natgillin/translations-raw huggingface dataset:
If interference occurs that is ≥ 20 % of basal hormone production for T and/or E2 as determined by hormone analysis, the Chemical Hormone Assay Interference Test (such as described in Appendix III to the validation report (4) section 5.0) should be run on all test chemical stock solution dilutions to identify the threshold dose at which significant (≥ 20 % ) interference occurs.
Înaintea testării unor substanțe chimice necunoscute, un laborator trebuie să demonstreze că poate să obțină și să mențină o cultură de celule adecvată și condițiile de testare necesare pentru desfășurarea cu succes a testului de competență a laboratorului.
If interference is less than 30 %, results may be corrected for the interference.
Întrucât performanța unei analize este direct legată de personalul de laborator care efectuează testul, procedurile ar trebui să fie parțial repetate în cazul în care apare o modificare a personalului de laborator.
If interference exceeds 30 %, the data are invalid and the data at these concentrations should be discarded.
Testul de competență se va efectua în aceleași condiții enumerate la punctele 38-40, prin expunerea celulelor la 7 concentrații gradate de inductori și inhibitori puternici, moderați și slabi, precum și o substanță negativă (a se vedea tabelul 2).
If significant interference of a test chemical with a hormone measurement system occurs at more than one non-cytotoxic concentration, a different hormone measurement system should be used.
În mod specific, substanțele chimice de testat includ inductorul puternic forskolin (CAS nr. 66575-29-9);
In order to avoid interference from contaminating chemicals it is recommended that hormones are extracted from the medium using suitable solvent, possible methods can be found in the validation report (4).
inhibitorul puternic procloraz (CAS nr. 67747-09-5);
Performance criteria for hormone measurement systems
inductorul moderat atrazină (CAS nr.
Parameter
1912-24-9);
Criterion
inhibitorul moderat aminoglutetimidă (CAS 125-84-8);
Measurement Method Sensitivity
inductorul slab (producție E2) și inhibitorul slab bisfenol A (producție T) (CAS nr. 80-05-7);
Limit of Quantification (LOQ)
și substanța chimică negativă gonadotropina corionică umană (HCG) (CAS nr. 9002-61-3) astfel cum se arată în tabelul 2.
Hormone Extraction Efficiency (only when extraction is needed)
Se aplică plăci separate pentru toate substanțele chimice, utilizând formatul specificat în tabelul 6.
The average recovery rates (based on triplicate measures) for the spiked amounts of hormone should not deviate more than 30 % from amount that was added.
O placă CC (tabelul 4, punctele 36-37) se include zilnic în testele pentru substanțele chimice de verificare.
Chemical Interference (only antibody based systems)
Substanțe chimice de testat și concentrațiile de expunere
No substantial (≥ 30 % of basal hormone production of the respective hormone) cross-reactivity with any of the hormones produced by the cells should occur [19] [20]
Substanțe chimice de verificare
Laboratory Proficiency Test
Concentrațiile de testare [μM]
As the performance of an assay is directly linked to the laboratory personnel conducting the assay, these procedures should be partly repeated if a change in laboratory personnel occurs.
Atrazina
This proficiency test will be conducted under the same conditions listed in paragraphs 38 through 40 by exposing cells to 7 increasing concentrations of strong, moderate and weak inducers and inhibitors as well as a negative chemical (see Table 2).
Aminoglutetimida
Specifically, chemicals to be tested include the strong inducer forskolin (CAS No 66575-29-9);
Bisfenol A
the strong inhibitor prochloraz (CAS No 67747-09-5);
Expunerea H295R la substanțele chimice de verificare trebuie realizată pe plăci de 24 de godeuri în timpul testului de competență a laboratorului.
the moderate inducer atrazine (CAS No 1912-24-9);
Stabilirea dozelor se realizează în μM pentru toate substanțele de testat.
the moderate inhibitor aminoglutethimide (CAS No 125-84-8);
Dozele se administrează în DMSO la 0,1 % v/v în fiecare godeu.
the weak inducer (E2 production) and weak inhibitor (T production) bisphenol A (CAS No 80-05-7);
Toate concentrațiile trebuie să fie testate în trei godeuri duplicate (tabelul 6).
and the negative chemical human chorionic gonadotropin (HCG) (CAS No 9002-61-3) as shown in Table 2.
Fiecare substanță chimică se testează pe plăci separate.
Separate plates are run for all chemicals using the format as shown in Table 6.
O placă CC este inclusă în fiecare zi de desfășurare.
One QC plate (Table 4, paragraphs 36-37) should be included with each daily run for the proficiency chemicals.
Analizele de viabilitate celulară și a hormonilor se desfășoară astfel cum se prevede la punctele 42-46.
Proficiency chemicals and exposure concentrations
Valoarea prag (CMEO) și decizia de clasificare ar trebui să fie raportate și comparate cu valorile din tabelul 3.
Proficiency chemical
Datele sunt considerate acceptabile în cazul în care acestea îndeplinesc CFEO și deciziile de clasificare din tabelul 3.
Test Concentrations [μM]
Valorile prag (CMEO) și deciziile de clasificare a substanțelor chimice de testat
Forskolin
CAS nr.
Atrazine
Decizie de clasificare
Aminoglutethimide
+ [22] (Inhibare)
Bisphenol A
+ (Inhibare)
Exposure of H295R to proficiency chemicals should be conducted in 24 well plates during the laboratory proficiency test.
+ (Inducere)
Dosing is in μM for all test chemical doses.
Negativ
All test concentrations should be tested in triplicate wells (Table 6).
Placa de control al calității (CC) este utilizată pentru a verifica performanța celulelor H295R în conformitate cu condițiile standardului de cultivare și pentru a stabili o bază de date istorice privind concentrațiile de hormoni în martorii pentru solvent, martorii pozitivi și martorii negativi, precum și alte măsuri de control al calității în timp.
Separate plates are run for each chemical.
performanța celulelor H295R trebuie să fie evaluată utilizând o placă CC pentru fiecare lot nou de la ATCC sau după utilizarea pentru prima dată a unei rezerve de celule congelată anterior, cu excepția cazului în care testul de competență a laboratorului (punctele 32-34) s-a efectuat pe lotul de celule respectiv;
One QC plate is included with each daily run.
o placă CC oferă o evaluare completă a condițiilor de testare (de exemplu, viabilitate celulară, martori pentru solvent, martori pozitivi și negativi, precum și variabilitate intra- și intertest) pentru testarea de substanțe chimice și trebuie să facă parte din fiecare ciclu de test.
Cell viability and hormone analyses should be conducted as provided in paragraphs 42 through 46.
Testul CC este efectuat utilizând o placă cu 24 de godeuri și urmează aceleași proceduri de incubare, dozare, viabilitate/citotoxicitate celulară, extracție hormonală și analiză hormonală descrise la punctele 38-46 pentru testarea substanțelor chimice.
The threshold value (lowest observed effect concentration, LOEC) and classification decision should be reported and compared with the values in Table 3.
Placa CC conține spații libere, martori pentru solvent și două concentrații ale unui inductor (forskolin, 1, 10 μM) și inhibitor cunoscut (procloraz, 0,1, 1 μM) al sintezei de E2 și T. În plus, în godeuri selectate se utilizează MeOH ca martor pozitiv pentru testul de viabilitate/citotoxicitate.
The data are considered acceptable if they meet the LOEC and decision classification in Table 3.
În tabelul 4 se găsește o descriere detaliată a aspectului plăcii.
Threshold values (LOECs) and decision classifications for Proficiency Chemicals
În tabelul 5 sunt enumerate criteriile care trebuie îndeplinite cu privire la placa CC.
n/a:
Trebuie să se obțină producția minimă bazală de hormoni pentru T și E2 atât în martorul pentru solvent, cât și în godeurile libere.
not applicable as no changes should occur after exposure to non-cytotoxic concentrations of negative control.
Tabelul 4
CAS No
Aspectul plăcii de control al calității pentru testarea competenței celulelor H295R neexpuse și a celulelor expuse la inhibitori (PRO = procloraz) și stimulatori cunoscuți (FOR = forskolin) ai producției de E2 și T. După încheierea experimentului de expunere și îndepărtarea mediului, se adaugă o soluție de metanol MeOH 70 % la toate godeurile pentru a servi ca martor pozitiv pentru citotoxicitate [a se vedea testul de citotoxicitate în apendicele III la raportul de validare (4)]
Decision Classification
spațiu liber [23]
+ [22] (Inhibition)
spațiu liber [23](+ MeOH) [24]
+ (Inhibition)
(+ MeOH) [24]
+ (Induction)
Tabelul 5
n/a
Criterii de performanță pentru placa de control al calității
Negative
Producția bazală de hormoni în martorul pentru solvent (MS)
Quality Control Plate
≥ 5 ori limita de cuantificare (LC)
The quality control (QC) plate is used to verify the performance of the H295R cells under standard culture conditions, and to establish a historical database for hormone concentrations in solvent controls, positive and negative controls, as well as other QC measures over time.
≥ 2,5 ori limita de cuantificare (LC)
H295R cell performance should be assessed using a QC plate for each new ATCC batch or after using a previously frozen stock of cells for the first time unless the laboratory proficiency test (paragraphs 32-34) has been run with that batch of cells.
Inducere (10 μM forskolin)
A QC plate provides a complete assessment of the assay conditions (e.g. cell viability, solvent controls, negative and positive controls, as well as intra- and inter-assay variability) when testing chemicals and should be part of each test run.
≥ 1,5 ori MS
The QC test is conducted in a 24-well plate and follows the same incubation, dosing, cell viability/cytotoxicity, hormone extraction and hormone analysis procedures described in paragraphs 38 through 46 for testing chemicals.
≥ 7,5 ori MS
The QC plate contains blanks, solvent controls, and two concentrations of a known inducer (forskolin, 1, 10 μM) and inhibitor (prochloraz, 0,1, 1 μM) of E2 and T synthesis.
Inhibare (1 μM procloraz)
In addition, MeOH is used in select wells as a positive control for the viability/cytotoxicity assay.
≤ 0,5 ori MS
A detailed description of the plate layout is provided in Table 4.
PROCEDURA DE EXPUNERE LA SUBSTANȚE CHIMICE
The criteria to be met on the QC plate are listed in Table 5.
Celulele preincubate sunt scoase din incubator (punctul 21) și se verifică la microscop pentru a se asigura că sunt în stare bună (fixare, morfologie) înainte de dozare.
The minimum basal hormone production for T and E2 should be met in both the solvent control and blank wells.
Celulele sunt plasate într-un dulap de biosecuritate, iar mediul de completare este eliminat și înlocuit cu un nou mediu de completare (1 ml/godeu).
Table 4 Quality control plate layout for testing performance of unexposed H295R cells and cells exposed to known inhibitors (PRO = prochloraz) and stimulators (FOR = forskolin) of E2 and T production.
DMSO este solventul preferat pentru prezenta metodă de testare.
After termination of the exposure experiment and removal of medium, a 70 % methanol solution will be added to all MeOH wells to serve as a positive control for cytotoxicity (see cytotoxicity assay in Appendix III to the validation report (4))
Cu toate acestea, în cazul în care există motive pentru a folosi alți solvenți, se prezintă justificarea științifică pentru aceasta.
Blank [23]
Celulele sunt expuse la substanța de testat prin adăugarea a 1 μl de soluție stoc corespunzătoare în DMSO [a se vedea apendicele II la raportul de validare (4)] per 1 ml de mediu de completare (volumul godeului).
Blank [23](+ MeOH) [24]
Aceasta conduce la o concentrație finală de 0,1 % DMSO în godeuri.
(+ MeOH) [24]
Pentru a asigura amestecarea adecvată, se preferă, în general, ca soluția stoc corespunzătoare de substanță de testat din DMSO să fie amestecată cu mediu de completare, astfel încât să se obțină concentrația finală dorită pentru fiecare doză, iar amestecul se adaugă în fiecare godeu imediat după îndepărtarea mediului vechi.
Table 5
Dacă se utilizează această opțiune, concentrația de DMSO (0,1 %) trebuie să fie consecventă în toate godeurile.
Performance criteria for the Quality Control Plate
Godeurile care conțin cele mai mari două concentrații sunt evaluate vizual, cu ajutorul unui microscop stereoscopic, pentru a verifica formarea de precipitate sau aspectul tulbure ca o indicație a solubilității incomplete a substanței de testat.
Basal Production of hormone in the solvent control (SC)
În cazul în care se observă astfel de condiții (formarea de precipitate, aspect tulbure), se examinează, de asemenea, godeurile care conțin următoarele concentrații mai mici (și așa mai departe), iar concentrațiile care nu sunt complet dizolvate în soluție urmează să fie excluse de la evaluare și analiză suplimentară.
≥ 5 times the LOQ
Placa este pusă din nou în incubator la 37 °C în atmosferă de aer cu sub 5 % CO2 timp de 48 ore.
≥ 2,5 times the LOQ
În tabelul 6 se prezintă aspectul plăcii substanței de testat.
Induction (10 μM forskolin)
Stocurile 1-7 indică plasarea de doze din ce în ce mai mari ale substanței de testat.
≥ 1,5 times the SC
Tabelul 6
≥ 7,5 times the SC
Schema dozării pentru expunerea celulelor H295R la substanțe chimice de testat într-o placă cu 24 de godeuri
Inhibition (1μM prochloraz)
Stoc 4
≤ 0,5 times the SC
Stoc 1
CHEMICAL EXPOSURE PROCEDURE
Stoc1
The pre-incubated cells are removed from the incubator (paragraph 21) and checked under a microscope to assure that they are in good condition (attachment, morphology) prior to dosing.
Stoc 5
The cells are placed in a bio-safety cabinet and the supplemented medium removed and replaced with new supplemented medium (1 ml/well).
Stoc 2
DMSO is the preferred solvent for this test method.
Stoc 6
However, if there are reasons for using other solvents the scientific rationale should be described.
Stoc 3
Cells are exposed to the test chemical by adding 1 μl of the appropriate stock solution in DMSO (see Appendix II to the validation report (4)) per 1 ml supplemented medium (well volume).
Stoc 7
This results in a final concentration of 0,1 % DMSO in the wells.
După 48 ore de expunere, plăcile sunt scoase din incubator și fiecare godeu este verificat la microscop pentru a determina starea celulelor (fixare, morfologie, grad de confluență) și semne de citotoxicitate.
To assure adequate mixing it is generally preferred that the appropriate stock solution of the test chemical in DMSO is mixed with supplemented medium to yield the desired final concentration for each dose, and the mixture added to each well immediately after removal of old medium.
Mediul din fiecare godeu este împărțit în două părți egale (aproximativ 490 μl fiecare) și este transferat în două flacoane separate etichetate corespunzător (de exemplu, o alicotă pentru a furniza un eșantion de rezervă pentru fiecare godeu).
If this option is used, the concentration of DMSO (0,1 %) should remain consistent among all wells.
Pentru a preveni uscarea celulelor, mediul este înlăturat câte un rând sau o coloană o dată și se înlocuiește cu mediul pentru testul de viabilitate/citotoxicitate celulară.
The wells containing the greatest two concentrations are visually assessed for formation of precipitates or cloudiness as an indication of incomplete solubility of the test chemical by using a stereo microscope.
Dacă viabilitatea/citotoxicitatea celulară nu se măsoară imediat, se adaugă 200 μl PBS cu Ca2+ și Mg2+ la fiecare godeu.
If such conditions (cloudiness, formation precipitates) are observed, wells containing the next lesser concentrations are examined as well (and so forth) and concentrations that did not completely go into solution are to be excluded from further evaluation and analysis.
Mediile sunt congelate la – 80 °C până la prelucrarea ulterioară pentru analizarea concentrațiilor de hormoni (a se vedea punctele 44-46).
The plate is returned to the incubator at 37 °C under a 5 % CO2 in air atmosphere for 48 hours.
În timp ce T și E2 în mediu păstrat la – 80 °C sunt, în general, stabili timp de cel puțin 3 de luni, stabilitatea hormonilor în timpul stocării trebuie documentată în fiecare laborator.
The test chemical plate layout is shown in Table 6.
Imediat după înlăturarea mediului, se determină viabilitatea/citotoxicitatea celulară pentru fiecare placă de expunere.
Stocks 1 -7 show placement of increasing doses of test chemical.
Determinarea viabilității celulare
Table 6
Un test de viabilitate/citotoxicitate a celulelor la alegere poate fi utilizat pentru a determina impactul potențial al substanței de testat asupra viabilității celulelor.
Dosing schematic for the exposure of H295R cells to test chemicals in a 24 well plate
Testul trebuie să poată furniza o măsură reală a procentului de celule viabile prezente într-un godeu sau trebuie să se demonstreze că aceasta este direct comparabilă cu (o funcție liniară din) testul celule vii/moarte (Live/Dead® Assay) [a se vedea apendicele III la raportul de validare (4)].
Stock 4
O altă analiză care s-a dovedit că funcționează la fel de bine este testul MTT [bromură de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil) tetrazoliu] (18).
Stock 1
Evaluarea viabilității celulare prin metodele de mai sus reprezintă o măsurare relativă care nu prezintă neapărat relații liniare cu numărul absolut de celule dintr-un godeu.
Stock1
Prin urmare, analistul ar trebui să efectueze o evaluare vizuală paralelă subiectivă a fiecărui godeu, se fac fotografii digitale ale MS și primele două cele mai mari concentrații necitotoxice trebuie să fie prelevate și arhivate pentru a permite evaluări ulterioare ale densității celulare reale, dacă acest lucru este necesar.
Stock 5
În cazul în care, prin inspecție vizuală sau astfel cum demonstrează testul de viabilitate/citotoxicitate, se pare că există o creștere a numărului de celule, creșterea aparentă trebuie să fie verificată.
Stock 2
În cazul în care o creștere a numărului de celule este confirmată, acest lucru trebuie specificat în raportul de testare.
Stock 6
Viabilitatea celulară se exprimă în raport cu răspunsul mediu în MS, care se consideră a fi 100 % celule viabile, și se calculează în funcție de testul de viabilitate/citotoxicitate celulară care este utilizat.
Stock 3
Pentru MTT, se poate utiliza următoarea formulă:
Stock 7
% celule viabile = (răspuns în godeu – răspunsul mediu în godeuri tratate cu MeOH [= 100 % moarte]) ÷ (răspunsul mediu în godeuri MS – răspunsul mediu în godeuri tratate cu MeOH [= 100 % moarte])
After 48 hours the exposure plates are removed from the incubator and every well is checked under the microscope for cell condition (attachment, morphology, degree of confluence) and signs of cytotoxicity.
Godeurile cu viabilitate mai mică de 80 % în raport cu viabilitatea medie în MS (= 100 %) nu ar trebui să fie incluse în analiza finală a datelor.
The medium from each well is split into two equal amounts (approximately 490 μl each) and transferred to two separate vials appropriately labelled (i.e. one aliquot to provide a spare sample for each well).
Inhibarea steroidogenezei care se produce în prezența unui nivel de aproape 20 % citotoxicitate trebuie evaluată cu atenție pentru a se asigura că nu citotoxicitatea este cauza inhibării.
To prevent cells from drying out, medium is removed a row or column at a time and replaced with the medium for the cell viability/cytotoxicity assay.
Analiza hormonilor
If cell viability/cytotoxicity is not to be measured immediately, 200 μl PBS with Ca2+ and Mg2+ is added to each well.
Fiecare laborator poate utiliza un sistem de măsurare a hormonilor la alegerea sa pentru analiza T și E2.
The media are frozen at – 80 °C until further processing to analyse hormone concentrations (see paragraphs 44-46).
Se pot utiliza părți alicote de rezervă de mediu de la fiecare grup de tratament pentru a prepara diluții pentru a aduce concentrația în partea liniară a curbei standard.
While T and E2 in medium kept at – 80 °C are generally stable for at least 3 months, hormone stability during storage should be documented within each laboratory.
Astfel cum s-a menționat la punctul 29, fiecare laborator trebuie să demonstreze conformitatea sistemului său de măsurare hormonală (de exemplu, ELISA, RIA, LC-MS, LC-MS/MS) cu criteriile CC prin analizarea mediului de completare la care se adaugă un martor hormon intern înainte de a efectua testele CC sau testarea substanțelor chimice.
Immediately after removing the medium, cell viability/cytotoxicity is determined for each exposure plate.
Pentru a se asigura că niciuna dintre componentele sistemului de testare nu interferează cu măsurarea hormonilor, ar putea fi necesar ca hormonii să fie extrași din medii înainte de măsurarea acestora (a se vedea punctul 30 pentru condițiile în care o extracție este sau nu necesară).
Cell Viability Determination
Se recomandă să se efectueze extracția urmând procedurile specificate în apendicele III la raportul de validare (4).
A cell viability/cytotoxicity assay of choice can be used to determine the potential impact of the test chemical on cell viability.
În cazul în care pentru măsurarea producției de hormoni se utilizează o trusă de testare comercială, analiza hormonală trebuie efectuată astfel cum se precizează în manualele furnizate de producătorul trusei de testare.
The assay should be able to provide a true measure of the percentage of viable cells present in a well, or it should be demonstrated that it is directly comparable to (a linear function of) the Live/Dead® Assay (see Appendix III to the validation report (4)).
Majoritatea producătorilor au o procedură unică prin care se efectuează analizele hormonale.
An alternative assay that has been shown to work equally well is the MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] test (18).
Diluțiile de probe trebuie să fie ajustate astfel încât concentrațiile preconizate de hormoni la martorii pentru solvent să se afle în centrul intervalului liniar al curbei standard a testului individual [apendicele III la raportul de validare (4)].
The assessment of cell viability using the above methods is a relative measurement that does not necessarily exhibit linear relationships with the absolute number of cells in a well.
Valorile care depășesc porțiunea liniară a curbei standard trebuie să fie respinse.
Therefore, a subjective parallel visual assessment of each well by the analyst should be conducted, and digital pictures of the SCs and the two greatest non-cytotoxic concentrations are to be taken and archived to enable later assessment of true cell density if this should be required.
Concentrațiile hormonale finale sunt calculate după cum urmează:
If by visual inspection or as demonstrated by the viability/cytotoxicity assay there appears to be an increase in cell number, the apparent increase needs to be verified.
Exemplu:
If an increase in cell numbers is verified, this should be stated in the test report.
Extrase:
Cell viability will be expressed relative to the average response in the SCs, which is considered 100 % viable cells, and is calculated as appropriate for the cell viability/cytotoxicity assay that is used.
450 μl mediu
For the MTT assay, the following formula may be used:
Reconstituite în:
% viable cells = (response in well – average response in MeOH treated [= 100 % dead] wells) ÷ (average response in SC wells – average response in MeOH treated [= 100 % dead] wells)
250 μl tampon de analiză
Wells with viability lower than 80 %, relative to the average viability in the SCs (= 100 % viability), should not be included in the final data analysis.
Diluare în test:
Inhibition of steroidogenesis occurring in the presence of almost 20 % cytotoxicity should be carefully evaluated to ensure that cytotoxicity is not the cause for the inhibition.
10:1 (pentru a aduce eșantionul la intervalul liniar al curbei standard)
Hormone Analysis
Concentrația de hormoni în test:
Each laboratory can use a hormone measurement system of its choice for the analysis of T and E2.
150 pg/ml (adaptat deja la concentrația per ml de probă testată)
Spare aliquots of medium from each treatment group may be used to prepare dilutions to bring the concentration within the linear part of the standard curve.
Redresare: