natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Weigh 2 g agarose in 100 ml 1 × TAE-buffer
Dacă se suspectează degradarea abiotică sau mecanisme de pierdere, precum hidroliza (problemă care apare numai în cazul unei analize specifice), volatilizarea sau absorbția, se recomandă efectuarea unui test de control fizico-chimic.
Heat in a microwave (ca.
Acesta poate fi realizat prin adăugarea de clorură de mercur (II) (HgCl2) [10] (50 – 100 mg/l) în vase cu substanțe testată pentru a opri activitatea microbiană.
2-3 min) to dissolve the agarose.
O scădere semnificativă a DOC sau a concentrației substanței specifice în testul de control fizico-chimic indică prezența unor mecanisme de îndepărtare abiotice.
Add 2 drops of ethidium bromide final concentration 0,5 μg/ml
(Dacă se utilizează clorură de mercur, trebuie să se acorde atenție interferențelor sau dezactivării catalizatorului în analiza DOC).
Transfer the hot solution into the gel casting equipment.
Numărul de flacoane
Allow the gel to harden
Într-un test tipic sunt folosite următoarele flacoane:
Gel-Electrophoresis:
Flacoanele 1 & 2 care conțin substanța testată (suspensia de testare);
Transferred the agarose gel to the electrophoresis equipment and submerge in 1 × TAE-buffer
Flacoanele 3 & 4 care conțin numai apă de mare (martor);
Load 20 μl of each sample to a separate well, adding a molecular weight marker (100 bp DNA ladder, Promega) to a spare well.
Flaconul 5 care conține substanța de referință (control procedură);
Electrophoresis is performed at 120 V for 30-45 minutes.
Flaconul 6 care conține substanța testată și de referință (control toxicitate) – opțional;
Visualisation of the amplification products
Flaconul 7 care conține substanța testată și agentul de sterilizare (control steril abiotic) – opțional.
If the ethidium bromide was incorporated in to the agarose gel as described above, the DNA products are visualised under a UV source.
Analiza DOC
Alternatively the agarose gel is stained by covering the gel in a dilute solution of ethidium bromide (0,5 μg/ml in water) for 30 minutes prior to visualisation.
Pe parcursul testului, eșantioanele se extrag la intervale adecvate pentru analiza DOC (apendicele 1).
Appendix 11
Eșantioanele se prelevează întotdeauna la începutul testului (ziua 0) și în ziua 60.
Guidance for artificial fertilisation procedure for the three-spined stickleback
Cel puțin cinci eșantioane în total sunt necesare pentru a descrie evoluția în timp a degradării.
The purpose of this section is to describe the procedures to obtain fertilised eggs from the three-spined stickleback in view of using them in the FSDT.
Nu se poate indica un calendar fix pentru eșantionare întrucât viteza de biodegradare variază.
Procedures
Se determină DOC în duplicat pentru fiecare eșantion.
Obtaining sperm from the males
Volumul necesar de eșantioane depinde de metoda de analiză (analiză specifică), de analizorul de carbon utilizat și de procedura (filtrarea cu membrană sau centrifugarea) selectată pentru tratamentul eșantionului înainte de determinarea carbonului (punctele 25 și 26).
A well-coloured male of the desired population is euthanised.
Înainte de eșantionare, trebuie să se asigure că mediul de testare este bine amestecat și că orice material aderent pe peretele flaconului este dizolvat sau suspendat.
The testes are dissected from each side of the fish.
Se filtrează cu membrană sau se centrifughează imediat după eșantionare.
The testes are generally heavily pigmented, rod shaped structures that are readily apparent at the lateral midline of the body.
Dacă este necesar, eșantioanele filtrate sau centrifugate se depozitează la 2 – 4 °C timp de 48 de ore sau sub – 18 °C pentru perioade de timp mai lungi (dacă se cunoaște faptul că substanța va rămâne neafectată, se acidifiază la pH 2 înainte de depozitare).
Use either of the following methods:
Filtrele cu membrană (0,2 – 0,45 μm) sunt adecvate dacă se asigură că acestea nu eliberează carbon și nu absorb substanța în etapa de filtrare, de exemplu, filtre cu membrană din policarbonat.
Using a pair of fine scissors, begin at the cloaca and make a 1-1,5 cm incision with a single snip angled at about 45 degrees.
Anumite filtre cu membrană sunt impregnate cu agenți tensioactivi pentru hidrofilizare și pot elibera cantități considerabile de carbon dizolvat.
Use a scalpel to make a small incision in the side of the fish slightly posterior to the pelvis and just ventral of the lateral plates.
Aceste filtre se pregătesc prin fierberea în apă deionizată pe parcursul a trei perioade consecutive, fiecare cu durata de o oră.
The testes are removed using fine forceps and placed into a petri dish.
După fierbere, filtrele se depozitează în apă deionizată.
Each testis is covered with 100 μl freshly made Hank's final solution.
Primii 20 ml de filtrat se elimină.
The testes are finely diced by using a razor blade or scalpel.
Centrifugarea eșantioanelor poate fi aleasă ca alternativă la filtrarea cu membrană.
This will release sperm and give the Hank's solution a milky appearance.
Se realizează centrifugarea la 40000 m.s– 2 (~ 4000 g) timp de 15 minute, de preferință într-o centrifugă frigorifică.
The fluid containing sperm is added into a tube, while trying not to include any pieces of testes tissue when pipetting.
Diferențierea dintre carbonul organic total (Total Organic Carbon – TOC) și DOC (TOC/DOC) prin centrifugare la concentrații foarte mici nu pare să funcționeze, deoarece fie nu au fost îndepărtate toate bacteriile, fie carbonul, ca parte a plasmei bacteriene, este redizolvat.
800 μl of Hank's final solution are added into the tube and mixed well.
La concentrații mai mari (> 10 mg C per litru), eroarea în urma centrifugării pare a fi comparativ mică.
If required, the male can be preserved by fixing in 100 % ethanol or other desired fixative.
Frecvența eșantionării
This is particularly important if the study is assigning parental origin of offsprings.
Dacă analizele sunt efectuate imediat după eșantionare, se evaluează următorul moment de eșantionare, luând în considerare rezultatul determinării analitice.
Although most of the stock solutions required can be made in advance, stock 5 and subsequently the final solution, should be made up fresh on the day of use.
Dacă eșantioanele sunt conservate (punctul 24) pentru o analiză ulterioară, trebuie prelevate mai multe eșantioane decât numărul minim de cinci.
Stock 1
Se analizează mai întâi ultimele eșantioane prelevate și, printr-o selecție pas cu pas «inversă» a eșantioanelor adecvate pentru analiză, este posibilă obținerea unei bune descrieri a curbei de biodegradare cu un număr relativ mic de determinări analitice.
8,00 g
În cazul în care până la sfârșitul testului nu există degradare, nu mai este necesară analiza de eșantioane suplimentare, și în această situație, strategia «inversă» poate asigura economisirea unei părți considerabile a costurilor analitice.
0,40 g
Dacă se observă un platou al curbei de degradare înainte de ziua 60, se încheie testul.
Distilled water (DW)
Dacă degradarea a început în mod evident înainte de ziua 60, dar nu a atins un platou, experimentul se prelungește pentru o perioadă suplimentară.
100 ml
Se înregistrează rezultatele analitice pe fișa de date anexată (apendicele 2) și se calculează valorile biodegradării pentru substanțele testată și de referință pe baza ecuației:
Stock 2
degradarea în procent de îndepărtare a DOC sau a substanței specifice în momentul t;
HPO4 (anhydrous)
concentrația inițială a DOC sau a substanței specifice în mediul de testare;
0,358 g
concentrația DOC sau a substanței specifice în mediul de testare la momentul t,
0,60 g
concentrația inițială a DOC sau a substanței specifice în martor,
Stock 3
concentrația DOC sau a substanței specifice în martor la momentul t;
0,72 g
Se indică degradarea sub formă de procent al îndepărtării DOC (degradare completă) sau a substanței specifice (degradare primară) la momentul t.
50 ml
Concentrațiile DOC se calculează cu rotunjire la cea mai apropiată zecime de mg/l și se rotunjesc valorile medii ale Dt la cel mai apropiat procent întreg.
Stock 4
Se ilustrează în mod grafic curba de degradare într-o diagramă astfel cum se indică în figura «Validitatea și interpretarea rezultatelor».
MgSO4.7H2O
Dacă există suficiente date, pornind de la această curbă, se calculează faza de latență tL) și timpul necesar pentru a obține îndepărtarea în proporție de 50 % după încheierea fazei de latență (t50).
1,23 g
Raportul privind testul trebuie să conțină următoarele informații:
Stock 5 (freshly prepared)
Substanța testată:
0,35 g
natura fizică și, dacă este relevant, proprietățile fizico-chimice;
10 ml
date de identificare.
If you already have some of the above salts but with different water content (i.e. 2H2O instead of anhydrous) you can still use it but first adjust weight based on molecular weight).
locul prelevării de eșantioane și descrierea sa;
For Hank's final solution combine in the following order:
situația poluării și a nutrienților (numărul coloniilor, azotat, amoniu, fosfat, dacă este cazul);
stock 1
caracteristicile eșantionului [data eșantionării, adâncimea, aspectul, temperatura, salinitatea, DOC (opțional), intervalul de timp dintre prelevare și utilizarea în test];
1,0 ml
metoda utilizată (dacă este cazul) pentru învechirea apei de mare;
stock 2
metoda utilizată pentru pretratarea (filtrare/sedimentare) apei de mare;
0,1 ml
metoda utilizată pentru determinarea DOC;
stock 3
metoda utilizată pentru analize specifice (opțional);
8,6 ml
metoda utilizată pentru determinarea numărului de heterotrofe în apa de mare (metoda de numărare pe placă sau o procedură alternativă) (opțional);
stock 4
alte metode (opțional) utilizate pentru caracterizarea apei de mare (măsurători ale ATP etc.).
stock 5
datele analitice raportate într-o fișă de date (apendicele 2);
Mix well before use.
evoluția testului de degradare este reprezentată grafic într-o diagramă indicând faza de latență (tL), panta și timpul (începând cu sfârșitul fazei de latență) de obținere a îndepărtării în proporție de 50 % (t50).
Fertilisation
Faza de latență poate fi estimată grafic astfel cum se indică în figura din secțiunea «Validitatea și interpretarea rezultatelor» sau considerată în mod convenabil ca timpul necesar pentru o degradare de 10 %;
Large, gravid females are identified from the desired population;
procentul de degradare măsurat după 60 de zile sau la sfârșitul testului.
females are ready for squeezing only when you can see eggs protruding from the cloaca.
Discutarea rezultatelor.
Ready females have the characteristic “head up” posture.
Validitatea și interpretarea rezultatelor
Gently run a finger or thumb down the side of the fish towards the tail to encourage the expulsion of an egg sack into a fresh petri dish.
Rezultatele obținute cu substanțele de referință, de exemplu benzoatul de sodiu, acetatul de sodiu sau anilina, trebuie să fie comparabile cu rezultatele obținute în testul interlaboratoare (3) (a se consulta secțiunea «Substanțe de referință», punctul 7).
Repeat on the other side and return the fish to its tank.
Dacă rezultatele obținute cu substanțele de referință sunt atipice, testul trebuie repetat folosind alt eșantion de apă de mare.
The eggs can be spread out (forming a monolayer) using a fine paintbrush.
Deși rezultatele testelor de inhibiție nu pot fi întotdeauna ușor de interpretat din cauza aportului de DOC al substanței testate, o reducere semnificativă a ratei de îndepărtare a DOC total, în raport cu cea controlului, este un semn pozitiv că există efecte toxice.
It is important to try and expose as many eggs as possible to the sperm so maximising the surface area of the eggs is helpful.
Ca urmare a concentrațiilor de testare relativ mari utilizate în raport cu cea mai mare parte a sistemelor naturale (și în consecință, a unui raport nefavorabil între concentrațiile substanțelor testate și a altor surse de carbon), metoda trebuie considerată ca test preliminar care poate fi utilizat pentru a indica dacă o substanță este sau nu ușor degradabilă.
Keep the eggs humid by laying damp tissue around them (it is important the eggs do not touch water directly as this can prematurely harden the chorion preventing fertilisation).
Prin urmare, un rezultat slab nu înseamnă în mod necesar că substanța testată nu este biodegradabilă în medii marine, ci indică faptul că pentru a stabili aceasta vor fi necesare studii suplimentare.
There is a large variation in the number of eggs each female can produce but as an average, about 150 eggs should be easily obtained from a single gravid female.
Teste neparametrice
of sperm in Hank's mixture is spread evenly over the whole surface of the eggs using the paintbrush.
Această metodă este o variantă de testare cu apă de mare prin testul cu flaconul închis (5) și a fost finalizată în urma unui test interlaboratoare organizat pentru Comisia Europeană (CE) de Institutul danez pentru calitatea apei (3).
The eggs will quickly harden and change colour (within a minute) once fertilisation has begun.
La fel ca în cazul metodei însoțitoare de testare cu apă de mare prin agitarea flaconului, rezultatele acestui test nu trebuie să fie considerate drept indicații ale ușurinței biodegradabilității, însă trebuie să fie utilizate în mod specific pentru a obține informații privind biodegradabilitatea substanțelor din mediile marine.
If the estimated number of eggs is more than 150, repeat the procedure.
O cantitate predeterminată de substanță testată este dizolvată în mediul de testare într-o concentrație, de obicei, de 2 – 10 mg de substanță testată per litru (pot fi utilizate una sau mai multe concentrații).
Similarly if the eggs don't harden within a minute add a bit more sperm.
Soluție este păstrată într-un flacon plin, închis, la întuneric, într-o baie cu temperatură constantă sau într-o incintă controlată la ± 1 °C în intervalul 15 – 20 °C.
Adding more sperm does not necessarily improve fertilisation rate.
În cazurile în care obiectivul studiului este acela de a simula condițiile de mediu, testele pot fi efectuate în afara acestui interval normal de temperatură, cu condiția efectuării ajutărilor adecvate pentru a controla temperatura.
The eggs and the sperm solution should be left to “interact” for at least 15 minutes and the fertilised eggs should be placed into the exposure aquaria within 1,5 hours post fertilisation.
Degradarea este urmată de analizele oxigenului pe parcursul unei perioade de 28 de zile.
The procedure is repeated using another female until the desired number of eggs is collected.
Testul interlaboratoare a indicat că dacă testul se prelungește peste perioada de 28 de zile, nu pot fi colectate informații utile, în cele mai multe dintre cazuri, din cauza interferențelor severe.
Spare few eggs from the last batch and fix them in 10 % acetic acid.
Valorile consumului biologic de oxigen (biological oxygen demand – BOD) pentru martor au fost excesiv de mari, probabil din cauza creșterii parietale, ca urmare a neagitării și a nitrificării.
Counting and distributing eggs in test aquaria
Așadar, durata recomandată este de 28 de zile, însă dacă valoarea BOD pentru martor se menține în limita a 30 % (punctele 15 și 40), perioada de testare poate fi prelungită.
Eggs should be evenly distributed between each treatment level to avoid genetic bias.
Este necesară formula empirică pentru a putea calcula consumul teoretic de oxigen (theoretical oxygen demand – ThOD) (a se vedea apendicele 3);
Each batch of fertilised eggs should be separated into equal size groups (as many as the treatment levels) by the use of a blunt instrument (i.e. wide-blade entomology forceps or use of an inoculation loop).
altfel, consumul chimic de oxigen (chemical oxygen demand – COD) al substanței trebuie să fie determinat pentru a servi ca valoare de referință.
If you aim for 4 replicates per treatment, with 20 eggs each then you need to distribute 80 eggs per exposure aquaria.
Utilizarea COD este mai puțin satisfăcătoare, deoarece unele substanțe nu sunt complet oxidate în testul COD.
It is advisable to add an extra 20 % (i.e. 96 eggs per treatment level) until you are confident that you obtain 100 % fertilisation rates.
Solubilitatea substanței trebuie să fie de minimum 2 mg/l, deși, în principiu, ar putea fi testate substanțe mai puțin solubile (de exemplu, folosind ultrasonicarea), la fel cum ar putea fi testate și substanțele volatile.
Stickleback eggs are very prone to fungal infections outside the father-guarded nest.
Informațiile privind toxicitatea substanței pentru bacterii, de exemplu astfel cum este măsurată în testele de respirație pe termen scurt (4), pot fi foarte utile atunci când sunt selectate concentrațiile de testare corespunzătoare și pot fi esențiale pentru interpretarea corectă a valorilor mici ale biodegradabilității.
In this respect, treatment of all eggs with methylene blue during the first 5 days of the test is critically important.
Cu toate acestea, astfel de informații nu sunt întotdeauna suficiente pentru interpretarea rezultatelor obținute în testarea biodegradării, iar procedura descrisă la punctul 27 este mai adecvată.
A stock solution of methylene blue is prepared at 1 mg/ml and added to the exposure aquaria to give a maximum final concentration of 2,125 mg/l.
Anilina, acetatul de sodiu sau benzoatul de sodiu (de exemplu) pot fi utilizate în acest scop.
Sticklebacks should not be exposed to methylene blue once hatched so the system should be free of methylene blue by day 6.
O degradare a acestor substanțe în proporție de cel puțin 60 % (din ThOD-ul lor) trebuie să intervină într-un interval de timp rezonabil de scurt, altfel se recomandă ca testul să fie repetat folosind alt eșantion de apă de mare.
The eggs are inspected daily and any dead or unfertilised eggs are recorded as such.
În testul interlaboratoare organizat de CE în urma căruia au fost prelevate eșantioane de apă de mare din diferite locații și în momente diferite pe parcursul anului, faza de latență (tL) și timpul necesar obținerii unei degradări de 50 % (t50), neincluzând faza de latență, au fost de 0 – 2 zile și, respectiv, de 1 ± 4 zile pentru benzoatul de sodiu.
The eggs should never be outside water until they hatch even for very brief periods.
Pentru anilină, valorile tLși t50 au fost de 0 – 7 zile și, respectiv, de 2 – 12 zile.
Hank's Buffered Salt Solution (HBSS):HBSS is needed to preserve the sperm whilst preparing for fertilisation.
REPRODUCTIBILITATE
C.42 BIODEGRADABILITY IN SEAWATER
Reproductibilitatea metodelor a fost stabilită prin testul interlaboratoare organizat de CE (3).
GENERAL INTRODUCTION
Echipament de laborator obișnuit și:
This test method is equivalent to OECD Test Guideline (TG) 306 (1992).
Pot fi utilizate flacoane BOD de 250 – 300 ml cu dop de sticlă sau flacoane cu gât îngust de 250 ml cu dop de sticlă;
When the original test methods were developed, it was not known to what extent results from the screening tests for ready biodegradability using freshwater, and sewage effluent or activated sludge as inoculum, could be applied to the marine environment.
Mai multe flacoane de 2-, 3- și 4- litri cu gradație pentru litri pentru pregătirea experimentului și pentru umplerea flacoanelor BOD;
Variable results on this point have been reported (e.g. (1)).
Baie de apă sau o cameră cu temperatură constantă pentru păstrarea flacoanelor la temperatură constantă (± 1 °C) ferite de lumină.
Many industrial waste waters, containing a variety of chemicals, reach the sea either by direct discharge or via estuaries and rivers in which the residence times are low compared with the period necessary for complete biodegradation of many of the chemicals present.
Echipament pentru analiza oxigenului dizolvat;
Because of the growing awareness of the need to protect the marine environment against increasing loads of chemicals and the need to estimate the probable concentration of chemicals in the sea, test methods for biodegradability in seawater have been developed.
Filtre cu membrană, 0,2 – 0,45 μm (opțional);
The methods described here use natural seawater both as the aqueous phase and as the source of micro-organisms.
Echipamente pentru analize specifice (opțional).
In an endeavour to conform with the methods for ready biodegradability in freshwater, the use of ultra-filtered and centrifuged seawater was investigated, as was the use of marine sediments as inocula.
Se prelevează un eșantion de apă de mare într-un recipient curățat cu atenție și se transportă la laborator, de preferință în termen de o zi sau două după prelevare.
These investigations were unsuccessful.
Pe durata transportului, temperatura eșantionului nu trebuie lăsată să depășească semnificativ temperatura care urmează să fie utilizată în test.
The test medium therefore is natural seawater pre-treated to remove coarse particles.
Locația de unde a fost prelevat eșantionul se identifică cu precizie și se descrie situația poluării și a nutrienților.
In order to assess ultimate biodegradability with the Shake Flask Method, relatively high concentrations of the test substance have to be used because of the poor sensitivity of the dissolved organic carbon (DOC) analytical method.
În special pentru apele de coastă sau poluate, această descriere trebuie să includă numărul coloniilor microbiene heterotrofe și determinarea concentrațiilor azotatului, amoniului și fosfatului dizolvați.
This in turn necessitates the addition to the seawater of mineral nutrients (N and P), the low concentrations of which would otherwise limit the removal of DOC.
aspectul eșantionului – tulbure etc.;
It is also necessary to add the nutrients in the Closed Bottle Method because of the concentration of the added test substance.
carbonul organic dizolvat (DOC);
Hence, the methods are not tests for ready biodegradability since no inoculum is added in addition to the micro-organisms already present in the seawater.
În cazul în care conținutul de DOC dintr-un eșantion se dovedește a fi mare sau în care se consideră că BOD pentru martor după 28 de zile va fi mai mare de 30 % din cel al substanțelor de referință, se recomandă ca apa de mare să fie învechită timp de aproximativ o săptămână înainte de utilizare.
Neither do the tests simulate the marine environment since nutrients are added and the concentration of test substance is very much higher than would be present in the sea.
Eșantionul se învechește prin depozitare în condiții aerobe la temperatura de testare, la întuneric sau la lumină difuză.
For these reasons the methods are proposed under a new subsection “Biodegradability in Seawater”.
În testul interlaboratoare (3), nu au fost observate diferențe între potențialele de degradare ale eșantioanelor de apă de mare învechite sau recent prelevate.
APPLICATION
Înainte de utilizare, apa de mare este tratată în prealabil pentru a îndepărta particulele mari, de exemplu prin filtrare cu ajutorul unui filtru din nailon sau al unui filtru de hârtie cu porozitate mare (fără membrană sau filtre GF-C) sau prin sedimentare și decantare.
The results of the tests, which would be applied because the pattern of use and disposal of the substance in question indicated a route to the sea, give a first impression of biodegradability in seawater.
Procedura utilizată se raportează.
If the result is positive (> 70 % DOC removal; > 60 % ThOD — theoretical oxygen demand), it may be concluded that there is a potential for biodegradation in the marine environment.
După învechire se pretratează, dacă se utilizează.
However, a negative result does not preclude such a potential but indicates that further study is necessary, for example, using as low a concentration of the test substance as possible.
Se prepară următoarele soluții stoc folosind reactivi de puritate analitică:
In either case, if a more definitive value for the rate or degree of biodegradation in seawater at a particular site is required, other more complex and sophisticated, and hence more costly, methods would have to be applied.
Se adaugă pentru fiecare litru de apă de mare pretratată 1 l din fiecare dintre soluțiile stoc sus-menționate.
For example, a simulation test could be applied using a concentration of test substance nearer to the likely environmental concentration.
Concentrația saturată a oxigenului dizolvat ca funcție a salinității și temperatura pot fi citite în nomograma anexată la această metodă de testare (apendicele 4).