natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Prior to use, Nu-serum (or a comparable serum of equal properties that has been demonstrated to produce data that meets the test performance and Quality Control (QC) requirements), which is a constituent of supplemented media, should be analysed for background T and E2 concentrations.
Mediul trebuie să fie schimbat în ziua următoare.
The preparation of these solutions is described in Appendix II to the validation report (4).
Celulele H295R sunt cultivate într-un incubator la 37 °C în atmosfera de aer cu 5 % CO2 și mediul este reînnoit de 2-3 ori pe săptămână.
After initiation of an H295R cell culture from an original ATCC batch, cells should be grown for five passages (i.e.the cells are split 4 times).
Atunci când celulele sunt aproximativ 85-90 % confluente, acestea trebuie să fie divizate.
Passage five cells are then frozen in liquid nitrogen for storage.
Divizarea celulelor este necesară pentru a se asigura sănătatea și creșterea celulelor și pentru a păstra celule pentru efectuarea de bioteste.
Prior to freezing the cells, a sample of the previous passage four cells is run in a QC plate (See paragraph 36 and 37) to verify whether the basal production of hormones and the response to positive control chemicals meet the assay quality control criteria as defined in Table 5.
Celulele sunt clătite de trei ori cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS, fără Ca2+ Mg2+.) și se eliberează din balonul de cultură prin adăugarea unei enzime de detașare adecvate, de exemplu, tripsina, în PBS (fără Ca2+ Mg2+).
H295R cells need to be cultured, frozen and stored in liquid nitrogen to make sure that there are always cells of the appropriate passage/age available for culture and use.
Imediat ce celulele se desprind de balonul de cultură, acțiunea enzimei ar trebui să fie oprită prin adăugarea unui mediu de completare la un raport de 3 × volumul utilizat pentru tratamentul enzimatic.
The maximum number of passages after taking a new [15] or frozen [16] batch of cells into culture that is acceptable for use in the H295R assay should not exceed 10.
Celulele sunt introduse într-un tub de centrifugă, centrifugate la temperatura camerei, supernatantul se elimină, iar extractul concentrat de celule se resuspendă în mediu de completare.
For example, acceptable passages for cultures of cells from a batch frozen at passage 5 would be 4.5 through 10.5.
Cantitatea corespunzătoare de soluție de celule se introduce într-un nou vas de cultură.
For cells started from these frozen batches, the procedure described in paragraph 19 should be followed.
Cantitatea de soluție de celule se ajustează astfel încât celulele să fie confluente în 5-7 zile.
These cells should be cultured for at least four (4) additional passages (passage 4.5) prior to their use in testing.Starting Cells from the Frozen Stock
Raportul recomandat de sub-cultivare este de 1: 3 și 1: 4.
The procedure for starting the cells from frozen stock is to be used when a new batch of cells is removed from liquid nitrogen storage for the purpose of culture and testing.
Placa se etichetează cu atenție.
Details for this procedure are set forth in Appendix III to the validation report (4).
În această etapă celulele sunt gata pentru a fi utilizate la testare și celulele suplimentare trebuie să fie congelate în azot lichid, astfel cum se specifică la punctul 20.
Cells are removed from liquid nitrogen storage, thawed rapidly, placed in supplemented medium in a centrifuge tube, centrifuged at room temperature, re-suspended in supplemented medium, and transferred to a culture flask.
Congelarea celulelor H 295R (prepararea celulelor pentru stocare în azot lichid)
The medium should be changed the following day.
Pentru a prepara celulele H 295R pentru congelare, procedura descrisă mai sus pentru separarea celulelor trebuie urmată până la treapta pentru resuspendarea concentratului de celule din partea de jos a tubului de centrifugare.
The H295R cells are cultivated in an incubator at 37 °C with 5 % CO2 in air atmosphere and the medium is renewed 2-3 times per week.
În această etapă, concentratul de celule se re-resuspendă în mediul de congelare.
When the cells are approximately 85-90 % confluent, they should be split.
Soluția este transferată într-un flacon criogenic, etichetat în mod corespunzător și congelat la – 80°C timp de 24 h, după care flaconul de criogenie este transferat în azot lichid pentru stocare.
Splitting of the cells is necessary to ensure the health and growth of the cells and to maintain cells for performing bioassays.
Plasarea pe plăci și preincubarea celulelor pentru testare
The cells are rinsed three times with phosphate-buffered saline (PBS, without Ca2+ Mg2+.) and freed from the culture flask by the addition of an appropriate detachment enzyme, e.g. trypsin, in PBS (without Ca2+ Mg2+).
Numărul de plăci cu 24 de godeuri, preparate astfel cum s-a specificat la punctul 19, care vor fi necesare depinde de numărul de substanțe chimice care urmează să fie testate și de confluența celulelor în vasele de cultură.
Immediately after the cells detach from the culture flask, the enzyme action should be stopped with the addition of supplemented medium at a ratio of 3× the volume used for the enzyme treatment.
Ca regulă generală, un balon de cultură (75 cm2) cu 80-90 % celule confluente va furniza suficiente celule pentru una până la 1,5 plăci (cu 24 de godeuri), la o densitate țintă de 200000 până la 300000 celule/ml de mediu care rezultă în aproximativ 50-60 % confluență în godeuri la 24 de ore (figura 2).
Cells are placed into a centrifuge tube, centrifuged at room temperature, the supernatant is removed and the pellet of cells is re-suspended in supplemented medium.
Aceasta este, în mod normal, densitatea celulară optimă pentru producția de hormoni în cadrul testului.
The appropriate amount of cell solution is placed in the new culture flask.
La densități mai mari, modelele de producție ale T și E2 se modifică.
The amount of cell solution should be adjusted so that the cells are confluent within 5-7 days.
Înainte de a efectua testul prima dată, se recomandă să se testeze diferite densități de însămânțare între 200000 și 300000 celule/ml și se recomandă selectarea densității care rezultă într-o confluență de 50-60 % în godeu la 24 de ore pentru experiențe suplimentare.
The recommended sub-cultivation ratio is 1:3 to 1:4.
Fotomicrografie a celulelor H295R la o densitate de însămânțare de 50 % într-o placă de cultură cu 24 de godeuri și preluate la 24 de ore la marginea (A) și în centrul (B) al unui godeu.
The plate should be carefully labelled.
Necropsia animalelor P
The cells are now ready to be used in the assay and excess cells should be frozen in liquid nitrogen as described in paragraph 20.
Înainte de împerechere
Freezing H295R Cells (preparing cells for liquid nitrogen storage)
După împerechere
To prepare H295R cells for freezing, the procedure described above for splitting cells should be followed until the step for re-suspending the pellet of cells in the bottom of the centrifuge tube.
2 săptămâni
Here, the pellet of cells is re-suspended in freezing medium.
6 săptămâni
The solution is transferred to a cryogenic vial, labelled appropriately, and frozen at – 80 °C for 24 hours after which the cryogenic vial is transferred to liquid nitrogen for storage.
Sarcină
Plating and Pre-incubation of Cells for Testing
Lactație
The number of 24-well plates, prepared as outlined in paragraph 19, that will be needed depends on the number of chemicals to be tested and the confluency of the cells in the culture dishes.
Dezvoltare intrauterină
As a general rule, one culture flask (75 cm2) of 80-90 % confluent cells will supply sufficient cells for one to 1,5 (24-well) plates at a target density of 200000 to 300000 cells per ml of medium resulting in approximately 50-60 % confluency in the wells at 24 hours (Figure 2).
Înainte de înțărcare
This is typically the optimal cell density for hormone production in the assay.
După înțărcare
At higher densities, T as well as E2 production patterns are altered.
Generația parentală
Before conducting the assay the first time, it is recommended that different seeding densities between 200000 and 300000 cells per ml be tested, and the density resulting in 50-60 % confluency in the well at 24 hours be selected for further experiments.
Cohortă
Photomicrograph of H295R cells at a seeding density of 50 % in a 24 well culture plate at 24 hours taken at the edge (A) and centre (B) of a well
Denumire
Necropsy P animals
Animale/cohortă
Pre-mating
Vârsta aproximativă la necropsie (săptămâni)
Post-mating
Obiectiv de 20 de pui per grup
2 weeks
Excedent
6 weeks
Reproductiv
Pregnancy
Neurotoxicitate
Pre-weaning
14 sau 20-25, dacă se declanșează
Post-weaning
@ unul per cuib și reprezentativ pentru 20 de cuiburi în total, dacă este posibil
Parental generation
Mediul este pipetat din balonul de cultură, iar celulele sunt spălate de 3 ori cu PBS sterilă (fără Ca2+Mg2+).
Cohort
Se adaugă soluție enzimatică (în PBS) pentru desprinderea celulelor de balonul de cultură.
Designation
După o perioadă adecvată pentru detașarea celulelor, acțiunea enzimei trebuie să fie oprită prin adăugarea unui mediu de completare într-un raport de 3× volumul utilizat pentru tratamentul enzimatic.
Animals/cohort
Celulele sunt introduse într-un tub de centrifugă, centrifugate la temperatura camerei, supernatantul se elimină, iar extractul concentrat de celule se resuspendă în mediu de completare.
Approximate age at necropsy (weeks)
Densitatea celulară se calculează utilizând, de exemplu, un hemocitometru sau un contor de celule.
Target is 20 litters per group
Soluția de celule se diluează până la densitatea dorită pentru placare și este amestecată cu atenție, pentru a asigura densitatea celulară omogenă.
Surplus
Celulele sunt dispuse pe placă cu 1 ml soluție de celule/godeu, iar plăcile și godeurile se etichetează.
Reproductive
Plăcile însămânțate se incubează la 37 °C în atmosferă de aer cu sub 5 % CO2 timp de 24 de ore pentru a permite celulelor să se atașeze la godeuri.
Neurotoxicity
CERINȚE DE CONTROL AL CALITĂȚII
Immunotoxicity
Este esențial ca în timpul administrării să se furnizeze volumele exacte ale soluțiilor și ale eșantioanelor în godeuri, întrucât volumele determină concentrațiile utilizate în calculele de analiză a rezultatelor.
Spares
Înainte de a iniția cultura celulară și testarea ulterioară, fiecare laborator trebuie să demonstreze sensibilitatea sistemului său de măsurare a hormonilor (punctele 29-31).
20 M + 20 F
În cazul în care se vor utiliza teste de măsurare a hormonilor pe bază de anticorpi, substanțele chimice supuse testului trebuie analizate pentru a identifica potențialul acestora de a interfera cu sistemul de măsurare utilizat pentru a cuantifica T și E2, astfel cum se indică la punctul 32, înainte de începerea testării.
10 M + 10 F @
DMSO este solventul recomandat pentru test.
14 or 20-25 if triggered
Dacă se utilizează un alt solvent, trebuie să se determine următoarele:
@ one per litter and representative of 20 litters in total where possible
solubilitatea substanței chimice de testat, forskolin și procloraz în solvent;
The medium is pipetted off the culture flask, and the cells are rinsed 3 times with sterile PBS (without Ca2+Mg2+).
citotoxicitatea în funcție de concentrația de solvent.
An enzyme solution (in PBS) is added to detach the cells from the culture flask.
Concentrația maximă admisibilă a solventului se recomandă să nu depășească o diluție 10 × din cea mai mică concentrație citotoxică a solventului.
Following an appropriate time for detachment of the cells, the enzyme action should be stopped with the addition of supplemented medium at a ratio of 3 × the volume used for the enzyme treatment.
Înainte de a efectua testarea pentru prima dată, laboratorul trebuie să efectueze un experiment de calificare care să demonstreze faptul că acesta este în măsură să mențină și să obțină culturile celulare corespunzătoare și condițiile experimentale necesare pentru analize chimice, astfel cum se specifică la punctele 33-35.
Cells are placed into a centrifuge tube, centrifuged at room temperature, the supernatant is removed, and the pellet of cells is re-suspended in supplemented medium.
La începerea testării prin utilizarea unui nou lot, trebuie să se realizeze o placă de control înainte de a utiliza un nou lot de celule pentru a evalua performanța celulelor conform descrierii de la punctele 36 și 37.
The cell density is calculated using e.g. a haemocytometer or cell counter.
Performanța sistemului de măsurare a hormonilor
The cell solution should be diluted to the desired plating density and thoroughly mixed to assure homogenous cell density.
Sensibilitatea, exactitatea, precizia și trans-reactivitatea metodei cu matrice eșantion
The cells should be plated with 1 ml of the cell solution/well and the plates and wells labelled.
Fiecare laborator poate utiliza un sistem de măsurare a hormonilor la alegerea sa pentru analiza producției de T și E2 de către celulele H295R, cu condiția ca acesta să îndeplinească criteriile de performanță, inclusiv limita de cuantificare (LC).
The seeded plates are incubated at 37 °C under 5 % CO2 in air atmosphere for 24 hours to allow the cells to attach to the wells.
Nominal, acestea sunt de 100 pg/ml pentru T și de 10 pg/ml pentru E2, valori care se bazează pe nivelurile bazale ale hormonilor observate în studiile de validare.
QUALITY CONTROL REQUIREMENTS
Cu toate acestea, niveluri mai mari sau mai mici pot fi adecvate, în funcție de nivelurile bazale ale hormonilor înregistrate în laboratorul în care se efectuează studiul.
It is critical that exact volumes of solutions and samples are delivered into the wells during dosing because these volumes determine the concentrations used in the calculations of assay results.
Înainte de inițierea plăcii CC și a ciclurilor de teste, laboratorul trebuie să demonstreze că analiza hormonului de utilizat poate măsura concentrațiile de hormon în mediul de completare cu suficientă acuratețe și precizie, pentru a se îndeplini criteriile CC prevăzute în tabelele 1 și 5, analizând mediul de completare la care s-a adăugat un martor hormon intern.
Prior to the initiation of cell culture and any subsequent testing, each laboratory should demonstrate the sensitivity of its hormone measurement system (paragraphs 29-31).
La mediul de completare se adaugă cel puțin trei concentrații din fiecare hormon (de exemplu, 100, 500 și 2500 pg/ml de T; 10, 50 și 250 pg/ml de E2; sau se pot utiliza concentrațiile cele mai mici posibile bazate pe limitele de detectare ale sistemul ales de măsurare a hormonilor pentru cele mai mici variabilități ale concentrației de T și E2) și se analizează.
If antibody-based hormone measurement assays are to be used, the chemicals to be tested should be analysed for their potential to interfere with the measurement system used to quantify T and E2 as outlined in paragraph 32 prior to initiating testing.
Concentrațiile măsurate ale hormonilor în eșantioanele neextrase trebuie să fie în limita a 30 % din concentrațiile nominale, iar diferențele între măsurătorile duble pentru aceeași probă nu trebuie să depășească 25 % (a se vedea, de asemenea, tabelul 8 pentru noi criterii CC).
DMSO is the recommended solvent for the assay.
În cazul în care sunt îndeplinite criteriile CC, se presupune că analiza testului selectat pentru măsurarea hormonilor este suficient de precisă și nu provoacă o reacție încrucișată cu componentele din mediu (matricea eșantion), astfel încât să fie preconizată o influență semnificativă asupra rezultatului testului.
If an alternative solvent is utilised, the following should be determined:
În acest caz, nu este necesară o extracție de eșantioane înainte de măsurarea hormonilor.
The solubility of the test chemical, forskolin and prochloraz in the solvent;
În cazul în care nu sunt îndeplinite criteriile CC din tabelele 1 și 8, poate apărea un important efect de matrice și trebuie să se efectueze un experiment cu mediu extras contaminat.
The cytotoxicity as a function of the concentration of solvent.
Un exemplu de procedură de extracție este descris în apendicele II la raportul de validare (4).
It is recommended that the maximum allowable solvent concentration should not exceed a 10 × dilution of the least cytotoxic concentration of the solvent.
Măsurarea concentrațiilor de hormoni în eșantioanele extrase se efectuează în trei exemplare [17].
Prior to conducting testing for the first time, the laboratory should conduct a qualifying experiment demonstrating that the laboratory is capable of maintaining and achieving appropriate cell culture and experimental conditions required for chemical testing as described in paragraphs 33-35.
În cazul în care se poate dovedi că, după extracție, componentele mediului nu interferează cu metoda de depistare a hormonilor, astfel cum se definește în criteriile CC, orice alte experimente trebuie să se efectueze cu eșantioane extrase.
When initiating testing using a new batch, a control plate should be run before using a new batch of cells to evaluate the performance of the cells as described in paragraphs 36 and 37.
În cazul în care criteriile CC nu pot fi îndeplinite după extragere, sistemul utilizat pentru măsurarea hormonilor nu este adecvat pentru scopul testului de steroidogeneză H295R și trebuie să se utilizeze o altă metodă de detectare a hormonilor.Curba standard
Performance of the Hormone Measurement System
Concentrațiile de hormon ale probelor martor pentru solvent (MS) trebuie să se situeze în porțiunea liniară a curbei standard.
Method sensitivity, accuracy, precision and cross-reactivity with sample matrix
De preferință, valorile MS ar trebui să fie în apropierea centrului porțiunii liniare pentru a garanta că se poate măsura inducerea și inhibarea sintezei de hormoni.
Each laboratory may use a hormone measurement system of its choice for the analysis of the production of T and E2 by H295R cells so long as it meets performance criteria, including the Limit of Quantification (LOQ).
Diluțiile de mediu (sau extras) de măsurat se selecționează în consecință.
Nominally these are 100 pg/ml for T and 10 pg/ml for E2, which are based on the basal hormone levels observed in the validation studies.
Relația liniară se determină printr-o abordare statistică adecvată.
However, greater or lower levels may be appropriate depending upon the basal hormone levels achieved in the performing laboratory.
Interferența substanței de testat
Prior to initiation of QC plate and test runs, the laboratory should demonstrate that the hormone assay to be used can measure hormone concentrations in supplemented medium with sufficient accuracy and precision to meet the QC criteria specified in Tables 1 and 5 by analysing supplemented medium spiked with an internal hormone control.
În cazul în care se vor utiliza teste pe bază de anticorpi, cum ar fi testul de absorbție imunoenzimatică ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assays) și testele de radioimunodozare (Radio-Immuno Assays, RIA) pentru a măsura valorile hormonilor, fiecare substanță chimică trebuie să fie testată pentru o posibilă interferență cu sistemul de măsurare a hormonilor care va fi utilizat înainte de inițierea efectivă a substanțelor chimice [apendicele III la raportul de validare (4)], întrucât unele substanțe chimice pot interfera cu testele (17).
Supplemented medium should be spiked with at least three concentrations of each hormone (e.g. 100, 500 and 2500 pg/ml of T; 10, 50 and 250 pg/ml of E2; or the lowest possible concentrations based upon the detection limits of the chosen hormone measurement system can be used for the lowest spike concentrations for T and E2) and analysed.
Dacă apare interferența, și anume, ≥ 20 % din producția bazală de hormoni pentru T și/sau E2, astfel cum este stabilită de analiza hormonilor, testul de stabilire a interferenței asupra analizei hormonilor chimici [astfel cum este descris în apendicele III la raportul de validare (4), secțiunea 5.0] ar trebui să se aplice la toate diluțiile de soluție stoc ale substanței chimice testate pentru a identifica doza prag la care are loc o interferență semnificativă (≥ 20 %).
Measured hormone concentrations of non-extracted samples should be within 30 % of nominal concentrations, and variation between replicate measurements of the same sample should not exceed 25 % (see also Table 8 for additional QC criteria).
În cazul în care interferența nu depășește 30 %, rezultatele pot fi corectate ținând cont de interferență.
If these QC criteria are fulfilled it is assumed that the selected hormone measurement assay is sufficiently accurate, precise and does not cross-react with components in the medium (sample matrix) such that a significant influence on the outcome of the assay would be expected.
În cazul în care interferența depășește 30 %, datele nu sunt valabile și datele la concentrațiile respective trebuie să fie eliminate.
In this case, no extraction of samples prior to measurement of hormones is required.
În cazul în care are loc o interferență semnificativă a substanței chimice de testat cu un sistem de măsurare a hormonilor la nivelul mai multor concentrații necitotoxice, trebuie utilizat un alt sistem de măsurare a hormonilor.
In the case that the QC criteria in Tables 1 and 8 are not fulfilled, a significant matrix effect may be occurring, and an experiment with extracted spiked medium should be conducted.
În vederea evitării interferenței unor substanțe chimice contaminante, se recomandă ca hormonii să fie extrași din mediu utilizând un solvent adecvat, metodele posibile putând fi consultate în raportul de validare (4).
An example of an extraction procedure is described in Appendix II to the validation report (4).
Criterii de performanță pentru sistemele de măsurare a hormonilor
Measurements of the hormone concentrations in the extracted samples should be made in triplicate.
Parametru
If it can be shown that after extraction the components of the medium do not interfere with the hormone detection method as defined by the QC criteria, all further experiments should be conducted using extracted samples.
Criteriu
If the QC criteria cannot be met after extraction, the utilised hormone measurement system is not suitable for the purpose of the H295R Steroidogenesis Assay, and an alternative hormone detection method should be used.Standard curve
Sensibilitatea metodei de măsurare
The hormone concentrations of the solvent controls (SC) should be within the linear portion of the standard curve.
Limita de cuantificare (LC)
Preferably, the SC values should fall close to the centre of the linear portion to ensure that induction and inhibition of hormone synthesis can be measured.
Eficiența extracției hormonilor (numai în cazul în care extracția este necesară)
Dilutions of medium (or extracts) to be measured are to be selected accordingly.
Ratele de recuperare medii (pe baza a trei măsurători duplicate) pentru cantitățile de hormoni îmbogățite nu trebuie să se abată cu mai mult de 30 % de la cantitatea care a fost adăugată.
The linear relationship is to be determined by a suitable statistical approach.
Interferența substanței (numai sistemele bazate pe anticorpi)
Chemical interference test
Nu ar trebui să se manifeste nicio trans-reactivitate substanțială (≥ 30 % din producția bazală de hormoni a hormonului respectiv) cu oricare dintre hormonii produși de celule [19] [20]
If antibody-based assays such as Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISAs) and Radio-Immuno Assays (RIAs) are going to be used to measure hormones, each chemical should be tested for potential interference with the hormone measurement system to be utilised prior to initiation of the actual testing of chemicals (Appendix III to the validation report (4)) because some chemicals can interfere with these tests (17).
Testul de competență a laboratorului