natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Next, if the concentration-response is consistent with monotonicity, then the JonckheereTerpstra test is preferable to any of the above.
Aceste proceduri sunt efectuate după cum urmează:
If t-tests or Dunnett's test is used, there is no need for a ANOVA significance F-test in order to proceed.
a.
For details see the flow chart in Appendix 8.
Dacă blocul a fost plasat pe gheață, el este îndepărtat de pe gheață și înlocuit în mandrin microtomului.
Results should be reported in tables as concentration means ± SD for males, females, intersex and undifferentiated separately.
b.
Statistical significance for phenotypic females and phenotypic males should be highlighted.
În condițiile în care grosimea secțiunilor de pe microtom este fixată la 3 – 5 microni, mandrina este avansată prin rotirea roții microtomului.
Test chemical actual concentrations
Secțiunile sunt tăiate din bloc până când se obține o «panglică» care conțin cel puțin o secțiune acceptabilă care include gonade.
The actual chamber concentrations of the test chemical should be analysed in frequencies described in paragraph 34.
(În măsura în care este necesar în timpul secționării, blocul poate fi îndepărtat din mandrină, plasat pe gheață pentru a înmuia țesutul și apoi înlocuit în mandrină.)
Results should be reported in tables as mean concentration ± SD on replicate basis as well as on concentration basis with information on number of samples and with outliers from the mean treatment concentration ± 20 % highlighted.
c.
Examples can be found in the FSDT Phase 2 validation report (42).
Secțiunile plutesc la suprafața apei din baia de apă.
The test results should be interpreted with caution where measured test chemical concentrations in test solutions occur at levels near the detection limit of the analytical method.
Se încearcă să se obțină cel puțin o secțiune care nu conține nici încrețituri și nici bule de aer.
Relevant physical-chemical properties;
d.
chemical identification data including purity and analytical method for quantification of the test chemical.
O lamă de microscop este introdusă sub cea mai bună secțiune, care este ridicată din apă cu ajutorul lamei.
Test procedure used (e.g. flow-through semi-static/renewal);
Acest proces este denumit «montarea» secțiunii pe lamă.
test design including test concentrations, method of preparation of stock solutions (in an Annex), frequency of renewal (the solubilising agent and its concentration should be given, when used);
e.
The nominal test concentrations, the means of the measured values and their standard deviations in the test chambers and the method by which these were attained (the analytical method used should be presented in an Annex);Evidence that the measurements refer to the concentrations of the test chemical in true solution;
Pentru un set de pești sunt pregătite trei secțiuni.
Water quality within test chambers:
A doua și a treia secțiune sunt tăiate la intervale de 50 de microni de la prima secțiune.
Detailed information on feeding (e.g. type of food(s), source, amount given and frequency and analyses for contaminants (e.g. PCBs, PAHs and organochlorine pesticides) if relevant.
Dacă peștele nu este integrat cu gonadele sale în același nivel de secționare, se vor realiza mai multe secțiuni pentru a se asigura că de la fiecare pește sunt obținute cel puțin șase secțiuni care să includă gonadele.
Evidence that controls met the validity criteria:
f.
data on hatching rate should be presented in tables as percentage per replicate and per concentration.
Cu un pix de marcare a lamei, numărul blocului din care a fost produsă lama este înregistrat pe lamă.
Outliers from the acceptance criteria (in controls) should be highlighted.
g.
Survival should be presented as percentage per replicate and per concentration.
Lama este plasată pe un suport de colorare.
Outliers from the validity criteria (in controls) should be highlighted;
h.
Clear indication of the results obtained on the different endpoints observed:
Blocul este îndepărtat din mandrină și plasat cu fața în jos pentru depozitare.
embryo survival and hatching success;
Colorarea, aplicarea lamelelor și marcarea lamelor
external abnormalities;
Se colorează secțiunile pentru examenul histopatologic.
length and weight;
Se sigilează permanent țesturile montate și colorate.
VTG measurements (ng/g homogenate, ng/ml plasma or ng/mg liver);
Se identifică permanent secțiunile colorate într-un mod care să permită o trasabilitate completă.
gonadal histology, sex ratio, genetic sex data;
Colorare
incidence of any unusual reactions by the fish and any visible effects produced by the test chemical.
a.
The results should be presented as mean values ± standard deviation (SD) or standard error (SE).
Lamele se lasă să se usuce la aer peste noapte înainte de colorare.
Statistics should be reported as a minimum as NOEC and LOEC and confidence intervals.
b.
The statistical flow chart (Appendix 8) should be followed.
Secțiunile sunt colorate cu hematoxilină-eozină.
Sumpter, 1996, “Inhibition of testicular growth in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) exposed to estrogenic alkylphenolic chemicals”, Environmental Toxicology and Chemistry 15, pp. 194-202.
Aplicarea lamelelor
Sumpter, J.P. and S. Jobling, 1995, “Vitellogenesis As A Biomarker for Estrogenic Contamination of the Aquatic Environment”, Environmental Health Perspectives 103, pp. 173-178.
a.
Hutchinson, S. Maddix, and H. Trip (1999), “An in vivo testing system for endocrine disruptors in fish early life stages using induction of vitellogenin”, Environmental Toxicology and Chemistry 18, pp. 337-347.
Lamelele pot fi aplicate manual sau automat.
Pedersen, and P. Bjerregaard (2001a), “Development of an ELISA for vitellogenin in whole body homogenate of zebrafish (Danio rerio)”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 130, pp. 119-131.
b.
Andersen, L., P. Bjerregaard, and B. Korsgaard (2003), “Vitellogenin induction and brain aromatase activity in adult male and female zebrafish exposed to endocrine disrupters”, Fish Physiology and Biochemistry 28, pp. 319-321.
O lamă se scufundă în xilen sau în TissueClear, iar excesul de xilen/TissueClear este îndepărtat ușor de pe lamă.
Petersen (2003), “Gonad development and vitellogenin production in zebrafish (Danio rerio) exposed to ethinylestradiol and methyltestosterone”, Aquatic Toxicology 65, pp. 397-411.
c.
Tyler (2002), “Utility of a juvenile fathead minnow screening assay for detecting (anti-)estrogenic substances”, Environmental Toxicology and Chemistry 21, pp. 319-326.
Aproximativ 0,1 ml de mediu de montare se aplică aproape de capătul lamei, opus capătului congelat sau pe lamelă.
LeBlanc, and C.V.Sullivan (1999), “Fathead minnow (Pimephales promelas) vitellogenin: purification, characterization and quantitative immunoassay for the detection of estrogenic compounds”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 123, pp. 113-125.
Se aplică lamela pe lamă înclinând-o ușor.
Porcher (2002), “Development and validation of an enzyme-linked immunosorbent assay to measure vitellogenin in the zebrafish (Danio rerio)”, Environmental Toxicology and Chemistry 21, pp. 1699-1708.
Etichetarea
Hatano, H. Mizukami, M. Yamashita, R. Sakakibara, and E. Tamiya (2002), “Development and application of a monoclonal antibody-based sandwich ELISA for quantification of Japanese medaka (Oryzias latipes) vitellogenin”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 132, pp. 161-169.
a.
Bengtsson (2004), “The juvenile three-spined stickleback (Gasterosteus aculeatus L.) as a model organism for endocrine disruption — II — kidney hypertrophy, vitellogenin and spiggin induction”, Aquatic Toxicology 70, pp. 311-326.
Eticheta de pe fiecare lamă trebuie să includă următoarele informații:
Tatarazako, N., M. Koshio, H. Hori, M. Morita, and T. Iguchi (2004), “Validation of an enzyme-linked immunosorbent assay method for vitellogenin in the medaka”, Journal of Health Science 50, pp. 301-308.
i.
Eidem, J.K., H. Kleivdal, K. Kroll, N. Denslow, R. van Aerle, C. Tyler, G. Panter, T. Hutchinson, and A. Goksoyr (2006), “Development and validation of a direct homologous quantitative sandwich ELISA for fathead minnow (Pimephales promelas) vitellogenin.
Denumirea laboratorului
Ankley (2006), “Evaluation of a commercial kit for measuring vitellogenin in the fathead minnow (Pimephales promelas)”, Ecotoxicology and Environmental Safety 64, pp. 101-105.
Substanța chimică/grupul de tratament
Holbech, H., Petersen, G. I., Norman, A., Örn, S, Norrgren, L., and Bjerregaard, P (2001b), “Suitability of zebrafish as test organism for detection of endocrine disrupting chemicals.
Organigramă statistică pentru analiza vitelogeninei
Comparison of vitellogenin in plasma and whole body homogenate from zebrafish (Danio rerio) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)”, Nordic Council of Ministers, TemaNord 2001:597, pp. 48-51.
Testul regresiv Jonckheere
Porcher, and A. Goksoyr (2004), “Development of quantitative vitellogenin-ELISAs for fish test species used in endocrine disruptor screening”, Analytical and Bioanalytical Chemistry 378, pp. 621-633.
ANOVA ierarhizată normală
Orn, S., S. Yamani, and L. Norrgren (2006), “Comparison of vitellogenin induction, sex ratio, and gonad morphology between zebrafish and Japanese medaka after exposure to 17 alpha-ethinylestradiol and 17 beta-trenbolone”, Archives of Environmental Contamination and Toxicology 51, pp. 237-243.
Transformare de stabilizare a varianței?
Scholz, S. and N. Kluver (2009), “Effects of Endocrine Disrupters on Sexual, Gonadal Development in Fish, Sexual Development 3”, pp. 136-151.
Varianțe inegale
Fenske, M., G. Maack, C. Schafers, and H. Segner (2005), “An environmentally relevant concentration of estrogen induces arrest of male gonad development in zebrafish, Danio rerio”, Environmental Toxicology and Chemistry 24, pp. 1088-1098.
Mediile replicilor nu sunt normale sau omogene
Nagahama (2004), “Two DM domain genes, DMY and DMRT1, involved in testicular differentiation and development in the medaka, Oryzias latipes”, Developmental Dynamics 231, pp. 518-526.
Mediile replicilor normale și omogene
Shinomiya, A., H. Otake, K. Togashi, S. Hamaguchi, and M. Sakaizumi (2004), “Field survey of sex-reversals in the medaka, Oryzias latipes: genotypic sexing of wild populations”, Zoological Science 21, pp. 613-619.
Mediile replicilor distribuite normal
Flick (2007), “Collapse of a fish population after exposure to a synthetic estrogen”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, pp. 8897-8901.
Varianțe egale Nu Da Da
Kidd (2009), “Interspecies differences in biochemical, histopathological, and population responses in four wild fish species exposed to ethynylestradiol added to a whole lake”, Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 66, pp. 1920-1935.
Testul Dunn sau Mann-Whitney
Tyler (2006), “Development of chronic tests for endocrine active chemicals — Part 1.
Transformare de normalizare?
An extended fish early-life stage test for oestrogenic active chemicals in the fathead minnow (Pimephales promelas)”, Aquatic Toxicology 77, pp. 279-290.
Se determină dacă relația doză-răspuns este monotonă
Petersen, P. Jackson, K. Hylland, L. Norrgren, and P. Bjerregaard (2006), “Detection of endocrine disrupters: Evaluation of a Fish Sexual Development Test (FSDT)”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 144, pp. 57-66.
Se combină controalele, se rețin subgrupurile
Andersen, L., K. Kinnberg, H. Holbech, B. Korsgaard, and P. Bjerregaard (2004), “Evaluation of a 40 day assay for testing endocrine disrupters: Effects of an anti-estrogen and an aromatase inhibitor on sex ratio and vitellogenin concentrations in juvenile zebrafish (Danio rerio)”, Fish Physiology and Biochemistry 30, pp. 257-266.
Sunt prezentate atât controalele cu solvent, cât și cele fără solvent
Morthorst, J.E., H. Holbech, and P. Bjerregaard (2010), “Trenbolone causes irreversible masculinization of zebrafish at environmentally relevant concentrations”, Aquatic Toxicology 98, pp. 336-343.
Organigramă statistică pentru analiza raportului sexelor
Metcalf (2003), “Effects of the antiandrogens, vinclozolin and cyproterone acetate on gonadal development in the Japanese medaka (Oryzias latipes)”, Aquatic Toxicology 63, pp. 391-403.
Se aplică testul regresiv Jonckheere-Terpstra (+) pentru determinarea NOEC
Tyler (2004), “Successful detection of (anti-) androgenic and aromatase inhibitors in pre-spawning adult fathead minnows (Pimephales promelas) using easily measured endpoints of sexual development”, Aquatic Toxicology 70, pp. 11-21.
Testul U Dunn sau Mann-Whitney cu ajustare Bonferroni-Holm pentru determinarea NOEC
Petersen, and P. Bjerregaard (2007), “Effects of the fungicide prochloraz on the sexual development of zebrafish (Danio rerio)”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 145, pp. 165-170.
Se utilizează testul Dunnett dacă varianțele sunt omogene (*), în caz contrar, se utilizează testul Tamhane-Dunnett (T3) pentru determinarea NOEC
Chapter C.14 of this Annex, Fish Juvenile Growth Test.
Datele sunt distribuite normal?
Chapter C.4 of this Annex, Ready Biodegradability.
Datele corespund unei relații doză-răspuns monotone?
Chapter C.37 of this Annex, 21-Day Fish Assay:
(‡) Sau altă selecție de probe de control convenită
A Short Term Screening for Oestrogenic and Androgenic Activity, and Aromatase Inhibition.
După transformarea arcsin
Schäfers, C., Teigeler, M., Wenzel, A., Maack, G., Fenske, M., Segner, H (2007), “Concentration- and time-dependent effects of the synthetic estrogen, 17 alpha-ethinylestradiol, on reproductive capabilities of the zebrafish, Danio rerio” Journal of Toxicology and Environmental Health-Part A, 70, 9-10 pp 768-779.
(+) Cu mai puțin de 5 unități experimentale per tratament, trebuie utilizat testul J-T sau M-W exact, dacă este disponibil
Abbreviations and definitions
Se combină probele de control
Apical endpoint
Se exclude proba de control cu apă (‡)
Causing effect at population level
Se utilizează solvent?
Air saturation value
Apendicele 9
Biomarker
Orientări privind prelevarea de țesut pentru determinarea sexului genetic și pentru determinarea sexului genetic prin metoda PCR
Causing effect at individual level
Prelevarea de țesut, pregătirea și depozitarea înainte de determinarea sexului genetic prin metoda PCR la Oryzias latipes (pregătită de Laboratorul pentru organisme acvatice al Bayer CropScience AG)
A substance or a mixture.
Cu ajutorul unor foarfeci fine se taie înotătoarea anală sau dorsală a fiecărui pește individual și se plasează într-o eprubetă umplută cu 100μl de tampon de extracție 1 (pentru detalii privind prepararea tamponului, a se vedea mai jos).
Days post hatch
Foarfecele vor fi curățate după fiecare pește individual într-un pahar de laborator umplut cu H2O distilată și uscate cu un șervet de hârtie.
Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish
Țesuturile de la înotătoare vor fi omogenizate cu un pistil de teflon într-o microeprubetă pentru liza celulelor.
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
Pentru fiecare eprubetă va fi utilizat un nou pistil pentru a preveni orice contaminare.
Fish weight
Pistilurile vor fi plasate peste noapte în 0,5 M NaOH, clătite timp de 5 minute în H2O distilată și depozitate în etanol sau în apă sterilă după autoclavare, până la utilizare.
Fish wet weight (blotted dry)
De asemenea, este posibil ca țesutul de la înotătoare să fie depozitat fără ajutorul unui tampon de extracție 1 pe dioxid de carbon solid și apoi într-un congelator la o temperatură de – 80 °C pentru a preveni orice degenerare a ADN-ului.
FSDT
Dar extragerea se realizează mai bine dacă se extrage ADN-ul în același timp (pentru manipulare, a se vedea mai sus; eșantioanele trebuie decongelate pe gheață după depozitare – 80 °C înainte ca tamponul să fie vărsat eprubete).
Fish Sexual Development Test
După omogenizare, toate eprubetele vor fi plasate într-o baie de apă și se fierb timp de 15 minute la 100 °C.
Hypothalamic-pituitary-gonadal axis
Apoi, 100 μl din tampon de extracție 2 (pentru detalii privind prepararea tamponului, a se vedea mai jos) vor fi pipetați în fiecare eprubetă.
Intersex fish
Eșantioanele vor fi depozitate la temperatura camerei timp de 15 minute și, între timp, vor fi agitate ușor, din când în când, manual.
Fish with more than one oocyte in testis per 6 sections analysed or spermatogenetic cells in ovaries (yes/no)
Apoi, toate eprubetele vor fi plasate din nou în baia de apă și se fierb timp de încă 15 minute la 100 °C.
Wet weight of fish per volume of water
Până la o analiză suplimentară eprubetele vor fi congelate la – 20 °C.
Mode of action
Prepararea tamponului
Reverse Transcriptase Polymerase Chain-Reaction
Tamponul 1 pentru PCR:
Undifferentiated fish
500 mg N--lauroilsarcozina (de exemplu, Merck KGaA, Darmstadt, GE)
Fish with gonads exhibiting no discernible germ cells.
→ autoclavare
Vitellogenin
Tamponul 2 pentru PCR:
Experimental conditions for the FSDT (freshwater species)
Determinarea sexului genetic (prin metoda PCR) la Oryzias latipes (pregătită de Laboratorul pentru organisme acvatice al Bayer CropScience AG și de Universität Würzburg Biozentrum)
Japanese medaka (Oryzias latipes)
Eprubetele pregătite și congelate (descrise în secțiunea de mai sus) vor fi decongelată pe gheață.
Zebrafish (Danio rerio)
Apoi, ele vor fi centrifugate folosind o centrifugă Eppendorf (30 de secunde la viteză maximă, la temperatura camerei).
Three-spined Stickleback (Gasterostreus aculeatus)
Pentru PCR, se va folosi supernatantul clar separat de precipitat.
Flow-through or semi-static
Trebuie să se evite cu orice preț ca orice urmă de Chelex (localizată în precipitat) să fie transferată la reacția PCR, deoarece aceasta va interfera cu activitatea polimerazei «Taq».
Fluorescent bulbs (wide spectrum
Supernatantul va fi utilizat direct sau poate fi depozitat congelat (la – 20 °C) și redecongelat în mai multe cicluri fără un impact negativ asupra ADN-ului, pentru analize ulterioare.
Light intensity
Pregătirea «amestecului de reacție» (25 μl per eșantion):
10-20 μE/m2/s, 540-1080 lux, or 50-100 ft-c (ambient laboratory levels)
Volum
12-16 h light, 8-12 h dark
Concentrație finală
Minimum chamber size
Model de ADN
Individual chambers should contain a minimum of 7 l water volume
0,5μl – 2μl
Age of test organisms at start of exposure
10 x tampon PCR cu MgCl2
Newly fertilised eggs (Early blastula stage)
Nucleotide (fiecare dintre dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Newly fertilised eggs
Primer sens (10 μM) (a se vedea mai jos 3 – 5)
No. of eggs per treatment
Primer antisens (10 μM) (a se vedea mai jos 3 – 5)
Minimum 120
Apă (calitate PCR)
Minimum 3 (plus appropriate controls)
până la 25 μl
No. replicates per treatment
Polimerază Taq E
Minimum 4 (unless square root allocation to controls)
0,3 μl
Live Artemia, frozen adult brine shrimp, flake food, etc.
10 x tampon PCR cu MgCl2:
It is recommended to feed twice daily
670 mM Tris/HCl (pH 8,8 la 25 °C), 160 mM (NH4)2SO4, 25 mM MgCl2, 0,1 % Tween 20
Special fry food, live Artemia, frozen adult brine shrimp, flake food, etc.
Pentru fiecare PCR (a se vedea mai jos 3 – 5) este necesar primerul special ca o nouă combinație de «amestec de reacție» și cantitatea adecvată necesară pentru modelul de ADN pentru fiecare eșantion (a se vedea mai sus).
It is recommended to feed twice daily
Volumele respective vor fi transferat în eprubete noi, folosind pipete.
None unless DO concentration falls below 60 % saturation
Ulterior, toate eprubetele vor fi închise și agitate (aproximativ 10 secunde) și centrifugate (10 secunde la temperatura camerei).
None unless DO concentration falls below 70 % saturation
Acum respectivele programe PCR pot fi pornite.
Clean surface, well or reconstituted water
În plus, un control pozitiv (eșantion de ADN exemplar cu activitate cunoscută și rezultate clare) și un control negativ (1 μl H2O distilată) vor fi utilizate în fiecare program PCR.
Test chemical exposure duration
Prepararea gelului de agaroză (1 %) – Pe durata funcționării programelor PCR:
Hatching success, Survival Gross- morphology, VTG gonadal histology, Genetic sex, Sex ratio
Se dizolvă 3 g agaroză în 300 ml 1 × tampon TAE (1 % gel de agaroză).
Hatching success, Survival Gross- morphology, VTG gonadal histology, Sex ratio
Această soluție trebuie fiartă într-un cuptor cu microunde (aproximativ 2 – 3 minute).
Test acceptability criteria for pooled replicates of controls
Se transferă soluția fierbinte într-o cutie specială de turnare, care este așezată pe gheață.
Hatching success > 80 %
După aproximativ 20 de minute, gelul de agaroză este gata de utilizare.
Post hatch survival ≥ 70 %
Se depozitează gelul de agaroză în 1 × tampon TAE până la sfârșitul programelor PCR.
growth (Fish wet weight, blotted dry) > 150 mg
Programul PCR pentru actină:
growth (Fish wet weight, blotted dry) > 75 mg
Această reacție PCR are ca scop să demonstreze că ADN-ul din eșantion nu este deteriorat.
growth (Fish wet weight, blotted dry) > 120 mg
Primer special:
Length (standard length) > 20mm
«Mact1(sus/sens)» → TTC AAC AGC CCT GCC ATG TA
Length (standard length) > 14 mm
«Mact2(jos/antisens)» → GCA GCT CAT AGC TCT TCT CCA GGG AG
Length (standard length) > 20 mm
Program:
Sex ratio (% males or females) 30 %-70 %
Ciclu (35 de ori):
Chemical characteristics of an acceptable dilution water
Denaturare
CONCENTRATION
→ 45 sec la 95 °C
Particular matter
Atașarea primerului
From test method C.14/Guidance on test concentrations
→ 45 sec la 56 °C
Column (Number of concentrations between 100 and 10, or between 10 and 1) [1]
Elongare
A series of three (or more) successive concentrations may be chosen from a column.
→ 1 min la 68 °C
Mid-points between concentrations in column (x) are found in column (2x + 1).
15 min la 68 °C
The values listed can represent concentrations expressed as percentage per volume or weight (mg/l or μg/l).
Programul PCR pentru genele X și Y
Values can be multiplied or divided by any power of 10 as appropriate.
Probele cu ADN intact vor fi utilizate în acest program PCR pentru a detecta genele X și Y.
Column 1 might be used if there was considerable uncertainty on the toxicity level.
ADN-ul de la masculi trebuie să indice o bandă dublă, iar ADN-ul de la femele trebuie să indice o singură bandă (după colorare și electroforeză în gel).
Guidance for homogenisation of head & tail from juvenile zebrafish, fathead minnow, three spined stickleback and Japanese medaka
Pentru acest program trebuie inclus un control pozitiv pentru masculi (eșantion XY) și unul pentru femele (eșantion XX).
The purpose of this section is to describe the procedures that occur prior to the quantification of the VTG concentration.
«PG 17.5» (sus/sens) → CCG GGT GCC CAA GTG CTC CCG CTG
Other procedures that result in comparable VTG quantification can be used.
«PG 17.6» (jos/antisens) → GAT CGT CCC TCC ACA GAG AAG AGA
It is an option to determine the VTG concentration in blood plasma or liver instead of head/tail homogenate.
Ciclu (40 de ori):
The head and tail are cut of the fish in accordance with the test description.
→ 45 sec la 55 °C
All dissection instruments, and the cutting board should be rinsed and cleaned properly (e.g. with 96 % ethanol) between handling of each single fish to prevent “VTG pollution” from females or induced males to un-induced males.
→ 1 min 30 sec la 68 °C
When a homogenous mass is achieved an amount of 4-10 time the tissue weight of ice-cold homogenisation buffer is added (note the dilution).
Program PCR pentru gena Y drept «control» pentru X și program PCR pentru genele X și Y:
The samples are placed on ice until centrifugation at 4 °C at 50000 g for 30 min.
Acest program PCR verifică rezultatele «programului PCR pentru genele X și Y».
Use a pipette to dispense portions of 20 to 50 μl (note the amount) supernatant into at least two tubes by dipping the tip of the pipette below the fat layer on the surface and carefully sucking up the supernatant without fat- or pellet fractions.
«Eșantioanele-mascul» trebuie să prezinte o bandă, iar «eșantioanele-femelă» nu trebuie să prezintă nicio bandă (după colorare și electroforeză în gel).
Place on ice during use
«DMTYa (sus/sens)» → GGC CGG GTC CCC GGG TG
Homogenisation buffer:50 mM Tris-HCl pH 7,4;
«DMTYd (jos/antisesn)» → TTT GGG TGA ACT CAC ATG G