natgillin/translations-raw huggingface dataset:
However, in case the amount of inoculum is small, tissue from up to five fish may be used.
Eșantioanele de țesut se fragmentează cu ajutorul unui foarfece steril sau al unui scalpel, se omogenizează în conformitate cu descrierea de la primul paragraf al prezentului punct și se plasează în suspensie în mediul de transport.
Alternatively, samples may be pooled in RNA stabilization reagents, such as 0,2 g tissue/ml reagent according to the recommendation from the manufacturers, although each fish shall be processed individually and shall not be pooled in the samples because of the small amount of material to be used for extraction.
Raportul final între țesuturi și mediul de transport trebuie să fie ajustat în laborator la 1:10.
Whole fish may also be sent to the laboratory.
Centrifugarea omogenatului
Shipment of samples for fish
Omogenatul trebuie să fie centrifugat într-o centrifugă cu răcire, la o temperatură cuprinsă între 2 și 5 °C, la 2000-4000 × g, timp de 15 minute, iar supernatantul trebuie colectat și poate fi tratat, fie timp de 4 ore la 15 °C, fie timp de o noapte la o temperatură de 4-8 °C cu antibiotice.
Tubes containing fish tissues in transport medium for cell cultivation or RT-PCR/RT-qPCR analysis shall be placed in insulated containers, such as thick-walled polystyrene boxes, together with sufficient ice or an alternative cooling medium with the similar cooling effect to ensure chilling of the samples during transportation to the laboratory.
Dacă eșantionul a fost expediat într-un mediu de transport, tratamentul supernatantului cu antibiotice nu este necesar.
However, freezing of the samples shall be avoided.
În cazul în care se întâlnesc dificultăți, cum ar fi un incubator defect sau probleme cu culturile celulare, care împiedică inocularea celulelor în cele 48 de ore de la colectarea eșantioanelor de țesuturi de pește, se poate congela supernatantul la – 80 °C și se poate efectua un examen virusologic în decurs de 14 zile.
The temperature of a sample during transit must never exceed 10 °C and ice must still be present in the transport box at receipt or one or more freeze blocks must still be partly or completely frozen.
Dacă supernatantul colectat este conservat la – 80 °C în intervalul de 48 de ore de la prelevarea eșantioanelor, el poate fi reutilizat o singură dată pentru un examen virusologic.
Whole fish may be sent to the laboratory if the temperature requirements referred to in the first paragraph during transportation can be fulfilled.
Înainte de a inocula celulele, se amestecă supernatantul în proporție egală cu un amestec de antiseruri împotriva serotipurilor indigene ale virusului necrozei pancreatice infecțioase (NPI), diluate corespunzător, și se incubează astfel timp de cel puțin o oră la 15 °C sau timp de cel mult 18 ore la 4 °C.
Whole fish shall be wrapped up in paper with absorptive capacity and shall finally be shipped in a plastic bag.
Titrul antiserului trebuie să fie de cel puțin 1:2000 într-un test de neutralizare a plajelor cu 50 % reducerea plajelor.
Live fish may also be shipped.
Tratarea tuturor inoculilor cu antiser împotriva virusului NPI are drept scop prevenirea apariției efectului citopatic (ECP), datorat virusului NPI, în culturile celulare inoculate.
Collection of supplementary diagnostic material
Acest tratament permite reducerea duratei examenelor virusologice, precum și a numărului de cazuri în care apariția ECP ar trebui considerată ca un indicator potențial al virusului SHV sau NHI.
When approved by the diagnostic laboratory, other fish tissues may be collected as well and prepared for supplementary examinations.
Atunci când eșantioanele provin din unități de producție considerate ca fiind indemne de NPI, tratamentul inoculilor cu antiser împotriva virusului NPI poate fi omis.
Preparation of samples for cell culture examination and RT-qPCR
Prepararea eșantioanelor pentru programele de supraveghere care utilizează testul RT-PCR și RT-qPCR
Freezing in exceptional cases
Dacă eșantioanele au fost plasate într-un mediu de transport, se efectuează procedura prevăzută la punctele I.4.2 și I.4.3.
Where practical difficulties arise, which make it impossible to process the samples within 48 hours after the collection of the fish tissues, it may be acceptable to freeze the tissue specimens in transport medium at – 20 °C or below and to carry out virological examination within 14 days.
După centrifugare, se colectează supernatantul și se extrage ARN-ul.
However, the fish tissue shall only be frozen and thawed once before examination.
Dacă nu trebuie realizată o examinare suplimentară imediat după centrifugare, eșantioanele trebuie congelate imediat la – 20 °C sau la o temperatură inferioară acesteia.
Records shall be kept with details on the reason for each freezing of fish tissue samples.
Pentru analiza țesuturilor de pește conservate în reactiv de stabilizare a ARN, se realizează alte operațiuni în termenele următoare, pe eșantioane depozitate la diferite temperaturi:
Homogenisation of organs
eșantioane depozitate la 37 °C: o zi;
In the laboratory, the fish tissue in the tubes shall be completely homogenised, either by stomacher, blender or mortar and pestle with sterile sand, and subsequently suspended in the original transport medium.
eșantioane depozitate la 25 °C: o săptămână;
If a sample consists of a whole fish less than 4 cm long, it shall be minced with sterile scissors or scalpel after removal of the body behind the gut opening.
eșantioane depozitate la 4 °C: o lună;
If a sample consists of a whole fish with body length between 4 cm and 6 cm, the viscera including kidney shall be collected.
eșantioane depozitate la – 20 °C: termen nelimitat.
If a sample consists of a whole fish more than 6 cm long, the tissue specimens shall be collected as described in point I.1.
Eșantioanele globale conservate în reactiv de stabilizare a ARN trebuie să fie tratate la fel ca eșantioanele individuale în reactiv de stabilizare a ARN.
The tissue specimens shall be minced with sterile scissors or scalpel and homogenised as described in the first paragraph of this point and suspended in transport medium.
În cazul eșantioanelor globale conservate în reactiv de stabilizare a ARN, volumul eșantionului nu trebuie să depășească volumul recomandat de producător pentru extracția ARN cu ajutorul kiturilor, de exemplu kiturile RNeasy Mini kits (Qiagen) sau cele similare.
The final ratio between tissue material and transport medium shall be adjusted in the laboratory to 1:10.
Dacă sunt comasate eșantioane mai mari, kiturile sau metodele de extracție trebuie să fie adaptate în consecință.
Centrifugation of homogenate
Eșantioanele colectate în reactivi de stabilizare a ARN nu trebuie să fie utilizate pentru culturi celulare.
The homogenate shall be centrifuged in a refrigerated centrifuge at 2 °C to 5 °C at 2000 to 4000 × g for 15 minutes and the supernatant collected and may be treated for either four hours at 15 °C or overnight at 4 to 8 °C with antibiotics.
Comasarea eșantioanelor pentru RT-qPCR
If the sample has been shipped in a transport medium, the treatment of the supernatant with antibiotics may be omitted.
întrucât protocoalele RT-qPCR au o sensibilitate similară sau mai mare decât cea a metodelor de cultură celulară, se poate accepta utilizarea, pentru PCR, a supernatantului obținut din țesuturi de pește omogenizate provenind din organe prelevate de la maximum zece pești și comasate în mediul de cultură celulară.
Where practical difficulties arise, such as incubator breakdown or problems with cell cultures, which make it impossible to inoculate cells within 48 hours after the collection of the fish tissue samples, the supernatant may be frozen at – 80 °C and virological examination may be carried out within 14 days.
Cu toate acestea, datorită cantității mult mai mici de inocul utilizate pentru PCR, comparativ cu cultura celulară, toate țesuturile de pește trebuie să fie omogenizate cu atenție înainte de gruparea materialului pentru extracție.
If the collected supernatant is stored at – 80 °C within 48 hours after the sampling, it may be reused only once for virological examination.
Același principiu se aplică și în cazul în care se prelevează eșantioane în reactivi de stabilizare a ARN.
Prior to the inoculation of the cells, the supernatant shall be mixed with equal parts of a suitably diluted pool of antisera to the indigenous serotypes of Infectious pancreatic necrosis (IPN) virus and incubated with this for a minimum of one hour at 15 °C or a maximum of 18 hours at 4 °C.
Însă în acest caz este adesea dificil să se colecteze material reprezentativ de la maximum 10 pești într-un tub, iar numărul de pești per eșantion global trebuie prin urmare să fie redus la 2-5.
The titre of the antiserum shall be at least 1/2000 in a 50 % plaque neutralisation test.
Examinarea virusologică pe cultură celulară
Treatment of all inocula with antiserum to IPN virus aims at preventing cytopathic effect (CPE) due to IPN virus from developing in inoculated cell cultures.
Culturi celulare și medii de cultură
This will reduce the duration of the virological examinations as well as the number of cases in which occurrence of CPE would have to be considered potentially indicative of VHSV or IHNV.
Se cultivă celule din linia celulară 2 de la alevini din specia Lepomis macrochirus (BF-2) sau din linia celulară 2 din gonade de păstrăv-curcubeu (RTG-2) și celule de Epithelioma papulosum cyprini (EPC) sau de Pimephales promelas (FHM) la o temperatură cuprinsă între 20 și 30 °C într-un mediu adecvat, și anume mediu Eagle (Eagle's Minimum essential medium – MEM) sau o variantă a acestuia, la care s-au adăugat ser fetal bovin 10 % și antibiotice în concentrații standard.
When samples come from production units, which are considered free from IPN, the treatment of inocula with antiserum to IPN virus may be omitted.
Atunci când celulele sunt cultivate în flacoane închise, se recomandă să se tamponeze mediul cu bicarbonat.
Sample preparation for RT-PCR and RT-qPCR based surveillance programmes
Culturile celulare care se folosesc pentru inoculare cu material tisular de la pești trebuie să fie tinere, de obicei culturi celulare de o zi în monostrat, dacă este posibil; cu toate acestea, pot fi acceptate culturi cu vârste situate în intervalul 4-48 de ore.
If samples were collected in transport medium, the procedure set out in points I.4.2 and I.4.3 shall be carried out.
Celulele trebuie să fie în faza de creștere activă în momentul inoculării.
After centrifugation, supernatant shall be collected and RNA extracted.
Inocularea culturilor celulare
If further examination is not to be undertaken directly after centrifugation, the samples shall be immediately frozen at – 20 °C or below.
Se inoculează o suspensie de organe tratată cu antibiotice în culturile celulare în două diluții, și anume diluția inițială și, în plus, o diluție de 1:10 din aceasta, rezultând diluții finale ale materialului tisular în mediul de cultură celulară de 1:100 și de 1:1000, pentru a se evita interferențele omologilor.
For the analysis of fish tissues preserved in RNA stabilization reagent, subsequent work shall be carried out within the following time scales for samples stored at different temperatures:
Trebuie inoculate cel puțin două linii celulare, astfel cum se menționează la punctul I.5.1.
samples stored at 37 °C: 1 day;
Raportul dintre cantitatea de inocul și volumul mediului de cultură celulară trebuie să fie de aproximativ 1:10.
samples stored at 25 °C: 1 week;
Pentru fiecare diluție și fiecare linie celulară trebuie să se utilizeze o suprafață de cel puțin 2 cm2, ceea ce corespunde unui godeu dintr-o placă de cultură celulară cu 24 de godeuri.
samples stored at 4 °C: 1 month;
Trebuie să fie utilizate plăci de cultură celulară, atunci când este posibil.
samples stored at – 20 °C: indefinitely
Incubarea culturilor celulare
Pooled samples in RNA stabilization reagent shall be treated like single samples in RNA stabilization reagent.
Culturile celulare inoculate sunt incubate la 15 °C timp de șapte până la zece zile.
For samples pooled in RNA stabilization reagent, the sample amount shall not exceed that recommended by the manufacturer for extraction with RNA kits, such as RNeasy Mini kits (Qiagen) or similar.
În cazul în care culoarea mediului de cultură celulară se modifică din roșu în galben, indicând o acidifiere a mediului, se ajustează pH-ul cu ajutorul unei soluții sterile de bicarbonat sau cu ajutorul unor substanțe echivalente, pentru a garanta sensibilitatea culturii celulare la infecția virală.
If larger samples are pooled, the extraction kits or methods must reflect this pooling.
Cel puțin la fiecare șase luni sau în cazul în care se suspectează o scădere a sensibilității celulare se efectuează titrarea stocurilor de virusuri SHV și NHI congelate, pentru a se verifica sensibilitatea culturilor celulare la infecție.
Samples collected in RNA stabilization reagents shall not be used for cell cultivation.
Se utilizează procedura stabilită în secțiunea III, dacă este posibil.
As the RT-qPCR protocols given are of similar or higher sensitivity than the cell cultivation methods, it may be acceptable to use supernatant from homogenised fish tissue material of pooled organs from up to 10 fish in cell culture medium for PCR.
Culturile celulare inoculate trebuie să fie verificate cu regularitate, cel puțin de trei ori pe săptămână, pentru a se observa apariția ECP, cu un grosisment între 40 × și 150 ×.
However, due to the much smaller inoculum used for PCR compared to cell cultivation, all fish tissues shall be carefully homogenised before collating material for extraction.
În cazul în care ECP este evident, se încep imediat procedurile de identificare a virusului în conformitate cu punctul I.6.
The same principle shall also be applied if samples are collected in RNA stabilization reagents.
Subcultivarea
However, in that case it is often difficult to collect representative material from up to 10 fish in one tube, and the number of fish per pool shall therefore be reduced to 2 to 5.
În cazul în care nu se produce niciun ECP după prima incubație de șapte până la zece zile, se procedează la o subcultivare pe culturi celulare proaspete, folosindu-se o suprafață celulară similară cu cea din cultura primară.
Virological examination on cell culture
Părți alicote din mediu (supernatant) provenind de la toate culturile sau godeurile care constituie cultura primară se reunesc într-un pool pentru fiecare linie celulară, la 7-10 zile de la inoculare.
Cell cultures and media
Pool-urile respective sunt apoi inoculate pe culturi celulare omoloage, nediluate și diluate 1:10 (rezultând în final diluții ale supernatantului de respectiv 1:10 și 1:100), în conformitate cu descrierea de la punctul I.5.2.
Bluegill fry cell line -2 (BF-2) or Rainbow trout gonad cell line - 2 (RTG-2) and either Epithelioma papulosum cyprini (EPC) or Fathead minnow (FHM) cells shall be grown at 20 to 30 °C in suitable medium, namely Eagle's Minimum essential medium (MEM) or modifications thereof, with a supplement of 10 % foetal bovine serum and antibiotics in standard concentrations.
Se inoculează, de asemenea, părți alicote de 10 % din mediul care constituie cultura primară direct într-un godeu cu culturi celulare proaspete (subcultivare godeu la godeu).
When the cells are cultivated in closed vials, the medium shall be buffered with bicarbonate.
Inocularea poate fi precedată de o preincubare a diluțiilor cu antiser împotriva virusului NPI la o diluție corespunzătoare, în conformitate cu descrierea de la punctul I.4.3.
The medium used for cultivation of cells in open units may be buffered with tris(hydroxymethyl)aminomethane-HCl (Tris-HCl) (23 mM) and sodium bicarbonate (6 mM).
Se incubează apoi culturile inoculate timp de 7-10 zile la 15 °C și se examinează ținându-se cont de dispozițiile de la punctul I.5.4.
The pH must be 7,6 ± 0,2.
În cazul în care se produce un ECP toxic în cursul primelor trei zile de incubație, se realizează o subcultivare în acest stadiu, dar în acest caz celulele trebuie să fie incubate timp de șapte zile și supuse unei noi subcultivări, cu durata de incubație tot de șapte zile.
The cell cultures to be used for inoculation with fish tissue material shall be young, normally 1 day old cell culture monolayers where possible; however, a range between 4 to 48 hours old may be accepted.
În cazul în care se produce un ECP toxic după trei zile, celulele sunt pasate o dată și incubate pentru a se ajunge la numărul total de 14 zile de la prima inoculare.
The cells must be actively growing at inoculation.
Nu trebuie să existe semne de toxicitate în cursul ultimelor șapte zile de incubație.
Inoculation of cell cultures
În cazul în care se produce o contaminare bacteriană în ciuda tratamentului cu antibiotice, subcultivarea trebuie să fie precedată de o centrifugare la 2000-4000 × g timp de 15-30 de minute, la o temperatură de 2-5 °C, sau de o filtrare a supernatantului printr-un filtru (membrană cu procent scăzut de absorbție a proteinelor) de 0,45 μm sau de ambele.
Antibiotic-treated organ suspension shall be inoculated into cell cultures in two dilutions, namely the primary dilution and, in addition, a 1:10 dilution thereof, resulting in final dilutions of tissue material in cell culture medium of 1:100 and 1:1000, respectively, in order to prevent homologous interference.
În plus, subcultivarea trebuie să urmeze aceleași proceduri ca cele descrise pentru producerea ECP toxic în al patrulea paragraf de la prezentul punct.
At least two cell lines shall be inoculated as referred to in point I.5.1.
În cazul în care nu se produce ECP, testul poate fi declarat negativ.
The ratio between inoculum size and volume of cell culture medium shall be about 1:10.
Identificarea virusului
For each dilution and each cell line, a minimum of about 2 cm2 cell area, corresponding to one well in a 24-well cell culture tray, shall be utilised.
Dacă se observă apariția ECP într-o cultură celulară, mediul (supernatantul) este colectat și examinat prin una sau mai multe din tehnicile următoare: testul de imunoadsorbție cu anticorpi marcați enzimatic (ELISA), testul de imunofluorescență (IF), neutralizarea, RT-PCR sau RT-qPCR.
Cell culture trays shall be used where possible.
În cazul în care aceste teste nu au permis identificarea definitivă a virusului într-o săptămână, supernatantul trebuie trimis la un laborator de referință național sau la laboratorul de referință al Uniunii Europene pentru bolile peștilor, menționat în anexa VI la Directiva 2006/88/CE, în vederea identificării imediate.
Incubation of cell cultures
Se efectuează un test ELISA sandviș dublu anticorp în vederea identificării izolatului de virus.
The inoculated cell cultures shall be incubated at 15 °C for seven to 10 days.
Plăcile de microtitrare sunt umplute cu 50 μl/godeu (0,9 pg) de soluție de imunoglobuline (Ig) din antiseruri de iepure împotriva virusului NHI sau a virusului SHV, purificate cu proteina A, de calitate dovedită, diluate într-un tampon de carbonat (pH 9,6) conținând 15 mM azidă de sodiu, și sunt incubate la 4 °C de-a lungul unei perioade cuprinse între 18 ore și 2 săptămâni.
If the colour of the cell culture medium changes from red to yellow indicating medium acidification, pH adjustment with sterile bicarbonate solution or equivalent substances shall be performed to ensure cell susceptibility to virus infection.
Pe o placă de diluare, fiecare eșantion conținând 1 % Triton X-100 și controalele pozitive se diluează cu o soluție tampon [și anume, tampon fosfat salin (PBS)-T-BSA, 1 % BSA] în patru raporturi de diluție, respectiv nediluat, 1:4, 1:16 și 1:64.
At least every 6 months or if decreased cell susceptibility is suspected, titration of frozen stocks of VHSV and IHNV shall be performed to verify the susceptibility of the cell cultures to infection.
Se spală plăcile ELISA în PBS conținând 0,05 % Tween-20 (PBS-T) și 50 μl din fiecare diluție se transferă de pe placa de diluare pe placa ELISA spălată și umplută.
The procedure set out in Section III shall be used, if possible.
Se transferă pe placa ELISA 50μl anticorpi antișoarece de iepure conjugați cu peroxidază din hrean (HRP), diluați 1:1000 în PBS-T-BSA.
Microscopy
În cele din urmă, după o nouă spălare, sunt declanșate reacțiile adăugând 50 μl de orto-fenilendiamină (OPD) în fiecare godeu.
Inoculated cell cultures shall be inspected regularly, at least three times a week, for the occurrence of CPE at 40 to 150 × magnification.
Plăcile ELISA se incubează timp de 20 de minute la temperatura camerei, în întuneric, iar reacția se oprește prin adăugarea a 100 μl de 0,5 M H2SO4 în fiecare godeu.
If obvious CPE is observed, virus identification procedures in accordance with point I.6 shall be initiated immediately.
Absorbanța va fi monitorizată la o lungime de undă de 492 și 620 nm într-un cititor ELISA.
Subcultivation
Eșantioanele trebuie să fie declarate pozitive sau negative, după compararea rezultatelor testului cu valorile absorbanței pentru controalele pozitive și negative.
If no CPE has developed after the primary incubation for 7 to 10 days, subcultivation shall be performed to fresh cell cultures utilising a cell area similar to that of the primary culture.
În general, eșantioanele cu absorbanță totală (A) < 0,5 pentru material nediluat sunt considerate negative, eșantioanele cu valori A cuprinse între 0,5 și 1,0 sunt considerate suspecte, iar eșantioanele cu valori A > 1,0 sunt considerate pozitive.
Aliquots of medium (supernatant) from all cultures or wells constituting the primary culture shall be pooled according to cell line 7 to 10 days after inoculation.
Pot fi folosite alte variante ELISA cu eficacitate similară dovedită, în locul celor menționate la prezentul punct.
The pools shall then be inoculated into homologous cell cultures undiluted and diluted 1:10 (resulting in final dilutions of 1:10 and 1:100, respectively, of the supernatant) as described in point I.5.2.
Imunofluorescența (IF)
Alternatively, aliquots of 10 % of the medium constituting the primary culture shall be inoculated directly into a well with fresh cell culture (namely, well to well subcultivation).
Identificarea agenților patogeni listați VSHV și VNHI trebuie să fie efectuată prin infectarea celulelor în plăci cu 96 de godeuri „Black”, plăci clasice cu 24 de godeuri sau pe lamele în plăci cu 24 de godeuri.
The inoculation may be preceded by pre-incubation of the dilutions with the antiserum to IPN virus at appropriate dilution as described in point I.4.3.
La identificarea VNHI sau a VSHV sau a ambelor virusuri prin infectarea celulelor pe lamele, trebuie să se aplice următorul protocol:
The inoculated cultures shall then be incubated for 7 to 10 days at 15 °C and inspected in accordance with point I.5.4.
lamelele sunt însămânțate cu celule la o densitate care să asigure o confluență între 60 % și 90 % după 24 de ore de la cultivare.
If toxic CPE occurs within the first 3 days of incubation, subcultivation shall be performed at that stage, but the cells shall then be incubated for 7 days and sub cultivated again with further 7 days incubation.
Dacă este posibil se folosesc celule EPC în acest scop, datorită aderenței lor ridicate la suprafețele de sticlă, dar se pot folosi și alte linii celulare, de exemplu BF-2, RTG-2 sau FHM.
When toxic CPE develops after 3 days, the cells shall be passed once and incubated to achieve the total of 14 days from the primary inoculation.
Se inoculează 150 μl de supernatant al culturii celulare în două diluții diferite (1:10 și 1:1000) în două exemplare pe culturi monostrat cu vârsta de o zi și se incubează la 15 °C timp de 24 de ore;
There must be no evidence of toxicity in the final 7 days of incubation.
ulterior, se elimină mediul de cultură celulară și monostraturile de celule infectate sunt fixate cu 0,5 ml soluție apoasă de acetonă rece (80 % vol/vol).
If no CPE occurs, the test may be declared negative.
anticorpii monoclonali specifici (și anume MAb IP5B11 pentru identificarea VSHV și Hyb 136-3 pentru identificarea VNHI) sunt diluați în PBST 0,01 M, cu pH 7,2, la diluția recomandată de către furnizorul de anticorpi monoclonali; aceștia sunt adăugați apoi la monostraturile fixate, utilizându-se 50-100 μl pentru fiecare godeu, și plăcile se incubează timp de o oră la 37 °C într-o etuvă umedă;