natgillin/translations-raw huggingface dataset:
TRIS-ULTRA PURE (ICN)Protease inhibitor cocktail:
50 % glicerol
From Sigma (for mammalian tissue) Product number P 8340.
0,25 % Albastru de bromfenol
Guidance for quantification of head & tail homogenate vitellogenin in zebrafish (Danio rerio) (modified from Holbech et al., 2001). other procedures using homologous antibodies and standards can be used
0,25 % xilencianol
Microtiter plates (certified Maxisorp F96, Nunc, Roskilde Denmark) previously coated with 5 μg/ml anti zebrafish lipovitellin-IgG are thawed and washed 3 times with washing buffer (*).
Se pipetează 1 μl de soluție de colorare în fiecare eprubetă în parte
Purified zebrafish vitellogenin standard [1] is serially diluted to 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10 and 20 ng/ml in dilution buffer (**) and samples are diluted at least 200 times (to prevent matrix effect) in dilution buffer and applied to the plates.
Începerea electroforezei în gel:
An assay control is applied in duplicate.
Gelul de agaroză 1 % preparat va fi transferat într-o cameră pentru electroforeză în gel umplută cu 1 × tampon TAE
150 μl are applied to each well.
10 – 15 μl din fiecare eșantion PCR colorat vor fi pipetați într-un godeu de gel de agaroză
Standards are applied in duplicate and samples in triplicate.
De asemenea, 5 – 15 μl din 1kb-«Ladder»(Invitrogen) vor fi pipetați într-un godeu separat
Incubate over night at 4 °C on a shaker.
Se începe electroforeza cu 200 V
The plates are washed 5 times with washing buffer (*)
Se oprește după 30 – 45 de minute
150 μl are applied to each well and the plates are incubated for 1 hour at room temperature on a shaker.
În continuare, se transferă gelul de agaroză în bromură de etidiu timp de 15 – 30 minute
The plates are washed 5 times with washing buffer (*) and the bottom of the plates is carefully cleaned with ethanol.
Apoi se fotografiază gelul de agaroză într-o cutie cu UV
150 μl TMB plus (***) are applied to each well.
În final, eșantioanele se analizează în comparație cu banda (benzile) controlului pozitiv și scara
Protect the plate against light with tinfoil, and watch the colour development on a shaker.
Apendicele 10
When the standard curve is fully developed the enzyme activity is stopped by adding 150 μl 0,2 M H2SO4 to each well.
Orientări privind prelevarea de țesut pentru determinarea sexului genetic prin metoda PCR la ghidrin
The absorbance is measured at 450 nm (e.g. on a Molecular Devices Thermomax plate reader).
Prelevarea de țesut și extracția ADN-ului
Data are analysed on the associated software (e.g. Softmax).
ADN-ul poate fi extras utilizând o varietate de reactivi disponibili comercial și sisteme manuale și automate de extracție.
Washing buffer:
Protocolul utilizat în laboratorul Cefas Weymouth este indicat mai jos și au fost adăugate metode alternative acolo unde a fost cazul.
PBS-stock (****)
Cu ajutorul unor foarfece fine, se prelevă o bucată mică de țesut (10 – 20 mg) din zona dorsolaterală (după înlăturarea capului și a cozii pentru analiza VTG) de la fiecare pește.
Adjust pH to 7,3 and fill to 5 l with millipore H2O.
Țesutul se adaugă într-o eprubetă și fie este plasat direct în azot lichid (pentru depozitare la – 80 °C), fie umplut cu etanol 70 % (pentru transport și depozitare ulterioară la 4 °C).
Store at 4 °C.
Foarfecele sunt curățate după fiecare pește în parte în etanol 70 %, apoi în apă distilată și se usucă cu hârtie absorbantă.
Dilution buffer:
Etanolul (dacă este prezent) este îndepărtat prin aspirare, iar țesutul este digerat peste noapte cu proteinaza K în 400 μl de tampon ATL (Qiagen).
Adjust pH to 7,3 and fill to 1 l with millipore H2O.
ADN-ul este eluat în 50 μl de apă fără DNază și RNază.
TMB plus is a “ready-to-use” substrate produced by KemEnTec (Denmark).
Dacă se folosesc țesuturi dure pentru a extrage ADN-ul (precum coloana vertebrală sau o înotătoare pectorală), poate fi necesar să se omogenizeze eșantionul în tampon pentru liză cu ajutorul unui produs de liză tisulară FastPrep® sau al unui sistem echivalent de liză tisulară.
It is sensitive to light.
În mod alternativ,
PBS stock
țesutul este digerat peste noapte cu proteinază K în 400 μl de tampon de liză G2 (Qiagen) și se extrage ADN-ul din 200 μl de țesut digerat utilizând fie kit-ul tisular ușor ADN EZ-1 și biorobotul EZ-1, fie minikit-ul tisular ușor ADN.
HPO4 · 2H2O
AND-ul este eluat într-un volum de 50 μl.
Adjust pH to 6,8 and fill with millipore H2O to 2 l.
Țesuturile sunt procesate utilizând reactivul DNAzol.
Store at room temperature.
Rezumând, eșantioanele de țesut sunt lizate în 1 ml de DNAzol timp de 10 minute într-o eprubetă de microcentrifugă de 1,5 ml și apoi centrifugate la 13000 rpm timp de 5 minute pentru a îndepărta orice materie sub formă de particule.
Battelle AP4.6.04 (1,18 mg/ml (AAA)), purified according to:
Eșantionul lizat este apoi transferat într-o nouă eprubetă de microcentrifugă de 1,5 ml care conține 500 μl de etanol 100 % de grad molecular și apoi centrifugat la 13000 rpm timp de 10 minute pentru a precipita ADN-ul.
Guidance for the preparation of tissue sections for sex determination and staging of gonads
Etanolul este îndepărtat și înlocuit cu 400 μl de etanol 70 % de grad molecular, centrifugat la 13000 rpm timp de 5 minute, iar granulele de ADN sunt dizolvate în 50 μl de apă fără DNază și RNază moleculară.
The purpose of this section is to describe the procedures that occur prior to the evaluation of histological sections.
Din nou, atunci când se utilizează țesuturi dure (înotătoare pectorală), poate fi necesar să se omogenizeze eșantionul în tamponul pentru liză cu ajutorul unui produs de liză tisulară FastPrep® sau al unui sistem echivalent de liză tisulară înainte de extragerea ADN-ului.
Other procedures that result in similar sex determination and gonadal staging can be used.
ADN-ul se păstrează la temperatura de – 20 °C, până în momentul utilizării.
With a few exceptions, these procedures are similar for Japanese medaka (JMD) and zebrafish (ZF).
în cursul procedurilor este obligatorie purtarea mănușilor.
Euthanasia, Necropsy, and Tissue Fixation
Testarea prin reacția în lanț a polimerazei (PCR)
Objectives:
Amplificările au fost efectuate utilizând 2,5 μl de extract de ADN într-un volum de reacție de 50 μl utilizând primeri de locus Idh (astfel cum a fost descris de Peichel et al., 2004.
Provide for the humane sacrifice of fish.
Current Biology 1:1416-1424):
Obtain necessary body weights and measurements.
Primer sens
Evaluate secondary sex characteristics.
Primer antisens
Dissect tissues for VTG analysis.
Există numeroși furnizori de reactivi PCR corespunzători.
Fixation of the gonads.
Metoda descrisă mai jos este cea utilizată în prezent în laboratorul Cefas Weymouth.
Fish should be sacrificed immediately prior to necropsy.
Se prepară un amestec principal după cum urmează:
Therefore, unless multiple prosectors are available, multiple fish should not be sacrificed simultaneously.
Acesta poate fi pregătit în prealabil și păstrat în stare congelată la – 20 °C până în momentul utilizării.
The fish is removed from the solution when there is cessation of respiration and the fish is unresponsive to external stimuli.
Tampon de reacție 5xGoTaq®
The fish is wet weighed.
Nucleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
For preparation of tissues for VTG analysis, the fish can be placed on a corkboard on the stage of a dissecting microscope.
0,5 μl (25 mM fiecare)
For zebrafish the head is cut right behind the pectoral fin and tail is cut right behind the dorsal fin.
250 μM fiecare
For Japanese medaka the abdomen is opened via a carefully made incision that extends along the ventral midline from the pectoral girdle to a point just cranial to the anus.
Primer sens
Using the small forceps and small scissors, the liver is carefully removed.
0,5μl (0,1 nmol/μl)
Specimen for VTG analysis are placed in eppendorf tubes and immediately frozen in liquid nitrogen.
Primer antisens
The carcass including the gonads is placed into a pre-labelled plastic tissue cassette, which is transferred into Davidson's or Bouin's fixative.
2 μM
The volume of fixative should be at least 10 times the approximated volume of the tissues.
Apă de calitate pentru biologie moleculară
The fixative container is gently agitated for five seconds to dislodge air bubbles from the cassette.
Polimerază GoTaq
All tissues remain in Davidson's fixative overnight, followed by transfer to individual containers of 10 % neutral buffered formalin the next day.
Se introduce 47,5 μl într-o eprubetă cu pereți subțiri de 0,5 ml pentru PCR.
Containers with cassettes are gently agitated for 5 seconds to ensure adequate penetration of formalin into cassettes.
Se adaugă 2,5 μl de ADN purificat în eprubeta marcată corespunzător.
Tissue Processing
Se adaugă deasupra 2 picături de ulei mineral.
Dehydrate tissue for adequate penetration of paraffin.
În mod alternativ, se utilizează un aparat de ciclizare termică cu capac încălzit.
Labelled tissue cassettes are removed from formalin/ethanol storage and the cassettes are placed in the processing basket(s).
Eșantioanele au fost denaturate într-un aparat de ciclizare termică Peltier PTC-225 la 94 ± 2 °C timp de 5 minute, urmată de 39 de cicluri la 94 ± 2 °C timp de 1 minut, 55 ± 2 °C timp de 1 minut, 72 ± 2 °C timp de 1 minut și o extensie finală la 72 ± 2 °C timp de 10 minute.
The processing basket is loaded in the tissue processor.
Prepararea gelului de agaroză (2 %):
The processing schedule is selected.
În mod tradițional, produsele PCR sunt introduse într-un gel de agaroză 20 % care conține bromură de etidiu.
After the tissue processor has completed the processing cycle, the basket(s) may be transferred to the embedded station.
Pot fi utilizate, de asemenea, sisteme de electroforeză capilare.
Embedding
Se cântăresc 2 g de agaroză în 100 ml 1 × tampon TAE
Objective:
Se încălzesc într-un cuptor cu microunde (aproximativ 2 – 3 min) pentru a dizolva agaroza.
Properly orient the specimen in solidified paraffin for microtomy.
Se adaugă 2 picături de bromură de etidiu cu o concentrație finală de 0,5μg/ml
The basket(s) of cassettes is/are removed from the processor and immersed in the paraffin-filled front chamber of the embedding station thermal console or the cassettes are moved to a separate paraffin heater.
Se transferă soluția fierbinte în echipamentul de formare a gelului.
The first cassette to be embedded is removed from the front chamber of the thermal console or the paraffin heater.
Se lasă gelul să se întărească
The cassette lid is removed and discarded, and the cassette label is checked against the animal records to resolve potential discrepancies prior to embedding.
Electroforeza în gel:
An appropriately sized embedding mould is selected.
Gelul de agaroză este transferat în echipamentul de electroforeză și se scufundă în 1 × tampon TAE
The mould is held under the spout of the dispensing console and filled with molten paraffin.
Se încarcă 20 μl din fiecare eșantion într-un godeu separat, adăugând un marker de greutate moleculară (scară ADN 100 bp, Promega) într-un godeu liber.
The specimen is removed from the cassette and placed in the molten paraffin in the mould.
Electroforeza se realizează la 120 V timp de 30 – 45 de minute.
This is repeated with 4-8 specimens for each paraffin mould.
Vizualizarea produșilor de amplificare
The position of individual fish is marked by putting fish no 1 in 180 degrees to fish 2-4/8.
Dacă bromura de etidiu a fost încorporată în gelul de agaroză astfel cum se descrie mai sus, produșii ADN sunt vizualizați cu o sursă de raze UV.
Additional paraffin is added to cover the specimen.
Ca alternativă, gelul de agaroză este colorat prin acoperirea gelului cu soluție diluată de bromură de etidiu (0,5 μg/ml în apă) timp de 30 de minute înainte de vizualizare.
The mould with the cassette base is placed on the cooling plate of the cryo console.
Apendicele 11
After the paraffin has solidified, the block (i.e., the hardened paraffin containing the tissues and the cassette base) is removed from the mould.
Orientări pentru procedura de fertilizare artificială a de ghidrinilor
Microtomy
Scopul acestei secțiuni este de a descrie procedurile de obținere a ouălor fertilizate de ghidrin în vederea utilizării lor în FSDT.
Cut and mount histological sections for staining.
Proceduri
The initial phase of microtomy termed “facing” is conducted as follows:
Obținerea spermei de la masculi
The paraffin block is placed in the chuck of the microtome.
Un mascul bine colorat din populația dorită este eutanasiat.
The chuck is advanced by rotating the microtome wheel and thick sections are cut from the paraffin surface of the block until the knife reaches the embedded tissues.
Testiculele sunt disecate de pe fiecare latură a peștelui.
The section thickness on the microtome is set between 3 - 5 microns.
Testiculele sunt în general structuri intens pigmentate, sub formă bastoane, care sunt ușor vizibile lateral de linia mediană a corpului.
The chuck is advanced and multiple sections are cut from the block to remove any artefacts created on the cut surface of the tissue during rough trimming.
Se utilizează una dintre următoarele metode:
The block can be removed from the chuck and placed facedown on ice to soak the tissue.
Utilizând o pereche de foarfeci fine, se începe de la cloacă și se realizează o incizie de 1 – 1,5 cm într-o singură mișcare sub un unghi de circa 45 de grade.
The next phase of microtomy is final sectioning and mounting of tissue sections on slides.
Se folosește un bisturiu pentru realizarea unei incizii mici în părțile laterale ale peștelui ușor posterior față de pelvis și imediat ventral față de plăcile laterale.
These procedures are conducted as follows:
Testiculele sunt îndepărtate utilizând un forceps fin și sunt plasate într-o placă Petri.
If the block has been placed on ice, the block is removed from the ice and replaced in the chuck of the microtome.
Fiecare testicul este acoperit cu 100 μl de soluție finală Hank proaspăt preparată.
With the section thickness on the microtome set to 3 - 5 microns, the chuck is advanced by rotating the microtome wheel.
Testiculele sunt tăiate mărunt folosind o lamă de oțel sau un bisturiu.
Sections are cut from the block until a “ribbon” containing at least one acceptable section including the gonads has been produced.
Aceasta va elibera sperma și va conferi soluției Hank un aspect lăptos.
(As necessary during sectioning, the block may be removed from the chuck, placed on ice to soak the tissue, and replaced in the chuck.)
Fluidul conținând spermă se adaugă într-o pipetă, încercând, în același timp, să nu se includă bucăți de țesut de testicule atunci când se pipetează.
The sections are floated flat on the surface of the water in the water bath.
800 μl de soluție finală Hank se adaugă într-o eprubetă și se amestecă bine.
An attempt is made to obtain at least one section that contains no wrinkles and has no air bubbles trapped beneath it.
Dacă este necesar, masculii pot fi conservați prin fixare în etanol 100 % sau în alt fixator dorit.
A microscope slide is immersed beneath the best section, which is lifted out of the water using the slide.
Aceasta este deosebit de important în cazul în care studiul atribuie originea parentală a descendenților.
This process is referred to as “mounting” the section on the slide.
Cu toate că majoritatea soluțiilor stoc necesare pot fi efectuate în avans, soluția stoc 5 și, ulterior, soluția finală, trebuie constituite în stare proaspătă în ziua utilizării.
Three sections are prepared for a set of fish.
Soluția stoc 1
The second and third sections are taken at 50 micron intervals following the first section.
8,00 g
If the fish are not embedded with their gonads in the same sectioning level, more sections are to be made to ensure that at least six sections including the gonads are obtained from each fish.
0,40 g
With a slide-marking pen, the block number from which the slide was produced is recorded on the slide.
Apă distilată (Distilled water – DW)
The slide is placed in a staining rack.
Soluția stoc 2
The block is removed from the chuck and placed facedown for storage.
HPO4 (anhidru)
Staining, Cover slipping, and Slide Labelling
0,358 g
Stain the sections for histopathological examination
0,60 g
Permanently seal mounted and stained tissues.
Soluția stoc 3
Permanently identify stained sections in a manner that allows complete traceability.
0,72 g
Staining
50 ml
Slides are air-dried overnight before staining.
Soluția stoc 4
Cover slipping
1,23 g
Cover slips can be applied manually or automatically.
Soluția stoc 5 (proaspăt preparată)
A slide is dipped in xylene or TissueClear, and the excess xylene/TissueClear is gently knocked off the slide.
0,35 g
Approximately 0,1 ml of mounting medium is applied near the end of the slide opposite to the frosted end or on the cover slip.
10 ml
The cover slip is tilted at a shallow angle as it is applied to the slide.
Dacă există disponibile unele dintre sărurile de mai sus dar cu conținut de apă diferit (i.e.
Labelling
2H2O în loc de anhidre) ele pot fi utilizate, dar mai întâi se ajustează greutatea pe baza greutății moleculare).
Each slide label should contain the following information.
Pentru soluția finală Hank se combină în următoarea ordine:
Laboratory name
soluția stoc 1
Specimen No./Slide No.
soluția stoc 2
Chemical/Treatment group
0,1 ml
Statistical Flow Chart for vitellogenin analysis
soluția stoc 3
Dunnett test
8,6 ml
variances stabilising transform?
soluția stoc 4
Variances unequal Variances equal No Yes
soluția stoc 5
Yes Step-down trend test on replicate means
Se amestecă bine înainte de utilizare.
<=3 reps per conc
Fertilizare
Normalising transform?
Se identifică femele mari, gestante, din populația dorită;
Nested ANOVA not normal
femelele sunt gata de presare numai atunci când se pot vedea ouăle ieșind din cloacă.
Nested ANOVA normal Monotone
Femelele pregătite au o postură caracteristică cu capul în sus.
Drop water control
Se presează ușor cu un deget pe partea laterală a peștelui în direcția spre coadă pentru a stimula expulzarea ouălor într-un vas Petri proaspăt.
Dunn test
Acțiunea se repetă pe cealaltă parte, apoi peștele este întors în bazin.
Step-down Jonckheere or Williams' test
Ouăle pot fi răspândite (formând un monostrat) cu ajutorul unei pensule fine.
Rep means not normal or not homogenous
Este important să se încerce expunerea a cât mai multor ouă la spermă maximalizând astfel aria suprafeței ouălor.
Rep means not normally distributed
Ouăle se mențin umede prin plasarea unui șervet umed în jurul lor (este important ca ouăle să nu intre în contact direct cu apa pentru că acest lucru poate întări prematur corionul, împiedicând fertilizarea).
Combine controls, retains subgroups
Există o mare variație a numărului de ouă produse de fiecare femelă, dar ca o medie, ar trebui să se obțină cu ușurință aproximativ 150 de ouă de la o singură femelă gestantă.
Compare controls using Wilcoxon or T-test.
de spermă în amestecul Hank se aplică în mod uniform pe întreaga suprafață a ouălor cu ajutorul unei pensule.
Do controls differ?
Ouăle se vor întări rapid și își vor schimba culoarea (într-un minut) odată cu începerea fertilizării.
Both solvent and non-solvent control are present
Dacă numărul estimat de ouă este mai mare de 150 procedura se repetă.
Statistical Flow Chart for sex ratio analysis
În mod similar, dacă ouăle nu se întăresc într-un minut se mai adaugă spermă.
Apply step-down Jonckheere-Terpstra test (+) to determine NOEC
Adăugarea de spermă suplimentară nu îmbunătățește neapărat rata de fertilizare.
Dunn or Mann-Whitney U-test w/Bonferroni-Holm adjustment to determine NOEC
Ouăle și soluția de spermă trebuie lăsate să «interacționeze» timp de minimum 15 minute, iar ouăle fertilizate trebuie introduse în acvariile de expunere după 1,5 ore de la fertilizare.
Use Dunnett test if homogenous variances (*), Tamhane-Dunnett (T3) test otherwise, to determine NOEC
Procedura se repetă utilizând o altă femelă până se colectează numărul dorit de ouă.
Are data normally distributed?
Se păstrează câteva ouă din ultimul lot și se fixează în acid acetic 10 %.
Are data consistent with monotone dose-response?
Numărarea și distribuirea ouălor în acvariile de testare
(‡) Or other agreed control selection
Ouăle trebuie să fie distribuite în mod uniform între fiecare nivel de tratament pentru evitarea rezultatelor incorecte din cauze genetice.
After arcsin square-root transform
Fiecare lot de ouă fertilizate trebuie separat în grupe de mărimi egale (număr egal cu nivelurile de tratament) folosind un instrument neascuțit (forceps entomologic cu lame late sau o ansă de inoculare).
(+) With fewer than 5 experimental units per treatment exact J-T or M-W test should be used if available
În cazul în care se vizează 4 replici per tratament, fiecare cu 20 de ouă, trebuie să se distribuie 80 ouă per acvariu de expunere.
Combine controls
Este recomandabil să se adauge un supliment de 20 % (adică 96 de ouă per nivel de tratament) până când este sigur că se obțin rate de fertilizare de 100 %.
Drop water control (‡)
Ouăle de ghidrin sunt foarte predispuse la infecții micotice în afara cuibului păzit de tată.
Compare controls using t-Test.
În această privință, tratarea tuturor ouălor cu albastru de metilen în primele 5 de zile ale testului are o importanță capitală.
Is solvent used?
O soluție stoc de albastru de metilen este preparată la concentrația de 1 mg/ml și este adăugată în acvariile de expunere pentru a se obține o concentrație finală maximă de 2,125 mg/l.
Appendix 9
Ghidrinii nu trebuie să fie expuși la albastru de metilen odată eclozați, astfel încât sistemul trebuie să fie lipsit de albastru de metilen până în ziua 6.
Guidance for tissue sampling for genetic sex determination and for genetic sex determination by PCR-method
Ouăle se inspectează în fiecare zi și orice ouă moarte sau nefertilizate sunt înregistrate ca atare.
Tissue sampling, preparation and storage before determination of genetic sex by PCR-method in medaka (Prepared by the Laboratory for Aquatic Organisms of Bayer CropScience AG)
Ouăle nu trebuie să ajungă niciodată în afara apei până când eclozează, chiar și pentru perioade foarte scurte.
With fine scissors the anal or the dorsal fin will be cut off in each individual fish and placed into a tube filled with 100 μl of extraction-buffer 1 (details on buffer preparation see below).
Soluție salină tamponată Hank (Hank's Buffered Salt Solution – HBSS):HBSS este necesară pentru a păstra sperma în cursul pregătirii pentru fertilizare.
The scissors will be cleaned after each single fish in a beaker filled up with distilled H2O and dried with a paper tissue.
C.42 BIODEGRADABILITATEA ÎN APĂ DE MARE
Now the fin-tissues will be homogenised by a micro tube teflon pistil for the lysis of cells.
INTRODUCEREA GENERALĂ
For each tube a new pistil will be used to prevent any contaminations.
Prezenta metodă de testare este echivalentă cu Orientarea OCDE privind testarea (TG) nr.
The pistils will be placed overnight in 0,5 M NaOH, rinse for 5 minutes in distilled H2O and stored in ethanol or sterile after autoclave until use.
306 (1992).
It is also possible to store the fin tissue without any extraction-buffer 1 on dry-ice and then at – 80 °C refrigerator to prevent any degeneration of the DNA.
Atunci când au fost elaborate metodele de testare originale, nu se știa în ce măsură rezultatele testelor de screening pentru ușurința biodegradabilității, utilizând apă dulce cu inocul de apă de canal sau nămol activat, ar putea fi aplicate mediului marin.
But the extraction runs better, if you extract the DNA at the same time (handling see above; samples should be thawed on ice after storaging at – 80 °C before the buffer will be filled in the tubes).
Cu privire la acest subiect au fost raportate rezultate variabile [de exemplu (1)].
After homogenizing all tubes will be placed in a water bath and boiled for 15 minutes at 100 °C.
Multe ape reziduale industriale, care conțin o varietate de substanțe chimice, ajung în mare fie prin descărcare directă, fie prin intermediul unor estuare și râuri în care timpii de staționare sunt mici în comparație cu perioada necesară pentru biodegradarea completă a multora dintre substanțele chimice prezente.