natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Upon receipt, cells are propagated (e.g. 2 to 4 passages) and stored frozen as a homogeneous stock.
Nakon primitka stanice se razmnožavaju (npr. 2 do 4 pasaža) te čuvaju zamrznute kao homogena zaliha.
Cells from this original stock can be propagated up to a maximum passage number (i.e. 25 in the case of KeratinoSensTM) and are employed for routine testing using the appropriate maintenance medium (in the case of KeratinoSensTM this represents DMEM containing serum and Geneticin).
Stanice iz izvorne zalihe mogu se razmnožiti do maksimalnog broja pasaža (npr. 25 u slučaju testa KeratinoSensTM) te se upotrebljavaju za rutinsko ispitivanje koristeći se pritom odgovarajućim medijem za održavanje (u slučaju testa KeratinoSensTM to je DMEM koji sadržava serum i geneticin).
For testing, cells should be 80-90 % confluent, and care should be taken to ensure that cells are never grown to full confluence.
Za ispitivanje, stanice bi trebale biti 80 – 90 % konfluentne te bi trebalo paziti da nikada ne dosegnu punu konfluenciju.
One day prior to testing cells are harvested, and distributed into 96-well plates (10000 cells/well in the case of KeratinoSensTM).
Dan prije ispitivanja stanice se izdvajaju i raspoređuju na pločice s 96 jažica (10000 stanica po jažici u slučaju testa KeratinoSensTM).
Attention should be paid to avoid sedimentation of the cells during seeding to ensure homogeneous cell number distribution across wells.
Potrebno je paziti da se izbjegne taloženje stanica tijekom nasađivanja kako bi se osigurala homogena distribucija broja stanica među jažicama.
If this is not the case, this step may give raise to high well-to-well variability.
Ako to nije slučaj, ova faza može izazvati veliku varijabilnost među jažicama.
For each repetition, three replicates are used for the luciferase activity measurements, and one parallel replicate used for the cell viability assay.
Za svako ponavljanje upotrebljavaju se tri ponovljena uzorka za mjerenje aktivnosti luciferaze te jedan paralelni ponovljeni uzorak za ispitivanje sposobnosti preživljavanja stanica.
Preparation of the test chemical and control substances
Priprema ispitivane kemikalije i tvari koje služe kao kontrola
The test chemical and control substances are prepared on the day of testing.
Ispitivana kemikalija i tvari koje služe kao kontrola pripremaju se na dan ispitivanja.
For the KeratinoSensTM assay, test chemicals are dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) to the final desired concentration (e.g. 200 mM).
Za test KeratinoSensTM ispitivane kemikalije otapaju se u dimetil sulfoksidu (DMSO) do konačne željene koncentracije (npr. 200 mM).
The DMSO solutions can be considered self-sterilising, so that no sterile filtration is needed.
Otopine DMSO-a mogu se smatrati samosterilizirajućima te nije potrebna sterilna filtracija.
Test chemical not soluble in DMSO is dissolved in sterile water or culture medium, and the solutions sterilised by e.g. filtration.
Ispitivana kemikalija koja nije topljiva u DMSO-u otapa se u sterilnoj vodi ili hranjivoj podlozi za uzgoj kulture i otopine se steriliziraju, npr. filtriranjem.
For a test chemical which has no defined molecular weight (MW), a stock solution is prepared to a default concentration (40 mg/mL or 4 % (w/v)) in the KeratinoSensTM assay.
Za ispitivanu kemikaliju koja nema utvrđenu molekularnu masu (MM) priprema se radna otopina do zadane koncentracije (40 mg/mL ili 4 % (w/v)) u testu KeratinoSensTM.
In case solvents other than DMSO, water or the culture medium are used, sufficient scientific rationale should be provided.
Ako se upotrebljavaju druga otapala, a ne DMSO, voda ili hranjiva podloga za uzgoj kulture, potrebno je navesti dovoljno znanstveno obrazloženje.
Based on the stock DMSO solutions of the test chemical, serial dilutions are made using DMSO to obtain 12 master concentrations of the chemical to be tested (from 0,098 to 200 mM in the KeratinoSensTM assay).
Od radnih otopina ispitivane kemikalije u DMSO-u pripremaju se serijska razrjeđenja s pomoću DMSO-a kako bi se dobilo 12 glavnih koncentracija kemikalije koje će se ispitivati (od 0,098 do 200 mM u testu KeratinoSensTM).
For a test chemical not soluble in DMSO, the dilutions to obtain the master concentrations are made using sterile water or sterile culture medium.
Za ispitivanu kemikaliju koja nije topljiva u DMSO-u razrjeđenja za dobivanje glavnih koncentracija pripremaju se s pomoću sterilne vode ili sterilne hranjive podloge za uzgoj kulture.
Independent of the solvent used, the master concentrations, are then further diluted 25 fold into culture medium containing serum, and finally used for treatment with a further 4 fold dilution factor so that the final concentrations of the tested chemical range from 0,98 to 2000 μM in the KeratinoSensTM assay.
Neovisno o upotrijebljenom otapalu glavne se koncentracije potom razrjeđuju dvadesetpeterostruko u hranjivoj podlozi za uzgoj kulture koja sadržava serum te se na kraju upotrebljavaju za tretiranje nakon još jednog četverostrukog razrjeđivanja tako da konačne koncentracije ispitivane kemikalije budu u rasponu od 0,98 do 2000 μM u testu KeratinoSensTM.
Alternative concentrations may be used upon justification (e.g. in case of cytotoxicity or poor solubility).
U opravdanim je slučajevima moguće upotrijebiti druge koncentracije (npr. u slučaju citotoksičnosti ili slabe topljivosti).
The negative (solvent) control used in the KeratinoSensTM assay is DMSO (CAS No. 67-68-5, ≥ 99 % purity), for which six wells per plate are prepared.
U testu KeratinoSensTM kao negativna kontrola (s otapalom) upotrebljava se DMSO (CAS br. 67-68-5, čistoće ≥ 99 %), za koju se priprema šest jažica po pločici.
It undergoes the same dilution as described for the master concentrations in paragraph 22, so that the final negative (solvent) control concentration is 1 %, known not to affect cell viability and corresponding to the same concentration of DMSO found in the tested chemical and in the positive control.
Razrjeđuje se na isti način kako je opisano za glavne koncentracije u stavku 22., tako da konačna koncentracija negativne kontrole (s otapalom) bude 1 %, za koju je poznato da ne utječe na preživljavanje stanica te odgovara istoj koncentraciji DMSO-a u ispitanoj kemikaliji i pozitivnoj kontroli.
For a test chemical not soluble in DMSO, for which the dilutions were made in water, the DMSO level in all wells of the final test solution must be adjusted to 1 % as for the other test chemicals and control substances.
Za ispitivanu kemikaliju koja nije topljiva u DMSO-u i za koju su razrjeđenja pripremljena u vodi, koncentracija DMSO-a u svim jažicama konačne ispitne otopine mora se prilagoditi tako da iznosi 1 % kao i kod drugih ispitivanih kemikalija i tvari koje služe kao kontrola.
The positive control used in the case of the KeratinoSensTM assay is cinnamic aldehyde (CAS No. 14371-10-9, ≥ 98 % purity), for which a series of 5 master concentrations ranging from 0,4 to 6,4 mM are prepared in DMSO (from a 6,4 mM stock solution) and diluted as described for the master concentrations in paragraph 22, so that the final concentration of the positive control range from 4 to 64 μM.
U testu KeratinoSensTM kao pozitivna kontrola upotrebljava se cimetni aldehid (CAS br. 14371-10-9, čistoće ≥ 98 %) te se za nju priprema serija od pet glavnih koncentracija u rasponu od 0,4 do 6,4 mM u DMSO-u (od radne otopine od 6,4 mM), koje se razrjeđuju kako je opisano za glavne koncentracije u stavku 22. tako da konačna koncentracija pozitivne kontrole bude u rasponu od 4 do 64 μM.
Other suitable positive controls, preferentially providing EC1,5 values in the mid-range, may be used if historical data are available to derive comparable run acceptance criteria.
Mogu se upotrijebiti i druge prikladne pozitivne kontrole koje po mogućnosti daju srednje vrijednosti EC1,5, pod uvjetom da su dostupni prijašnji podaci na temelju kojih se mogu odrediti usporedivi kriteriji prihvatljivosti za analitičku seriju.
Application of the test chemical and control substances
Primjena ispitivane kemikalije i tvari koje služe kao kontrola
For each test chemical and positive control substance, one experiment is needed to derive a prediction (positive or negative), consisting of at least two independent repetitions containing each three replicates (i.e. n = 6).
Za svaku ispitivanu kemikaliju i tvar koja se upotrebljava za pozitivnu kontrolu potreban je jedan pokus za izvođenje predviđanja (pozitivnog ili negativnog), koji se sastoji od najmanje dva neovisna ponavljanja od kojih svako sadržava tri ponovljena uzorka (tj. n = 6).
In case of discordant results between the two independent repetitions, a third repetition containing three replicates should be performed (i.e. n = 9).
Ako se dvama neovisnim ponavljanjima dobiju nesukladni rezultati, trebalo bi provesti treće ponavljanje s tri ponovljena uzorka (tj. n = 9).
Each independent repetition is performed on a different day with fresh stock solution of test chemicals and independently harvested cells.
Neovisna se ponavljanja provode u različite dane svaki put sa svježom radnom otopinom ispitivanih kemikalija i neovisno izdvojenim stanicama.
Cells may come from the same passage however.
Međutim, stanice mogu biti iz iste pasaže.
After seeding as described in paragraph 20, cells are grown for 24 hours in the 96-wells microtiter plates.
Nakon što se nasade kako je opisano u stavku 20., stanice se uzgajaju 24 sata na mikrotitracijskim pločicama s 96 jažica.
The medium is then removed and replaced with fresh culture medium (150 μl culture medium containing serum but without Geneticin in the case of KeratinoSensTM) to which 50 μl of the 25 fold diluted test chemical and control substances are added.
Medij se potom uklanja i zamjenjuje svježom hranjivom podlogom za uzgoj kulture (150 μl hranjive podloge za uzgoj kulture koja sadržava serum, ali bez geneticina u slučaju testa KeratinoSensTM) u koju se dodaje 50 μl dvadesetpeterostruko razrijeđene ispitivane kemikalije i tvari koje služe za kontrolu.
At least one well per plate should be left empty (no cells and no treatment) to assess background values.
Najmanje jednu jažicu po pločici trebalo bi ostaviti praznu (bez stanica i tretiranja) radi određivanja osnovnih vrijednosti.
The treated plates are then incubated for about 48 hours at 37 ± 1 °C in the presence of 5 % CO2 in the KeratinoSensTM assay.
Tretirane se pločice potom inkubiraju oko 48 sati na 37 ± 1 °C u prisutnosti 5 % CO2 u testu KeratinoSensTM.
Care should be taken to avoid evaporation of volatile test chemicals and cross-contamination between wells by test chemicals by e.g. covering the plates with a foil prior to the incubation with the test chemicals.
Potrebno je paziti da ne dođe do isparavanja hlapljivih ispitivanih kemikalija te unakrsne kontaminacije jažica ispitivanim kemikalijama, npr. pokrivanjem pločica metalnom folijom prije inkubacije s ispitivanim kemikalijama.
Luciferase activity measurements
Mjerenja aktivnosti luciferaze
Three factors are critical to ensure appropriate luminescence readings:
Tri su faktora ključna za osiguranje pravilnih očitavanja luminiscencije:
the choice of a sensitive luminometer,
odabir osjetljivog luminometra,
the use of a plate format with sufficient height to avoid light-cross-contamination; and
upotreba formata pločice dovoljne visine da se izbjegne unakrsna kontaminacija svjetlom i
the use of a luciferase substrate with sufficient light output to ensure sufficient sensitivity and low variability.
upotreba supstrata luciferaze koji emitira dovoljno svjetlosti da osigura dovoljnu osjetljivost i nisku varijabilnost.
Prior to testing, a control experiment setup as described in Appendix 3 should be carried out to ensure that these three points are met.
Prije ispitivanja trebalo bi provesti kontrolni pokus kako je opisano u Dodatku 3. kako bi se osiguralo ispunjavanje tih triju zahtjeva.
After the 48 hour exposure time with the test chemical and control substances in the KeratinoSensTM assay, cells are washed with a phosphate buffered saline, and the relevant lysis buffer for luminescence readings added to each well for 20 min at room temperature.
Nakon 48 sati izlaganja ispitivanoj kemikaliji i tvarima koje služe za kontrolu u testu KeratinoSensTM stanice se ispiru fiziološkom otopinom puferiranom fosfatnim puferom te se u svaku jažicu doda odgovarajući lizni pufer za očitavanje luminiscencije i ostavi 20 minuta na sobnoj temperaturi.
Plates with the cell lysate are then placed in the luminometer for reading which in the KeratinoSensTM assay is programmed to: (i) add the luciferase substrate to each well (i.e. 50 μl), (ii) wait for 1 second, and (iii) integrate the luciferase activity for 2 seconds.
Potom se pločice koje sadržavaju stanični lizat radi očitavanja stavljaju u luminometar koji je u testu KeratinoSensTM programiran tako da: i. u svaku jažicu dodaje supstrat luciferaze (tj. 50 μl), ii. čeka jednu sekundu te iii. integrira aktivnost luciferaze dvije sekunde.
In case alternative settings are used, e.g. depending on the model of luminometer used, these should be justified.
Ako se upotrebljavaju drukčiji parametri, npr. ovisno o modelu luminometra, potrebno ih je obrazložiti.
Furthermore, a glow substrate may also be used provided that the quality control experiment of Appendix 3 is successfully fulfilled.
Nadalje, može se upotrijebiti i tinjavi supstrat pod uvjetom da je pokus za kontrolu kvalitete iz Dodatka 3. uspješno izveden.
Cytotoxicity Assessment
Procjena citotoksičnosti
For the KeratinoSensTM cell viability assay, medium is replaced after the 48 hour exposure time with fresh medium containing MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Thiazolyl blue tetrazolium bromide; CAS No. 298-93-1) and cells incubated for 4 hours at 37 °C in the presence of 5 % CO2.
Za test preživljavanja stanica KeratinoSensTM medij se nakon 48 sati izlaganja zamjenjuje svježim medijem koji sadržava MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijev bromid, tiazolil plavi tetrazolijev bromid; CAS br. 298-93-1) te se stanice inkubiraju četiri sata na 37 oC u prisutnosti 5 % CO2.
The MTT medium is then removed and cells are lysed (e.g. by adding 10 % SDS solution to each well) overnight.
Potom se medij MTT uklanja i stanice se tijekom noći liziraju (npr. dodavanjem 10 %-tne otopine SDS-a u svaku jažicu).
After shaking, the absorption is measured at i.e. 600 nm with a photometer.
Nakon protresanja fotometrom se mjeri apsorpcija na 600 nm.
The following parameters are calculated in the KeratinoSensTM assay:
U testu KeratinoSensTM izračunavaju se sljedeći parametri:
the maximal average fold induction of luciferase activity (Imax) value observed at any concentration of the tested chemical and positive control;
najveći prosječni multiplikacijski faktor indukcije aktivnosti luciferaze (Imax) za svaku koncentraciju ispitane kemikalije i pozitivne kontrole,
the EC1,5 value representing the concentration for which induction of luciferase activity is above the 1,5 fold threshold (i.e. 50 % enhanced luciferase activity) was obtained; and
vrijednost EC1,5 koja predstavlja koncentraciju za koju je dobivena indukcija aktivnosti luciferaze iznad praga koji odgovara povećanju pomnoženom s 1,5 (tj. povećanju aktivnosti luciferaze od 50 %) i
the IC50 and IC30 concentration values for 50 % and 30 % reduction of cellular viability.
vrijednosti koncentracije IC50 i IC30 koje odgovaraju smanjenju preživljavanja stanica od 50 % i 30 %.
Fold luciferase activity induction is calculated by Equation 1, and the overall maximal fold induction (Imax) is calculated as the average of the individual repetitions.
multiplikacijski faktor indukcije aktivnosti luciferaze izračunava se s pomoću jednadžbe 1., a ukupni maksimalni multiplikacijski faktor indukcije (Imax) izračunava se kao prosjek pojedinačnih ponavljanja.
Fold induction
Multiplikacijski faktor indukcije
Lsample
Luzorak
Lblank
Lprazno
Lsolvent
Lotapalo
L sample
L uzorak
is the luminescence reading in the test chemical well
luminiscencija izmjerena u jažici koja sadržava ispitivanu kemikaliju
L blank
L prazno
is the luminescence reading in the blank well containing no cells and no treatment
luminiscencija izmjerena u praznoj jažici koja ne sadržava stanice i nije tretirana
L solvent
L otapalo
is the average luminescence reading in the wells containing cells and solvent (negative) control
prosječna vrijednost luminiscencije izmjerene u jažicama koje sadržavaju stanice i negativnu kontrolu (s otapalom)
,5 is calculated by linear interpolation according to Equation 2, and the overall EC1,5 is calculated as the geometric mean of the individual repetitions.
,5 se izračunava linearnom interpolacijom s pomoću jednadžbe 2., a ukupan EC1,5 izračunava se kao geometrijska sredina pojedinačnih ponavljanja.
is the lowest concentration in μM with > 1,5 fold induction
najniža koncentracija u μM pri kojoj je povećanje indukcije > 1,5 puta
is the highest concentration in μM with < 1,5 fold induction
najviša koncentracija u μM pri kojoj je povećanje indukcije < 1,5 puta
is the fold induction measured at the lowest concentration with > 1,5 fold induction (mean of three replicate wells)
multiplikacijski faktor indukcije izmjerene pri najnižoj koncentraciji pri kojoj je povećanje indukcije > 1,5 puta (srednja vrijednost za tri jažice kao ponovljeni uzorak)
is the fold induction at the highest concentration with < 1,5 fold induction (mean of three replicate wells)
multiplikacijski faktor indukcije izmjerene pri najvišoj koncentraciji pri kojoj je povećanje indukcije > 1,5 puta (srednja vrijednost za tri jažice kao ponovljeni uzorak)
Viability is calculated by Equation 3:
Preživljavanje se izračunava s pomoću jednadžbe 3.:
Equation 3:
jednadžba 3.:
Viability
Preživljavanje
Vsample
Vuzorak
Vblank
Vprazno
Vsolvent
Votapalo
V sample
V uzorak
is the MTT-absorbance reading in the test chemical well
apsorbancija izmjerena testom MTT u jažici koja sadržava ispitivanu kemikaliju
V blank
V prazno
is the MTT-absorbance reading in the blank well containing no cells and no treatment
apsorbancija izmjerena testom MTT u praznoj jažici koja ne sadržava stanice i nije tretirana
V solvent
V otapalo
is the average MTT-absorbance reading in the wells containing cells and solvent (negative) control
prosječna apsorbancija izmjerena testom MTT u jažicama koje sadržavaju stanice i negativnu kontrolu (s otapalom)
and IC30 are calculated by linear interpolation according to Equation 4, and the overall IC50 and IC30 are calculated as the geometric mean of the individual repetitions.
i IC30 izračunavaju se linearnom interpolacijom s pomoću jednadžbe 4., a ukupni IC50 i IC30 izračunavaju se kao geometrijska sredina pojedinačnih ponavljanja.
X is the % reduction at the concentration to be calculated (50 and 30 for IC50 and IC30)
X smanjenje od % pri koncentraciji koju treba izračunati (50 i 30 za IC50 i IC30)
is the lowest concentration in μM with > x % reduction in viability
najniža koncentracija u μM za koju je smanjenje preživljavanja > x %
is the highest concentration in μM with < x % reduction in viability
najviša koncentracija u μM za koju je smanjenje preživljavanja > x %
is the % viability at the lowest concentration with > x % reduction in viability
preživljavanje od % pri najnižoj koncentraciji za koju je smanjenje preživljavanja > x %
is the % viability at the highest concentration with < x % reduction in viability
preživljavanje od % pri najvišoj koncentraciji za koju je smanjenje preživljavanja < x %
For each concentration showing > 1,5 fold luciferase activity induction, statistical significance is calculated (e.g. by a two-tailed Student's t-test), comparing the luminescence values for the three replicate samples with the luminescence values in the solvent (negative) control wells to determine whether the luciferase activity induction is statistically significant (p < 0,05).
Za svaku se koncentraciju koja pokazuje povećanje indukcije aktivnosti luciferaze > 1,5 puta izračunava statistička značajnost (npr. dvosmjernim Studentovim t-testom) uspoređivanjem vrijednosti luminiscencije za tri ponovljena uzorka s vrijednostima luminiscencije u jažicama koje sadržavaju (negativnu) kontrolu s otapalom kako bi se utvrdilo je li indukcija aktivnosti luciferaze statistički značajna (p < 0,05).
The lowest concentration with > 1,5 fold luciferase activity induction is the value determining the EC1,5 value.
Najniža koncentracija pri kojoj je povećanje indukcije aktivnosti luciferaze > 1,5 puta vrijednost je koja određuje EC1,5.
It is checked in each case whether this value is below the IC30 value, indicating that there is less than 30 % reduction in cellular viability at the EC1,5 determining concentration.
U svakom se slučaju provjerava je li ta vrijednost niža od vrijednosti IC30, dakle je li pri koncentraciji koja određuje vrijednost EC1,5 smanjenje preživljavanja stanica manje od 30 %.
It is recommended that data are visually checked with the help of graphs.
Preporučuje se da se podaci vizualno provjeravaju s pomoću grafikona.
If no clear dose-response curve is observed, or if the dose-response curve obtained is biphasic (i.e. crossing the threshold of 1,5 twice), the experiment should be repeated to verify whether this is specific to the test chemical or due to an experimental artefact.
Ako se ne uočava jasna krivulja doza – odgovor ili ako dobivena krivulja doza – odgovor ima dvofazičan izgled (tj. dva puta presijeca prag od 1,5), pokus bi trebalo ponoviti kako bi se provjerilo je li taj rezultat specifičan za ispitivanu kemikaliju ili je riječ o analitičkom artefaktu.
In case the biphasic response is reproducible in an independent experiment, the lower EC1,5 value (the concentration when the threshold of 1,5 is crossed the first time) should be reported.
U slučaju da je dvofazični odgovor obnovljiv u neovisnom pokusu, u izvješću bi trebalo navesti nižu vrijednost EC1,5 (koncentraciju pri kojoj krivulja prvi put presijeca prag od 1,5).
In the rare cases where a statistically non-significant induction above 1,5 fold is observed followed by a higher concentration with a statistically significant induction, results from this repetition are only considered as valid and positive if the statistically significant induction above the threshold of 1,5 was obtained for a non-cytotoxic concentration.
U rijetkim se slučajevima u kojima se iznad praga od 1,5 puta uočava indukcija koja nije statistički značajna, a nakon koje slijedi statistički značajna indukcija pri višoj koncentraciji, rezultati tog ponavljanja smatraju valjanima i pozitivnima jedino ako je statistički značajna indukcija iznad praga od 1,5 dobivena za koncentraciju koja nije citotoksična.
Finally, for test chemicals generating a 1,5 fold or higher induction already at the lowest test concentration of 0,98 μM, the EC1,5 value of < 0,98 is set based on visual inspection of the dose-response curve.
Konačno, za ispitivane kemikalije kod kojih se već i pri najnižoj ispitnoj koncentraciji od 0,98 μM javlja 1,5 puta ili veća indukcija, vrijednost EC1,5 < 0,98 utvrđuje se na temelju vizualnog pregleda krivulje doza – odgovor.
The following acceptance criteria should be met when using the KeratinoSensTM assay.
Sljedeći bi kriteriji prihvatljivosti trebali biti ispunjeni kada se primjenjuje test KeratinoSensTM.
First, the luciferase activity induction obtained with the positive control, cinnamic aldehyde, should be statistically significant above the threshold of 1,5 (e.g. using a T-test) in at least one of the tested concentrations (from 4 to 64 μM).
Prvo, indukcija aktivnosti luciferaze dobivena s pozitivnom kontrolom, cimetnim aldehidom, trebala bi biti statistički značajna iznad praga od 1,5 (npr. na temelju T-testa) za najmanje jednu od ispitanih koncentracija (od 4 do 64 μM).
Second, the EC1,5 value should be within two standard deviations of the historical mean of the testing facility (e.g. between 7 μM and 30 μM based on the validation dataset) which should be regularly updated.
Drugo, vrijednost EC1,5 trebala bi biti unutar dvaju standardnih odstupanja prijašnje srednje vrijednosti ispitnog laboratorija (npr. između 7 μM i 30 μM na temelju podataka upotrijebljenih za validaciju), koju bi trebalo redovito ažurirati.