natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Such considerations are not needed, when there is a regulatory requirement for testing of the mixture.
Za održavanje kultura trebalo bi primjenjivati prikladne uvjete za hranjive podloge za uzgoj kultura i uvjete inkubacije (posude za kulture, prema potrebi vlažne atmosferske uvjete od 5 % CO2, temperaturu inkubacije od 37 °C).
PRINCIPLE OF THE TEST
Rutinski bi trebalo provjeravati stabilnost modalnog broj kromosoma staničnih linija te odsutnost mikoplazmatske kontaminacije (7. i 19.), a stanice ne bi trebalo upotrebljavati ako su kontaminirane ili ako je promijenjen modalni broj kromosoma.
Cell cultures of human or other mammalian origin are exposed to the test chemical both with and without an exogenous source of metabolic activation unless cells with an adequate metabolizing capability are used (see paragraph 13).
Trebalo bi utvrditi uobičajeno trajanje staničnog ciklusa staničnih linija ili primarnih kultura upotrijebljenih u ispitnom laboratoriju i ono bi trebalo biti usklađeno s objavljenim svojstvima stanica (20).
At appropriate predetermined intervals after the start of exposure of cell cultures to the test chemical, they are treated with a metaphase-arresting chemical (e.g. colcemid or colchicine), harvested, stained and metaphase cells are analysed microscopically for the presence of chromatid-type and chromosome-type aberrations.
Priprema kultura
DESCRIPTION OF THE METHOD
Stanične linije: stanice se razmnožavaju iz matičnih kultura te se nasađuju na hranjivu podlogu za uzgoj kulture takvom gustoćom da stanice u suspenziji ili jednoslojnoj kulturi nastave eksponencijalno rasti do izdvajanja (npr. treba izbjegavati konfluenciju kod stanica koje rastu kao jednoslojna kultura).
Cells
Limfociti: cjelokupna krv tretirana antikoagulansom (npr. heparinom) ili izdvojeni limfociti uzgajaju se (npr.
A variety of cell lines (e.g. Chinese Hamster Ovary (CHO), Chinese Hamster lung V79, Chinese Hamster Lung (CHL)/IU, TK6) or primary cell cultures, including human or other mammalian peripheral blood lymphocytes, can be used (7).
48 sati za ljudske limfocite) u prisutnosti mitogena (npr. fitohemaglutinina (PHA) za ljudske limfocite) kako bi se izazvala dioba stanica prije izlaganja ispitivanoj kemikaliji.
The choice of the cell lines used should be scientifically justified.
Metabolička aktivacija
When primary cells are used, for animal welfare reasons, the use of primary cells from human origin should be considered where feasible and sampled in accordance with the human ethical principles and regulations.
Kod uporabe stanica s neodgovarajućom endogenom sposobnošću metabolizma trebalo bi upotrebljavati egzogene sustave metaboličkog djelovanja.
Human peripheral blood lymphocytes should be obtained from young (approximately 18-35 years of age), non-smoking individuals with no known illness or recent exposures to genotoxic agents (e.g. chemicals, ionizing radiations) at levels that would increase the background incidence of chromosomal aberrations.
Sustav koji se najčešće upotrebljava i automatski preporučuje, osim ako je drukčije opravdano, jest postmitohondrijska frakcija s dodanim kofaktorom (S9), pripravljena iz jetra glodavaca (općenito štakora), koja je bila tretirana sredstvima za enzimsku indukciju, kao što je Aroclor 1254 (21., 22. i 23.), ili mješavinom fenobarbitona i β-naftoflavona (24., 25., 26., 27., 28. i 29.).
This would ensure the background incidence of chromosomal aberrations to be low and consistent.
Potonja smjesa nije u suprotnosti sa Stockholmskom konvencijom o postojanim organskim onečišćujućim tvarima (30.) i dokazano je da je za nastanak oksidaza s miješanom funkcijom jednako učinkovita kao Aroclor 1254 (24., 25., 26. i 28.).
The baseline incidence of chromosomal aberrations increases with age and this trend is more marked in females than in males (17) (18).
Frakcija S9 obično se upotrebljava u koncentracijama u rasponu od 1 do 2 % (v/v), ali može se povećati na 10 % (v/v) u konačnom ispitnom mediju.
If cells from more than one donor are pooled for use, the number of donors should be specified.
Tijekom tretiranja trebalo bi izbjegavati uporabu proizvoda kojima se smanjuje mitotski indeks, posebno proizvoda s kompleksom kalcija (31.).
It is necessary to demonstrate that the cells have divided from the beginning of treatment with the test chemical to cell sampling.
Na odabir vrste i koncentracije upotrijebljenog egzogenog sustava metaboličke aktivacije ili metaboličkog pokretača može utjecati kategorija kemikalija koje se ispituju.
Cell cultures are maintained in an exponential cell growth phase (cell lines) or stimulated to divide (primary cultures of lymphocytes), to expose the cells at different stages of the cell cycle, since the sensitivity of cell stages to the test chemicals may not be known.
Priprema ispitivane kemikalije
The primary cells that need to be stimulated with mitogenic agents in order to divide are generally no longer synchronized during exposure to the test chemical (e.g. human lymphocytes after a 48-hour mitogenic stimulation).
Prije tretiranja stanica krute ispitivane kemikalije trebalo bi pripremiti u prikladnim otapalima i prema potrebi razrijediti (vidjeti stavak 23.).
The use of synchronized cells during treatment is not recommended, but can be acceptable if justified.
Tekuće ispitivane kemikalije mogu se dodati izravno u ispitni sustav i/ili razrijediti prije tretiranja ispitnog sustava.
Media and culture conditions
Plinovite ili hlapive ispitivane kemikalije trebalo bi ispitivati nakon što se prikladno izmijene standardni protokoli, kao što je tretiranje u hermetički zatvorenim posudama za kulture (32., 33. i 34.).
Appropriate culture medium and incubation conditions (culture vessels, humidified atmosphere of 5 % CO2 if appropriate, incubation temperature of 37 °C) should be used for maintaining cultures.
Ispitivanu kemikaliju potrebno je pripremiti neposredno prije tretiranja, osim ako je prema podacima o stabilnosti prihvatljivo skladištenje.
Cell lines should be checked routinely for the stability of the modal chromosome number and the absence of Mycoplasma contamination (7) (19), and cells should not be used if contaminated or if the modal chromosome number has changed.
Otapala
The normal cell cycle time of cell lines or primary cultures used in the testing laboratory should be established and should be consistent with the published cell characteristics (20).
Otapalo bi trebalo odabrati tako da se optimizira topljivost ispitivanih kemikalija bez negativnih učinaka na provedbu testa, kao što su npr. promjena rasta stanica, učinak na integritet ispitivane kemikalije, reagiranje s posudama za kulture ili oštećenje sustava metaboličke aktivacije.
Preparation of cultures
Preporučuje se da se, kada god je to moguće, prvo uzme u obzir upotreba vodenog otapala (ili hranjive podloge za uzgoj kulture).
Cell lines: cells are propagated from stock cultures, seeded in culture medium at a density such that the cells in suspensions or in monolayers will continue to grow exponentially until harvest time (e.g. confluence should be avoided for cells growing in monolayers).
Dobro provjerena su otapala, na primjer, voda ili dimetil sulfoksid.
Lymphocytes: whole blood treated with an anti-coagulant (e.g. heparin) or separated lymphocytes are cultured (e.g. for 48 hours for human lymphocytes) in the presence of a mitogen [e.g. phytohaemagglutinin (PHA) for human lymphocytes] in order to induce cell division prior to exposure to the test chemical.
Općenito, organska otapala ne bi trebala prelaziti 1 % (v/v), dok vodena otapala (fiziološka otopina ili voda) ne bi trebala prelaziti 10 % (v/v) u konačnom mediju za tretiranje.
Metabolic activation
Ako se upotrebljavaju otapala koja nisu dobro provjerena (npr. etanol ili aceton), njihovu uporabu trebalo bi poduprijeti podacima u kojima su navedeni njihova kompatibilnost s ispitivanim kemikalijama, sustav ispitivanja i izostanak genetske toksičnosti u koncentraciji koja se upotrebljava.
Exogenous metabolising systems should be used when employing cells which have inadequate endogenous metabolic capacity.
Ako ne postoje takvi popratni podaci, važno je uključiti netretirane kulture (vidjeti Dodatak 1.) kako bi se dokazalo da odabrano otapalo nema štetne ili klastogene učinke.
The most commonly used system that is recommended by default, unless otherwise justified, is a co-factor-supplemented post-mitochondrial fraction (S9) prepared from the livers of rodents (generally rats) treated with enzyme-inducing agents such as Aroclor 1254 (21) (22) (23) or a combination of phenobarbital and β-naphthoflavone (24) (25) (26) (27) (28) (29).
Mjerenje proliferacije stanica i citotoksičnosti te odabir ispitnih koncentracija
The latter combination does not conflict with the Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants (30) and has been shown to be as effective as Aroclor 1254 for inducing mixed-function oxidases (24) (25) (26) (28).
Pri utvrđivanju najviše koncentracije ispitivane kemikalije trebalo bi izbjegavati koncentracije koje imaju sposobnost izazivanja lažnih pozitivnih odgovora, kao što su koncentracije koje izazivaju prekomjernu citotoksičnost (vidjeti stavak 22.), taloženje u hranjivoj podlozi za uzgoj kulture (vidjeti stavak 23.) i značajne promjene pH vrijednosti ili osmolalnosti (vidjeti stavak 5.).
The S9 fraction typically is used at concentrations ranging from 1 to 2 % (v/v) but may be increased to 10 % (v/v) in the final test medium.
Ako ispitivana kemikalija u trenutku dodavanja uzrokuje znatnu promjenu pH-vrijednosti hranjive podloge, pH-vrijednost može se prilagoditi puferiranjem konačnog medija za tretiranje kako bi se izbjegli lažno pozitivni rezultati te održali primjereni uvjeti za uzgoj kulture.
The use of products that reduce the mitotic index, especially calcium complexing products (31) should be avoided during treatment.
Proliferacija stanica mjeri se kako bi se osiguralo da je u dovoljnom broju tretiranih stanica tijekom ispitivanja došlo do mitoze i da se stanice tretiraju pri prikladnim razinama citotoksičnosti (vidjeti stavke 18. i 22.).
The choice of type and concentration of exogenous metabolic activation system or metabolic inducer employed may be influenced by the class of chemicals being tested.
Citotoksičnost bi trebalo utvrditi s metaboličkom aktivacijom i bez nje u glavnom pokusu uz uporabu prikladnih pokazatelja smrti i rasta stanica.
Test chemical preparation
Iako ocjena citotoksičnosti u početnom ispitivanju može biti korisna za bolje određivanje koncentracija koje će se upotrebljavati u glavnom pokusu, početno ispitivanje nije obvezno.
Solid test chemicals should be prepared in appropriate solvents and diluted, if appropriate, prior to treatment of the cells (see paragraph 23).
Ako se provede, njime se ne bi trebalo zamijeniti mjerenje citotoksičnosti u glavnom pokusu.
Liquid test chemicals may be added directly to the test system and/or diluted prior to treatment of the test system.
Relativno udvostručenje populacije (RPD) ili relativno povećanje broja stanica (RICC) prikladne su metode za ocjenu citotoksičnosti u citogenetskim ispitivanjima (13., 15., 35., 36. i 55.) (formule vidjeti u Dodatku 2.).
Gaseous or volatile test chemicals should be tested by appropriate modifications to the standard protocols, such as treatment in sealed culture vessels (32) (33) (34).
U slučaju dugotrajnih tretiranja i vremena uzorkovanja koja od početka tretiranja traju dulje od 1,5 uobičajenog staničnog ciklusa (npr. dulje od tri stanična ciklusa ukupno), u okviru RPD-a citotoksičnost može biti podcijenjena (37.).
Preparations of the test chemical should be made just prior to treatment unless stability data demonstrate the acceptability of storage.
U tim okolnostima RICC može biti bolja mjera ili bi ocjena citotoksičnosti nakon 1,5 uobičajenog staničnog ciklusa bila korisna procjena uz primjenu RPD-a.
Solvents
Iako je za limfocite u primarnim kulturama mitotski indeks mjerilo citotoksičnih/citostatskih učinaka, na njega utječu vrijeme u koje je izmjeren nakon tretiranja, upotrijebljeni mitogen i mogući poremećaj staničnog ciklusa.
The solvent should be chosen to optimize the solubility of the test chemicals without adversely impacting the conduct of the assay, e.g. changing cell growth, affecting the integrity of the test chemical, reacting with culture vessels, impairing the metabolic activation system.
Međutim, mitotski je indeks prihvatljiv jer druga mjerenja citotoksičnosti mogu biti komplicirana i nepraktična i ne mogu se primjenjivati na ciljanu populaciju limfocita koji rastu kao odgovor na stimulaciju fitohemaglutininom (PHA).
It is recommended that, wherever possible, the use of an aqueous solvent (or culture medium) should be considered first.
Iako su RICC i RPD za stanične linije i mitotski indeks za primarne kulture limfocita preporučeni parametri citotoksičnosti, drugim pokazateljima (kao što su npr. integritet stanica, apoptoza, nekroza, stanični ciklus) mogu se pružiti korisne dodatne informacije.
Well established solvents are for example water or dimethyl sulfoxide.
Potrebno je ocijeniti najmanje tri ispitne koncentracije (ne uključujući otapalo i pozitivne kontrole) koje ispunjuju kriterije prihvatljivosti (odgovarajuća citotoksičnost, broj stanica itd.).
Generally organic solvents should not exceed 1 % (v/v) and aqueous solvents (saline or water) should not exceed 10 % (v/v) in the final treatment medium.
Neovisno o vrsti stanica (stanične linije ili primarne kulture limfocita) za svaku se ispitivanu koncentraciju može upotrijebiti samo jedna tretirana kultura ili više njezinih ponovljenih uzoraka.
If not well-established solvents are used (e.g. ethanol or acetone), their use should be supported by data indicating their compatibility with the test chemicals, the test system and their lack of genetic toxicity at the concentration used.
Iako se preporučuje upotreba dviju usporednih kultura, prihvatljiva je i upotreba jedne kulture pod uvjetom da se pregleda jednak ukupni broj stanica neovisno o tome je li riječ o jednoj kulturi ili dvjema usporednim kulturama.
In the absence of that supporting data, it is important to include untreated controls (see Appendix 1) to demonstrate that no deleterious or clastogenic effects are induced by the chosen solvent.
Uporaba jedne kulture posebno je relevantna ako se ocjenjuje više od tri koncentracije (vidjeti stavak 31.).
Measuring cell proliferation and cytotoxicity and choosing treatment concentrations
Rezultati dobiveni iz više neovisnih ponovljenih kultura pri određenoj koncentraciji mogu se objediniti radi analize podataka (38.).
When determining the highest test chemical concentration, concentrations that have the capability of producing artifactual positive responses, such as those producing excessive cytotoxicity (see paragraph 22), precipitation in the culture medium (see paragraph 23), or marked changes in pH or osmolality (see paragraph 5), should be avoided.
Za ispitivane kemikalije za koje je dokazana mala citotoksičnost ili nepostojanje citotoksičnosti uobičajeno će biti prikladne koncentracije u dva do tri intervala.
If the test chemical causes a marked change in the pH of the medium at the time of addition, the pH might be adjusted by buffering the final treatment medium so as to avoid artifactual positive results and to maintain appropriate culture conditions.
U slučaju pojave citotoksičnosti, odabranim ispitnim koncentracijama trebao bi biti obuhvaćen raspon od koncentracije pri kojoj se pojavljuje citotoksičnost kako je opisano u stavku 22. do koncentracija pri kojima je citotoksičnost umjerena, niska ili nepostojeća.
Measurements of cell proliferation are made to assure that a sufficient number of treated cells have reached mitosis during the test and that the treatments are conducted at appropriate levels of cytotoxicity (see paragraphs 18 and 22).
Mnoge ispitivane kemikalije imaju oštre krivulje odgovora na koncentraciju te će za dobivanje podataka pri niskoj ili umjerenoj citotoksičnosti ili za detaljno istraživanje odnosa između doze i odgovora biti potrebno upotrijebiti bliže raspoređene koncentracije i/ili više od tri koncentracije (za jednu ili ponovljene kulture), posebno u situacijama u kojima je potrebno ponavljanje pokusa (vidjeti stavak 47.).
Cytotoxicity should be determined with and without metabolic activation in the main experiment using an appropriate indication of cell death and growth.
Ako se maksimalna koncentracija temelji na citotoksičnosti, najvišom koncentracijom trebalo bi nastojati ostvariti citotoksičnost od 55 ± 5 % uz primjenu preporučenih parametara citotoksičnosti (odnosno smanjenja RICC-a i RPD-a za stanične linije i smanjenja mitotskog indeksa za primarne kulture limfocita na 45 ± 5 % istodobne negativne kontrole).
While the evaluation of cytotoxicity in an initial test may be useful to better define the concentrations to be used in the main experiment, an initial test is not mandatory.
Trebalo bi voditi računa o tumačenju pozitivnih rezultata koji se mogu utvrditi samo u gornjem dijelu tog raspona citotoksičnosti od 55 ± 5 % (13.).
If performed, it should not replace the measurement of cytotoxicity in the main experiment.
Za slabo topljive ispitivane kemikalije koje nisu citotoksične pri koncentracijama nižima od najniže koncentracije pri kojoj kemikalija nije topljiva najviša bi analizirana koncentracija trebala dovesti do zamućenosti ili taloga vidljivog golim okom ili inverznim mikroskopom na kraju tretiranja ispitivanom kemikalijom.
Relative Population Doubling (RPD) or Relative Increase in Cell Count (RICC) are appropriate methods for the assessment of cytotoxicity in cytogenetic tests (13) (15) (35) (36) (55) (see Appendix 2 for formulas).
Čak i ako se citotoksičnost pojavi iznad najniže netopljive koncentracije, preporučuje se ispitivanje pri samo jednoj koncentraciji koja dovodi do zamućenja ili s vidljivim talogom jer lažni učinci mogu biti posljedica taloga.
In case of long-term treatment and sampling times after the beginning of treatment longer than 1,5 normal cell cycle lengths (i.e. longer than 3 cell cycle lengths in total), RPD might underestimate cytotoxicity (37).
Pri koncentraciji zbog koje nastaje talog potrebno je osigurati da taj talog ne utječe na izvođenje ispitivanja (npr. bojenje ili brojenje).
Under these circumstances RICC might be a better measure or the evaluation of cytotoxicity after 1,5 normal cell cycle lengths would be a helpful estimate using RPD.
Može biti korisno odrediti topljivost u hranjivoj podlozi za uzgoj kulture prije izvođenja pokusa.
For lymphocytes in primary cultures, while the mitotic index (MI) is a measure of cytotoxic/cytostatic effects, it is influenced by the time after treatment it is measured, the mitogen used and possible cell cycle disruption.
Ako nisu zapaženi talog ili ograničavajuća citotoksičnost, najviša ispitna koncentracija trebala bi odgovarati najnižoj od sljedećih vrijednosti: 10 mM, 2 mg/ml ili 2 μl/ml (39., 40. i 41.).
However, the MI is acceptable because other cytotoxicity measurements may be cumbersome and impractical and may not apply to the target population of lymphocytes growing in response to PHA stimulation.
Ako nije utvrđen sastav ispitivane kemikalije, npr. ako je ona tvar nepoznatog ili promjenjivog sastava, složeni reakcijski proizvod ili biološki materijal (UVCB) (42.), uzorak iz okoliša itd., najviša koncentracija možda će morati biti viša (npr.
While RICC and RPD for cell lines and MI for primary culture of lymphocytes are the recommended cytotoxicity parameters, other indicators (e.g. cell integrity, apoptosis, necrosis, cell cycle) could provide useful additional information.
5 mg/ml) u slučaju izostanka dostatne citotoksičnosti kako bi se povećala koncentracija svake komponente.
At least three test concentrations (not including the solvent and positive controls) that meet the acceptability criteria (appropriate cytotoxicity, number of cells, etc) should be evaluated.
Međutim, trebalo bi napomenuti da ti zahtjevi mogu biti drukčiji za farmaceutske proizvode namijenjene ljudima (43.).
Whatever the types of cells (cell lines or primary cultures of lymphocytes), either replicate or single treated cultures may be used at each concentration tested.
Kontrole
While the use of duplicate cultures is advisable, single cultures are also acceptable provided that the same total number of cells are scored for either single or duplicate cultures.
Kod svakog izdvajanja stanica trebalo bi uključiti istodobne negativne kontrole (vidjeti stavak 15.) koje se sastoje samo od otapala u hranjivoj podlozi i koje su tretirane jednako kao i kulture.
The use of single cultures is particularly relevant when more than 3 concentrations are assessed (see paragraph 31).
Istodobne pozitivne kontrole potrebne su za dokazivanje sposobnosti laboratorija za određivanje klastogena u uvjetima upotrijebljenog protokola ispitivanja i učinkovitosti egzogenog sustava metaboličke aktivacije ako je to primjenjivo.
The results obtained in the independent replicate cultures at a given concentration can be pooled for the data analysis (38).
Primjeri pozitivnih kontrola navedeni su u tablici 1. u nastavku.
For test chemicals demonstrating little or no cytotoxicity, concentration intervals of approximately 2 to 3 fold will usually be appropriate.
Ako je to opravdano, mogu se koristiti alternativne kemikalije koje se upotrebljavaju kao pozitivna kontrola.
Where cytotoxicity occurs, the test concentrations selected should cover a range from that producing cytotoxicity as described in paragraph 22 and including concentrations at which there is moderate and little or no cytotoxicity.
Budući da su in vitro ispitivanja stanica sisavaca na genetsku toksičnost u dovoljnoj mjeri standardizirana, uporaba pozitivnih kontrola može biti ograničena na klastogen koji zahtijeva metaboličku aktivaciju.
Many test chemicals exhibit steep concentration response curves and in order to obtain data at low and moderate cytotoxicity or to study the dose response relationship in detail, it will be necessary to use more closely spaced concentrations and/or more than three concentrations (single cultures or replicates), in particular in situations where a repeat experiment is required (see paragraph 47).
Pod uvjetom da se provodi paralelno s neaktiviranim ispitivanjem uz primjenu jednakog trajanja tretiranja, jednim odgovorom pozitivne kontrole dokazat će se aktivnost sustava metaboličke aktivacije i osjetljivost sustava ispitivanja.
If the maximum concentration is based on cytotoxicity, the highest concentration should aim to achieve 55 ± 5 % cytotoxicity using the recommended cytotoxicity parameters (i.e. reduction in RICC and RPD for cell lines and reduction in MI for primary cultures of lymphocytes to 45 ± 5 % of the concurrent negative control).
Međutim, dugotrajno tretiranje (bez S9) trebalo bi imati svoju pozitivnu kontrolu jer će se trajanje tretiranja razlikovati od ispitivanja u kojem se primjenjuje metabolička aktivacija.
Care should be taken in interpreting positive results only to be found in the higher end of this 55 ± 5 % cytotoxicity range (13).
Svaku pozitivnu kontrolu trebalo bi primijeniti pri jednoj ili više koncentracija za koje se očekuje da će dovesti do ponovljivih i zamjetnih povećanja u odnosu na pozadinu kako bi se dokazala osjetljivost ispitnog sustava (tj. učinci su jasni, ali identitet kodiranih predmetnih stakalaca nije odmah očit osobi koja očitava rezultate), a odgovor ne bi trebalo dovesti u pitanje citotoksičnošću koja prelazi granične vrijednosti utvrđene u ispitnoj metodi.
For poorly soluble test chemicals that are not cytotoxic at concentrations lower than the lowest insoluble concentration, the highest concentration analysed should produce turbidity or a precipitate visible by eye or with the aid of an inverted microscope at the end of the treatment with the test chemical.
Referentne kemikalije preporučene za ocjenu osposobljenosti laboratorija i za odabir pozitivnih kontrola.
Even if cytotoxicity occurs above the lowest insoluble concentration, it is advisable to test at only one concentration producing turbidity or with a visible precipitate because artifactual effects may result from the precipitate.
Kategorija