natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Isoelectric focusing of plasmin-treated caseins in the presence of urea and staining of proteins
kazein kravljeg mlijeka može se detektirati uz potrebnu osjetljivost čak i nakon dužih razdoblja zrenja, što se može dogoditi u uobičajenim trgovinskim uvjetima.
Evaluation of stained γ3 and γ2 -casein patterns (evidence of cow's milk) by comparison of the pattern obtained from the sample with those obtained in the same gel from the reference standards containing 0 % and 1 % cow's milk.
Ako bilo koji od gore navedenih zahtjeva nije ispunjen, upotrebljavaju se referentne metode utvrđene u Dodatku.
Unless otherwise indicated, analytical grade chemicals shall be used.
Dodatak
Water shall be double-distilled or of equivalent purity.
METODA ZA DETEKCIJU KRAVLJEG MLIJEKA I KAZEINATA U SIREVIMA OD OVČJEG, KOZJEG ILI BIVOLJEG MLIJEKA ILI OD MJEŠAVINA OVČJEG, KOZJEG I BIVOLJEG MLIJEKA
Note: The following details apply to laboratory prepared polyacrylamide gels containing urea, of dimensions 265 × 125 × 0,25 mm.
PODRUČJE PRIMJENE
Where other sizes and types of gel are used, the separation conditions may have to be adjusted.
Detekcija kravljeg mlijeka i kazeinata u sirevima od ovčjeg, kozjeg ili bivoljeg mlijeka ili od mješavina ovčjeg, kozjeg i bivoljeg mlijeka izoelektričnim fokusiranjem γ-kazeina nakon plazminolize.
Isoelectric focusing
PODRUČJE PRIMJENE
Reagents for production of the urea containing polyacrylamide gels
Metoda je prikladna za osjetljivu i specifičnu detekciju sirovog i toplinski obrađenog kravljeg mlijeka i kazeinata u svježim ili zrelim sirevima od ovčjeg, kozjeg i bivoljeg mlijeka, ili od mješavina ovčjeg, kozjeg i bivoljeg mlijeka.
Stock gel solution
Nije primjerena za otkrivanje patvorenja mlijeka i sira toplinski obrađenim koncentratima bjelančevina sirutke od kravljeg mlijeka.
Dissolve:
Izolacija kazeina iz sira i referentni standardi
4,85 g acrylamide
Otapanje izoliranih kazeina i njihovo podvrgavanje plazminskom cijepanju (EC.3.4.21.7)
0,15 g N, N′-methylene-bis-acrylamide (BIS)
Izoelektrično fokusiranje plazminski obrađenih kazeina u prisutnosti ureje i bojenje bjelančevina
48,05 g urea
Ocjenjivanje obojenih obrazaca γ3- i γ2-kazeina (dokaz kravljeg mlijeka) na temelju usporedbe obrasca dobivenog iz uzorka s obrascima dobivenim u istom gelu iz referentnih standarda koji sadržavaju 0 % i 1 % kravljeg mlijeka
15,00 g glycerol (87 % w/w),
Ako nije navedeno drukčije, moraju se upotrebljavati kemikalije analitičke čistoće.
in water and make up to 100 ml and store in a brown glass bottle in the refrigerator.
Voda mora biti dvostruko destilirana ili jednake čistoće.
Note: A commercially available pre-blended acrylamide/BIS solution may be used in preference to the quoted fixed weights of the neurotoxic acrylamides.
Napomena: Sljedeći detalji odnose se na laboratorijski pripravljene poliakrilamidne gelove koji sadržavaju ureju, dimenzija 265 × 125 × 0,25 mm.
Where such a solution contains 30 % w/v acrylamide and 0,8 % w/v BIS, a volume of 16,2 ml shall be used for the formulation instead of the fixed weights.
U slučajevima kad se upotrebljavaju druge veličine i vrste gelova, možda treba podesiti uvjete razdvajanja.
The shelf life of the stock solution is a maximum of 10 days; if its conductivity is more than 5 μS, de-ionize by stirring with 2 g Amberlite MB-3 for 30 minutes, then filter through a 0,45 μm membrane.
Izoelektrično fokusiranje
Gel solution
Reagensi za proizvodnju poliakrilamidnih gelova koji sadržavaju ureju
Prepare a gel solution by mixing additives and ampholytes (*) with the stock gel solution (see 4.1.1).
Osnovna otopina gela
9,0 ml stock solution
Otopite:
24 mg β-alanine
4,85 g akrilamida,
500 μl ampholyte pH 3,5-9,5
0,15 g N, N′-metilen-bis-akrilamida (BIS),
250 μl ampholyte pH 5-7
48,05 g ureje,
250 μl ampholyte pH 6-8
15,00 g glicerola (87 % w/w)
Mix the gel solution and de-gas for two to three minutes in an ultrasonic bath or in vacuum.
u vodi, dopunite do 100 ml i pohranite u smeđoj staklenoj bočici u hladnjak.
Note: Prepare the gel solution immediately prior to pouring it (see 6.2).
Napomena: Umjesto navedenih fiksnih masa neurotoksičnih akrilamida može se upotrijebiti gotova mješavina otopina akrilamida/BIS-a, koja je dostupna na tržištu.
Catalyst solutions
Ako takva otopina sadržava 30 % w/v akrilamida i 0,8 % w/v BIS-a, umjesto navedenih fiksnih masa za pripravak upotrebljava se količina od 16,2 ml.
N, N, N′ N′ — tetramethylethylenediamine (Temed)
Rok valjanosti osnovne otopine je najviše 10 dana; ako je njena vodljivost veća od 5 μS, otopinu treba deionizirati miješajući je 30 minuta s 2 g Amberlita MB-3 i potom profiltrirati kroz membranu od 0,45 μm.
40 % w/v ammonium persulphate (PER):
Otopina gela
Dissolve 800 mg PER in water and make up to 2 ml.
Pripremite otopinu gela miješanjem aditiva i amfolita (*) s osnovnom otopinom gela (vidjeti 4.1.1.).
Note: Always use freshly prepared PER solution.
9,0 ml osnovne otopine
Contact fluid
24 mg β-alanina
Kerosene or liquid paraffin
500 μl amfolita pH 3,5-9,5
Anode solution
250 μl amfolita pH 5-7
Dissolve 5,77 g phosphoric acid (85 % w/w) in water and dilute to 100 ml.
250 μl amfolita pH 6-8
Cathode solution
Otopinu gela pomiješajte i otplinjavajte dvije do tri minute u ultrazvučnoj kupelji ili vakuumu.
Dissolve 2,00 g sodium hydroxide in water and dilute to 100 ml with water.
Napomena: Otopinu gela pripremite neposredno prije uporabe (vidjeti 6.2.).
Sample preparation
Otopine katalizatora
Reagents for protein isolation
N, N, N′ N′ – tetrametiletilendiamin (Temed).
Dilute acetic acid (25,0 ml of glacial acetic acid made up to 100 ml with water)
40 % w/v amonijev persulfat (PER):
Dichloromethane
Otopite 800 mg PER-a u vodi i dopunite do 2 ml.
Acetone
Napomena: Uvijek upotrebljavajte svježe pripremljenu otopinu PER-a.
Protein dissolving buffer
Kontaktna tekućina
Dissolve
Kerozin ili tekući parafin
5,75 g glycerol (87 % w/w)
Anodna otopina
24,03 g urea
Otopite 5,77 g fosforne kiseline (85 % w/w) u vodi i razrijedite do 100 ml.
250 mg dithiothreitol,
Katodna otopina
in water and make up to 50 ml
Otopite 2,00 g natrijeva hidroksida u vodi i razrijedite vodom do 100 ml.
Note: Store in a refrigerator, maximum shelf-life one week.
Priprema uzorka
Reagents for plasmin cleavage of caseins
Reagensi za izolaciju bjelančevina
Ammonium carbonate buffer
Razrijeđena octena kiselina (25,0 ml ledene octene kiseline razrijedite vodom do 100 ml)
Titrate a 0,2 mol/l ammonium hydrogencarbonate solution (1,58 g/100 ml water) containing 0,05 mol/l ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 1,46 g/100 ml with a 0,2 mol/l ammonium carbonate solution (1,92 g/100 ml water) containing 0,05 mol/l EDTA to pH 8.
Diklorometan
Bovine plasmin (EC.
Aceton
3.4.21.7), activity at least 5 U/ml
Pufer za rastapanje bjelančevina
ε-Aminocaproic acid solution for enzyme inhibition
Otopite:
Dissolve 2,624 g ε-aminocaproic acid (6 amino-n-hexanoic acid) in 100 ml of 40 % (v/v) ethanol.
5,75 g glicerola (87 % w/w),
Standards
24,03 g ureje,
Certified reference standards of a mixture of renneted ewe's and goat's skimmed milk containing 0 % and 1 % of cow's milk are available from the Commission's Institute for Reference Materials and Measurements, B-2440 Geel, Belgium
250 mg ditiotreitola
Preparation of laboratory interim-standards of buffalo's renneted milk containing 0 % and 1 % of cow's milk
u vodi i nadopunite do 50 ml.
Skimmed milk is prepared by centrifuging of either buffalo or bovine raw bulk milk at 37 °C at 2500 g for 20 minutes.
Napomena: Spremite pufer u hladnjak; maksimalni rok trajanja jest tjedan dana.
After cooling the tube and contents rapidly to 6 to 8 °C, the upper fat layer is removed completely.
Reagensi za plazminsko cijepanje kazeina
For the preparation of the 1 % standard add 5,00 ml of bovine skimmed milk to a 495 ml of buffalo's skimmed milk in a 1 l beaker, adjust the pH to 6,4 by the addition of dilute lactic acid (10 % w/v).
Pufer amonijeva karbonata
Adjust the temperature to 35 °C and add 100 μl of calf rennet (rennet activity 1: 10000, c.
Titrirajte 0,2 mol/l otopine amonijeva hidrogen-karbonata (1,58 g/100 ml vode), koja sadržava 0,05 mol/l etilen-diamin-tetraoctene kiseline (EDTA, 1,46 g/100 ml), s 0,2 mol/l otopine amonijeva karbonata (1,92 g/100 ml vode), koja sadržava 0,05 mol/l kiseline EDTA do pH 8.
3000 U/ml), stir for 1 minute and then leave the beaker covered with an aluminium foil at 35 °C for one hour to allow formation of the curd.
Plazmin kravljeg mlijeka (EC.
After the curd has formed, the whole renneted milk is freeze-dried without prior homogenization or draining of the whey.
3.4.21.7), aktivnosti najmanje 5 U/ml
After freeze-drying it is finely ground to produce a homogeneous powder.
Otopina ε-aminokapronske kiseline za inhibiranje enzima
For the preparation of the 0 % standard, carry out the same procedure using genuine buffalo skimmed milk.
Otopite 2,624 g ε-aminokapronske kiseline (6-amino-n-heksanske kiseline) u 100 ml 40 %-tnog (v/v) etanola.
The standards shall be stored at – 20 °C.
Standardi
Note: It is advisable to check the purity of the buffalo milk by isoelectric focusing of the plasmin-treated caseins before preparation of the standards.
Potvrđeni referentni standardi za mješavinu usirenog obranog ovčjeg i kozjeg mlijeka koja sadržava 0 % i 1 % kravljeg mlijeka dostupni su na Institutu Komisije za referentne materijale i mjerenja, B-2440, Geel, Belgija.
Reagents for protein staining
Priprema privremenih laboratorijskih standarda za usireno bivolje mlijeko koje sadržava 0 % i 1 % kravljeg mlijeka.
Fixative
Obrano se mlijeko priprema centrifugiranjem 2500 g bivoljeg ili kravljeg sirovog mlijeka na temperaturi od 37 °C u trajanju od 20 minuta.
Dissolve 150 g trichloroacetic acid in water and make up to 1000 ml.
Nakon brzog hlađenja epruvete i sadržaja na 6 do 8 °C, potpuno uklonite gornji sloj masti.
Destaining solution
Za pripremu standarda od 1 % dodajte 5,00 ml obranog kravljeg mlijeka u 495 ml obranog bivoljeg mlijeka u laboratorijskoj čaši od 1 l, podesite pH na 6,4 dodavanjem razrijeđene mliječne kiseline (10 % w/v).
Dilute 500 ml methanol and 200 ml glacial acetic acid to 2000 ml with distilled water.
Podesite temperaturu na 35 °C i dodajte 100 μl telećeg sirila (aktivnost sirila 1: 10000, oko 3000 U/ml), miješajte 1 minutu i potom ostavite posudu pokrivenu aluminijskom pločom jedan sat na temperaturi od 35 °C da bi se mogao formirati gruš.
Note: Prepare the destaining solution fresh every day; it can be prepared by mixing equal volumes of stock solutions of 50 % (v/v) methanol and 20 % (v/v) glacial acetic acid.
Nakon formiranja gruša, cijelo usireno mlijeko liofilizira se bez prethodne homogenizacije ili cijeđenja sirutke.
Staining solutions
Nakon liofilizacije, sitno ga sameljite da biste dobili homogeni prah.
Staining solution (stock solution 1)
Za pripremu standarda od 0 % provodi se isti postupak uz uporabu isključivo obranog bivoljeg mlijeka.
Dissolve 3,0 g Coomassie Brilliant Blue G-250 (C.I. 42655) in 1000 ml 90 % (v/v) methanol using a magnetic stirrer (approximately 45 minutes), filter through two medium-speed folded filters.
Standardi se čuvaju na temperaturi od – 20 °C.
Staining solution (stock solution 2)
Napomena: Prije pripreme standarda preporuča se provjeriti čistoću bivoljeg mlijeka metodom izoelektričnog fokusiranja kazeina razgrađenih djelovanjem plazmina.
Dissolve 5,0 g copper sulphate pentahydrate in 1000 ml 20 % (v/v) acetic acid.
Reagensi za bojenje bjelančevina
Staining solution (working solution)
Fiksator
Mix together 125 ml of each of the stock solutions (4.11.1, 4.11.2) immediately prior to staining.
Otopite 150 g triklorooctene kiseline u vodi i dopunite do 1000 ml.
Note: The staining solution should be prepared on the day that it is used.
Otopina za odbojavanje
EQUIPMENT
Razrijedite 500 ml metanola i 200 ml ledene octene kiseline destiliranom vodom do količine od 2000 ml.
Glass plates (265 × 125 × 4 mm); rubber roller (width 15 cm); levelling table
Napomena: Svaki dan pripremite svježu otopinu za odbojavanje; možete je pripremiti miješanjem jednakih količina osnovnih otopina 50 %-tnog (v/v) metanola i 20 %-tne (v/v) ledene octene kiseline.
Gel carrier sheet (265 × 125 mm)
Otopine za bojenje
Covering sheet (280 × 125 mm).
Otopina za bojenje (osnovna otopina 1)
Stick on strip of adhesive tape (280 × 6 × 0,25 mm) to each long edge (see Figure 1)
Otopite 3,0 g boje Coomassie Brilliant Blue G-250 (C.I. 42655) u 1000 ml 90 %-tnog (v/v) metanola s pomoću magnetske miješalice (oko 45 minuta), filtrirajte kroz dva naborana filtra srednje brzine.
Electrofocusing chamber with cooling plate (e.g. 265 × 125 mm) and suitable power supply (≥ 2,5 kV) or automatic electrophoresis device
Otopina za bojenje (osnovna otopina 2)
Circulation cryostat, thermostatically controlled at 12 ± 0,5 °C
Otopite 5,0 g bakrenog sulfata pentahidrata u 1000 ml 20 %-tne (v/v) octene kiseline.
Centrifuge, adjustable to 3000 g
Otopina za bojenje (radna otopina)
Electrode strips (≥ 265 mm long)
Pomiješajte po 125 ml od svake osnovne otopine (4.11.1., 4.11.2.) neposredno prije bojenja.
Plastic dropping bottles for the anode and cathode solutions
Napomena: Otopina za bojenje priprema se na dan kad se koristi.
Sample applicators (10 × 5 mm, viscose or low protein-adsorption filter paper)
OPREMA
Stainless steel or glass staining and destaining dishes (e.g. 280 × 150 mm instrument trays)
Staklene ploče (265 × 125 × 4 mm); gumeni valjak (širine 15 cm); stol s nagibnom radnom površinom
Adjustable rod homogenizer (10 mm shaft diameter), rpm range 8000 to 20000
Noseća ploča za gel (265 × 125 mm)
Film welder
Pokrivna ploča (280 × 125 mm).
25 μl micropipettes
Na sve duge bridove (vidjeti sliku 1.) nanesite ljepljivu traku (280 × 6 × 0,25 mm).
Vacuum concentrator or freeze-dryer
Komora za elektrofokusiranje s rashladnom pločom (npr.
Thermostatically controlled water bath adjustable to 35 and 40 ± 1 °C with shaker
265 × 125 mm) i odgovarajućim električnim napajanjem (≥ 2,5 kV) ili uređajem za automatsku elektroforezu
Densitometer equipment reading at λ = 634 nm
Cirkulacijski kriostat, termostatski reguliran na 12 ± 0,5 °C
Isolation of caseins
Centrifuga, podesiva do 3000 g
Weigh the amount equivalent to 5 g dry mass of cheese or the reference standards into a 100 ml centrifuge tube, add 60 ml distilled water and homogenize with a rod homogenizer (8000 to 10000 rpm).
Elektrodne trake (duljine ≥ 265 mm)
Adjust to pH 4,6 with dil. acetic acid (4.5.1) and centrifuge (5 minutes, 3000 g).
Plastične boce s kapaljkom za anodnu i katodnu otopinu
Decant the fat and whey, homogenize the residue at 20000 rpm in 40 ml distilled water adjusted to pH 4,5 with dil. acetic acid (4.5.1), add 20 ml dichloromethane (4.5.2), homogenize again and centrifuge (5 minutes, 3000 g).
Aplikatori za uzorke (10 × 5 mm, od viskoze ili od filtar-papira koji slabo adsorbira bjelančevine)
Remove the casein layer that lies between the aqueous and organic phases (see Figure 2) with a spatula and decant off both phases.
Posude za bojenje i odbojavanje od nehrđajućeg čelika ili stakla (npr. plitice za instrumente dimenzija 280 × 150 mm)
Rehomogenise the casein in 40 ml distilled water (see above) and 20 ml dichloromethane (4.5.2) and centrifuge.
Podesivi štapni homogenizator (promjera osovine 10 mm), raspona brzine od 8000 do 20000 o/min
Repeat this procedure until both extraction phases are colourless (two to three times).
Uređaj za zavarivanje ploče
Homogenize the protein residue with 50 ml acetone (4.5.3) and filter through a medium-speed folded filter paper.
Mikropipete od 25 μl.
Wash the residue on the filter with two separate 25 ml portions of acetone each time and allow to dry in the air or a stream of nitrogen, then pulverize finely in a mortar.
Vakuumski koncentrator ili liofilizator
Note: Dry casein isolates should be kept at –20 °C.
Vodena kupelj, termostatski regulirana između 35 i 40 ± 1 °C s vibracijskom miješalicom
Plasmin cleavage of β-caseins to intensify γ-caseins
Denzitometar za očitavanje na valnoj duljini λ = 634 nm
Disperse 25 mg of isolated caseins (6.1.1) in 0,5 ml ammonium carbonate buffer (4.7.1) and homogenize for 20 minutes by e.g. using ultrasonic treatment.
Izolacija kazeina
Heat to 40 °C and add 10 μl plasmin (4.7.2), mix and incubate for one hour at 40 °C with continuous shaking.
Odvagnite količinu koja je ekvivalent 5 g suhe mase sira ili referentnih standarda u epruvetu za centrifugiranje od 100 ml, dodajte 60 ml destilirane vode i homogenizirajte štapnim homogenizatorom (8000 do 10000 o/min).
To inhibit the enzyme add 20 μl ε-aminoproic acid solution (4.7.3), then add 200 mg of solid urea and 2 mg of dithiothreitol.
Podesite pH na 4,6 pomoću razrijeđene octene kiseline (4.5.1.) i centrifugirajte (5 minuta, 3000 g).
Note: To obtain more symmetry in the focused casein bands it is advisable to freeze-dry the solution after adding the ε-aminocaproic acid and then dissolving the residues in 0,5 ml protein dissolving buffer (4.6).
Dekantirajte mast i sirutku, ostatak homogenizirajte na 20000 o/min u 40 ml destilirane vode čija je pH vrijednost od 4,5 podešena pomoću razrijeđene octene kiseline (4.5.1.); dodajte 20 ml diklorometana (4.5.2.), ponovno homogenizirajte i centrifugirajte (5 minuta, 3000 g).
Preparation of the urea containing polyacrylamide gels
Špatulom uklonite sloj kazeina koji se nalazi između vodene i organske faze (vidjeti sliku 2.) i dekantirajte obje faze.
With the aid of a few drops of water roll the gel carrier sheet (5.2) onto a glass plate (5.1), removing any extraneous water with paper towel or tissue.
Kazein ponovo homogenizirajte u 40 ml destilirane vode (vidjeti gore) i 20 ml diklorometana (4.5.2.) i centrifugirajte.
Roll the cover sheet (5.3) with spacers (0,25 mm) onto another glass plate in the same way.
Ponavljajte postupak sve dok obje faze ekstrakcije ne postanu bezbojne (dva do tri puta).
Lay the plate horizontally on a levelling table.
Ostatak bjelančevina homogenizirajte pomoću 50 ml acetona (4.5.3.) i filtrirajte kroz naborani filtar-papir srednje brzine filtracije.
Add 10 μl Temed (4.1.3.1) to the prepared and de-aerated gel solution (4.1.2), stir and add 10 μl PER-solution (4.1.3.2), mix thoroughly and immediately pour out evenly onto the centre of the cover sheet.
Ostatak na filtru isperite dva puta, svaki put upotrebljavajući po 25 ml acetona, ostavite da se osuši na zraku ili u struji dušika te fino usitnite u tarioniku.
Place one edge of the gel carrier plate (sheet side down) on the cover sheet plate and lower it slowly so that a gel film forms between the sheets and spreads out regularly and free of bubbles (Figure 3).
Napomena: Suhe izolate kazeina treba držati na temperaturi od – 20 °C.
Carefully lower the gel carrier plate completely using a thin spatula and place three more glass plates on top of it to act as weights.
Plazminsko cijepanje β-kazeina radi intenzifikacije γ-kazeina
After polymerization is complete (about 60 minutes) remove the gel polymerized onto the gel carrier sheet along with the cover sheet by tipping the glass plates.
Disperzirajte 25 mg izoliranih kazeina (6.1.1.) u 0,5 ml puferske otopine amonijeva karbonata (4.7.1.) i homogenizirajte 20 minuta, npr. ultrazvučnim postupkom.
Clean the reverse of the carrier sheet carefully to remove gel residues and urea.
Zagrijte do 40 °C i dodajte 10 μl plazmina (4.7.2.), promiješajte i inkubirajte jedan sat na 40 °C uz neprestano tresenje.
Weld the gel sandwich into a film tube and store in a refrigerator (maximum six weeks).
Radi inhibicije enzima dodajte 20 μl otopine ε-aminokapronske kiseline (4.7.3.) te potom dodajte 200 mg ureje u krutom obliku i 2 mg ditiotreitola.
Note: The cover sheet with the spacers can be re-used.
Napomena: Radi postizanja veće simetrije fokusiranih kazeinskih vrpci, preporučuje se liofiliziranje otopine nakon dodavanja ε-aminokapronske kiseline i potom otapanje ostatka u 0,5 ml pufera za otapanje bjelančevina (4.6.).
The polyacrylamide gel can be cut to smaller sizes, recommended when there are few samples or if an automatic electrophoresis device is used (two gels, size 4,5 × 5 cm).
Priprema poliakrilamidnih gelova koji sadržavaju ureju
lsoelectric focusing
S pomoću nekoliko kapi vode i valjka noseću ploču za gel (5.2.) stavite na staklenu ploču (5.1.), a višak vode uklonite papirnatim ubrusom ili ručnikom.
Set the cooling thermostat to 12 °C.
Na isti način pokrivnu ploču (5.3.) s odstojnicima (0,25 mm) stavite na drugu staklenu ploču.
Wipe off the reverse of the gel carrier sheet with kerosene, then drip a few drops of kerosene (4.2) onto the centre of the cooling block.
Položite ploču vodoravno na stol s nagibnom radnom površinom.
Then roll the gel sandwich, carrier side down, onto it, taking care to avoid bubbles.
Dodajte 10 μl Temeda (4.1.3.1.) u pripremljenu i deaeriranu otopinu gela (4.1.2.), promiješajte i dodajte 10 μl otopine PER (4.1.3.2.), dobro izmiješajte i jednakomjerno razlijte po sredini pokrivne ploče.
Wipe off any excess kerosene and remove the cover sheet.
Stavite jedan rub noseće ploče za gel (ploča okrenuta prema dolje) na pokrivnu ploču i preostali dio polagano spuštajte tako da se između dvije plohe stvori tanki sloj gela koji će se jednakomjerno raširiti bez stvaranja mjehurića (slika 3.).
Soak the electrode strips with the electrode solutions (4.3, 4.4), cut to gel length and place in the positions provided (distance of electrodes 9,5 cm).
Pažljivo spustite noseću ploču do kraja, koristeći se pritom tankom špatulom, i na nju položite još tri staklene ploče koje će poslužiti kao utezi.
Conditions for isoelectric focusing:
Po završetku polimerizacije (oko 60 minuta), gel koji se polimerizirao na nosećoj ploči maknite zajedno s pokrivnom pločom, laganim nakretanjem staklenih ploča.
Step
Zatvorite „gel-sendvič” u cjevastu foliju i pohranite u hladnjak (najviše šest tjedana).
Voltage
Napomena: Pokrivna ploča s odstojnicima može se ponovo upotrebljavati.
Current
Poliakrilamidni gel može se razrezati na manje dijelove, što se preporučuje u slučaju manjeg broja uzoraka ili ako se upotrebljava uređaj za automatsku elektroforezu (dva gela, dimenzija 4,5 × 5 cm).
Power
Izoelektrično fokusiranje
Volt-hours
Termostat za hlađenje podesite na 12 °C.
Pre-focusing
Kerozinom očistite stražnju stranu noseće ploče za gel i potom dodajte nekoliko kapljica kerozina (4.2.) u sredinu rashladnog bloka.
maximum
Zatim na njega stavite gel-sendvič s nosećom stranom okrenutom prema dolje i povaljajte ga valjkom, pazeći da se pritom ne stvaraju mjehurići.
constant 4
Obrišite višak kerozina i skinite pokrivnu ploču.
Sample focusing
Elektrodne trake natopite elektrodnim otopinama (4.3., 4.4.), izrežite ih prema duljini gela i položite na predviđena mjesta (razmak između elektroda 9,5 cm).
Final focusing
Uvjeti za izoelektrično fokusiranje:
Note: If thickness or width of the gels are changed, the values for current and power have to be suitably adjusted (e.g. double the values for electric current and power if a 265 × 125 × 0,5 mm gel is used).
Veličina gela 265 × 125 × 0,25 mm
Example of a voltage programme for an automatic electrophoresis device (2 gels of 5,0 × 4,5 cm), electrodes without strips applied directly to the gel
Faza
Temp.
Napon
Focusing
Jakost
Place sample applicator in step 2 at 0 Vh.
Snaga
Remove sample applicator in step 2 at 30 Vh.
Volt-sati
Protein staining
Predfokusiranje
Protein fixation
maksimalna
Remove the electrode strips immediately after turning off the power and put the gel immediately into a staining/destaining dish filled with 200 ml fixative (4.9); leave for 15 minutes, shaking continuously.
konstantna 4
Washing and staining the gel plate
Fokusiranje uzorka
Thoroughly drain off the fixative and wash the gel plate twice for 30 seconds each time with 100 ml destaining solution (4.10).
Konačno fokusiranje
Pour off the destaining solution and fill the dish with 250 ml staining solution (4.11.3); allow to stain for 45 minutes with gentle shaking.
Napomena: Ako se promijeni debljina ili širina gela, vrijednosti za jakost i snagu treba podesiti u skladu s promjenom (npr. udvostručiti vrijednosti jakosti i snage ako se upotrebljava gel dimenzija 265 × 125 × 0,5 mm).
Destaining the gel plate
Primjer naponskog režima za uređaj za automatsku elektroforezu (2 gela dimenzija 5,0 × 4,5 cm); elektrode bez traka nanesene izravno na gel