natgillin/translations-raw huggingface dataset:
If cytotoxicity occurs within the first 7 days of incubation, subcultivation shall be performed at that stage, and the cells shall be incubated for 14 to 18 days and sub cultivated again with a further period of 14 to 18 days incubation.
Pentru ca un test să fie valabil, controalele pozitive trebuie să dea un rezultat pozitiv, iar cele negative un rezultat negativ.
If cytotoxicity occurs after 7 days, subcultivation shall be performed once and the cells shall be incubated to achieve the total period of 28 to 36 days incubation from the primary inoculation.
Examinarea altor țesuturi
If bacterial contamination occurs in the primary culture, the test shall be set up again using the tissue homogenate stored at – 80 °C.
Tehnica menționată la punctul II.2.6 poate fi aplicată și altor țesuturi de pește, precum ficatul, splina și inima, cu condiția ca pe lamă să se poată depune o cantitate suficientă de celule endoteliale, de leucocite sau de limfocite.
Prior to inoculation, the tissue homogenate shall be centrifuged at 4000 × g for 15 to 30 minutes at 0 to 6 °C and the supernatant shall be filtered at 0,22 μm.
Procedura de colorare este identică pentru toate țesuturile, chiar dacă pentru unele dintre ele este preferabil să se renunțe la colorarea cu iodură de propidiu și să se utilizeze iluminarea în faze pentru identificarea tipurilor de celule prezente pe amprentă.
If bacterial contamination occurs during the subcultivation step the supernatant shall be filtered at 0,22 μm, inoculated onto fresh cells and incubated for a further 14 to 18 days.
Histologia
Virus identification tests
Secțiunile incluse în parafină vor fi tăiate la 5 μm și colorate folosindu-se hematoxilină și eozină.
If evidence of CPE is observed at any stage, or if a haemadsorption test is positive, virus identification shall be carried out.
În cazul somonului de Atlantic care prezintă semne clinice ale bolii, modificările histologice sunt variabile, dar pot include următoarele elemente:
The methods of choice for the identification of ISAV shall be RT-PCR in accordance with point II.1 and Immunofluorescence (IF) in accordance with point II.2.6.
numeroase eritrocite în sinusul venos central și în capilarele lamelare ale branhiilor, unde se pot forma și trombi de eritrocite;
If it is considered that other viruses may be present, supplementary virus identification tests shall be carried out.
peteșii multifocale sau confluente sau necroza hepatocitelor, sau ambele, la o anumită distanță de vasele de sânge mai mari din ficat; acumulare multifocală de eritrocite în sinusoidele hepatice dilatate;
If those tests have not resulted in a definitive identification of the virus within 1 week, the supernatant shall be forwarded for immediate identification to:
acumulare de eritrocite în vasele de sânge din lamina propria intestinală și, în cele din urmă, hemoragie în lamina propria;
the World Organisation for Animal Health (OIE) reference laboratory for ISA, or;
distensia stromei splinei, din cauza acumulării de eritrocite;
a national reference laboratory or the EU reference laboratory for fish diseases as referred to in Annex VI to Directive 2006/88/EC.
hemoragie interstițială ușoară și multifocală până la extinsă și difuză, cu necroză tubulară în zonele afectate de hemoragie, acumulare de eritrocite în glomerulii renali;
Haemadsorption
eritrofagocitoză în splină și hemoragii secundare în ficat și rinichi.
As replication of ISAV in cell cultures does not always result in a CPE, every well shall be subject to an RT-PCR test or a haemadsorption test in accordance with this point, or an IF test in accordance with point II.2.6.
Imunohistochimie (IHC)
Cell culture medium shall be removed from each well, including those of positive and negative controls, and placed in labelled sterile tubes.
Anticorpii policlonali împotriva nucleoproteinelor VAIS trebuie utilizați pe secțiuni de țesuturi fixate cu formol și incluse în parafină.
500 μl of a 0,2 % (vol:vol) suspension of washed rabbit or horse red blood cells, or a 0,05 % (vol:vol) suspension of washed rainbow trout or Atlantic salmon red blood cells, shall be added to each well and incubated at room temperature for 45 minutes.
Organele care urmează a fi examinate trebuie să fie rinichiul median și inima (inclusiv zona de tranziție, toate cele trei camere și valvele).
The red blood cells shall be removed and each well shall be washed twice with L-15 medium.
Cazurile suspecte din cauza semnelor patologice se verifică prin intermediul unui test IHC pozitiv.
Each well shall be examined using a microscope.
Secțiunile histologice se pregătesc în conformitate cu metodele standard.
The presence of clusters of red blood cells attaching to the surface of ASK cells shall be indicative of presumptive infection with an orthomyxovirus.
Pregătirea secțiunilor de țesuturi
If a haemadsorption test is positive, a virus identification test shall be performed immediately in accordance with point II.2.4.
Țesuturile trebuie fixate cu ajutorul unei soluții neutre de formol 10 % tamponate cu fosfat timp de cel puțin o zi, apoi trebuie să fie deshidratate prin băi de etanol succesive, clarificate în xilen și incluse în parafină, în conformitate cu protocoalele standard.
Immunofluorescence (IF)
Secțiunile de aproximativ 5 μm grosime (pentru IHC pe lame acoperite cu poli-L-lizină) trebuie să fie încălzite la 56 °C-58 °C (maximum 60 °C) timp de 20 minute, deparafinate în xilen, rehidratate prin intermediul unor băi de etanol succesive și colorate cu hematoxilină și eozină în vederea analizei patomorfologice și a imunohistochimiei în conformitate cu punctul 2
ASK (pass 65 or lower) shall be grown in a L-15 medium containing 10 % foetal bovine serum, 2 % (vol:vol) 200 mM L-glutamine, and 0,08 % (vol:vol) 50 mM 2-mercaptoethanol in multi-well plates and used at greater than 50 % confluence.
Procedura de colorare pentru IHC
Other cell lines or growth medium of proven efficacy may also be used.
Toate incubațiile se efectuează la temperatura camerei pe platforma de basculare, cu excepția cazului în care se prevede altfel în prezenta decizie:
225 μl of putative virus-infected culture supernatant shall be added to each of two wells, mixed and 225 μl transferred to two further wells, namely a 1:5 dilution.
extragerea antigenului se face prin fierberea secțiunilor în 0,1 M de soluție tampon de citrat cu pH 6,0 timp de 2 × 6 minute, urmată de blocare cu 5 % lapte degresat uscat și 2 % ser de capră în 50 mM TBS (TBS; Tris/HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,6) timp de 20 de minute;
Two additional wells shall be left uninoculated to act as controls.
secțiunile se incubează peste noapte cu anticorp primar (anticorp monospecific de iepure împotriva nucleoproteinelor VAIS) diluat în TBS cu 1 % lapte degresat uscat, apoi se spală de trei ori în TBS cu Tween 20 0,1 %;
Samples from each fish farm site shall be handled on separate plates, as shall the virus control.
pentru detectarea anticorpilor legați, secțiunile se incubează timp de 60 de minute cu anticorpi anti-IgG de iepure conjugați cu fosfatază alcalină.
A virus control shall be established using a reference isolate of ISAV.
După o ultimă spălare, se adaugă Fast Red (1 mg ml– 1) și naftol AS-MX fosfat (0,2 mg ml– 1) cu 1 mM levamisol în 0,1 M TBS (pH 8,2) și se lasă să se dezvolte timp de 20 de minute.
Plates shall be incubated at 14 ± 2 °C and examined microscopically for up to 7 days.
Secțiunile sunt apoi spălate cu apă de la robinet, înainte de contracolorarea cu hematoxilină Harris și montarea într-un mediu de montare apos.
When early CPE is observed, or if no CPE is observed within 7 days, the next step shall be fixation.
La fiecare etapă trebuie incluse secțiuni de țesuturi pozitive și negative la VAIS, drept controale.
Wells shall be washed with Phosphate buffered saline (PBS) and fixed by incubation with 80 % acetone for 20 minutes at room temperature.
Interpretarea rezultatului IHC
Plates shall be air-dried and stained immediately or stored at 0 to 6 °C for no more than 24 hours prior to staining.
Rezultatul testului IHC trebuie să fie interpretat conform prevederilor de la literele (a) și (b):
Replicate wells shall be stained with a mix of monoclonal antibodies (MAb) 3H6F8 and 1OC9F5 against ISAV, or other MAb of proven efficacy and specificity, diluted in PBS and incubated at 37 ± 4 °C for 30 minutes.
secțiunile de control sunt considerate pozitive atunci când se observă că citoplasma și interiorul nucleului celulelor endoteliale din vasele de sânge ale endocardului au o culoare roșie (roșiatică) vizibilă în mod clar.
MAb shall be removed and plates washed three times with 0,05 % Tween 20 in PBS.
O secțiune dintr-un eșantion utilizat pentru testare este considerată pozitivă numai dacă se observă în mod clar o colorare în roșu a interiorului nucleului celulelor endoteliale;
Anti-mouse IgG Fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugate diluted in PBS shall be added to each well and incubated at 37 ± 4 °C for 30 minutes.
secțiunile de control sunt considerate negative dacă nu au nicio reacție de colorare semnificativă.
The dilutions of different batches of MAb and FITC conjugate shall be optimised in each laboratory.
Având în vedere că localizarea în interiorul nucleului este specifică nucleoproteinei ortomixovirusului într-o etapă de replicare a virusului, însă predomină adesea o colorare citoplasmatică concomitentă, zonele de colorare citoplasmatice și de alte tipuri care nu sunt localizate în interiorul nucleului trebuie să fie considerate nespecifice sau neconcludente.
Antibody shall be removed and plates shall be washed three times with 0,05 % Tween 20 in PBS.
Cele mai puternice reacții de colorare pozitive sunt obținute, în mod obișnuit, în celulele endoteliale din inimă și din rinichi.
Wells shall be examined immediately using an inverted microscope set up for fluorescence microscopy with a suitable filter for excitation of FITC.
Colorarea celulelor endoteliale poate fi slabă sau inexistentă la nivelul leziunilor hemoragice foarte extinse, eventual din cauza lizei celulelor endoteliale infectate.
A test shall be considered positive if fluorescent cells are observed.
METODE ȘI PROCEDURI DE DIAGNOSTIC DETALIATE PENTRU SUPRAVEGHEREA ȘI CONFIRMAREA INFECȚIEI CU MARTEILIA REFRINGENS
For a test to be valid, the positive controls shall score positive and the negative controls shall score negative.
I. Metode și proceduri de diagnostic detaliate pentru diagnosticarea infecției cu Marteilia refringens
Examination of other tissues
În cazul în care sunt prelevate eșantioane și sunt realizate examene de laborator în scopul obținerii sau al menținerii unui anumit statut sanitar în ceea ce privește infecția cu Marteilia refringens, astfel cum se prevede în partea 4 secțiunea I din anexa I, sau în scopul confirmării prezenței acestei boli listate sau al excluderii suspiciunii privind această boală în conformitate cu articolul 57 litera (b) din Directiva 2006/88/CE, folosind metodele de diagnostic prevăzute în partea 4 secțiunea II din anexa I, trebuie aplicate metodele și procedurile de diagnostic detaliate prevăzute la punctele I.1, I.2 și I.3 din prezenta parte.
The technique referred to in point II.2.6 may be applied to other fish tissues such as liver, spleen and heart providing a reasonable quantity of endothelial cells, leucocytes or lymphocytes can be deposited on the slide.
Proceduri de eșantionare
The staining procedure shall remain the same for each tissue, although for some tissues it may be preferable to omit the propidium iodide staining and rely on the phase illumination to identify the cell types present in the imprint.
Moluștele cu cochilia deschisă sau care au murit recent sunt selectate cu prioritate, pentru a spori șansele de a găsi animale infectate.
Histology
Odată selecționate, stridiile sau midiile se păstrează la 4 °C sau refrigerate pe gheață, timp de maximum 24 de ore dacă eșantioanele includ moluște cu cochilia deschisă și timp de maximum 72 de ore în caz contrar, într-o pungă de plastic cu o etichetă cuprinzând detaliile referitoare la natura și originea stridiilor sau a midiilor.
Paraffin-embedded sections shall be cut at 5 μm and stained using haematoxylin and eosin.
Moluștele cu cochilia deschisă sau care au murit recent sunt păstrate separat de alte moluște.
Histological changes in clinically diseased Atlantic salmon are variable, but may include the following:
Pentru diagnosticarea Marteilia refringens prin histologie se utilizează o secțiune de țesuturi cu grosime de 3-5 mm, incluzând branhii și țesut cardiac.
numerous erythrocytes in the central venous sinus and lamellar capillaries of the gills, where erythrocyte thrombi also may be formed;
O porțiune de glandă digestivă trebuie să fie utilizată pentru anumite teste, inclusiv pentru amprente și pentru reacția în lanț a polimerazei (PCR).
multifocal to confluent petechiae or hepatocyte necrosis or both at some distance from larger vessels in the liver; multifocal accumulation of erythrocytes in dilated hepatic sinusoids;
Tehnici de microscopie
accumulation of erythrocytes in blood vessels of the intestinal lamina propria and eventually haemorrhage into the lamina propria;
Citologia (tehnica citologică de colorare)
spleen stroma distended by erythrocyte accumulation;
După uscarea țesuturilor de glandă digestivă pe o hârtie absorbantă se realizează mai multe amprente pe o lamă din sticlă.
slight multifocal to extensive diffuse interstitial haemorrhage with tubular necrosis in the haemorrhagic areas, erythrocyte accumulation in the glomeruli in the kidney;
Lamele sunt lăsate să se usuce la aer, se fixează în metanol sau etanol absolut și se colorează cu ajutorul unui kit de colorare disponibil în comerț, precum Diff-Quik®/Hemacolor®, în conformitate cu instrucțiunile producătorului.
erythrophagocytosis in the spleen and secondary haemorrhages in liver and kidney.
După spălare cu apă de la robinet și uscare, lamele se acoperă cu o lamelă cu ajutorul unei rășini sintetice adecvate.
Immunohistochemistry (IHC)
Lamele trebuie să fie analizate mai întâi la un grosisment de × 200 și apoi în imersiune în ulei la un grosisment de × 1000.
Polyclonal antibody against ISAV nucleoprotein shall be used on paraffin sections from formalin-fixed tissue.
Un rezultat pozitiv constă în observarea unor celule ale căror dimensiuni variază între 30-40 μm.
The organs to be examined shall be mid-kidney and heart (transitional area including all three chambers and valves).
Citoplasma este bazofilă, iar nucleul este eozinofil.
Suspected cases due to pathological signs shall be verified with a positive IHC.
Se observă halouri pale în jurul granulelor mari, puternic colorate (refringente), iar în cazul celulelor de dimensiuni mai mari se observă o dispunere de tip „celulă în celulă”.
Histological sections shall be prepared in accordance with standard methods.
Tehnica nu este specifică acestei specii de parazit.
Preparation of tissue sections
Trebuie fixate secțiuni de țesut care includ branhii, glanda digestivă, mantaua și gonadele timp de cel puțin 24 de ore în fixator Davidson, urmând o prelucrare normală pentru examenul histologic după includerea în parafină și colorare, de exemplu cu hematoxilină și eozină.
The tissues shall be fixed in neutral phosphate-buffered 10 % formalin for at least 1 day, dehydrated in a graded ethanol series, cleared in xylene and embedded in paraffin, according to standard protocols.
Observațiile trebuie efectuate la grosismente succesive, de maximum × 1000.
Approximately 5 μm thick sections (for IHC placed on poly-L-lysine-coated slides) shall be heated at 56 °C to 58 °C (maximum 60 °C) for 20 minutes, dewaxed in xylene, rehydrated through a graded ethanol series, and stained with haematoxylin and eosin for pathomorphology and IHC in accordance with point (2).
Un rezultat pozitiv constă în observarea unor celule ale căror dimensiuni variază între 4 și 40 μm.
Staining procedure for IHC
Primele etape constau în celule multinucleate, de formă sferică până la alungită.
All incubations shall be carried out at room temperature on a rocking platform, unless otherwise provided for in this decision:
Acestea se găsesc în special în epiteliul esofagului și al stomacului și uneori în palpii labiali.
antigen retrieval shall be done by boiling sections in 0,1 M citrate buffer pH 6,0 for 2 × 6 minutes followed by blocking with 5 % non-fat dry milk and 2 % goat serum in 50 mM TBS (TBS; Tris/HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,6) for 20 minutes;
Sporulația implică diviziunea de celule în interiorul celulelor și are loc în tubulii și în conductele glandei digestive.
sections shall then be incubated overnight with primary antibody (monospecific rabbit antibody against ISAV nucleoprotein) diluted in TBS with 1 % non-fat dry milk, followed by three washes in TBS with 0,1 % Tween 20;
Granulele refringente apar în cursul sporulației, dar nu se observă în stadiile incipiente.
for detection of bound antibodies, sections shall be incubated with Alkaline phosphatase-conjugated antibodies to rabbit IgG for 60 minutes.
În fazele tardive ale infecției, se observă sporangi liberi în lumenul tubului digestiv.
Following a final wash, Fast Red (1 mg ml– 1) and Naphthol AS-MX phosphate (0,2 mg ml– 1) with 1 mM Levamisole in 0,1 M TBS (pH 8,2) shall be added to develop for 20 minutes.
Culoarea granulelor poate varia de la portocaliu intens la roșu intens.
Sections shall then be washed in tap water before counterstaining with Harris haematoxylin and mounted in aqueous mounting medium.
Tehnici moleculare
ISAV positive and ISAV negative tissue sections shall be included as controls in every setup.
Pot fi utilizate kituri de extracție a ADN-ului disponibile pe piață, care permit de obicei obținerea unui ADN de înaltă calitate, ce poate fi utilizat în protocoalele PCR menționate la punctul I.3.2.
Interpretation of the result of IHC
Reacția în lanț a polimerazei (PCR)
The interpretation of the result of the IHC test shall be as set out in points (a) and (b):
Au fost elaborate și publicate mai multe protocoale PCR.
control sections shall be considered as positive, when it is observed that the control sections have clearly visible red-coloured (reddish) cytoplasmic and intranuclear staining of endothelia cells in blood vessels of endocardium.
Trebuie utilizați primeri PCR care vizează regiunea spațierii transcrise intern (ITS1), deoarece aceștia pot amplifica numai M. refringens.
A test sample section shall only be regarded as positive if such clear, intranuclear red staining of endothelial cells is found;
PCR se efectuează într-un volum de 50 μl.
control sections shall be considered as negative if they don't have any significant colour reaction.
Amestecurile pentru PCR trebuie să conțină tampon [500 mM KCl, 100 mM Tris/HCl (pH 9,0 la 25 °C) și 1 % Triton® X-100)], 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM amestec dNTP, 1 μM primer sens și antisens, 0,02 unități μl– 1 polimerază ADN Taq și 10-100 ng de ADN extras.
Since the intranuclear localisation is particular to the orthomyxovirus nucleoprotein during a stage of virus replication but concurrent cytoplasmic staining is often dominant, cytoplasmic and other staining patterns without intranuclear localisation shall be considered as nonspecific or inconclusive.
După denaturarea ADN-ului timp de 5 minute la 94 °C, se efectuează 30 de cicluri după cum urmează: denaturare la 94 °C timp de un minut, atașare la 55 °C timp de un minut, elongația la 72 °C timp de un minut per 1000 de perechi de baze.
The strongest positive staining reactions are usually obtained in endothelial cells of heart and kidney.
Trebuie efectuată o etapă de elongație finală de 10 minute la 72 °C.
Endothelial staining reactions within very extensive haemorrhagic lesions may be slight or absent, possibly because of lysis of infected endothelial cells.
Pentru detectarea M. refringens, PCR se efectuează cu primeri care vizează regiunea ITS1 (5′-CCG-CAC-ACG-TTC-TTC-ACT-CC-3′ și 5′-CTC-GCG-AGT-TTC-GAC-AGA-CG-3′).
DETAILED DIAGNOSTIC METHODS AND PROCEDURES FOR THE SURVEILLANCE AND CONFIRMATION OF INFECTION WITH MARTEILIA REFRINGENS
Controalele pozitive constau în ADN-ul genomic al unei gazde cu o infecție pronunțată sau în ADN plasmidic incluzând regiunea vizată.
I. Detailed diagnostic methods and procedures for the diagnosis of infection with Marteilia refringens
Controalele negative constau în ADN-ul genomic al unor gazde neinfectate și în reactivi PCR fără ADN țintă.
When sampling and laboratory examination are carried out for the purpose of obtaining or maintaining a health status with regard to infection with Marteilia refringens as set out in Section I of Part 4 of Annex I or to confirm or rule out the presence of that listed disease in accordance with Article 57(b) of Directive 2006/88/EC, using the diagnostic methods set out in Section II of Part 4 of Annex I, the detailed diagnostic methods and procedures set out in points I.1, I.2 and I.3 of this Part shall apply.
Un rezultat pozitiv constă într-un produs de amplificare pozitiv de mărimea preconizată (412 pb), toate controalele negative având rezultate negative și toate controalele pozitive având rezultate pozitive.
Sampling procedure
Hibridare in situ (IHS)
Gaping or freshly dead individual molluscs shall be sampled by priority, to increase the chances of finding infected animals.
Au fost elaborate și publicate mai multe protocoale IHS.
Once sampled, oysters or mussels shall be maintained at 4 °C or on refrigerated ice for no more than 24 hours if samples include gaping molluscs and no more than 72 hours if not, in a plastic bag including a label with details related to the nature and the origin of the oysters or mussels.
Trebuie utilizată o sondă care vizează subunitatea mică din complexul de gene al ARNr, deoarece aceasta a fost validată în raport cu histologia.
Gaping or freshly dead molluscs shall be maintained separately from other molluscs.
Trebuie fixate secțiuni de țesut care includ branhii și glanda digestivă timp de cel puțin 24 de ore în fixator Davidson, urmând o prelucrare normală pentru examenul histologic după includerea în parafină.
A 3 to 5 mm thick section of tissues including gills and heart tissue shall be used for the diagnostic of Marteilia refringens by histology.
Se decupează secțiuni de 5 μm și se așează pe lame acoperite cu aminoalchilsilan, apoi se incubează în timpul nopții într-o etuvă la 40 °C.
A piece of digestive gland shall be used for some tests, including imprints and polymerase chain reaction (PCR).
Secțiunile sunt deparafinate prin scufundarea în xilen timp de 10 minute.
Microscopic techniques
Această etapă se repetă o singură dată și apoi solventul se elimină prin scufundare în două băi succesive de etanol absolut de 10 minute fiecare.
Cytology (imprint cytology)
Secțiunile sunt apoi deshidratate prin imersie în băi succesive de etanol.
After drying digestive gland tissues on absorbent paper, several imprints shall be made on a glass slide.
Secțiunile sunt tratate cu proteinaza K (100 μg ml– 1) într-un tampon TE [Tris (50 mm), EDTA (10 mm)], la 37 °C timp de 30 de minute.
Slides shall be air-dried, fixed in methanol or in absolute ethanol and stained using a commercially available blood-staining kit such as Diff-Quik®/Hemacolor®, in accordance with the manufacturer's instructions.
Lamele trebuie să fie deshidratate prin imersie în băi succesive de etanol și apoi uscate la aer.
After rinsing in tap water and drying, the slides shall be mounted with a cover-slip using an appropriate synthetic resin.
Secțiunile trebuie să fie incubate cu 100 μl de tampon de hibridare [4 × SSC (soluție salină de citrat), formamidă 50 %, 1 × soluție Denhardt, 250 μg ml– 1 ARNt din drojdie, sulfat de dextran 10 %] conținând 10 ng (1 μl din reactanții PCR pregătiți astfel cum se descrie la punctul I.3.2 utilizând primerii CCG-GTG-CCA-GGT-ATA-TCT-CG și TTC-GGG-TGG-TCT-TGA-AAG-GC) din sonda marcată cu digoxigenină.
The slides shall be observed first at × 200 magnification and then under oil immersion at × 1000 magnification.
Secțiunile sunt acoperite cu lamele de plastic pentru hibridare in situ și sunt așezate pe un bloc de încălzire la 95 °C timp de cinci minute.
A positive result shall be the observation of cells ranging in size up to between 30 to 40 μm.
Lamele trebuie apoi răcite pe gheață timp de un minut înainte de hibridizarea la 42 °C timp de o noapte într-o etuvă umedă.