natgillin/translations-raw huggingface dataset:
The cytoplasm stains basophilic, whereas the nucleus stains eosinophilic.
Secțiunile se spală de două ori timp de cinci minute în 2 × SSC la temperatura camerei și o dată timp de 10 minute în 0,4 × SSC la 42 °C.
Pale halos around large, strongly stained (refringent) granules and, in larger cells, cell within cell arrangements are observed.
Etapele de detectare se efectuează în conformitate cu instrucțiunile producătorului.
The technique is not parasite species specific.
Lamele sunt apoi clătite în apă distilată sterilă (dH2O).
Sections of tissue that include gills, digestive gland, mantle, and gonad shall be fixed for at least 24 hours in Davidson's fixative followed by normal processing for paraffin histology and staining, for example with haematoxylin and eosin.
Secțiunile sunt contracolorate cu Bismarck Brown Yellow și clătite în dH2O; se acoperă cu lamele, utilizând un mediu de montare apos.
Observations shall be made at increasing magnifications up to × 1000.
Controalele pozitive și negative sunt secțiuni de la gazde despre care se știe că sunt infectate și, respectiv, neinfectate.
A positive result shall be the observation of cells ranging in size from 4 up to 40 μm.
Rezultatul pozitiv trebuie stabilit prin colorarea în violet-negru a celulelor de M. refringens în țesuturile-țintă cunoscute, toate controalele negative având rezultate negative și toate controalele pozitive având rezultate pozitive.
Early stages consist of multinucleate, spheric to elongated cells.
Secvențiere
These are mainly found in the epithelium of oesophagus and stomach and sometimes of labial palps.
Secvențierea este una dintre ultimele etape necesare pentru confirmarea diagnosticului.
Sporulation involves divisions of cells within cells and takes place in the digestive gland tubules and ducts.
Regiunile vizate sunt subunitatea mică a ADNr și ITS1.
Refringent granules appear in the course of sporulation, but are not observed in early stages.
Metode și proceduri de diagnostic detaliate pentru supravegherea și pentru confirmarea infecției cu Marteilia refringens
In late phases of infection, sporangia are observed free in the lumen of the digestive tract.
În scopul programelor de supraveghere și pentru a confirma prezența unei infecții cu Marteilia refringens sau pentru a exclude suspiciunea privind această boală listată, în conformitate cu cerințele stabilite în partea 4 secțiunea II din anexa I, metodele de diagnosticare și procedurile aferente care trebuie utilizate trebuie să fie în conformitate cu orientările stabilite în tabelul 4.1, după cum urmează:
The granules can range from deep orange to deep red.
Tabelul 4.1
Molecular techniques
Orientări privind utilizarea metodelor de diagnostic pentru programele de supraveghere și pentru a confirma infecția cu Marteilia refringens sau pentru a exclude suspiciunea privind această boală
DNA extraction kits, which are available commercially and usually produce high quality DNA suitable for use with the PCR protocols as described in point I.3.2, may be used.
Metodă
Polymerase chain reaction (PCR)
Supraveghere individualizată
Several PCR protocols have been developed and published.
Diagnostic prezumtiv
PCR primers that target the internal transcribed spacer (ITS1) region shall be used as they are able to amplify only M. refringens.
Confirmarea diagnosticului
PCR shall be carried out in a 50 μl volume.
Amprente ale glandei digestive
PCR mixtures shall contain buffer (500 mM KCl, 100 mM Tris/HCl [pH 9,0 at 25 °C] and 1 % Triton® X-100), 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP mix, 1 μM forward and reverse primers, 0,02 units μl– 1 Taq DNA polymerase, and 10 to100 ng of extracted DNA.
X sau
After denaturation of DNA at 94 °C for five minutes, 30 cycles shall be run as follows: denaturation at 94 °C for one minute, annealing at 55 °C for one minute, and elongation at 72 °C for one minute per kilo-base pair.
Histopatologie
A final elongation step of 10 minutes at 72 °C shall be performed.
Hibridare in situ
For the detection of M. refringens, PCR shall be performed with primers that target the ITS1 region (5′-CCG-CAC-ACG-TTC-TTC-ACT-CC-3′ and 5′-CTC-GCG-AGT-TTC-GAC-AGA-CG-3′).
X și
Positive controls shall consist of genomic DNA from a highly infected host or plasmidic DNA including the target region.
METODE ȘI PROCEDURI DE DIAGNOSTIC DETALIATE PENTRU SUPRAVEGHEREA ȘI CONFIRMAREA INFECȚIEI CU BONAMIA OSTREAE
Negative controls shall consist of genomic DNA from non-infected hosts and PCR reactives without target DNA.
I. Proceduri pentru diagnosticarea infecției cu Bonamia ostreae
A positive result shall be positive PCR amplification at the expected size (412 bp), with all negative controls being negative and all positive controls being positive.
În cazul în care sunt prelevate eșantioane și sunt realizate examene de laborator în scopul obținerii sau al menținerii unui anumit statut sanitar în ceea ce privește Bonamia ostreae, astfel cum se prevede în partea 5 secțiunea I din anexa I, sau în scopul confirmării prezenței acestei boli listate sau al excluderii suspiciunii privind această boală în conformitate cu articolul 57 litera (b) din Directiva 2006/88/CE, folosind metodele de diagnostic prevăzute în partea 5 secțiunea II din anexa I, trebuie aplicate metodele și procedurile de diagnostic detaliate prevăzute la punctele I.1, I.2 și I.3 următoare.
In-situ hybridisation (ISH)
Procesul de eșantionare
Several ISH protocols have been developed and published.
Odată selecționate, stridiile se păstrează la 4 °C sau refrigerate pe gheață timp de maximum 24 de ore dacă eșantioanele includ moluște cu cochilia deschisă și 72 de ore în caz contrar, într-o pungă de plastic cu o etichetă cuprinzând detaliile referitoare la natura și originea stridiilor.
Probe that targets the SSU of the rRNA gene complex shall be used because it has been validated against histology.
Pentru diagnosticarea Bonamia ostreae prin histologie se utilizează o secțiune de țesuturi cu grosime de 3-5 mm, incluzând branhii și țesut cardiac.
Sections of tissue that include gills, digestive gland, shall be fixed for at least 24 hours in Davidson's fixative followed by normal processing for paraffin histology.
După uscarea țesutului branhial și a celui cardiac pe o hârtie absorbantă se realizează mai multe amprente pe o lamă din sticlă.
Sections of 5 μm shall be cut and placed on aminoalkylsilane-coated slides, which shall then be baked overnight in an oven at 40 °C.
Lamele sunt lăsate să se usuce la aer, se fixează în metanol sau etanol absolut și se colorează cu ajutorul unui kit de colorare disponibil în comerț (precum Diff-Quik®/Hemacolor®), în conformitate cu instrucțiunile producătorului.
The sections shall be dewaxed by immersing in xylene for 10 minutes.
Lamele trebuie să fie analizate mai întâi la un grosisment de × 200 și apoi în imersiune în ulei la un grosisment de × 1000.
This step shall be repeated once and then the solvent shall be eliminated by immersion in two successive absolute ethanol baths for 10 minutes each.
Rezultatul pozitiv constă în prezența unor organisme mici, de formă sferică sau ovală (2-5 μm lățime), în interiorul hemocitelor.
The sections shall then be dehydrated by immersion in a graded ethanol series.
Cu toate acestea, parazitul ar putea fi prezent și în afara celulelor.
The sections shall be treated with proteinase K (100 μg ml– 1) in TE buffer (Tris [50 mM], EDTA [10 mM]), at 37 °C for 30 minutes.
Aceste organisme au o citoplasmă bazofilă și un nucleu eozinofil (culorile pot varia în funcție de colorantul utilizat) și, deoarece se răspândesc pe lamă, pot părea mai mari pe amprente decât la examinarea histologică.
Slides shall be dehydrated by immersion in a graded ethanol series and then air dried.
Pot fi observate celule multinucleate.
Sections shall be incubated with 100 μl of hybridisation buffer (4 × SSC [standard saline citrate], 50 % formamide, 1 × Denhardt's solution, 250 μg ml– 1 yeast tRNA, 10 % dextran sulphate) containing 10 ng (1 μl of the PCR reactants prepared as described in point I.3.2 using primers CCG-GTG-CCA-GGT-ATA-TCT-CG and TTC-GGG-TGG-TCT-TGA-AAG-GC) of the digoxigenin-labelled probe.
Trebuie fixate secțiuni de țesut care includ branhii și glanda digestivă timp de cel puțin 24 de ore în fixator Davidson, urmând o prelucrare normală pentru examenul histologic după includerea în parafină și colorare, de exemplu cu hematoxilină și eozină.
Sections shall be covered with in-situ plastic cover-slips and placed on a heating block at 95 °C for five minutes.
Rezultatul pozitiv constă în prezența unor paraziți sub formă de celule foarte mici, cu lățimea de 2-5 μm, în interiorul hemocitelor sau libere în țesutul conjunctiv sau în sinusurile epiteliului branhiilor, tubului digestiv și mantalei, deseori asociați unei reacții inflamatorii intense.
Slides shall then be cooled on ice for one minute before overnight hybridisation at 42 °C in a humid chamber.
Pentru a se înlătura orice îndoială, paraziții trebuie să fie observați în interiorul hemocitelor în vederea stabilirii unui diagnostic pozitiv.
Sections shall be washed twice for five minutes in 2 × SSC at room temperature, and once for 10 minutes in 0,4 × SSC at 42 °C.
Pot fi utilizate kituri de extracție a ADN-ului disponibile pe piață, care permit de obicei obținerea unui ADN de înaltă calitate, ce poate fi utilizat în protocoalele PCR după cum este detaliat mai jos.
The detection steps shall be performed according to the manufacturer's instructions.
Pot fi utilizate două protocoale PCR care vizează subunitatea mică a ADNr:
The slides shall then be rinsed in sterile distilled water (dH2O).
Amestecurile pentru PCR conțin tampon [500 mM KCl, 100 mM Tris/HCl (pH 9,0 la 25 °C) și 1 % Triton® X-100)], 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM amestec dNTP, 1 μM primer sens și antisens, 0,02 unități μl– 1 polimerază ADN Taq și 0,2 ng μl– 1 de matrice ADN într-un volum total de 50 μl.
The sections shall be counter-stained with Bismarck Brown Yellow, rinsed in dH2O, and cover-slips shall be applied using an aqueous mounting medium.
Eșantioanele sunt denaturate într-un termociclu timp de cinci minute la 94 °C, urmând 30 de cicluri (94 °C timp de un minut, 55 °C timp de un minut, la 72 °C timp de un minut) și o elongație finală timp de 10 minute la 72 °C.
Positive and negative controls shall be sections from known infected and non-infected hosts respectively.
Un rezultat pozitiv constă într-un produs de amplificare pozitiv de mărimea preconizată (și anume, 300 pb), toate controalele negative având rezultate negative și toate controalele pozitive având rezultate pozitive.
A positive result shall be demonstrated by the purple-black labelling of M. refringens cells within known target tissues, with all negative controls being negative and all positive controls being positive.
Al doilea protocol PCR este un test PCR în timp real cu SYBR® Green.
Sequencing
Acesta permite detectarea specifică a B. ostreae (descrisă în cele ce urmează) și poate fi combinat cu un test PCR în timp real cu SYBR® Green care să permită detectarea specifică a B. exitiosa (Ramilo et al., 2013).
Sequencing shall be carried out as one of the final steps for confirmatory diagnostic.
Primerii BOSTRE-F (5′- TTACGTCCCTGCCCTTTGTA-3′) și BOSTRE-R (5′- TCGCGGTTGAATTTTATCGT-3′) amplifică un produs de 208 pb.
Targeted regions are the SSU rDNA and ITS1.
Amestecurile pentru PCR conțin SYBR® Green Master Mix (1X), 0,3 μM primeri sens și antisens și 200 ng de ADN extras.
Detailed diagnostic methods and procedures for surveillance and confirmation of infection with Marteilia refringens
Eșantioanele sunt denaturate într-un sistem de detectare în timp real timp de 10 minute la 95 °C, urmând 35 de cicluri (95 °C timp de 30 de secunde, 55 °C timp de 45 de secunde și 72 °C timp de un minut).
For the purpose of surveillance programmes and to confirm the presence of an infection with Marteilia refringens or to rule out a suspicion of that listed disease, in accordance with the requirements laid down in Section II of Part 4 to Annex I, the diagnostic methods and corresponding procedures to be used shall be in accordance with the guidelines laid down in Table 4.1 as follows:
Analiza curbei de topire se efectuează crescând temperatura cu câte 0,5 °C/s, pornind de la o temperatură de 55 °C și ajungând la 95 °C, înregistrând intensitatea fluorescenței la fiecare schimbare de temperatură.
Table 4.1
Controalele pozitive constau în ADN-ul genomic al unei gazde cu o infecție pronunțată sau în ADN plasmidic incluzând regiunea vizată.
Guidelines for the use of diagnostic methods for the surveillance programmes and to confirm or rule out infection with Marteilia refringens
Controalele negative constau în ADN-ul genomic al unor gazde neinfectate și în reactivi PCR fără ADN țintă.
Method
Un rezultat pozitiv constă într-un produs de amplificare pozitiv cu un singur vârf al temperaturii de topire (78,25 ± 0,25 °C în condițiile publicate de Ramilo et al., 2013), toate controalele negative având rezultate negative și toate controalele pozitive având rezultate pozitive.
Targeted surveillance
Trebuie utilizată o sondă care vizează subunitatea mică din complexul de gene al ADNr, cu toate că s-a demonstrat că poate apărea o reacție încrucișată cu alți membri ai familiei Haplosporidia.
Presumptive diagnosis
Trebuie fixate secțiuni de țesut care includ branhii și glanda digestivă timp de cel puțin 24 de ore în fixator Davidson, urmând o prelucrare normală pentru examenul histologic după includerea în parafină.
Confirmatory diagnosis
Secțiunile trebuie să fie incubate cu 100 μl de tampon de hibridare [4 × SSC (soluție salină de citrat), formamidă 50 %, 1 × soluție Denhardt, 250 μg ml– 1 ARNt din drojdie, sulfat de dextran 10 %] conținând 20 ng (2 μl din reacția PCR pregătiți astfel cum se descrie la punctul I.3.2 utilizând primerii Bo și Boas) din sonda marcată cu digoxigenină.
Digestive gland imprints
Secțiunile se spală de două ori timp de cinci minute în 2 × SSC la temperatura camerei și o dată timp de 10 minute în 0,4 × SSC la 42 °C.
X, or
Un rezultat pozitiv constă în existența unor paraziți marcați în interiorul hemocitelor, toate controalele negative având rezultate negative și toate controalele pozitive având rezultate pozitive.
Histopathology
Regiunile vizate sunt subunitatea mică a ADNr și ITS1.
In situ hybridisation
Proceduri privind supravegherea și confirmarea infecției cu Bonamia ostreae
X, and
În scopul supravegherii și confirmării prezenței infecției cu Bonamia ostreae sau al excluderii suspiciunii privind această boală în conformitate cu cerințele stabilite în partea 5 secțiunea II din anexa I, metodele de diagnostic și procedurile aferente care trebuie utilizate respectă orientările stabilite în tabelul 5.1 de mai jos.
DETAILED DIAGNOSTIC METHODS AND PROCEDURES FOR THE SURVEILLANCE AND CONFIRMATION OF INFECTION WITH BONAMIA OSTREAE
Tabelul 5.1
I. Procedures for diagnosis of Infection with Bonamia ostreae
Orientări privind utilizarea metodelor de diagnostic pentru programele de supraveghere și pentru a confirma infecția cu Bonamia ostreae sau pentru a exclude suspiciunea privind această boală
When sampling and laboratory examination are carried out for the purpose of obtaining or maintaining a certain health status with regard to Bonamia ostreae as set out in Section I of Part 5 of Annex I or to confirm or rule out the presence of that listed disease in accordance with Article 57(b) of Directive 2006/88/EC, using the diagnostic methods set out in Section II of Part 5 of Annex I, the detailed diagnostic methods and procedures set out in following points I.1, I.2 and I.3 shall apply.
Amprente de la inimă sau branhii
Sample process
METODE ȘI PROCEDURI DE DIAGNOSTIC DETALIATE PENTRU SUPRAVEGHEREA ȘI CONFIRMAREA BOLII PETELOR ALBE (WHITE SPOT DISEASE – WSD)
Once sampled, oysters shall be maintained at 4 °C or on refrigerated ice for no more than 24 hours if samples include gaping molluscs and 72 hours if not, in a plastic bag including a label with details related to the nature and the origin of the oysters.
Proceduri de diagnostic pentru detectarea WSSV
A 3 to 5 mm thick section of tissues including gills and heart tissue shall be used for the diagnostic of Bonamia ostreae by histology.
În cazul în care se efectuează prelevări de eșantioane și examene de laborator în scopul programelor de supraveghere și de eradicare prevăzute în partea 6 secțiunea I din anexa I și în scopul confirmării prezenței infecției cu WSSV sau al excluderii suspiciunii privind această boală, în conformitate cu articolul 57 litera (b) din Directiva 2006/88/CE, folosind metodele de diagnostic prevăzute în partea 6 secțiunea II din anexa I, trebuie aplicate metodele și procedurile de diagnostic detaliate prevăzute la punctele 2-7 din prezenta parte.
Slides shall be air-dried, fixed in methanol or in absolute ethanol and stained using a commercially available blood-staining kit (namely such as Diff- Quik®/Hemacolor®.), in accordance with the manufacturer's instructions.
Pot fi folosite abordări alternative, utilizând condiții echivalente sau kituri fabricate de producători diferiți, dar care au o sensibilitate și o specificitate echivalente celor descrise în prezenta parte.
Slides shall be observed first at × 200 magnification and then under oil immersion at × 1000 magnification.
În toate cazurile, produsul PCR de amplificare trebuie să fie secvențiat, pentru a confirma că este vorba despre virusul sindromului petelor albe (WSSV).
A positive result shall be the presence of small spherical or ovoid organisms (2 to 5 μm wide) within haemocytes.
Țesuturile (pleopode și branhii) de la crustacee infectate cu WSSV pot fi păstrate în etanol, în RNAlater sau pot fi congelate rapid la – 80 °C.
However, the parasite might also occur extracellularly.
Etapele necesare pentru identificarea WSSV utilizând eșantioane de țesuturi sunt următoarele: omogenizarea țesuturilor, extracția ADN-ului, amplificarea specifică a ADN-ului WSSV utilizând PCR, vizualizarea produsului amplificat pe un gel, purificarea ADN-ului și secvențierea pentru confirmarea identității agentului patogen.
These organisms show a basophilic cytoplasm and an eosinophilic nucleus (colours may vary with the stain used) and, because they spread on the slide, they can appear wider on imprints than on histological examination.
Omogenizarea țesuturilor
Multinucleated cells may be observed.
Mărunțirea țesuturilor și pregătirea unui omogenat într-un tampon adecvat se efectuează utilizând un mixer Fast Prep și tuburi Lysing Matrix A (MP Biomedicals).
Sections of tissue that include gills and digestive gland, shall be fixed for a period of at least 24 hours in Davidson's fixative followed by normal processing for paraffin histology and staining, for example with haematoxylin and eosin.
Țesuturile sunt cântărite, plasate în tuburi Lysing Matrix A, diluate într-o proporție de 1 la 10 g/v sau în conformitate cu instrucțiunile producătorului, într-un tampon adecvat [G2 și 10 μl de proteinază K de utilizat cu kitul de extracție a ADN-ului din țesuturi DNA Tissue kit (QIAGEN)] și omogenizate cu un omogenizator Fast Prep 24 timp de două minute.
A positive result shall be the presence of parasites as very small cells of 2 to 5 μm wide within the haemocytes or free in the connective tissue or sinuses of gill, gut and mantle epithelium, often associated with an intense inflammatory reaction.
Eșantioanele omogenizate se incubează la 56 °C timp de minimum patru ore sau timp de o noapte.
To avoid any doubt, the parasite shall be observed inside the haemocyte for a positive diagnosis.
Eșantioanele se agită, se centrifughează la 9000 rpm timp de două minute, iar 50 μl de supernatant sau un volum echivalent cu 5 mg de țesut (greutatea țesutului optimă pentru kitul de extracție) se adaugă într-un tub-eșantion pentru extracția ADN-ului, completându-se volumul până la 200 μl cu ajutorul unui tampon G2.
DNA extraction kits, which are available commercially and usually produce high quality DNA suitable for use with the PCR protocols as detailed below, may be used.
ADN-ul total este extras utilizând un set pentru extracția ADN-ului din țesuturi și EZ1 Advanced XL Biorobot (Qiagen), conform instrucțiunilor producătorului.
Two PCR protocols targeting the small subunit (SSU) rDNA may be used:
Fiecare lot de eșantioane trebuie să fie însoțit de un control al extracției (ADN din timus de vițel) și de un control negativ (tampon G2).
the first one is a conventional PCR that amplify several members of the Haplosporidia including Bonamia spp.
ADN-ul este eluat într-un volum de 50 μl.
Primers designated Bo and Boas are 5′-CAT-TTA-ATT-GGT-CGG-GCC-GC-3′ and 5′-CTG-ATC-GTC-TTC-GAT-CCC-CC-3′ respectively, and amplify a 300 bp product.
Pentru a se asigura că extracția s-a finalizat cu succes, se determină concentrația ADN-ului pentru toate eșantioanele și controalele, folosind un Nano Drop.
PCR mixtures contain buffer (500 mM KCl, 100 mM Tris/HCl [pH 9,0 at 25 °C] and 1 % Triton® X-100), 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP mix, 1 μM forward and reverse primers, 0,02 units μl– 1 Taq DNA polymerase, and 0,2 ng μl– 1 of the DNA template in a total volume of 50 μl.
ADN-ul extras trebuie să fie congelat la – 20 °C în cazul în care nu este necesar imediat.
Samples shall be denatured in a thermocycler for five minutes at 94 °C before being submitted to 30 cycles (94 °C for one minute, 55 °C for one minute, 72 °C for one minute) followed by a final extension of 10 minutes at 72 °C.
Amplificarea WSSV prin reacția în lanț a polimerazei (PCR)
A positive result shall be positive PCR amplification at the expected size (namely, 300 bp), with all negative controls being negative and all positive controls being positive;
Metoda care trebuie să fie folosită pentru detectarea WSSV este protocolul pentru detectarea WSSV prin nested PCR, prevăzut în paragrafele următoare, care permite obținerea, în prima și în a doua etapă a PCR, a unui produs de amplificare de 1447 pb și, respectiv, de 848 pb al genei ARNr 18S.
the second PCR protocol is a SYBR® Green Real time PCR assay.
Prima etapă a PCR se realizează într-un volum de 50 μl care conține concentrații finale de 1 × GoTaq Buffer (Promega), 5mM MgCl2, 1pmol/μl primer WSSV 146 F1, 1pmol/μl primer WSSV 146 R1 (tabelul 1), 0,25mM dNTP, 1,25U polimerază Taq și 2,5μl ADN.
It allows the specific detection of B. ostreae (described below) and may be combined with a SYBR® Green Real time PCR assay allowing the specific detection of B. exitiosa (Ramilo et al.
Fiecare eșantion este duplicat și asociat unui control de extracție negativ, unui control PCR negativ (se adaugă 2,5μl H2O în loc de ADN) și unui control pozitiv.
2013).
Controlul pozitiv constă în plasmidă de WSSV diluată, pregătită și validată pentru utilizare în laborator (pusă la dispoziție de laboratorul de referință al UE).
Primers BOSTRE-F (5′- TTACGTCCCTGCCCTTTGTA-3′) and BOSTRE-R (5′- TCGCGGTTGAATTTTATCGT-3′) amplify a 208 bp product.
Reacția din cea de-a doua etapă a PCR are loc în același mod ca și prima etapă, dar utilizând setul de primeri WSSV 146 F2/R2 și un al doilea control pozitiv, pentru a verifica dacă această etapă a PCR a funcționat.
PCR mixtures contain SYBR® Green Master Mix (1X), 0,3 μM forward and reverse primers, and 200 ng of extracted DNA.
TACGGCAGCTGCTGCACCTTGT
Samples shall be denatured in a Real Time Detection System for 10 minutes at 95 °C before being submitted to 35 cycles (95 °C for 30 seconds, 55 °C for 45 seconds and 72 °C for one minute).
Atât prima, cât și a doua etapă a PCR se realizează folosind următoarea succesiune a ciclurilor, utilizând un termociclu DNA Engine Tetrad 2 Peltier (sau echivalent): o etapă inițială de denaturare la 94 °C timp de două minute, apoi o etapă la 94 °C timp de 30 de secunde, la 62 °C timp de 30 de secunde, la 72 °C timp de 30 de secunde, repetată pe parcursul a 30 de cicluri, o etapă de elongație la 72 °C timp de două minute și menținere la 4 °C.
Melting temperature curve analysis shall be carried out with temperature increments of 0,5 °C/s starting at 55 °C and ending at 95 °C and recording fluorescence at each change of temperature.
Electroforeză în gel