natgillin/translations-raw huggingface dataset:
The method described by Guthrie et al.
Prin urmare, este adecvată includerea în anexa IV la Directiva 2009/156/CE a unor metode de identificare și de detectare a anticorpilor ca metode complementare pentru diagnosticarea rapidă a pestei cabaline africane.
was specifically designed to ensure that horses from areas at risk of African horse sickness can be transported safely after the minimum quarantine period required in accordance with the Terrestrial Animal Health Code [6] of the OIE.
În consecință, anexa IV la Directiva 2009/156/CE ar trebui să fie modificată prin eliminarea testului ELISA competitiv și prin actualizarea procedurilor pentru testele ELISA indirect și ELISA de blocare în conformitate cu capitolul 2.5.1 din Manualul de teste de diagnostic și vaccinuri pentru animale terestre al OIE, ediția 2016, bazat pe versiunea adoptată de Adunarea mondială a delegaților OIE în mai 2012 [7].
It is therefore appropriate to incorporate in Annex IV to Directive 2009/156/EC methods for agent identification and for the detection of antibody as complementary methods for a rapid diagnosis of African horse sickness.
În același timp, procedurile RT-PCR în timp real, astfel cum sunt descrise de Agüero et al.
Annex IV to Directive 2009/156/EC should be therefore amended by deletion of the competitive ELISA test and by an updating the procedures for the indirect and blocking ELISA tests in accordance with Chapter 2.5.1. of the Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals of the OIE, Edition 2016 based on the Version adopted by the World Assembly of Delegates of the OIE in May 2012 [7].
, precum și de Guthrie et al.
At the same time, real-time RT-PCR procedures as described by Agüero et al.
, ar trebui să fie incluse în anexa respectivă pentru ca testele respective de identificare a agentului să fie disponibile pentru testarea înainte de deplasările animalelor.
as well as by Guthrie et al.
Prin urmare, Directiva 2009/156/CE ar trebui modificată în consecință.
should be included in that Annex to make those agent identification tests available for the purpose of pre-movement testing.
Măsurile prevăzute în prezenta decizie sunt conforme cu avizul Comitetului permanent pentru plante, animale, produse alimentare și hrană pentru animale,
Directive 2009/156/EC should therefore be amended accordingly.
ADOPTĂ PREZENTA DECIZIE:
HAS ADOPTED THIS DECISION:
Anexa IV la Directiva 2009/156/CE se înlocuiește cu textul din anexa la prezenta decizie.
Annex IV to Directive 2009/156/EC is replaced by the text set out in the Annex to this Decision.
Prezenta decizie se adresează statelor membre.
Article 2
Adoptată la Bruxelles, 14 octombrie 2016.
Done at Brussels, 14 October 2016.
Membru al Comisiei
For the Commission
JO L 192, 23.7.2010, p. 1.
Member of the Commission
Directiva 92/35/CEE a Consiliului din 29 aprilie 1992 de stabilire a normelor de control și a măsurilor pentru combaterea pestei cabaline africane (JO L 157, 10.6.1992, p. 19).
OJ L 192, 23.7.2010, p. 1.
A se vedea nota de subsol 2.
http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahc/current/chapitre_ahs.pdf
PARTEA A
See footnote 2.
Teste serologice
ANNEX
Metoda serologică descrisă în continuare reprezintă teste de imunoadsorbție cu anticorpi marcați enzimatic (ELISA) bazate pe capitolul 2.5.1 secțiunea B punctul 2 din Manualul de teste de diagnostic și vaccinuri pentru animale terestre, ediția 2016, astfel cum a fost adoptat de Adunarea mondială a delegaților OIE în mai 2012.
‘ANNEX IV
Proteina virală VP7 este un antigen major imunodominant al virusului pestei cabaline africane (VPCA) și există în toate cele nouă serotipuri ale VPCA.
AFRICAN HORSE SICKNESS
S-a dovedit că proteinele recombinante VP7 ale VPCA sunt stabile, inofensive și potrivite pentru a fi utilizate ca antigeni în procedurile ELISA pentru determinarea anticorpilor anti-VPCA cu un grad mare de sensibilitate și de specificitate [Laviada et al., 1992b [1]; Maree și Paweska, 2005].
DIAGNOSIS
Testul ELISA indirect și testul ELISA de blocare sunt cele două teste ELISA PCA-VP7 adecvate pentru diagnosticul serologic al pestei cabaline africane (PCA).1.
PART A
Test ELISA indirect pentru detectarea anticorpilor împotriva virusului pestei cabaline africane (VPCA)
Serological tests
Conjugatul utilizat în această metodă este o gamaglobulină anti-cal conjugată cu peroxidază de hrean care reacționează cu ser de cal, de catâr și de măgar.
The serological method described hereinafter are enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) based on point 2 of Section B in Chapter 2.5.1 of the Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, Edition 2016 as adopted by the World Assembly of Delegates of the OIE in May 2012.
Procedura de testare
The VP7 viral protein is an immuno-dominant major antigen of the African horse sickness virus (AHSV) and is conserved across the nine AHSV serotypes.
Faza solidă
Recombinant AHSV-VP7 proteins have been shown to be stable and innocuous and suitable to be used as antigens in ELISA procedures for determination of AHSV antibodies with a high degree of sensitivity and specificity (Laviada et al., 1992b [1]; Maree and Paweska, 2005).
Se toarnă în plăcile ELISA proteina recombinantă VP7 a VPCA de serotip 4 diluată într-un tampon carbonat/bicarbonat cu pH 9,6.
The indirect ELISA and the blocking ELISA are the two AHS-VP7 ELISA tests suitable for serological diagnosis of African horse sickness (AHS).
Se incubează plăcile peste noapte la 4 °C.
Indirect ELISA for the detection of antibodies to African horse sickness virus (AHSV)
Se clătesc plăcile de cinci ori cu apă distilată conținând 0,01 % (V/V) Tween-20 (soluție de spălare).
The antigen may be provided by the Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA), Spain, within 4 to 6 months of request.
Se înlătură soluția de blocare și se scutură ușor plăcile pe un material absorbant.
Test procedure
Eșantioane de testat
Solid phase
Eșantioanele de ser de testat și serurile de control pozitiv și negativ se diluează la 1/25 într-o SSTF + 5 % (G/V) lapte degresat + 0,05 % (V/V) Tween-20, 100 μl în fiecare godeu.
Coat ELISA plates with recombinant AHSV-4 VP7 diluted in carbonate/bicarbonate buffer, pH 9,6.
Se incubează timp de o oră la 37 °C.
Incubate plates overnight at 4 °C.
Pentru titrare, se efectuează serii de diluție de înjumătățire începând cu 1 la 25 (100 μl/godeu), utilizându-se câte un ser pentru o coloană a plăcii; se procedează la fel cu controalele pozitiv și negativ.
Wash the plates five times with distilled water containing 0,01 % (v/v) Tween 20 (washing solution).
Conjugat
Gently tap the plates onto absorbent material to remove any residual wash.
Se toarnă în fiecare godeu câte 100 μl de gamaglobuline anti-cal conjugate cu peroxidază de hrean diluate într-o SSTF + 5 % lapte + 0,05 % Tween-20 cu pH 7,2.
Block the plates with phosphate buffered saline (PBS) pH 7,2 + 5 % (w/v) skimmed milk (Nestlé Dry Skim MilkTM), 200 μl/well, for 1 hour at 37 °C.
Cromogen/substrat
Remove the blocking solution and gently tap the plates onto absorbent material.
Se adaugă 200 μl/godeu de soluție de cromogen/substrat [10 ml de DMAB (dimetilaminobenzaldehidă) 80,6 mM + 10 ml de MBTH (hidroclorură de 3-metil-2-benzotiazolină hidrazonă) 1,56 mM + 5 μl de H2O2].
Test samples
Se blochează reacția colorimetrică după aproximativ 5-10 minute (înainte să înceapă să se coloreze controlul negativ) prin adăugarea a 50 μl de H2SO4 3N.
Serum samples to be tested, and positive and negative control sera, are diluted 1 in 25 in PBS + 5 % (w/v) skimmed milk + 0,05 % (v/v) Tween 20, 100 μl per well.
Se pot utiliza și alți cromogeni, cum ar fi ABTS [acid 2,2′-azino-bis-(3-etilbenzotiazolină-6-sulfonic)], TMB (tetrametil de benzidină) sau OFD (ortofenildiamină).
Incubate for 1 hour at 37 °C.
Se citesc plăcile la 600 nm (sau 620 nm).
For titration, make a twofold dilution series from 1 in 25 (100 μl/well), one serum per plate column, and do the same with positive and negative controls.
Interpretarea rezultatelor
Conjugate
Se calculează valoarea-prag adăugând 0,06 la valoarea controlului negativ (0,06 este abaterea standard calculată pe baza unui grup de 30 de seruri negative).
Dispense 100 μl/well of horseradish-peroxidase (HRP) -conjugated anti-horse gamma-globulin diluted in PBS + 5 % milk + 0,05 % Tween 20, pH 7,2.
Eșantioanele testate care prezintă valori ale absorbanței inferioare valorii-prag sunt considerate negative.
Chromogen/Substrate
Eșantioanele testate care prezintă valori ale absorbanței superioare valorii-prag + 0,15 sunt considerate pozitive.
Add 200 μl/well of chromogen/substrate solution (10 ml of 80,6 mM DMAB (dimethyl aminobenzaldehyde) + 10 ml of 1,56 mM MBTH (3-methyl-2-benzo-thiazoline hydrazone hydrochlorid) + 5 μl H2O2).
Eșantioanele testate care prezintă valori ale absorbanței intermediare sunt neconcludente și trebuie utilizată o a doua tehnică pentru confirmarea rezultatului.
Colour development is stopped by adding 50 μl of 3N H2SO4 after approximately 5 to 10 minutes (before the negative control begins to be coloured).
Test ELISA de blocare pentru detectarea anticorpilor împotriva virusului pestei cabaline africane (VPCA)
Other chromogens such as ABTS (2,2′-Azino-bis-[3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid]), TMB (tetramethyl benzidine), or OPD (ortho-phenyldiamine) can also be used.
Testul ELISA de blocare competitiv este conceput pentru detectarea anticorpilor specifici VPCA în serurile provenite de la animale din orice specie de ecvidee, și anume cai, măgari, zebre și hibrizii acestora, prevenind problema specificității care este întâlnită ocazional atunci când se utilizează testele ELISA indirecte.
Read the plates at 600 nm (or 620 nm).
Principiul testului este blocarea reacției dintre proteina recombinantă VP7 absorbită în placa ELISA și un anticorp monoclonal conjugat specific proteinei VP7 a PCA (Mab).
Interpretation of the results
Anticorpii din serurile de testat vor bloca reacția dintre antigen și Mab, ceea ce va duce la atenuarea culorii.
Calculate the cut-off value by adding 0,06 to the value of the negative control (0,06 is the standard deviation derived with a group of 30 negative sera).
Deoarece Mab este îndreptat împotriva proteinei VP7, testul va fi foarte sensibil și foarte specific.
Test samples giving absorbance values lower than the cut-off are regarded as negative.
Testul ELISA de blocare competitiv este disponibil comercial.
Test samples giving absorbance values greater than the cut-off + 0,15 are regarded as positive.
Faza solidă
Test samples giving intermediate absorbance values are considered to be inconclusive and a second technique must be employed to confirm the result.
Se toarnă în plăcile ELISA 50-100 ng de proteină recombinantă VP7 a VPCA de serotip 4, diluată într-un tampon carbonat/bicarbonat cu pH 9,6.
Blocking ELISA for the detection of antibodies to African horse sickness virus (AHSV)
Se incubează peste noapte la 4 °C.
The competitive blocking ELISA is designed to detect specific AHSV antibodies in sera from animals of any equine species, i.e. horses, donkeys, zebra and their crosses, preventing the problem of specificity experienced occasionally using the indirect ELISAs.
Se spală plăcile de trei ori cu o soluție salină tamponată cu fosfat (SSTF) 0,1x conținând 0,135 M NaCl și 0,05 % (V/V) Tween-20 (SSTFT).
The principle of the test is the blocking of the reaction between the recombinant VP7 protein absorbed to the ELISA plate and a conjugated AHS-VP7 specific monoclonal antibody (Mab).
Se scutură ușor plăcile pe un material absorbant pentru a îndepărta orice urmă de apă.
Antibody in the test sera will block the reaction between the antigen and the Mab resulting in a reduction in colour.
Eșantioane de testat și controale
Because the Mab is directed against the VP7, the assay will give a high level of sensitivity and specificity.
Eșantioanele de ser de testat și serurile pozitiv și negativ de control se diluează 1 la 5 într-un diluant care conține 0,35 M NaCl, 0,05 % (V/V) Tween-20 și 0,1 % Kathon, 100 μl în fiecare godeu.
The competitive blocking ELISA is commercially available.
Pentru titrare, se efectuează serii de diluție de înjumătățire a serurilor de testat, începând cu 1 la 10 până la 1 la 280 în 8 godeuri (100 μl/godeu), utilizându-se câte un ser pentru o coloană a plăcii; se procedează la fel cu controalele pozitiv și negativ.
Solid Phase
Se incubează timp de o oră la 37 °C.
Coat ELISA plates with 50-100 ng of recombinant AHSV-4 VP7 diluted in carbonate/bicarbonate buffer, pH 9,6.
Se spală plăcile de cinci ori cu o soluție salină tamponată cu fosfat (SSTF) 0,1× conținând 0,135 M NaCl și 0,05 % (V/V) Tween-20 (SSTFT).
Incubate overnight at 4 °C.
Se depun în fiecare godeu câte 100 μl de Mab anti-VP7 conjugat cu peroxidază de hrean.
Wash the plates three times with phosphate buffered saline (PBS) 0,1× containing 0,135 M NaCl and 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST).
Înainte de această operațiune, Mab respectiv a fost diluat la 1/5000-1/15000 într-o soluție 1/1 de stabilizator StabiliZyme Select® (referința SurModics.: SZ03) în apă distilată.
Gently tap the plates on to absorbent material to remove any residual wash.
Se incubează timp de 30 de minute la 37 °C.
Test samples and controls
Se adaugă în fiecare godeu câte 100 μl din soluția de cromogen/substrat, și anume 1 ml de ABTS [acid 2,2′-azino-bis-(3-etilbenzotiazolină-6-sulfonic)] 5 mg/ml + 9 ml de tampon de substrat (0,1 M de tampon de fosfat-citrat cu pH 4 conținând 0,03 % H2O2), apoi se incubează timp de 10 minute la temperatura ambiantă.
Serum samples to be tested, and positive and negative control sera, are diluted 1 in 5 in diluent containing 0,35 M NaCl, 0,05 % (v/v) Tween 20 and 0,1 % Kathon, 100 μl per well.
Se blochează reacția colorimetrică prin adăugarea în fiecare godeu a 100 μl de SDS (dodecilsulfat de sodiu) 2 % (G/V).
For titration, make a twofold dilution series of the test sera from 1 in 10 to 1 in 280 across 8 wells (100 μl/well), one serum per plate column, and do the same with positive and negative controls.
Citire
Incubate for 1 hour at 37 °C.
Se citește la 405 nm într-un cititor de plăci ELISA.
Wash the plates five times with phosphate buffered saline (PBS) 0,1× containing 0,135 M NaCl and 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST).
Determinarea procentului de blocare (PB) din fiecare eșantion prin aplicarea următoarei formule, unde «Abs» înseamnă anticorpi:
Dispense 100 μl/well of horseradish peroxidase-conjugated Mab anti-VP7.
Abseșantion
In advance, this Mab has been diluted 1/5000-1/15000 in a 1/1 solution of StabiliZyme Select® Stabilizer (SurModics.
Eșantioanele care prezintă o valoare a PB mai mare de 50 % ar trebui considerate pozitive pentru anticorpi VPCA.
Reference: SZ03) in distilled water.
Eșantioanele care prezintă o valoare a PB mai mică de 45 % ar trebui considerate negative pentru anticorpi VPCA.
Incubate for 30 minutes at 37 °C.
Eșantioanele care prezintă o valoare a PB cuprinsă între 45 % și 50 % ar trebui considerate neconcludente și trebuie supuse din nou testelor.
Add 100 μl/well chromogen/substrate solution, i.e. 1 ml of ABTS (2,2′-Azino-bis-[3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid]) 5 mg/ml + 9 ml of substrate buffer (0,1 M Phosphate-Citrate buffer of pH 4 containing 0,03 % H2O2), and incubate for 10 minutes at room temperature.
Dacă rezultatul este tot neconcludent, animalele ar trebui retestate pe baza unor eșantioane prelevate nu mai devreme de două săptămâni de la prelevarea eșantionului considerat neconcludent.
Colour development is stopped by adding 100 μl/well of 2 % (w/v) SDS (sodium dodecyl sulphate).
PARTEA B
Reading
Identificarea agentului
Determine the blocking percentage (BP) of each sample by applying the following formula, where “Abs” stands for antibodies:
Testele de identificare a agentului bazate pe metode în care se utilizează acizi nucleici trebuie să detecteze tulpini de referință de la cele nouă serotipuri ale virusului VPCA.
Abscontrol
Metoda descrisă la punctul 2.1 se bazează pe capitolul 2.5.1 secțiunea B punctul 1.2 din Manualul de teste de diagnostic și vaccinuri pentru animale terestre, ediția 2016, astfel cum a fost adoptat de Adunarea mondială a delegaților OIE în mai 2012.
Abssample
Orice metodă de detectare bazată pe RT-PCR care este utilizată pentru testarea eșantioanelor, fie sânge, fie splină, în contextul Directivei 2009/156/CE, trebuie să fie cel puțin la fel de sensibilă cu metodologiile descrise la punctul 2.
Samples showing a BP value higher than 50 % should be considered as positive for AHSV antibodies.
Tulpinile de referință de virus inactivat din serotipurile 1-9 pot fi obținute de la laboratorul de referință al Uniunii Europene sau de la laboratorul de referință al OIE pentru pesta cabalină africană din Algete, Spania.
Samples showing a BP value lower than 45 % should be considered as negative for AHSV antibodies.
Extracția ARN-ului viral
Samples showing a BP value between 45 % and 50 % should be considered as inconclusive and must be retested.
Pentru a asigura o reacție bună este necesar să se extragă din eșantion un ARN al VPCA de înaltă calitate.
If the result is again inconclusive, the animals should be retested on samples taken not earlier than two weeks after the sample which was considered to be inconclusive was taken.
Extracția acizilor nucleici din eșantioanele clinice se poate realiza printr-o varietate de metode interne și de metode disponibile comercial.
PART B
Seturile comerciale utilizează metode diferite pentru izolarea ARN-ului.
Identification of the agent
Majoritatea se bazează pe una dintre următoarele proceduri:
Real-time Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction (rRT-PCR)
extracția cu fenol-cloroform a acizilor nucleici;
Agent identification tests based on nucleic acid methods must detect reference strains from the nine virus serotypes of the AHSV.
adsorbția acizilor nucleici într-un sistem de filtrare;
The method described in point 2.1 is based on point 1.2 of Section B in Chapter 2.5.1 of the Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, Edition 2016 as adopted by the World Assembly of Delegates of the OIE in May 2012.
adsorbția acizilor nucleici într-un sistem cu bile magnetice.
Any RT-PCR detection method used for the testing of samples, either blood or spleen, in the context of Directive 2009/156/EC must perform equal to or exceed the sensitivity of the methodologies described in point 2.
Un exemplu de extracție internă a ARN-ului este indicat mai jos:
Inactivated virus of serotypes 1 to 9 reference strains may be obtained from the European Union Reference Laboratory or the OIE Reference Laboratory for African horse sickness, Algete, Spain.
Un eșantion de 1 g de țesut este omogenizat în 1 ml de soluție de denaturare (tiocianat de guanidină 4 M, citrat de sodiu 25 mM, 2-mercaptoetanol 0,1 M, sarcozil 0,5 %).
Extraction of viral RNA
După centrifugare, la supernatant se adaugă 1 μg de ARN de drojdie, 0,1 ml de acetat de sodiu 2 M cu pH 4, 1 ml de fenol și 0,2 ml de amestec de cloroform/alcool izoamilic (49/1).
To assure a good reaction it is necessary to extract from the sample an AHSV RNA of high quality.
Suspensia se scutură energic și se răcește pe gheață timp de 15 minute.
The extraction of nucleic acids from clinical samples can be performed by a variety of in-house and commercially available methods.
După centrifugare, ARN-ul prezent în faza apoasă este extras cu fenol, precipitat cu etanol și resuspendat în apă sterilă.
Commercial kits use different approaches for RNA isolation.
Procedura RT-PCR în timp real
Most are based on one of the following procedures:
RT-PCR în timp real specifică de grup, de Agüero et al., 2008 [3]
Phenol-chloroform extraction of nucleic acids;
Această RT-PCR în timp real specifică de grup vizează proteina VP7 a VPCA și poate detecta toate serotipurile și tulpinile cunoscute de VPCA care circulă în prezent.
Adsorption of nucleic acids to filter system;
Primer și secvențe de probe pentru detectarea virusurilor din specia VPCA:
Adsorption of nucleic acids to magnetic beads system.
Primer sens 5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′
An example of an in-house RNA extraction is given below:
Primer antisens 5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′
1 g of tissue sample is homogenised in 1 ml of denaturing solution (4 M guanidium thiocyanate, 25 mM sodium citrate, 0,1 M 2-mercaptoethanol, 0,5 % sarcosyl).
Probă MGB-TaqMan 5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′
After centrifugation, 1 μg of yeast RNA, 0,1 ml of 2 M sodium acetate pH 4, 1 ml of phenol and 0,2 ml of chloroform/isoamyl alcohol mixture (49/1) are added to the supernatant.
Concentrația soluției de primer este diluată la o concentrație de lucru de 8 μM («soluție de primer de lucru 8 μM»), în timp ce proba este diluată la o concentrație de lucru de 50 μM («soluție de probă de lucru 50 μM»).
The suspension is vigorously shaken and cooled on ice for 15 minutes.
Trebuie concepută o dispoziție a plăcii de testat, care trebuie încărcată în softul mașinii de PCR în timp real.
After centrifugation, the RNA present in the aqueous phase is phenol extracted, ethanol precipitated and resuspended in sterile water.
Utilizând dispoziția ca ghid, se adaugă 2,5 μl din fiecare soluție de primer de lucru 8 μM în fiecare godeu care va conține eșantioane de ARN, controale pozitiv și/sau negativ (concentrația finală a primerului va fi de 1 μM în cei 20 μl de amestec RT-PCR).
Real-time RT-PCR Procedure
Placa se ține pe gheață.
This group-specific real-time RT-PCR targets VP7 of the AHSV and is able to detect all known AHSV serotypes and strains currently circulating.
Acest amestec este denaturat prin încălzire la 95 °C timp de 5 minute, urmată de o răcire rapidă pe gheață timp de cel puțin 5 minute.
It has been employed with very good results by the participating national reference laboratories of the European Union Member States in the proficiency tests annually organised by the European Union Reference Laboratory for the period 2009-2015.
Se pregătește, conform instrucțiunilor producătorului, un volum adecvat de amestec principal pentru RT-PCR în timp real într-o singură etapă, pentru numărul de eșantioane care trebuie să fie testate.
Moreover, in an international ring trial organised in 2015 in the framework of the OIE reference laboratories network this protocol was ranked very high amongst others.
În fiecare godeu care conține eșantioane de ARN se adaugă 0,1 μl de soluție de probă de lucru 50 μM (concentrația finală a probei va fi de 0,25 μM în fiecare godeu care conține eșantioane de ARN).
Primer and probe sequences for the detection of AHSV species viruses:
Se distribuie, în fiecare godeu al plăcii PCR care conține ARN-ul și primerii denaturați, 13 μl de amestec principal pentru RT-PCR în timp real într-o singură etapă.
forward Primer 5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′
Se pune placa într-un thermocycler în timp real programat pentru transcriere inversă și pentru detectarea ADNc prin fluorescență/amplificare.
reverse Primer 5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′
Condițiile de amplificare constau într-o primă etapă de transcriere inversă la 48 °C timp de 25 de minute, urmată de 10 minute la 95 °C («hot start») și de 40 de cicluri de 15 secunde la 95 °C, de 35 de secunde la 55 °C și de 30 de secunde la 72 °C (sau 40 de cicluri la 97 °C timp de 2 secunde și la 55 °C timp de 30 de secunde dacă se utilizează reactivi și un thermocycler care permit reacții rapide).
MGB-TaqMan probe 5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′
Datele privind fluorescența sunt obținute la sfârșitul etapei de 55 °C.
Primer stock concentration is diluted to a working concentration of 8 μM (“primer working stock 8 μM”) whereas probe is diluted to a working concentration of 50 μM (“probe working stock 50 μM”).
Dacă se obțin curbe de amplificare atipice, testul nu este considerat valabil și trebuie repetat.
A test plate layout should be designed and loaded into the real time PCR machine software.
Eșantioanele sunt considerate pozitive dacă valoarea Ct (numărul ciclului la care fluorescența generată în cadrul unei reacții depășește pragul de fluorescență) este mai mică sau egală cu pragul Ct definit (35) în decurs de maximum 40 de cicluri PCR (Ct ≤ 35).