natgillin/translations-raw huggingface dataset:
immobility and/or absence of respiratory movement and/or absence of heart-beat and/or white opaque coloration of central nervous system and/or lack of reaction to mechanical stimulus.
kikelés eredményessége, túlélési arány álatlános morfológia, VTG ivarmirigy-szövettan, ivararány
Abnormal appearance
A vizsgálat elfogadhatósági kritériumai a kontrollok összevont ismétlései esetében
The number of larvae or fish showing abnormality of body form should be recorded, and the appearance and the nature of the abnormality described.
Kikelés eredményessége > 80 %
It should be noted that abnormal embryos and larvae occur naturally and can be of the order of several per cent in the control(s) in some species.
Kikelés utáni túlélési arány ≥ 70 %
Abnormal animals should only be removed from the test chambers on death.
Növekedés (hal nedves tömege, szárazra itatva) > 150 mg
However, in accordance with Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes, if abnormalities result in pain, suffering and distress or lasting harm, and death can be reliably predicted, animals should be anaesthetised and euthanised according to the description in paragraph 44 and treated as mortality for data analysis..
Növekedés (hal nedves tömege, szárazra itatva) > 75 mg
Abnormal behaviour
Növekedés (hal nedves tömege, szárazra itatva) > 120 mg
Abnormalities, e.g. hyperventilation, uncoordinated swimming, atypical quiescence and atypical feeding behaviour should be recorded at appearance.
Hossz (standard hossz) > 20 mm
Weight
Testhossz (standard hossz) > 14 mm
At the end of the test all surviving fish should be euthanised (anaesthetised if blood samples should be taken), and individual wet weight (blotted dry) should be measured.
Testhossz (standard hossz) > 20 mm
Length
Ivararány (% hím vagy nőstény) 30–70 %
At the end of the test, individual lengths (standard length) should be measured.
Az elfogadható hígítóvíz kémiai tulajdonságai
These observations will result in some or all of the following data being available for reporting:
KONCENTRÁCIÓ
cumulative mortality;
Finomszemcsés anyag
numbers of healthy fish at end of test;
A C.14.
time to start of hatching and end of hatching;
Vizsgálati módszerből / Iránymutatás a vizsgálati koncentrációkhoz
length and weight of surviving animals;
Oszlop (koncentrációértékek száma 100 és 10 vagy 10 és 1 között) [1]
numbers of deformed larvae;
Három (vagy több) egymást követő koncentrációértéket lehet egy oszlopból kiválasztani.
numbers of fish exhibiting abnormal behaviour.
Az (x) oszlopban szereplő koncentrációértékek közötti középértékek a (2x + 1) oszlopban találhatók.
Sampling of fish
A felsorolt értékek térfogat- vagy tömegszázalék (mg/liter vagy μg/liter) formájában kifejezett koncentrációértékeket jelenthetnek.
Fish sampling is performed at termination of the test.
Az értékeket adott esetben 10 bármely hatványával meg lehet szorozni vagy el lehet osztani.
Sampled fish should be euthanised with e.g. MS-222 (100-500 mg per l buffered with 200 mg NaHCO3 per l) or FA-100 (4-allyl-2-methoxyphenol: eugenol) and individually measured and weighed as wet weight (blotted dry) or anaesthetised if a blood sample should be taken (see paragraph 49).
Az 1. oszlop adatai akkor használhatók, ha jelentős a bizonytalanság a toxicitás szintjét illetően.
Sampling for VTG analysis and sex determination via histological evaluation
Útmutató a fiatal a zebradánióból, az amerikai cselléből, a tüskés pikóból és a japán fogaspontyból vett fej/farok minta homogenizációjához
All fish should be sampled and prepared for analysis of sex and VTG.
E szakasz célja, hogy bemutassa a VTG-koncentráció mennyiségi meghatározását megelőző eljárásokat.
All fish should be analysed histologically to determine sex.
A VTG összehasonlítható mennyiségi meghatározását eredményező egyéb eljárások is alkalmazhatók.
For the VTG measurements, a sub-sampling of at least 16 fish from each replicate is accepted.
A fej/farok homogenizátum helyett lehetőség van a VTG koncentrációjának vérplazmában vagy májban történő meghatározására is.
More fish should be analysed for VTG if the results of the sub-sampling turn out to be unclear.
A halak fejét és farkát a vizsgálati leírásnak megfelelően levágjuk.
The sampling procedure for VTG and sex determination is dependent on the VTG analysis method:
A boncolóeszközöket, valamint a vágódeszkát az egyes halak kezelése között le kell öblíteni és alaposan meg kell tisztítani (pl. 96 %-os etanollal), hogy megakadályozható legyen a nem indukált hímek nőstényektől vagy indukált hímektől eredő »VTG-szennyeződése«.
Head/tail homogenate method for VTG analysis
Amikor már elértük a homogén masszát, a szövet tömegének 4–10-szeresét kitevő mennyiségű jéghideg homogenizáló puffert adunk hozzá (a hígítást figyelembe kell venni).
The fish is euthanised.
A mintákat a 4 °C-on 50000 g-vel 30 percig zajló centrifugálásig jégre tesszük:
Head and tail of each fish are separated from the body of the fish by cuts made right behind the pectoral fins, and right behind the dorsal fin, using a scalpel (See Figure 1).
A felülúszóból pipettával 20–50 μl (jegyezzük fel a mennyiséget) térfogatú adagokat vigyünk át legalább két csőbe úgy, hogy a pipetta csúcsát merítsük a felületen lévő zsírréteg alá és óvatosan szívjuk fel a zsír- vagy pelletfrakció nélküli felülúszót.
The head and tail part from each fish are pooled, weighed and individually numbered, frozen in liquid nitrogen and stored at – 70° or less for VTG analysis.
Használat közben helyezzük jégre
The body part of the fish is numbered and fixed in an appropriate fixative for histological evaluation (22).
Homogenizáló puffer:50 mmol trisz-HCl, pH 7,4;
By use of this method VTG and histopathology are evaluated on each individual and a possible change in the VTG level can thus be related to the phenotypic sex of the fish or genetic sex (Japanese medaka and the three-spined stickleback) of the fish.
1 % proteázgátló koktél (Sigma):
For further information see guidance for homogenisation (Appendix 5) and guidance for VTG quantification (Appendix 6).
12 ml trisz-HCl pH = 7,4 + 120 μl proteázgátló koktél (vagy azzal egyenértékű proteázgátló koktélok).TRIS:
Liver homogenate method for VTG analysis
TRIS-ULTRA PURE (ICN)Proteázgátló koktél:
The liver is dissected out and stored at – 70 °C or below.
Sigma (emlősszövetekhez) Termékszám P 8340.
Recommended procedures for liver excision and pre-treatment are available in OECD TG 229 (37) or Chapter C.37 of this Annex (38).
Útmutató a fej/farok homogenizátum vitellogenin-tartalmának mennyiségi meghatározásához zebradánióban (Danio rerio) (Holbech és mtsai által módosítva, 2001.).
Livers are then individually homogenised as described in OECD TG 229 or Chapter C.37 of this Annex.
Homológ antitesteket és standardokat használó egyéb eljárások is alkalmazhatók
The supernatant collected is used for measuring VTG with a homologous ELISA technique (see Appendix 6 for an example of quantification in zebrafish or OECD TG 229 (37) for Japanese medaka).
5 μg/ml anti zebradánió lipovitellin-IgG-vel előzetesen bevont mikrotiterlemezeket (Maxisorp F96, Nunc, Roskilde, Dánia) felolvasztunk és mosópufferrel (*) 3-szor megmosunk.
Following this approach, it is also possible to have individual fish data on both VTG and gonad histology.
Tisztított zebradánió vitellogenin standardot [1] sorozatban 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10 és 20 ng/ml-re hígítunk hígítópufferben (**), és a mintákat hígítópufferben legalább 200-szor hígítjuk (a mátrixhatás megakadályozása céljából), majd felvisszük a lemezekre.
Blood plasma method for VTG analysis
Egy vizsgálati kontrollt alkalmazunk két ismétlésben.
Blood is collected from the anaesthetised fish by cardiac puncture, caudal vein or tail cutting, and centrifuged at 4 °C for plasma collection.
150 μl-t viszünk be minden lyukba.
The plasma is stored at – 70 °C or below until use.
A standardokat két példányban, a mintákat három példányban alkalmazzuk.
The whole fish is euthanised and fixed for histology.
Inkubáljuk egy éjszakán át 4 °C-on rázógépen.
Both plasma samples and fish are numbered individually to relate VTG levels to the sex of the fish.
A lemezeket mosópufferrel (*) 5-ször lemossuk.
How to cut a fish for measurement of VTG in head/tail homogenate and histological evaluation of the mid section
Dextránlánchoz kapcsolt HRP-t (pl. AMDEX A/S, Dánia), illetve konjugált antitesteket hígítunk fel mosópufferben;
Genetic sex determination
a tényleges hígítás tételenként és életkoronként különbözik.
A biological sample for the determination of the genetic sex is taken from individual fish in species possessing appropriate markers.
150 μl-t viszünk be az egyes lyukakba, majd a lemezeket 1 órán át inkubáljuk szobahőmérsékleten, rázógépen.
For Japanese medaka, the anal fin or dorsal fin is collected.
A lemezeket mosópufferrel (*) 5-ször lemossuk, és a lemezek alját gondosan megtisztítjuk etanollal.
A detailed description is given in Appendix 9 including tissue sampling and sex determination by a PCR-method.
150 μl TMB plus (***) készítményt viszünk be az egyes lyukakba.
Equally, for the three spined stickleback, a description of tissue sampling and a sex determining PCR-method is given in Appendix 10.
A lemezt alufóliával védjük a fénytől, és kövessük figyelemmel a szín fejlődését a rázógépen.
VTG measurement
Amikor a standard görbe teljesen kialakult, az enzimaktivitást lyukanként 150 μl 0,2 M H2SO4 hozzáadásával leállítjuk.
The measurement of VTG should be based upon a quantitative and analytically validated method.
Mosópuffer:
Information should be available upon the intra-assay and inter-assay variability of the method used in a given laboratory.
PBS-törzs (****)
Considering the variability of VTG measurement, NOECs based on this endpoint alone should be treated with great care.
4 °C-on tároljuk.
Different methods are available to assess VTG production in the fish species considered in this assay.
Hígítópuffer:
A measurement technique that is both relatively sensitive and specific is the determination of protein concentrations via enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
PBS-törzs (****)
Homologous antibodies (raised against VTG of the same species) and most important homologous standards should be used.
Állítsuk be a pH-t 7,3-ra és töltsük fel 1 l-re Millipore H2O-val.
Sex determination
A TMB plus egy »használatra kész« szubsztrátum, amelyet a KemEnTec (Dánia) készít.
Dependent on the VTG sampling procedure, whole fish or the remaining mid-section of each fish is placed in a pre-labelled processing cassette and fixed in an appropriate fixative for histological determination of sex (optionally also for evaluation of gonadal staging).
Fényre érzékeny.
Guidance on fixation and embedding is provided in Appendix 7 as well as in the OECD Guidance Document on the Diagnosis of Endocrine-Related Histopathology of Fish Gonads (22).
PBS törzs
The individuals should be placed longitudinally in the paraffin block.
Szobahőmérsékleten tárolandó.
At least six longitudinal sections (3-5 μm in thickness) in a frontal plane including gonadal tissue from both gonads are taken from each individual.
Battelle AP4.6.04 (1,18 mg/ml (AAA)), az alábbiak szerint tisztított:
The interval between these sections should be approximately 50 μm for males and 250 μm for females.
Útmutató szövetmetszetek ivarmeghatározás és az ivarmirigyek stádiumbeosztása céljából történő készítéséhez
However, since each block will often contain males and females (if more than one individual are embedded in each block), the interval between sections from these blocks should be approximately 50 μm until at least six sections of the gonads from each male are obtained.
E szakasz célja, hogy leírja azokat az eljárásokat, amelyek a szövettani metszetek értékelése előtt zajlanak.
Thereafter, the interval between sections can be increased to approximately 250 μm for the females.
Hasonló ivarmeghatározást és ivarmirigy-stádiumbeosztást eredményező egyéb eljárások is alkalmazhatók.
Sections are stained with haematoxylin and eosin and examined by light-microscopy with focus on sex (male, female, intersex or undifferentiated).
Néhány kivételtől eltekintve az eljárások hasonlóak a japán fogasponty (JMD) és zebradánió (ZF) esetében.
Intersex is defined as presence of more than one oocyte in testis per six sections analysed or spermatogenic cells (yes/no) in ovaries.
Elaltatás, boncolás és szövetrögzítés
Histopathology and staging of ovaries and testis is optional but if investigated, the results should be statistically analyzed and reported.
Célkitűzések:
It should be noted that some fish species naturally lack a fully developed pair of gonads and only one gonad may be present (e.g. Japanese medaka and occasionally zebrafish).
A halak humánus leölése.
Genetic sex determination in individual Japanese medaka is based on the presence or absence of the medaka male-sex determining gene, DMY, which is located on the Y chromosome.
A másodlagos ivari jelleg értékelése.
The genotypic sex of medaka can be identified by sequencing the DMY gene from DNA extracted from for instance a piece of anal fin or dorsal fin.
Szövetek boncolása a VTG elemzése céljából.
The presence of DMY indicates a XY (male) individual regardless of phenotype, while the absence of DMY indicates a XX (female) individual regardless of phenotype (23).
Az ivarmirigyek rögzítése.
Guidance for tissue preparation and PCR method is given in Appendix 9.
Eljárások:
The genetic sex determination in individual three-spined stickleback is also performed via a PCR method, described in Appendix 10.
A halakat közvetlenül a boncolást megelőzően kell elpusztítani.
The occurrence of intersex (for definition, see Appendix 1) should be reported.
Ezért – kivéve, ha több boncoló áll rendelkezésre – nem szabad több halat elpusztítani egyszerre.
Secondary sexual characteristics
A vizsgálati kamrából kis merítőhálóval eltávolítunk egy halat, és a szállítótartályban átvisszük a boncolási területre.
Secondary sexual characteristics are under endocrine control in species like the Japanese medaka;
A halat az altatóoldatba helyezzük.
therefore observations of physical appearance of the fish should if possible be made at the end of the exposure.
A halat akkor távolítjuk el az oldatból, ha a légzés megszűnt, és a hal nem reagál a külső ingerekre.
In the Japanese medaka, the papillary formation on the posterior part of the anal fin in females is androgen sensitive.
Megmérjük a hal nedves tömegét.
Chapter C.37 of this Annex (38) provides relevant photographs of male secondary sex characteristics and androgenised females.
A szövetek VTG-elemzés céljából történő előkészítéséhez a halat egy parafalapra lehet helyezni a preparálómikroszkóp látóterében.
It is important that the strongest valid statistical test determine the endpoint.
a.
The replicate is the experimental unit but intra-replicate variability should be included in the statistical testing.
A zebradánió fejét közvetlenül a mellúszó mögött vágjuk le, a farkát pedig közvetlenül a hátúszó mögött.
A decision flow-chart is available in Appendix 8 to help with the most appropriate statistical test to use based on the characteristic of the data obtained from the test.
b.
Statistical significance level is 0,05 for all endpoints included.
A japán fogasponty hasát egy gondosan elkészített, a vállövtől a ventrális középvonal mentén a végbélnyílástól craniálisan elhelyezkedő pontig terjedő metszéssel felnyitjuk.
Proportions of sex and genetic sex
A májat egy kis csipesz és egy kis olló segítségével óvatosan eltávolítjuk.
The proportions of sex should be analysed for significant effect (NOEC/LOEC approach) of exposure by Jonckheere-Terpstra (Trend test) if a monotone dose-response exists.
A VTG-analízishez vett mintákat Eppendorf-csövekbe helyezzük, és folyékony nitrogénben azonnal lefagyasztjuk.
If non-monotonicity is found then a pair wise test should be applied:
Az ivarmirigyeket tartalmazó test előre felcímkézett műanyag szövetkazettába kerül, amelyet Davidson- vagy Bouin-féle fixálóba helyezünk.
Use Dunnett's test if normality and homogenous variance can be obtained.
A fixáló mennyisége legalább 10-szerese legyen a szövetek közelítőleges térfogatának.
Use Tamhane-Dunnett if heterogeneous variance is present.
A fixáló tartályt öt másodpercig óvatosan keverjük, hogy kimozdítsuk a légbuborékokat a kazettából.
Otherwise use exact Mann-Whitney test with Bonferroni-Holm adjustment.
a.
A flow chart describing the statistics of the proportions of sex is placed in Appendix 8.
A szövetek egy éjszakán át a Davidson-féle fixálószerben maradnak, majd a következő napon 10 % semleges pufferelt formalint tartalmazó egyedi tartályokba helyezzük őket át.
The proportions of sex should be presented in tables as concentration proportions ± SD of males, females, intersex and undifferentiated.
A kazettákat tartalmazó tartályokat 5 másodpercig óvatosan keverjük, hogy a formalin megfelelően átjárja a kazettákat.
Statistical significance should be highlighted.
b.
Examples are presented in the FSDT Phase 2 validation report (42).
A szövetek a Bouins-féle fixálóban maradnak 24 órán át, majd 70 %-os etanolba helyezzük át azokat.
Genetic sex should be reported as percentage of phenotypic sex reversal of males, females, intersex and undifferentiated.
A szövetek feldolgozása
VTG concentrations
A szövetek kiszárítása a paraffin megfelelő behatolásának biztosításához.
VTG concentrations should be analysed for significant effect (NOEC/LOEC approach) of exposure.
A szövet paraffinos impregnálása a szövetek integritásának fenntartása és a metszetkészítéshez szükséges szilárd felület létrehozása céljából.
The Dunnett test is preferable to the t-test with Bonferroni correction.
3.
Where a Bonferroni correction is used, the Bonferroni-Holm correction is preferable.
A címkével ellátott szövetkazettákat eltávolítjuk a formalin/etanol tárolóból, és a feldolgozó kosárba (kosarakba) helyezzük.
Allowance should be made for log-transformation of VTG to achieve normality and variance homogeneity.
A feldolgozó kosarat betöltjük a szövetprocesszorba.
Next, if the concentration-response is consistent with monotonicity, then the JonckheereTerpstra test is preferable to any of the above.
Kiválasztjuk a feldolgozási programot.
If t-tests or Dunnett's test is used, there is no need for a ANOVA significance F-test in order to proceed.
Miután a szövetprocesszor befejezte a feldolgozási ciklust, a kosarat (kosarakat) át lehet vinni a beágyazó állomásra.
For details see the flow chart in Appendix 8.
Beágyazás
Results should be reported in tables as concentration means ± SD for males, females, intersex and undifferentiated separately.
Célkitűzés:
Statistical significance for phenotypic females and phenotypic males should be highlighted.
A példányok metszetkészítéshez megfelelő orientálása a megszilárdult paraffinban.
Test chemical actual concentrations
A kazettákat tartalmazó kosarat (kosarakat) eltávolítjuk a processzorból, és elmerítjük a beágyazó állomás termikus konzoljának paraffinnal töltött elülső kamrájában vagy a kazettákat egy külön paraffinmelegítőbe visszük át.
The actual chamber concentrations of the test chemical should be analysed in frequencies described in paragraph 34.
Eltávolítjuk a beágyazandó első kazettát a termikus konzol elülső kamrájából vagy a paraffinmelegítőből.
Results should be reported in tables as mean concentration ± SD on replicate basis as well as on concentration basis with information on number of samples and with outliers from the mean treatment concentration ± 20 % highlighted.
Levesszük és kidobjuk a kazetta fedelét, majd a kazetta címkéjét összevetjük az állatokra vonatkozó feljegyzésekkel, hogy az esetleges eltéréseket a beágyazás előtt rendezhessük.
Examples can be found in the FSDT Phase 2 validation report (42).
Kiválasztunk egy megfelelő méretű beágyazó öntőformát.
The test results should be interpreted with caution where measured test chemical concentrations in test solutions occur at levels near the detection limit of the analytical method.
Az öntőformát a kijuttató konzol nyílása alá tartjuk, és feltöltjük megolvadt paraffinnal.
Relevant physical-chemical properties;
A példányt eltávolítjuk a kazettából, és behelyezzük az öntőformában található olvadt paraffinba.
chemical identification data including purity and analytical method for quantification of the test chemical.
Ezt minden paraffin öntőforma esetében 4–8 példánnyal megismételjük.
Test procedure used (e.g. flow-through semi-static/renewal);
Az egyes halak helyzetét azzal jelezzük, hogy az első halat a 2–4/8 halhoz képest 180 fokkal elfordítva helyezzük be.
test design including test concentrations, method of preparation of stock solutions (in an Annex), frequency of renewal (the solubilising agent and its concentration should be given, when used);
További paraffint adunk hozzá, hogy befedje a példányokat.
The nominal test concentrations, the means of the measured values and their standard deviations in the test chambers and the method by which these were attained (the analytical method used should be presented in an Annex);Evidence that the measurements refer to the concentrations of the test chemical in true solution;
Az öntőformát a kazetta aljával együtt a kriokonzol hűtőlemezére helyezzük.
Water quality within test chambers:
Miután a paraffin megszilárdult, a blokkot (azaz a szöveteket tartalmazó megkeményedett paraffint és kazetta alját) eltávolítjuk a formából.
Detailed information on feeding (e.g. type of food(s), source, amount given and frequency and analyses for contaminants (e.g. PCBs, PAHs and organochlorine pesticides) if relevant.
Metszetkészítés
Evidence that controls met the validity criteria:
Szövettani metszetek vágása és tárgylemezre ragasztása a festéshez.
data on hatching rate should be presented in tables as percentage per replicate and per concentration.
A metszetkészítés kezdeti szakaszát, az úgynevezett »facing«-et a következőképpen hajtjuk végre:
Outliers from the acceptance criteria (in controls) should be highlighted.
a.
Survival should be presented as percentage per replicate and per concentration.
A paraffinblokkot behelyezzük a mikrotóm befogójába.
Outliers from the validity criteria (in controls) should be highlighted;
b.
Clear indication of the results obtained on the different endpoints observed:
A befogót a mikrotóm kerekének forgatásával előre mozgatjuk, és vastag szeleteket vágunk le a paraffinblokk felszínéből, amíg a vágókés el nem éri a beágyazott szöveteket.
embryo survival and hatching success;
c.
external abnormalities;
A metszetvastagságot 3–5 mikron közé állítjuk be a mikrotómon.
length and weight;
A befogót előretoljuk, és több metszetet vágunk le a blokkból, hogy eltávolítsuk a műtermékeket, amelyek a durva vágás során jöttek létre a vágási felületen.
VTG measurements (ng/g homogenate, ng/ml plasma or ng/mg liver);
d.
gonadal histology, sex ratio, genetic sex data;
A blokkot el lehet távolítani a befogóból, és vágófelülettel lefelé jégre lehet helyezni a szövet beáztatása céljából.
incidence of any unusual reactions by the fish and any visible effects produced by the test chemical.
A metszetkészítés következő fázisa a végleges metszetek készítése és tárgylemezre rögzítése.
The results should be presented as mean values ± standard deviation (SD) or standard error (SE).
Ezeket az eljárásokat a következő módon végezzük:
Statistics should be reported as a minimum as NOEC and LOEC and confidence intervals.
a.
The statistical flow chart (Appendix 8) should be followed.
Ha a blokkot jégre helyeztük, akkor eltávolítjuk a jégről, és visszahelyezzük a mikrotóm befogójába.
Sumpter, 1996, “Inhibition of testicular growth in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) exposed to estrogenic alkylphenolic chemicals”, Environmental Toxicology and Chemistry 15, pp. 194-202.
b.
Sumpter, J.P. and S. Jobling, 1995, “Vitellogenesis As A Biomarker for Estrogenic Contamination of the Aquatic Environment”, Environmental Health Perspectives 103, pp. 173-178.
A mikrotóm szeletvastagságát 3–5 mikronra állítva a befogót a mikrotóm kerekének forgatásával előre mozgatjuk.