natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Tissue sampling, preparation and storage before determination of genetic sex by PCR-method in medaka (Prepared by the Laboratory for Aquatic Organisms of Bayer CropScience AG)
Uzorkovanje, priprema i pohrana tkiva prije određivanja genetskog spola metodom PCR-a u medake (pripremio Laboratorij za vodene organizme Bayer CropScience AG-a)
With fine scissors the anal or the dorsal fin will be cut off in each individual fish and placed into a tube filled with 100 μl of extraction-buffer 1 (details on buffer preparation see below).
Finim se škarama reže analna ili leđna peraja svake pojedine ribe i stavlja u cijev napunjenu sa 100 μl pufera za ekstrakciju 1 (pojedinosti o pripremi pufera nalaze se u nastavku).
The scissors will be cleaned after each single fish in a beaker filled up with distilled H2O and dried with a paper tissue.
Škare se nakon svake pojedine ribe čiste u laboratorijskoj čaši napunjenoj destiliranim H2O i suše papirnatim ručnikom.
Now the fin-tissues will be homogenised by a micro tube teflon pistil for the lysis of cells.
Nakon toga tkivo peraja homogenizira se teflonskim tučkom s mikrocjevčicom kako bi se razložile stanice.
For each tube a new pistil will be used to prevent any contaminations.
Za svaku se cijev upotrebljava novi tučak kako bi se izbjegla bilo kakva kontaminacija.
The pistils will be placed overnight in 0,5 M NaOH, rinse for 5 minutes in distilled H2O and stored in ethanol or sterile after autoclave until use.
Tučci se tijekom noći stavljaju u 0,5 M NaOH, ispiru pet minuta u destiliranom H2O i pohranjuju u etanolu ili sterilni nakon autoklava do upotrebe.
It is also possible to store the fin tissue without any extraction-buffer 1 on dry-ice and then at – 80 °C refrigerator to prevent any degeneration of the DNA.
Tkivo peraja može se pohraniti i bez pufera za ekstrakciju 1 na suhom ledu i zatim na – 80 °C u hladnjaku kako bi se spriječila bilo kakva degeneracija DNK-a.
But the extraction runs better, if you extract the DNA at the same time (handling see above; samples should be thawed on ice after storaging at – 80 °C before the buffer will be filled in the tubes).
Međutim, ekstrakciju je bolje provesti uz istovremenu ekstrakciju DNK-a (prethodno vidi postupak; uzorci bi se trebali otapati na ledu nakon pohrane na – 80 °C prije dodavanja pufera u cijevi).
After homogenizing all tubes will be placed in a water bath and boiled for 15 minutes at 100 °C.
Nakon homogenizacije sve se cijevi stavljaju u vodenu kupelj i kuhaju 15 minuta na 100 °C.
Then 100 μl of the extraction buffer 2 (details on buffer preparation see below) will be pipetted into each tube.
Zatim se pipetom u svaku cijev dodaje 100 μl pufera za ekstrakciju 2 (pojedinosti o pripremi pufera nalaze se u nastavku).
The samples will be stored at room temperature for 15 minutes and in the meantime they will be sometimes gently shaken by hand.
Uzorci se pohranjuju na sobnoj temperaturi 15 minuta uz povremeno nježno protresanje rukom.
Afterwards all tubes will be placed in the water bath again and boiled for another 15 minutes at 100 °C.
Nakon toga sve se cijevi ponovno stavljaju u vodenu kupelj i kuhaju dodatnih 15 minuta na 100 °C.
Until further analysis the tubes will be frozen at – 20 °C.
Do daljnje se analize cijevi zamrzavaju na – 20 °C.
Buffer preparation
Priprema pufera
PCR-buffer 1:
PCR-pufer 1:
500 mg N-Lauroylsarcosine (e.g. Merck KGaA, Darmstadt, GE)
500 mg N-lauroilsarkozina (npr. Merck KGaA, Darmstadt, Njemačka)
→ autoclave
→ autoklav
The supernatant will be used directly or can be stored frozen (at – 20 °C) and rethawed again in several cycles without negative impact on the DNA for later analyses.
20 g Chelexa (npr. Biorad, München, Njemačka) bubrenje u 100 ml destiliranog H2O → autoklav
Final Concentration
Konačna koncentracija
Tris/HCl (pH8,8 at 25 °C), 160mM (NH4)2SO4, 25mM MgCl2, 0,1 %Tween 20
Supernatant se upotrebljava izravno ili se može pohraniti zamrznut (na – 20 °C) i ponovno otopiti u nekoliko ciklusa bez negativnog učinka na DNK za kasnije analize. 1. Priprema ‚reakcijske smjese’ (25 μl po uzorku): Volumen Konačna koncentracija Kalup DNK-a
After that all tubes will be closed, stirred (ca. 10 sec) and centrifuged (10 sec, at room temperature).
10 x PCR-pufer s MgCl2
Now the respective PCR-programmes can be started.
2,5 μl
Additionally a positive control (exemplary DNA sample with known activity and clear results) and a negative control (1 μl dest. H2O) will be used in each PCR-programme.
1 x Nukleotidi (svaki dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 4 μl (5 mM) 200 μM Uzvodna početnica (10 μM) (vidi u nastavku 3 – 5) 0,5 μl 200 nM Nizvodna početnica (10 μM) (vidi u nastavku 3 – 5) 0,5 μl 200 nM DMSO
Preparation of the agarose gel (1 %) — During running PCR-programmes:
1,25 μl 5 %
Solve 3 g agarose in 300 ml 1 × TAE-buffer (1 % agarose gel)
Voda (stupanj čistoće za PCR) do 25 μl Polimeraza Taq E
This solution should be boiled using an microwave (ca. 2-3 min)
0,3 μl
Transfer the hot solution into a special casting box, which lies on ice
1,5 U 10 × PCR-pufer s MgCl2:
After ca. 20 min the agarose gel is ready to use
670 mM Tris/HCl (pH-vrijednost 8,8 na 25 °C), 160 mM (NH4)2SO4, 25 mM MgCl2, 0,1 Tween 20 Za svaki je PCR (vidi u nastavku 3 – 5) potrebna posebna početnica kao nova kombinacija ‚reakcijske smjese’ i odgovarajuće potrebne količine kalupa DNK-a za svaki uzorak (vidi prethodno). Odgovarajući se volumeni pipetama prenose u nove cijevi. Nakon toga sve se cijevi zatvaraju, miješaju (oko deset sekundi) i centrifugiraju (deset sekundi na sobnoj temperaturi). Sada se može pokrenuti odgovarajući program PCR-a.
Storage the agarose gel in 1 × TAE-buffer until the end of the PCR-programmes
Pored toga, u svakom se programu PCR-a primjenjuju pozitivna kontrola (reprezentativni uzorak DNK-a s poznatim djelovanjem i jasnim rezultatima) i negativna kontrola (1 μl destiliranog H2O). 2. Priprema agaroznog gela (1 %) – tijekom provedbe programa PCR-a: Otopiti 3 g agaroze u 300 ml 1 × tris-acetatni EDTA pufera (TAE) (1 %-tni agarozni gel). Otopinu je potrebno kuhati u mikrovalnoj peći (oko dvije do tri minute). Topla se otopina prenosi u posebnu kutiju za izradu odljevaka, koja je položena na led. Nakon približno 20 minuta agarozni gel spreman je za upotrebu. Agarozni gel pohranjuje se u pufer TAE do kraja programa PCR-a.
Actin-PCR-programme:
Program PCR-a za aktin
This PCR-reaction is aimed to demonstrate that the DNA in the sample is not harmed.
Cilj je navedene reakcije PCR dokazati da DNK iz uzorka nije oštećen.
Special primer:
Posebna početnica:
“Mact1(upper/forward)” → TTC AAC AGC CCT GCC ATG TA
‚Mact1(gornji/uzvodni)’ → TTC AAC AGC CCT GCC ATG TA
“Mact2(lower/reverse)” → GCA GCT CAT AGC TCT TCT CCA GGG AG
‚Mact2(donji/nizvodni)’ → GCA GCT CAT AGC TCT TCT CCA GGG AG
Cycle (35-times):
ciklus (35 puta)
Denaturation
denaturacija
→ 45 sec at 95 °C
→ 45 sekundi na 95 °C
Annealing
prianjanje
→ 45 sec at 56 °C
→ 45 sekundi na 56 °C
Elongation
produljenje
→ 1 min at 68 °C
→ jedna minuta na 68 °C
15 min 68 °C
15 minuta na 68 °C
X- and Y-Gene-PCR-programme:
Program PCR-a za gene X i Y
The samples with intact DNA will be used in this PCR-programme to detect the X- and Y-Genes.
U okviru navedenog programa PCR-a upotrebljavaju se uzorci s netaknutim DNK-om za određivanje gena X i Y.
Male DNA should show one double-band and female DNA should show one single band (after staining and gel-electrophoresis).
Muški DNK trebao bi pokazivati jednu dvostruku vrpcu, a ženski jednu jednostruku vrpcu (nakon bojenja i gel-elektroforeze).
For this programme-run one positive control for males (XY-sample) and one for females (XX-sample) should be included.
U provedbu ovog programa potrebno je uključiti jednu pozitivnu kontrolu za mužjake (uzorak XY) i jednu za ženke (uzorak XX).
“PG 17,5” (upper/forward) → CCG GGT GCC CAA GTG CTC CCG CTG
‚PG 17,5’ (gornji/uzvodni) → CCG GGT GCC CAA GTG CTC CCG CTG
“PG 17,6” (lower/reverse) → GAT CGT CCC TCC ACA GAG AAG AGA
‚PG 17.6’ (donji/nizvodni) → GAT CGT CCC TCC ACA GAG AAG AGA
Cycle (40-times):
ciklus (40 puta)
→ 45 sec at 55 °C
→ 45 sekundi na 55 °C
→ 1 min 30 sec at 68 °C
→ jedna minuta 30 sekundi na 68 °C
Y-Gene-PCR-programme as “control” for X- and Y-Gene-PCR-programme:
Program PCR-a za gen Y kao ‚kontrola’ programa PCR-a za gene X i Y
This PCR-programme verifies the results of the “X- and Y-Gene-PCR-programme”.
Ovim se programom PCR-a potvrđuju rezultati ‚programa PCR-a za gene X i Y’.
The “male-samples” should show one band and the “female-samples” shouldn't show any band (after staining and gel-electrophoresis).
‚Muški uzorci’ trebali bi pokazivati jednu vrpcu, dok ‚ženski uzorci’ ne bi trebali pokazivati ni jednu vrpcu (nakon bojenja i gel-elektroforeze).
“DMTYa (upper/forward)” → GGC CGG GTC CCC GGG TG
‚DMTYa (gornji/uzvodni)’ → GGC CGG GTC CCC GGG TG
“DMTYd (lower/reverse)” → TTT GGG TGA ACT CAC ATG G
‚DMTYd (donji/nizvodni)’ → TTT GGG TGA ACT CAC ATG G
Staining of the PCR-samples:
Bojenje uzoraka za PCR:
Staining solution:
otopina za bojenje:
50 % Glycerol
50 % glicerola
0,25 % Bromphenolblue
0,25 % bromfenol plavog
0,25 % Xylenecyanol
0,25 % ksilencijanola
Pipette 1 μl of the staining solution into each single tube
U svaku se pojedinačnu cijev pipetom stavlja 1 μl otopine za bojenje.
Start of the Gel-Electrophoresis:
Početak gel-elektroforeze:
The prepared 1 % agarose gel will be transferred into a gel-electrophoresis-chamber filled with 1 × TAE-Buffer
Pripremljeni 1 %-tni agarozni gel prenosi se u posudu za gel-elektroforezu koja je napunjena 1 × puferom TAE.
10 - 15 μl of each stained PCR-sample will be pipetted into an agarose gel slot
Pipetom se prenosi 10 – 15 μl svakog obojenog uzorka za PCR u utor u agaroznom gelu.
Also 5 - 15 μl of the 1kb-“Ladder”(Invitrogen) will be pipetted into a separate slot
U zasebni se utor pipetom dodaje i 5 – 15 μl ‚ljestvice’ od 1 kb (Invitrogen).
Start the electrophoresis by 200 V
Početak elektroforeze na 200 V.
Stop after 30-45 min
Prestanak nakon 30 – 45 minuta.
Determination of the bands:
Određivanje vrpci:
Clean the agarose gel in distilled H2O
Agarozni gel čisti se u destiliranom H2O.
Now transfer the agarose gel into Ethidium bromide for 15 - 30 min
Zatim se agarozni gel prenosi u etidijev bromid u trajanju 15 – 30 minuta.
After that, a picture of the agarose gel should be taken in an UV-light-box
Nakon toga potrebno je napraviti sliku agaroznog gela UV lampom.
Finally the samples are analysed in comparison to the positive control-band (or bands) and the ladder
Naposljetku se analiziraju uzorci u odnosu na vrpcu (ili vrpce) iz pozitivne kontrole i ljestvicu.
Guidance on tissue sampling for genetic sex determination by PCR method in the three-spined stickleback
Smjernica za uzorkovanje tkiva za određivanje genetskog spola metodom PCR-a u koljuške
Tissue sampling and DNA extraction
Uzorkovanje tkiva i ekstrakcija DNK-a
DNA can be extracted using a variety of commercially available reagents and both manual and automated extraction systems.
DNK se može ekstrahirati primjenom različitih komercijalno dostupnih reagensa te ručnih i automatskih sustava za ekstrakciju.
The protocol used at the Cefas Weymouth laboratory is outlined below, and the alternative approaches have been added where appropriate.
U nastavku je opisan protokol koji se upotrebljava u laboratoriju Cefas Weymouth i po potrebi dodani su alternativni pristupi.
With fine scissors, a small piece of tissue (10-20 mg) from the dorsolateral area (after removing the head and tail for VTG analysis), is removed from each individual fish.
Sa svake se pojedinačne ribe finim škarama uklanja mali komad tkiva (10 – 20 mg) s dorzolateralnog područja (nakon uklanjanja glave i repa za analizu VTG-a).
The tissue is added into a tube and either placed directly in liquid nitrogen (for storage at – 80 °C) or filled with 70 % ethanol (for transport and subsequent storage at 4 °C).
Tkivo se dodaje u cijev i zatim stavlja izravno u tekući dušik (za pohranu na – 80 °C) ili se cijev puni 70 %-tnim etanolom (za prijevoz i naknadnu pohranu na 4 °C).
The scissors are cleaned after each single fish in 70 % ethanol then in distilled water and dried with tissue paper.
Nakon svake pojedinačne ribe škare se čiste u 70 %-tnom etanolu i zatim u destiliranoj vodi te suše papirnatim ručnikom.
The ethanol (if present) is removed by aspiration and the tissue is digested overnight with proteinase K in 400 μl of ATL buffer (Qiagen).
Etanol se (ako je prisutan) uklanja aspiracijom i tkivo se tijekom noći otapa proteinazom K u 400 μl pufera za razlaganje životinjskog tkiva (ATL) (Qiagen).
An aliquot (200 μl) of the digest is transferred to a 96-well S-block (Qiagen) and the DNA extracted in a 96-well format using the Qiagen Universal BioRobot and the QIamp Investigator BioRobot kit.
Alikvot (200 μl) otopine prenosi se u S-blok s 96 jažica (Qiagen) i ekstrahira se DNK u formatu s 96 jažica primjenom pribora Qiagen Universal BioRobot i QIamp Investigator BioRobot.
The DNA is eluted in a 50 μl of DNase and RNase free water.
DNK se eluira u 50 μl vode bez DNase i RNase.
If using hard tissues to extract DNA (such as a spine or a pectoral fin) it may be necessary to homogenise the sample in the lysis buffer using a FastPrep® tissue lyser or equivalent tissue disruption system.
Ako se za ekstrakciju DNK-a upotrebljavaju čvrsta tkiva (kao što su bodlje ili prsne peraje), može biti potrebno homogenizirati uzorak u puferu za razlaganje uz primjenu instrumenta za razlaganje tkiva FastPrep® ili istovjetnog sustava za razlaganje tkiva.
Alternatively,
Kao druga mogućnost,
the tissue is digested overnight with proteinase K in 400 μl of G2 lysis buffer (Qiagen) and DNA is extracted from 200 μl of the digest using either the EZ-1 DNA easy tissue kit and the EZ-1 biorobot or the DNA easy tissue mini kit.
tkivo se otapa tijekom noći proteinazom K u 400 μl pufera za razlaganje G2 (Qiagen) i ekstrahira se DNK iz 200 μl otopine uz primjenu pribora za jednostavno dobivanje DNK-a iz tkiva EZ-1 i pribora EZ-1 biorobot ili minipribora za jednostavno dobivanje DNK-a iz tkiva.
The DNA is eluted in a 50 μl volume.
DNK se eluira u 50 μl volumena;
The tissues are processed using the DNAzol reagent.
tkiva se obrađuju primjenom reagensa DNAzol.
Briefly, tissue samples are lysed in 1ml of DNAzol for 10 minutes in a 1,5 ml micro centrifuge tube and then centrifuged at 13000 rpm for 5 minutes to remove any particulate matter.
Ukratko, uzorci tkiva razlažu se u 1 ml DNAzola deset minuta u mikrocijevi za centrifugu od 1,5 ml i zatim centrifugiraju na 13000 o/min pet minuta kako bi se uklonile sve čestice.
The lysed sample is then transfered to a new 1,5 ml micro centrifuge tube containing 500 μl of 100 % molecular grade ethanol and then centrifuged at 13000 rpm for 10 minutes to precipitate the DNA.
Razloženi uzorak zatim se prenosi u novu mikrocijev za centrifugu od 1,5 ml koja sadržava 500 μl etanola 100 %-tne molekularne čistoće i potom centrifugira na 13000 o/min deset minuta kako bi nastao talog DNK-a.
The ethanol is removed and replaced with 400 μl of 70 % molecular grade ethanol, centrifuged at 13000 rpm for 5 minutes and the DNA pellet is dissolved in 50 μl molecular DNase and RNase free water.
Etanol se uklanja i zamjenjuje s 400 μl etanola 70 %-tne molekularne čistoće, provodi se centrifugiranje na 13000 rpm pet minuta i otapa se pelet DNK-a u 50 μl vode bez DNase i RNase za molekularnu biologiju.
Again, when using the hard tissues (pectoral fin) it may be necessary to homogenise the sample in the lysis buffer using a FastPrep® tissue lyser or equivalent tissue disruption system prior to extracting the DNA.
Ponovno, ako se upotrebljavaju čvrsta tkiva (prsna peraja), može biti potrebno homogenizirati uzorak u puferu za razlaganje primjenom instrumenta za razlaganje tkiva FastPrep® ili istovjetnog sustava za razlaganje tkiva prije ekstrakcije DNK-a.
The DNA is stored at – 20 °C until required.
DNK se pohranjuje na – 20 °C do upotrebe.
gloves must be worn during the procedures.
obvezno je nošenje rukavica tijekom postupaka.
Polymerase chain reaction (PCR) analysis
Analiza lančane reakcije polimerazom (PCR)
Amplifications were performed using 2,5 μl of the DNA extract in a 50 μl reaction volume using the Idh locus primers (as described by Peichel et al., 2004. Current Biology 1:1416-1424):
Provedene su amplifikacije primjenom 2,5 μl ekstrakta DNK-a u 50 μl reakcijskog volumena uz upotrebu prajmera lokusa Idh (kako je opisano u Peichel et al., 2004. Current Biology 1:1416. – 1424.):
Forward primer
uzvodna početnica
Reverse primer
nizvodna početnica
There are numerous suppliers of suitable PCR reagents.
Mnogo je dobavljača odgovarajućih reagensa za PCR.
The method outlined below is that currently used at the Cefas Weymouth laboratory.
Metoda opisana u nastavku trenutačno se primjenjuje u laboratoriju Cefas Weymouth.
Preparation of the “Reaction Mix” (50 μl per sample):
Priprema ‚reakcijske smjese’ (50 μl po uzorku)
A mastermix is prepared as follows.
Glavna smjesa priprema se kako slijedi.
This can be prepared in advance and stored frozen at – 20 °C until required.
Smjesu je moguće pripremiti unaprijed i pohraniti zamrznutu na – 20 °C do upotrebe.
Make sufficient mastermix for a negative control (molecular biology grade water only).
Treba pripremiti dovoljno glavne smjese za negativnu kontrolu (samo voda za molekularnu biologiju).
Volume (stock conc.)/ sample
Volumen (koncentracija zaliha) / uzorak
® Reaction Buffer
5 x reakcijski pufer GoTaq®
Nucleotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Nukleotidi (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
0,5 μl (25 mM each)
0,5 μl (25 mM svaki)
250 μM each
250 μM svaki
Forward Primer
Uzvodna početnica
0,5μl (0,1 nmol/μl)
0,5 μl (0,1 nmol/μl)
Reverse Primer
Nizvodna početnica
2,0μM
2,0 μM
Molecular biology grade water
Voda za molekularnu biologiju
GoTaq polymerase
Polimeraza GoTaq
Dispense 47,5 μl to a labelled 0,5 ml thin walled PCR tube.
Ulijeva se 47,5 μl u označenu cijev za PCR tanke stijenke od 0,5 ml.
Add 2,5 μl of the purified DNA to the appropriately labelled tube.
Dodaje se 2,5 μl pročišćenog DNK-a u prikladno označenu cijev.
Repeat for all samples and the negative control.
Postupak se ponavlja za sve uzorke i negativnu kontrolu.
Over lay with 2 drops of mineral oil.
Na vrh se nanose dvije kapi mineralnog ulja.
Alternatively, use a thermal cycler with a heated lid.
Kao druga mogućnost može se upotrijebiti cirkularna termalna kupka sa zagrijanim poklopcem.
Close the lids.
Zatvaraju se poklopci.
Samples were denatured in a Peltier PTC-225 thermal cycler at 94 ± 2 °C for 5 minutes followed by 39 cycles of 94 ± 2 °C for 1 minute, 55 ± 2 °C for 1 minute, 72 ± 2 °C for 1 minute, and a final extension of 72 ± 2 °C for 10 minutes.
Uzorci su bili denaturirani u cirkularnoj termalnoj kupki Peltier PTC-225 na 94 ± 2 °C pet minuta nakon čega je slijedilo 39 ciklusa na 94 ± 2 °C jednu minutu, na 55 ± 2 °C jednu minutu, na 72 ± 2 °C jednu minutu i konačno produljenje na 72 ± 2 °C deset minuta.
Preparation of the agarose gel (2 %):
Priprema agaroznog gela (2 %)
Traditionally the PCR products are resolved on a 20 % agarose gel containing ethidium bromide.
Tradicionalno se produkti PCR-a razlučuju na 20 % agaroznom gelu koji sadržava etidijev bromid.
Capillary based electrophoresis systems can also be used.
Mogu se upotrebljavati i kapilarni sustavi za elektroforezu.
Weigh 2 g agarose in 100 ml 1 × TAE-buffer
Važu se 2 g agaroze u 100 ml 1 × pufera TAE.
Heat in a microwave (ca. 2-3 min) to dissolve the agarose.
Zagrijava se u mikrovalnoj peći (oko 2 – 3 minute) kako bi se otopila agaroza.
Add 2 drops of ethidium bromide final concentration 0,5 μg/ml
Dodaju se dvije kapi etidijeva bromida konačne koncentracije od 0,5 μg/ml.
Transfer the hot solution into the gel casting equipment.
Topla otopina prenosi se u opremu za izradu odljevaka od gela.
Allow the gel to harden
Gel se ostavlja kako bi se stvrdnuo.
Gel-Electrophoresis:
Gel-elektroforeza
Transferred the agarose gel to the electrophoresis equipment and submerge in 1 × TAE-buffer
Agarozni se gel prenosi u opremu za elektroforezu i uranja u 1 × pufer TAE.
Load 20 μl of each sample to a separate well, adding a molecular weight marker (100 bp DNA ladder, Promega) to a spare well.
Puni se 20 μl svakog uzorka u zasebnu jažicu uz dodavanje markera molekularne mase (DNK ljestvica 100 bp, Promega) u raspoloživu jažicu.
Electrophoresis is performed at 120 V for 30-45 minutes.
Elektroforeza se provodi na 120 V u trajanju 30 – 45 minuta.
Visualisation of the amplification products
Vizualizacija produkata amplifikacije
If the ethidium bromide was incorporated in to the agarose gel as described above, the DNA products are visualised under a UV source.
Ako je etidijev bromid bio inkorporiran u agarozni gel kako je prethodno opisano, produkti DNK-a vidljivi su pod izvorom UV svjetla.
Alternatively the agarose gel is stained by covering the gel in a dilute solution of ethidium bromide (0,5 μg/ml in water) for 30 minutes prior to visualisation.
Kao druga mogućnost agarozni gel boji se prekrivanjem gela razrijeđenom otopinom etidijeva bromida (0,5 μg/ml u vodi) 30 minuta prije vizualizacije.
Guidance for artificial fertilisation procedure for the three-spined stickleback
Smjernica za postupak umjetne oplodnje za koljušku
The purpose of this section is to describe the procedures to obtain fertilised eggs from the three-spined stickleback in view of using them in the FSDT.
Cilj je ovog odjeljka opisati postupke za dobivanje oplođenih jajašaca koljuške radi njihove upotrebe u ispitivanju spolnog razvoja riba.
Obtaining sperm from the males
Dobivanje sperme od mužjaka
A well-coloured male of the desired population is euthanised.
Usmrćuje se mužjak dobre boje iz željene populacije.
The testes are dissected from each side of the fish.
Ribi se sa svake strane seciraju testisi.
The testes are generally heavily pigmented, rod shaped structures that are readily apparent at the lateral midline of the body.
Testisi su uobičajeno jako pigmentirane strukture u obliku štapa koje su jasno vidljive na bočnoj središnjoj liniji tijela.
Use either of the following methods:
Primjenjuje se bilo koja od metoda navedenih u nastavku.
Using a pair of fine scissors, begin at the cloaca and make a 1-1,5 cm incision with a single snip angled at about 45 degrees.
Finim se škarama počinje od kloake i pravi se rez veličine 1 – 1,5 cm jednim potezom pod kutom od približno 45 stupnjeva.
Use a scalpel to make a small incision in the side of the fish slightly posterior to the pelvis and just ventral of the lateral plates.
Skalpelom se pravi mali rez sa strane ribe malo iza zdjelice i odmah ventralno od bočnih pločica.
The testes are removed using fine forceps and placed into a petri dish.
Testisi se uklanjaju finim hvataljkama i stavljaju u Petrijevu zdjelicu.
Each testis is covered with 100 μl freshly made Hank's final solution.
Svaki se testis prekriva sa 100 μl svježe pripremljene Hankove konačne otopine.
The testes are finely diced by using a razor blade or scalpel.
Testisi se britvicom ili skalpelom usitnjavaju.
This will release sperm and give the Hank's solution a milky appearance.
Time se oslobađa sperma te Hankova otopina poprima mliječni izgled.
The fluid containing sperm is added into a tube, while trying not to include any pieces of testes tissue when pipetting.
Tekućina koja sadržava spermu dodaje se u cijev uz istovremeno izbjegavanje dodavanja dijelova tkiva testisa prilikom prijenosa pipetom.
800 μl of Hank's final solution are added into the tube and mixed well.
800 μl Hankove konačne otopine dodaje se u cijev i dobro miješa.
If required, the male can be preserved by fixing in 100 % ethanol or other desired fixative.
Po potrebi se mužjak može konzervirati fiksiranjem u 100 %-tnom etanolu ili drugom željenom fiksativu.
This is particularly important if the study is assigning parental origin of offsprings.
To je osobito važno ako se u studiji određuje roditeljsko podrijetlo potomaka.
Although most of the stock solutions required can be made in advance, stock 5 and subsequently the final solution, should be made up fresh on the day of use.
iako se većinu radnih otopina može pripremiti unaprijed, radnu otopinu 5 i kasnije konačnu otopinu potrebno je pripremiti svježe na dan upotrebe.
Stock 1
Radna otopina 1
8,00 g
8,00 g
0,40 g
0,40 g
Distilled water (DW)
Destilirana voda
Stock 2
Radna otopina 2
HPO4 (anhydrous)
HPO4 (anhidridni)
0,358 g
0,358 g
0,60 g
0,60 g