natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Moreover CytoB is not generally used when samples are evaluated for micronuclei using flow cytometric methods.
S obzirom na to da je in vitro ispitivanje genotoksičnosti na stanicama sisavaca u dostatnoj mjeri standardizirano za kratkotrajna tretiranja koja se istodobno provode s metaboličkom aktivacijom i bez nje uz isto trajanje tretiranja, upotreba pozitivnih kontrola može se ograničiti na klastogene tvari koje zahtijevaju metaboličku aktivaciju.
The appropriate concentration of cytoB should be determined by the laboratory for each cell type to achieve the optimal frequency of binucleate cells in the solvent control cultures and should be shown to produce a good yield of binucleate cells for scoring.
U tom će slučaju jedan klastogeni odgovor u pozitivnoj kontroli dokazati djelovanje sustava metaboličke aktivacije i osjetljivost ispitnog sustava.
The appropriate concentration of cytoB is usually between 3 and 6 μg/ml (19).
Međutim, dugotrajno tretiranje (bez S9) trebalo bi imati vlastitu pozitivnu kontrolu s obzirom na to da je trajanje tretiranja drukčije nego kod ispitivanja u kojemu se upotrebljava metabolička aktivacija.
When determining the highest test chemical concentration, concentrations that have the capability of producing artifactual positive responses, such as those producing excessive cytotoxicity (see paragraph 29), precipitation in the culture medium (see paragraph 30), or marked changes in pH or osmolality (see paragraph 9), should be avoided.
Ako se odabere klastogen kao jedina pozitivna kontrola za kratkotrajno tretiranje s metaboličkom aktivacijom i bez nje, za dugotrajno tretiranje s metaboličkom aktivacijom trebalo bi odabrati aneugen.
Measurements of cell proliferation are made to assure that sufficient treated cells have undergone mitosis during the test and that the treatments are conducted at appropriate levels of cytotoxicity (see paragraph 29).
Pozitivne kontrole i za klastogenost i za aneugenost trebalo bi upotrebljavati za metabolički kompetentne stanice koje ne zahtijevaju S9.
Cytotoxicity should be determined in the main experiment with and without metabolic activation using an appropriate indication of cell death and growth (see paragraphs 26 and 27).
Svaku pozitivnu kontrolu trebalo bi primijeniti pri jednoj ili više koncentracija za koje se očekuje da će dovesti do ponovljivih i zamjetnih povećanja u odnosu na pozadinu kako bi se dokazala osjetljivost ispitnog sustava (tj. učinci su jasni, ali identitet kodiranih predmetnih stakalaca nije odmah očit osobi koja ih očitava), a odgovor ne bi trebalo dovesti u pitanje citotoksičnošću koja prelazi granične vrijednosti utvrđene u ispitnoj metodi.
While the evaluation of cytotoxicity in an initial preliminary test may be useful to better define the concentrations to be used in the main experiment, an initial test is not mandatory.
Preporučene referentne kemikalije za procjenu osposobljenosti laboratorija i odabir pozitivnih kontrola
Treatment of cultures with cytoB and measurement of the relative frequencies of mononucleate, binucleate, and multi-nucleate cells in the culture provides an accurate method of quantifying the effect on cell proliferation and the cytotoxic or cytostatic activity of a treatment (6), and ensures that only cells that divided during or after treatment are microscopically scored.
Aneugeni
The cytokinesis-block proliferation index (CBPI) (6) (27) (68) or the Replication Index (RI) from at least 500 cells per culture (see Appendix 2 for formulas) are recommended to estimate the cytotoxic and cytostatic activity of a treatment by comparing values in the treated and control cultures.
Kolhicin
Assessment of other indicators of cytotoxicity (e.g. cell integrity, apoptosis, necrosis, metaphase counting, cell cycle) could provide useful information, but should not be used in place of CBPI or RI.
Vinblastin
In studies without cytoB, it is necessary to demonstrate that the cells in culture have divided, so that a substantial proportion of the cells scored have undergone division during or following treatment with the test chemical, otherwise false negative responses may be produced.
Plan tretiranja
The measurement of Relative Population Doubling (RPD) or Relative Increase in Cell Count (RICC) is recommended to estimate the cytotoxic and cytostatic activity of a treatment (17) (68) (69) (70) (71) (see Appendix 2 for formulas).
Kako bi vjerojatnost otkrivanja aneugenih ili klastogenih tvari koje djeluju u određenoj fazi staničnog ciklusa bila što veća, važno je da u svim fazama njihovih staničnih ciklusa dovoljan broj stanica bude tretiran ispitivanom kemikalijom.
At extended sampling times (e.g. treatment for 1,5-2 normal cell cycle lengths and harvest after an additional 1,5-2 normal cell cycle lengths, leading to sampling times longer than 3-4 normal cell cycle lengths in total as described in paragraphs 38 and 39), RPD might underestimate cytotoxicity (71).
Sva bi tretiranja trebala započeti i završiti tijekom eksponencijalnog rasta stanica, koje bi trebale nastaviti rasti sve do uzorkovanja.
Under these circumstances RICC might be a better measure or the evaluation of cytotoxicity after a 1,5-2 normal cell cycle lengths would be a helpful estimate.
Raspored tretiranja staničnih linija i primarnih staničnih kultura stoga se do određene mjere može razlikovati od onoga za limfocite koji zahtijevaju mitogensku stimulaciju za započinjanje staničnog ciklusa (17.).
Assessment of other markers for cytotoxicity or cytostasis (e.g. cell integrity, apoptosis, necrosis, metaphase counting, Proliferation index (PI), cell cycle, nucleoplasmic bridges or nuclear buds) could provide useful additional information, but should not be used in place of either the RPD or RICC.
Najučinkovitiji pristup za limfocite je započeti s izlaganjem ispitivanoj tvari 44 do 48 sati nakon stimulacije PHA-om, kada su diobe stanica asinkrone (6.).
The use of single cultures is particularly relevant when more than 3 concentrations are assessed (see paragraphs 44-45).
Objavljeni podaci (19.) pokazuju da se većina aneugena i klastogena otkriva kratkotrajnim tretiranjem u trajanju od tri do šest sati u prisutnosti i odsutnosti S9 nakon čega se ispitivana kemikalija uklanja te se uzorkovanje provodi po isteku razdoblja koje otprilike odgovara trajanju od 1,5 do 2,0 normalna stanična ciklusa nakon početka tretiranja (7.).
The results obtained from the independent replicate cultures at a given concentration can be pooled for the data analysis.
stanice je potrebno izlagati ispitivanoj kemikaliji s metaboličkom aktivacijom od tri do šest sati te ih uzorkovati po isteku razdoblja koje otprilike odgovara trajanju od 1,5 do 2,0 normalna stanična ciklusa nakon početka tretiranja (19.),
Where cytotoxicity occurs, the test concentrations selected should cover a range from that producing cytotoxicity as described in paragraph 29 and including concentrations at which there is moderate and little or no cytotoxicity.
stanice je potrebno neprestano izlagati bez metaboličke aktivacije sve do uzorkovanja po isteku razdoblja koje otprilike odgovara trajanju 1,5 do 2,0 normalna stanična ciklusa.
If the maximum concentration is based on cytotoxicity, the highest concentration should aim to achieve 55 ± 5 % cytotoxicity using the recommended cytotoxicity parameters (i.e. reduction in RICC and RPD for cell lines when cytoB is not used, and reduction in CBPI or RI when cytoB is used to 45± 5 % of the concurrent negative control) (72).
Primjerice, kod limfocita eksponencijalni rast može početi opadati 96 sati nakon stimulacije te jednoslojne kulture stanica mogu postati konfluentne.
Care should be taken in interpreting positive results only found in the higher end of this 55 ± 5 % cytotoxicity range (71).
Predloženi rasporedi tretiranja stanica sažeto su navedeni u tablici 2.
When the test chemical is not of defined composition, e.g. a substance of unknown or variable composition, complex reaction products or biological materials (UVCB) (76), environmental extract, etc., the top concentration may need to be higher (e.g. 5 mg/ml) in the absence of sufficient cytotoxicity, to increase the concentration of each of the components.
Limfociti, primarne stanice i stanične linije tretirane primjenom citohalazina B
It should be noted however that these requirements may differ for human pharmaceuticals (93).
Kratkotrajno tretiranje
Concurrent negative controls (see paragraph 21), consisting of solvent alone in the treatment medium and processed in the same way as the treatment cultures, should be included for every harvest time.
Tretirati od tri do šest sati u prisutnosti S9;
Concurrent positive controls are needed to demonstrate the ability of the laboratory to identify clastogens and aneugens under the conditions of the test protocol used and the effectiveness of the exogenous metabolic activation system (when applicable).
ukloniti S9 i hranjivu podlogu u kojoj je izvršeno tretiranje;
Examples of positive controls are given in Table 1 below.
dodati svježu podlogu i citohalazin B;
At the present time, no aneugens are known that require metabolic activation for their genotoxic activity (17).
izdvojiti stanice nakon 1,5 do 2,0 normalna stanična ciklusa nakon početka tretiranja.
Because in vitro mammalian cell tests for genetic toxicity are sufficiently standardised for the short-term treatments done concurrently with and without metabolic activation using the same treatment duration, the use of positive controls may be confined to a clastogen requiring metabolic activation.
Tretirati od tri do šest sati;
In this case a single clastogenic positive control response will demonstrate both the activity of the metabolic activation system and the responsiveness of the test system.
ukloniti hranjivu podlogu u kojoj je izvršeno tretiranje;
However, long term treatment (without S9) should have its own positive control, as the treatment duration will differ from the test using metabolic activation.
Produljeno tretiranje
If a clastogen is selected as the single positive control for short-term treatment with and without metabolic activation, an aneugen should be selected for the long-term treatment without metabolic activation.
Tretirati u trajanju od 1,5 do 2 normalna stanična ciklusa u prisutnosti citohalazina B;
Positive controls for both clastogenicity and aneugenicity should be used in metabolically competent cells that do not require S9.
izdvojiti stanice na kraju razdoblja tretiranja.
Each positive control should be used at one or more concentrations expected to give reproducible and detectable increases over background in order to demonstrate the sensitivity of the test system (i.e. the effects are clear but do not immediately reveal the identity of the coded slides to the reader), and the response should not be compromised by cytotoxicity exceeding the limits specified in this test method.
Stanične linije tretirane bez primjene citohalazina B
Reference chemicals recommended for assessing laboratory proficiency and for the selection of positive controls
(identično prethodno navedenim rasporedima tretiranja, ali bez dodavanja citohalazina B)
Aneugens
Na kraju tretiranja u trajanju od tri do šest sati u jednoslojnim kulturama mogu biti prisutne mitotičke stanice (prepoznatljive po tome što su okrugle i odvajaju se od površine).
Colchicine
Ako postoji dokaz o znatnom povećanju broja mitotičkih stanica u odnosu na kontrole, čime se ukazuje na vjerojatno zaustavljanje mitoze, te stanice trebalo bi prikupiti centrifugiranjem i ponovno dodati kulturama kako bi se u trenutku izdvajanja stanica izbjegao gubitak stanica koje se nalaze u fazi mitoze i kojima prijeti opasnost od mikronukleusa / kromosomskih aberacija.
Vinblastine
Izdvajanje stanica i priprema predmetnih stakalaca
Treatment Schedule
Svaka se kultura izdvaja i obrađuje zasebno.
In order to maximise the probability of detecting an aneugen or clastogen acting at a specific stage in the cell cycle, it is important that sufficient numbers of cells representing all of the various stages of their cell cycles are treated with the test chemical.
Priprema stanica može uključiti hipotonično tretiranje, iako taj korak nije potreban ako se na drugi način može ostvariti primjereno širenje stanica.
All treatments should commence and end while the cells are growing exponentially and the cells should continue to grow up to the time of sampling.
Za pripremu stakalca mogu se upotrijebiti različite tehnike, pod uvjetom da se za pregled dobiju visokokvalitetni preparati sa stanicama.
The treatment schedule for cell lines and primary cell cultures may, therefore, differ somewhat from that for lymphocytes which require mitogenic stimulation to begin their cell cycle (17).
Potrebno je zadržati stanice koje imaju netaknutu staničnu membranu i netaknutu citoplazmu kako bi se omogućilo otkrivanje mikronukleusa i (u metodi blokirane citokineze) pouzdana identifikacija dvojezgrenih stanica.
For lymphocytes, the most efficient approach is to start the treatment with the test chemical at 44-48 hours after PHA stimulation, when cells will be dividing asynchronously (6).
Stakalca se mogu obojiti različitim metodama, kao što su metoda po Giemsi ili s pomoću fluorescentnih bojila specifičnih za DNK.
Published data (19) indicate that most aneugens and clastogens will be detected by a short term treatment period of 3 to 6 hours in the presence and absence of S9, followed by removal of the test chemical and sampling at a time equivalent to about 1,5 - 2,0 normal cell cycle lengths after the beginning of treatment (7).
Upotrebom odgovarajućih fluorescentnih bojila (npr. akridin oranž (78.) ili Hoechst 33258 plus pironin-Y (79.)) može se spriječiti stvaranje nekih od artefakta koji se povezuju s upotrebom bojila koja nisu specifična za DNK.
However, for thorough evaluation, which would be needed to conclude a negative outcome, all three following experimental conditions should be conducted using a short term treatment with and without metabolic activation and long term treatment without metabolic activation (see paragraphs 56, 57 and 58): Cells should be exposed to the test chemical without metabolic activation for 3-6 hours, and sampled at a time equivalent to about 1,5 - 2,0 normal cell cycle lengths after the beginning of treatment (19),
Antikinetohorna protutijela, fluorescentna in situ hibridizacija (FISH) pancentromernim sondama DNK ili primarno označivanje in situ početnicama specifičnima za centromere zajedno s odgovarajućim kontrastnim bojenjem DNK mogu se primijeniti za određivanje sadržaja mikronukleusa (čitavi kromosomi bit će obojeni, a acentrični kromosomski fragmenti neće) ako se žele dobiti mehanističke informacije o njihovu nastajanju (16., 17.).
Cells should be exposed to the test chemical with metabolic activation for 3-6 hours, and sampled at a time equivalent to about 1,5 - 2,0 normal cell cycle lengths after the beginning of treatment (19),
Za razlikovanje klastogenih i aneugenih tvari mogu se primijeniti i druge metode, ako su dokazano učinkovite i validirane.
Cells should be continuously exposed without metabolic activation until sampling at a time equivalent to about 1,5 - 2,0 normal cell cycle lengths.
Primjerice, za određene se stanične linije korisne informacije mogu dobiti mjerenjem jezgri sub-2N kao hipodiploidnih događaja primjenom tehnika poput analize slike, laserske skenirajuće citometrije ili protočne citometrije (80., 81., 82.).
If it is known or suspected that the test chemical affects the cell cycling time (e.g. when testing nucleoside analogues), especially for p53 competent cells (35) (36) (77), sampling or recovery times may be extended by up to a further 1,5 - 2,0 normal cell cycle lengths (i.e. total 3,0 to 4,0 cell cycle lengths after the beginning of short-term and long-term treatments).
Morfološka zapažanja na jezgrama mogla bi isto tako upućivati na moguću aneuploidiju.
These options address situations where there may be concern regarding possible interactions between the test chemical and cytoB.
Osim toga, ispitivanje aberacija metafaznih kromosoma, provedeno po mogućnosti na istoj vrsti stanice i u skladu s protokolom usporedive osjetljivosti, moglo bi isto tako biti koristan način određivanja nastaju li mikronukleusi zbog loma kromosoma (znajući da gubitak kromosoma ne bi bio otkriven testom kromosomske aberacije).
When using extended sampling times (i.e. total 3,0 to 4,0 cell cycle lengths culture time), care should be taken to ensure that the cells are still actively dividing.
Sva predmetna stakalca, uključujući ona s otapalom te netretiranim (ako su upotrijebljene) i pozitivnim kontrolama, potrebno je pojedinačno kodirati prije mikroskopske analize učestalosti mikronukleusa.
For example, for lymphocytes exponential growth may be declining at 96 hours following stimulation and monolayer cultures of cells may become confluent.
Kod kultura tretiranih citohalazinom B učestalost mikronukleusa potrebno je analizirati na najmanje 2000 dvojezgrenih stanica po koncentraciji i kontroli (83.), jednakomjerno raspodijeljenih na ponovljenim uzorcima, ako se oni upotrebljavaju.
The suggested cell treatment schedules are summarised in Table 2.
Ako se za svaku koncentraciju upotrebljava samo jedna kultura (vidjeti stavak 28.), potrebno je pregledati najmanje 2000 dvojezgrenih stanica po kulturi (83.).
These general treatment schedules may be modified (and should be justified) depending on the stability or reactivity of the test chemical or the particular growth characteristics of the cells being used.
Ako je za pregled pri svakoj koncentraciji dostupno znatno manje od 1000 dvojezgrenih stanica po kulturi (u slučaju dviju usporednih kultura) ili 2000 dvojezgrenih stanica (ako se upotrebljava jedna kultura) te ako nije utvrđeno značajno povećanje mikronukleusa, test je potrebno ponoviti na većem broju stanica ili pri manje citotoksičnim koncentracijama, ovisno o tome što je primjerenije.
Cell treatment and harvest times for the MNvit test
Potrebno je paziti da se ne ocjenjuju dvojezgrene stanice nepravilnog oblika ili kod kojih postoji velika razlika u veličini dviju jezgri.
Lymphocytes, primary cells and cell lines treated with cytoB
Osim toga, dvojezgrene stanice ne smiju se zamijeniti sa slabo raširenim višejezgrenim stanicama.
Treat for 3-6 hours in the presence of S9;
Kod staničnih linija koje se ispituju bez tretiranja citohalazinom B mikronukleuse bi trebalo brojiti u najmanje 2000 stanica po ispitnoj koncentraciji i kontroli (83.), jednakomjerno raspodijeljenih na ponovljenim uzorcima, ako se oni upotrebljavaju.
remove the S9 and treatment medium;
Ako se za svaku koncentraciju upotrebljava samo jedna kultura (vidjeti stavak 28.), potrebno je pregledati najmanje 2000 stanica po kulturi.
add fresh medium and cytoB;
Ako je za pregled pri svakoj koncentraciji dostupno znatno manje od 1000 stanica po kulturi (u slučaju dviju usporednih kultura) ili 2000 stanica (ako se upotrebljava jedna kultura) te ako nije utvrđeno znatno povećanje mikronukleusa, test je potrebno ponoviti na većem broju stanica ili pri manje citotoksičnim koncentracijama, ovisno o tome što je primjerenije.
harvest 1,5 - 2,0 normal cell cycle lengths after the beginning of treatment.
Ako se upotrebljava citohalazin B, potrebno je utvrditi CBPI ili RI kako bi se procijenila proliferacija stanica (vidjeti Dodatak 2.), upotrebljavajući pri tom najmanje 500 stanica po kulturi.
Treat for 3-6 hours;
Ako se tretiranje izvodi bez dodanog citohalazina B, ključno je dostaviti dokaz da je došlo do diobe stanica u kulturi, kako je objašnjeno u stavcima od 24. do 28.
harvest at the end of the treatment period.
Pri prvom bi dobivanju podataka radi uspostave baze podataka o raspodjeli prijašnjih negativnih kontrola istodobne negativne kontrole trebale biti u skladu s objavljenim podacima o negativnim kontrolama, ako postoje.
Cell lines treated without cytoB
Kako se budu dodavali novi podaci o raspodjeli kontrola, istodobne negativne kontrole trebale bi u idealnom slučaju biti unutar kontrolnih granica od 95 % te raspodjele (87., 88.).
(Identical to the treatment schedules outlined above with the exception that no cytoB is added)
Laboratorij bi svoju bazu podataka o prijašnjim negativnim kontrolama prvo trebao uspostaviti na temelju najmanje deset pokusa, iako se preporučuje da se ona temelji na najmanje 20 pokusa provedenih u usporedivim pokusnim uvjetima.
For monolayer cultures, mitotic cells (identifiable as being round and detaching from the surface) may be present at the end of the 3-6 hour treatment.
Laboratoriji bi trebali primjenjivati metode kontrole kvalitete, kao što su kontrolni dijagrami (npr.
If there is evidence for a substantial increase in the number of mitotic cells compared with controls, indicating likely mitotic arrest, then the cells should be collected by centrifugation and added back to the culture, to avoid losing cells that are in mitosis, and at risk for micronuclei/chromosome aberration, at the time of harvest.
C-dijagrami (C-charts) ili X-stupčasti dijagrami (X-bar charts) (88.)), kako bi utvrdili varijabilnost svojih podataka o pozitivnim i negativnim kontrolama te pokazali da je u njihovu laboratoriju metodologija ‚pod kontrolom’ (83.).
Cell harvest and slide preparation
Dodatne preporuke o tome kako uspostaviti i upotrebljavati prijašnje podatke (tj. kriteriji prema kojima se podaci uključuju u bazu o prijašnjim podacima te isključuju iz nje, kao i kriteriji prihvatljivosti za određeni pokus) dostupne su u literaturi (87.).
Each culture should be harvested and processed separately.
Svaku izmjenu pokusnog protokola trebalo bi razmotriti s obzirom na to jesu li podaci u skladu s postojećim bazama podataka laboratorija o prijašnjim kontrolama.
Cell preparation may involve hypotonic treatment, but this step is not necessary if adequate cell spreading is otherwise achieved.
Podaci o negativnim kontrolama trebali bi se sastojati od podataka o učestalosti stanica s mikronukleusima u jednoj kulturi ili u skupu ponovljenih kultura kako je opisano u stavku 28.
Different techniques can be used in slide preparation provided that high-quality cell preparations for scoring are obtained.
Istodobne negativne kontrole u idealnom bi slučaju trebale biti unutar kontrolnih granica od 95 % raspodjele prijašnjih podataka o negativnim kontrolama koji se nalaze u bazi podataka laboratorija (87., 88.).
Cells with intact cell membrane and intact cytoplasm should be retained to allow the detection of micronuclei and (in the cytokinesis-block method) reliable identification of binucleate cells.
Ako se podaci o istodobnim negativnim kontrolama nalaze izvan kontrolnih granica od 95 %, mogu biti prihvatljivi za uključenje u bazu povijesnih podataka o raspodjeli pod uvjetom da ti podaci nisu ekstremne netipične vrijednosti te da postoje dokazi o tome da je ispitni sustav ‚pod kontrolom’ (vidjeti stavak 50.) i da nema tehničke ili ljudske pogreške.
The slides can be stained using various methods, such as Giemsa or fluorescent DNA specific dyes.
Ako se primjenjuje tehnika blokiranja citokineze, za ocjenjivanje indukcije mikronukleusa uzima se u obzir isključivo učestalost dvojezgrenih stanica s mikronukleusima (bez obzira na broj mikronukleusa po stanici).
The use of appropriate fluorescent stains (e.g. acridine orange (78) or Hoechst 33258 plus pyronin-Y (79)) can eliminate some of the artifacts associated with using a non-DNA specific stain.
O pregledavanju stanica s jednim, dvama ili više mikronukleusa može se odvojeno izvijestiti te iako se tako mogu dobiti korisne informacije, to nije obvezno.
Anti-kinetochore antibodies, FISH with pancentromeric DNA probes, or primed in situ labelling with pancentromere-specific primers, together with appropriate DNA counterstaining, can be used to identify the contents (whole chromosomes will be stained while acentric chromosome fragments will not) of micronuclei if mechanistic information of their formation is of interest (16) (17).
Potrebno je izvršiti istodobna mjerenja citotoksičnosti i/ili citostaze za sve tretirane kulture te pozitivne i negativne kontrole (16.).