natgillin/translations-raw huggingface dataset:
A cut is made just anterior to pectoral fins with scissors.
Bazinele de tratament trebuie să fie dispuse aleator într-o anumită poziție în cadrul sistemului de expunere, pentru a reduce eventualele efecte legate de poziție, inclusiv variațiile ușoare ale temperaturii, intensității luminii etc. Iluminarea fluorescentă trebuie să fie utilizată pentru a asigura o perioadă de expunere la lumină de 12 h de lumină:
Figure 2
12 h de întuneric la o intensitate cuprinsă între 600 și 2000 lux (lumen/m2) la suprafața apei.
The midline of abdomen is incised with scissors to a point approximately 2 mm cranial to the anus.
În fiecare bazin de testare, temperatura apei trebuie menținută la 22° ± 1 °C, pH-ul trebuie menținut la valori cuprinse între 6,5 și 8,5, iar concentrația oxigenului dizolvat (OD) la > 3,5 mg/l (> 40 % din saturația în aer).
Figure 3
Ca o condiție minimă, temperatura apei, pH-ul și oxigenul dizolvat trebuie măsurate săptămânal;
The abdominal walls are spread with forceps for exposure of the liver and other internal organs.
temperatura trebuie să fie măsurată, de preferință, în mod continuu în cel puțin unul dintre vasele de testare.
(Alternatively, the abdominal walls may be pinned laterally).
Apendicele 1 schițează condițiile experimentale necesare executării protocolului.
Figure 4
Pentru informații suplimentare privind instalare sistemelor de expunere cu flux continuu și/sau a celor statice cu reînnoire, a se consulta ghidul ASTM «Standard Guide for Conducting Acute Toxicity Tests on Test Materials with Fishes, Macroinvertebrates, and Amphibians» (Orientare-standard privind efectuarea testelor de toxicitate acută cu materiale de testare pe pești, macronevertebrate și amfibieni) (5) și testele de toxicologie acvatică generale.
The liver is bluntly dissected and excised using forceps.
Calitatea apei
Figure 5
Poate fi utilizată orice apă disponibilă local (apa de izvor sau apa de la robinet filtrată cu filtru de carbon) și care permite creșterea și dezvoltarea normale ale mormolocilor de X. laevis.
The intestines are gently retracted using forceps.
Întrucât calitatea apei locale poate varia în mod semnificativ de la o zonă la alta, trebuie efectuată o analiză a calității apei, în special dacă nu sunt disponibile date istorice privind utilitatea respectivei ape pentru creșterea de Xenopus.
Testis 6
O atenție specială trebuie acordată confirmării absenței din apă a cuprului, a clorului și a cloraminelor, toate acestea fiind toxice pentru broaște și mormoloci.
Both ends of the intestines and any mesenteric attachments are severed using scissors.
În plus, se recomandă să se analizeze apa în ceea ce privește concentrațiile de fond de fluoruri, perclorați și clorați (subproduse rezultate din dezinfectarea apei potabile), întrucât toți acești anioni sunt substraturi ale transportatorului iodului la glanda tiroidă, iar nivelurile ridicate ale acestora pot perturba rezultatele studiului.
Testis 7 (female)
Analiza trebuie să fie efectuată înainte de începerea testării, iar apa de testare trebuie în mod normal să nu conțină acești anioni.
The procedure is identical for the female.
Concentrația de ioduri din apa de testare
Testis 8
Sinteza hormonilor tiroidieni în glanda tiroidă se bazează pe cantități suficiente de ioduri aflate la dispoziția larvelor, din surse acvatice și alimentare.
The completed procedure.
În prezent, nu există recomandări empirice privind concentrațiile de ioduri minime.
Procedure 2 B:
Cu toate acestea, cantitățile de ioduri disponibile pot afecta reactivitatea sistemului tiroidian la agenții activi asupra tiroidei, un factor de altfel cunoscut ca influențând activitatea bazală a acestei glande, un aspect care trebuie luat în considerare în momentul interpretării rezultatelor histopatologiei tiroidei.
Take the bottle of homogenate buffer from the ELISA kit and cool it with crushed ice (temperature of the solution: ≤ 4 °C).
Pe baza datelor disponibile provenind din studiile de validare, s-a demonstrat că protocolul funcționează bine atunci când concentrațiile de ioduri (I–) din apa de testare au fost situate între 0,5 și 10 μg/l.
If homogenate buffer from EnBio ELISA system is used, thaw the solution at room temperature, and then cool the bottle with crushed ice.
În mod ideal, concentrația minimă de ioduri din apa de testare trebuie să fie de 0,5μg/l.
Calculate the volume of homogenate buffer for the liver on the basis of its weight (add 50 μl of homogenate buffer per mg liver weight for homogenate).
Dacă testul este efectuat cu apă deionizată, pentru a atinge această concentrație minimă de 0,5μg/l este necesară suplimentare cu iod.
For example, if the weight of the liver is 4,5 mg, the volume of homogenate buffer for the liver is 225 μl.
Orice altă suplimentare a apei de testare cu iod sau cu alte săruri trebuie notată în raport.
Prepare a list of the volume of homogenate buffer for all livers.
Îngrijirea animalelor
Preparation of the liver for pre-treatment
Îngrijirea și reproducerea animalelor adulte
Take the 1,5 ml microtube containing the liver from the freezer just before the pre-treatment.
Îngrijirea și reproducerea animalelor adulte este realizată în conformitate cu orientările standard, iar pentru informații mai detaliate, cititorul este invitat să consulte orientările standard privind efectuarea testului intitulat «Frog Embryo Teratogenesis Assay (FETAX)» (Testul de teratogeneză la embrionii de broască) (6).
Pre-treatment of the liver from males should be performed before females to prevent vitellogenin contamination.
Aceste orientări standard oferă un exemplu de metode de îngrijire și de reproducere adecvate, însă fără să fie necesară respectarea loc cu strictețe.
In addition, the pre-treatment for test groups should be conducted in the following order:
Pentru a induce reproducerea, mai multe cupluri (3 – 5) de adulți, femele și masculi, sunt injectate cu gonadotropină corionică umană (HCG).
The number of 1,5 ml microtubes containing liver samples taken from the freezer at a given time should not exceed the number that can be centrifuged at that time.
Dozele injectate femelelor și masculilor sunt de aproximativ 800 IU – 1000 IU și, respectiv, la 600 IU – 800 IU de HCG dizolvată într-o soluție salină de 0,6 – 0,9 %.
Arrange the 1,5 ml microtubes containing liver samples in the order of specimen number on the ice rack (no need to thaw the liver).
Cuplurile reproducătoare sunt ținute în bazine de mari dimensiuni, ferite de perturbări și în condiții statice, în vederea promovării amplexusului.
Operation of the pre-treatment
Fundul fiecărui bazin de reproducere este prevăzut cu un grilaj din plastic sau din oțel inoxidabil, care să permită maselor de ouă să cadă pe fundul bazinului.
Addition of the homogenization buffer
Broaștele injectate după-amiaza târziu vor depune, de obicei, cea mai mare parte a ouălor pe la jumătatea dimineții zilei următoare.
Check the list for the volume of the homogenate buffer to be used for a particular sample of liver and adjust the micropipette (volume range: 100-1000 μl) to the appropriate volume.
După ce o cantitate suficientă de ouă sunt eliberate și fertilizate, adulții trebuie să fie îndepărtați din bazinele de reproducere.
Attach a clean tip to the micropipette.
Îngrijirea și selectarea larvelor
Take the homogenate buffer from the reagent bottle and add the buffer to the 1,5 ml microtube containing the liver.
După ce adulții sunt îndepărtați din bazinele de reproducere, ouăle sunt colectate și evaluate din punctul de vedere al viabilității lor, utilizându-se un subset de embrioni prelevați din toate bazinele de reproducere.
Add the homogenate buffer to all of 1,5 ml microtubes containing the liver according to the procedure described above.
Cele mai bune progenituri (2 – 3 sunt recomandate pentru evaluarea calității lor) trebuie reținute pe baza viabilității embrionilor și a prezenței unui număr adecvat (minimum 1500) de embrioni.
There is no need to change the micropipette tip to a new one.
Toate organismele utilizate în cadrul unui studiu trebuie să provină dintr-un singur eveniment de reproducere (progeniturile nu trebuie amestecate).
However, if the tip is contaminated or suspected to be contaminated, the tip should be changed.
Embrionii sunt transferați într-un recipient sau vas mare și plat și toate ouăle vizibil moarte sau anormale [a se vedea definiția de la (5)] sunt îndepărtate cu ajutorul unei pipete sau al unei pipete oculare.
Homogenisation of the liver
Embrionii sănătoși rezultați din fiecare set de progenituri sunt transferați în trei bazine de eclozare separate.
Attach a new pestle for homogenisation to the microtube homogeniser.
La patru zile după transferare în bazinele de eclozare se selectează, pe baza viabilității și a succesului eclozării, cele mai bune progenituri, iar larvele sunt transferate într-un număr corespunzător de bazine de creștere la 22° ±1 °C.
Insert the pestle into the 1,5 ml microtube.
În plus, alte larve sunt mutate în bazine suplimentare pentru a servi ca înlocuitori în caz de mortalitate în bazinele de creștere pe parcursul primei săptămâni.
Hold the microtube homogeniser to press the liver between the surface of the pestle and the inner wall of the 1,5 ml microtube.
Această procedură menține o densitate constantă de organisme, ceea ce reduce divergența dezvoltării în cohorta provenită dintr-un singur eveniment de reproducere.
Operate the microtube homogeniser for 10 to 20 seconds.
Toate bazinele de creștere trebuie să fie curățate zilnic.
Cool the 1,5 ml microtube with crushed ice during the operation.
Ca măsură de precauție, mănușile de vinil sau de nitril sunt preferabile mănușilor din latex.
Lift up the pestle from the 1,5 ml microtube and leave it at rest for about 10 seconds.
Organismele moarte trebuie să fie îndepărtate zilnic și înlocuite cu larve pentru a menține astfel densitatea organismelor la un nivel constant pe parcursul primei săptămâni.
Then conduct a visual check of the state of the suspension.
Larvele trebuie hrănite cel puțin de două ori pe zi.
If pieces of liver are observed in the suspension, repeat the operations (3) and (4) to prepare satisfactory liver homogenate.
Pe parcursul etapei de preexpunere, mormolocii sunt aclimatizați la condițiile corespunzătoare etapei de expunere, inclusiv la tipul de hrană, la temperatură, la ciclul lumină-întuneric și la mediul de cultură.
Cool the suspended liver homogenate on the ice rack until centrifugation.
Prin urmare, se recomandă ca aceeași apă de cultură/diluție să fie utilizată pe parcursul etapei de preexpunere și al celei de expunere.
Change the pestle to the new one for each homogenate.
Dacă un sistem de cultură static este utilizat pentru menținerea mormolocilor pe durata etapei de preexpunere, mediul de cultură trebuie să fie înlocuit complet cel puțin de două ori pe săptămână.
Homogenise all livers with homogenate buffer according to the procedure described above.
Suprapopularea, cauzată de densitățile mari de larve din cursul etapei de preexpunere, trebuie evitată deoarece un astfel de fenomen ar putea afecta în mod semnificativ dezvoltarea mormolocilor în cursul fazei de testare care urmează.
Centrifugation of the suspended liver homogenate
Prin urmare, densitatea din bazinul de creștere nu trebuie să depășească aproximativ patru mormoloci/l de mediu de cultură (sistem de expunere statică) sau 10 mormoloci/l de mediu de cultură (de exemplu, cu un debit de 50 ml/min în sistemul de cultură sau de preexpunere).
Confirm the temperature of the refrigerated centrifuge chamber at ≤ 5 °C.
În aceste condiții, mormolocii trebuie să se dezvolte de la stadiul 45/46 la stadiul 51 în doisprezece zile.
Insert the 1,5 ml microtubes containing the suspended liver homogenate in refrigerated centrifuge (adjust the balance if necessary).
Mormolocii reprezentativi ai acestei populații trebuie inspectați zilnic pentru a observa stadiul de dezvoltare în vederea estimării timpului corespunzător pentru începerea expunerii.
However, if the supernatants are adequately separated, centrifugal force and time may be adjusted as needed.
Condițiile/activitățile stresante trebuie evitate, în special zgomotele puternice și/sau constante, vibrațiile și lovirea acvariilor, activitatea excesivă în laborator și modificări rapide ale mediului (lumina, temperatura, pH-ul, OD, debitul apei, etc.).
If the separation is not adequate, centrifuge the suspension again under the same conditions.
Cultura și hrănirea larvelor
Remove all specimens from the refrigerated centrifuge and arrange them in the order of specimen number on the ice rack.
Mormolocii sunt hrăniți de exemplu cu hrană comercială pentru mormoloci utilizată în studiile de validare (a se vedea, de asemenea, apendicele 1) pe parcursul etapei de preexpunere [conform stadiului Nieuwkoop și Faber (NF) 45/46 (8)] și pe parcursul întregii perioade de testare de 21 de zile sau cu alt tip de hrană care a demonstrat aceeași performanță în cadrul testului de metamorfoză la amfibieni.
Be careful not to resuspend each separated layer after the centrifugation.
Regimul de hrănire pe parcursul perioadei de preexpunere trebuie să fie ajutat cu atenție pentru a îndeplini necesitățile mormolocilor în dezvoltare.
Collection of the supernatant
În practică, de mai multe ori pe zi (de cel puțin două ori), porții mici de hrană trebuie administrate larvelor recent eclozate.
Collect 30 μl of each supernatant (separated as the intermediate layer) with the micropipette and dispense it to one 0,5 ml microtube.
În ceea ce privește hrana administrată mormolocilor în studiile de validare, porțiile zilnice trebuie crescute pe măsura creșterii mormolocilor până la atingerea unei cantități de aproximativ 30 mg/animal/zi cu puțin timp înainte de începerea testului.
Collect the supernatant and dispense it to other two 0,5 ml microtubes in the same manner as described above.
Prin urmare, volumul zilnic total de hrană trebuie împărțit în porții mai mici și administrate zilnic de cel puțin două ori.
Collect the rest of the supernatant with the micropipette (if feasible: ≥ 100 μl).
Pentru acest tip de hrană, regimul de hrănire este prezentat în tabelul 1.
Then dispense the supernatant to the remaining 0,5 ml microtube.
Ritmul de hrănire trebuie înregistrat.
Close the cap of the 0,5 ml microtube and write the volume of the supernatant on the label.
Acest tip de hrană poate fi administrat sub formă uscată sau sub formă de soluție stoc pregătită în apă de diluție.
Then immediately cool the microtubes on the ice rack.
O astfel de soluție stoc trebuie pregătită proaspăt la un interval de două zile și depozitată la 4 °C atunci când nu este utilizată.
Change the tip of the micropipette to the new one for each supernatant.
Regimul de hrănire cu hrană comercială pentru mormoloci utilizată în studiile de validare pentru mormolocii de X. laevis în etapa în care animalele sunt în viață în cursul AMA în condiții de flux continuu
If a large amount of lipid becomes attached to the tip, change it to the new one immediately to avoid contamination of the liver extract with fat.
Ziua studiului
Dispense all of the centrifuged supernatant to four 0,5 ml microtubes according to the procedure described above.
Porția de hrană (mg de hrană/animal/zi)
After dispensing the supernatant to the 0,5 ml microtubes, place all of them in the tube rack with the identification label, and then freeze them in the freezer immediately.
Chimie analitică
If the VTG concentrations are measured immediately after the pre-treatment, keep one 0,5 ml microtube (containing 30 μl of supernatant) cool in the tube rack and transfer it to the workstation where the ELISA assay is conducted.
Înainte de efectuarea unui studiu, stabilitatea substanței chimice testate ar trebui evaluată utilizând informațiile existente referitoare la solubilitatea, degradabilitatea și volatilitatea sa.
In such case, place the remaining microtubes in the tube racks and freeze them in the freezer.
Soluțiile de testat din fiecare bazin replică la fiecare concentrație ar trebui eșantionate pentru analize de chimie analitică la începerea testării (ziua 0) și săptămânal pe durata testării, cu un minimum de patru eșantioane.
After the collection of the supernatant, discard the residue adequately.
De asemenea, se recomandă ca fiecare concentrație de testare să fie analizată pe durata pregătirii sistemului, înainte de începerea testării, în vederea verificării performanței sistemului.
Storage of the specimen
În plus, se recomandă ca soluțiile stoc să fie analizate atunci când sunt modificate, în special dacă volumul soluției stoc nu furnizează cantități corespunzătoare de substanțe chimice pentru a acoperi durata perioadelor de eșantionare de rutină.
Store the 0,5 ml microtubes containing the supernatant of the liver homogenate at ≤ – 70 °C until they are used for the ELISA.
În cazul substanțelor chimice care nu pot fi detectate la anumite concentrații sau la toate concentrațiile utilizate într-o testare trebuie măsurate soluțiile stoc și trebuie înregistrate debitele sistemului pentru a calcula concentrațiile nominale.
Zebrafish, Blood Collection from the Caudal Vein / Artery
Metoda utilizată pentru a introduce substanța chimică testată în sistem poate varia în funcție de proprietățile sale fizico-chimice.
Immediately following anaesthesia, the caudal peduncle is severed transversely, and the blood is removed from the caudal artery/vein with a heparinised microhematocrit capillary tube.
Substanțele chimice solubile în apă pot fi dizolvate în alicote de apă de testare la o concentrație care permite livrarea la concentrația de testare vizată în cadrul unui sistem cu flux continuu.
Blood volumes range from 5 to 15 μl depending on fish size.
Substanțele chimice care sunt lichide la temperatura camerei și greu solubile în apă pot fi introduse cu ajutorul metodelor care implică o saturare lichid:lichid.
An equal volume of aprotinin buffer (6 μgml in PBS) is added to the microcapillary tube, and plasma is separated from the blood via centrifugation (5 minutes at 600 g).
Substanțele chimice care sunt solide la temperatura camerei și greu solubile în apă pot fi introduse cu ajutorul unor coloane de saturare cu vată de sticlă (7).
Plasma is collected in the test tubes and stored at – 20 °C until analyzed for vitellogenin or other proteins of interest.
Se preferă utilizarea unui sistem de testare fără cărăuși, totuși, diferitele substanțe chimice testate vor avea proprietăți fizico-chimice diferite care probabil vor necesita diferite abordări pentru pregătirea apei de expunere la substanțe chimice.
Procedure 3B:
Este de preferat să se depună eforturi pentru a evita solvenții sau cărăușii deoarece:
Zebrafish, Blood Collection by Cardiac Puncture
anumiți solvenți pot fi ei înșiși toxici și/sau pot induce răspunsuri endocrinologice nedorite sau neașteptate, ii) testarea substanțelor chimice în concentrații care depășesc solubilitatea lor în apă (astfel cum se poate întâmpla frecvent în cazul solvenților) pot conduce la determinări inexacte ale concentrațiilor efective și iii) utilizarea solvenților în teste cu o durată mai lungă poate conduce la un grad semnificativ de formare de «biofilme» asociat cu activitatea microbiană.
To avoid coagulation of blood and degradation of protein the samples are collected within Phosphate-buffered saline (PBS) buffer containing heparin (1000 units/ml) and the protease inhibitor aprotinin (2 TIU/ml).
În ceea ce privește substanțele chimice care sunt dificil de testat, trebuie utilizat, în ultimă instanță, un solvent și trebuie consultat documentul de orientare al OCDE privind testarea toxicității acvatice a substanțelor și amestecurilor dificile (4) pentru a determina cea mai bună metodă.
As ingredients for the buffer, heparin ammonium salt and lyophilised aprotinin are recommended.
Solvenții care s-au dovedit eficienți pentru testarea toxicității acvatice includ acetona, etanolul, metanolul, dimetilformamida și trietilenglicolul.
For blood sampling, a syringe (1 ml) with a fixed thin needle (e.g. Braun Omnikan-F) is recommended.
În cazul în care este utilizat un solvent-cărăuș, concentrațiile solventului trebuie să fie sub concentrația fără efecte observabile (No Observed Effect Concentration – NOEC) cronică;
The syringe should be prefilled with buffer (approximately 100 μl) to completely elute the small blood volumes from each fish.
documentul de orientare al OCDE recomandă un maximum de 100μl/l;
The blood samples are taken by cardiac puncture.
o examinare recentă recomandă utilizarea de concentrații ale solvenților de maximum 20μl/l în apa de diluție (12).
At first the fish should be anesthetized with MS-222 (100 mg/l).
În cazul în care sunt utilizați solvenți-cărăuși, trebuie evaluate controalele cu solvent adecvate în plus față de controalele fără solvent (apă curată).
The proper plane of anaesthesia allows the user to distinguish the heartbeat of the zebrafish.
În cazul în care nu este posibilă administrarea unei substanțe chimice cu ajutorul apei, fie din cauza caracteristicilor fizico-chimice (solubilitate mică) sau disponibilitate limitată a substanței chimice, poate fi luată în considerare introducerea acesteia prin alimentație.
While puncturing the heart, keep the syringe piston under weak tension.
Au fost efectuate activități preliminare privind expunerile prin hrană;
Collectable blood volumes range between 20 - 40 microliters.
totuși, această rută de expunere nu este utilizată frecvent.
After cardiac puncture, the blood/buffer-mixture should be filled into the test tube.
Alegerea metodei trebuie documentată și verificată în mod analitic.
Plasma is separated from the blood via centrifugation (20 min; 5000 g) and should be stored at – 80 °C until required for analysis.
Stabilirea concentrației de testare mari
Procedure 3C:
În scopul acestei testări, concentrația de testare mare trebuie stabilită de limita de solubilitate a substanței chimice testate;
SOP:
concentrația maximă tolerată (maximum tolerated concentration – MTC) pentru substanțele chimice cu toxicitate acută;
Zebrafish, homogenisation of head & tail
sau 100 mg/l, oricare este concentrația cea mai mică.
The fish are anaesthetised and euthanised in accordance with the test description.
MTC este definită drept cea mai mare concentrație de testare a substanței chimice care determină o mortalitate acută de sub 10 %.
The head and tail are cut of the fish in accordance with Figure 1.
Utilizarea acestei metode presupune faptul că există date empirice privind mortalitatea acută pe baza cărora poate fi estimată MTC.
Important:
Cu toate că utilizarea de modele de regresie poate fi cea mai bună abordare din punct de vedere tehnic pentru a estima MTC, o aproximare utilă a MTC poate fi obținută din datele existente privind toxicitatea acută utilizând 1/3 din valoarea LC50 acute.
All dissection instruments, and the cutting board should be rinsed and cleaned properly (e.g. with 96 % ethanol) between handling of each single fish to prevent “vitellogenin pollution” from females or induced males to uninduced males.
Totuși, datele privind toxicitatea acută pot lipsi în cazul speciilor testate.
Cut behind
În cazul în care nu sunt disponibile date specifice privind toxicitatea acută pentru specii, poate fi efectuat un test LC50 de 96 de ore cu mormoloci reprezentativi (adică, în același stadiu) pentru cei testați în cadrul AMA.
Cut behind dorsal fin
În mod opțional, în cazul în care sunt disponibile date privind alte specii acvatice (ex., studii LC50 la pești și alte specii de amfibieni), judecata profesională poate fi utilizată pentru a estima o MTC probabilă pe baza extrapolării inter-specii.
For Vtg analysis
În mod alternativ, în cazul în care substanța chimică nu este toxică în mod acut și este solubilă la peste 100 mg/l, atunci valoarea de 100 mg/l ar trebui considerată concentrația de testare cea mai mare (highest test concentration – HTC), deoarece această concentrație este considerată în mod tipic ca fiind «practic netoxică».
For gonad histology
Deși nu este procedura recomandată, metode statice cu reînnoire pot fi utilizate în cazurile în care metodele cu flux continuu nu sunt adecvate pentru a obține MTC.