natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Test samples
Titráláshoz készítsünk kétszeres hígítási sort 1:25 aránytól kezdve (lyukanként 100 μl), a lemez minden oszlopában egy szérumból, majd ugyanezt a pozitív és negatív kontrollszérumból is.
Serum samples to be tested, and positive and negative control sera, are diluted 1 in 25 in PBS + 5 % (w/v) skimmed milk + 0,05 % (v/v) Tween 20, 100 μl per well.
Konjugátum
Incubate for 1 hour at 37 °C.
Adagoljunk lyukanként 100 μl-nyi, PBS, 5 % tej és 0,05 % Tween-20 7,2 pH értékű keverékében hígított torma-peroxidázzal (HRP) konjugált anti-ló gamma-globulint.
For titration, make a twofold dilution series from 1 in 25 (100 μl/well), one serum per plate column, and do the same with positive and negative controls.
Kromogén/szubsztrát
Conjugate
Adjunk mindegyik lyukhoz 200 μl kromogén-/szubsztrátoldatot (10 ml 80,6 mM DMAB (dimetil-aminobenzaldehid) + 10 ml 1,56 mM MBTH (3-metil-2-benzo-tiazolin hidrazon hidroklorid) + 5 μl H2O2).
Dispense 100 μl/well of horseradish-peroxidase (HRP) -conjugated anti-horse gamma-globulin diluted in PBS + 5 % milk + 0,05 % Tween 20, pH 7,2.
A színképződést kb. 5–10 perccel később 50 μl 3N H2SO4 hozzáadásával állítjuk le (mielőtt a negatív kontrollszérum elszíneződne).
Chromogen/Substrate
Más kromogének is alkalmazhatók, mint pl. az ABTS (2,2′-azino-bisz-[3-etilbenzotiazolin-6-szulfonsav]), TMB (tetra-metil benzidin) vagy az OPD (orto-fenildiamin).
Add 200 μl/well of chromogen/substrate solution (10 ml of 80,6 mM DMAB (dimethyl aminobenzaldehyde) + 10 ml of 1,56 mM MBTH (3-methyl-2-benzo-thiazoline hydrazone hydrochlorid) + 5 μl H2O2).
Olvassuk le a lemezeket 600 (vagy 620) nm-en.
Colour development is stopped by adding 50 μl of 3N H2SO4 after approximately 5 to 10 minutes (before the negative control begins to be coloured).
Az eredmények értékelése
Other chromogens such as ABTS (2,2′-Azino-bis-[3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid]), TMB (tetramethyl benzidine), or OPD (ortho-phenyldiamine) can also be used.
A küszöbértéket úgy számítjuk ki, hogy 0,06-ot hozzáadunk a negatív kontroll értékéhez (0,06 a standard szórás 30 negatív szérumból származtatva).
Read the plates at 600 nm (or 620 nm).
A küszöbértéknél alacsonyabb abszorpciós értéket mutató vizsgált mintákat negatívnak tekintjük.
Interpretation of the results
A küszöbérték + 0,15-nél nagyobb abszorpciós értéket mutató vizsgált mintákat pozitívnak tekintjük.
Calculate the cut-off value by adding 0,06 to the value of the negative control (0,06 is the standard deviation derived with a group of 30 negative sera).
A köztes abszorpciós értéket mutató vizsgált minták kétesnek tekintendők, ezért egy második technikát kell alkalmazni az eredmények megerősítéshez.
Test samples giving absorbance values lower than the cut-off are regarded as negative.
Az afrikai lópestis vírusával (ALPV) szemben termelt ellenanyagok kimutatására szolgáló blokkoló ELISA próba
Test samples giving absorbance values greater than the cut-off + 0,15 are regarded as positive.
A kompetitív blokkoló ELISA próba specifikus ALPV-ellenes antitestek detektálására szolgál a lófélék bármely fajából származó szérumban, ideértve a lovakat, szamarakat, zebrát és azok keresztezéseit, megkerülve az indirekt ELISA próbák során alkalmanként tapasztalt specificitási problémát.
Test samples giving intermediate absorbance values are considered to be inconclusive and a second technique must be employed to confirm the result.
A vizsgálat elve az ELISA-lemezhez kötött rekombináns VP7-fehérje és a konjugált, ALP-VP7-specifikus monoklonális ellenanyag (mea) közötti reakció megszakításán alapul.
Blocking ELISA for the detection of antibodies to African horse sickness virus (AHSV)
A vizsgálandó szérumban lévő ellenanyagok gátolják az antigén és a mea közötti reakciót, ami a színintenzitás csökkenését fogja eredményezni.
The competitive blocking ELISA is designed to detect specific AHSV antibodies in sera from animals of any equine species, i.e. horses, donkeys, zebra and their crosses, preventing the problem of specificity experienced occasionally using the indirect ELISAs.
Mivel a mea a VP7 ellen irányul, a próba érzékenysége és specificitása magas fokú.
The principle of the test is the blocking of the reaction between the recombinant VP7 protein absorbed to the ELISA plate and a conjugated AHS-VP7 specific monoclonal antibody (Mab).
A kompetitív blokkoló ELISA próba kereskedelmi forgalomban kapható.
Antibody in the test sera will block the reaction between the antigen and the Mab resulting in a reduction in colour.
Szilárd fázis
Because the Mab is directed against the VP7, the assay will give a high level of sensitivity and specificity.
Az ELISA-lemezeket 9,6 pH-értékű karbonát/bikarbonát pufferoldatban hígított, 50-100 ng mennyiségű rekombináns ALPV-4 VP7-tel vonjuk be.
The competitive blocking ELISA is commercially available.
A lemezeket egy éjszakán át inkubáljuk 4 °C-on.
Solid Phase
A lemezeket háromszor kimossuk 0,135 M NaCl-ot és 0,05 % (v/v) Tween-20-at tartalmazó, 0,1× foszfáttal pufferelt sóoldattal (PBST).
Coat ELISA plates with 50-100 ng of recombinant AHSV-4 VP7 diluted in carbonate/bicarbonate buffer, pH 9,6.
Finoman ütögessük a lemezeket nedvszívó anyaghoz, hogy a rajtamaradt oldatot eltávolítsuk.
Incubate overnight at 4 °C.
Vizsgálandó minták és kontrollok
Wash the plates three times with phosphate buffered saline (PBS) 0,1× containing 0,135 M NaCl and 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST).
A vizsgálandó szérummintákat, valamint a pozitív és negatív kontrollszérumokat 1:5 arányban 0,35 M NaCl, 0,05 % (v/v) Tween-20 és 0,1 % Kathon lyukanként 100 μl-nyi keverékében hígítjuk.
Gently tap the plates on to absorbent material to remove any residual wash.
Titráláshoz készítsünk a vizsgálandó szérumokból kétszeres hígítási sort 1:10 aránytól 1:280 arányig 8 lyukban (lyukanként 100 μl), a lemez minden oszlopában egy szérumból, majd ugyanezt a pozitív és negatív kontrollszérumból is.
Test samples and controls
Egy órán át 37 °C-on inkubáljuk.
Serum samples to be tested, and positive and negative control sera, are diluted 1 in 5 in diluent containing 0,35 M NaCl, 0,05 % (v/v) Tween 20 and 0,1 % Kathon, 100 μl per well.
A lemezeket ötször kimossuk 0,135 M NaCl-ot és 0,05 % (v/v) Tween-20-at tartalmazó, 0,1× foszfáttal pufferelt sóoldattal (PBST).
For titration, make a twofold dilution series of the test sera from 1 in 10 to 1 in 280 across 8 wells (100 μl/well), one serum per plate column, and do the same with positive and negative controls.
Adagoljunk lyukanként 100 μl-nyi, torma-peroxidázzal konjugált mea anti-VP7-et.
Incubate for 1 hour at 37 °C.
Előzetesen ezt a mea-t 1/5000–1/15000 arányban hígították StabiliZyme Select® Stabilizer (SurModics.
Wash the plates five times with phosphate buffered saline (PBS) 0,1× containing 0,135 M NaCl and 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST).
Referencia: SZ03) és desztillált víz 1/1 arányú oldatában.
Dispense 100 μl/well of horseradish peroxidase-conjugated Mab anti-VP7.
30 percig 37 °C-on inkubáljuk.
In advance, this Mab has been diluted 1/5000-1/15000 in a 1/1 solution of StabiliZyme Select® Stabilizer (SurModics.
Leolvasás
Add 100 μl/well chromogen/substrate solution, i.e. 1 ml of ABTS (2,2′-Azino-bis-[3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid]) 5 mg/ml + 9 ml of substrate buffer (0,1 M Phosphate-Citrate buffer of pH 4 containing 0,03 % H2O2), and incubate for 10 minutes at room temperature.
Eakontroll
Colour development is stopped by adding 100 μl/well of 2 % (w/v) SDS (sodium dodecyl sulphate).
Eaminta
Reading
Az 50 %-nál magasabb BSz értéket mutató minták ALPV ellenanyagokra pozitívnak tekintendők.
Read at 405 nm in an ELISA reader.
A 45 %-nál alacsonyabb BSz értéket mutató minták ALPV ellenanyagokra negatívnak tekintendők.
Determine the blocking percentage (BP) of each sample by applying the following formula, where “Abs” stands for antibodies:
A 45-50 % közötti BSz értékeket mutató minták kétesnek tekintendők, és újra kell azokat vizsgálni.
Abscontrol
Amennyiben az eredmény ismételten kétes, a kétes minta vételétől számított legalább két hét elteltével az állatoktól újabb mintát kell venni.
Abssample
B. RÉSZ
Samples showing a BP value higher than 50 % should be considered as positive for AHSV antibodies.
A kórokozó azonosítása
Samples showing a BP value lower than 45 % should be considered as negative for AHSV antibodies.
Valós idejű reverz transzkripciós polimeráz láncreakció (rRT-PCR)
Samples showing a BP value between 45 % and 50 % should be considered as inconclusive and must be retested.
A nukleinsav módszereken alapuló kórokozó azonosító vizsgálatoknak az ALPV kilenc szerotípusából származó referencia törzseket kell felismernie.
If the result is again inconclusive, the animals should be retested on samples taken not earlier than two weeks after the sample which was considered to be inconclusive was taken.
A 2.1. pontban leírt módszer „A szárazföldi állatoknál alkalmazott diagnosztikai vizsgálatok és vakcinák kézikönyve”, 2016-os kiadása 2.5.1. fejezete B. szakaszának 1.2. pontján alapul, ahogy azt 2012 májusában elfogadta az OIE delegáltak világtalálkozója.
PART B
A minták – legyen az vér vagy lép – vizsgálatára használt, bármely RT-PCR detektálási módszernek a 2009/156/EK irányelv szerint a 2. pontban leírt módszertanokéval azonos érzékenységet kell teljesítenie vagy meghaladnia azt.
Identification of the agent
Az 1–9 szerotípusú referenciatörzsekbe tartozó inaktivált vírusok az Európai Unió referencialaboratóriumától, illetve az OIE afrikai lópestissel foglalkozó referencialaboratóriumától (Algete, Spanyolország) szerezhetők be.
Real-time Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction (rRT-PCR)
A vírus RNS extrakciója
Agent identification tests based on nucleic acid methods must detect reference strains from the nine virus serotypes of the AHSV.
A jó reakció biztosítása érdekében magas minőségű ALPV RNS kinyerése szükséges a mintából.
The method described in point 2.1 is based on point 1.2 of Section B in Chapter 2.5.1 of the Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, Edition 2016 as adopted by the World Assembly of Delegates of the OIE in May 2012.
A klinikai mintákból a nukleinsavak extrakciója számos házon belüli és kereskedelmi forgalomban kapható módszer segítségével végezhető.
Any RT-PCR detection method used for the testing of samples, either blood or spleen, in the context of Directive 2009/156/EC must perform equal to or exceed the sensitivity of the methodologies described in point 2.
A kereskedelmi készletek különböző megközelítéseket alkalmaznak az RNS izoláláshoz.
Inactivated virus of serotypes 1 to 9 reference strains may be obtained from the European Union Reference Laboratory or the OIE Reference Laboratory for African horse sickness, Algete, Spain.
Legnagyobb részük az alábbi eljárások valamelyikén alapul:
Extraction of viral RNA
a nukleinsavak fenol-kloroform extrakciója;
To assure a good reaction it is necessary to extract from the sample an AHSV RNA of high quality.
a nukleinsavak adszorpciója egy filter rendszerre;
The extraction of nucleic acids from clinical samples can be performed by a variety of in-house and commercially available methods.
a nukleinsavak adszorpciója egy mágneses gyöngy-rendszerre;
Commercial kits use different approaches for RNA isolation.
A házon belüli RNS extrakció egy példája az alábbiakban található:
Most are based on one of the following procedures:
1 g szövetmintát 1 ml denaturáló oldatban (4 M guanidium-tiocianát, 25 mM nátrium-citrát, 0,1 M 2-merkaptoetanol, 0,5 % sarcosyl) homogenizálunk.
Phenol-chloroform extraction of nucleic acids;
A centrifugálást követően a felülúszóhoz hozzáadjuk 1 μg élesztő RNS, 0,1 ml 2 M-os, 4 pH-értékű nátrium-acetát, 1 ml fenol és 0,2 ml kloroform/izoamil-alkohol keverékét (49/1).
Adsorption of nucleic acids to filter system;
A szuszpenziót erősen felrázzuk, majd 15 percig jégen hűtjük.
Adsorption of nucleic acids to magnetic beads system.
A centrifugálást követően a vizes fázisban jelenlévő RNS-t fenollal kivonjuk, etanollal precipitáljuk, majd steril vízben újraszuszpendáljuk.
An example of an in-house RNA extraction is given below:
Valós idejű RT-PCR eljárás
1 g of tissue sample is homogenised in 1 ml of denaturing solution (4 M guanidium thiocyanate, 25 mM sodium citrate, 0,1 M 2-mercaptoethanol, 0,5 % sarcosyl).
Csoport-specifikus valós idejű RT-PCR Agüero et al., 2008 szerint [3]
After centrifugation, 1 μg of yeast RNA, 0,1 ml of 2 M sodium acetate pH 4, 1 ml of phenol and 0,2 ml of chloroform/isoamyl alcohol mixture (49/1) are added to the supernatant.
Ez a csoportspecifikus valós idejű RT-PCR az ALPV VP7 fehérjéjét célozza meg, és képes detektálni minden ismert, jelenleg cirkuláló ALPV szerotípust és törzset.
The suspension is vigorously shaken and cooled on ice for 15 minutes.
Az ALPV vírusfajok detektálásához a primer és próba szekvenciák az alábbiak:
After centrifugation, the RNA present in the aqueous phase is phenol extracted, ethanol precipitated and resuspended in sterile water.
MGB-TaqMan próba 5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′
Real-time RT-PCR Procedure
A primer törzskoncentrációt 8 μM munkakoncentrációra hígítjuk („8 μM primer munkatörzs”), a próbát pedig 50 μM munkakoncentrációra hígítjuk („50 μM próba munkatörzs”).
This group-specific real-time RT-PCR targets VP7 of the AHSV and is able to detect all known AHSV serotypes and strains currently circulating.
A tervet használva útmutatóként, minden egyes 8 μM-os primer törzsoldatból 2,5 μl-nyit (végső koncentráció 1 μM) hozzáadunk minden egyes lyukhoz, amely RNS mintákat, pozitív és/vagy negatív kontrollokat fog tartalmazni (a primer oldat végső koncentrációja 1 μM 20 μl RT-PCR oldatban).
Primer and probe sequences for the detection of AHSV species viruses:
Ezt a keveréket 5 percig 95 °C-ra hevítve denaturáljuk, ezt gyors hűtés követi a jégen legalább 5 percig.
forward Primer 5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′
A vizsgálandó minták számára megfelelő mennyiségű valós idejű egylépcsős RT-PCR mesterkeveréket készítünk a gyártó utasításait követve.
reverse Primer 5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′
Minden RNA-mintát tartalmazó lyukhoz 0,1 μl 50 μM-os próba törzsoldatot adunk (a próbaoldat koncentrációja 0,25 μM minden RNA-mintát tartalmazó lyuk esetében).
MGB-TaqMan probe 5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′
A valós idejű egylépcsős RT-PCR mesterkeverékből 13 μl-nyit oszlatunk el minden egyes lyukban a denaturált primereket és RNS-t tartalmazó PCR lemezen.
Primer stock concentration is diluted to a working concentration of 8 μM (“primer working stock 8 μM”) whereas probe is diluted to a working concentration of 50 μM (“probe working stock 50 μM”).
A lemezt egy reverz transzkripcióra és cDNS amplifikációra/fluoreszcencia detektálásra programozott valós idejű thermal cycler-be helyezzük.
A test plate layout should be designed and loaded into the real time PCR machine software.
Az amplifikációs körülmények a következőkből állnak: első reverz transzkripciós lépés 48 °C-on 25 percig, majd 10 percig 95 °C-on („forró start”), ezután egy 95 °C-on 15 másodpercből, 55 °C-on 35 másodpercből és 72 °C-on 30 másodpercből álló ciklus 40-szer ismételve (vagy 40 ciklusnyi 97 °C 2 másodpercig és 55 °C 30 másodpercig, amennyiben gyors reakciókat lehetővé tevő reagenseket és a termocyler-t használnak).
Using the layout as a guide, 2,5 μl of each primer working stock 8 μM is added to each well that will contain RNA samples, positive and/or negative controls (final concentration of the primer will be 1 μM in the 20 μl RT-PCR mix).
A fluoreszcencia adatokat az 55 °C-os lépés végén vesszük fel.
The plate is held on ice.
A vizsgálat érvénytelennek tekintendő, ha atípusos amplifikációs görbéket kaptunk, és meg kell azt ismételni.
2 μl of isolated RNA (test samples and positive control), or 2 μl of RNAse-free water in negative reaction controls, is mixed with forward and reverse primers.
A minták pozitívnak tekintendők, ha a Ct érték (azon ciklus száma, amelynél a reakcióban generált fluoreszcencia meghaladja a fluoreszcencia küszöbértéket) kisebb vagy egyenlő a meghatározott Ct küszöbértékkel (35) 40 PCR cikluson belül (Ct ≤ 35).
This mixture is denatured by heating at 95 °C for 5 minutes, followed by rapid cooling on ice for at least 5 minutes.
A minták kétesnek tekintendők, ha a Ct érték magasabb mint a meghatározott Ct küszöbérték (35) 40 PCR cikluson belül (Ct > 35).
An appropriate volume of real time one-step RT-PCR master mix for the number of samples to be tested is prepared following manufacturer's instructions.
A minták negatívnak tekintendők, ha egy horizontális amplifikációs görbét nyerünk, amely nem keresztezi a küszöbvonalat 40 PCR cikluson belül.
0,1 μl of probe working stock 50 μM is added to each well containing RNA samples (final concentration of the probe will be 0,25 μM in each well containing RNA samples).
Csoport-specifikus valós idejű RT-PCR Guthrie et al., 2013 szerint [4]
13 μl of real time one-step RT-PCR master mix is distributed in each well on the PCR plate containing the denatured primers and RNA.
Fluoreszcencia rezonancia energia transzfer (FRET) próbákat használó valós idejű RT-PCR az ALPV nukleinsav detektálására.
The plate is placed in a real time thermal cycler programmed for reverse transcription and cDNA amplification/fluorescence detection.
A leírt ALPV RT-PCR vizsgálatot úgy tervezték, hogy az ALPV számos, jelenleg cirkuláló vad törzséből származó szekvenciát használjon (Quan et al., 2010 [5]).
Amplification conditions consist of a first reverse-transcription step at 48 °C for 25 minutes, followed by 10 minutes at 95 °C (“hot start”) and 40 cycles of 15 seconds at 95 °C, 35 seconds at 55 °C and 30 seconds at 72 °C (or 40 cycles at 97 °C for 2 seconds and 55 °C for 30 seconds if reagents and thermocycler allowing fast reactions are used).
Védett szintetikus külső kontrolltesztet is magában foglal a vizsgálati elemek megfelelő működésének verifikálása céljából.
Fluorescence data are acquired at the end of the 55 °C step.
Az egylépcsős valós idejű PCR-hoz való készletek kereskedelmi forgalomban kaphatók.
The assay is considered not valid if atypical amplification curves are obtained, and must be repeated.
Az alábbiakban néhány alaplépés látható a Guthrie et al.
Samples are considered positives, if the Ct value (cycle number at which the fluorescence generated within a reaction crosses the fluorescence threshold) is lower than or equal to the defined Ct threshold (35) within 40 PCR cycles (Ct ≤ 35).
által leírtaknak megfelelően, amelyek módosíthatók a helyi/esetspecifikus igények, a használt készletek és a rendelkezésre álló készülékek függvényében
Samples are considered inconclusive, if the Ct value is higher than the defined Ct threshold (35) within 40 PCR cycles (Ct > 35).
MGB-TaqMan próba 5′-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3′
Samples are considered negative, if a horizontal amplification curve is obtained which does not cross the threshold line within 40 PCR cycles.
A primer és próba keverék törzsoldatokat 25x, 5 μΜ-os koncentrációban készítjük el a forward és reverse primerek esetén, 3 μΜ-osan pedig a próba esetében.
Group-specific real-time RT-PCR by Guthrie et al., 2013 [4]
Alakítsunk ki egy tesztlemez tervet és töltsük be azt a valós idejű PCR készülék szoftverébe.
Real-time RT-PCR using fluorescence resonance energy transfer (FRET) probes to detect nucleic acid of AHSV.
A tervet használva útmutatóként, RNS mintákból 5 μl-t, beleértve a tesztmintákat, valamint pozitív és negatív kontrollokat, hozzáadunk a lemez megfelelő lyukaihoz a tervet követve.
The AHSV RT-PCR assay described was designed using sequences from a wide variety of currently circulating field strains of AHSV (Quan et al., 2010 [5]).
Az RNS-t 5 percig 95 °C-ra hevítve denaturáljuk, ezt gyors hűtés követi a jégen legalább 3 percig.
It also incorporates a proprietary synthetic external control assay to verify proper functioning of the assay components.
A vizsgálandó minták számára megfelelő mennyiségű valós idejű egylépcsős RT-PCR mesterkeveréket készítünk a gyártó utasításait követve.
, which can be modified depending upon local/case-specific requirements, kits used and equipment available.
A lemezt egy reverz transzkripcióra és cDNS amplifikációra/fluoreszcencia detektálásra programozott valós idejű thermal cycler-be helyezzük a gyártó javaslata szerint.
forward Primer 5′-AGA-GCT-CTT-GTG-CTA-GCA-GCC-T-3′
Az amplifikációs körülmények például a következőkből állnak: első reverz transzkripciós lépés 48 °C-on 10 percig, majd 95 °C-on 10 percig, ezután 95 °C-on 15 másodpercből és 60 °C-on 45 másodpercből álló ciklus 40-szer ismételve.
reverse Primer 5′-GAA-CCG-ACG-CGA-CAC-TAA-TGA-3′
A minták pozitívnak tekintendők, ha a normalizált fluoreszcencia az AHSV RT-PCR vizsgálatnál meghaladja a 0,1-es küszöböt 36 PCR cikluson belül a minta összes replikátumában.
MGB-TaqMan probe 5′-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3′
A minták kétesnek tekintendők, ha a normalizált fluoreszcencia az AHSV RT-PCR vizsgálatnál meghaladja a 0,1-es küszöböt 36-40 PCR ciklus között a minta bármely replikátumában.
Primer and probe mix stock solutions are made up in a 25× concentration at 5 μΜ for the forward and reverse primers and 3 μΜ for the probe.
A minták negatívnak tekintendők, ha a normalizált fluoreszcencia az RT-PCR vizsgálatnál nem haladta meg a 0,1-es küszöböt 40 PCR cikluson belül a minta összes replikátumában, és ha a normalizált fluoreszcencia a védett szintetikus külső kontrollteszt esetében meghaladja a 0,1-es küszöböt 33 PCR cikluson belül.
A test plate layout should be designed and loaded into the real-time PCR machine software.
CRC Press, Boca Raton, Florida, USA, 646–650.
Using the layout as a guide, 5 μl of RNA samples, including test samples and positive and negative controls, are added to appropriate wells of the plate following the layout.
Methods, 125 (1), 55–65.
The RNA is denatured by heating at 95 °C for 5 minutes, followed by rapid cooling on ice for at least 3 minutes.
Methods 167, 45–52.
An appropriate volume of real-time one-step RT-PCR master mix for the number of samples to be tested is prepared, following the manufacturer's instructions.
Továbbá az Európai Unió tagállamai nemzeti referencialaboratóriumainak többsége valós idejű RT-PCR módszereket alkalmaz, az afrikai lópestis diagnózisára is, amely módszerek a célnak megfelelőnek bizonyultak a 2009–2014 között végzett éves jártassági vizsgálati gyakorlatokban.
1 μl of 25× primer probe mix stock solution (from point 2.2.1 above) is included in the master mix to give a final concentration in each well of 200 nM for each primer and 120 nM of the probe.
A jelentés arra is rámutatott, hogy az Unión kívül számos OIE referencialaboratórium és egyéb, specifikus afrikai lópestis tapasztalattal bíró laboratórium létezik, amelyek legalább egy valós idejű RT-PCR módszert bevezettek az afrikai lópestis genom detektálására.
20 μl of the master mix is distributed in each well on the PCR plate containing the denatured RNA.
Mindegyik lyukhoz hozzáadunk 100 μl kromogén-/szubsztrátoldatot (1 ml ABTS (2,2′-azino-bisz-[3-etilbenzotiazolin-6-szulfonsav]), 5 mg/ml, + 9 ml szubsztrát puffer (0,1 M 4 pH-értékű, 0,03 % H2O2-t tartalmazó foszfát-citrát puffer), és 10 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk.
The plate is placed in a real-time thermal cycler programmed for reverse transcription and cDNA amplification/fluorescence detection as suggested by the manufacturers.
A színképződést lyukanként 100 μl 2 % (w/v) SDS (nátrium-dodecil-szulfát) hozzáadásával állítjuk le.
Amplification conditions consist of, for example, a first reverse-transcription step at 48 °C for 10 minutes, followed by 10 minutes at 95 °C and 40 cycles of 15 seconds at 95 °C and 45 seconds at 60 °C.
Nagyon jó eredményekkel alkalmazták ezt a módszert az Európai Unió tagállamainak résztvevő nemzeti referencialaboratóriumai az Európai Unió referencialaboratóriuma által 2009-2015 közötti időszakban évente szervezett jártassági teszteken.
Samples are considered positives, if the normalised fluorescence for the AHSV RT-PCR assay exceeds a 0,1 threshold within 36 PCR cycles in all replicates of a sample.
Ezenfelül az OIE referencialaboratóriumok hálózata keretében 2015-ben szervezett nemzetközi körvizsgálatban ezt a protokollt nagyon magas helyre sorolták a többi között.
Council Decision (EU) 2016/1841
A Tanács (EU) 2016/1841 határozata