natgillin/translations-raw huggingface dataset:
In the absence of kinetic data a suitable compromise for the measurement of genotoxicity is to sample at 2-6 h after the last treatment for two or more treatments, or at both 2-6 and 16-26 h after a single administration, although care should be taken to necropsy all animals at the same time after the last (or only) dose.
Važni čimbenici koje treba uzeti u obzir trebali bi uključivati put primjene (na temelju vjerojatnog puta (putova) izloženosti ljudi), predviđenu tkivnu distribuciju i apsorpciju, ulogu metabolizma i moguće mehanizme djelovanja ispitivanih kemikalija.
Information on the appearance of toxic effects in target organs (if available) may also be used to select appropriate sampling times.
Jetra je najčešće proučavano tkivo i za nju postoji najviše podataka.
General clinical observations related to the health of the animals should be made and recorded at least once a day preferably at the same time(s) each day and considering the peak period of anticipated effects after dosing (54).
Stoga, u nedostatku osnovnih informacija te ako ne postoje razlozi za odabir nekog točno određenog tkiva, opravdano je uzorkovati jetru jer je ona primarno mjesto ksenobiotičkog metabolizma i često je u velikoj mjeri izložena kako izvornoj tvari (tvarima) tako i njezinu metabolitu (metabolitima).
At least twice daily, all animals should be observed for morbidity and mortality.
U nekim slučajevima može biti najrelevantnije ispitati mjesto izravnog dodira (na primjer, žljezdani želudac ili duodenum/jejunum ako je riječ o kemikalijama koje se daju oralnim putem, ili pluća ako je riječ o inhaliranim kemikalijama).
For longer duration studies, all animals should be weighed at least once a week, and at completion of the test period.
Dodatna ili alternativna tkiva trebalo bi odabrati uzimajući u obzir konkretne razloge zbog kojih se ispitivanje provodi, ali može biti korisno ispitati više tkiva iste životinje pod uvjetom da je laboratorij dokazao da je osposobljen za rad s tim tkivima te da je u stanju obrađivati više tkiva u isto vrijeme.
Food consumption should be measured at each change of food and at least weekly.
Priprema uzoraka
Animals exhibiting non-lethal indicators of excessive toxicity should be euthanized prior to completion of the test period, and are generally not used for comet analysis.
Za postupke opisane u sljedećim stavcima (44. do 49.) važno je da sve otopine ili stabilne suspenzije budu upotrijebljene prije isteka njihove valjanosti ili da budu svježe pripremljene ako je potrebno.
Tissue Collection
U sljedećim stavcima, isto tako, vremena potrebna za i. uzimanje svakog tkiva nakon obdukcije, ii. obradu svakog tkiva da bi se dobile suspenzije stanica/jezgri te iii. obradu suspenzije i pripremu predmetnih stakalaca smatraju se kritičnim varijablama (vidjeti definicije, Dodatak 1.) te bi prihvatljivo trajanje svake od tih etapa trebalo odrediti tijekom uspostavljanja metode i dokazivanja tehničke osposobljenosti.
Since it is possible to study induction of DNA strand breaks (comets) in virtually any tissue, the rationale for selection of tissue(s) to be collected should be clearly defined and based upon the reason for conducting the study together with any existing ADME, genotoxicity, carcinogenicity or other toxicity data for the test chemicals under investigation.
Životinje se eutanaziraju, u skladu s važećim zakonodavstvom o dobrobiti životinja i načelima 3R, u odgovarajućem trenutku (trenucima) nakon zadnje primjene ispitivane kemikalije.
Important factors for consideration should include the route of administration (based on likely human exposure route(s)), the predicted tissue distribution and absorption, the role of metabolism and the possible mechanism of action of the test chemicals.
Odabrano se tkivo uklanja (odabrana se tkiva uklanjaju), disecira (diseciraju) te se dio uzima za komet-test, pri čemu bi se istodobno trebao uzeti isječak iz istog dijela tkiva te staviti u otopinu formaldehida ili odgovarajući fiksativ za eventualnu histopatološku analizu (vidjeti stavak 55.) u skladu sa standardnim metodama (12.).
The liver has been the tissue most frequently studied and for which there are the most data.
Tkivo za komet-test stavlja se u pufer za usitnjavanje, pomno se ispere hladnim puferom za usitnjavanje kako bi se uklonila rezidualna krv te se do obrade čuva u izrazito ledenom puferu za usitnjavanje.
Therefore, in the absence of any background information, and if no specific tissues of interest are identified, sampling the liver would be justified as this is a primary site of xenobiotic metabolism and is often highly exposed to both parent substance(s) and metabolite(s).
Može se isto tako izvesti in situ perfuzija, npr. za jetru, bubrege.
In some cases, examination of a site of direct contact (for example, for orally-administered chemicals the glandular stomach or duodenum/jejunum, or for inhaled chemicals the lungs) may be most relevant.
Objavljen je veliki broj metoda izoliranja stanica/jezgri.
Additional or alternative tissues should be selected based on the specific reasons for the test is being conducted but it may be useful to examine multiple tissues in the same animals providing the laboratory has demonstrated proficiency with those tissues and competency in handling multiple tissues at the same time.
One uključuju usitnjavanje tkiva poput jetre i bubrega, struganje mukozne površine u slučaju gastrointestinalnog trakta, homogenizaciju i enzimsku digestiju.
Preparation of specimens
U validacijskom ispitivanju koje je proveo JaCVAM proučavane su samo izolirane stanice pa je stoga u smislu uspostavljanja metode i upućivanja na podatke iz ispitivanja koje je proveo JaCVAM tijekom dokazivanja tehničke osposobljenosti poželjno upotrijebiti izolirane stanice.
For the processes described in the following paragraphs (44-49) it is important that all solutions or stable suspensions should be used within their expiration date, or should be freshly prepared if needed.
Međutim, pokazalo se da se rezultat testa ne razlikuje bitno bez obzira na to jesu li upotrijebljene izolirane stanice ili jezgre (8.).
Also in the following paragraphs, the times taken to (i) remove each tissue after necropsy, (ii) process each tissue into cell/nuclei suspensions, and (iii) process the suspension and prepare the slides are all considered critical variables (see Definitions, Appendix 1), and acceptable lengths of time for each of these steps should have been determined during establishment of the method and demonstration of proficiency.
Isto tako, različite metode izoliranja stanica/jezgri (npr. homogenizacija, usitnjavanje, enzimska digestija i filtriranje kroz mrežicu) dale su usporedive rezultate (55.).
Animals will be euthanised, consistent with effective animal welfare legislation and 3Rs principles, at the appropriate time(s) after the last treatment with a test chemical.
Stoga se mogu upotrijebiti izolirane stanice ili izolirane jezgre.
Selected tissue(s) is removed, dissected, and a portion is collected for the comet assay, whilst at the same time a section from the same part of the tissue should be cut and placed in formaldehyde solution or appropriate fixative for possible histopathology analysis (see paragraph 55) according to standard methods (12).
Laboratorij bi trebao temeljito ocijeniti i validirati metode izoliranja pojedinačnih stanica/jezgri koje su specifične za pojedino tkivo.
The tissue for the comet assay is placed into mincing buffer, rinsed sufficiently with cold mincing buffer to remove residual blood, and stored in ice-cold mincing buffer until processed.
Kao što je navedeno u stavku 40., neke lezije koje dovode do lomova lanaca DNK koji se otkrivaju komet-testom mogu trajati vrlo kratko (52., 53.).
In situ perfusion may also be performed, e.g. for liver, kidney.
Stoga, neovisno o tome koja se metoda upotrebljava za pripremu suspenzija pojedinačnih stanica/jezgri, važno je tkiva obraditi što je prije moguće nakon eutanazije životinja te ih smjestiti u uvjete kojima se smanjuje nestanak lezija (npr. držati tkiva na niskoj temperaturi).
Many published methods exist for cell/nuclei isolation.
Sve dok ne budu spremne za upotrebu, suspenzije stanica trebalo bi držati na vrlo niskoj temperaturi kako bi se mogle dokazati minimalne varijacije među uzorcima i odgovarajući odgovori kod pozitivnih i negativnih kontrola.
These include mincing of tissues such as liver and kidney, scraping mucosal surfaces in the case of the gastro-intestinal tract, homogenization and enzymic digestion.
PRIPREMA PREDMETNIH STAKALACA
The JaCVAM validation trial only studied isolated cells, and therefore in terms of establishing the method and being able to refer to the JaCVAM trial data for demonstration of proficiency, isolated cells are preferred.
Predmetna stakalca trebalo bi pripremiti što je prije moguće (idealno bi bilo u roku od jednog sata) nakon pripreme pojedinačnih stanica/jezgri, ali bi temperaturu i vrijeme između smrti životinje i pripreme predmetnih stakalaca trebalo strogo kontrolirati i validirati u uvjetima laboratorija.
However, it has been shown that there was no essential difference in the assay result whether isolated cells or nuclei were used (8).
Volumen stanične suspenzije koji se dodaje agarozi niskog tališta (obično od 0,5 do 1,0 %) kako bi se pripremila predmetna stakalca ne bi smio sniziti postotak agaroze niskog tališta na manje od 0,45 %.
Also different methods to isolate cells/nuclei (e.g. homogenizing, mincing, enzymic digestion and mesh filtration) gave comparable results (55).
Optimalna gustoća stanica određuje se sustavom za analizu slike koji se upotrebljava za brojanje kometa.
Consequently, either isolated cells or isolated nuclei can be used.
Liza
A laboratory should thoroughly evaluate and validate tissue-specific methods of single cell/nuclei isolation.
Uvjeti liziranja isto su tako kritična varijabla i mogu utjecati na lomove lanaca koji nastaju zbog specifičnih vrsta modifikacije DNK (alkilacije i stvaranja adukata na bazama DNK).
As discussed in paragraph 40, the persistence of some of the lesions that lead to the DNA strand breaks detected by the comet assay may be very short (52) (53).
Stoga se preporučuje održavati uvjete liziranja konstantnima koliko je god moguće za sva predmetna stakalca unutar pokusa.
Therefore, whatever method is used to prepare the single cell/nuclei suspensions, it is important that tissues are processed as soon as possible after the animals have been euthanised and placed in conditions that reduce the removal of lesions (e.g. by maintaining the tissue at low temperature).
Nakon pripreme predmetna stakalca trebalo bi namakati u rashlađenoj otopini za lizu najmanje jedan sat (ili preko noći) na oko 2 do 8 °C pod prigušenim svjetlom, npr. žutim svjetlom (ili u svjetlonepropusnim uvjetima) kako bi se izbjeglo izlaganje bijelom svjetlu koje može sadržavati UV komponente.
The cell suspensions should be kept ice-cold until ready for use, so that minimal inter-sample variation and appropriate positive and negative control responses can be demonstrated.
Nakon tog razdoblja inkubacije predmetna stakalca trebalo bi isprati kako bi se uklonili ostaci deterdženta i soli prije faze alkalnog odmatanja.
PREPARATION OF SLIDES
To se može učiniti s pomoću pročišćene vode, pufera za neutralizaciju ili fosfatnog pufera.
Slide preparation should be done as soon as possible (ideally within one hour) after single cell/nuclei preparation, but the temperature and time between animal death and slide preparation should be tightly controlled and validated under the laboratory's conditions.
Može se upotrijebiti i pufer za elektroforezu.
The volume of the cell suspension added to low melting point agarose (usually 0,5-1,0 %) to make the slides should not reduce the percentage of low melting point agarose to less than 0,45 %.
Time će se održavati alkalni uvjeti u komori za elektroforezu.
The optimum cell density will be determined by the image analysis system used for scoring comets.
Odmatanje i elektroforeza
It is therefore recommended that the lysis conditions be kept as constant as possible for all slides within an experiment.
Predmetna stakalca trebalo bi postaviti u kadicu za elektroforezu na uravnotežen način kako bi se ublažili učinci eventualnih tendencija ili efekt ruba unutar kadice te smanjila varijabilnost među šaržama, tj. u svakom ciklusu elektroforeze trebao bi biti jednak broj predmetnih stakalaca s materijalom od svake životinje koja se upotrebljava u istraživanju te bi trebalo uključiti i uzorke različitih skupina doza te negativne i pozitivne kontrole.
Once prepared, the slides should be immersed in chilled lysing solution for at least one hour (or overnight) at around 2-8 °C under subdued lighting conditions e.g. yellow light (or light proof) that avoid exposure to white light that may contain UV components.
Predmetna stakalca trebalo bi držati u kadici najmanje 20 minuta kako bi se odmotao DNK te ih potom podvrgnuti elektroforezi u kontroliranim uvjetima kojima se maksimiziraju osjetljivost i dinamički raspon testa (tj. koji dovode do prihvatljivih postotaka DNK u repu kometa, kod pozitivnih i negativnih kontrola, kojima se osigurava maksimalna osjetljivost).
After this incubation period, the slides should be rinsed to remove residual detergent and salts prior to the alkali unwinding step.
Stupanj migracije DNK linearno je povezan s trajanjem elektroforeze, kao i s potencijalom (V/cm).
This can be done using purified water, neutralization buffer or phosphate buffer.
Prema ispitivanju koje je proveo JaCVAM, to bi moglo biti 0,7 V/cm tijekom najmanje 20 minuta.
Electrophoresis buffer can also be used.
Trajanje elektroforeze smatra se kritičnom varijablom te bi vrijeme elektroforeze trebalo odrediti tako da se osigura optimalan dinamički raspon.
This would maintain the alkaline conditions in the electrophoresis chamber.
Dulje trajanje elektroforeze (npr.
Unwinding and electrophoresis
30 ili 40 minuta radi maksimiziranja osjetljivosti) obično dovodi do jačih pozitivnih reakcija s poznatim mutagenima.
Slides should be randomly placed onto the platform of a submarine-type electrophoresis unit containing sufficient electrophoresis solution such that the surfaces of the slides are completely covered (the depth of covering should also be consistent from run to run).
Međutim, dulje trajanje elektroforeze može dovesti i do pretjerane migracije u kontrolnim uzorcima.
In another type of comet assay electrophoresis units i.e. with active cooling, circulation and high capacity power supply a higher solution covering will result in higher electric current while the voltage is kept constant.
U svakom bi pokusu trebalo održavati stalan napon, a varijabilnost ostalih parametara trebala bi biti unutar uskog i specificiranog raspona, na primjer u ispitivanju koje je proveo JaCVAM uz 0,7 V/cm postignuta je početna struja od 300 mA.
A balanced design should be used to place slides in the electrophoresis tank to mitigate the effects of any trends or edge effect within the tank and to minimize batch-to-batch variability, i.e., in each electrophoresis run, there should be the same number of slides from each animal in the study and samples from the different dosage groups, negative and positive controls, should be included.
Dubinu pufera trebalo bi prilagoditi tako da se postignu željeni uvjeti i trebalo bi je održavati tijekom cijelog pokusa.
The slides should be left for at least 20 minutes for the DNA to unwind, and then subjected to electrophoresis under controlled conditions that will maximize the sensitivity and dynamic range of the assay (i.e. lead to acceptable levels of % tail DNA for negative and positive controls that maximize sensitivity).
Trebalo bi zabilježiti intenzitet struje na početku i na kraju razdoblja elektroforeze.
The level of DNA migration is linearly associated with the duration of electrophoresis, and also with the potential (V/cm).
Optimalne bi uvjete stoga trebalo odrediti tijekom početnog dokazivanja tehničke osposobljenosti predmetnog laboratorija za svako tkivo koje se ispituje.
Based on the JaCVAM trial this could be 0,7 V/cm for at least 20 minutes.
Temperaturu otopine za elektroforezu tijekom odmotavanja i elektroforeze trebalo bi održavati na niskoj razini, obično na 2 do 10 °C (10.).
The duration of electrophoresis is considered a critical variable and the electrophoresis time should be set to optimize the dynamic range.
Trebalo bi zabilježiti temperaturu otopine za elektroforezu na početku odmotavanja, na početku elektroforeze i na kraju elektroforeze.
Longer electrophoresis times (e.g. 30 or 40 minutes to maximize sensitivity) usually lead to stronger positive responses with known mutagens.
Po završetku elektroforeze predmetna stakalca trebalo bi namakati/ispirati u puferu za neutralizaciju najmanje pet minuta.
However longer electrophoresis times may also lead to excessive migration in control samples.
Gelovi se mogu obojiti i pregledati u ‚svježem’ stanju (npr. unutar jednog do dva dana) ili ih se može dehidrirati za kasnije pregledavanje (npr. unutar jednog do dva tjedna nakon bojenja) (56.).
In each experiment the voltage should be kept constant, and the variability in the other parameters should be within a narrow and specified range, for example in the JaCVAM trial 0,7 V/cm delivered a starting current of 300 mA.
Međutim, navedene bi uvjete trebalo validirati tijekom dokazivanja tehničke osposobljenosti te bi trebalo prikupiti prijašnje podatke i odvojeno ih čuvati za svaki od tih uvjeta.
The depth of buffer should be adjusted to achieve the required conditions and maintained throughout the experiment.
U tom drugom slučaju, predmetna stakalca trebalo bi dehidrirati namakanjem u apsolutnom etanolu najmanje pet minuta, ostaviti da se osuše na zraku te do pregledavanja čuvati na sobnoj temperaturi ili u spremniku pohranjenom u hladnjaku.
The current at the start and end of the electrophoresis period should be recorded.
Metode mjerenja
The optimum conditions should therefore be determined during the initial demonstration of proficiency in the laboratory concerned with each tissue studied.
Kvantitativnu analizu kometa trebalo bi izvršiti s pomoću automatskog ili poluautomatskog sustava za analizu slike.
The temperature of the electrophoresis solution through unwinding and electrophoresis should be maintained at a low temperature, usually 2-10 °C (10).
Predmetna stakalca boje se odgovarajućom fluorescentnom bojom, npr. bojom SYBR Gold, Green I, propidijevim jodidom ili etidijevim bromidom te se mjere pod prikladnim povećanjem (npr.
The temperature of the electrophoresis solution at the start of unwinding, the start of electrophoresis, and the end of electrophoresis should be recorded.
200×) s pomoću epifluorescentnog mikroskopa opremljenog odgovarajućim detektorima ili digitalnom kamerom (npr.
After completion of electrophoresis, the slides should be immersed/rinsed in the neutralization buffer for at least 5 minutes.
CCD).
Gels can be stained and scored “fresh” (e.g. within 1-2 days) or can be dehydrated for later scoring (e.g. within 1-2 weeks after staining) (56).
Stanice se mogu razvrstati u tri kategorije opisane u atlasu slika kometa (57.), i to u kategoriju mjerljivih, nemjerljivih i ‚fantomskih’ stanica (hedgehog) (za detalje vidjeti stavak 56.).
However, the conditions should be validated during the demonstration of proficiency and historical data should be obtained and retained separately for each of these conditions.
Kako bi se izbjegli artefakti, postotak DNK u repu trebalo bi mjeriti samo u mjerljivim stanicama (koje imaju jasno definiranu glavu i rep bez ikakve interferencije sa susjednim stanicama).
In case of the latter, slides should be dehydrated by immersion into absolute ethanol for at least 5 minutes, allowed to air dry, and then stored, either at room temperature or in a container in a refrigerator until scored.
Nije potrebno izvijestiti o učestalosti nemjerljivih stanica.
Methods of Measurement
Učestalost fantomskih stanica trebalo bi odrediti i odvojeno dokumentirati na temelju vizualnog pregleda (jer nedostatak jasno definirane glave znači da se stanice ne mogu dobro otkriti s pomoću sustava za analizu slike) najmanje 150 stanica po uzorku (za detalje vidjeti stavak 56.).
Comets should be scored quantitatively using an automated or semi-automated image-analysis system.
Sva predmetna stakalca za analizu, uključujući i one za pozitivne i negativne kontrole, trebalo bi neovisno kodirati i pregledati ‚na slijepo’ tako da analitičar ne zna uvjete tretiranja.
The slides will be stained with an appropriate fluorescent stain e.g. SYBR Gold, Green I, propidium iodide or ethidium bromide and measured at a suitable magnification (e.g. 200x) on a microscope equipped with epi-fluorescence and appropriate detectors or a digital (e.g. CCD) camera.
Za svaki bi uzorak (po tkivu po životinji) trebalo analizirati barem 150 stanica (isključujući fantomske stanice – vidjeti stavak 56.).
Cells may be classified into three categories as described in the atlas of comet images (57), namely scorable, non-scorable and “hedgehog” (see paragraph 56 for further discussion).
Pregledavanjem 150 stanica po životinji kod najmanje pet životinja po dozi (ali manje od pet u skupini koja služi kao istodobna pozitivna kontrola – vidjeti stavak 29.) osigurava se odgovarajuća statistička snaga prema analizi koju su proveli Smith et al., 2008.
Only scorable cells (clearly defined head and tail with no interference with neighbouring cells) should be scored for % tail DNA to avoid artefacts.
Ako se upotrebljavaju predmetna stakalca, to bi značilo pregledavanje dvaju ili triju predmetnih stakalaca po uzorku ako se upotrebljava pet životinja po skupini.
There is no need to report the frequency of non-scorable cells.
Trebalo bi pregledati nekoliko površina predmetnog stakalca pri gustoći koja osigurava da nema preklapanja repova kometa.
The frequency of hedgehogs should be determined based on the visual scoring (since the absence of a clearly-defined head will mean they are not readily detected by image analysis) of at least 150 cells per sample (see paragraph 56 for further discussion) and separately documented.
Trebalo bi izbjegavati pregledavanje na rubovima predmetnih stakalaca.
All slides for analysis, including those of positive and negative controls, should be independently coded and scored “blinded” so the scorer is unaware of the treatment condition.
Lomovi lanaca DNK u komet-testu mogu se izmjeriti prema neovisnim parametrima kao što su postotak DNK u repu, duljina repa i repni moment.
For each sample (per tissue per animal), at least 150 cells (excluding hedgehogs — see paragraph 56) should be analysed.
Ako se upotrebljava odgovarajući računalni program za analizu slike, mogu se izvršiti sva tri mjerenja.
Scoring 150 cells per animal in at least 5 animals per dose (less in the concurrent positive control — see paragraph 29) provides adequate statistical power according to the analysis of Smith et al., 2008 (5).
Međutim, za ocjenjivanje i tumačenje rezultata preporučuje se postotak DNK u repu (poznat i kao intenzitet repa) (12., 40., 41., 42.), koji je određen intenzitetom fragmenata DNK u repu izraženom kao postotak ukupnog intenziteta stanice (13).
If slides are used, this could be from 2 or 3 slides scored per sample when five animals per group are used.
Oštećenje tkiva i citotoksičnost
Several areas of the slide should be observed at a density that ensures there is no overlapping of tails.
Pozitivni nalazi u komet-testu ne moraju biti isključivo posljedica genotoksičnosti jer i toksičnost za ciljna tkiva može isto tako dovesti do povećanja migracije DNK (12., 41.).
Scoring at the edge of slides should be avoided.
Nasuprot tome, u slučaju poznatih genotoksičnih tvari često se uočava niska ili umjerena citotoksičnost (12.), što pokazuje da komet-test sam po sebi ne omogućuje razlikovanje migracije DNK koju je inducirala genotoksičnost od one koju je inducirala citotoksičnost.
DNA strand breaks in the comet assay can be measured by independent endpoints such as % tail DNA, tail length and tail moment.
Međutim, uoči li se povećanje migracije DNK, preporučuje se ispitati jedan ili više pokazatelja citotoksičnosti jer to može pomoći u tumačenju nalaza.