natgillin/translations-raw huggingface dataset:
The identification of listed pathogens VHSV and IHNV shall be performed by infecting cells in ‘Black’ 96-well plates, conventional 24-well plates or cover slips into 24-well plates.
VHSV-vel szembeni csoportspecifikus ellenanyagot tartalmazó szérum 1:50 (V/V) hígításban;
When IHNV or VHSV or both are identified by infecting cells on cover slips, the following protocol shall apply:
IHNV-vel szembeni csoportspecifikus ellenanyagot tartalmazó szérum 1:50 (V/V) hígításban;
cover slips shall be seeded with cells at a density leading to between 60 % and 90 % confluence after 24 hours of cultivation.
az IPNV endemikusan előforduló szerotípusai ellen termelt antiszérumok elegye 1:50 (V/V) hígításban;
EPC cells shall be used where possible for this purpose because of their strong adherence to glass surfaces, but other cell lines such as BF-2, RTG-2 or FHM may be used as well.
a tápfolyadék önmagában (pozitív kontroll).
150 μl cell culture supernatant in two different dilutions (1:10 and 1:1000) shall be inoculated in duplicate onto 1-day-old monolayers and incubated at 15 °C for 24 hours;
A vírusokat tartalmazó felülúszó-szérumok elegyének mindegyikéből legalább két sejttenyészetet 50–50 μl inokulummal be kell oltani, majd 15 °C-on inkubálni kell.
subsequently, cell culture medium shall be removed, and the infected cell monolayers fixed with 0,5 ml ice-cold, aqueous acetone solution (80 % vol:vol).
A CPE kialakulását az I.5.4. pontban foglaltaknak megfelelően kell ellenőrizni.
Fixation shall take place in fume hood for 15 minutes at room temperature, then the acetone solution shall be removed and the cover glasses shall be air dried for at least 30 minutes.
A neutralizációs próbákra nem reagáló VHSV-törzseket és -izolátumokat IF vagy ELISA segítségével kell kimutatni.
At this stage, the plates shall either be processed immediately or stored at – 20 °C for further use;
Ehelyett más, igazoltan hasonló hatékonyságú neutralizációs próbák is alkalmazhatók.
specific monoclonal antibodies (namely for VHSV identification, MAb IP5B11 and for IHNV, Hyb 136-3 respectively) shall be diluted in 0,01 M PBST, pH 7,2 in the dilution recommended by the provider of the MAbs; 50 to 100 μl/well shall be added to the fixed monolayer and plates shall be incubated for one hour at 37 °C in a humid chamber;
A vírus-RNS előkészítése
cover glasses shall be washed gently three times with PBS containing 0,05 % Tween-20 (PBS-T), and the buffer shall be removed completely after the last rinse.
Az RNS-sel kapcsolatos összes műveletet jégen, kesztyűben kell végezni.
The cells shall subsequently be incubated for one hour at 37 °C with fluorescein isothiocyanate (FITC) — or tetramethylrhodamine-5-(and-6-) isothiocyanate (TRITC)-conjugated antibodies against mouse immunoglobulin used as the primary antibody, diluted according to the supplier instructions, washed again in PBS-T, and dried.
Az RNS-t – a gyártó útmutatása szerint – a fenol-kloroform módszerrel vagy RNS-affinitásoszlop segítségével kell kivonni.
Stained cultures shall be mounted onto glass slides using glycerol saline and examined under incident ultraviolet (UV) light.
Az alábbi pontokban részletezett RT-PCR-protokolloknál történő felhasználásra alkalmas kiváló minőségű RNS-t előállító, kereskedelmi forgalomban kapható RNS-kivonási készletek használata megengedett.
Use 10 × or 12 × eyepieces and a × 25 or × 40 objective lens with numerical apertures > 0,7 and > 1,3 respectively.
Az RNS-t RNáz-mentes desztillált vízben (konkrétan 0,1 % dietil-pirokarbonáttal kezelt vízben) vagy megfelelő elúciós pufferben újra kell szuszpendálni.
Other IF techniques, with regard to cell cultures, fixation and antibodies of reference quality, of proven similar efficacy may be used instead.
Az IHNV kimutatásához a következő primereket kell alkalmazni:
Neutralisation
forward primer: 5′-AGA-GAT-CCC-TAC-ACC-AGA-GAC-3′;
Aliquots of a minimum of two supernatant dilutions shall be mixed and incubated for 60 minutes at 15 °C with equal parts of the following reagents separately:
A következő ciklusokat kell alkalmazni (egylépcsős RT-PCR): 1 ciklus 50 °C-on 30 percig; 1 ciklus 95 °C-on 2 percig; 30 ciklus 95 °C-on 30 másodpercig, 50 °C-on 30 másodpercig, 72 °C-on 60 másodpercig; 1 ciklus 72 °C-on 7 percig és 4 °C-on áztatás.
serum containing group specific antibody against VHSV at a 1:50 (vol:vol) dilution;
A VHSV kimutatásához a következő primereket kell alkalmazni:
serum containing group specific antibody against IHNV at a 1:50 (vol:vol) dilution;
VN forward primer: 5′-ATG-GAA-GGA-GGA-ATT-CGT-GAA-GCG-3′;
pool of antisera against the indigenous serotypes of IPNV at a 1:50 (vol:vol) dilution;
VN reverz primer: 5′-GCG-GTG-AAG-TGC-TGC-AGT-TCC-C-3′.
medium alone (positive control).
A következő ciklusokat kell alkalmazni (egylépcsős RT-PCR): 50 °C-on 30 percig, 95 °C-on 15 percig, 35 ciklus 94 °C-on 30 másodpercig, 55 °C-on 30 másodpercig és 68 °C-on 60 másodpercig.
From each virus supernatant-serum mixture, at least two cell cultures shall be inoculated with 50 μl each and then incubated at 15 °C.
Ezt követően a reakciót 68 °C-on 7 percig fenn kell tartani.
The development of CPE shall be checked as described in point I.5.4.
Az RT-PCR reakciók mennyiségét és specifikusságát etidium-bromiddal festett 1,5 %-os agarózgélen végzett gélelektroforézissel kell értékelni és UV-átvilágítással kell megfigyelni.
VHSV strains and isolates that do not react in neutralisation tests shall be identified by IF or ELISA.
Az IHNV esetében 693 bp méretű PCR-amplikon figyelhető meg.
Other neutralisation tests of proven similar efficacy may be used instead.
A VHSV esetében ez a méret 505 bp.
RT-PCR/RT-qPCR
A PCR eredményei a műveletek elvégzésének körülményeitől függően változhatnak, azaz a használt PCR-készüléktől függően előfordulhat, hogy a hőmérsékleti protokollok optimalizálásra szorulnak.
Preparation of viral RNA
Ezenfelül fals primerkötődés vagy kontamináció miatt előfordulhatnak fals pozitív eredmények.
All work with RNA shall be performed on ice, using gloves.
Ezért a kétségek elkerülése érdekében megfelelő pozitív és negatív kontrollokat és szekvenált amplikonokat is alkalmazni kell.
RNA shall be extracted using the phenol-chloroform method or by RNA affinity spin columns, according to the manufacturer's instructions.
A VHSV-primerek esetében különösen gondosan kell eljárni a BF-2 sejtek használatakor, mivel a primerek reakcióba léphetnek a DNS-/RNS-sejtvonalakkal, és hasonló méretű hamis pozitív eredményeket hozhatnak.
Commercially available RNA extraction kits that will produce high quality RNA suitable for use with the RT-PCR protocols detailed in the points below may be used.
A BF-2 sejtekből származó felülúszó vizsgálatakor az amplifikált PCR-fragmenseket szekvenálni kell.
RNA shall be re-suspended in distilled RNAse-free water, (namely water treated with 0,1 % diethyl pyrocarbonate) or an appropriate elution buffer.
A VHSV esetében alkalmazott RT-qPCR
The following primers shall be used for detection of IHNV:
A VHSV esetén az amplifikációt a következő primerekkel és próbával kell végezni:
Forward Primer 5′-AGA-GAT-CCC-TAC-ACC-AGA-GAC-3′;
reverz primer: 5′-TCT-GCG-ATC-TCA-GTC-AGG-ATG-AA-3′;
Reverse Primer 5′-GGT-GGT-GTT-GTT-TCC-GTG-CAA-3′.
valamint próba: 5′-FAM-TAG-AGG-GCC-TTG-GTG-ATC-TTC-TG-BHQ1.
The following cycles shall be used (one-step RT-PCR): 1 cycle: 50 °C for 30 minutes; 1 cycle: 95 °C for 2 minutes; 30 cycles: 95 °C for 30 seconds, 50 °C for 30 seconds, 72 °C for 60 seconds; 1 cycle: 72 °C for 7 minutes and soak at 4 °C.
Egylépcsős RT-qPCR:
The following primers shall be used for detection of VHSV:
Minden végigfuttatott lemeznek templátnegatív és pozitív kontrollokat is tartalmaznia kell.
VN For 5′-ATG-GAA-GGA-GGA-ATT-CGT-GAA-GCG-3′;
Ciklusparaméterek: 50 °C-on 30 percig, 95 °C-on 15 percig, 40 ciklus 94 °C-on 15 másodpercig, 60 °C-on 40 másodpercig, 72 °C-on 20 másodpercig; szükség esetén kiigazítandó.
VN Rev 5′-GCG-GTG-AAG-TGC-TGC-AGT-TCC-C-3′.
Ehelyett más, igazoltan hasonló hatékonyságú RT-PCR- vagy RT-qPCR-változatok is alkalmazhatók.
The following cycles shall be used (one-step RT-PCR): 50 °C for 30 minutes, 95 °C for 15 minutes, 35 cycles at 94 °C for 30 seconds, 55 °C for 30 seconds, and 68 °C for 60 seconds.
Az IHNV esetében alkalmazott RT-qPCR
Subsequently, the reaction shall be held at 68 °C for 7 minutes.
Az IHNV esetén az amplifikációt a következő primerekkel és próbával kell végezni:
A 693 bp PCR amplicon may be observed for IHNV.
reverz primer: 5′-TTCTTTGCGGCTTGGTTGA-3′;
For VHSV, the size shall be 505 bp.
valamint próba: 5′ 6FAM-TGAGACTGAGCGGGACA-NFQ/MGB.
The results of the PCR may vary depending on the conditions under which it is performed, namely the thermal protocols might need optimisation, depending on the thermal cycler in use.
Kétlépcsős RT-qPCR:
Furthermore, false-positive results may occur because of false primer annealing or laboratory contamination.
Mivel a következő próba kétlépcsős amplifikáción alapul, a fertőzés megakadályozása érdekében a csövek egyik reakcióból a másikba mozgatásakor különös gondossággal kell eljárni.
Adequate positive and negative controls and sequence amplicons shall therefore be included to avoid any doubts.
Ciklusparaméterek (az RT-lépcsőt követően): 50 °C-on 2 percig, 95 °C-on 10 percig, azt követően 40 ciklus 95 °C-on 15 másodpercig és 60 °C-on 1 percig; szükség esetén kiigazítandó.
For the VHSV primers, special care shall be taken when using BF-2 cells, as the primers may react with the cell line DNA/RNA producing false-positive results of similar size.
Járványkitörés gyanúja esetén alkalmazandó, a VHS, az IHN vagy mindkettő gyanújának megerősítésére vagy kizárására szolgáló részletes diagnosztikai módszerek és eljárások
When testing supernatant from BF-2 cells, any amplified PCR fragments shall be sequenced.
Amennyiben a 2006/88/EK irányelv 57. cikke b) pontjának megfelelően laboratóriumi vizsgálat szükséges az IHN, a VHS vagy mindkettő jelenlétének az I. melléklet 1. részének II.3. pontjában meghatározott diagnosztikai módszerekkel történő megerősítéséhez vagy kizárásához, az alábbi részletes diagnosztikai módszerek és eljárások alkalmazandók:
RT-qPCR for VHSV
hagyományos vírusizolálás, majd szérumneutralizáció, valamint immunkémiai vagy molekuláris vírusazonosítás;
For VHSV, amplification shall be performed using the following primers and probe:
RT-PCR vagy RT-qPCR útján végzett víruskimutatás;
Forward primer: 5′-AAA-CTC-GCA-GGA-TGT-GTG-CGT-CC-3′;
egyéb diagnosztikai módszerek, például IFAT, ELISA, RT-PCR, IHC.
Reverse primer: 5′-TCT-GCG-ATC-TCA-GTC-AGG-ATG-AA-3′;
Hagyományos vírusizolálás azt követő vírusazonosítással
and probe: 5′-FAM-TAG-AGG-GCC-TTG-GTG-ATC-TTC-TG-BHQ1.
Minták kiválasztása
One-step RT-qPCR:
Legalább 10, az IHN vagy a VHS tipikus tüneteit mutató halat kell vizsgálatra kiválasztani.
Negative template controls and positive controls shall be included on each plate run.
A hagyományos vírusizolálás céljából történő előkészítéskor és szállításkor az I.2. pontban ismertetett módszereket és eljárásokat kell követni.
Cycling conditions: 50 °C for 30 minutes, 95 °C for 15 minutes, 40 cycles of 94 °C for 15 seconds, 60 °C for 40 seconds, 72 °C for 20 seconds; adjust if necessary.
A kiegészítő diagnosztikai anyag hagyományos vírusizolálás céljából végzett gyűjtésekor az I.3. pontban ismertetett módszereket és eljárásokat kell követni.
Other RT-PCR or RT-qPCR versions of proven similar efficacy may be used instead.
A minták sejttenyészet-vizsgálatra történő előkészítése
RT-qPCR for IHNV
A minták hagyományos vírusizolálás céljából végzett sejttenyészet-vizsgálatra történő előkészítésekor az I.4. pontban ismertetett módszereket és eljárásokat kell követni.
For IHNV, amplification shall be performed using the following primers and probe:
A hagyományos vírusizolálás céljából végzett virológiai vizsgálatkor az I.5. pontban ismertetett módszereket és eljárásokat kell követni.
Forward primer: 5′- AGA-GCC-AAG-GCA-CTG-TGC-G-3′;
A hagyományos vírusizolálás céljából végzett vírusazonosításkor az I.6. pontban ismertetett módszereket és eljárásokat kell követni.
Reverse primer: 5′- TTCTTTGCGGCTTGGTTGA - 3′;
RT-qPCR útján történő víruskimutatás
and probe: 5′ 6FAM-TGAGACTGAGCGGGACA-NFQ/MGB.
A minták RT-qPCR útján végzendő víruskimutatás céljából történő kiválasztásakor az I.1.2. pontban ismertetett módszereket és eljárásokat kell követni.
Two-step RT-qPCR:
Az RT-qPCR útján végzendő víruskimutatás céljából történő előkészítéskor és szállításkor az I.2. pontban ismertetett módszereket és eljárásokat kell követni.
As the following assay depends on a two-step amplification, extra care shall be taken when handling the tubes from one reaction to the other in order to prevent contamination.
A kiegészítő diagnosztikai anyag RT-qPCR útján végzendő víruskimutatás céljából történő gyűjtésekor az I.3. pontban ismertetett módszereket és eljárásokat kell követni.
Cycling conditions (after RT-step): 50 °C for 2 minutes, 95 °C for 10 minutes, followed by 40 cycles of 95 °C for 15 seconds and 60 °C for 1 minutes; adjustments shall be made if necessary.
Minták előkészítése RT-qPCR céljára
Detailed diagnostic methods and procedures for the confirmation of or to rule out the suspicion of VHS or IHN or both in suspected outbreaks
A minták RT-qPCR útján végzendő víruskimutatás céljából történő előkészítésekor az I.6.4.1. pontban ismertetett módszereket és eljárásokat kell követni.
When a laboratory examination is required to confirm or rule out the presence of IHN or VHS or both in accordance with Article 57(b) of Directive 2006/88/EC using the diagnostic methods set out in point II.3 of Part 1 of Annex I, the following detailed diagnostic methods and procedures shall apply:
Az RT-qPCR útján történő víruskimutatáskor az I.6.4.1., I.6.4.3. és I.6.4.4. pontban ismertetett módszereket és eljárásokat kell követni.
conventional virus isolation with subsequent seroneutralisation, immune-chemical or molecular virus identification;
Más diagnosztikai módszerek
virus detection by RT-PCR or RT-qPCR;
Az I.4.3. pontban foglaltak szerint előkészített felülúszó az I.6.1. pontnak megfelelően továbbítható ELISA próbára, az I.6.2. pontnak megfelelően továbbítható indirekt fluoreszcens ellenanyag-vizsgálatra (IFAT), illetve az I.6.4. pontnak megfelelően továbbítható RT-PCR-vizsgálatra.
other diagnostic techniques such as IFAT, ELISA, RT-PCR, IHC.
A szövetminta alávethető más diagnosztikai módszereknek is, például fagyasztott metszeteken végzett IFAT-vizsgálatnak és formalinban fixált szövetmintán végzett immunhisztokémiai vizsgálatnak.
Conventional virus isolation with subsequent virus identification
E gyors módszerek mellett a II.a) vagy a II.b) pontnak megfelelően a mintavételt követő 48 órán belül virológiai vizsgálatot kell végezni, amennyiben:
Selection of samples
negatív eredmény mutatható ki, vagy
At least 10 fish showing typical signs of IHN or VHS shall be selected for examination.
pozitív eredmény mutatható ki a VHS vagy IHN előfordulásának első eseténél vett anyaggal.
The preparation and shipment for the purpose of conventional virus isolation shall follow the methods and procedures laid down in point I.2.
A sejttenyészetek fertőzés iránti fogékonyságának ellenőrzésére irányuló titrálási eljárás
The collection of supplementary material for the purpose of conventional virus isolation shall follow the methods and procedures laid down in point I.3.
A sejttenyészetek fertőzés iránti fogékonyságának ellenőrzésére irányuló, az I.5.3. pontban említett titráláskor az e pont alábbi bekezdéseiben meghatározott eljárások követendők.
Preparation of samples for cell culture examination
Legalább két VHSV- és egy IHNV-izolátumot kell használni.
The preparation of samples for cell culture examination for the purpose of conventional virus isolation shall follow the methods and procedures laid down in point I.4.
Az izolátumoknak az Európai Unión belül előforduló vírusok fő csoportját kell képviselniük, mégpedig a VHSV esetében egy édesvízi, a szivárványos pisztrángból származó kórokozó izolátumát, valamint egy tengeri, a nagy rombuszhalat megbetegítő izolátumot, az IHNV esetében pedig egy, a szivárványos pisztrángot megbetegítő, Európai Unión belüli törzs izolátumát.
The virological examination for the purpose of conventional virus isolation shall follow the methods and procedures laid down in point I.5.
A tagállamokból származó, pontosan meghatározott izolátumokat kell használni.
The virus identification for the purpose of conventional virus isolation shall follow the methods and procedures laid down in point I.6.
Alacsony passzázsszámú sejtkultúrán, sejttenyésztő palackban, a VHSV esetében BF-2 vagy RTG-2 sejteken, az IHNV esetében EPC- vagy FHM-sejteken kell szaporítani a vírustörzseket.
Virus detection by RT-qPCR
Legalább 10 % szérumot tartalmazó sejttenyésztő tápfolyadékot kell használni.
The selection of samples for the purpose of virus detection by RT-qPCR shall follow the methods and procedures laid down in point I.1.2.
A beoltáshoz alacsony MOI érték (< 1) alkalmazandó.
The preparation and shipment for the purpose of virus detection by RT-qPCR shall follow the methods and procedures laid down in point I.2.
Teljes CPE esetén a vírust a sejttenyészet felülúszójának 2000 × g fordulaton, 15 percig végzett centrifugálásával le kell fejteni, 0,45 μm-es membránszűrőn át kell szűrni és megjelölt fagyasztócsövekbe kell adagolni.
The collection of supplementary diagnostic material for the purpose of virus detection by RT-qPCR shall follow the methods and procedures laid down in point I.3.
A vírust – 80 °C-on kell tárolni.
Sample preparation for RT-qPCR
A fagyasztás után egy héttel minden vírusból három párhuzamos ampullát hideg vízben fel kell olvasztani, és azokat a megfelelő sejtvonalon titrálni kell.
The sample preparation for the purpose of virus detection by RT-qPCR shall follow the methods and procedures laid down in point I.6.4.1.
Legalább hathavonként vagy a sejtvonal fogékonysága csökkenésének gyanúja esetén minden vírusizolátumot fel kell olvasztani és titrálni kell.
The virus detection by RT-qPCR shall follow the methods and procedures laid down in points I.6.4.1, I.6.4.3 and I.6.4.4.
A titrálási eljárást részletesen le kell írni és mindig ugyanazon eljárást kell követni.
Other diagnostic techniques
A végpontig történő titrálás során minden hígítási lépésnél legalább hat párhuzamos ampullát kell alkalmazni.
Supernatant prepared as described in point I.4.3 may be submitted to ELISA, Indirect fluorescent antibody test (IFAT), or RT-PCR in accordance with point I.6.1, point I.6.2 or point I.6.4 respectively.
A titereket össze kell hasonlítani a korábban kapott titerekkel.
Tissue material may be subjected to other diagnostic techniques, such as IFAT on frozen sections, immunohistochemistry on formalin fixed tissue material.
Ha a három vírusizolátum bármelyikének titere egy vagy több log2 értékkel csökken az eredeti titerhez képest, akkor a sejtvonal többé nem használható felügyeleti célokra.
Those rapid techniques shall be supplemented with a virological examination in accordance with either point II(a) or point II(b) within 48 hours after sampling, if:
Ha a laboratóriumban különböző sejtvonalakat tartanak, akkor minden vonalat külön-külön vizsgálni kell.
a negative result is obtained; or
A nyilvántartásokat legalább tíz évig meg kell őrizni.
a positive result is obtained with material representing the first case of IHN or VHS.
A KOI-HERPESZVÍRUSBETEGSÉG (KHVD) FELÜGYELETÉRE ÉS MEGERŐSÍTÉSÉRE SZOLGÁLÓ RÉSZLETES DIAGNOSZTIKAI MÓDSZEREK ÉS ELJÁRÁSOK
Procedure for titration to verify the susceptibility of the cell cultures to infection
I. A KHVD jelenlétének megerősítésére vagy gyanújának kizárására szolgáló részletes diagnosztikai módszerek és eljárások
When titration to verify the susceptibility of the cell cultures to infection as referred to in point I.5.3 is carried out, the procedures set out in the following paragraphs of this point shall be followed.
Amennyiben a 2006/88/EK irányelv 57. cikke b) pontjának megfelelően laboratóriumi vizsgálat szükséges a KHVD jelenlétének megerősítéséhez vagy gyanújának az I. melléklet 2. részének III. szakaszában meghatározott diagnosztikai módszerekkel történő kizárásához, az e rész I.1–I.2. pontjában meghatározott részletes diagnosztikai módszerek és eljárások alkalmazandók.
At least two VHSV isolates and one isolate of IHNV shall be used.
A halakból származó minták előkészítése
The isolates shall represent the major group of viruses within the European Union, namely for VHSV one pathogenic isolate from rainbow trout in freshwater and one marine isolate pathogenic for turbot, and for IHNV one rainbow trout pathogenic strain from the European Union.
Diagnosztikai célra a halak elküldhetők élve vagy leölve, lezárt aszeptikus tárolóedényekbe külön-külön csomagolva, illetve alternatív megoldásként 80–100 %-os alkoholban vagy vírusszállító tápfolyadékban tartósított (a begyűjtést követően 48 órán belül feldolgozandó) fagyasztott szervek vagy szervdarabok is felhasználhatók a hagyományos PCR- vagy qPCR-alapú módszerekkel végzett vizsgálathoz.
Well-defined isolates from the Member States shall be used.
A KHV kimutatásához kopoltyút és vesét kell gyűjteni; ezenfelül lép, agyvelő és bél kerülhet egy további külön mintába.
Batches of virus in low cell culture passage numbers shall be propagated in cell culture flasks on BF-2 or RTG-2 cells for VHSV and on EPC or FHM cells for IHNV.
Akut esetekben legfeljebb öt halból származó szövetminta összevonható.
Cell culture medium with at least 10 % serum shall be used.
Ezen túlmenően egyes esetekben nem letális minták, például vér, kopoltyúból vett tamponminták, kopoltyúbiopsziás minta és nyálkahártya-kaparék is felhasználható (azaz a KHV jelenlétének gyanúja esetén nagyon értékes halak is felhasználhatók).
Low MOI for inoculation (< 1) shall be used.
DNS-kivonás
At total CPE, the virus shall be harvested by centrifugation of cell culture supernatant at 2000 × g for 15 minutes, filter sterilised through 0,45 μm membrane filter and distributed in labelled cryotubes.
A DNS kivonását szabványműveleti eljárásoknak megfelelően kell végezni.
The virus shall be kept at – 80 °C.
Az I.2. pontban említett PCR-protokollokkal való felhasználásra alkalmas kiváló minőségű DNS-t előállító, kereskedelmi forgalomban kapható DNS-kivonási készletek használata megengedett.
1 week after freezing, three replicate vials with each virus shall be thawed under cold water and titrated on their respective cell lines.
Polimeráz láncreakción (PCR) alapuló kórokozó-kimutatás és -azonosítás
At least every 6 months, or if it is suspected that the susceptibility of a cell line has decreased, each virus isolate shall be thawed and titrated.
I.2.1.
Titration procedures must be described in detail and the same procedure followed each time.
KHV-kimutatásra szolgáló qPCR
Titration by end point dilution shall include at least six replicates at each dilution step.
A KHV qPCR útján történő kimutatásához az alábbi qPCR-próba alkalmazandó:
The titres shall be compared with previously obtained titres.
forward primer (KHV-86f): 5′-GACGCCGGAGACCTTGTG-3′;
If the titre of any of the three virus isolates drops by a factor of 2 logs or more, compared with the initial titre, the cell line shall no longer be used for surveillance purposes.
reverz primer (KHV-163r): 5′-CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT-3′;
If different cell lines are kept in the laboratory each line shall be examined separately.
valamint próba (KHV-109p): 5′-FAM-CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG-3′.
Records shall be kept for a period of at least 10 years.
Ciklusparaméterek: 1 ciklus 95 °C-on 15 percig, azt követően 40 ciklus 94 °C-on 15 másodpercig és 60 °C-on 60 másodpercig.
DETAILED DIAGNOSTIC METHODS AND PROCEDURES FOR THE SURVEILLANCE AND CONFIRMATION OF KHV DISEASE (KHVD)
Ehelyett más, igazoltan hasonló hatékonyságú qPCR-változatok is alkalmazhatók.
I. Detailed diagnostic methods and procedures for the confirmation of the presence of or to rule out the suspicion of KHVD
KHV-kimutatásra szolgáló hagyományos PCR