natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Definitions and abbreviations used in this test method are described in the Appendix.
A vizsgálati rendszer által rögzített, a T- és az E2-termelés módosulásának formájában megnyilvánuló változások a vizsgált vegyi anyagok és a H295R-sejtek által kifejezett szteroidogén funkciók közötti különböző kölcsönhatások következményei lehetnek.
A detailed protocol including instructions on how to prepare solutions, cultivate cells and perform various aspects of the test is available as Appendix I-III to the OECD document “Multi-Laboratory Validation of the H295R Steroidogenesis Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol Production” (4).
Ezek közé tartozik a génexpresszió, a szintézis vagy a szteroid hormonok előállításában, átalakításában vagy eliminációjában részt vevő enzimek funkciójának modulációja (12) (13) (14).
Five different enzymes catalysing six different reactions are involved in sex steroid hormone biosynthesis.
A hormontermelés gátlása bekövetkezhet a reakcióútban szereplő enzimhez való közvetlen kompetitív kötődés, a kofaktorokra – mint például az NADPH (nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát) és a cAMP (ciklikus adenozin-monofoszfát) – gyakorolt hatás és/vagy a szteroidmetabolizmus növekedése vagy a szteroidogenezis útvonalában szereplő bizonyos enzimek génexpressziójának gátlása révén.
Enzymatic conversion of cholesterol to pregnenolone by the cytochrome P450 (CYP) cholesterol side-chain cleavage enzyme (CYP11A) constitutes the initial step in a series of biochemical reactions that culminate in synthesis of steroid end-products.
Míg a gátlás a hormontermelésben szerepet játszó közvetlen vagy közvetett folyamatoknak egyaránt a függvénye lehet, az indukció tipikusan közvetett jellegű, mint például a kofaktorok, mint a NADPH és a cAMP befolyásolása (például a forskolin esetében), vagy a szteroidmetabolizmus csökkentése (13), illetve a szteroidogén génexpresszió feljebb szabályozása.
Depending upon the order of the next two reactions, the steroidogenic pathway splits into two paths, the Δ5-hydroxysteroid pathway and Δ4-ketosteroid pathway, which converge in the production of androstenedione (Figure 1).
A H295R-vizsgálatnak számos előnye van:
Androstenedione is converted to testosterone (T) by 17β-hydroxysteroid dehydrogenase (17β-HSD).
egyaránt lehetővé teszi a T- és E2-termelés növekedésének és csökkenésének kimutatását,
Testosterone is both an intermediate and end-hormone product.
lehetőséget biztosít a vegyi anyag sejtek életképességére gyakorolt lehetséges hatásának, citotoxicitásának közvetlen értékelésére.
In the male, T can be converted to dihydrotestosterone (DHT) by 5α-reductase, which is found in the cellular membranes, nuclear envelope, and endoplasmic reticulum of target tissues of androgenic action such as prostate and seminal vesicles.
Ez egy fontos tulajdonság, mivel lehetővé teszi a citotoxicitás miatti hatások megkülönböztetését a vegyi anyagok és a szteroidogén utak közötti közvetlen kölcsönhatások alapján fellépő hatásoktól, ami nem lehetséges a több, különböző érzékenységű és funkciójú sejttípusból álló szöveti explantátum rendszerekben,
DHT is significantly more potent as an androgen than T and is also considered an end-product hormone.
nem igényli állatok használatát,
The H295R assay does not measure DHT (see paragraph 10).
a H295R sejtvonal a kereskedelemben kapható.
The enzyme in the steroidogenic pathway which converts androgenic chemicals into oestrogenic chemicals is aromatase (CYP19).
A vizsgálat alapvető korlátai az alábbiak:
CYP19 converts T into 17β-oestradiol (E2) and androstenedione into oestrone.
A vizsgálat nem méri a DHT-t és ezért nem várható, hogy kimutassa az 5α-reduktáz gátló vegyi anyagokat, amelyek esetében a Hershberger assay-t (16) lehet használni.
E2 and T are considered end-product hormones of the steroidogenic pathway.
A H295R-vizsgálat nem fogja érzékelni azokat a vegyi anyagokat, amelyek a hipotalamusz-hipofízis-gonád tengely (HPG) befolyásolása révén zavarják a szteroidogenezist, mivel azt csak ép állatokban lehet vizsgálni.
The specificity of the lyase activity of CYP17 differs for the intermediate substrates among species.
A vizsgálat célja a T- és E2-termelést befolyásoló vegyi anyagok kimutatása.
In the human, the enzyme favours substrates of the Δ5-hydroxysteroid pathway (pregnenolone), whereas substrates in the Δ4-ketosteroid pathway (progesterone) are favoured in the rat (19).
A T egyúttal egy köztes termék is az E2 előállításához vezető úton.
Such differences in the CYP17 lyase activity may explain some species-dependent differences in response to chemicals that alter steroidogenesis in vivo (6).
A vizsgálat képes észlelni azokat a vegyi anyagokat, amelyek tipikusan gátolják vagy indukálják a szteroidogenezis-útvonal enzimeit.
The H295 cells have been shown to most closely reflect human adult adrenal enzyme expression and steroid production pattern (20), but are known to express enzymes for both the Δ5-hydroxysteroid and Δ4-ketosteroid pathways for androgen synthesis (7) (11) (13) (15).
A vizsgálatot rendszerint standard sejttenyésztési körülmények között, 24-lyukú szövettenyésztő lemezeken végezzük.
Steroidogenic pathway in H295R cells.
A többlyukú lemezen történt 24 órás akklimatizációs időszak után a sejteket 48 órán keresztül a vizsgált vegyi anyag hét koncentrációjának tesszük ki legalább három példányban.
Enzymes are in italics, hormones are bolded and arrows indicate the direction of synthesis.
Negatív és pozitív kontrollként oldószert, egy ismert hormoninhibitort és egy hormontermelést indukáló anyagot futtatunk rögzített koncentrációban.
Gray background indicates corticosteroid pathways/products.
Az expozíciós idő végén minden lyukból eltávolítjuk a táptalajt.
Sex steroid pathways/products are circled.
Az egyes lyukakban lévő sejtek életképességét a táptalaj eltávolítása után azonnal elemezzük.
CYP = cytochrome P450;
Különböző módszerekkel lehet mérni a hormonok koncentrációját a táptalajban, beleértve a kereskedelmi forgalomban kapható hormonmérő készleteket és/vagy a műszeres technikákat, mint például a folyadékkromatográfia-tömegspektrometriát (LC-MS).
HSD = hydroxysteroid dehydrogenase;
Az adatokat az oldószer kontrollhoz és a megfigyelhető hatást okozó legalacsonyabb koncentrációhoz (LOEC) viszonyított valahányszoros változásban fejezzük ki.
DHEA = dehydroepiandrosterone.
Ha a vizsgálat eredménye negatív, a legnagyobb vizsgált koncentrációt megfigyelhető hatást nem okozó koncentrációként (NOEC) jegyzőkönyvezzük.
The human H295R adreno-carcinoma cell line is a useful in vitro model for the investigation of effects on steroid hormone synthesis (2) (7) (8) (9) (10).
A vegyi anyag szteroidogenezist befolyásoló képességére vonatkozó következtetést legalább két független tesztre kell alapozni.
Changes recorded by the test system in the form of alteration in the production of T and E2 can be the result of a multitude of different interactions of test chemicals with steroidogenic functions that are expressed by the H295R cells.
Bevezetés
These include modulation of the expression, synthesis or function of enzymes involved in the production, transformation, or elimination of steroid hormones (12) (13) (14).
Mivel az E2-termelő kapacitás a sejtek életkorának/passzálások számának növekedésével változik (2), a sejteket használat előtt egy adott protokoll szerint kell tenyészteni, és fel kell jegyezni a sejtek kiolvasztása óta történt passzálások számát, valamint annak az passzálásnak a sorszámát is, amelyen a sejteket lefagyasztottuk és folyékony nitrogén tárolóba helyeztük.
Inhibition of hormone production can be due to direct competitive binding to an enzyme in the pathway, impact on co-factors such as NADPH (Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate) and cAMP (cyclic Adenosine Monophosphate), and/or increase in steroid metabolism or suppression of gene expression of certain enzymes in the steroidogenesis pathway.
Az első szám a passzálások számát jelzi, a második szám pedig leírja annak a passzálásnak a számát, amelyen a sejteket lefagyasztottuk és betároltuk.
While inhibition can be a function of both direct or indirect processes involved with hormone production, induction is typically of an indirect nature, such as by affecting co-factors such as NADPH and cAMP (as in the case of forskolin), decreasing steroid metabolism (13), and or up-regulating steroidogenic gene expression.
Például, azokat a sejteket, amelyeket az ötödik passzálás után fagyasztottunk le, majd felolvasztottunk, és ismételt tenyésztést követően háromszor felosztottunk (4 passzálás, a frissen felolvasztott sejteket 1. passzálásnak tekintve), 4.5 passzálásként címkéznénk fel.
The H295R assay has several advantages:
A számozási rendszer egy példáját a validálási jelentés I. függeléke szemlélteti (4).
It allows for the detection of both increases and decreases in the production of both T and E2;
A kiegészített és fagyasztó táptalajok alapjaként alapközeget használunk.
It does not require the use of animals;
Használat előtt a Nu-szérumot (vagy az olyan összehasonlítható tulajdonságokkal rendelkező szérumot, amelyről kimutatták, hogy a vizsgálati teljesítményre és minőség-ellenőrzésre (QC) vonatkozó követelményeknek megfelelő adatokat produkál) – amely a kiegészített táptalajok alkotórésze – analizálni kell a háttér T- és E2-koncentráció szempontjából.
The H295R cell line is commercially available.
Az oldatok előkészítését a validálási jelentés II. függeléke írja le (4).
The principle limitations of the assay are as follows:
Az eredeti ATCC-tételből származó H295R-sejttenyészet megkezdését követően a sejteket öt passzáláson keresztül kell tenyészteni (azaz a sejteket 4-szer kell felosztani).
Its metabolic capability is unknown but probably quite limited;
Az ötödik passzázs sejtjeit ezután folyékony nitrogénben lefagyasztjuk tárolás céljából.
therefore, chemicals that need to be metabolically activated will probably be missed in this assay.
A sejtek lefagyasztása előtt a negyedik passzázs sejtjeiből vett mintát lefuttatjuk egy QC-lemezen (lásd a 36. és 37. bekezdést) annak ellenőrzése céljából, hogy a hormonok termelődése és a pozitív kontroll vegyi anyagokra adott válasz megfelel-e a vizsgálat minőségbiztosítási kritériumainak, amelyeket az 5. táblázat tartalmaz.
Being derived from adrenal tissue, the H295R possesses the enzymes capable of producing the gluco-, and mineral-corticoids as well as the sex hormones;
A H295R-sejteket tenyészteni kell, le kell fagyasztani és folyékony nitrogénben kell tárolni annak érdekében, hogy folyamatosan rendelkezésre álljanak megfelelő passzálású/korú sejtek a tenyésztés és a használat céljára.
therefore, effects on the production of gluco-, and mineral corticoids could influence the levels of T and E2 observed in the assay.
Egy új [15] vagy fagyasztott [16] sejttétel tenyésztésbe vétele utáni passzálások maximális száma, amely még elfogadható a H295R-vizsgálatban való használatra, nem haladhatja meg a 10-et.
It does not measure DHT and, therefore, would not be expected to detect chemicals that inhibit 5α-reductase in which case the Hershberger assay (16) can be used.
Például az 5. passzázsban lefagyasztott tételből származó sejtkultúrák passzálásainak elfogadható száma 4.5-10.5 lenne.
The H295R assay will not detect chemicals that interfere with steroidogenesis by affecting the hypothalamic-pituitary-gonadal axis (HPG) axis as this can only be studied in intact animals.
Az ezekből a fagyasztott tételekből indult sejtek esetében a 19. bekezdésben leírt eljárást kell követni.
The purpose of the assay is the detection of chemicals that affect T and E2 production.
Ezeket a sejteket legalább négy (4) további passzáláson át kell tenyészteni (passzázs-szám 4,5) a tesztelésben való használatot megelőzően.Sejtek indítása fagyasztott állományból
T is also an intermediate in the pathway to produce E2.
A sejtek fagyasztott állományból történő indítására vonatkozó eljárást kell alkalmazni, amikor egy új sejttételt tenyésztés és tesztelés céljából kiemelünk a folyékony nitrogén tartályból.
The assay can detect chemicals that typically inhibit or induce the enzymes of the steroidogenesis pathway.
Ennek az eljárásnak a részleteit a validálási jelentés III. függeléke tartalmazza (4).
The assay is usually performed under standard cell culture conditions in 24-well culture plates.
A sejteket eltávolítjuk a folyékony nitrogén tartályból, gyorsan felolvasztjuk, kiegészített táptalajban egy centrifugacsőbe helyezzük, szobahőmérsékleten centrifugáljuk, újraszuszpendáljuk a kiegészített táptalajban, majd átvisszük egy sejttenyésztő edénybe.
Alternatively, other plate sizes can be used for conducting the assay;
A táptalajt a következő napon le kell cserélni.
however, seeding and experimental conditions should be adjusted accordingly to maintain adherence to the performance criteria.
A H295R-sejteket 37 °C-on inkubátorban tenyésztjük 5 % CO2-t tartalmazó levegő atmoszférában, és a táptalajt hetente 2-3 alkalommal megújítjuk.
After an acclimation period of 24 h in multi-well plates, cells are exposed for 48 h to seven concentrations of the test chemical in at least triplicate.
Amikor a sejtkultúra körülbelül 85–90 %-ban egybefolyik, akkor meg kell osztani.
Solvent and a known inhibitor and inducer of hormone production are run at a fixed concentration as negative and positive controls.
A sejtek megosztására azért van szükség, hogy biztosítsuk a sejtek egészségét és növekedését, és hogy fenntartsuk a sejtkultúrát a biológiai tesztek elvégzésére.
At the end of the exposure period, the medium is removed from each well.
A sejteket háromszor átöblítjük foszfáttal pufferelt sóoldattal (PBS, Ca2+ Mg2+ nélkül), és felszabadítjuk a sejttenyésztő edényből egy megfelelő leválasztó enzim, például tripszin PBS-ben (Ca2+ Mg2+ nélkül) való hozzáadásával.
Cell viability in each well is analysed immediately after removal of medium.
Közvetlenül azután, hogy a sejtek leválnak a sejttenyésztő edényről, az enzimes eljárást le kell állítani úgy, hogy kiegészített táptalajt adunk hozzá a kultúrához az enzimes kezeléshez használt térfogat háromszoros mennyiségében.
Concentrations of hormones in the medium can be measured using a variety of methods including commercially available hormone measurement kits and/or instrumental techniques such as liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS).
A sejteket behelyezzük egy centrifugacsőbe, szobahőmérsékleten centrifugáljuk, a felülúszót elöntjük, és a sejtpelletet újraszuszpendáljuk kiegészített táptalajban.
Data are expressed as fold change relative to the solvent control and the Lowest-Observed-Effect-Concentration (LOEC).
Megfelelő mennyiségű sejtoldatot áthelyezünk az új sejttenyésztő edénybe.
If the assay is negative, the highest concentration tested is reported as the No-Observed-Effect-Concentration (NOEC).
A sejtoldat mennyiségét úgy kell beállítani, hogy a sejtek 5–7 napon belül összefolyjanak.
Conclusions regarding the ability of a chemical to affect steroidogenesis should be based on at least two independent test runs.
Az ajánlott másodlagos tenyésztési arány 1:3-1:4.
The first test run may function as a range finding run with subsequent adjustment of concentrations for runs 2 and 3, if applicable, if solubility or cytotoxicity problems are encountered or the activity of the chemical seems to be at the end of the range of concentrations tested.
A lemezt gondosan fel kell címkézni.
CULTURE PROCEDURE
A sejtek most már készen állnak a vizsgálatban való felhasználásra és a felesleges sejteket le kell fagyasztani folyékony nitrogénben a 20. bekezdésben leírtak szerint.
Cell Line
A H295R-sejtek lefagyasztása (a sejtek előkészítése a folyékony nitrogénben való tárolásra)
The NCI-H295R cells are commercially available from the American Type Culture Collections (ATCC) upon signing a Material Transfer Agreement (MTA) [14].
A H295R-sejtek fagyasztásra történő előkészítése érdekében a sejtek felosztására vonatkozó fentiekben leírt eljárást kell követni a sejtpelletnek a centrifugacső alján történő újraszuszpendálásáig.
Introduction
Itt a sejtpelletet a fagyasztó táptalajban kell újraszuszpendálni.
Due to changes in the E2 producing capacity of the cells with increasing age/passages (2), cells should be cultured following a specific protocol before they are used and the number of passages since the cells were defrosted as well as the passage number at which the cells were frozen and placed in liquid nitrogen storage should be noted.
Az oldatot átvisszük egy megfelelően felcímkézett kriogén fiolába, és – 80 °C hőmérsékleten 24 órán keresztül fagyasztjuk, majd a kriogén fiolát folyékony nitrogénbe helyezzük tárolás céljából.
The first number indicates the actual cell passage number and the second number describes the passage number at which the cells were frozen and placed in storage.
A sejtek lemezre ültetése és előzetes inkubálása tesztelés céljából
For example, cells that were frozen after passage five and defrosted and then were split three times (4 passages counting the freshly thawed cells as passage 1) after they were cultured again would be labelled passage 4.5.
Az, hogy a 19. bekezdésben körvonalazott módon előkészített 24-lyukú lemezekből mennyire lesz szükség, a vizsgálandó vegyi anyagok számától és a tenyésztőedényekben lévő sejtek konfluenciájától függ.
An example of a numbering scheme is illustrated in Appendix I to the validation report (4).
Általános szabály, hogy a 80–90 %-ban összefolyó sejtek egy sejttenyésztő edénye (75 cm2) elegendő mennyiségű sejtet szolgáltat 1,5 (24-lyukú) lemezhez 200000-300000 sejt/ml táptalaj célsűrűség mellett, aminek eredményeként körülbelül 50–60 %-os összefolyás érhető el a lyukakban 24 óra alatt (2. ábra).
Stock medium is used as the base for the supplemented and freezing mediums.
Általában ez az optimális sejtsűrűség a hormontermeléshez a vizsgálatban.
Supplemented medium is a necessary component for culturing cells.
Nagyobb sűrűség esetén a T- és E2-termelési minták megváltoznak.
Freezing medium is specifically designed to allow for impact-free freezing of cells for long-term storage.
A vizsgálat első alkalommal történő elvégzése előtt ajánlott tesztelni a 200000 és 300000 sejt/ml közötti különböző ültetési sűrűségeket, és a lyukakban 24 óra alatt 50–60 %-os összefolyást eredményező sűrűséget kell kiválasztani a további kísérletekhez.
Prior to use, Nu-serum (or a comparable serum of equal properties that has been demonstrated to produce data that meets the test performance and Quality Control (QC) requirements), which is a constituent of supplemented media, should be analysed for background T and E2 concentrations.
yukú tenyésztőlemezen 24 óra után 50 %-os ültetési sűrűségű H295R-sejtek mikrofotogramja a lyuk szélén (A) és közepén (B)
The preparation of these solutions is described in Appendix II to the validation report (4).
P-állatok boncolása
After initiation of an H295R cell culture from an original ATCC batch, cells should be grown for five passages (i.e.the cells are split 4 times).
Pároztatás előtt
Passage five cells are then frozen in liquid nitrogen for storage.
Pároztatás után
Prior to freezing the cells, a sample of the previous passage four cells is run in a QC plate (See paragraph 36 and 37) to verify whether the basal production of hormones and the response to positive control chemicals meet the assay quality control criteria as defined in Table 5.
2 hét
H295R cells need to be cultured, frozen and stored in liquid nitrogen to make sure that there are always cells of the appropriate passage/age available for culture and use.
6 hét
The maximum number of passages after taking a new [15] or frozen [16] batch of cells into culture that is acceptable for use in the H295R assay should not exceed 10.
Vemhesség
For example, acceptable passages for cultures of cells from a batch frozen at passage 5 would be 4.5 through 10.5.
Szoptatás
For cells started from these frozen batches, the procedure described in paragraph 19 should be followed.
Méhen belüli fejlődés
These cells should be cultured for at least four (4) additional passages (passage 4.5) prior to their use in testing.Starting Cells from the Frozen Stock
Elválasztás előtt
The procedure for starting the cells from frozen stock is to be used when a new batch of cells is removed from liquid nitrogen storage for the purpose of culture and testing.
Elválasztás után
Details for this procedure are set forth in Appendix III to the validation report (4).
Szülői generáció
Cells are removed from liquid nitrogen storage, thawed rapidly, placed in supplemented medium in a centrifuge tube, centrifuged at room temperature, re-suspended in supplemented medium, and transferred to a culture flask.
Kohort
The medium should be changed the following day.
Cél
The H295R cells are cultivated in an incubator at 37 °C with 5 % CO2 in air atmosphere and the medium is renewed 2-3 times per week.
Állat/kohort
When the cells are approximately 85-90 % confluent, they should be split.
Hozzávetőleges életkor boncoláskor (hét)
Splitting of the cells is necessary to ensure the health and growth of the cells and to maintain cells for performing bioassays.
A cél 20 alom csoportonként
The cells are rinsed three times with phosphate-buffered saline (PBS, without Ca2+ Mg2+.) and freed from the culture flask by the addition of an appropriate detachment enzyme, e.g. trypsin, in PBS (without Ca2+ Mg2+).
Felesleg
Immediately after the cells detach from the culture flask, the enzyme action should be stopped with the addition of supplemented medium at a ratio of 3× the volume used for the enzyme treatment.
Reprodukció
Cells are placed into a centrifuge tube, centrifuged at room temperature, the supernatant is removed and the pellet of cells is re-suspended in supplemented medium.
Neurotoxicitás
The appropriate amount of cell solution is placed in the new culture flask.
Immonutoxicitás
The amount of cell solution should be adjusted so that the cells are confluent within 5-7 days.
Tartalék
The recommended sub-cultivation ratio is 1:3 to 1:4.
20 H + 20 N
The plate should be carefully labelled.
10 H + 10 N @
The cells are now ready to be used in the assay and excess cells should be frozen in liquid nitrogen as described in paragraph 20.
14 vagy 20-25, ha szükségessé válik
Freezing H295R Cells (preparing cells for liquid nitrogen storage)
@ Almonként egy, összességében reprezentatív a 20 alomra nézve, ha lehetséges
To prepare H295R cells for freezing, the procedure described above for splitting cells should be followed until the step for re-suspending the pellet of cells in the bottom of the centrifuge tube.
A táptalajt lepipettázzuk a sejttenyésztő edényből, és a sejteket 3-szor átöblítjük steril PBS-sel (Ca2+ Mg2+ nélkül).
Here, the pellet of cells is re-suspended in freezing medium.
Enzimoldatot (PBS-ben) adunk hozzá, amely elválasztja a sejteket a sejttenyésztő edénytől.
The solution is transferred to a cryogenic vial, labelled appropriately, and frozen at – 80 °C for 24 hours after which the cryogenic vial is transferred to liquid nitrogen for storage.
A sejtek leválására biztosított megfelelő idő után az enzimes eljárást le kell állítani úgy, hogy kiegészített táptalajt adunk hozzá a kultúrához az enzimes kezeléshez használt térfogat háromszoros mennyiségében.
Plating and Pre-incubation of Cells for Testing
A sejteket behelyezzük egy centrifugacsőbe, szobahőmérsékleten centrifugáljuk, a felülúszót elöntjük, és a sejtpelletet kiegészített táptalajban újraszuszpendáljuk.
The number of 24-well plates, prepared as outlined in paragraph 19, that will be needed depends on the number of chemicals to be tested and the confluency of the cells in the culture dishes.
A sejtsűrűséget például hemocitométerrel vagy sejtszámlálóval kiszámítjuk.
As a general rule, one culture flask (75 cm2) of 80-90 % confluent cells will supply sufficient cells for one to 1,5 (24-well) plates at a target density of 200000 to 300000 cells per ml of medium resulting in approximately 50-60 % confluency in the wells at 24 hours (Figure 2).
A sejtoldatot fel kell hígítani a kívánt ültetési sűrűségre és alaposan össze kell keverni a homogén sejtsűrűség biztosítása érdekében.
This is typically the optimal cell density for hormone production in the assay.
A sejteket 1 ml sejtoldat/lyuk mennyiségben kell ültetni, illetve a lemezeket és lyukakat fel kell címkézni.