natgillin/translations-raw huggingface dataset:
ANNEX VI
A kazeinek izolálása a sajtból és a referenciastandardból.
Methods of analysis of butter under private storage
Az izolált kazeinek feloldása és alávetése a plazminos (EC.3.4.21.7.) bontásnak.
Non Fat Solids (excluding salt)
Izoelektromos fókuszálás alkalmazása a plazminnal kezelt kazeinekre karbamid jelenlétében, és a fehérjék megfestése.
Salt
A megfestett (a tehéntej jelenlétét bizonyító) γ3 és γ2-kazeinmintázatoknak az értékelése a vizsgálati mintából nyert mintázatok és az ugyanazon a gélen, a 0 %, illetve az 1 % tehéntejet tartalmazó referenciastandardokból kapott mintázatok összehasonlításával.
The method to be applied shall be approved by the paying agency.
Ellenkező rendelkezés hiányában, analitikai tisztaságú vegyszereket kell alkalmazni.
ANNEX VII
A víznek kétszeresen desztilláltnak vagy azzal egyenértékű tisztaságúnak kell lennie.
Methods of analysis of skimmed milk powder under private storage
Megjegyzés: A következő részletek a laboratóriumban elkészített, karbamidtartalmú poliakrilamid gélekre vonatkoznak, amelyek méretei 265 × 125 × 0,25 mm.
ANNEX VIII
Ha más nagyságú vagy más típusú gélt használunk, a leválasztási körülményeket külön be kell állítani.
Methods of analysis of cheeses under private storage
Izoelektromos fókuszálás
The method of analysis laid down in the Appendix shall be used to ensure that cheese made exclusively from ewe's milk, goat's milk or buffalo milk or from a mixture of ewe's milk, goat's milk and buffalo milk does not contain cow's milk casein.
Vegyszerek a karbamidtartalmú poliakrilamid gél előállításához
Cow's milk casein is considered to be present if the cow's milk casein content of the analysed sample is equal to or higher than the content of the reference sample containing 1 % cow's milk as laid down in the Appendix.
Géltörzsoldat
Methods for detecting cow's milk casein in cheeses referred to in paragraph 1 may be used provided that:
Oldjuk fel a következőket vízben:
the detection limit is maximum 0,5 % and
4,85 g akrilamid
there are no false-positive results and
0,15 g N, N′-metilén-bisz-akrilamid (BIS)
cow's milk casein is detectable with the required sensitivity even after long ripening periods, as may occur in usual commercial conditions.
48,05 g karbamid
If any of the above mentioned requirements is not met, the methods laid down in the Appendix shall be used.
15,00 g glicerin (87 % m/m),
Appendix
töltsük fel 100 ml-re, és hűtőszekrényben, barna üvegben tároljuk.
METHOD FOR THE DETECTION OF COW'S MILK AND CASEINATE IN CHEESES FROM EWE'S MILK, GOAT'S MILK OR BUFFALO MILK OR MIXTURES OF EWE'S MILK, GOAT'S MILK AND BUFFALO MILK
Megjegyzés: A fent említett fix tömegű, neurotoxikus akrilamidok helyett előnyösebb lehet a kereskedelemben kapható, előre bekevert akrilamid/BIS-oldat használata.
SCOPE
Ha az ilyen oldat 30 % vegyesszázalék (m/v) akrilamidot és 0,8 % m/v BIS-t tartalmaz, 16,2 ml térfogatot kell belőle felhasználni a fix tömegek helyett.
Detection of cow's milk and caseinate in cheeses made from ewe's milk, goat's milk, buffalo milk or mixtures of ewe's, goat's and buffalo milk by isoelectric focusing of γ-caseins after plasminolysis.
A törzsoldat eltarthatósági ideje legfeljebb 10 nap; ha vezetőképessége több mint 5 μS, 2 g Amberlite MB-3 vegyszerrel kell 30 percen keresztül történő keverés útján ionmentesíteni, majd egy 0,45 μm pórusátmérőjű membránszűrőn átszűrni.
FIELD OF APPLICATION
Géloldat
The method is suitable for sensitive and specific detection of native and heat-treated cow's milk and caseinate in fresh and ripened cheeses made from ewe's milk, goat's milk, buffalo milk or mixtures of ewe's, goat's and buffalo milk.
Készítsük el a géloldatot úgy, hogy az adalékanyagokat és az amfolitokat (*) elkeverjük a géltörzsoldattal (lásd a 4.1.1. pontot).
It is not suitable for the detection of milk and cheese adulteration by heat-treated bovine whey protein concentrates.
9,0 ml törzsoldat
Isolation of caseins from cheese and the reference standards
24 mg β-alanin
Dissolving of the isolated caseins and submitting to plasmin (EC.3.4.21.7) cleavage
500 μl 3,5–9,5 pH közötti amfolit
Isoelectric focusing of plasmin-treated caseins in the presence of urea and staining of proteins
250 μl 5–7 pH közötti amfolit
Evaluation of stained γ3 and γ2 -casein patterns (evidence of cow's milk) by comparison of the pattern obtained from the sample with those obtained in the same gel from the reference standards containing 0 % and 1 % cow's milk.
250 μl 6–8 pH közötti amfolit
Unless otherwise indicated, analytical grade chemicals shall be used.
Keverjük össze a géloldatot, és vákuumban vagy ultrahangos fürdőben gázmentesítsük két vagy három percen át.
Water shall be double-distilled or of equivalent purity.
Megjegyzés: A géloldatot közvetlenül a kiöntés előtt készítsük el (lásd a 6.2. pontot).
Note: The following details apply to laboratory prepared polyacrylamide gels containing urea, of dimensions 265 × 125 × 0,25 mm.
Katalizátoroldatok
Where other sizes and types of gel are used, the separation conditions may have to be adjusted.
N, N, N′ N′ – tetrametil-etilén-diamin (Temed).
Isoelectric focusing
40 % m/v ammónium-perszulfát (PER):
Reagents for production of the urea containing polyacrylamide gels
Oldjunk fel vízben 800 mg PER-t, és töltsük fel vízzel 2 ml-re.
Stock gel solution
Megjegyzés: Mindig frissen készített PER-oldatot használjunk.
Dissolve:
Kontaktfolyadék
4,85 g acrylamide
Világítópetróleum vagy folyékony paraffin
0,15 g N, N′-methylene-bis-acrylamide (BIS)
Anódoldat
48,05 g urea
Oldjunk fel vízben 5,77 g foszforsavat (85 % m/m), és töltsük fel vízzel 100 ml-re.
15,00 g glycerol (87 % w/w),
Katódoldat
in water and make up to 100 ml and store in a brown glass bottle in the refrigerator.
Oldjunk fel vízben 2,00 g nátrium-hidroxidot, és hígítsuk fel vízzel 100 ml-re.
Note: A commercially available pre-blended acrylamide/BIS solution may be used in preference to the quoted fixed weights of the neurotoxic acrylamides.
A minta előkészítése
Where such a solution contains 30 % w/v acrylamide and 0,8 % w/v BIS, a volume of 16,2 ml shall be used for the formulation instead of the fixed weights.
Regensek a fehérjék izolálására
The shelf life of the stock solution is a maximum of 10 days; if its conductivity is more than 5 μS, de-ionize by stirring with 2 g Amberlite MB-3 for 30 minutes, then filter through a 0,45 μm membrane.
Hígított ecetsav (25,0 ml jégecet vízzel 100 ml-re hígítva)
Gel solution
Diklórmetán
Prepare a gel solution by mixing additives and ampholytes (*) with the stock gel solution (see 4.1.1).
Aceton
9,0 ml stock solution
Proteinoldó puffer
24 mg β-alanine
Oldjuk fel vízben a következőket:
500 μl ampholyte pH 3,5-9,5
5,75 g glicerin (87 % m/m)
250 μl ampholyte pH 5-7
24,03 g karbamid
250 μl ampholyte pH 6-8
250 mg ditio-treitol,
Mix the gel solution and de-gas for two to three minutes in an ultrasonic bath or in vacuum.
és töltsük fel 50 ml-re.
Note: Prepare the gel solution immediately prior to pouring it (see 6.2).
Megjegyzés: Hűtőszekrényben tárolva eltarthatósági ideje legfeljebb egy hét.
Catalyst solutions
A kazeinek plazminos bontására használt vegyszerek
N, N, N′ N′ — tetramethylethylenediamine (Temed)
Ammónium-karbonát-puffer
40 % w/v ammonium persulphate (PER):
Titráljunk 0,05 mol/l etilén-diamin-tetraecetsavat (EDTA, 1,46 g/100 ml) tartalmazó 0,2 mol/l ammónium-hidrogénkarbonát-oldatot (1,58 g/100 ml víz) 0,05 mol/l EDTA-t tartalmazó 0,2 mol/l ammónium-karbonát-oldattal (1,92 g/100 ml víz) 8 pH-ig.
Dissolve 800 mg PER in water and make up to 2 ml.
Szarvasmarhaplazmin (EC.3.4.21.7.), aktivitása legalább 5 U/ml
Note: Always use freshly prepared PER solution.
ε-aminokapronsav-oldat enzimgátlásra
Contact fluid
Oldjunk fel 2624 g ε-aminokapronsavat (6-amino-n-hexánsav) 100 ml 40 térfogat-százalékos etil-alkoholban.
Kerosene or liquid paraffin
Standardok
Anode solution
Bizonylattal ellátott, 0 %, illetve 1 % tehéntejet tartalmazó, tejoltóenzimmel kezelt fölözött juhtej- és kecsketejkeverék referenciastandardot a Referenciaanyagok és Mérések Bizottsági Intézeténél (B-2440 Geel, Belgium) lehet beszerezni.
Dissolve 5,77 g phosphoric acid (85 % w/w) in water and dilute to 100 ml.
Tejoltóenzimmel kezelt bivalytejből előállított, 0 % és 1 % tehéntejet tartalmazó laboratóriumi belső standard készítése
Cathode solution
A fölözött tejet nyers, ömlesztett bivalytejből, illetve szarvasmarhatejből 37 °C-on, 2500 g-vel 20 percen át történő centrifugálással készítjük.
Dissolve 2,00 g sodium hydroxide in water and dilute to 100 ml with water.
A centrifugacsövet a tartalmával együtt hirtelen 6–8 °C-ra lehűtjük, majd a felső, zsíros réteget teljes egészében eltávolítjuk.
Sample preparation
Az 1 %-os standard elkészítéséhez 1 literes főzőpohárban adjunk 5,00 ml fölözött szarvasmarhatejet 495 ml fölözött bivalytejhez, pH-ját 10 vegyesszázalékos (m/v) hígított tejsav hozzáadásával állítsuk be 6,4-re.
Reagents for protein isolation
A hőmérsékletet állítsuk be 35 °C-ra és adjunk hozzá 100 μl borjúgyomorból nyert oltóenzimet (aktivitása 1:10000, c.
Dilute acetic acid (25,0 ml of glacial acetic acid made up to 100 ml with water)
3000 U/ml), egy percen keresztül kavarjuk, majd a főzőpoharat alufóliával letakarva hagyjuk egy órán át 35 °C-on pihenni az alvadék kialakulásának elősegítésére.
Dichloromethane
Miután az alvadék kialakult, a teljes beoltott tejet előzetes homogenizálás és a savó leszívása nélkül fagyasztva szárítjuk.
Acetone
A fagyasztva szárítást követően az anyagot finomra daráljuk, amíg homogén port nem kapunk.
Protein dissolving buffer
A 0 %-os standard elkészítéséhez ugyanezt a műveletsort a tiszta fölözött bivalytejjel kell elvégezni.
Dissolve
A standardokat – 20 °C-on kell tárolni.
5,75 g glycerol (87 % w/w)
Megjegyzés: Ajánlatos a bivalytej tisztaságát a standardok elkészítése előtt a plazminos emésztéssel előkészített kazeinek izoelektromos fókuszálásával ellenőrizni.
24,03 g urea
A fehérje festéséhez használt vegyszerek
250 mg dithiothreitol,
Fixálószer
in water and make up to 50 ml
Oldjunk fel vízben 150 g triklór-ecetsavat, és töltsük fel vízzel 1000 ml-re.
Note: Store in a refrigerator, maximum shelf-life one week.
Festékeltávolító oldat
Reagents for plasmin cleavage of caseins
Oldjunk fel 500 ml metil-alkoholt és 200 ml jégecetet 2000 ml desztillált vízben.
Ammonium carbonate buffer
Megjegyzés: A festékeltávolító oldatot minden nap frissen készítsük el; elkészíthető 50 % térfogat-százalékos metilalkohol- és 20 térfogat-százalékos jégecettörzsoldat egyenlő mennyiségeinek az összekeverésével.
Titrate a 0,2 mol/l ammonium hydrogencarbonate solution (1,58 g/100 ml water) containing 0,05 mol/l ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 1,46 g/100 ml with a 0,2 mol/l ammonium carbonate solution (1,92 g/100 ml water) containing 0,05 mol/l EDTA to pH 8.
Festékoldatok
Bovine plasmin (EC.
Festékoldat (1. törzsoldat)
3.4.21.7), activity at least 5 U/ml
Mágneses keverő alkalmazásával oldjunk fel 3,0 g Coomassie G-250 brilliánskéket (C.I. 42655) 1000 ml 90 térfogat-százalékos metil-alkoholban (megközelítőleg 45 percen át), és két, közepes sebességű, redős szűrőn szűrjük át.
ε-Aminocaproic acid solution for enzyme inhibition
Festékoldat (2. törzsoldat)
Dissolve 2,624 g ε-aminocaproic acid (6 amino-n-hexanoic acid) in 100 ml of 40 % (v/v) ethanol.
Oldjunk fel 5,0 g rézszulfát-pentahidrátot 1000 ml 20 térfogat-százalékos jégecetben.
Standards
Festékoldat (munkaoldat)
Certified reference standards of a mixture of renneted ewe's and goat's skimmed milk containing 0 % and 1 % of cow's milk are available from the Commission's Institute for Reference Materials and Measurements, B-2440 Geel, Belgium
Közvetlenül festés előtt öntsünk össze 125 ml-t mindkét törzsoldatból (4.11.1., 4.11.2.).
Preparation of laboratory interim-standards of buffalo's renneted milk containing 0 % and 1 % of cow's milk
Megjegyzés: A festékoldatot a felhasználás napján kell elkészíteni.
Skimmed milk is prepared by centrifuging of either buffalo or bovine raw bulk milk at 37 °C at 2500 g for 20 minutes.
ESZKÖZÖK
After cooling the tube and contents rapidly to 6 to 8 °C, the upper fat layer is removed completely.
Üveglemezek (265 × 125 × 4 mm); gumihenger (15 cm széles); szintező asztal
For the preparation of the 1 % standard add 5,00 ml of bovine skimmed milk to a 495 ml of buffalo's skimmed milk in a 1 l beaker, adjust the pH to 6,4 by the addition of dilute lactic acid (10 % w/v).
Géltartó lemez (265 × 125 mm)
Adjust the temperature to 35 °C and add 100 μl of calf rennet (rennet activity 1: 10000, c.
Fedőlemez (280 × 125 mm).
3000 U/ml), stir for 1 minute and then leave the beaker covered with an aluminium foil at 35 °C for one hour to allow formation of the curd.
Mindkét hosszanti végére ragasszunk fel egy-egy csíkban ragasztószalagot (280 × 6 × 0,25 mm) (lásd az 1. ábrát)
After the curd has formed, the whole renneted milk is freeze-dried without prior homogenization or draining of the whey.
Elektrofókuszáló kamra hűtőlemezzel (pl. 265 × 125 mm) és megfelelő áramellátással (≥ 2,5 kV) vagy automata elektroforézis-készülék
After freeze-drying it is finely ground to produce a homogeneous powder.
Cirkulációs kriosztát, termosztátos vezérléssel 12 ± 0,5 °C-on
For the preparation of the 0 % standard, carry out the same procedure using genuine buffalo skimmed milk.
3000 g-ig állítható centrifuga
The standards shall be stored at – 20 °C.
Elektródacsíkok (≥ 265 mm hosszban)
Note: It is advisable to check the purity of the buffalo milk by isoelectric focusing of the plasmin-treated caseins before preparation of the standards.
Műanyag csepegtetőpalackok az anód- és a katódoldat számára
Reagents for protein staining
Mintafelvivő eszköz (10 × 5 mm, viszkózus vagy alacsony fehérjeadszorpciós szűrőpapír)
Fixative
Rozsdamentes acél vagy üvegfestő- és festékeltávolító-edények (például 280 × 150 mm műszertálca)
Dissolve 150 g trichloroacetic acid in water and make up to 1000 ml.
Szabályozható rúdhomogenizátor (10 mm tengelyátmérővel), percenkénti fordulatszám-tartomány 8000–20000 között
Destaining solution
Filmhegesztő gép
Dilute 500 ml methanol and 200 ml glacial acetic acid to 2000 ml with distilled water.
25 μl-es mikropipetta
Note: Prepare the destaining solution fresh every day; it can be prepared by mixing equal volumes of stock solutions of 50 % (v/v) methanol and 20 % (v/v) glacial acetic acid.
Vákuumbepárló vagy fagyasztva-szárító
Staining solutions
Termosztatikus vezérlésű, 35 és 40 ± 1 °C-ra állítható vízfürdő rázógéppel
Staining solution (stock solution 1)
Denzitométer, λ = 634 nm-es leolvasóval felszerelve
Dissolve 3,0 g Coomassie Brilliant Blue G-250 (C.I. 42655) in 1000 ml 90 % (v/v) methanol using a magnetic stirrer (approximately 45 minutes), filter through two medium-speed folded filters.
Kazeinek izolálása
Staining solution (stock solution 2)
Egy 100 milliliteres centrifugacsőbe mérjünk ki 5 g szárazanyag-mennyiségnek megfelelő sajtot vagy a referenciastandardot, adjunk hozzá 60 ml desztillált vizet és homogenizáljuk a rúdhomogenizátorral (8000–10000-es percenkénti fordulatszám között).
Dissolve 5,0 g copper sulphate pentahydrate in 1000 ml 20 % (v/v) acetic acid.
Állítsuk be hígított ecetsavval (4.5.1.) 4,6 pH-ra, és centrifugáljuk (5 perc, 3000 g).
Staining solution (working solution)
A zsírt és a savót öntsük le, a maradékot pedig 20000-es percenkénti fordulatszámon homogenizáljuk 40 ml desztillált vízben, amelynek a pH-ját előzetesen hígított ecetsavval (4.5.1.) 4,5 pH-ra állítottuk be, adjunk hozzá 20 ml diklórmetánt (4.5.2.), ismét homogenizáljuk és centrifugáljuk (5 perc, 3000 g).
Mix together 125 ml of each of the stock solutions (4.11.1, 4.11.2) immediately prior to staining.
Egy spatulával távolítsuk el a kazeinréteget, amely a vizes és a szerves fázis között található (lásd a 2. ábrát), és dekantáljuk mindkét fázist.
Note: The staining solution should be prepared on the day that it is used.
A kazeint ismét homogenizáljuk 40 ml desztillált vízben (a fentiek szerint), és 20 ml diklórmetánnal (4.5.2.) centrifugáljuk.
EQUIPMENT
Addig ismételjük ezt a műveletet, amíg mindkét extraháló fázis színtelen nem lesz (két-három alkalommal).
Glass plates (265 × 125 × 4 mm); rubber roller (width 15 cm); levelling table
A fehérjemaradékot 50 ml acetonban (4.5.3.) homogenizáljuk, és egy közepes átfolyási sebességű, redős papírszűrőn szűrjük át.
Gel carrier sheet (265 × 125 mm)
A szűrőn maradt maradékot két, külön 25 ml-es adagban acetonnal mossuk le, hagyjuk a levegőn megszáradni, vagy nitrogénnel szárítsuk, majd törjük finom porrá egy mozsárban.
Covering sheet (280 × 125 mm).
Megjegyzés: száraz kazeinizolátumokat – 20 °C hőmérsékleten kell tartani.
Stick on strip of adhesive tape (280 × 6 × 0,25 mm) to each long edge (see Figure 1)
A β-kazeinek plazminos bontása a γ-kazeinek kifejezettebbé tétele érdekében
Electrofocusing chamber with cooling plate (e.g. 265 × 125 mm) and suitable power supply (≥ 2,5 kV) or automatic electrophoresis device
Oszlassunk el 25 mg izolált kazeint (6.1.1.) 0,5 ml ammónium-karbonát-pufferben (4.7.1.) és 20 percig homogenizáljuk, például ultrahangos kezeléssel.
Circulation cryostat, thermostatically controlled at 12 ± 0,5 °C
Melegítsük fel 40 °C-ra, és adjunk hozzá 10 μl plazmint (4.7.2.), keverjük össze, majd folyamatos rázatás mellett inkubáljuk egy órán át 40 °C-on.
Centrifuge, adjustable to 3000 g
Az enzim késleltetése érdekében adjunk hozzá 20 μl ε-aminokapronsav-oldatot (4.7.3.), majd 200 mg szilárd karbamidot és 2 mg ditio-treitolt.
Electrode strips (≥ 265 mm long)
Megjegyzés: A fókuszált kazeincsíkok nagyobb szimmetriájának elérése érdekében ajánlatos az oldatot a ε-aminokapronsav hozzáadását követően liofilizálni, majd a maradékot 0,5 ml proteinoldó-pufferben oldani (4.6.).
Plastic dropping bottles for the anode and cathode solutions
A karbamidtartalmú poliakrilamid gél elkészítése
Sample applicators (10 × 5 mm, viscose or low protein-adsorption filter paper)
Néhány csepp víz segítségével terítsük ki a géltartó lemezt (5.2.) egy üveglapra (5.1.) egy papírtörölközővel vagy itatóssal eltávolítva a felesleges vizet.
Stainless steel or glass staining and destaining dishes (e.g. 280 × 150 mm instrument trays)
A fedőlemezt (5.3.) egy másik üveglapra terítsük ki a távtartókkal (0,25 mm) együtt azonos módon.
Adjustable rod homogenizer (10 mm shaft diameter), rpm range 8000 to 20000
Fektessük a lapot vízszintesen egy szintező asztalra.
Film welder
Adjunk hozzá az előkészített és légmentesített géloldathoz (4.1.2.) 10 μl Temed-oldatot (4.1.3.1.), keverjük össze és adjunk még hozzá 10 μl PER-oldatot (4.1.3.2.), ezt is alaposan keverjük össze, majd azonnal öntsük ki egyenletesen a fedőlemez közepére.
25 μl micropipettes
A géltartó lemez egyik szélét arccal lefelé fektessük a fedőlemez mellé, és lassan engedjük rá úgy, hogy a két lemez között egy gélfilm képződjön, amely egyenletesen és buborékmentesen kitölti a helyet (3. ábra).
Vacuum concentrator or freeze-dryer
Egy vékony spatula segítségével gondosan, egészen engedjük le a gélhordozó lemezt, és helyezzünk súlyként még három üveglemezt a tetejére.
Thermostatically controlled water bath adjustable to 35 and 40 ± 1 °C with shaker
Miután a polimerizáció befejeződött (mintegy 60 perc elteltével), a polimerizálódott gélt az üveglemezek felfordításával emeljük át a hordozólemezről a fedőlemezre.
Densitometer equipment reading at λ = 634 nm
A hordozólemez alsó felét gondosan tisztítsuk meg a maradványok és a karbamid eltávolítása érdekében.
Isolation of caseins
A gélszendvicset hegesszük bele egy filmcsőbe, és tároljuk hűtőszekrényben (legfeljebb hat hétig).
Weigh the amount equivalent to 5 g dry mass of cheese or the reference standards into a 100 ml centrifuge tube, add 60 ml distilled water and homogenize with a rod homogenizer (8000 to 10000 rpm).
Megjegyzés: A fedőlemez a távtartókkal újra felhasználható.
Adjust to pH 4,6 with dil. acetic acid (4.5.1) and centrifuge (5 minutes, 3000 g).
A poliakrilamid gél kisebb darabokra is felvágható, amely akkor ajánlott, ha kevesebb minta áll rendelkezésünkre, vagy egy automatikus elektroforézis készüléket használunk (két gél, 4,5 × 5 cm méretben).
Decant the fat and whey, homogenize the residue at 20000 rpm in 40 ml distilled water adjusted to pH 4,5 with dil. acetic acid (4.5.1), add 20 ml dichloromethane (4.5.2), homogenize again and centrifuge (5 minutes, 3000 g).
Izoelektromos fókuszálás
Remove the casein layer that lies between the aqueous and organic phases (see Figure 2) with a spatula and decant off both phases.
A hűtőtermosztátot állítsuk be 12 °C-ra.
Rehomogenise the casein in 40 ml distilled water (see above) and 20 ml dichloromethane (4.5.2) and centrifuge.
A géltartó lemez hátulját petróleummal töröljük le, majd cseppentsünk néhány csepp petróleumot (4.2.) a hűtőblokk közepére.
Repeat this procedure until both extraction phases are colourless (two to three times).
Ezután a gélszendvicset terítsük rá hordozó felülettel lefelé, óvatosan ügyelve arra, hogy ne képződjenek levegőbuborékok.
Homogenize the protein residue with 50 ml acetone (4.5.3) and filter through a medium-speed folded filter paper.
Törüljünk le minden felesleges petróleumot, és távolítsuk el a fedőlemezt.
Wash the residue on the filter with two separate 25 ml portions of acetone each time and allow to dry in the air or a stream of nitrogen, then pulverize finely in a mortar.
Az elektródcsíkokat áztassuk bele az elektródos oldatokba (4.3., 4.4.), vágjuk le a gél hosszára, és fektessük le a megadott helyzetbe (az elektródok távolsága 9,5 cm).
Note: Dry casein isolates should be kept at –20 °C.
Az izoelektromos fókuszálás feltételei:
Plasmin cleavage of β-caseins to intensify γ-caseins
Gélméret 265 × 125 × 0,25 mm
Disperse 25 mg of isolated caseins (6.1.1) in 0,5 ml ammonium carbonate buffer (4.7.1) and homogenize for 20 minutes by e.g. using ultrasonic treatment.
Lépés
Heat to 40 °C and add 10 μl plasmin (4.7.2), mix and incubate for one hour at 40 °C with continuous shaking.
Feszültség
To inhibit the enzyme add 20 μl ε-aminoproic acid solution (4.7.3), then add 200 mg of solid urea and 2 mg of dithiothreitol.
Áramerősség
Note: To obtain more symmetry in the focused casein bands it is advisable to freeze-dry the solution after adding the ε-aminocaproic acid and then dissolving the residues in 0,5 ml protein dissolving buffer (4.6).
Teljesítmény
Preparation of the urea containing polyacrylamide gels
Volt-óra
With the aid of a few drops of water roll the gel carrier sheet (5.2) onto a glass plate (5.1), removing any extraneous water with paper towel or tissue.
Előfókuszálás
Roll the cover sheet (5.3) with spacers (0,25 mm) onto another glass plate in the same way.
konstans 4
Lay the plate horizontally on a levelling table.
A minta fókuszálása
Add 10 μl Temed (4.1.3.1) to the prepared and de-aerated gel solution (4.1.2), stir and add 10 μl PER-solution (4.1.3.2), mix thoroughly and immediately pour out evenly onto the centre of the cover sheet.
Zárófókuszálás
Place one edge of the gel carrier plate (sheet side down) on the cover sheet plate and lower it slowly so that a gel film forms between the sheets and spreads out regularly and free of bubbles (Figure 3).
Megjegyzés: Ha a gél vastagságát vagy szélességét megváltoztatjuk, az áramerősség és a teljesítmény értékeit megfelelő módon kell módosítani (például kettőzzük meg az áramerősség és teljesítmény értékeit, ha 265 × 125 × 0,5 mm-es gélt használunk).
Carefully lower the gel carrier plate completely using a thin spatula and place three more glass plates on top of it to act as weights.
A következőkben egy automatikus elektroforéziskészülék feszültségprogramja látható (2 db 5,0 × 4,5 cm gél), az elektródokat csíkok nélkül, közvetlenül a gélre helyezzük fel.
After polymerization is complete (about 60 minutes) remove the gel polymerized onto the gel carrier sheet along with the cover sheet by tipping the glass plates.
Hőmérséklet
Clean the reverse of the carrier sheet carefully to remove gel residues and urea.
Fókuszálás
Weld the gel sandwich into a film tube and store in a refrigerator (maximum six weeks).
A mintafelvivőt a 2. lépésben 0 Vh-nál helyezzük el.
Note: The cover sheet with the spacers can be re-used.
A mintafelvivőt a 2. lépésben 30 Vh-nál távolítsuk el.
The polyacrylamide gel can be cut to smaller sizes, recommended when there are few samples or if an automatic electrophoresis device is used (two gels, size 4,5 × 5 cm).
Fehérjefestés