natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Whole fish may be transported to the laboratory if the temperature requirements during transportation, as described in paragraph 3 of this point can be fulfilled.
Un inconvenient al RT-qPCR este faptul că adesea nu este posibilă secvențierea produselor de amplificare.
Whole fish shall be wrapped in absorbent paper and shipped in a plastic bag, chilled as described in that paragraph.
Cu toate acestea, în cazul în care există îndoieli cu privire la specificitatea produsului de amplificare, trebuie efectuat un alt test specific VAIS în vederea verificării rezultatului.
Live fish may also be shipped, but only under the supervision of the National reference laboratory for fish diseases and taking into account the additional disinfection and biosecurity issues when transporting live fish.
Trebuie utilizat testul descris la prezentul punct, care vizează segmentul 8.
Blood samples and tubes containing fish tissues for virological examination or RT-PCR analysis shall be placed in insulated containers, such as thick-walled polystyrene boxes, together with sufficient ice or freeze blocks to ensure chilling of the samples during transportation to the laboratory.
Acest test trebuie să fie valabil pentru izolatele care provin din Uniunea Europeană, din Asociația Europeană a Liberului Schimb și din America de Nord.
Freezing shall be avoided and ice must still be present in the transport box at receipt of the shipment or one or more of the ‘freeze blocks’ must still be partly or completely frozen.
Atunci când este posibil, se folosește metoda într-o singură etapă, deoarece testul realizat într-un singur tub reduce la minimum riscul de contaminare încrucișată.
In exceptional circumstances, RT-PCR samples and samples for virological examination may be snap-frozen and transported to the laboratory at – 20 °C or below.
Primer sens: 5′- CTACACAGCAGGATGCAGATGT -3′;
For RT-PCR analysis of tissues preserved in Ribonucleic acid(RNA)later, RNA extraction shall be carried out within the following time frames depending on the temperature the samples are stored at:
Primer antisens: 5′- CAGGATGCCGGAAGTCGAT -3′;
samples stored at – 20 °C: indefinitely.
și sondă: 5′-FAM- CATCGTCGCTGCAGTTC – MGBNFQ-3′.
If fish tissues are transported in fixative for histological examination, they shall be shipped in leak proof tubes in impact-resistant containers.
Succesiunea ciclurilor: un ciclu la 50 °C timp de 30 de minute, 1 ciclu la 95 °C timp de 15 minute, 40 de cicluri la 94 °C timp de 15 secunde, la 60 °C timp de 60 de secunde; se efectuează ajustări, dacă este necesar.
Freezing of those samples shall be avoided.
Secvențierea produselor PCR amplificate
Subject to the approval of the diagnostic laboratory, fish tissues other than those referred to in point I.1 may be collected and prepared for supplementary examination.
Primer sens (ILAs6-3F): 5′-ATGAGGGAGGTAGCATTGCA -3′;
Detailed diagnostic methods and procedures for the surveillance and for the confirmation of the presence of or to rule out the suspicion of ISA
Primer antisens (ILAs6-2R): 5′-CATGCTTTCCAACCTGCTAGGA -3′.
When laboratory examination for the purpose of obtaining or maintaining a certain health status with regard to ISA as set out in Section I of Part 3 of Annex I, or for the purpose of the confirmation of the presence of or to rule out a suspicion of ISA in accordance with Article 57(b) of Directive 2006/88/EC, are carried out, using the diagnostic methods set out in Section II of Part 3 of Annex I, the detailed methods and procedures set out in the following points II.1 to II.5 shall apply.
Succesiunea ciclurilor (RT-PCR într-o singură etapă): un ciclu la 50 °C timp de 30 de minute, un ciclu la 94 °C timp de 15 minute, 40 de cicluri la 94 °C timp de 30 de secunde, la 55 °C timp de 30 de secunde, la 72 °C timp de 60 de secunde, un ciclu la 72 °C timp de 5 minute; se efectuează ajustări, dacă este necesar.
Examination of samples by RT-PCR
Alternativ, poate fi folosită următoarea metodă de secvențiere a HPR în segmentul 6:
The diagnostic method to be used for the screening for ISAV shall be RT-qPCR.
Primer sens: 5′-GAC-CAG-ACA-AGC-TTA-GGT-AAC-ACA-GA-3′;
As the results of the RT-qPCR can vary depending on the conditions under which it is performed, adequate positive and negative controls and amplicons shall be included to avoid any doubts.
Primer antisens: 5′-GAT-GGT-GGA-ATT-CTA-CCT-CTA-GAC-TTG-TA-3′.
Total RNA extraction
Dimensiunea produsului: 304 nt dacă HPR0.
Total RNA shall be extracted using the phenol-chloroform method or RNA affinity spin columns, according to the manufacturer's instructions.
Pot fi, de asemenea, utilizate teste RT-PCR cu sensibilitate și specificitate similare celor ale testelor descrise la prezentul punct.
Purified RNA shall be re-suspended in distilled RNase-free water (namely water treated with 0,1 % diethyl pyrocarbonate).
Puritatea produsului de amplificare obținut prin RT-PCR se verifică prin electroforeză în gel înainte de secvențiere.
The concentration and purity of the extracted RNA shall be estimated by measuring the optical density at 260 nm and at 280 nm.
Dacă apare un singur fragment pur, acesta se purifică direct din reacția PCR.
An alternative approach may be to include internal controls targeted against the virus genome as referred to in point II.1.3.
Dacă sunt prezente mai multe fragmente amplificate, fragmentul care interesează trebuie să fie purificat prin electroforeză în gel.
RT-PCR for ISAV detection
Purificarea fragmentelor PCR din soluții sau gel de agaroză se efectuează cu ajutorul unor coloane de afinitate pentru fragmente de PCR, în conformitate cu instrucțiunile producătorului.
Several RT-PCR methods may be used for ISAV genome amplification.
Secvențierea trebuie să fie efectuată cu ajutorul primerilor de amplificare, de către societăți externe specializate în secvențiere.
A two-step RT-PCR may be performed whereby the RT and the PCR reactions steps are run in two separate tubes.
Rezultatele trebuie să fie analizate cu ajutorul instrumentului de căutare BLAST, iar secvențele sunt comparate cu alte secvențe cunoscute din baza de date de nucleotide a Centrului Național de Informații Biotehnologice din SUA (National Centre for Biotechnical Information – NCBI).
However, a one-step reaction, where the two reactions are run in one tube, may also be performed.
Secvențierea trebuie să elimine orice dubiu în ceea ce privește specificitatea unui produs amplificat prin RT-PCR.
The one-step method shall be used where possible, as the one tube assay minimises the risk of cross-contamination as no transfer of content have to be made and it is regarded to be as sensitive as the two-step method.
Izolarea VAIS în cultură celulară
The primers and assay described in this point, namely the ILA1 or ILA2 primer pair that target segment 8 and which have been found suitable for detection of ISAV in outbreaks and in carrier fish, shall be used.
Pregătirea eșantioanelor
The ILA2 reverse primer does not match isolates from North America and an alternative primer set shall be used in those cases.
Țesuturile pot fi păstrate la – 80 °C.
Forward primer (ILA1): 5′-GGCTATCTACCATGAACGAATC-3′;
Țesuturile pot fi congelate și dezghețate numai o singură dată înaintea examinării acestora.
Reverse primer (ILA2): 5′-GCCAAGTGTAAGTAGCACTCC-3′.
În scopul supravegherii și al controlului, examinarea trebuie se efectueze cât mai rapid posibil.
Cycling conditions: one cycle of 50 °C for 30 minutes, 1 cycle of 94 °C for 15 minutes, 40 cycles of 94 °C for 30 seconds, 55 °C for 30 seconds, 72 °C for 60 seconds; one cycle of 72 °C for 5 min.
Fiecare eșantion (amestec de țesuturi într-o soluție de transport) este complet omogenizat cu un omogenizator validat, centrifugat la 2000-4000 × g timp de 15 minute la 0-6 °C, apoi supernatantul este filtrat (0,45 μm) și incubat cu un volum egal dintr-un amestec diluat corespunzător de antiseruri contra serotipurilor indigene ale VNPI.
Product size 155 bp.
Titrul antiserului trebuie să fie de cel puțin 1:2000 într-un test de neutralizare a plajelor cu 50 % reducerea plajelor.
However, other RT-PCR versions of proven similar efficacy may be used instead.
Amestecul este incubat timp de o oră la 15 °C.
RT-qPCR for ISAV detection
Acesta constituie inoculul.
The use of RT-qPCR may increase specificity and probably also sensitivity.
Tratamentul tuturor inoculilor cu antiser împotriva virusului necrozei pancreatice infecțioase (virus care, în anumite regiuni ale Europei, este prezent în 50 % din eșantioanele de pește) are ca scop împiedicarea apariției ECP datorat virusului NPI în culturile celulare inoculate.
The method can be performed more rapidly as no gel electrophoresis step is required and it reduces the risk of cross contamination as it is possible to estimate the amount of viral genomic RNA within the sample tube.
Acest tratament poate fi efectuat pentru reducerea duratei examenelor virusologice, precum și a numărului de cazuri în care apariția ECP ar trebui considerată ca un indicator potențial al VAIS.
A drawback of the RT-qPCR assay is that it is often not possible to sequence amplified products.
Atunci când eșantioanele provin din unități de producție considerate ca fiind indemne de NPI, tratamentul inoculilor cu antiser împotriva virusului NPI poate fi omis.
However, if there is doubt on the specificity of the amplified product, another ISAV specific assay must be run to verify the result.
Inocularea culturilor celulare
The assay described in this point, which is an assay that target segment 8, shall be used.
Pentru izolarea primară a virusului AIS trebuie folosite celule de rinichi de la somonul de Atlantic (ASK).
This assay shall cover isolates from the European Union, the European Free Trade Association and North America.
Se pot utiliza și alte linii celulare cu o eficacitate și sensibilitate confirmate pentru izolarea VAIS, ținând seama de variabilitatea tulpinii și de capacitatea diverselor tulpini de a se reproduce în linii celulare diferite.
The one-step method shall be used where possible, because the one tube assay minimises the risk of cross-contamination.
Celulele ASK par să suporte izolarea și creșterea izolatelor de virus cunoscute până în prezent, atât timp cât numărul de pasaje este redus.
Forward primer: 5′- CTACACAGCAGGATGCAGATGT -3′;
În celulele ASK poate apărea un efect citopatic (ECP) mai clar decât în alte linii celulare sensibile, precum SHK-1 (celule de rinichi anterior de somon-1).
Reverse primer: 5′- CAGGATGCCGGAAGTCGAT -3′;
Se cultivă celule ASK (maximum 65 de pasaje) într-un mediu L-15 care conține 10 % ser fetal bovin, 2 % (vol/vol) de L-glutamină la 200 mM și 0,08 % (vol/vol) de 2-mercaptoetanol la 50 mM în plăci multigodeu.
and probe: 5′-FAM- CATCGTCGCTGCAGTTC – MGBNFQ-3′.
Se inoculează o suspensie de organe tratată cu antiser în culturi celulare tinere în fază de creștere activă, în scopul obținerii unei diluții finale a materialului tisular într-un mediu de cultură de 1:1000.
Cycling conditions: one cycle of 50 °C for 30 minutes, one cycle of 95 °C for 15 minutes, 40 cycles of 94 °C for 15 seconds, 60 °C for 60 seconds; it shall be adjusted if necessary.
Pentru fiecare organ, se adaugă 40 μl din suspensia de inocul la un godeu care conține 2 ml de mediu de cultură.
Sequencing of amplified PCR products
Se păstrează o placă neinoculată care va servi drept control negativ.
Forward primer (ILAs6-3F): 5′-ATGAGGGAGGTAGCATTGCA -3′;
Se inoculează o altă placă cu un izolat de referință al VAIS, care va servi drept control pozitiv, și se procedează în felul următor: se inoculează o sută de μl dintr-un preparat stoc de VAIS [titru minim 107 doza infectantă pentru 50 % din culturile celulare (TCID 50 ml– 1)] în primul godeu și se amestecă.
Reverse primer (ILAs6-2R): 5′-CATGCTTTCCAACCTGCTAGGA -3′.
Se transferă un volum din această materie din primul în al doilea godeu pentru a se obține o diluție de 1:10 și se amestecă.
Cycling conditions (One-step RT-PCR): one cycle of 50 °C for 30 minutes, one cycle of 94 °C for 15 minutes, 40 cycles of 94 °C for 30 seconds, 55 °C for 30 seconds, 72 °C for 60 seconds, one cycle of 72 °C for 5 minutes; it shall be adjusted if necessary.
Se repetă operațiunea pe întreaga placă pentru a se obține șase diluții de 1:10.
Alternatively, the following method for sequencing HPR in segment 6 may be used:
Preparatul stoc de VAIS poate fi depozitat la – 80 °C timp de cel puțin doi ani; cu toate acestea, o dată dezghețat, el trebuie să fie utilizat în termen de trei zile.
Forward primer: 5′-GAC-CAG-ACA-AGC-TTA-GGT-AAC-ACA-GA-3′;
Se iau măsuri pentru prevenirea contaminării încrucișate a plăcilor de testare cu materialul controlului pozitiv.
Reverse primer: 5′-GAT-GGT-GGA-ATT-CTA-CCT-CTA-GAC-TTG-TA-3′;
Pentru a se evita acest risc, controalele pozitive se așează separat și se manipulează separat de plăcile de testare.
Product size: 304 nt if HPR0.
Ca alternativă la includerea unui control pozitiv pentru fiecare inoculare, se poate realiza la fiecare șase luni un test de sensibilitate a celulelor ASK la izolatele VAIS.
RT-PCR assays with similar sensitivities and specificities to the assays described in this point may also be used.
Se incubează eșantioanele la 15 ± 2 °C timp de cel mult 15 zile.
The purity of the amplified RT-PCR product shall be checked by gel electrophoresis before sequencing.
Se examinează culturile celulare de două ori la microscop pentru depistarea ECP, mai întâi între a cincea și a șaptea zi, apoi între a douăsprezecea și a paisprezecea zi de la inoculare.
If only one pure fragment appears, it shall be purified directly from the PCR reaction.
Dacă un amestec prezintă ECP, se inițiază imediat proceduri de identificare a virusului în conformitate cu punctul II.2.4.
If multiple amplified fragments are present, the fragment of interest shall be purified by gel electrophoresis.
În cazul în care nu se observă niciun ECP până în a paisprezecea zi, se efectuează un test de imunofluorescență indirectă (IFAT), un test de hemadsorbție sau RT-PCR.
The purification of PCR fragments from solutions or agarose gels shall be made using PCR fragment affinity spin columns, according to the manufacturer's instructions.
Subcultivarea se va efectua între a treisprezecea și a cincisprezecea zi.
Sequencing shall be performed using amplification primers at external specialised sequencing companies.
Se adaugă supernatant de cultură în godeurile de pe plăci multigodeu care conțin celule proaspete în fază activă de creștere, la o diluție adecvată (1/10), apoi se lasă să incubeze la 14 ± 2 °C timp de cel mult 18 zile.
The results shall be analysed with the search tool BLAST and the sequences shall be compared with other known sequences in the US National Centre for Biotechnical Information (NCBI) nucleotide database.
Se examinează culturile celulare de două ori la microscop pentru depistarea ECP, mai întâi între a cincea și a șaptea zi, apoi între a paisprezecea și a optsprezecea zi de la inoculare.
Sequencing must eliminate any doubt on the specificity of an amplified RT-PCR product.
Dacă între a paisprezecea și a optsprezecea zi nu se observă ECP, se efectuează un test de hemadsorbție sau RT-PCR.
ISAV isolation on cell cultures
Dacă în decurs de șapte zile de la incubație se observă un efect citotoxic, se realizează o subcultivare în acest stadiu și se lasă celulele la incubat timp de 14 până la 18 zile, apoi celulele sunt supuse unei noi subcultivări cu durata de incubație de 14 până la 18 zile.
Preparation of samples
Dacă efectul citotoxic apare după șapte zile, se realizează o singură subcultivare și celulele se lasă la incubat astfel încât să se ajungă la un număr total de 28 până la 36 de zile de incubație de la prima inoculare.
The tissue may be kept at – 80 °C.
În cazul contaminării bacteriene a culturii primare, se reia testul, pe un omogenat de țesuturi depozitat la – 80 °C.
The tissue shall only be frozen and thawed once before examination.
Înaintea inoculării, omogenatul de țesuturi trebuie să fie centrifugat la 4000 × g timp de 15-30 de minute, la o temperatură cuprinsă între 0 și 6 °C, iar supernatantul trebuie să fie filtrat la 0,22 μm.
For surveillance and control purposes, the examination shall be undertaken as fast as possible.
Dacă are loc contaminarea bacteriană în cursul fazei de subcultivare, supernatantul se filtrează la 0,22 μm, se inoculează unor celule proaspete și se lasă la incubat o nouă perioadă de 14 până la 18 zile.
Each sample (tissue pool in transport solution) shall be completely homogenised using a validated homogeniser, centrifuged at 2000 to 4000 × g for 15 minutes at 0 to 6 °C, and the supernatant shall be filtered (0,45 μm) and incubated with an equal volume of a suitably diluted pool of antisera to the indigenous serotypes of IPNV.
Teste de identificare a virusului
The titre of the antiserum must be at least 1:2000 in a 50 % plaque neutralisation test.
În cazul depistării ECP, indiferent de stadiu, sau în cazul unui test de hemadsorbție pozitiv, se efectuează identificarea virusului.
The mixture shall be incubated for one hour at 15 °C.
Metodele de predilecție pentru identificarea VAIS sunt RT-PCR în conformitate cu punctul II.1 și de imunofluorescența (IF) în conformitate cu punctul II.2.6.
To reduce the duration of the virological examinations as well as the number of cases in which occurrence of CPE would have to be considered potentially indicative of ISAV, such treatment may be carried out.
laboratorului de referință al Organizației Mondiale pentru Sănătatea Animalelor (OIE) în ceea ce privește AIS; sau
When samples come from production units which are considered free from IPN, the treatment of inocula with antiserum to IPN virus may be omitted.
unui laborator național de referință sau laboratorului de referință al Uniunii Europene pentru bolile peștilor, astfel cum se menționează în anexa VI la Directiva 2006/88/CE.
Inoculation on cell cultures
Hemadsorbție
Atlantic salmon kidney (ASK) cells shall be used for primary ISAV isolation.
Deoarece replicarea VAIS în culturile celulare nu are întotdeauna drept rezultat apariția ECP, fiecare godeu este supus unui test RT-PCR sau unui test de hemadsorbție în conformitate cu prezentul punct, sau unui test IF în conformitate cu punctul II.2.6.
Other cell lines of proven efficacy and sensitivity in isolating ISAV may be used, taking into consideration strain variability and the ability of different strains to replicate in different cell lines.
Se efectuează o prelevare din mediul de cultură celulară din fiecare godeu, inclusiv din godeurile controalelor pozitive și negative, și se introduce în tuburi sterile etichetate.
The ASK cells seem to support isolation and growth of the hitherto known virus isolates, as long as a low passage level is used.
La fiecare godeu se adaugă 500 μl de suspensie 0,2 % (vol/vol) de globule roșii de iepure sau de cal spălate sau de suspensie 0,05 % (vol/vol) de globule roșii de păstrăv-curcubeu sau de somon de Atlantic spălate și se lasă să incubeze la temperatura camerei timp de 45 de minute.
A more distinct cytopathic effect (CPE) may appear in ASK cells than in other susceptible cell lines like SHK-1 (Salmon head kidney-1).
Se îndepărtează globulele roșii și se spală fiecare godeu de două ori cu mediul L-15.
ASK (pass 65 or lower) cells shall be grown in L-15 medium containing 10 % foetal bovine serum, 2 % (vol:vol) 200 mM L-glutamine, and 0,08 % (vol:vol) 50 mM 2-mercaptoethanol in multi-well plates.
Fiecare godeu este examinat la microscop.
Antiserum-treated organ suspension shall be inoculated into young actively growing cell cultures to give a final dilution of tissue material to culture medium of 1:1000.
Prezența ciorchinelui de globule roșii aderând la suprafața celulelor ASK indică prezența probabilă a infecției cu un ortomixovirus.
For each organ, suspension 40 μl of inoculum shall be added to one well containing 2 ml of culture medium.
Dacă testul de hemadsorbție este pozitiv, se efectuează imediat un test de identificare a virusului în conformitate cu punctul II.2.4.
To minimise the risk of cross-contamination, separate 12- or 24-well plates shall be used for samples from different fish farm sites.
Imunofluorescența (IF)
One plate shall be left uninoculated to serve as a negative control.
Se cultivă celule ASK (maximum 65 de pasaje) într-un mediu L-15 care conține 10 % ser fetal bovin, 2 % (vol/vol) de L-glutamină la 200 mM și 0,08 % (vol/vol) de 2-mercaptoetanol la 50 mM în plăci multigodeu, cu o confluență mai mare de 50 %.
A separate plate shall be inoculated with a reference isolate of ISAV as a positive control, as follows.
Se pot utiliza și alte linii celulare sau un mediu de cultură cu o eficacitate dovedită.
One hundred μl of a stock preparation of ISAV (minimum titre 107 Tissue culture infective dose at the 50 % end point (TCID50 ml– 1)) shall be inoculated into the first well and mixed.
Se adaugă 225 μl de supernatant de cultură presupusă a fi infectată de virus în fiecare din cele două godeuri, se amestecă și se transferă 225 μl în alte două godeuri, la o diluție de 1:5.
A volume of this material shall be transferred from the first well to the second well to make a 1:10 dilution and mixed.
Alte două godeuri se lasă neinoculate, pentru a servi drept controale.
This shall be repeated across the plate to make six 10-fold dilutions.
Eșantioanele de la diferite ferme piscicole se tratează pe plăci separate, la fel ca și controalele.
Stock ISAV may be stored at – 80 °C for at least 2 years but once thawed must be used within 3 days.
Virusul se controlează pe un izolat de referință al VAIS.
Care shall be taken to prevent cross-contamination of test plates with positive control material.
Plăcile se incubează la 14 ± 2 °C și sunt examinate la microscop timp de cel mult șapte zile.
To avoid that risk, positive controls shall be set up and handled separately from test plates.
Dacă se observă ECP într-un stadiu incipient sau dacă nu se observă ECP în termen de șapte zile, etapa următoare este fixarea.
A sensitivity test every 6 months of ASK cells towards ISAV isolates may replace the use of including a positive control at each inoculation.
Se spală godeurile cu tampon fosfat salin (PBS) și se fixează prin incubare cu acetonă 80 %, timp de 20 de minute, la temperatura camerei.
Samples shall be incubated at 15 ± 2 °C for up to 15 days.
Plăcile sunt lăsate să se usuce la aer și apoi se colorează imediat sau sunt depozitate la o temperatură de 0-6 °C timp de cel mult 24 de ore înainte de colorare.
Using a microscope, cell cultures shall be examined for CPE twice, between 5 to 7 and 12 to 14 days following inoculation.
Godeurile duplicate se colorează cu un amestec de anticorpi monoclonali 3H6F8 și 1OC9F5 anti-VAIS sau cu un alt anticorp monoclonal cu o eficacitate și specificitate dovedite, se diluează în PBS și se lasă la incubat la o temperatură de 37 ± 4 °C, timp de 30 de minute.
If any pool shows CPE, virus identification procedures shall be initiated immediately in accordance with point II.2.4.
Se îndepărtează anticorpii monoclonali și se spală plăcile de trei ori cu Tween 20 0,05 % în PBS.
If no CPE is observed by day 14, an Indirect fluorescent antibody test (IFAT), haemadsorption or RT-PCR shall be performed.
Conjugatul IgG marcat cu FITC (izotiocianat de fluoresceină) antișoarece diluat în PBS trebuie adăugat în fiecare godeu și incubat la temperatura de 37 ± 4 °C timp de 30 de minute.
Subcultivation shall be carried out between days 13 to 15.
Diluțiile de la loturi diferite de anticorpi monoclonali și conjugatul FITC trebuie optimizate în fiecare laborator.
Culture supernatant shall be added to wells containing fresh actively growing cells in appropriate dilution (1/10) in multi-well plates and incubated at 14 ± 2 °C for up to 18 days.
Se îndepărtează anticorpul și se spală plăcile de trei ori cu Tween 20 0,05 % în PBS.
Using a microscope, cell cultures shall be examined for CPE twice, between days five to seven and days 14 to 18 following inoculation.
Se examinează imediat godeurile la un microscop inversat, echipat pentru examinarea fluorescenței cu un filtru corespunzător pentru stimularea FITC.
If no CPE is observed by days 14 to 18, a haemadsorption or an RT-PCR test shall be performed.
Un test este considerat pozitiv dacă se observă celule fluorescente.