natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Hutchinson, S. Maddix, and H. Trip (1999), “An in vivo testing system for endocrine disruptors in fish early life stages using induction of vitellogenin”, Environmental Toxicology and Chemistry 18, pp. 337-347.
Metszeteket vágunk le a blokkból mindaddig, amíg egy olyan »szalagot« nem állítunk elő, amely legalább egy elfogadható, az ivarmirigyeket is magában foglaló metszetet tartalmaz.
Pedersen, and P. Bjerregaard (2001a), “Development of an ELISA for vitellogenin in whole body homogenate of zebrafish (Danio rerio)”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 130, pp. 119-131.
(Szükség esetén a szeletelés során a blokkot el lehet távolítani a befogóból, és jégre tenni a szövet beáztatása céljából, majd visszatenni a befogóba.)
Andersen, L., P. Bjerregaard, and B. Korsgaard (2003), “Vitellogenin induction and brain aromatase activity in adult male and female zebrafish exposed to endocrine disrupters”, Fish Physiology and Biochemistry 28, pp. 319-321.
c.
Petersen (2003), “Gonad development and vitellogenin production in zebrafish (Danio rerio) exposed to ethinylestradiol and methyltestosterone”, Aquatic Toxicology 65, pp. 397-411.
A metszeteket a vízfürdőben lévő víz felszínén lebegtetjük.
Tyler (2002), “Utility of a juvenile fathead minnow screening assay for detecting (anti-)estrogenic substances”, Environmental Toxicology and Chemistry 21, pp. 319-326.
Megkísérlünk legalább egy olyan metszetet készíteni, amely nem tartalmaz gyűrődéseket és nincs alatta levegőbuborék.
Wang (2007), “Toxicity of the aromatase inhibitor letrozole to Japanese medaka (Oryzias latipes) eggs, larvae and breeding adults”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 145, pp. 533-541.
d.
LeBlanc, and C.V.Sullivan (1999), “Fathead minnow (Pimephales promelas) vitellogenin: purification, characterization and quantitative immunoassay for the detection of estrogenic compounds”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 123, pp. 113-125.
A mikroszkóplemezt a legjobb metszet alá merítjük, és a tárgylemezzel kiemeljük a vízből.
Porcher (2002), “Development and validation of an enzyme-linked immunosorbent assay to measure vitellogenin in the zebrafish (Danio rerio)”, Environmental Toxicology and Chemistry 21, pp. 1699-1708.
Ezt a folyamatot nevezik a metszet tárgylemezre való »ragasztásának«.
Hatano, H. Mizukami, M. Yamashita, R. Sakakibara, and E. Tamiya (2002), “Development and application of a monoclonal antibody-based sandwich ELISA for quantification of Japanese medaka (Oryzias latipes) vitellogenin”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 132, pp. 161-169.
e.
Bengtsson (2004), “The juvenile three-spined stickleback (Gasterosteus aculeatus L.) as a model organism for endocrine disruption — II — kidney hypertrophy, vitellogenin and spiggin induction”, Aquatic Toxicology 70, pp. 311-326.
Egy haltételből három metszetet készítünk.
Tatarazako, N., M. Koshio, H. Hori, M. Morita, and T. Iguchi (2004), “Validation of an enzyme-linked immunosorbent assay method for vitellogenin in the medaka”, Journal of Health Science 50, pp. 301-308.
A második és harmadik metszetet az első metszetet követő 50 mikronos intervallumonként készítjük.
Eidem, J.K., H. Kleivdal, K. Kroll, N. Denslow, R. van Aerle, C. Tyler, G. Panter, T. Hutchinson, and A. Goksoyr (2006), “Development and validation of a direct homologous quantitative sandwich ELISA for fathead minnow (Pimephales promelas) vitellogenin.
Ha a halak nem úgy lettek beágyazva, hogy az ivarmirigyeik ugyanazon a metszésszinten legyenek, több metszetet kell készíteni annak érdekében, hogy legalább hat olyan metszetet nyerjünk minden egyes halból, amelyek tartalmazzák az ivarmirigyeket.
Ankley (2006), “Evaluation of a commercial kit for measuring vitellogenin in the fathead minnow (Pimephales promelas)”, Ecotoxicology and Environmental Safety 64, pp. 101-105.
A tárgylemezre megfelelő filctollal ráírjuk annak a blokknak a számát, amelyből a tárgylemez készült.
Holbech, H., Petersen, G. I., Norman, A., Örn, S, Norrgren, L., and Bjerregaard, P (2001b), “Suitability of zebrafish as test organism for detection of endocrine disrupting chemicals.
g.
Comparison of vitellogenin in plasma and whole body homogenate from zebrafish (Danio rerio) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)”, Nordic Council of Ministers, TemaNord 2001:597, pp. 48-51.
A tárgylemezt egy festőállványba helyezzük.
Porcher, and A. Goksoyr (2004), “Development of quantitative vitellogenin-ELISAs for fish test species used in endocrine disruptor screening”, Analytical and Bioanalytical Chemistry 378, pp. 621-633.
h.
Orn, S., S. Yamani, and L. Norrgren (2006), “Comparison of vitellogenin induction, sex ratio, and gonad morphology between zebrafish and Japanese medaka after exposure to 17 alpha-ethinylestradiol and 17 beta-trenbolone”, Archives of Environmental Contamination and Toxicology 51, pp. 237-243.
A blokkot eltávolítjuk a befogóból és vágófelülettel lefelé helyezzük tárolás céljából.
Scholz, S. and N. Kluver (2009), “Effects of Endocrine Disrupters on Sexual, Gonadal Development in Fish, Sexual Development 3”, pp. 136-151.
Festés, fedőlemez ráhelyezése és a tárgylemez felcímkézése
Fenske, M., G. Maack, C. Schafers, and H. Segner (2005), “An environmentally relevant concentration of estrogen induces arrest of male gonad development in zebrafish, Danio rerio”, Environmental Toxicology and Chemistry 24, pp. 1088-1098.
A metszetek kórszövettani vizsgálathoz történő megfestése.
Nagahama (2004), “Two DM domain genes, DMY and DMRT1, involved in testicular differentiation and development in the medaka, Oryzias latipes”, Developmental Dynamics 231, pp. 518-526.
A felragasztott és festett szövetek tartós lezárása.
Shinomiya, A., H. Otake, K. Togashi, S. Hamaguchi, and M. Sakaizumi (2004), “Field survey of sex-reversals in the medaka, Oryzias latipes: genotypic sexing of wild populations”, Zoological Science 21, pp. 613-619.
A megfestett metszetek tartós azonosítása olyan módon, amely lehetővé teszi a teljes nyomonkövethetőséget.
Flick (2007), “Collapse of a fish population after exposure to a synthetic estrogen”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, pp. 8897-8901.
Festés
Tyler (2006), “Development of chronic tests for endocrine active chemicals — Part 1.
A metszeteket festés előtt egy éjszakán át levegőn szárítjuk.
An extended fish early-life stage test for oestrogenic active chemicals in the fathead minnow (Pimephales promelas)”, Aquatic Toxicology 77, pp. 279-290.
b.
Petersen, P. Jackson, K. Hylland, L. Norrgren, and P. Bjerregaard (2006), “Detection of endocrine disrupters: Evaluation of a Fish Sexual Development Test (FSDT)”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 144, pp. 57-66.
A metszeteket hematoxilin-eozinnal megfestjük.
Andersen, L., K. Kinnberg, H. Holbech, B. Korsgaard, and P. Bjerregaard (2004), “Evaluation of a 40 day assay for testing endocrine disrupters: Effects of an anti-estrogen and an aromatase inhibitor on sex ratio and vitellogenin concentrations in juvenile zebrafish (Danio rerio)”, Fish Physiology and Biochemistry 30, pp. 257-266.
A fedőlemez ráhelyezése
Morthorst, J.E., H. Holbech, and P. Bjerregaard (2010), “Trenbolone causes irreversible masculinization of zebrafish at environmentally relevant concentrations”, Aquatic Toxicology 98, pp. 336-343.
a.
Metcalf (2003), “Effects of the antiandrogens, vinclozolin and cyproterone acetate on gonadal development in the Japanese medaka (Oryzias latipes)”, Aquatic Toxicology 63, pp. 391-403.
A fedőlemezeket manuálisan vagy automatikusan lehet ráhelyezni.
Tyler (2004), “Successful detection of (anti-) androgenic and aromatase inhibitors in pre-spawning adult fathead minnows (Pimephales promelas) using easily measured endpoints of sexual development”, Aquatic Toxicology 70, pp. 11-21.
b.
Petersen, and P. Bjerregaard (2007), “Effects of the fungicide prochloraz on the sexual development of zebrafish (Danio rerio)”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 145, pp. 165-170.
A tárgylemezt xilolba vagy TissueClear készítménybe mártjuk, és a felesleges xilolt/TissueClear készítményt finoman leütögetjük a tárgylemezről.
Chapter C.14 of this Annex, Fish Juvenile Growth Test.
c.
Chapter C.4 of this Annex, Ready Biodegradability.
Körülbelül 0,1 ml ragasztóközeget viszünk fel a tárgylemez matt végével ellentétes vége közelében, vagy a fedőlemezre.
Chapter C.37 of this Annex, 21-Day Fish Assay:
d.
A Short Term Screening for Oestrogenic and Androgenic Activity, and Aromatase Inhibition.
A fedőlemezt lapos szögben megdöntjük, és ráhelyezzük a tárgylemezre.
Schäfers, C., Teigeler, M., Wenzel, A., Maack, G., Fenske, M., Segner, H (2007), “Concentration- and time-dependent effects of the synthetic estrogen, 17 alpha-ethinylestradiol, on reproductive capabilities of the zebrafish, Danio rerio” Journal of Toxicology and Environmental Health-Part A, 70, 9-10 pp 768-779.
Címkézés
Abbreviations and definitions
a.
Apical endpoint
A tárgylemez címkéjének a következő információkat kell tartalmaznia.
Causing effect at population level
i.
Air saturation value
Laboratórium neve
Biomarker
Példány száma / Tárgylemez száma
Causing effect at individual level
Vegyi anyag / Kezelési csoport
A substance or a mixture.
Statisztikai folyamatábra a vitellogenin elemzéséhez
Days post hatch
A beágyazott ANOVA nem normális
Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish
Nem egyenlő szórásnégyzetek
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
Az ismétlések átlagai nem mutatnak normalitást és homogenitást
Fish weight
<= 3 ismétlés / koncentráció
Fish wet weight (blotted dry)
Eltérnek egymástól a kontrollok?
FSDT
>= 4 ismétlés / koncentráció
Fish Sexual Development Test
Egyenlő szórásnégyzet
Hypothalamic-pituitary-gonadal axis
Dunnett-féle próba a beágyazott ANOVA-n Dunnett-féle próba
Intersex fish
Szórásnégyzet-stabilizáló transzformáció?
Fish with more than one oocyte in testis per 6 sections analysed or spermatogenetic cells in ovaries (yes/no)
Nem Igen Igen
Wet weight of fish per volume of water
Szórásnégyzet stabilizáló transzformáció?
Mode of action
Monoton Állapítsuk meg hogy a dózisválasz monoton e
Reverse Transcriptase Polymerase Chain-Reaction
Zárjuk ki a vizes kontrollt Dunn-féle próba
Undifferentiated fish
Nem monoton
Fish with gonads exhibiting no discernible germ cells.
Oldószeres és oldószer nélküi kontroll is van
Vitellogenin
Statisztikai folyamatábra az ivararány elemzéséhez Kombináljuk a kontrollokat
Experimental conditions for the FSDT (freshwater species)
Hasonlítsuk össze a kontrollokat a t-próba használatával.
Japanese medaka (Oryzias latipes)
Eltérnek egymástól a kontrollok?
Zebrafish (Danio rerio)
Alkalmazzuk a lefelé lépegető Jonckheere-Terpstra-próbát (+) a NOEC meghatározására Dunn-féle vagy Mann-Whitney-féle U-próba Bonferroni-Holm-féle korrekcióval a NOEC meghatározására
Three-spined Stickleback (Gasterostreus aculeatus)
A NOEC meghatározására szóráshomogenitás esetén a Dunnett-féle próbát használjuk (*), egyébként pedig a Tamhane-Dunnett-féle (T3) próbát
Flow-through or semi-static
Normál eloszláúak az adatok?
Fluorescent bulbs (wide spectrum
Az adatok monoton dózisválasszal jellemezhetők?
Light intensity
(‡) Vagy a kontroll kiválasztására elfogadott egyéb módszer
10-20 μE/m2/s, 540-1080 lux, or 50-100 ft-c (ambient laboratory levels)
Négyzetgyök arkusz transzformáció után
12-16 h light, 8-12 h dark
Igen
Minimum chamber size
Nem
Individual chambers should contain a minimum of 7 l water volume
Használtunk oldószert?
Age of test organisms at start of exposure
9. függelék
Newly fertilised eggs (Early blastula stage)
Útmutató a genetikai ivar meghatározását és a genetikai ivar PCR-módszerrel történő meghatározását célzó szöveti mintavételhez
Newly fertilised eggs
Szöveti mintavétel, előkészítés és tárolás a genetikai ivar PCR-módszerrel történő meghatározásához fogaspontyban (Készítette: a Bayer CropScience AG vízi élőlények laboratóriuma)
No. of eggs per treatment
Finom ollóval levágjuk a halak farokúszóját vagy hátúszóját és egy 100 μl extrakciós puffer 1-gyel (a puffer előállításának részleteit lásd alább) megtöltött csőbe helyezzük.
Minimum 120
Az ollót minden hal után megtisztítjuk desztillált H2O-val megtöltött pohárban, és papírkendővel szárazra töröljük.
Minimum 3 (plus appropriate controls)
Az úszók szöveteit a sejtek lízise céljából microcsöves teflon bibével homogenizáljuk.
No. replicates per treatment
Minden csőhöz új bibét használunk a szennyeződés elkerülése érdekében.
Minimum 4 (unless square root allocation to controls)
A bibét éjszakára 0,5 mólos NaOH-oldatba helyezzük, majd 5 percig öblítjük desztillált H2O-val, és felhasználásig etanolban vagy autoklávozás után sterilen tároljuk.
Live Artemia, frozen adult brine shrimp, flake food, etc.
Az úszók szöveteit extrakciós puffer 1. nélkül is tárolni lehet szárazjégen, majd – 80 °C-on fagyasztóban a DNS degenerációjának megelőzése érdekében.
It is recommended to feed twice daily
De az extrakció eredményesebb, ha a DNS-t ugyanakkor vonjuk ki (a kezelést lásd fent; a mintákat a – 80 °C-on történő tárolás után a puffercsövekbe való betöltés előtt jégen fel kell olvasztani).
Special fry food, live Artemia, frozen adult brine shrimp, flake food, etc.
Homogenizálás után a csövek vízfürdőbe kerülnek és 100 °C-on 15 percig forraljuk azokat.
It is recommended to feed twice daily
Ezután minden csőbe 100 μl extrakciós puffer 2-t (a puffer előállításának részleteit lásd alább) pipettázunk.
None unless DO concentration falls below 60 % saturation
A mintákat 15 percig szobahőmérsékleten tároljuk és időnként kézzel óvatosan összerázzuk.
None unless DO concentration falls below 70 % saturation
Ezt követően a csöveket újra vízfürdőbe helyezzük, és 100 °C-on további 15 percen át forraljuk.
Clean surface, well or reconstituted water
További elemzésig a csöveket – 20 °C-on lefagyasztjuk.
Test chemical exposure duration
A puffer készítése
Hatching success, Survival Gross- morphology, VTG gonadal histology, Genetic sex, Sex ratio
PCR-puffer 1.:
Hatching success, Survival Gross- morphology, VTG gonadal histology, Sex ratio
500 mg N-lauroil-szarkozin (pl. Merck KGaA, Darmstadt, GE)
Test acceptability criteria for pooled replicates of controls
H2O ad 100 ml
Hatching success > 80 %
→ autoklávozás
Post hatch survival ≥ 70 %
PCR-puffer 2.:
growth (Fish wet weight, blotted dry) > 150 mg
20 g Chelex (pl. Biorad, München, Németország)
growth (Fish wet weight, blotted dry) > 75 mg
Megduzzasztás 100 ml deszt.
growth (Fish wet weight, blotted dry) > 120 mg
A genetikai ivar meghatározása (PCR-módszer) fogaspontyban (készítette: a Bayer CropScience AG vízi élőlények laboratóriuma és az Universität Würzburg Biozentrum)
Length (standard length) > 20mm
Az elkészített és lefagyasztott csöveket (a fenti szakaszban leírtak szerint) jégen felolvasztjuk.
Length (standard length) > 14 mm
Ezt követően Eppendorf-centrifugában lecentrifugáljuk őket (30 mp max. sebességen, szobahőmérsékleten).
Length (standard length) > 20 mm
A PCR-hez a csapadéktól elválasztott tiszta felülúszó kerül felhasználásra.
Sex ratio (% males or females) 30 %-70 %
Feltétlenül el kell kerülni azt, hogy a Chelex nyomait (a csapadékban található) átvigyük a PCR-reakcióba, mert az zavarja a »Taq«-polimeráz aktivitását.
Chemical characteristics of an acceptable dilution water
A felülúszót közvetlenül felhasználjuk vagy fagyasztva tárolható (– 20 °C-on) és több ciklusban újra felolvasztható anélkül, hogy az a későbbi elemzések során negatív hatással lenne a DNS-re.
CONCENTRATION
A »reakciókeverék« elkészítése (25 μl mintánként):
Particular matter
Térfogat
From test method C.14/Guidance on test concentrations
Végső koncentráció
Column (Number of concentrations between 100 and 10, or between 10 and 1) [1]
DNS-templát
A series of three (or more) successive concentrations may be chosen from a column.
0,5–2 μl
Mid-points between concentrations in column (x) are found in column (2x + 1).
puffer MgCl2-dal
The values listed can represent concentrations expressed as percentage per volume or weight (mg/l or μg/l).
2,5 μl
Values can be multiplied or divided by any power of 10 as appropriate.
Nukleotidok (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Column 1 might be used if there was considerable uncertainty on the toxicity level.
Forward primer (10 μmol) (lásd alább 3-5)
Guidance for homogenisation of head & tail from juvenile zebrafish, fathead minnow, three spined stickleback and Japanese medaka
0,5 μl
The purpose of this section is to describe the procedures that occur prior to the quantification of the VTG concentration.
Reverz primer (10 μmol) (lásd alább 3-5)
Other procedures that result in comparable VTG quantification can be used.
Víz (PCR tisztaságú)
It is an option to determine the VTG concentration in blood plasma or liver instead of head/tail homogenate.
25 μl-re
The head and tail are cut of the fish in accordance with the test description.
Taq E-polimeráz
All dissection instruments, and the cutting board should be rinsed and cleaned properly (e.g. with 96 % ethanol) between handling of each single fish to prevent “VTG pollution” from females or induced males to un-induced males.
0,3 μl
When a homogenous mass is achieved an amount of 4-10 time the tissue weight of ice-cold homogenisation buffer is added (note the dilution).
puffer MgCl2-dal:
The samples are placed on ice until centrifugation at 4 °C at 50000 g for 30 min.
670 mmol trisz/HCl (pH 8,8 25 °C-on), 160 mmol (NH4)2SO4, 25 mmol MgCI2, 0,1 % Tween 20
Use a pipette to dispense portions of 20 to 50 μl (note the amount) supernatant into at least two tubes by dipping the tip of the pipette below the fat layer on the surface and carefully sucking up the supernatant without fat- or pellet fractions.
Minden PCR-hez (lásd alább 3-5) a »reakciókeverék« új kombinációjaként a speciális primerre, valamint az egyes mintákhoz szükséges DNS-templát megfelelő mennyiségére (lásd fent) van szükség.
Place on ice during use
Az egyes térfogatokat pipettával visszük át az új csövekbe.
Homogenisation buffer:50 mM Tris-HCl pH 7,4;
Ezután a csöveket lezárjuk, összekeverjük (körülbelül 10 másodpercig) és centrifugáljuk (10 mp, szobahőmérsékleten).
12 ml Tris-HCl pH 7,4 + 120 μl Protease inhibitor cocktail (or equivalent protease inhibitor cocktails).TRIS:
Ezen kívül az egyes PCR-programokban egy pozitív kontrollt (ismert aktivitású és egyértelmű eredményeket adó DNS-minta) és egy negatív kontrollt (1 μl deszt.
TRIS-ULTRA PURE (ICN)Protease inhibitor cocktail:
H2O) is használunk.
Microtiter plates (certified Maxisorp F96, Nunc, Roskilde Denmark) previously coated with 5 μg/ml anti zebrafish lipovitellin-IgG are thawed and washed 3 times with washing buffer (*).
Ezt az oldatot mikrohullámmal fel kell forralni (kb. 2-3 perc)
Purified zebrafish vitellogenin standard [1] is serially diluted to 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10 and 20 ng/ml in dilution buffer (**) and samples are diluted at least 200 times (to prevent matrix effect) in dilution buffer and applied to the plates.
Töltsük át a forró oldatot egy jégre fektetett speciális öntődobozba
An assay control is applied in duplicate.
Kb. 20 perc múlva az agaróz gél használatra kész
150 μl are applied to each well.
Az agaróz gélt 1 × TAE-pufferben tároljuk a PCR-programok végéig
Standards are applied in duplicate and samples in triplicate.
Aktin PCR-program:
Incubate over night at 4 °C on a shaker.
Ennek a PCR-reakciónak a célja annak bizonyítása, hogy a mintában lévő DNS nem sérült.
The plates are washed 5 times with washing buffer (*)
Speciális primer:
HRP coupled to a dextran chain (e.g. AMDEX A/S, Denmark) and conjugated antibodies are diluted in washing buffer;
»Mact1(felső/forward)« → TTC AAC AGC CCT GCC ATG TA
Actual dilution differs by batch and age.
»Mact2(alsó/reverz)« → GCA GCT CAT AGC TCT TCT CCA GGG AG
150 μl are applied to each well and the plates are incubated for 1 hour at room temperature on a shaker.
Program:
The plates are washed 5 times with washing buffer (*) and the bottom of the plates is carefully cleaned with ethanol.
Ciklus (35-ször):
150 μl TMB plus (***) are applied to each well.
Denaturáció
Protect the plate against light with tinfoil, and watch the colour development on a shaker.
→ 45 mp 95 °C-on
When the standard curve is fully developed the enzyme activity is stopped by adding 150 μl 0,2 M H2SO4 to each well.
Kapcsolódás
The absorbance is measured at 450 nm (e.g. on a Molecular Devices Thermomax plate reader).
→ 45 mp 56 °C-on
Data are analysed on the associated software (e.g. Softmax).
Lánchosszabbítás
Washing buffer:
→ 1 perc 68 °C-on
PBS-stock (****)
15 perc 68 °C
Store at 4 °C.
Ebben a PCR-programban a sértetlen DNS-t tartalmazó mintákat használjuk az X- és Y-gének kimutatására.
Dilution buffer:
A hím DNS-nek dupla sávot kell mutatnia, a nőstény DNS-nek pedig egyetlen sávot (festés és gélelektroforézis után).
Adjust pH to 7,3 and fill to 1 l with millipore H2O.
»PG 17.5« (felső/forward) → CCG GGT GCC CAA GTG CTC CCG CTG
TMB plus is a “ready-to-use” substrate produced by KemEnTec (Denmark).
»PG 17.6« (alsó/reverz) → GAT CGT CCC TCC ACA GAG AAG AGA
It is sensitive to light.
Ciklus (40-szer):
PBS stock
→ 45 mp 55 °C-on
HPO4 · 2H2O
→ 1 perc 30 mp 68 °C-on
Adjust pH to 6,8 and fill with millipore H2O to 2 l.
Y-gén PCR-program az X- és Y-gén PCR-program »kontrolljaként«:
Store at room temperature.
Ez a PCR-program az »X- és Y-gén PCR-program« eredményeit ellenőrzi.
Battelle AP4.6.04 (1,18 mg/ml (AAA)), purified according to:
A »hím mintáknak« egy sávot kell mutatniuk, a »nőstény minták« pedig nem mutathatnak semmilyen sávot (festés és gélelektroforézis után).
Guidance for the preparation of tissue sections for sex determination and staging of gonads
»DMTYa (felső/forward)« → GGC CGG GTC CCC GGG TG
The purpose of this section is to describe the procedures that occur prior to the evaluation of histological sections.
»DMTYd (alsó/reverz)« → TTT GGG TGA ACT CAC ATG G
Other procedures that result in similar sex determination and gonadal staging can be used.
A PCR-minták festése:
With a few exceptions, these procedures are similar for Japanese medaka (JMD) and zebrafish (ZF).
Festékoldat:
Euthanasia, Necropsy, and Tissue Fixation
50 % glicerin
Objectives:
0,25 % bromofenolkék
Provide for the humane sacrifice of fish.
0,25 % xilén-cianol
Obtain necessary body weights and measurements.
Minden csőbe pipettázzunk 1 μl festékoldatot
Evaluate secondary sex characteristics.
Kezdjük meg a gélelektroforézist:
Dissect tissues for VTG analysis.
Az elkészített 1 %-os agaróz gélt áttöltjük egy 1 × TAE-pufferrel töltött gélelektroforézis-kádba
Fixation of the gonads.
Minden festett PCR-mintából 10–15 μl mennyiséget pipettázunk egy agarózgél-zsebbe
Procedures:
Az 1kb-»létrából« (Invitrogen) is 5–15 μl-t pipettázunk egy külön zsebbe
Fish should be sacrificed immediately prior to necropsy.
Indítsuk el az elektroforézist 200 V-tal
Therefore, unless multiple prosectors are available, multiple fish should not be sacrificed simultaneously.
30–45 perc múlva állítsuk le
Using the small dip net, a fish is removed from the experimental chamber and transported to the necropsy area in the transport container.
A sávok meghatározása:
The fish is placed in the euthanasia solution.
Tisztítsuk le az agaróz gélt desztillált H2O-ban
The fish is removed from the solution when there is cessation of respiration and the fish is unresponsive to external stimuli.
Most 15–30 percre tegyük át az agaróz gélt etídium-bromidba
The fish is wet weighed.
Ezután az agaróz gélt egy UV-fénydobozban le kell fényképezni
For preparation of tissues for VTG analysis, the fish can be placed on a corkboard on the stage of a dissecting microscope.
Végül a mintákat a pozitív kontroll sávval (vagy sávokkal) és a létrával összehasonlítva elemezzük
For zebrafish the head is cut right behind the pectoral fin and tail is cut right behind the dorsal fin.
10. függelék
For Japanese medaka the abdomen is opened via a carefully made incision that extends along the ventral midline from the pectoral girdle to a point just cranial to the anus.
Útmutató a genetikai ivar PCR-módszerrel történő meghatározását célzó szöveti mintavételhez tüskés pikóban
Using the small forceps and small scissors, the liver is carefully removed.
Szöveti mintavétel és DNS-kivonás