natgillin/translations-raw huggingface dataset:
B.57 H295R STEROIDOGENESIS ASSAY
Un protocol detaliat, inclusiv instrucțiuni privind modul de elaborare a soluțiilor, cultivarea celulelor și efectuarea diferitelor aspecte ale testului, este disponibil ca apendicele I-III la documentul OCDE «Validarea interlaboratoare a testului de steroidogeneză H295R pentru a identifica modulatori ai producției de testosteron și estradiol» (4).
This test method is equivalent to OECD Test Guideline (TG) 456 (2011).
Cinci enzime diferite care catalizează șase reacții distincte sunt implicate în biosinteza hormonilor steroizi sexuali.
The OECD initiated a high-priority activity in 1998 to revise existing, and to develop new, test guidelines for the screening and testing of potential endocrine disrupting chemicals.
Conversia enzimatică a colesterolului la pregnenolon prin enzima (CYP11A) de disociere laterală a colesterolului citocrom P450 (CYP) constituie un prim pas într-o serie de reacții biochimice care se încheie cu sinteza de steroizi ca produse finite.
The 2002 OECD Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals comprises five levels, each level corresponding to a different level of biological complexity (1).
În funcție de ordinea următoarelor două reacții, mecanismul steroidogenic se împarte în două:
The in vitro H295R Steroidogenesis Assay (H295R) described in this test method utilises a human adreno-carcinoma cell line (NCI-H295R cells) and constitutes a level 2 “in vitro assay, providing mechanistic data”, to be used for screening and prioritisation purposes.
mecanismul Δ5-hidroxisteroid și mecanismul Δ4ketosteroid, care converg în producția de androstendion (figura 1).
Development and standardisation of the assay as a screen for chemical effects on steroidogenesis, specifically the production of 17β-oestradiol (E2) and testosterone (T), was carried out in a multi–step process.
Androstenedionul este convertit în testosteron (T) de către dehidrogenaza 17βhidroxisteroidului (17β-HDS).
The H295R assay has been optimised and validated (2) (3) (4) (5).
Testosteronul este atât un produs intermediar, cât și un hormon produs final.
The objective of the H295R Steroidogenesis Assay is to detect chemicals that affect production of E2 and T. The H295R assay is intended to identify xenobiotics that have as their target site(s) the endogenous components that comprise the intracellular biochemical pathway beginning with the sequence of reactions from cholesterol to the production of E2 and/or T. The H295R assay is not intended to identify chemicals that affect steroidogenesis due to effects on the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis.
La masculi, T poate fi convertit la dihidrotestosteron (DHT) de 5α-reductaza, care se găsește în membranele celulare, anvelopa nucleară și reticulul endoplasmic al țesuturilor vizate de acțiunile androgenice, cum ar fi prostata și veziculele seminale.
The goal of the assay is to provide a YES/NO answer with regard to the potential of a chemical to induce or inhibit the production of T and E2;
DHT este semnificativ mai puternic ca androgen decât T și este, de asemenea, considerat un hormon produs finit.
however, quantitative results may be obtained in some cases (see paragraphs 53 and 54).
Testul H295R nu măsoară DHT (a se vedea punctul 10).
The results of the assay are expressed as relative changes in hormone production compared with the solvent controls (SCs).
Enzima din mecanismul steroidogenic care transformă substanțele chimice androgenice în substanțe chimice estrogenice chimice este aromataza (CYP19).
The assay does not aim to provide specific mechanistic information concerning the interaction of the test chemical with the endocrine system.
CYP19 transformă T în 17β-estradiol (E2) și androstenedion în estron.
Research has been conducted using the cell line to identify effects on specific enzymes and intermediate hormones such as progesterone (2).
E2 și T sunt considerați hormoni produși finali pe filieră steroidogenică.
Definitions and abbreviations used in this test method are described in the Appendix.
Specificitatea activității liazei diferă în cazul CYP17 pentru substraturile intermediare între specii.
A detailed protocol including instructions on how to prepare solutions, cultivate cells and perform various aspects of the test is available as Appendix I-III to the OECD document “Multi-Laboratory Validation of the H295R Steroidogenesis Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol Production” (4).
La om, enzima favorizează substraturi ale mecanismului Δ5-hidroxisteroid (pregnenolon), în timp ce substraturile din mecanismul Δ4-ketosteroid (progesteron) sunt favorizate la șobolan (19).
Five different enzymes catalysing six different reactions are involved in sex steroid hormone biosynthesis.
Astfel de diferențe în activitatea liazei CYP17 pot explica unele diferențe dependente de specii, ca răspuns la substanțele chimice care modifică steroidogeneza in vivo (6).
Enzymatic conversion of cholesterol to pregnenolone by the cytochrome P450 (CYP) cholesterol side-chain cleavage enzyme (CYP11A) constitutes the initial step in a series of biochemical reactions that culminate in synthesis of steroid end-products.
Celulele H295 s-au dovedit a reflecta mai îndeaproape expresia enzimei adrenale adulte umane și modelul de producere a steroizilor (20), dar se știe că acestea exprimă enzime atât pentru mecanismul Δ5hidroxisteroid, cât și pentru mecanismul Δ4-ketosteroid pentru sinteza de androgeni (7) (11) (13) (15).
Depending upon the order of the next two reactions, the steroidogenic pathway splits into two paths, the Δ5-hydroxysteroid pathway and Δ4-ketosteroid pathway, which converge in the production of androstenedione (Figure 1).
OCDE407 îmbunătățit (parametri bazați pe mecanisme endocrine) — Test pe masculi și female aflate la pubertate
Androstenedione is converted to testosterone (T) by 17β-hydroxysteroid dehydrogenase (17β-HSD).
Enzimele sunt cu caractere italice, hormonii sunt cu caractere îngroșate și săgețile indică direcția de sinteză.
Testosterone is both an intermediate and end-hormone product.
Fundalul gri indică mecanisme/produse corticosteroide.
In the male, T can be converted to dihydrotestosterone (DHT) by 5α-reductase, which is found in the cellular membranes, nuclear envelope, and endoplasmic reticulum of target tissues of androgenic action such as prostate and seminal vesicles.
Mecanismele/produsele steroide sexuale sunt încercuite.
DHT is significantly more potent as an androgen than T and is also considered an end-product hormone.
CYP = citocrom P450;
The H295R assay does not measure DHT (see paragraph 10).
HSD = dehidrogenaza hidroxisteroidului;
The enzyme in the steroidogenic pathway which converts androgenic chemicals into oestrogenic chemicals is aromatase (CYP19).
DHEA = dehidroepiandrosteron.
CYP19 converts T into 17β-oestradiol (E2) and androstenedione into oestrone.
Linia de celule adenocarcinom umane H295R este un model in vitro util pentru investigarea efectelor asupra sintezei de hormoni steroizi (2) (7) (8) (9) (10).
E2 and T are considered end-product hormones of the steroidogenic pathway.
Linia de celule H295R exprimă gene care codifică pentru toate enzimele cheie pentru steroidogeneză precizate mai sus (11) (15) (figura 1).
The specificity of the lyase activity of CYP17 differs for the intermediate substrates among species.
Aceasta este o proprietate unică, întrucât expresia in vivo a acestor gene este țesutul și este specifică etapei de dezvoltare, iar, de regulă, nu există un singur țesut sau o etapă de dezvoltare care să exprime toate genele implicate în steroidogeneză (2).
In the human, the enzyme favours substrates of the Δ5-hydroxysteroid pathway (pregnenolone), whereas substrates in the Δ4-ketosteroid pathway (progesterone) are favoured in the rat (19).
Celulele H295R au caracteristicile fiziologice ale celulelor adrenale fetale umane nediferențiate zonal (11).
Such differences in the CYP17 lyase activity may explain some species-dependent differences in response to chemicals that alter steroidogenesis in vivo (6).
Celulele reprezintă un sistem unic in vitro în care acestea au capacitatea de a produce toți hormonii steroizi găsiți în cortexul adrenal și gonade la adult, permițând testarea efectelor asupra sintezei de corticosteroizi și producerea de hormoni steroizi sexuali, cum ar fi androgeni și estrogeni, deși testul a fost validat doar pentru a detecta T și E2.
The H295 cells have been shown to most closely reflect human adult adrenal enzyme expression and steroid production pattern (20), but are known to express enzymes for both the Δ5-hydroxysteroid and Δ4-ketosteroid pathways for androgen synthesis (7) (11) (13) (15).
Modificările înregistrate de sistemul de testare sub formă de alterare la nivelul producerii de T și E2 pot fi rezultatul unei multitudini de interacțiuni diferite ale substanțelor chimice de testat cu funcțiile steroidogene care sunt exprimate de celulele H295R.
Steroidogenic pathway in H295R cells.
Acestea includ modularea expresiei, a sintezei sau a funcției enzimelor implicate în producerea, transformarea sau eliminarea hormonilor steroizi (12) (13) (14).
Enzymes are in italics, hormones are bolded and arrows indicate the direction of synthesis.
Inhibarea producției de hormoni se poate datora legării concomitente de o enzimă din mecanism, impactului asupra unor cofactori precum NADPH (nicotinamida adenin dinucleotid fosfat) și AMP ciclic (adenozin monofosfat ciclic) și/sau creșterii metabolismului steroizilor sau eliminării expresiei genice a anumitor enzime implicate în steroidogeneză.
Gray background indicates corticosteroid pathways/products.
În timp ce inhibarea poate fi o funcție a proceselor implicate direct sau indirect de producția de hormoni, inducția este, de regulă, de natură indirectă, de exemplu, prin afectarea unor cofactori, cum ar fi NADPH și AMP ciclic (cum este cazul forskolinului), scăderea metabolismului steroizilor (13) și reglarea în sens ascendent a expresiei steroidogenice a genei.
Sex steroid pathways/products are circled.
Testul H295R are mai multe avantaje:
CYP = cytochrome P450;
permite detectarea creșterilor și a scăderilor la nivelul producției de T și E2;
HSD = hydroxysteroid dehydrogenase;
permite evaluare directă a impactului potențial al unei substanțe chimice asupra viabilității/citotoxicității celulare.
DHEA = dehydroepiandrosterone.
Aceasta este o caracteristică importantă, deoarece permite discriminarea între efectele determinate de citotoxicitate de cele determinate de interacțiunea directă a substanțelor chimice cu mecanismele steroidogenice, ceea ce nu este posibil în sisteme de explanturi de țesut care constau în mai multe tipuri de celule de diferite niveluri de sensibilitate și funcționalități;
The human H295R adreno-carcinoma cell line is a useful in vitro model for the investigation of effects on steroid hormone synthesis (2) (7) (8) (9) (10).
nu implică utilizarea animalelor;
The H295R cell line expresses genes that encode for all the key enzymes for steroidogenesis noted above (11) (15) (Figure 1).
linia de celule H295R este disponibilă în comerț.
This is a unique property because in vivo expression of these genes is tissue and developmental stage-specific with typically no one tissue or one developmental stage expressing all of the genes involved in steroidogenesis (2).
Principalele limitări ale testului sunt următoarele:
H295R cells have physiological characteristics of zonally undifferentiated human foetal adrenal cells (11).
capacitatea sa metabolică este necunoscută, dar probabil destul de limitată;
The cells represent a unique in vitro system in that they have the ability to produce all of the steroid hormones found in the adult adrenal cortex and the gonads, allowing testing for effects on both corticosteroid synthesis and the production of sex steroid hormones such as androgens and oestrogens, although the assay was validated only to detect T and E2.
prin urmare, substanțele chimice care trebuie să fie activate metabolic vor fi probabil ratate în cadrul testului;
Changes recorded by the test system in the form of alteration in the production of T and E2 can be the result of a multitude of different interactions of test chemicals with steroidogenic functions that are expressed by the H295R cells.
fiind derivat din țesut adrenal, H295R posedă enzimele capabile să producă gluco- și mineralocorticoizi, precum și hormoni sexuali;
These include modulation of the expression, synthesis or function of enzymes involved in the production, transformation, or elimination of steroid hormones (12) (13) (14).
astfel, efectele asupra producției de gluco- și mineralocorticoizi ar putea influența nivelurile de T și E2 observate în test;
Inhibition of hormone production can be due to direct competitive binding to an enzyme in the pathway, impact on co-factors such as NADPH (Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate) and cAMP (cyclic Adenosine Monophosphate), and/or increase in steroid metabolism or suppression of gene expression of certain enzymes in the steroidogenesis pathway.
nu măsoară DHT și, prin urmare, nu este de așteptat să detecteze substanțele chimice care împiedică 5α-reductaza, caz în care poate fi utilizat testul Hershberger (16);
While inhibition can be a function of both direct or indirect processes involved with hormone production, induction is typically of an indirect nature, such as by affecting co-factors such as NADPH and cAMP (as in the case of forskolin), decreasing steroid metabolism (13), and or up-regulating steroidogenic gene expression.
testul H295R nu va identifica substanțele chimice care interferează cu steroidogeneza prin afectarea axului hipotalamic-pituitar-gonadal (HPG), întrucât acest aspect poate fi studiat doar la animale intacte.
The H295R assay has several advantages:
Scopul testului este de a detecta substanțele chimice care afectează producția de T și E2.
It allows for the detection of both increases and decreases in the production of both T and E2;
T este, de asemenea, un intermediar în mecanismul de producere a E2.
It permits the direct assessment of the potential impact of a chemical on cell viability/cytotoxicity.
Testul poate detecta substanțele chimice care, de regulă, inhibă sau induc enzimele implicate în steroidogeneză.
This is an important feature as it allows for the discrimination between effects that are due to cytotoxicity from those due to the direct interaction of chemicals with steroidogenic pathways, which is not possible in tissue explants systems that consist of multiple cell types of varying sensitivities and functionalities;
Testul se desfășoară în mod normal în condiții standard de cultură a celulelor pe plăci de cultură cu 24 de godeuri.
It does not require the use of animals;
Alternativ, se pot utiliza alte dimensiuni de plăci pentru efectuarea testului;
The H295R cell line is commercially available.
cu toate acestea, condițiile de semănare și experimentale trebuie ajustate în consecință pentru a menține aderarea la criteriile de performanță.
The principle limitations of the assay are as follows:
După o perioadă de aclimatizare de 24 de ore în plăci cu godeuri multiple, celulele se expun timp de 48 de ore la șapte concentrații ale substanței chimice de testat în cel puțin trei exemplare.
Its metabolic capability is unknown but probably quite limited;
Solventul, precum și un inhibitor și un inductor de producție de hormoni cunoscuți sunt utilizați la o concentrație fixă, ca martori negativi și pozitivi.
therefore, chemicals that need to be metabolically activated will probably be missed in this assay.
La sfârșitul perioadei de expunere, mediul este îndepărtat din fiecare godeu.
Being derived from adrenal tissue, the H295R possesses the enzymes capable of producing the gluco-, and mineral-corticoids as well as the sex hormones;
Viabilitatea celulară din fiecare godeu este analizată imediat după îndepărtarea mediului.
therefore, effects on the production of gluco-, and mineral corticoids could influence the levels of T and E2 observed in the assay.
Concentrațiile de hormoni din mediu se pot măsura utilizând diverse metode, inclusiv truse de măsurare a nivelurilor de hormoni disponibile în comerț și/sau tehnici instrumentale precum cromatografia lichidă cuplată cu spectrometrie de masă (LC-MS).
It does not measure DHT and, therefore, would not be expected to detect chemicals that inhibit 5α-reductase in which case the Hershberger assay (16) can be used.
Datele sunt exprimate ca multiplu de schimbare în raport cu martorul pentru solvent și concentrația cea mai mică cu efect observat (CMEO).
The H295R assay will not detect chemicals that interfere with steroidogenesis by affecting the hypothalamic-pituitary-gonadal axis (HPG) axis as this can only be studied in intact animals.
În cazul în care testul este negativ, cea mai mare concentrație testată este raportată ca fiind concentrația fără efect observat (CFEO).
The purpose of the assay is the detection of chemicals that affect T and E2 production.
Concluziile cu privire la capacitatea unei substanțe chimice de a afecta steroidogeneza trebuie să se bazeze pe cel puțin două serii de teste independente.
T is also an intermediate in the pathway to produce E2.
Primul test aplicat poate funcționa ca un test de identificare a intervalului cu ajustare ulterioară a concentrațiilor pentru testele 2 și 3, dacă este cazul, în cazul în care există probleme de solubilitate sau de citotoxicitate sau activitatea substanței chimice pare a fi la sfârșitul intervalului de concentrații testate.
The assay can detect chemicals that typically inhibit or induce the enzymes of the steroidogenesis pathway.
PROCEDURA DE CULTIVARE
The assay is usually performed under standard cell culture conditions in 24-well culture plates.
Linie de celule
Alternatively, other plate sizes can be used for conducting the assay;
Celulele NCI-H295R sunt disponibile comercial de la American Type Culture Collections (ATCC), la semnarea unui acord de transfer de material (MTA) [14].
however, seeding and experimental conditions should be adjusted accordingly to maintain adherence to the performance criteria.
Introducere
After an acclimation period of 24 h in multi-well plates, cells are exposed for 48 h to seven concentrations of the test chemical in at least triplicate.
Datorită schimbărilor intervenite la nivelul capacității celulelor de producție de E2 la îmbătrânire/reînsămânțare (2), celulele se cultivă urmând un protocol specific înainte ca acestea să fie utilizate și se notează numărul de reînsămânțări de când celulele au fost decongelate, precum și numărul reînsămânțării la care celulele au fost congelate și introduse în azot lichid pentru stocare.
Solvent and a known inhibitor and inducer of hormone production are run at a fixed concentration as negative and positive controls.
Primul număr indică numărul curent de reînsămânțare al celulelor și cel de-al doilea număr indică numărul de reînsămânțare la care celulele au fost congelate și stocate.
At the end of the exposure period, the medium is removed from each well.
De exemplu, celulele care au fost congelate după reînsămânțarea cinci și dezghețate, iar ulterior au fost separate de trei ori (4 reînsămânțări, numărând celulele proaspăt decongelate ca reînsămânțarea 1) după ce au fost cultivate din nou ar fi etichetate drept reînsămânțarea 4.5.
Cell viability in each well is analysed immediately after removal of medium.
Un exemplu de sistem de numerotare este ilustrat în apendicele I din raportul de validare (4).
Concentrations of hormones in the medium can be measured using a variety of methods including commercially available hormone measurement kits and/or instrumental techniques such as liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS).
Se utilizează mediul stoc ca bază pentru mediile de completare și de congelare.
Data are expressed as fold change relative to the solvent control and the Lowest-Observed-Effect-Concentration (LOEC).
Mediul de completare este o componentă necesară pentru cultivarea celulelor.
If the assay is negative, the highest concentration tested is reported as the No-Observed-Effect-Concentration (NOEC).
Mediul de congelare este conceput anume pentru a permite congelarea celulelor fără impact asupra acestora, pentru stocare pe termen lung.
Conclusions regarding the ability of a chemical to affect steroidogenesis should be based on at least two independent test runs.
Înainte de utilizare, Nu-serum [sau un ser comparabil ca proprietăți, care s-a demonstrat că produce date care satisfac performanța testelor și cerințele de control al calității (CC)], care este un element constitutiv al mediilor de completare, trebuie analizat pentru identificarea concentrațiilor de fond T și E2.
The first test run may function as a range finding run with subsequent adjustment of concentrations for runs 2 and 3, if applicable, if solubility or cytotoxicity problems are encountered or the activity of the chemical seems to be at the end of the range of concentrations tested.
Prepararea soluțiilor este descrisă în apendicele II la raportul de validare (4).
CULTURE PROCEDURE
După inițierea unei culturi de celule H295R pornind de la un lot inițial ATCC, celulele sunt cultivate pentru cinci însămânțări (și anume, celulele sunt separate de 4 ori).
Cell Line
Celulele de însămânțare 5 sunt ulterior congelate în azot lichid pentru stocare.
The NCI-H295R cells are commercially available from the American Type Culture Collections (ATCC) upon signing a Material Transfer Agreement (MTA) [14].
Înainte de congelarea celulelor, se aplică un eșantion de celule anterioare de reînsămânțarea 4 pe o placă CC (a se vedea punctele 36 și 37) pentru a verifica dacă producția bazală de hormoni și răspunsul la substanțele martor pozitive îndeplinesc criteriile de control ale testului calității, astfel cum sunt definite în tabelul 5.
Introduction
Celulele H295R trebuie să fie cultivate, congelate și stocate în azot lichid pentru a se asigura că există întotdeauna celule de reînsămânțarea/vârsta corespunzătoare disponibile pentru cultivare și utilizare.
Due to changes in the E2 producing capacity of the cells with increasing age/passages (2), cells should be cultured following a specific protocol before they are used and the number of passages since the cells were defrosted as well as the passage number at which the cells were frozen and placed in liquid nitrogen storage should be noted.
Numărul maxim de însămânțări după luarea unui lot nou [15] sau congelat [16] de celule în cultură care este acceptabil pentru utilizare în testul H295R nu trebuie să depășească 10.
The first number indicates the actual cell passage number and the second number describes the passage number at which the cells were frozen and placed in storage.
De exemplu, însămânțările acceptabile pentru culturile de celule dintr-un lot congelat la reînsămânțarea 5 ar urma să fie de 4.5 până la 10.5.
For example, cells that were frozen after passage five and defrosted and then were split three times (4 passages counting the freshly thawed cells as passage 1) after they were cultured again would be labelled passage 4.5.
Pentru inițierea celulelor din loturile congelate, se respectă procedura descrisă la punctul (19).
An example of a numbering scheme is illustrated in Appendix I to the validation report (4).
Celulele se cultivă pentru cel puțin patru (4) însămânțări suplimentare (reînsămânțarea 4.5) înainte de a fi utilizate în test.Celulele de plecare din rezerva congelată
Stock medium is used as the base for the supplemented and freezing mediums.
Procedura de inițiere a celulelor din rezerva congelată se utilizează atunci când un nou lot de celule este scos din depozitul de azot lichid pentru cultivare și testare.
Supplemented medium is a necessary component for culturing cells.
Detaliile procedurii sunt prevăzute în apendicele III la raportul de validare (4).
Freezing medium is specifically designed to allow for impact-free freezing of cells for long-term storage.
Celulele se extrag din depozitul de azot lichid, se decongelează rapid, se introduc într-un mediu de completare într-un tub de centrifugă, sunt centrifugate la temperatura camerei, resuspendate în mediu de completare și transferate într-o balon de cultură.