natgillin/translations-raw huggingface dataset:
In addition, reference controls (i.e. samples containing only the peptide dissolved in the appropriate solvent) should also be included in the HPLC run sequence and these are used to verify the HPLC system suitability prior to the analysis (reference controls A), the stability of the reference controls over time (reference controls B) and to verify that the solvent used to dissolve the test chemical does not impact the percent peptide depletion (reference controls C) (see Appendix 3).
U okviru sustava HPLC koji je upotrijebljen u validacijskoj studiji i opisan u ovoj ispitnoj metodi u jednom se ciklusu HPLC-a može analizirati do 26 uzoraka (vidjeti i stavak 17.).
The appropriate reference control for each chemical is used to calculate the percent peptide depletion for that chemical (see paragraph 26).
U Dodatku 3. naveden je primjer analitičkog ciklusa HPLC-a.
In addition a co-elution control constituted by the test chemical alone for each of the test chemicals analysed should be included in the run sequence to detect possible co-elution of the test chemical with either the lysine or the cysteine peptide.
Procjena podataka
Incubation of the test chemical with the cysteine and lysine peptide solutions
Koncentracija peptida koji sadržava cistein ili lizin određuje se fotometrijski u svakom uzorku na valnoj duljini od 220 nm i to tako da se za odgovarajuće pikove izmjeri površina pika (površina ispod krivulje, PIK) te izračuna koncentracija peptida primjenom linearne kalibracijske krivulje utvrđene na temelju standarda.
Cysteine and lysine peptide solutions should be incubated in glass autosampler vials with the test chemical at 1:10 and 1:50 ratio respectively.
Postotak potrošnje peptida određuje se u svakom uzorku tako da se izmjeri površina pika te podijeli sa srednjom vrijednošću površine pikova odgovarajućih referentnih kontrola C (vidjeti Dodatak 3.) u skladu s formulom navedenom u nastavku.
If a precipitate is observed immediately upon addition of the test chemical solution to the peptide solution, due to low aqueous solubility of the test chemical, in this case one cannot be sure how much test chemical remained in the solution to react with the peptide.
Postotak potrošnje peptida
Therefore, in such a case, a positive result could still be used, but a negative result is uncertain and should be interpreted with due care (see also provisions in paragraph 11 for the testing of chemicals not soluble up to a concentration of 100 mM).
površina pika peptida ubrizg.ponovlj.uzorka
The reaction solution should be left in the dark at 25 ± 2,5 °C for 24 ± 2 hours before running the HPLC analysis.
srednja površina pika referentnih kontrola C
Each test chemical should be analysed in triplicate for both peptides.
Kriteriji prihvatljivosti
Samples have to be visually inspected prior to HPLC analysis.
Kako bi se ispitivanje smatralo valjanim, trebali bi biti ispunjeni sljedeći kriteriji:
If a precipitate or phase separation is observed, samples may be centrifuged at low speed (100-400 xg) to force precipitate to the bottom of the vial as a precaution since large amounts of precipitate may clog the HPLC tubing or columns.
kalibracijska krivulja standarda trebala bi imati koeficijent r2 > 0,99;
If a precipitation or phase separation is observed after the incubation period, peptide depletion may be underestimated and a conclusion on the lack of reactivity cannot be drawn with sufficient confidence in case of a negative result.
srednja vrijednost postotka potrošnje peptida kod tri ponovljena uzorka za pozitivne kontrole s cimetnim aldehidom trebala bi iznositi između 60,8 % i 100 % za peptid koji sadržava cistein te između 40,2 % i 69,0 % za peptid koji sadržava lizin, a najveće standardno odstupanje (SD) za ponovljene uzroke s pozitivnom kontrolom trebalo bi iznositi <14,9 % za postotak potrošnje peptida koji sadržava cistein te <11,6 % za postotak potrošnje peptida koji sadržava lizin i
Preparation of the HPLC standard calibration curve
srednja vrijednost koncentracije peptida u referentnim kontrolama A trebala bi iznositi 0,50 ± 0,05 mM, a koeficijent varijacije (CV) površina pikova peptida za devet referentnih kontrola B i C u acetonitrilu trebao bi biti < 15,0 %.
A standard calibration curve should be generated for both the cysteine and the lysine peptides.
Ako nije ispunjen jedan od tih kriterija ili više njih, ispitivanje bi trebalo ponoviti.
Peptide standards should be prepared in a solution of 20 % or 25 % acetonitrile:buffer using phosphate buffer (pH 7,5) for the cysteine peptide and ammonium acetate buffer (pH 10,2) for the lysine peptide.
Da bi se rezultate dobivene za ispitivanu kemikaliju smatralo valjanima, trebali bi biti ispunjeni sljedeći kriteriji:
Using serial dilution standards of the peptide stock solution (0,667 mM), 6 calibration solutions should be prepared to cover the range from 0,534 to 0,0167 mM.
najveće standardno odstupanje za ponovljene uzorke s ispitivanom kemikalijom trebalo bi iznositi < 14,9 % za postotak potrošnje peptida koji sadržava cistein te < 11,6 % za postotak potrošnje peptida koji sadržava lizin;
A blank of the dilution buffer should also be included in the standard calibration curve.
srednja vrijednost koncentracije peptida za tri referentne kontrole C u odgovarajućem otapalu trebala bi iznositi 0,50 ± 0,05 mM.
Suitable calibration curves should have an r2 > 0,99.
Ako navedeni kriteriji nisu ispunjeni, podatke bi trebalo odbaciti te bi za tu konkretnu ispitivanu kemikaliju ispitivanje trebalo ponoviti.
HPLC preparation and analysis
Model predviđanja
The suitability of the HPLC system should be verified before conducting the analysis.
Za svaku se ispitivanu kemikaliju izračunava srednja vrijednost postotka potrošnje cisteina i postotka potrošnje lizina.
Peptide depletion is monitored by HPLC coupled with an UV detector (photodiode array detector or fixed wavelength absorbance detector with 220 nm signal).
Pri izračunavanju srednje vrijednost za negativnu potrošnju uzima se vrijednost ‚0’.
The appropriate column is installed in the HPLC system.
Ako se primjenjuje model predviđanja s cisteinom u omjeru 1:10 / lizinom u omjeru 1:50, koji je prikazan u tablici 1., trebalo bi primjenjivati prag od 6,38 % prosječne potrošnje peptida kao jedan od kriterija za razlikovanje tvari koje izazivaju preosjetljivost kože od tvari koje ne izazivaju preosjetljivost kože u okviru IATA-e.
The HPLC set-up described in the validated protocol uses a Zorbax SB-C-18 2,1 mm × 100 mm × 3,5 micron as preferred column.
Primjena modela predviđanja za razvrstavanje ispitivane kemikalije u određeni razred reaktivnosti (tj. niska, umjerena ili visoka reaktivnost) može se pokazati korisnom i za dobivanje informacija potrebnih za procjenu jakosti tvari u okviru IATA-e.
With this reversed-phase HPLC column, the entire system should be equilibrated at 30 °C with 50 % phase A (0,1 % (v/v) trifluoroacetic acid in water) and 50 % phase B (0,085 % (v/v) trifluoroacetic acid in acetonitrile) for at least 2 hours before running.
Model predviđanja s cisteinom 1:10 / lizinom 1:50 [14]
The HPLC analysis should be performed using a flow rate of 0,35 ml/min and a linear gradient from 10 % to 25 % acetonitrile over 10 minutes, followed by a rapid increase to 90 % acetonitrile to remove other materials.
Srednja vrijednost postotka potrošnje cisteina i lizina
Equal volumes of each standard, sample and control should be injected.
Razred reaktivnosti
The column should be re-equilibrated under initial conditions for 7 minutes between injections.
Predviđanje na temelju metode DPRA [15]
If a different reversed-phase HPLC column is used, the set-up parameters described above may need to be adjusted to guarantee an appropriate elution and integration of the cysteine and lysine peptides, including the injection volume, which may vary according to the system used (typically in the range from 3-10 μl).
0 % ≤ srednja vrijednost postotka potrošnje ≤ 6,38 %
Importantly, if an alternative HPLC set-up is used, its equivalence to the validated set-up described above should be demonstrated (e.g. by testing the proficiency substances in Appendix 2).
Nepostojeća ili minimalna reaktivnost
Absorbance is monitored at 220 nm.
Negativno
If a photodiode array detector is used, absorbance at 258 nm should also be recorded.
6,38 % < srednja vrijednost postotka potrošnje ≤ 22,62 %
It should be noted that some supplies of acetonitrile could have a negative impact on peptide stability and this has to be assessed when a new batch of acetonitrile is used.
Niska reaktivnost
The ratio of the 220 peak area and the 258 peak area can be used as an indicator of co-elution.
Pozitivno
For each sample a ratio in the range of 90 % < mean [13] area ratio of control samples < 100 % would give a good indication that co-elution has not occurred.
22,62 % < srednja vrijednost postotka potrošnje ≤ 42,47 %
There may be test chemicals which could promote the oxidation of the cysteine peptide.
Umjerena reaktivnost
The peak of the dimerised cysteine peptide may be visually monitored.
42,47 % < srednja vrijednost postotka potrošnje ≤ 100 %
If dimerisation appears to have occurred, this should be noted as percent peptide depletion may be over-estimated leading to false positive predictions and/or assignment to a higher reactivity class (see paragraphs 29 and 30).
Visoka reaktivnost
HPLC analysis for the cysteine and lysine peptides can be performed concurrently (if two HPLC systems are available) or on separate days.
Može se dogoditi da ispitivana kemikalija (tvar ili jedan ili više sastojaka višekomponentne tvari ili smjese) značajno apsorbira na 220 nm te ima isto vrijeme zadržavanja kao i peptid (koelucija).
If analysis is conducted on separate days then all test chemical solutions should be freshly prepared for both assays on each day.
Koelucija se može riješiti tako da se postavke sustava HPLC neznatno prilagode kako bi se još više odvojila vremena eluiranja ispitivane kemikalije i peptida.
The analysis should be timed to assure that the injection of the first sample starts 22 to 26 hours after the test chemical was mixed with the peptide solution.
Ako se za rješavanje problema koelucije upotrebljava alternativni sustav HPLC, trebalo bi dokazati da je on u skladu s validiranim sustavom (npr. ispitivanjem tvari za dokazivanje osposobljenosti iz Dodatka 2.).
For the HPLC set up used in the validation study and described in this test method, up to 26 analysis samples can be accommodated in a single HPLC run (see also paragraph 17).
U slučaju pojavljivanja koelucije pik peptida ne može se integrirati te nije moguće izračunati postotak potrošnje peptida.
An example of HPLC analysis sequence is provided in Appendix 3.
Ako takve ispitne kemikalije koeluiraju i s peptidima koji sadržavaju cistein i s peptidima koji sadržavaju lizin, trebalo bi smatrati da je analiza ‚bez jasnih rezultata’.
Data evaluation
Ako se koelucija pojavljuje samo s peptidima koji sadržavaju lizin, može se upotrijebiti model predviđanja s cisteinom 1:10, koji je naveden u tablici 2.
The concentration of cysteine or lysine peptide is photometrically determined at 220 nm in each sample by measuring the peak area (area under the curve, AUC) of the appropriate peaks and by calculating the concentration of peptide using the linear calibration curve derived from the standards.
Model predviđanja s cisteinom 1:10 [16]
The percent peptide depletion is determined in each sample by measuring the peak area and dividing it by the mean peak area of the relevant reference controls C (see Appendix 3) according to the formula described below.
Postotak potrošnje cisteina (Cys)
Percent peptide depletion
Razred reaktivnosti
Peptide peak area in replicate injection
Predviđanje na temelju metode DPRA [17]
ean peptide peak area in reference controls C
0 % ≤ postotak potrošnje cisteina ≤ 13,89 %
Acceptance criteria
13,89 % < postotak potrošnje cisteina ≤ 23,09 %
The following criteria should be met for a run to be considered valid:
23,09 % < postotak potrošnje cisteina ≤ 98,24 %
the standard calibration curve should have an r2 > 0,99,
98,24 % < postotak potrošnje cisteina ≤ 100 %
the mean percent peptide depletion value of the three replicates for the positive control cinnamic aldehyde should be between 60,8 % and 100 % for the cysteine peptide and between 40,2 % and 69,0 % for the lysine peptide and the maximum standard deviation (SD) for the positive control replicates should be < 14,9 % for the percent cysteine depletion and < 11,6 % for the percent lysine depletion, and
Mogu isto tako postojati slučajevi u kojima se vrijeme zadržavanja ispitivane kemikalije i vrijeme zadržavanja jednog od peptida ne preklapaju u cijelosti.
the mean peptide concentration of reference controls A should be 0,50 ± 0,05 mM and the coefficient of variation (CV) of peptide peak areas for the nine reference controls B and C in acetonitrile should be < 15,0 %.
U takvim se slučajevima postotci potrošnje peptida mogu procijeniti i upotrijebiti u modelu predviđanja s cisteinom 1:10 / lizinom 1:50, ali ispitivanu kemikaliju nije moguće precizno razvrstati u razred reaktivnosti.
If one or more of these criteria is not met the run should be repeated.
Za ispitivanu kemikaliju trebala bi biti dovoljna jedna analiza HPLC-om za peptid koji sadržava cistein i peptid koji sadržava lizin ako se njome dobije jasan rezultat.
The following criteria should be met for a test chemical's results to be considered valid:
Međutim, u slučajevima rezultata koji su blizu praga koji se upotrebljava za razlikovanje pozitivnih i negativnih rezultata (tj. graničnih rezultata) mogu biti potrebna dodatna ispitivanja.
the maximum standard deviation for the test chemical replicates should be < 14,9 % for the percent cysteine depletion and < 11,6 % for the percent lysine depletion,
Ako je srednja vrijednost postotka potrošnje u rasponu od 3 % do 10 % za model predviđanja s cisteinom 1:10 / lizinom 1:50 ili ako je postotak potrošnje cisteina u rasponu od 9 % do 17 % za model predviđanja s cisteinom 1:10, trebalo bi razmotriti provođenje još jedne analize, a potom i treće ako se prvim dvjema analizama dobiju nesukladni rezultati.
the mean peptide concentration of the three reference controls C in the appropriate solvent should be 0,50 ± 0,05 mM.
Izvješće o ispitivanju trebalo bi sadržavati sljedeće informacije:
If these criteria are not met the data should be rejected and the run should be repeated for that specific test chemical.
tvar s jednim sastojkom:
Prediction model
kemijske identifikacijske oznake, kao što su IUPAC ili CAS naziv(i), CAS broj(evi), SMILES ili InChI oznaka, strukturna formula i/ili druge identifikacijske oznake,
The mean percent cysteine and percent lysine depletion value is calculated for each test chemical.
fizički izgled, topljivost u vodi, molekularna masa te dodatna relevantna fizikalno-kemijska svojstva, u mjeri u kojoj su podaci dostupni,
Negative depletion is considered as “0” when calculating the mean.
čistoća, kemijski identitet nečistoća prema potrebi i ako je izvedivo u praksi itd.,
By using the cysteine 1:10/lysine 1:50 prediction model shown in Table 1, the threshold of 6,38 % average peptide depletion should be used to support the discrimination between skin sensitisers and non-sensitisers in the framework of an IATA.
obrada prije ispitivanja, prema potrebi (npr. zagrijavanje, usitnjavanje),
Application of the prediction model for assigning a test chemical to a reactivity class (i.e. low, moderate and high reactivity) may perhaps prove useful to inform potency assessment within the framework of an IATA.
ispitana koncentracija (ispitane koncentracije),
Cysteine 1:10/lysine 1:50 prediction model [14]
uvjeti skladištenja i stabilnost, u mjeri u kojoj su podaci dostupni.
Mean of cysteine and lysine % depletion
višekomponentna tvar, UVCB tvar i smjesa:
Reactivity Class
opisane koliko god je to moguće npr. kemijskim identitetom (vidjeti prethodno), čistoćom, količinskom zastupljenošću i relevantnim fizikalno-kemijskim svojstvima sastojaka (vidjeti prethodno), u mjeri u kojoj su podaci dostupni,
DPRA Prediction [15]
fizički izgled, topljivost u vodi te dodatna relevantna fizikalno-kemijska svojstva, u mjeri u kojoj su podaci dostupni,
0 % ≤ mean % depletion ≤ 6,38 %
molekularna masa ili prividna molekularna masa u slučaju smjesa/polimera poznatog sastava ili druge informacije koje su relevantne za provođenje ispitivanja,
No or minimal reactivity
uvjeti skladištenja i stabilnost, u mjeri u kojoj su podaci dostupni,
Negative
upućivanje na podatke koji se odnose na prijašnje pozitivne kontrole i pokazuju prikladnost kriterija prihvatljivosti analitičke serije, ako je primjenjivo.
6,38 % < mean % depletion ≤ 22,62 %
upotrijebljeno otapalo/nosač te omjer njegovih sastojaka, ako je primjenjivo,
Low reactivity
kemijske identifikacijske oznake, kao što su IUPAC ili CAS naziv(i), CAS broj(evi) i/ili druge identifikacijske oznake,
Positive
fizički izgled, molekularna masa te dodatna relevantna fizikalno-kemijska svojstva u slučaju da su upotrijebljena otapala/nosači koji nisu navedeni u ispitnoj metodi, u mjeri u kojoj su podaci dostupni,
22,62 % < mean % depletion ≤ 42,47 %
obrazloženje za odabir otapala za svaku ispitivanu kemikaliju,
Moderate reactivity
za acetonitril, rezultati ispitivanja utjecaja na stabilnost peptida.
42,47 % < mean % depletion ≤ 100 %
Priprema peptida, pozitivna kontrola i ispitivana kemikalija
High reactivity
opis svojstava otopina peptida (dobavljač, serija, točna masa peptida, volumen dodan za pripremu radne otopine),
There might be cases where the test chemical (the substance or one or several of the components of a multi-constituent substance or a mixture) absorbs significantly at 220 nm and has the same retention time of the peptide (co-elution).
opis svojstava otopine koja sadržava pozitivnu kontrolu (točna masa tvari koja se upotrebljava za pozitivnu kontrolu, volumen dodan za pripremu ispitne otopine),
Co-elution may be resolved by slightly adjusting the HPLC set-up in order to further separate the elution time of the test chemical and the peptide.
opis svojstava otopina ispitivane kemikalije (točna masa ispitivane kemikalije, volumen dodan za pripremu ispitne otopine).
If an alternative HPLC set-up is used to try to resolve co-elution, its equivalence to the validated set-up should be demonstrated (e.g. by testing the proficiency substances in Appendix 2).
Postavke uređaja i analize HPLC-om
When co-elution occurs the peak of the peptide cannot be integrated and the calculation of the percent peptide depletion is not possible.
vrsta uređaja za HPLC, kolona za HPLC i pretkolona, detektor, automatski dodavač uzoraka,
If co-elution of such test chemicals occurs with both the cysteine and the lysine peptides then the analysis should be reported as “inconclusive”.
parametri relevantni za analizu HPLC-om, kao što su temperatura kolone, ubrizgavani volumeni, brzina protoka i gradijent.
In cases where co-elution occurs only with the lysine peptide, then the cysteine 1:10 prediction model reported in Table 2 can be used.
Prikladnost sustava
Cysteine 1:10 prediction model [16]
površina pika peptida na 220 nm za svaki standard i svaki ponovljeni uzorak referentne kontrole A,
Cysteine (Cys) % depletion
grafički prikaz linearne kalibracijske krivulje te iznos koeficijenta r2,
Reactivity class
koncentracija peptida za svaki ponovljeni uzorak referentne kontrole A,
DPRA prediction [17]
srednja vrijednost koncentracije peptida (mM) za tri referentne kontrole A, SD i CV,
0 % ≤ Cys % depletion ≤ 13,89 %
koncentracija peptida za referentne kontrole A i C.
13,89 % < Cys % depletion ≤ 23,09 %
Analitički ciklus
23,09 % < Cys % depletion ≤ 98,24 %
za referentne kontrole:
98,24 % < Cys % depletion ≤ 100 %
površina pika peptida na 220 nm za svaki ponovljeni uzorak B i C,
There might be other cases where the overlap in retention time between the test chemical and either of the peptides is incomplete.
srednja vrijednost površine pika peptida na 220 nm za devet referentnih kontrola B i C u acetonitrilu te SD i CV (za stabilnost referentnih kontrola za vrijeme trajanja analize),
In such cases percent peptide depletion values can be estimated and used in the cysteine 1:10/lysine 1:50 prediction model, however assignment of the test chemical to a reactivity class cannot be made with accuracy.
za svako upotrijebljeno otapalo, srednja vrijednost površine pika peptida na 220 nm za tri odgovarajuće referentne kontrole C (za izračunavanje postotka potrošnje peptida),
A single HPLC analysis for both the cysteine and the lysine peptide should be sufficient for a test chemical when the result is unequivocal.
za svako upotrijebljeno otapalo, koncentracija peptida (mM) za tri odgovarajuće referentne kontrole C,
However, in cases of results close to the threshold used to discriminate between positive and negative results (i.e. borderline results), additional testing may be necessary.
za svako upotrijebljeno otapalo, srednja vrijednost koncentracije peptida (mM) za tri odgovarajuće referentne kontrole C, SD i CV;
If situations where the mean percent depletion falls in the range of 3 % to 10 % for the cysteine 1:10/lysine 1:50 prediction model or the cysteine percent depletion falls in the range of 9 % to 17 % for the cysteine 1:10 prediction model, a second run should be considered, as well as a third one in case of discordant results between the first two runs.
za pozitivnu kontrolu:
The test report should include the following information
površina pika peptida na 220 nm za svaki ponovljeni uzorak,
Mono-constituent substance
postotak potrošnje peptida za svaki ponovljeni uzorak,
Chemical identification, such as IUPAC or CAS name(s), CAS number(s), SMILES or InChI code, structural formula, and/or other identifiers;
srednja vrijednost postotka potrošnje peptida za tri ponovljena uzorka, SD i CV;
Physical appearance, water solubility, molecular weight, and additional relevant physicochemical properties, to the extent available;
za svaku ispitivanu kemikaliju:
Purity, chemical identity of impurities as appropriate and practically feasible, etc;
pojava precipitacije u reakcijskoj smjesi na kraju razdoblja inkubacije, ako je zapažena.
Treatment prior to testing, if applicable (e.g. warming, grinding);
Navesti je li precipitat ponovno otopljen ili centrifugiran,
Concentration(s) tested;
prisutnost koelucije,
Storage conditions and stability to the extent available.
opis svih drugih relevantnih opažanja, ako je primjenjivo,
Multi-constituent substance, UVCB and mixture:
srednja vrijednost postotka potrošnje peptida za tri ponovljena uzorka, SD i CV,
Characterisation as far as possible by e.g. chemical identity (see above), purity, quantitative occurrence and relevant physicochemical properties (see above) of the constituents, to the extent available;
srednja vrijednost postotka potrošnje cisteina i postotka potrošnje lizina,
Physical appearance, water solubility and additional relevant physicochemical properties, to the extent available;
upotrijebljeni model predviđanja te predviđanje na temelju metode DPRA.
Molecular weight or apparent molecular weight in case of mixtures/polymers of known compositions or other information relevant for the conduct of the study;
Ispitivanje osposobljenosti
Storage conditions and stability to the extent available;
Ako je primjenjivo, postupak koji se koristi za dokazivanje osposobljenosti laboratorija za izvođenje ispitne metode (npr. ispitivanjem tvari koje služe za dokazivanje osposobljenosti) ili za dokazivanje obnovljive primjene ispitne metode tijekom vremena.
Reference to historical positive control results demonstrating suitable run acceptance criteria, if applicable.
Rasprava o rezultatima
Solvent/vehicle used and ratio of its constituents, if applicable;
rasprava o rezultatima dobivenima ispitnom metodom DPRA,
Chemical identification(s), such as IUPAC or CAS name(s), CAS number(s), and/or other identifiers;
rasprava o rezultatima ispitne metode u kontekstu IATA-e ako su dostupni drugi relevantni podaci.
Physical appearance, molecular weight, and additional relevant physicochemical properties in the case other solvents / vehicles than those mentioned in the test method are used and to the extent available;
Dostupno na: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html