natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Negative controls shall consist of genomic DNA from non-infected hosts and PCR reactives without target DNA.
A szekvenálást a megerősítő diagnosztika egyik végső lépéseként kell elvégezni.
A positive result shall be positive PCR amplification at the expected size (412 bp), with all negative controls being negative and all positive controls being positive.
A célzott régiók: SSU rDNS és ITS1.
In-situ hybridisation (ISH)
A Marteilia refringens-fertőzés felügyeletére és megerősítésére szolgáló részletes diagnosztikai módszerek és eljárások
Several ISH protocols have been developed and published.
A Marteilia refringens-fertőzésre vonatkozó felügyeleti programokhoz, valamint az említett, jegyzékbe foglalt betegség jelenlétének megerősítéséhez vagy gyanújának kizárásához az I. melléklet 4. részének II. szakaszában foglalt követelményeknek megfelelően alkalmazandó diagnosztikai módszerek és kapcsolódó eljárások a 4.1. táblázat szerinti iránymutatásokkal összhangban a következők:
Probe that targets the SSU of the rRNA gene complex shall be used because it has been validated against histology.
táblázat
Sections of tissue that include gills, digestive gland, shall be fixed for at least 24 hours in Davidson's fixative followed by normal processing for paraffin histology.
A felügyeleti programokhoz kapcsolódó diagnosztikai módszerek alkalmazására és a Marteilia refringens-fertőzés megerősítésére vagy kizárására vonatkozó iránymutatások
Sections of 5 μm shall be cut and placed on aminoalkylsilane-coated slides, which shall then be baked overnight in an oven at 40 °C.
Módszer
The sections shall be dewaxed by immersing in xylene for 10 minutes.
Célzott felügyelet
This step shall be repeated once and then the solvent shall be eliminated by immersion in two successive absolute ethanol baths for 10 minutes each.
Vélelmezett diagnózis
The sections shall then be dehydrated by immersion in a graded ethanol series.
Megerősítő diagnózis
The sections shall be treated with proteinase K (100 μg ml– 1) in TE buffer (Tris [50 mM], EDTA [10 mM]), at 37 °C for 30 minutes.
Emésztőmirigy-lenyomatok
Slides shall be dehydrated by immersion in a graded ethanol series and then air dried.
X vagy
Sections shall be incubated with 100 μl of hybridisation buffer (4 × SSC [standard saline citrate], 50 % formamide, 1 × Denhardt's solution, 250 μg ml– 1 yeast tRNA, 10 % dextran sulphate) containing 10 ng (1 μl of the PCR reactants prepared as described in point I.3.2 using primers CCG-GTG-CCA-GGT-ATA-TCT-CG and TTC-GGG-TGG-TCT-TGA-AAG-GC) of the digoxigenin-labelled probe.
Kórszövettan
Sections shall be covered with in-situ plastic cover-slips and placed on a heating block at 95 °C for five minutes.
In situ hibridizáció
Slides shall then be cooled on ice for one minute before overnight hybridisation at 42 °C in a humid chamber.
X és
Sections shall be washed twice for five minutes in 2 × SSC at room temperature, and once for 10 minutes in 0,4 × SSC at 42 °C.
A BONAMIA OSTREAE-FERTŐZÉS FELÜGYELETÉRE ÉS MEGERŐSÍTÉSÉRE SZOLGÁLÓ RÉSZLETES DIAGNOSZTIKAI MÓDSZEREK ÉS ELJÁRÁSOK
The detection steps shall be performed according to the manufacturer's instructions.
I. A Bonamia ostreae-fertőzés diagnosztizálására szolgáló eljárások
The slides shall then be rinsed in sterile distilled water (dH2O).
A Bonamia ostreae-fertőzés tekintetében bizonyos egészségügyi státusoknak az I. melléklet 5. része I. szakaszában meghatározott megszerzése vagy fenntartása céljából, illetve az említett, jegyzékbe foglalt betegség jelenlétének a 2006/88/EK irányelv 57. cikkének b) pontja szerinti megerősítése vagy kizárása céljából – az I. melléklet 5. részének II. szakaszában foglalt diagnosztikai módszerekkel – végzett mintavétel és laboratóriumi vizsgálat során az alábbi I.1., I.2. és I.3. pontban meghatározott részletes diagnosztikai módszerek és eljárások alkalmazandók.
The sections shall be counter-stained with Bismarck Brown Yellow, rinsed in dH2O, and cover-slips shall be applied using an aqueous mounting medium.
Mintavételi eljárás
Positive and negative controls shall be sections from known infected and non-infected hosts respectively.
A mintavételt követően az osztrigákat – ha a mintában vannak nyitott puhatestűek – legfeljebb 24 óráig vagy – ha a mintában nincsenek nyitott puhatestűek – legfeljebb 72 óráig 4 °C-on vagy hűtött jégen, az osztrigák jellegére és származására vonatkozó részletes adatokkal felcímkézett műanyag tasakban kell tárolni.
A positive result shall be demonstrated by the purple-black labelling of M. refringens cells within known target tissues, with all negative controls being negative and all positive controls being positive.
A Bonamia ostreae szövettani vizsgálattal végzett diagnosztizálásához többek között kopoltyú- és szívszövetek 3–5 mm vastagságú metszetét kell használni.
Sequencing
A kopoltyú- vagy szívszövetek nedvszívó papíron történő szárítását követően üveg tárgylemezen több lenyomatot kell készíteni.
Sequencing shall be carried out as one of the final steps for confirmatory diagnostic.
A tárgylemezeket – a gyártó útmutatásának megfelelően – levegőn kell megszárítani, metanolban vagy abszolút etanolban kell fixálni, és kereskedelmi forgalomban kapható vérfestő készlettel (például Diff-Quick®/Hemacolor®) kell megfesteni.
Targeted regions are the SSU rDNA and ITS1.
A tárgylemezeket először 200-szoros nagyításban, azt követően pedig olajimmerzió alkalmazásával 1000-szeres nagyításban kell megfigyelni.
Detailed diagnostic methods and procedures for surveillance and confirmation of infection with Marteilia refringens
Pozitív eredménynek az számít, ha a vérsejteken belül kisméretű, gömb vagy tojásdad alakú (2–5 μm szélességű) szervezetek figyelhetők meg.
For the purpose of surveillance programmes and to confirm the presence of an infection with Marteilia refringens or to rule out a suspicion of that listed disease, in accordance with the requirements laid down in Section II of Part 4 to Annex I, the diagnostic methods and corresponding procedures to be used shall be in accordance with the guidelines laid down in Table 4.1 as follows:
A kórokozó azonban a sejten kívül is előfordulhat.
Table 4.1
Ezek a szervezetek bazofil citoplazmával és eozinofil sejtmaggal rendelkeznek (a színek a használt festéktől függően változhatnak), és mivel terjeszkednek a tárgylemezen, szélesebbnek tűnhetnek a szövetlenyomat-, mint a szövettani vizsgálaton.
Guidelines for the use of diagnostic methods for the surveillance programmes and to confirm or rule out infection with Marteilia refringens
Előfordulhat, hogy sokmagvú sejtek is megfigyelhetők.
Method
A kopoltyúkból és az emésztőmirigyből származó szövetek metszeteit legalább 24 óráig Davidson-féle fixálóban kell fixálni, ezt paraffinbeágyazásos szövettani vizsgálat és (például hematoxilinnel és eozinnal való) festés céljából történő rendes feldolgozás követi.
Targeted surveillance
Pozitív eredménynek minősül, ha a kórokozók nagyon kis méretű, 2–5 μm szélességű sejtekként vannak jelen a vérsejtekben, illetve szabadon a kopoltyú, a bél és a köpeny epitéliumának kötőszöveteiben vagy szinuszaiban, és ehhez gyakran intenzív gyulladásos reakció társul.
Presumptive diagnosis
A kétségek elkerülése érdekében a pozitív diagnózishoz a kórokozót a vérsejten belül kell megfigyelni.
Confirmatory diagnosis
Az alábbiakban ismertetett PCR-protokollokkal való felhasználásra alkalmas és általában kiváló minőségű DNS-t előállító, kereskedelmi forgalomban kapható DNS-kivonási készletek használata megengedett.
Digestive gland imprints
Az rDNS kis alegységét (SSU) célzó két PCR-protokoll alkalmazható:
X, or
A PCR-elegyek puffert (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl [pH: 25 °C-on 9,0] és 1 % Triton® X-100), 2,5 mM MgCl2-t, 0,2 mM dNTP-keveréket, 1 μM forward és reverz primert, 0,02 egység μl – 1 Taq DNS-polimerázt és 0,2 ng μl – 1 DNS-templátot tartalmaznak összesen 50 μl térfogatban.
Histopathology
A templátokat PCR-készülékben 94 °C-on öt percig kell denaturálni, majd 30 (94 °C-on egy percig, 55 °C-on egy percig, 72 °C-on egy percig tartó) ciklust kell lefuttatni rajtuk, ezt követően pedig 72 °C-on 10 percig tartó végleges extenzió következik.
In situ hybridisation
Pozitív eredmény a várt méretben (300 bp) jelentkező pozitív PCR-amplifikáció; mindemellett valamennyi negatív kontrollnak negatívnak és valamennyi pozitív kontrollnak pozitívnak kell lennie.
X, and
A második PCR-protokoll SYBR® Green valós idejű PCR-próba.
DETAILED DIAGNOSTIC METHODS AND PROCEDURES FOR THE SURVEILLANCE AND CONFIRMATION OF INFECTION WITH BONAMIA OSTREAE
Ez lehetővé teszi a Bonamia ostreae (alábbiakban ismertetett) külön kimutatását és ötvözhető a Bonamia exitiosa külön kimutatását lehetővé tevő SYBR® Green valós idejű PCR-próbával (Ramilo et al., 2013).
I. Procedures for diagnosis of Infection with Bonamia ostreae
A BOSTRE-F (5′-TTACGTCCCTGCCCTTTGTA-3′) és a BOSTRE-R (5′-TCGCGGTTGAATTTTATCGT-3′) primer 208 bp terméket amplifikál.
When sampling and laboratory examination are carried out for the purpose of obtaining or maintaining a certain health status with regard to Bonamia ostreae as set out in Section I of Part 5 of Annex I or to confirm or rule out the presence of that listed disease in accordance with Article 57(b) of Directive 2006/88/EC, using the diagnostic methods set out in Section II of Part 5 of Annex I, the detailed diagnostic methods and procedures set out in following points I.1, I.2 and I.3 shall apply.
A PCR-elegyek SYBR® Green Master Mix (1X) oldatot, 0,3 μM forward és reverz primert, valamint 200 ng kivont DNS-t tartalmaznak.
Sample process
A templátokat valós idejű kimutatási rendszerben 95 °C-on 10 percig kell denaturálni, majd 35 (95 °C-on 30 másodpercig, 55 °C-on 45 másodpercig és 72 °C-on egy percig tartó) ciklust kell lefuttatni rajtuk.
Once sampled, oysters shall be maintained at 4 °C or on refrigerated ice for no more than 24 hours if samples include gaping molluscs and 72 hours if not, in a plastic bag including a label with details related to the nature and the origin of the oysters.
Az olvadáspontgörbét 55 °C és 95 °C között 0,5 °C-os lépésenként emelkedő hőmérsékleti skálán kell elemezni, és ennek során a fluoreszcenciát a hőmérséklet minden egyes változásakor fel kell jegyezni.
A 3 to 5 mm thick section of tissues including gills and heart tissue shall be used for the diagnostic of Bonamia ostreae by histology.
A pozitív kontrolloknak erősen fertőzött gazdaszervezetből származó genomikus DNS-ből vagy a célzott régióra kiterjedő gyűrűs DNS-ből kell állniuk.
Slides shall be air-dried, fixed in methanol or in absolute ethanol and stained using a commercially available blood-staining kit (namely such as Diff- Quik®/Hemacolor®.), in accordance with the manufacturer's instructions.
Pozitív eredménynek minősül az egyetlen olvadáspont-csúcsértékkel (78,25 ± 0,25 °C a Ramilo és társai által 2013-ban közzétett feltételek mellett) végzett pozitív PCR-amplifikálás; mindemellett valamennyi negatív kontrollnak negatívnak és valamennyi pozitív kontrollnak pozitívnak kell lennie.
Slides shall be observed first at × 200 magnification and then under oil immersion at × 1000 magnification.
Az rDNS génkomplexum kis alegységét (SSU) célzó próba alkalmazandó, bár ennél kimutatták, hogy keresztreakcióba lép a Haplosporidia család néhány más tagjával.
A positive result shall be the presence of small spherical or ovoid organisms (2 to 5 μm wide) within haemocytes.
A kopoltyúkból és az emésztőmirigyből származó szövetek metszeteit legalább 24 óráig Davidson-féle fixálóban kell fixálni, ezt paraffinbeágyazásos szövettani vizsgálat céljából történő rendes feldolgozás követi.
However, the parasite might also occur extracellularly.
A metszeteket 100 μl hibridizációs pufferrel (4 × SSC [standard citrátsó-oldat], 50 % formamid, 1 × Denhardt-féle oldat, 250 μg ml – 1 élesztő tRNS, 10 % dextrán-szulfát) kell inkubálni, amely a digoxigegin-jelölt próbából 20 ng-ot (a I.3.2. pontban ismertetett módon, a Bo és a Boas primerrel készített PCR-reakcióelegyből 2 μl-t) tartalmaz.
These organisms show a basophilic cytoplasm and an eosinophilic nucleus (colours may vary with the stain used) and, because they spread on the slide, they can appear wider on imprints than on histological examination.
A metszeteket kétszer öt percig 2 × SSC oldatban szobahőmérsékleten, valamint 42 °C-on egyszer 10 percig 0,4 × SSC oldatban át kell mosni.
Multinucleated cells may be observed.
Pozitív eredménynek minősül, ha a vérsejtek belsejében jelölt kórokozók figyelhetők meg, mindemellett valamennyi negatív kontrollnak negatív és valamennyi pozitív kontrollnak pozitívnak kell lennie.
Sections of tissue that include gills and digestive gland, shall be fixed for a period of at least 24 hours in Davidson's fixative followed by normal processing for paraffin histology and staining, for example with haematoxylin and eosin.
A célzott régiók: SSU rDNS és ITS1.
A positive result shall be the presence of parasites as very small cells of 2 to 5 μm wide within the haemocytes or free in the connective tissue or sinuses of gill, gut and mantle epithelium, often associated with an intense inflammatory reaction.
A Bonamia ostreae-fertőzés felügyeletére és megerősítésére szolgáló eljárások
To avoid any doubt, the parasite shall be observed inside the haemocyte for a positive diagnosis.
A Bonamia ostreae felügyeletéhez, valamint jelenlétének megerősítéséhez vagy gyanújának kizárásához az I. melléklet 5. részének II. szakaszában foglalt követelményeknek megfelelően az alábbi 5.1. táblázatban meghatározott iránymutatások szerinti diagnosztikai módszerek és kapcsolódó eljárások alkalmazandók.
DNA extraction kits, which are available commercially and usually produce high quality DNA suitable for use with the PCR protocols as detailed below, may be used.
táblázat
Two PCR protocols targeting the small subunit (SSU) rDNA may be used:
A felügyeleti programokhoz kapcsolódó diagnosztikai módszerek alkalmazására és a Bonamia ostreae-fertőzés kizárására vagy megerősítésére vonatkozó iránymutatások
the first one is a conventional PCR that amplify several members of the Haplosporidia including Bonamia spp.
Szív- vagy kopoltyúlenyomat
Primers designated Bo and Boas are 5′-CAT-TTA-ATT-GGT-CGG-GCC-GC-3′ and 5′-CTG-ATC-GTC-TTC-GAT-CCC-CC-3′ respectively, and amplify a 300 bp product.
A WHITE SPOT-BETEGSÉG (WSD) FELÜGYELETÉRE ÉS MEGERŐSÍTÉSÉRE SZOLGÁLÓ RÉSZLETES DIAGNOSZTIKAI MÓDSZEREK ÉS ELJÁRÁSOK
PCR mixtures contain buffer (500 mM KCl, 100 mM Tris/HCl [pH 9,0 at 25 °C] and 1 % Triton® X-100), 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP mix, 1 μM forward and reverse primers, 0,02 units μl– 1 Taq DNA polymerase, and 0,2 ng μl– 1 of the DNA template in a total volume of 50 μl.
A WSSV kimutatására szolgáló diagnosztikai eljárások
Samples shall be denatured in a thermocycler for five minutes at 94 °C before being submitted to 30 cycles (94 °C for one minute, 55 °C for one minute, 72 °C for one minute) followed by a final extension of 10 minutes at 72 °C.
Az I. melléklet 6. részének I. szakaszában meghatározott felügyeleti és felszámolási programok céljából, valamint a WSSV jelenlétének megerősítése vagy gyanújának kizárása céljából a 2006/88/EK irányelv 57. cikke b) pontja szerint – az I. melléklet 6. részének II. szakaszában meghatározott diagnosztikai módszerekkel – végzett mintavétel és laboratóriumi vizsgálat során az e rész 2–7. pontjában meghatározott részletes diagnosztikai módszerek és eljárások alkalmazandók.
A positive result shall be positive PCR amplification at the expected size (namely, 300 bp), with all negative controls being negative and all positive controls being positive;
A II. melléklet e részében ismertetett módszerek és eljárások a rákfélék betegségeivel foglalkozó európai uniós referencialaboratóriumban alkalmazott, az ISO 17025 szabvány alapján akkreditált vizsgálatból átültetett módszerek és eljárások.
the second PCR protocol is a SYBR® Green Real time PCR assay.
Más megközelítések is alkalmazhatók, amelyek során egyenértékű feltételek állnak fenn és más gyártók által előállított készletek használatára kerül sor, azonban az e részben ismertetettekkel egyenértékű érzékenységet és specifikusságot ezekben az esetekben is biztosítani kell.
It allows the specific detection of B. ostreae (described below) and may be combined with a SYBR® Green Real time PCR assay allowing the specific detection of B. exitiosa (Ramilo et al.
A PCR-amplifikált termékeket minden esetben szekvenálni kell a White spot-betegség vírusa (WSSV) fajtájának megerősítése érdekében.
2013).
A rákfélék WSSV-t tartalmazó (úszólábakból és kopoltyúkból származó) szövetei etanolban, RNAlater oldatban vagy – 80 °C-on gyorsfagyasztott állapotban tárolhatók.
Primers BOSTRE-F (5′- TTACGTCCCTGCCCTTTGTA-3′) and BOSTRE-R (5′- TCGCGGTTGAATTTTATCGT-3′) amplify a 208 bp product.
A WSSV szövetmintákból történő azonosításához szükséges szakaszok a következők: a szövet homogenizálása, a DNS kivonása, a WSSV-DNS PCR segítségével végzett célzott amplifikálása, az amplifikált termék gélen történő vizualizálása, a DNS tisztítása, valamint a kórokozó azonosítása céljából végzett szekvenálás.
PCR mixtures contain SYBR® Green Master Mix (1X), 0,3 μM forward and reverse primers, and 200 ng of extracted DNA.
Szövetek homogenizálása
Samples shall be denatured in a Real Time Detection System for 10 minutes at 95 °C before being submitted to 35 cycles (95 °C for 30 seconds, 55 °C for 45 seconds and 72 °C for one minute).
A szövetek roncsolását és a homogenátum megfelelő pufferben történő előkészítését Fast Prep szövetroncsolóval és Lysing Matrix A csövekkel (MP Biomedicals) kell végezni.
Melting temperature curve analysis shall be carried out with temperature increments of 0,5 °C/s starting at 55 °C and ending at 95 °C and recording fluorescence at each change of temperature.
A szövetek tömegét meg kell mérni, majd a szöveteket Lysing Matrix A csövekbe kell helyezni, 1:10 w/v arányban vagy a gyártó útmutatásának megfelelő pufferben (DNS szövetkészlettel (Qiagen) történő használatra szánt G2 és 10 μl K-proteináz pufferben) hígítani kell, majd Fast Prep 24 homogenizátorban két percig homogenizálni kell.
Positive controls shall consist in genomic DNA from a highly infected host or plasmidic DNA including the target region.
A homogenizált mintákat 56 °C-on legalább négy órán keresztül vagy egy éjszakán át inkubálni kell.
Negative controls shall consist in genomic DNA from non-infected hosts and PCR reactives without target DNA.
A mintákat vortex keverővel össze kell keverni, 9000 fordulat/perc fordulatszámon két percig centrifugálni kell, és 50 μl felülúszót vagy 5 mg szövetnek megfelelő mennyiséget (a kivonási készlethez optimális szövettömeget) kell DNS kivonására szolgáló mintatartó csőbe helyezni, és G2 puffer használatával a mennyiséget 200 μl-re kell növelni.
A positive result shall be positive PCR amplification with a unique melting temperature peak (78,25 ± 0,25 °C in the conditions published by Ramilo et al.
DNS-kivonó készlet és az EZ1 Advanced XL Biorobot (Qiagen) készülék segítségével, a gyártó útmutatása alapján az összes DNS-t ki kell vonni.
2013), with all negative controls being negative and all positive controls being positive.
Minden egyes mintatétellel együtt kivonási kontrollt (borjúcsecsemőmirigy-DNS) és negatív kontrollt (G2 puffer) kell futtatni.
A probe that targets the SSU of the rDNA gene complex shall be used although it was shown to cross react with some other members of the family Haplosporidia.
A DNS-t 50 μl térfogatban kell eluálni.
Sections of tissue that include gills and digestive gland shall be fixed for a period of at least 24 hours in Davidson's fixative followed by normal processing for paraffin histology.
A kivonás sikerességének biztosítása érdekében valamennyi minta és kontroll DNS-koncentrációját Nano Drop készülékkel kell meghatározni.
Sections shall be incubated with 100 μl of hybridisation buffer (4 × SSC [standard saline citrate], 50 % formamide, 1 × Denhardt's solution, 250 μg ml– 1 yeast tRNA, 10 % dextran sulphate) containing 20 ng (2 μl of the PCR reaction prepared as described in point I.3.2 using primers Bo and Boas) of the digoxigenin-labelled probe.
A kivont DNS-t – 20 °C-on le kell fagyasztani, ha nincs rá szükség azonnal.
Sections shall be washed twice for five minutes in 2 × SSC at room temperature, and once for 10 minutes in 0,4 × SSC at 42 °C.
WSSV kimutatására szolgáló polimeráz láncreakció (PCR)
A positive result shall correspond to labelled parasites inside the haemocytes, with all negative controls negative and all positive controls positive.
A WSSV kimutatásához alkalmazandó módszer az alábbi bekezdésekben meghatározott, fészek-PCR-rel végzendő WSSV-kimutatási protokoll, amely a PCR-ek első és második körében a 18s rRNS gén 1447 bp, illetve 848 bp méretű amplikonját amplifikálja.
Targeted regions shall be the SSU rDNA and ITS1.
A PCR-reakció első körét 50 μl térfogatban kell kialakítani, amelynek végső koncentrációja a következő: 1 × GoTaq puffer (Promega), 5 mM MgCl2, 1 pmol/μl WSSV 146 F1 primer, 1 pmol/μl WSSV 146 R1 primer (1. táblázat), 0,25 mM dNTPs, 1,25 egység Taq polimeráz és 2,5 μl DNS.
Procedures for surveillance and confirmation of infection with Bonamia ostreae
Minden mintát két példányban kell futtatni egy negatív kivonási kontroll, egy negatív PCR-kontroll (DNS helyett 2,5μl H2O hozzáadásával) és egy pozitív kontroll mellett.
For the purpose of surveillance and confirmation of the presence of or to rule out a suspicion of infection with Bonamia ostreae in accordance with the requirements laid down in Section II of Part 5 to Annex I, the diagnostic methods and corresponding procedures to be used shall be in accordance with the guidelines laid down in the following Table 5.1.
Pozitív kontrollként belső használatra előállított és validált hígított WSSV-plazmidot kell használni (az európai uniós referencialaboratóriumtól beszerezhető).
Table 5.1
A WSSV kimutatására szolgáló PCR-reakció második körét az első körrel megegyező módon kell kialakítani, de a WSSV 146F2/R2 primerkészlet és egy második pozitív kontroll használatával annak ellenőrzése érdekében, hogy a PCR e szakasza működött.
Guidelines for the use of diagnostic methods for the surveillance programmes and to rule out or confirm infection with Bonamia ostreae
A PCR-ek első és második körét az alábbi Ciklusparaméterek alkalmazásával, DNA Engine Tetrad 2 Peltier (vagy azzal egyenértékű) PCR-készülékben kell lefuttatni.
Heart or gill imprints
Az első lépés denaturálás 94 °C-on két percig, majd 30 ciklus 94 °C-on 30 másodperig, 62 °C-on 30 másodpercig, 72 °C-on 30 másodpercig, ezt követően extenzió 72 °C-on két percig és tartás 4 °C-on.
DETAILED DIAGNOSTIC METHODS AND PROCEDURES FOR SURVEILLANCE AND CONFIRMATION OF WHITE SPOT DISEASE (WSD)
Gélelektroforézis
Diagnostic procedures for detection of WSSV
A PCR-ek első és második köréből származó amplifikált PCR-termékeket TAE pufferrel készített 2 %-os agarózgélen kell vizualizálni.
When sampling and laboratory examination for the purpose of the surveillance and eradication programmes set out in Section I of Part 6 of Annex I and for the confirmation of the presence of or to rule out a suspicion of infection with WSSV are carried out in accordance with Article 57(b) of Directive 2006/88/EC, using the diagnostic methods set out in Section II of Part 6 of Annex I, the detailed diagnostic methods and procedures set out in points 2 to 7 of this Part shall apply.
Minden mintából 15 μl-t kell 120 V feszültségen kb. 20 percig futtatni és UV-fényben vizsgálni.
The methods and procedures described in this Part of Annex II are adapted from the ISO 17025 accredited test applied at the European Union Reference Laboratory for Crustacean Diseases.
A pozitív minták a PCR első körében 1447 bp sávszélességet, a PCR második körében 848 bp sávszélességet alakítanak ki.
Alternative approaches, using equivalent conditions or kits produced by different manufacturers, but which offer equivalent sensitivity and specificity to those described in this Part may be applied.
Az ekkora méretű mintákat ki kell vágni és 1,5 ml-es mikrocentrifuga-csőbe kell helyezni.
In all instances, PCR amplified product shall be sequenced to confirm identity as White spot syndrome virus (WSSV).
A géldarabokban található DNS-t Promega Wizard® SV géllel és PCR-tisztító rendszerrel kell kitisztítani a gyártó útmutatása szerint.