natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Supernatant prepared as described in point I.4.3 may be submitted to ELISA, Indirect fluorescent antibody test (IFAT), or RT-PCR in accordance with point I.6.1, point I.6.2 or point I.6.4 respectively.
Pot fi utilizate kituri de extracție a ADN-ului disponibile pe piață, care permit obținerea unui ADN de înaltă calitate, ce poate fi utilizat în protocoalele PCR menționate la punctul I.2.
Tissue material may be subjected to other diagnostic techniques, such as IFAT on frozen sections, immunohistochemistry on formalin fixed tissue material.
Detectarea și identificarea agentului prin metode bazate pe reacția de polimerizare în lanț (PCR)
Those rapid techniques shall be supplemented with a virological examination in accordance with either point II(a) or point II(b) within 48 hours after sampling, if:
I.2.1. qPCR pentru detectarea KHV
a negative result is obtained; or
Pentru detectarea KHV se efectuează următorul test qPCR:
a positive result is obtained with material representing the first case of IHN or VHS.
Primer sens (KHV-86f): 5′- GACGCCGGAGACCTTGTG -3′;
Low MOI for inoculation (< 1) shall be used.
Primer sens (KHV-TKf): 5′-GGGTTACCTGTAC GAG-3′;
1 week after freezing, three replicate vials with each virus shall be thawed under cold water and titrated on their respective cell lines.
Dimensiunea produsului ar trebui să fie de 409 pb.
At least every 6 months, or if it is suspected that the susceptibility of a cell line has decreased, each virus isolate shall be thawed and titrated.
În plus, se pot obține rezultate fals pozitive din cauza unor erori în ceea ce privește atașarea primerilor sau din cauza contaminării.
Titration procedures must be described in detail and the same procedure followed each time.
Cu toate acestea, alternativ se pot aplica și alte versiuni de PCR, cu eficacitate similară dovedită.
Titration by end point dilution shall include at least six replicates at each dilution step.
Prima detectare într-o anumită zonă trebuie să fie confirmată prin secvențiere sau trimisă la un laborator național de referință sau la un laborator de referință al Uniunii Europene pentru bolile peștilor, menționat în anexa VI la Directiva 2006/88/CE, în scopul identificării imediate a virusului.
The titres shall be compared with previously obtained titres.
Metode și proceduri de diagnostic detaliate pentru supravegherea KHVD
If the titre of any of the three virus isolates drops by a factor of 2 logs or more, compared with the initial titre, the cell line shall no longer be used for surveillance purposes.
În cazul în care sunt prelevate eșantioane și sunt realizate examene de laborator în scopul obținerii sau al menținerii unui anumit statut sanitar în ceea ce privește KHVD, astfel cum este prevăzut în partea 2 secțiunea I din anexa I, utilizând metodele de diagnostic prevăzute în partea 2 secțiunea II sau III din anexa menționată, trebuie aplicate metodele și procedurile de diagnostic detaliate prevăzute la următoarele puncte II.1 și II.2 din prezenta parte.
If different cell lines are kept in the laboratory each line shall be examined separately.
Dacă este posibil, trebuie să fie incluși în eșantion pești care au fost ținuți o perioadă de timp îndelungată la temperaturi propice dezvoltării virusului (și anume o perioadă de două până la trei săptămâni la temperaturi cuprinse între 15 °C și 26 °C).
Records shall be kept for a period of at least 10 years.
Dacă este posibil, eșantioanele sunt colectate la minimum 24 de ore, dar nu mai târziu de 72 de ore după practicile de gestionare care pot reactiva virusul la peștii-vector, cum ar fi prinderea în plase sau transportul, în vederea sporirii șanselor de detectare a KHV.
DETAILED DIAGNOSTIC METHODS AND PROCEDURES FOR THE SURVEILLANCE AND CONFIRMATION OF KHV DISEASE (KHVD)
În scopul supravegherii KHVD se pot trimite pești vii sau sacrificați și ambalați separat în recipiente aseptice sigilate sau, alternativ, organe congelate sau fragmente de organe conservate în alcool 80 %-100 % sau într-un mediu de transport viral (în vederea prelucrării în termen de 48 de ore după colectare) pentru testare prin metode bazate pe PCR.
I. Detailed diagnostic methods and procedures for the confirmation of the presence of or to rule out the suspicion of KHVD
Pentru supravegherea KHVD se va colecta țesut din branhii și din rinichi.
When a laboratory examination is required for the purpose of confirmation of the presence of or to rule out the suspicion of KHVD in accordance with Article 57(b) of Directive 2006/88/EC, using the diagnostic methods set out in Section III of Part 2 of Annex I, the detailed diagnostic methods and procedures set out in points I.1 – I.2 of this Part shall apply.
În scopul supravegherii KHVD, trebuie să se evite comasarea țesuturilor de la mai mulți pești, dacă este posibil.
Preparation of samples from fish
Dacă această comasare este necesară, se vor comasa țesuturi care provin de la cel mult doi pești.
For diagnostic purposes the fish (sent alive or killed and packed separately in sealed aseptic containers) or alternatively frozen organs or organ pieces preserved in 80 % to absolute ethanol or viral transport medium (to be processed within 48 hours after collection) may be used for testing with conventional PCR or qPCR based methods.
Pot fi utilizate kituri de extracție a ADN-ului disponibile pe piață, care permit obținerea unui ADN de înaltă calitate, ce poate fi utilizat în protocoalele PCR menționate la punctul II.2.
For the detection of KHV, gill and kidney shall be collected; in addition spleen, encephalon and intestine may be included in an additional separated sample.
Raportul acceptabil între țesuturi și mediu este de 1:9 g/v.
In acute cases, tissue material of up to five fish may be pooled.
Testele trebuie să fie realizate pe 20-25 mg de țesut.
Furthermore, non-lethal samples such as blood, gill swabs, gill biopsy, mucus scrape may be used in certain cases (namely very valuable fish may be used in the case of the suspicion of the presence of KHV).
Supravegherea KHVD prin metode bazate pe PCR
DNA extraction
Pentru supravegherea KHV trebuie utilizată qPCR.
DNA shall be extracted in accordance with standard procedures.
În cazul în care apar eșantioane pozitive într-o zonă care nu a fost anterior confirmată pozitiv, rezultatele testelor trebuie să fie confirmate:
The commercially available DNA extraction kits that produce high quality DNA suitable for use with the PCR protocols referred to in point I.2 may be used.
fie prin secvențierea produsului PCR sau nested PCR, obținut din eșantioane.
Agent detection and identification by Polymerase chain reaction (PCR) based methods
Secvența consens obținută trebuie să coincidă (cel puțin în proporție de 98 %) cu secvențele de referință;
I.2.1. qPCR for KHV detection
fie, alternativ, eșantioanele pot fi trimise la un laborator național de referință pentru confirmare.
For qPCR detection of KHV, the following qPCR assay shall be used:
qPCR pentru detectarea KHV
Forward primer (KHV-86f): 5′- GACGCCGGAGACCTTGTG -3′;
Trebuie aplicat protocolul de qPCR descris în cele ce urmează:
Reverse primer (KHV-163r): 5′- CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT -3′;
Succesiunea ciclurilor: un ciclu la 95 °C timp de 15 minute, apoi 50 de cicluri la 94 °C timp de 15 secunde și la 60 °C timp de 60 de secunde.
and probe (KHV-109p): 5′-FAM- CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG -3′.
Rezultatele qPCR pot varia în funcție de condițiile în care este realizată metoda, și anume ar putea fi necesară optimizarea protocoalelor termice, în funcție de termociclul utilizat.
Cycling conditions: one cycle of 95 °C at 15 minutes, followed by 40 cycles of 94 °C at 15 seconds and 60 °C for 60 seconds.
PCR convențională pentru confirmarea detectării KHV
However, other qPCR versions of proven similar efficacy may be used instead.
Pentru confirmarea prezenței infecției cu KHV se utilizează protocolul generic de nested PCR descris în tabelul 2.1 de mai jos, urmat de secvențierea produsului de amplificare.
Conventional PCR for KHV detection
Tabelul 2.1
The assay described in this point targeting the Thymine kinase (TK) gene of KHV shall be used.
Primeri și condiții pentru protocolul de nested PCR care vizează toate virusurile herpetice ale ciprinidelor (CyHV-1, CyHV-2 și CyHV-3)
However, other PCR assays with demonstrated similar sensitivities and specificities to the described assay may be used instead.
Denumirea primerului
Forward primer (KHV-TKf): 5′-GGGTTACCTGTAC GAG-3′;
Secvența
Reverse primer (KHV-TKr): 5′-CACCCAGTAGATTA TGC-3′.
Succesiunea ciclurilor
Cycling conditions: one cycle of 95 °C for 5 minutes followed by 35 cycles of 95 °C for 30 seconds, 52 °C for 30 seconds, 72 °C for one minute and one cycle of 72 °C for 10 minutes.
Dimensiunea produsului
Product size should be 409 bp.
CyHVpol-sens
Furthermore, false-positive results may occur because of false primer annealing or contamination.
Prima fază PCR
Detailed diagnostic methods and procedures for the surveillance of KHVD
40 de cicluri:
When sampling and laboratory examination for the purpose of obtaining or maintaining certain health statuses with regard to KHVD as set out in Section I of Part 2 of Annex I are carried out using the diagnostic methods set out in Sections II or III of Part 2 of that Annex, the detailed diagnostic methods and procedures set out in the following points II.1 and II.2 of this Part shall apply.
95 °C timp de 30 de secunde
If possible, fish that have been kept for a prolonged time period at the virus permissive temperature range (namely, 2 to 3 weeks at 15 °C to 26 °C) shall be sampled.
55 °C timp de 30 de secunde
If possible, samples shall be collected 24 hours but not later than 72 hours after management practices that may reactivate the virus in fish with a carrier status, such as netting or transport, in order to enhance the chance of KHV detection.
72 °C timp de 45 de secunde
For the purpose of the surveillance of KHVD, the fish may be sent alive or killed and packed separately in sealed aseptic containers or alternatively frozen organs or organ pieces preserved in 80 % to 100 % alcohol or viral transport medium (to be processed within 48 hours after collection) may be used for testing PCR based methods.
72 °C timp de 10 de minute
For the surveillance of KHVD, gill and kidney tissue shall be collected.
CyHVpol-antisens
For the purpose of surveillance of KHVD, pooling shall be avoided where possible.
CyHVpol-intern sens
If pooling is necessary, tissue material from a maximum of two fish may be pooled.
A doua fază PCR
Larger samples shall be homogenised in mortar and pestle or stomacher, and subsamples retrieved for DNA extraction before clarification.
95 °C timp de 2 minute
Alternatively, subsamples may be collected from each tissue included in the sample and placed in ‘lysis-tubes’.
CyHVpol-intern antisens
Commercially available DNA extraction kits that produce high quality DNA suitable for use with the PCR protocols set out in point II.2 may be used.
Alternativ, se pot aplica și alte versiuni de PCR, cu eficacitate similară dovedită.
The acceptable tissue medium ratio shall be 1:9 w/v.
Secvențierea poate fi efectuată de laborator sau de societăți externe specializate în secvențiere.
20 to 25 mg tissue material shall be included in the tests.
Rezultatele secvențierii trebuie să fie analizate comparând secvențele cu secvențele de referință ale KHV cunoscute (numere de acces la GenBank AP008984, DQ657948 și DQ177346).
Surveillance of KHVD by PCR based methods
Secvența consens obținută trebuie să coincidă cel puțin în proporție de 98 % cu aceste secvențe de referință.
For the surveillance of KHV, a qPCR shall be used.
METODE ȘI PROCEDURI DE DIAGNOSTIC DETALIATE PENTRU SUPRAVEGHEREA ȘI CONFIRMAREA ANEMIEI INFECȚIOASE A SOMONULUI (AIS)
If positive samples appear in an area not previously confirmed positive, the test results shall be confirmed either:
I. Proceduri de eșantionare pentru supravegherea și combaterea AIS
by sequencing of a PCR or nested PCR product from the samples.
În cazul în care sunt prelevate eșantioane și sunt realizate examene de laborator în scopul programelor de supraveghere și de eradicare prevăzute în partea 3 din anexa I sau pentru a confirma sau a exclude prezența AIS în conformitate cu articolul 57 litera (b) din Directiva 2006/88/CE, trebuie aplicate metodele și procedurile detaliate prevăzute la punctele I.1, I.2 și I.3 din prezenta secțiune.
The obtained clean consensus sequence shall match (by at least 98 %) with these reference sequences.
În scopul examinării de laborator pentru depistarea prezenței AIS, eșantioanele de pești nu trebuie să fie comasate, în măsura în care este posibil.
or alternatively, samples may be sent to a national reference laboratory for confirmation.
Cu toate acestea, în scopul supravegherii AIS, se acceptă comasarea a 2-5 pești.
qPCR for KHV detection
Trebuie prelevate eșantioane pentru analiza RT-PCR de la toți peștii care fac parte din eșantion.
The qPCR described as follows shall be used:
Se prelevă un fragment de rinichi median de la pești cu ajutorul unui instrument steril și acesta se transferă într-un microtub de centrifugare care conține 1 ml de soluție de conservare a ARN, cu eficacitate dovedită.
Cycling conditions: one cycle of 95 °C at 15 minutes, followed by 50 cycles of 94 °C at 15 seconds and 60 °C for 60 seconds.
Într-un tub cu soluție de transport se pot colecta țesuturi de la cel mult cinci pești; acesta constituie un eșantion global.
The results of the qPCR may vary depending on the conditions under which it is performed, namely the thermal protocols might need optimisation, depending on the thermal cycler in use.
Greutatea țesutului dintr-un eșantion trebuie să fie de 0,5 g.
Conventional PCR for confirmation of KHV detection
În cazul în care peștii sunt prea mici pentru a preleva eșantioane cu greutatea necesară, se pot preleva fragmente din rinichi, inimă, splină, ficat sau cecurile pilorice, în această ordine a preferințelor, pentru a se obține o greutate de 0,5 g.
For confirmation of the presence of infection with KHV, the generic nested PCR described in the following Table 2.1 shall be used followed by sequencing of the amplified product.
Țesuturile destinate unei examinări histologice sunt prelevate numai de la peștii sacrificați recent, cu constituție normală, care prezintă semne clinice sau care au făcut obiectul unor constatări post-mortem compatibile cu prezența AIS.
Table 2.1
Se prelevă orice leziune externă sau internă și, în toate cazurile, de la fiecare pește se prelevă, cu ajutorul unui scalpel, eșantioane de rinichi median, de inimă, de ficat, de pancreas, de intestin, de branhii și de splină, care apoi sunt transferate într-o soluție salină tamponată cu formol 8-10 % (vol/vol).
Primers and conditions for the nested PCR assay targeting all cyprinid herpesviruses (CyHV-1, CyHV-2 and CyHV-3)
Raportul dintre agentul de fixare și țesuturi trebuie să fie de cel puțin 20:1, pentru a garanta o conservare satisfăcătoare a țesuturilor.
Primer name
Pentru imunohistochimie (IHC) trebuie prelevate eșantioane de rinichi median și de inimă.
Sequence
Țesuturile utilizate pentru examinarea virusologică pe cultură celulară se prelevă de la toți peștii din eșantion.
Cycling conditions
De la pești se prelevă, cu ajutorul unui instrument steril, fragmente de ficat, de rinichi anterior sau median, de inimă și de splină, care sunt transferate în tuburi de plastic ce conțin 9 ml de mediu de transport.
Product size
Într-un tub care conține soluție de transport se pot colecta țesuturi prelevate de la cel mult cinci pești: acestea constituie un eșantion global.
CyHVpol-forward
Greutatea țesutului dintr-un eșantion trebuie să fie de 1,0 ± 0,5 g.
First round PCR
Expedierea eșantioanelor de la pești
1 cycle:
Se pot transporta pești întregi către laborator în cazul în care sunt îndeplinite condițiile de temperatură pe durata transportului, astfel cum sunt descrise la al treilea paragraf de la prezentul punct.
95 °C 2 minutes
Peștii întregi sunt înfășurați în hârtie absorbantă și expediați într-un sac de plastic, răcirea făcându-se în conformitate cu precizările de la paragraful menționat.
40 cycles:
De asemenea, pot fi transportați pești vii, dar numai sub supravegherea laboratorului național de referință pentru bolile peștilor și ținând seama de aspectele suplimentare referitoare la dezinfecție și la biosecuritate aferente transportului de pești vii.
95 °C for 30 seconds
Eșantioanele de sânge și tuburile cu țesuturi de pește destinate examenului virusologic sau analizei RT-PCR sunt amplasate în recipiente izolate, cum ar fi cutiile de polistiren cu pereți groși, cu o cantitate suficientă de gheață sau de blocuri refrigeratoare pentru a asigura refrigerarea eșantioanelor pe durata transportului către laborator.
55 °C for 30 seconds
Trebuie să se evite congelarea și recipientul de transport trebuie să aibă încă gheață în momentul recepției sau unul sau mai multe din blocurile refrigeratoare trebuie să fie încă parțial sau complet înghețate.
72 °C for 45 seconds
În mod excepțional, eșantioanele destinate analizei RT-PCR și cele destinate examenului virusologic pot fi congelate rapid și transportate spre laborator la o temperatură de – 20 °C sau mai mică.
72 °C for 10 minutes
Pentru analiza RT-PCR a țesuturilor conservate în RNAlater, extracția ARN se realizează în următoarele termene, care variază în funcție de temperatura la care sunt depozitate eșantioanele:
CyHVpol-reverse
eșantioane depozitate la – 20 °C: termen nelimitat.
CyHVpol-internal forward
În cazul în care țesuturile de pești sunt transportate într-un agent de fixare, în vederea examenului histologic, expedierea se face în tuburi etanșe, amplasate în recipiente rezistente la șoc.
Second round PCR
Trebuie evitată congelarea acestor eșantioane.
95 °C 2 minutes,
Sub rezerva aprobării de către laboratorul de diagnostic, se pot colecta și pregăti alte țesuturi de pești decât cele menționate la punctul I.1, în vederea unor examinări suplimentare.
CyHVpol-internal reverse
Metode și proceduri de diagnostic detaliate pentru supravegherea și pentru confirmarea prezenței AIS sau pentru excluderea suspiciunii privind această boală
PCR versions of proven similar efficacy may be used instead.
În cazul în care se efectuează examene de laborator în scopul obținerii sau al menținerii unui anumit statut sanitar în ceea ce privește AIS, astfel cum se prevede în partea 3 secțiunea I din anexa I, sau în scopul confirmării prezenței AIS sau al excluderii suspiciunii privind această boală, în conformitate cu articolul 57 litera (b) din Directiva 2006/88/CE, folosind metodele de diagnostic prevăzute în partea 3 secțiunea II din anexa I, trebuie aplicate metodele și procedurile detaliate prevăzute la punctele II.1-II.5 următoare.
Sequencing may be performed by the laboratory or at external specialised sequencing companies.
Examinarea eșantioanelor prin RT-PCR
Sequencing results shall be analysed by aligning the sequences to the known reference sequences of KHV (Gen Bank accession numbers AP008984, DQ657948 and DQ177346).
Metoda de diagnostic care trebuie utilizată pentru depistarea VAIS este RT-qPCR.
The obtained clean consensus sequence must match at least to 98 % with those reference sequences.
Întrucât rezultatele RT-qPCR pot varia în funcție de condițiile în care este realizată metoda, trebuie să fie incluse controale și produse de amplificare pozitive și negative adecvate, pentru a se evita orice dubiu.
DETAILED DIAGNOSTIC METHODS AND PROCEDURES FOR THE SURVEILLANCE AND CONFIRMATION OF INFECTIOUS SALMON ANEMIA (ISA)
Extracția ARN-ului total
I. Sampling procedures for the surveillance and control of ISA
Se extrage ARN-ul total prin metoda fenol-cloroform sau prin cromatografie de afinitate pe coloane, în conformitate cu instrucțiunile producătorului.
When sampling and laboratory examination are carried out, for the purpose of the surveillance or eradication programmes set out in Part 3 of Annex I or to confirm or rule out the presence of ISA in accordance with Article 57(b) of Directive 2006/88/EC, the detailed methods and procedures set out in points I.1, I.2 and I.3 of this Section shall apply.
ARN-ul purificat este resuspendat în apă distilată fără ARN-ază (și anume, apă tratată cu 0,1 % pirocarbonat de dietil).
For the purpose of laboratory examination for the presence of ISA, fish samples shall not be pooled where possible.
Concentrația și puritatea ARN-ului extras trebuie să fie estimate măsurând densitatea optică la 260 nm și la 280 nm.
However, for the purpose of surveillance for ISA, the pooling of 2 to be 5 fish is accepted.
O metodă alternativă constă în includerea de controale interne care vizează genomul virusului, astfel cum se menționează la punctul II.1.3.
Samples for Reverse Transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis shall be taken from all of the fish sampled.
RT-PCR pentru depistarea VAIS
A piece of mid-kidney shall be removed from the fish using a sterile instrument and transferred to a microfuge tube containing one ml RNA preservative solution of proven efficacy.
Pot fi utilizate mai multe metode RT-PCR pentru amplificarea genomului VAIS.
Tissue from up to five fish may be collected in one tube of transport solution and shall represent one pooled sample.
Se poate efectua RT-PCR în două etape, reacțiile de RT și de PCR desfășurându-se în două tuburi distincte.
The weight of tissue in one sample shall be 0,5 g.
Cu toate acestea, este posibilă și o reacție într-o singură etapă, în care cele două reacții au loc într-un singur tub.
When the fish are too small to obtain a sample of the required weight, pieces of kidney, heart, spleen, liver or pyloric caeca may be taken, in that order of preference, to make up 0,5 g.
Atunci când este posibil, se folosește metoda într-o singură etapă, căci utilizarea unui singur tub reduce la minimum riscul de contaminare încrucișată, dat fiind că nu trebuie transferat conținutul; se consideră că această metodă are aceeași sensibilitate ca și metoda în două etape.
Tissue for histological examination shall only be taken from freshly killed fish with a normal constitution, exhibiting clinical signs or post-mortem findings consistent with the presence of ISA.
Trebuie utilizați primerii și testul descriși la acest punct, și anume perechea de primeri ILA1 sau ILA2 care vizează segmentul 8 și care au fost apreciați drept adecvați pentru depistarea VAIS în cazul focarelor și la peștii-vector.
Any external or internal lesions shall be sampled and in any case samples of mid-kidney, heart, liver, pancreas, gut, gills and spleen shall be removed from individual fish using a scalpel and transferred to 8 % to 10 % (vol:vol) buffered formol saline.
Primerul antisens ILA2 nu corespunde izolatelor care provin din America de Nord; în aceste cazuri trebuie utilizat un alt primer.
The ratio of fixative to tissue shall be at least 20:1 to ensure satisfactory preservation of the tissues.
Primer sens (ILA1): 5′-GGCTATCTACCATGAACGAATC-3′;
For immunohistochemistry (IHC), samples from mid-kidney and heart shall be taken.
Primer antisens (ILA2): 5′-GCCAAGTGTAAGTAGCACTCC-3′.
Tissues for virological examination on cell culture shall be taken from all of the fish sampled.
Succesiunea ciclurilor: un ciclu la 50 °C timp de 30 de minute, 1 ciclu la 94 °C timp de 15 minute, 40 de cicluri la 94 °C timp de 30 secunde, la 55 °C timp de 30 de secunde și la 72 °C timp de 60 de secunde; un ciclu la 72 °C timp de 5 minute.
Pieces of the liver, anterior or mid-kidney, heart and spleen shall be removed from the fish using a sterile instrument and transferred to plastic tubes containing 9 ml transport medium.
Cu toate acestea, alternativ se pot aplica și alte versiuni de RT-PCR, cu eficacitate similară dovedită.
Tissues from up to five fish may be collected in one tube containing transport solution and represent one pooled sample.
RT-qPCR pentru depistarea VAIS
The weight of tissue in one sample shall be 1,0 ± 0,5 g.
Utilizarea RT-qPCR poate crește specificitatea și, probabil, sensibilitatea.
Shipment of samples from fish
Metoda se desfășoară mai rapid, deoarece nu este necesară etapa electroforezei în gel, și reduce riscul de contaminare încrucișată, deoarece este posibil să se estimeze cantitatea de ARN viral genomic în tubul cu materialul de testat.