natgillin/translations-raw huggingface dataset:
As noted in paragraph 29, each laboratory should demonstrate the conformance of their hormone measurement system (e.g. ELISA, RIA, LC-MS, LC-MS/MS) with the QC criteria by analysing supplemented medium spiked with an internal hormone control prior to conducting QC runs or testing of chemicals.
Concentrația hormonală finală =
In order to ensure that the components of the test system do not interfere with measurement of hormones, the hormones may need to be extracted from the media prior to their measurement (see paragraph 30 for the conditions under which an extraction is or is not required).
Concentrația de hormoni (per ml) ÷ recuperare) (factorul de diluție)
It is recommended to conduct extraction following the procedures in Appendix III to the validation report (4).
(150 pg/ml) ÷ (0,89) × (250 μl/450 μl) × 10 = 936,3 pg/ml
If a commercial test kit is being used to measure the hormone production, the hormone analysis should be conducted as specified in the manuals provided by the test kit manufacturer.
Selecția concentrațiilor de testare
Most manufacturers have a unique procedure by which the hormone analyses are conducted.
Ar trebui să se efectueze un minim de două serii de teste independente.
Dilutions of samples need to be adjusted such that expected hormone concentrations for the solvent controls fall within the centre of the linear range of the standard curve of the individual assay (Appendix III to the validation report (4)).
În cazul în care rezultatele primului test sunt neclare (și anume, coeficientul de modificare este semnificativ statistic de la MS la o singură concentrație) sau pozitive (și anume, coeficientul de modificare la două sau mai multe concentrații adiacente este semnificativ statistic), testul trebuie repetat, astfel cum se indică în tabelul 7, prin rafinarea concentrațiilor de testare selectate.
Values outside of the linear portion of the standard curve should be rejected.
Concentrațiile de testare din ciclurile de teste doi și trei (dacă este cazul) trebuie să fie ajustate în funcție de rezultatele ciclului inițial de teste care au valori de o parte și de alta a concentrațiilor care au provocat un efect, utilizând o spațiere de concentrare de 1/2-log (de exemplu, dacă ciclul inițial de 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100, 1000 μM a condus la induceri la 1 și 10 μM, concentrațiile testate în al doilea ciclu de teste trebuie să fie de 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 μM), cu excepția cazului în care trebuie să se utilizeze concentrații mai mici pentru obține CMEO.
Example:
În cazul în care al doilea ciclu de teste nu confirmă primul ciclu de teste (și anume, nu apare o semnificație statistică la concentrația testată anterior pozitiv ± 1 variație de concentrație), se va efectua un al treilea experiment utilizând condițiile inițiale de testare.
Extracted:
Rezultatele neclare din primul ciclu de teste se consideră negative în cazul în care efectul observat nu a putut fi confirmat în oricare dintre cele două cicluri ulterioare.
450 μl medium
Rezultatele neclare sunt considerate răspunsuri (efect) pozitive atunci când răspunsul poate fi confirmat în cel puțin încă un ciclu de teste cu un interval de creștere a concentrației de ± 1 (a se vedea punctul 55 pentru procedura de interpretare a datelor].
Reconstituted in:
Tabelul 7
250 μl assay buffer
Matrice de decizii pentru posibile scenarii de rezultat
Dilution in Assay:
Ciclul 1
1:10 (to bring the sample within the linear range of the standard curve)
Ciclul 2
Hormone Concentration in Assay:
Ciclul 3
150 pg/ml (already adjusted to concentration per ml sample assayed)
Decizie
Recovery:
Scenariu
Final hormone concentration =
Pozitiv
(Hormone concentration (per ml) ÷ recovery) (dilution factor)
De confirmat [26]
(150 pg/ml) ÷ (0,89) × (250 μl/450 μl) × 10 = 936,3 pg/ml
De perfecționat [27]
Selection of test concentrations
Neclar [28]
A minimum of two independent runs of the assay should be conducted.
Controlul de calitate al plăcii de testare
If the chemical is soluble, and not cytotoxic at any of the tested concentrations, and the first run was negative for all concentrations, then it is to be confirmed in one more run using the same conditions as the first run was conducted (Table 7).
Datele trebuie să se încadreze în intervalele acceptabile definite pentru fiecare parametru care urmează să fie luat în considerare pentru o evaluare suplimentară.
If the results of the first run are equivocal (i.e. the fold-change is statistically significant from the SC at only one concentration) or positive (i.e. the fold change at two or more adjacent concentrations is statistically significant), the test should be repeated as indicated in Table 7 by refining the selected test concentrations.
În cazul în care criteriile nu sunt îndeplinite, tabelul trebuie să menționeze că nu s-au îndeplinit criteriile de CC în eșantionul respectiv, iar eșantionul se analizează din nou sau se elimină din setul de date.
Test concentrations in runs two and three (if applicable) should be adjusted on the basis of the results of the initial run bracketing concentrations that elicited an effect using 1/2-log concentration spacing (e.g. if the original run of 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100, 1000 μM resulted in inductions at 1 and 10 μM, the concentrations tested in the second run should be 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 μM), unless lower concentrations need to be employed to achieve a LOEC.
Tabelul 8
In the latter case, at least five concentrations below the lowest concentration tested in the first run should be used in the second run using a 1/2-log scale.
Intervale și/sau variație acceptabile (%) pentru parametrii plăcii de testare a testului H295R
If the second run does not confirm the first run (i.e. statistical significance does not occur at the previously positively tested Live/Deadconcentration ± 1 concentration-increment), a third experiment is to be conducted using the original testing conditions.
(LC: limita de cuantificare a sistemului de măsurare hormonală.
Equivocal results in the first run are considered negative if the observed effect could not be confirmed in any of the two subsequent runs.
CV: coeficient de variație; MS: martor pentru solvent; DPM: dezintegrări pe minut)
Equivocal results are considered as positive responses (effect) when the response can be confirmed in at least one more run within a ± 1 concentration increment (see section 55 for the Data Interpretation Procedure).
Comparație între
Table 7
Producția hormonală bazală în MS
Decision matrix for possible outcome scenarios
Coeficient mai mare decât LC
Run 1
≥ 5 ori
Run 2
≥ 2,5 ori
Run 3
Experimente de expunere — CV pentru aceeași placă pentru MS (godeuri duplicate)
Decision
Concentrații absolute
Scenario
Experimente de expunere — CV între plăci pentru MS (experimente duplicate)
Positive
Coeficient de modificare
Confirm [26]
Sistemul de măsurare hormonală — sensibilitate
Stop
Scădere a coeficientului detectabilă în raport cu MS
Refine [27]
Sistemul de măsurare hormonală — CV pentru măsurare duplicată pentru MS [29]
Equivocal [28]
Extracția mediului — recuperarea standardului intern 3H (dacă este cazul)
Quality Control of the Test Plate
≥ 65 % nominal
In addition to meeting the criteria for the QC plate, other quality criteria that pertain to acceptable variation between replicate wells, replicate experiments, linearity and sensitivity of hormone measurement systems, variability between replicate hormone measures of the same sample, and percentage recovery of hormone spikes after extraction of medium (if applicable; see Paragraph 30 regarding extraction requirements) should be met and are provided in Table 8.
ANALIZA DATELOR ȘI RAPORTARE
Data should fall within the acceptable ranges defined for each parameter to be considered for further evaluation.
Analiza datelor
Table 8
Toate datele sunt exprimate ca medie ± 1 deviație standard (DS).
Acceptable ranges and/or variation (%) for H295R assay test plate parameters.
Numai datele privind hormonii din godeurile unde citotoxicitatea a fost sub 20 % ar trebui să fie incluse în analiza datelor.
(LOQ: Limit of Quantification of the hormone measurement system.
Modificările relative se calculează după cum urmează:
CV: Coefficient of variation; SC: Solvent Control; DPM: Disintegrations per minute)
Schimbare relativă = (concentrația de hormoni din fiecare godeu) ÷ (concentrația de hormoni medie în toate godeurile martor pentru solvent).
Comparison Between
În cazul în care, prin inspectarea vizuală a godeului sau astfel cum demonstrează testul de viabilitate/citotoxicitate descris la punctul 42, se pare că nu există o creștere a numărului de celule, creșterea aparentă trebuie să fie confirmată.
Basal hormone production in SCs
Înainte de a efectua analize statistice, trebuie să se evalueze ipotezele de normalitate și de omogenitate a varianței.
Fold-greater than LOQ
Normalitatea se evaluează utilizând reprezentări grafice standard ale probabilităților sau alte metode statistice adecvate (de exemplu, testul Shapiro-Wilk).
≥ 5-fold
În cazul în care datele (coeficientul de modificare) nu au o distribuție normală, se poate încerca transformarea datelor pentru a aproxima o distribuție normală.
≥ 2,5-fold
Dacă datele prezintă o distribuție normală sau aproximează o distribuție normală, trebuie să se analizeze diferențele dintre grupurile de concentrație a substanței chimice și MS cu ajutorul unui test parametric (de exemplu, testul Dunnett), concentrația fiind variabila independentă și răspunsul (coeficientul de modificare) fiind variabila dependentă.
Exposure Experiments — Within Plate CV for SCs (Replicate Wells)
În cazul în care datele nu au o distribuție normală, se utilizează un test non-parametric adecvat (de exemplu, testul de clasificare mulți-unul Kruskal Wallis, Steel).
Absolute Concentrations
Diferențele sunt considerate semnificative la p ≤ 0,05.
Exposure Experiments — Between Plate CV for SCs (Replicate Experiments)
Evaluările statistice sunt efectuate pe baza valorilor medii pentru fiecare godeu care reprezintă puncte de reper duplicate independent.
Fold-Change
Se preconizează că, datorită spațierii mari a dozelor în primul ciclu de teste (scară logaritmică log10), în multe cazuri nu va fi posibil să se descrie în mod clar relațiile concentrație-răspuns în care cele mai mari două doze se vor afla pe porțiunea liniară a curbei sigmoid.
Hormone Measurement System — Sensitivity
Prin urmare, pentru primul ciclu de teste sau alte seturi de date în care apare această situație (de exemplu, în cazul în care nu se poate estima o eficiență maximă), se aplică statistici variabile fixe de tip I, astfel cum sunt descrise mai sus.
Detectable fold-decrease relative to SC
În cazul în care mai mult de două puncte de date se află pe porțiunea liniară a curbei și se pot calcula eficacități maxime — se anticipează pentru unele dintre ciclurile secunde de teste care sunt efectuate utilizând o spațiere semi-logaritmică a concentrațiilor de expunere — trebuie să se utilizeze un probit, logit sau alte modele de regresie corespunzătoare pentru a calcula concentrații efective (de exemplu, EC50 și EC20).
Hormone Measurement System — Replicate Measure CV for SCs [29]
Rezultatele trebuie să fie prezentate atât în forme grafice (histograme care reprezintă DS medie ± 1), cât și în tabele (CMEO/CFEO, direcția efectului și magnitudinea răspunsului maxim care face parte din porțiunea de date care prezintă o relație doză-răspuns) (pentru un exemplu, a se vedea figura 3).
Medium Extraction — Recovery of Internal 3H Standard (If Applicable)
Evaluarea datelor este considerată valabilă doar în cazul în care aceasta s-a bazat pe cel puțin două cicluri de teste desfășurate în mod independent.
DPM
Un experiment sau un ciclu de teste este considerat independent în cazul în care acesta a fost executat la o altă dată cu ajutorul unui nou set de soluții și martori.
≥ 65 % Nominal
Intervalul de concentrații utilizat în ciclurile de teste 2 și 3 (în cazul în care este necesar) se poate adapta pe baza rezultatelor ciclului 1 pentru o mai bună definire a intervalului doză-efect care include CMEO (a se vedea punctul 47).
DATA ANALYSIS AND REPORTING
Figura 3
Data Analysis
Exemplu de prezentare și evaluare a datelor obținute pe durata derulării testului H295R în format grafic și de tabel
To evaluate the relative increase/decrease in chemically altered hormone production, the results should be normalised to the mean SC value of each test plate, and results expressed as changes relative to the SC in each test plate.
OH Pregnenolon
All data are to be expressed as mean ± 1 standard deviation (SD).
Progesteron
Only hormone data from wells where cytotoxicity was less than 20 % should be included in the data analysis.
OH Progesteron
Relative changes should be calculated as follows:
Androstenedion
If data are not normally distributed, an appropriate non-parametric test should be used (e.g. Kruskal Wallis, Steel's Many-one rank test).
Substanța chimică
Differences are considered significant at p ≤ 0,05.
Modificare maximă
Statistical evaluations are done based on average values for each well that represent independent replicate data points.
0,15 ori
It is anticipated that due to the large spacing of doses in the first run (log10 scale) in many cases it will not be possible to describe clear concentration-response relationships where the two greatest doses will be on the linear portion of the sigmoid curve.
Letrozol
Therefore, for the first run or any other data sets where this condition occurs (e.g. where no maximum efficacy can be estimated) type I fixed variable statistics as described above will be applied.
29 ori
Results should be provided both in graphical (bar graphs representing mean ± 1 SD) and tabular (LOEC/NOEC, direction of effect, and strength of maximum response that is part of the dose-response portion of the data) formats (see Figure 3 for an example).
O substanță chimică de testat se consideră a fi pozitivă în cazul în care coeficientul de inducție este diferit din punct de vedere statistic (p ≤ 0,05) față de martorul pentru solvent la două concentrații adiacente în cel puțin două cicluri independente de teste (tabelul 7).
Data assessment is only considered valid if it has been based on at least two independently conducted runs.
O substanță chimică de testat se consideră a fi negativă în urma a două cicluri independente de teste cu rezultat negativ, sau în urma a trei cicluri care cuprind două cicluri de teste negative și un ciclu neclar sau pozitiv.
An experiment or run is considered independent if it has been conducted at a different date using a new set of solutions and controls.
În cazul în care datele obținute în trei experimente independente nu îndeplinesc criteriile de decizie enumerate în tabelul 7, rezultatele experimentale nu sunt interpretabile.
The concentration range used in runs 2 and 3 (if necessary) may be tailored on the basis of the results of run 1 to better define the dose response range containing the LOEC (see paragraph 47).
Rezultatele la concentrații care depășesc limitele de solubilitate sau la concentrații citotoxice nu trebuie să fie incluse în interpretarea rezultatelor.
Figure 3
Raportul de testare
Example of the presentation and evaluation of data obtained during the conduct of the H295R Assay in graphical and tabular format.
denumirea unității, localizarea;
Asterisks indicate statistically significant differences from the solvent control (p < 0,05).
directorul studiului și alți membri ai personalului și responsabilitățile acestora în cadrul studiului;
Lowest observed effective concentration;
datele de început și de sfârșit ale studiului.
Max Change:
Substanța chimică de testat, reactivi și martori
Maximum strength of the response observed at any concentration relative to the average SC response (= 1).
identitatea (nume/nr.
Cholesterol
CAS, după caz), sursa, numărul lotului, puritatea, furnizorul și caracterizarea substanței chimice de testat, reactivi și martori;
Pregnenolone
natura fizică și proprietățile fizico-chimice relevante ale substanței de testat;
OH Pregnenolone
condițiile de stocare și metoda și frecvența preparării substanțelor de testare, a reactivilor și a martorilor;
Progesterone
stabilitatea substanței chimice de testat.
OH Progesterone
Celule
Androstenedione
sursa și tipul de celule;
Testosterone
numărul de reînsămânțări (identificator de reînsămânțare celulară) ale celulelor utilizate în test;
estradiol
descrierea procedurilor de păstrare a culturilor de celule.
eoxycorticosterone
Cerințe înainte de testare (dacă este cazul)
Cortisol
descrierea și rezultatele testului de interferență al testului hormon chimic;
Aldosterone
descrierea și rezultatele măsurătorilor eficienței de extracție a hormonilor;
Estrone
curbele standard și etalonare pentru toate testele analitice care trebuie efectuate;
Deoxycortisol
limitele de detecție pentru testele analitice selectate.
Corticosterone
Condiții de testare
LOEC Max Change
compoziția mediilor de cultură;
0,15 fold
concentrația substanței de testat;
Letrozole
densitatea celulară (concentrații celulare estimate sau măsurate la 24 de ore și la 48 de ore);
29 fold
solubilitatea substanței de testat (limita de solubilitate, în cazul în care este stabilită);
Data Interpretation Procedure
durata și condițiile de incubație.
A test chemical is judged to be positive if the fold induction is statistically different (p ≤ 0,05) from the solvent control at two adjacent concentrations in at least two independent runs (Table 7).
Rezultatele testului
A test chemical is judged to be negative following two independent negative runs, or in three runs, comprising two negative runs and one equivocal or positive run.
datele neprelucrate pentru fiecare godeu pentru martori și substanțele chimice de testat — fiecare măsură duplicată sub forma datelor originale furnizate de instrumentul utilizat pentru a măsura producția de hormoni (de exemplu, OD, unități de fluorescență, DPM etc.);
If the data generated in three independent experiments does not meet the decision criteria listed in Table 7, the experimental results are not interpretable.
validarea normalității sau explicațiile privind transformarea datelor;
Results at concentrations exceeding the limits of solubility or at cytotoxic concentrations should not be included in the interpretation of results.
răspunsurile medii ± 1 SD pentru fiecare godeu măsurat;
Test Report
datele privind citotoxicitatea (concentrațiile de testare care au determinat citotoxicitate);
Name of facility and location;
confirmarea faptului că au fost îndeplinite cerințele de control al calității;
Study director and other personnel and their study responsibilities;
modificarea relativă în comparație cu martorul pentru solvent rectificat pentru citotoxicitate;
Dates the study began and ended;
un grafic care să indice modificarea relativă (coeficient de modificare) la fiecare concentrație, SD și semnificația statistică, astfel cum s-a precizat la punctele 4954.
Test chemical, reagents and controls
Interpretarea datelor
Identity (name/CAS No as appropriate), source, lot/batch number, purity, supplier, and characterisation of test chemical, reagents, and controls;
se aplică procedura de interpretare a datelor la rezultate și se discută observațiile.
Physical nature and relevant physicochemical properties of test chemical;
Discuție
Storage conditions and the method and frequency of preparation of test chemicals, reagents and controls;
Există indicații din studiu în ceea ce privește posibilitatea ca datele referitoare la T/E2 să fi fost influențate de efecte indirecte asupra mecanismelor gluco- și mineralocorticoizilor?
Stability of test chemical;
Concluzii
Cells
OECD (2002), OECD Conceptual Framework for the Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals, in Appendix 2 to Chapter B.54 of this Annex.
Source and type of cells;
OECD (2010), Multi-Laboratory Validation of the H295R Steroidogenesis Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol Production, OECD Series of Testing and Assessment No.
Number of cell passages (cell passage identifier) of cells used in test;
132, ENV/JM/MONO(2010)31, Paris.
Description of procedures for maintenance of cell cultures;
OECD (2010), Peer Review Report of the H295R Cell-Based Assay for Steroidogenesis, OECD Series of Testing and Assessment No.
Pre-test requirements (if applicable)
133, ENV/JM/MONO(2010)32, Paris.
Description and results of chemical hormone-assay interference test;
Capitolul B.55 din prezenta anexă:
Description and results of hormone extraction efficiency measurements;
Biotestul Hershberger la șobolani:
Standard and calibration curves for all analytical assays to be conducted;
un test de depistare pe termen scurt pentru substanțe cu proprietăți (anti)androgenice.
Detection limits for the selected analytical assays;
Apendice
Test conditions
Confluență înseamnă acoperirea sau proliferarea permisă celulelor pe sau în tot mediul de cultură.
Composition of media;
CV înseamnă coeficientul de variație și este definit ca raportul dintre deviația standard a distribuției la media sa aritmetică.
Cell density (estimated or measured cell concentrations at 24 hours and 48 hours)
DPM înseamnă dezintegrări pe minut.
Solubility of test chemical (limit of solubility, if determined);
Este vorba despre numărul atomilor dintr-o cantitate dată de materiale radioactive, care este detectată că s-ar fi dezintegrat într-un minut.
Incubation time and conditions;
E2 înseamnă 17β-estradiol, cel mai important estrogen din sistemele mamiferelor.
Test results
Celulele H295R sunt celule adenocarcinom umane care au caracteristicile fiziologice ale celulelor adrenale fetale umane nediferențiate zonal și care exprimă toate enzimele implicate în steroidogeneză.
Raw data for each well for controls and test chemicals--each replicate measure in form of the original data provided by the instrument utilised to measure hormone production (e.g. OD, fluorescence units, DPM, etc.);
Acestea sunt disponibile de la ATCC.
Validation of normality or explanation of data transformation;
Mediul de congelare este utilizat pentru a congela și a stoca celulele congelate.
Mean responses ± 1 SD for each well measured;
Acesta se compune din mediu de stoc plus BD NuSerum și dimetilsulfoxid.
Cytotoxicity data (test concentrations that caused cytotoxicity);
Interval liniar înseamnă intervalul în curba standard pentru un sistem de măsurare a hormonilor unde rezultatele sunt proporționale cu concentrația de analit prezent în probă.
Confirmation that QC requirements were met;
LC înseamnă «limita de cuantificare» și este cea mai mică cantitate a unei substanțe chimice care poate fi distinsă de absența substanței respective (o valoare blanc) cuprinsă într-un interval de încredere declarat.
Relative change compared with solvent control corrected for cytotoxicity;
În scopul prezentei metode, LC este definit, de regulă, de către producătorul sistemelor de testare, dacă nu se specifică altfel.
A bar graph showing relative (fold change) at each concentration, SD and statistical significance as stated in paragraph 49-54;
CMEO înseamnă concentrația cea mai mică cu efecte observate, cel mai scăzut nivel de concentrație la care răspunsul este diferit statistic de cel al martorului pentru solvent.
Data interpretation
CFEO înseamnă concentrația fără efect observat, care este cea mai mare concentrație testată la care testul nu furnizează un răspuns pozitiv.
Apply the data interpretation procedure to the results and discuss findings;
Reînsămânțare înseamnă numărul de repetări ale procedurii prin care celulele sunt împărțite după inițierea unei culturi din stoc congelat.
Discussion
Reînsămânțarea inițială care a pornit de la stocul congelat primește numărul unu (1).
Are there any indications from the study regarding the possibility that the T/E2 data could be influenced by indirect effects on the gluco-, and mineral-corticoid pathways?
Celulele care au fost împărțite o dată sunt etichetate ca reînsămânțarea 2 etc.
Conclusions
PBS este soluția salină tamponată cu fosfat Dulbecco.
OECD (2002), OECD Conceptual Framework for the Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals, in Appendix 2 to Chapter B.54 of this Annex
Controlul calității, abreviat CC, înseamnă măsurile necesare pentru a asigura date valide.