstrated following exposure to aromatisable androgens (6) (7).
Procedura de testare utilizată (de exemplu cu flux continuu, semistatică/reînnoire);
A reduction in the circulating level of oestrogen in females, for instance through the inhibition of the aromatase converting the endogenous androgen to the natural oestrogen 17β-oestradiol, causes a decrease in the VTG concentration, which is used to detect chemicals having aromatase inhibiting properties or steroidogenesis inhibitors more broadly (33).
protocolul de testare inclusiv concentrațiile de testare, metoda de preparare a soluțiilor stoc (într-o anexă), frecvența de reînnoire (dacă se utilizează, trebuie indicat agentul de solubilizare și concentrația acestuia);
The biological relevance of the VTG response following oestrogenic/aromatase inhibition is established and has been broadly documented (8) (9).
Concentrațiile de testare nominale, mediile valorilor măsurate și abaterile lor standard în camerele de testare și metoda prin care acestea au fost obținute (metoda de analiză utilizată trebuie prezentată într-o anexă); dovada că măsurătorile se referă la concentrațiile de substanței chimice testate în soluție veritabilă;
However, it is possible that production of VTG in females can also be affected by general toxicity and non-endocrine toxic modes of action.
Calitatea apei în camerele de testare:
Several measurement methods have been successfully developed and standardised for routine use to quantify VTG in blood, liver, whole body or head/tail homogenate samples collected from individual fish.
Informații detaliate privind hrănirea [de exemplu, tipul (tipurile) de hrană, sursa, cantitatea furnizată, frecvența și analizele contaminanților (de exemplu, PCBs, PAHs și pesticide organoclorurate), dacă sunt relevante].
This is the case for zebrafish, three-spined stickleback and Japanese medaka and also the partially validated species fathead minnow;
Dovada că controalele au îndeplinit criteriile de validitate: