natgillin/translations-raw huggingface dataset:
The ratio between inoculum size and volume of cell culture medium shall be about 1:10.
Omjer je veličine inokuluma i količine stanične kulture oko 1:10.
For each dilution and each cell line, a minimum of about 2 cm2 cell area, corresponding to one well in a 24-well cell culture tray, shall be utilised.
Za svako razrjeđenje i svaku staničnu liniju upotrebljava se najmanje oko 2 cm2 površine stanica, što odgovara jednoj jažici na 24-jažičnoj plitici za staničnu kulturu.
Cell culture trays shall be used where possible.
Plitice za staničnu kulturu upotrebljavaju se kad je to moguće.
Incubation of cell cultures
Inkubacija staničnih kultura
The inoculated cell cultures shall be incubated at 15 °C for seven to 10 days.
Inokulirane stanične kulture inkubiraju se sedam do deset dana pri 15 °C.
If the colour of the cell culture medium changes from red to yellow indicating medium acidification, pH adjustment with sterile bicarbonate solution or equivalent substances shall be performed to ensure cell susceptibility to virus infection.
Ako se boja medija za staničnu kulturu promijeni s crvene u žutu, što ukazuje na zakiseljenje medija, pH se prilagođava s pomoću sterilne otopine bikarbonata ili istovrijednim tvarima kako bi se osigurala osjetljivost stanica na virusnu infekciju.
At least every 6 months or if decreased cell susceptibility is suspected, titration of frozen stocks of VHSV and IHNV shall be performed to verify the susceptibility of the cell cultures to infection.
Najmanje svakih šest mjeseci ili ako se sumnja na smanjenu osjetljivost stanica obavlja se titracija zamrznutih pohranjenih virusa VHS-a i IHN-a kako bi se verificirala osjetljivost staničnih kultura na infekciju.
The procedure set out in Section III shall be used, if possible.
Ako je moguće, upotrebljava se postupak utvrđen u odjeljku III.
Microscopy
Mikroskopiranje
Inoculated cell cultures shall be inspected regularly, at least three times a week, for the occurrence of CPE at 40 to 150 × magnification.
Inokulirane stanične kulture redovito se pregledavaju, najmanje tri puta tjedno, pri povećanju od 40 do 150 puta, kako bi se provjerilo je li došlo do pojave citopatogenog učinka (CPU).
If obvious CPE is observed, virus identification procedures in accordance with point I.6 shall be initiated immediately.
Ako se opazi očiti citopatogeni učinak (CPU), odmah se počinje s postupkom identifikacije virusa u skladu s točkom I.6.
Subcultivation
Supkultiviranje
If no CPE has developed after the primary incubation for 7 to 10 days, subcultivation shall be performed to fresh cell cultures utilising a cell area similar to that of the primary culture.
Ako se nakon primarne inkubacije od sedam do deset dana ne razvije citopatogeni učinak (CPU), provodi se supkultiviranje sa svježim staničnim kulturama korištenjem površine slične površini primarne kulture.
Aliquots of medium (supernatant) from all cultures or wells constituting the primary culture shall be pooled according to cell line 7 to 10 days after inoculation.
Alikvoti hranjive podloge (supernatant) svih kultura ili jažica koje čine primarnu kulturu objedinjavaju se prema staničnoj liniji sedam do deset dana nakon inokulacije.
The pools shall then be inoculated into homologous cell cultures undiluted and diluted 1:10 (resulting in final dilutions of 1:10 and 1:100, respectively, of the supernatant) as described in point I.5.2.
Tako dobiveni skupni uzorci inokuliraju se u homologne stanične kulture, nerazrijeđene i razrijeđene 1:10 (pri čemu se dobivaju konačna razrjeđenja supernatanta u omjeru 1:10 odnosno 1:100), kako je opisano u točki I.5.2.
Alternatively, aliquots of 10 % of the medium constituting the primary culture shall be inoculated directly into a well with fresh cell culture (namely, well to well subcultivation).
Druga je mogućnost da se alikvoti 10 % hranjive podloge koja čini primarnu kulturu inokuliraju izravno u jažicu sa svježom staničnom kulturom (točnije, supkultiviranje iz jažice u jažicu).
The inoculation may be preceded by pre-incubation of the dilutions with the antiserum to IPN virus at appropriate dilution as described in point I.4.3.
Inokulaciji može prethoditi predinkubacija razrjeđenja s antiserumom za virus IPN-a u odgovarajućem razrjeđenju kako je opisano u točki I.4.3.
The inoculated cultures shall then be incubated for 7 to 10 days at 15 °C and inspected in accordance with point I.5.4.
Inokulirane kulture potom se inkubiraju sedam do deset dana pri 15 °C i pregledavaju kako je opisano u točki I.5.4.
If toxic CPE occurs within the first 3 days of incubation, subcultivation shall be performed at that stage, but the cells shall then be incubated for 7 days and sub cultivated again with further 7 days incubation.
Ako se tijekom prva tri dana inkubacije javi toksični CPU, u toj se fazi može obaviti supkultiviranje, ali se stanice potom moraju inkubirati sedam dana i ponovno supkultivirati uz dodatnih sedam dana inkubacije.
When toxic CPE develops after 3 days, the cells shall be passed once and incubated to achieve the total of 14 days from the primary inoculation.
Kad se toksični CPU razvije nakon tri dana, stanice se jednom stavljaju u pasažu i inkubiraju dok ne prođe ukupno 14 dana od prve inokulacije.
There must be no evidence of toxicity in the final 7 days of incubation.
U zadnjih sedam dana inkubacije ne smiju se javiti znaci toksičnosti.
If bacterial contamination occurs despite treatment with antibiotics, subcultivation shall be preceded by centrifugation at 2000 to 4000 × g for 15 to 30 minutes at 2 to 5 °C, or filtration of the supernatant through a 0,45 μm filter or both (low protein-binding membrane).
Ako unatoč obradi antibioticima dođe do bakterijske kontaminacije, prije supkultivacije provodi se centrifugiranje na 2000 do 4000 × g od 15 do 30 minuta pri temperaturi od 2 do 5 °C ili filtriranje supernatanta kroz filtar od 0,45 μm ili oboje (membrana s niskom sposobnošću vezivanja proteina).
In addition to this, subcultivation shall follow the same procedures as described for toxic CPE in the fourth paragraph of this point.
Nadalje, u supkultivaciji slijede se isti postupci kao oni koji su opisani za toksični CPU u četvrtom stavku ove točke.
If no CPE occurs, the test may be declared negative.
Ako se ne razvije CPU, ispitivanje se može proglasiti negativnim.
Virus identification
Identifikacija virusa
If evidence of CPE has been observed in a cell culture, medium (supernatant) shall be collected and examined by one or more of the following techniques: Enzyme-linked immunosorbent essay (ELISA), Immunofluorescence (IF), neutralisation, RT-PCR or RT-qPCR.
Ako se u staničnoj kulturi uoči postojanje CPU-a, medij (supernatant) se prikuplja i pretražuje korištenjem jedne ili više sljedećih metoda: enzimski imunosorbentni test (ELISA), imunofluorescencija (IF), neutralizacija, RT-PCR ili RT-qPCR.
If these tests have not allowed definitive identification of the virus within 1 week, the supernatant shall be forwarded to the national reference laboratory or to the EU reference laboratory for fish diseases referred to in Annex VI to Directive 2006/88/EC for immediate identification.
Ako se ovim testovima ne može sa sigurnošću identificirati virus u roku od jednog tjedna, supernatant se prosljeđuje u nacionalni referentni laboratorij ili u referentni laboratorij Europske unije za bolesti riba naveden u prilogu VI. Direktivi 2006/88/EZ kako bi se virus odmah identificirao.
A double antibody sandwich ELISA shall be performed in order to identify the virus isolate.
Dvojni sendvič ELISA provodi se radi identifikacije izolata virusa.
Microwell plates shall be coated with 50 μl/well (0,9 pg) of proven quality protein-A purified immunoglobulins(Ig) from rabbit antisera against IHNV or VSHV diluted in carbonate buffer (pH 9,6) containing 15 mM sodium azide and incubated from 18 hours to 2 weeks at 4 °C.
Plitice s mikrojažicama premazuju se s 50 μl/jažica (0,9 pg) pročišćenog imunoglobulina (Ig) proteina-A dokazane kvalitete iz kunićjih protutijela protiv virusa IHN-a ili VHS-a razrijeđenog u puferu karbonata (pH 9,6) koji sadržava 15 mM natrijevog azida i inkubiranog između 18 sati i 2 tjedna pri temperaturi od 4 °C.
On a dilution plate, each sample containing 1 % Triton X-100 and the positive controls shall be diluted with buffer solution (namely, phosphate buffered saline (PBS)-T-BSA, 1 % BSA) in a 4-fold dilution: undiluted, 1:4, 1:16, 1:64.
Na plitici za razrjeđivanje svi uzorci koji sadržavaju 1 % Tritona X-100 i pozitivne kontrole razrjeđuju se otopinom pufera (točnije, fiziološkom otopinom puferiranom fosfatnim puferom (PBS)-T-BSA, 1 % BSA) u četverostrukom razrjeđenju: nerazrijeđeno, 1:4, 1:16, 1:64.
The ELISA plates shall be washed in PBS containing 0,05 % Tween-20 (PBS-T) and 50 μl of each dilution shall be transferred from the dilution plate to the washed and coated ELISA-plate.
Plitice za ELISA-u peru se u PBS-u koji sadržava 0,05 % Tweena-20 (PBS-T) i 50 μl svakog razrjeđenja prebacuje se iz plitice za razrjeđivanje na opranu i premazanu pliticu za ELISA-u.
ELISA plates shall then be incubated for 30 minutes at 37 °C.
Plitice za ELISA-u zatim se inkubiraju 30 minuta pri temperaturi od 37 °C.
Subsequently plates shall be washed and incubated for 30 minutes at 37 °C with specific monoclonal antibodies (namely for VHSV identification MAb IP5B11 and for IHNV Hyb 136-3, respectively).
Nakon toga, plitice se peru i inkubiraju 30 minuta pri temperaturi od 37 °C sa specifičnim monoklonskim protutijelima (točnije, za identifikaciju virusa VHS-a MAb IP5B11 odnosno Hyb 136-3 za virus IHN-a).
50 μl of horseradish-peroxidase (HRP) conjugated rabbit anti mouse antibodies diluted 1:1000 in PBS-T-BSA shall be transferred to the ELISA plate.
kunićjeg protumišjeg konjugata obilježenog peroksidazom iz hrena (HRP) razrijeđenog 1:1000 u PBS-T-BSA prebacuje se na pliticu za ELISA-u.
Finally, after renewed washing the reactions shall be developed adding 50 μl/well of ortho-phenylenediamine (OPD).
Konačno, nakon ponovnog pranja, reakcije se razvijaju dodavanjem 50 μl/jažica ortofenilenediamina (OPD).
The ELISA plates shall be incubated for 20 minutes at room temperature in the dark and the reaction shall be stopped by adding 100 μl/well 0,5 M H2SO4.
Plitice za ELISA-u inkubiraju se 20 minuta na sobnoj temperaturi u tami te se reakciju zaustavlja dodavanjem 100 μl/jažica 0,5 M H2SO4.
The absorbance shall be monitored at a wavelength of 492 and 620 nm in an ELISA reader.
Apsorbancija se prati na valnoj duljini od 492 i 620 nm u ELISA čitaču.
Samples shall be designated positive or negative after comparing the test results to the absorbance values for the positive and negative controls.
Uzorke se proglašava pozitivnima ili negativnima nakon usporedbe rezultata ispitivanja s vrijednostima apsorbancije za pozitivne i negativne kontrole.
In general, samples with combined absorbance (A) < 0,5 for undiluted material shall be considered negative, samples with A values between 0,5 and 1,0 shall be considered suspicious and samples with A values > 1,0 shall be considered positive.
Općenito, uzorci s kombiniranom apsorbancijom (A) < 0,5 za nerazrijeđeni materijal smatraju se negativnima, uzorci s vrijednostima A između 0,5 i 1,0 smatraju se sumnjivima, a uzorci s vrijednostima A > 1,0 smatraju se pozitivnima.
Other ELISA versions with a proven similar efficacy may be used instead of those referred to in this point.
Druge verzije ELISA-e dokazane slične učinkovitosti mogu se upotrijebiti umjesto onih navedenih u ovoj točki.
Immunofluorescence- IF
Imunofluorescencija
The identification of listed pathogens VHSV and IHNV shall be performed by infecting cells in ‘Black’ 96-well plates, conventional 24-well plates or cover slips into 24-well plates.
Identifikacija navedenih patogena virusa VHS-a i IHN-a provodi se infekcijom stanica u pliticama s 96 jažica „Black”, konvencionalnim pliticama s 24 jažice ili pokrovnim stakalcima u pliticama s 24 jažice.
When IHNV or VHSV or both are identified by infecting cells on cover slips, the following protocol shall apply:
Kad se virus VHS-a ili IHN-a ili obiju bolesti identificira infekcijom stanica na pokrovnim stakalcima, primjenjuje se sljedeći protokol:
cover slips shall be seeded with cells at a density leading to between 60 % and 90 % confluence after 24 hours of cultivation.
pokrovna stakalca nasađuju se stanicama u gustoći tako da se postigne približno 60 % do 90 %-tna konfluencija nakon 24 sata kultivacije.
EPC cells shall be used where possible for this purpose because of their strong adherence to glass surfaces, but other cell lines such as BF-2, RTG-2 or FHM may be used as well.
U tu se svrhu upotrebljavaju stanice EPC gdje god je moguće jer one snažno prianjaju za staklenu površinu, ali se mogu upotrebljavati i druge stanične linije kao što su BF-2, RTG-2 ili FHM.
150 μl cell culture supernatant in two different dilutions (1:10 and 1:1000) shall be inoculated in duplicate onto 1-day-old monolayers and incubated at 15 °C for 24 hours;
150 μl supernatanta stanične kulture u dva različita razrjeđenja (1:10 i 1:1000) inokuliraju se dvostruko na jednostruke slojeve stare jedan dan i inkubiraju 24 sata pri temperaturi od 15 °C;
subsequently, cell culture medium shall be removed, and the infected cell monolayers fixed with 0,5 ml ice-cold, aqueous acetone solution (80 % vol:vol).
naknadno se uklanja medij stanične kulture, a zaraženi jednostruki slojevi stanica fiksiraju se s 0,5 ml ledene vodene otopine acetona (80 % vol/vol).
Fixation shall take place in fume hood for 15 minutes at room temperature, then the acetone solution shall be removed and the cover glasses shall be air dried for at least 30 minutes.
Fiksacija se provodi u odsisniku dima 15 minuta na sobnoj temperaturi, a tada se otopina acetona uklanja i pokrovna stakalca suše na zraku najmanje 30 minuta.
At this stage, the plates shall either be processed immediately or stored at – 20 °C for further use;
U ovoj fazi plitice treba obraditi odmah ili ih pohraniti pri temperaturi od – 20 °C za daljnju upotrebu;
specific monoclonal antibodies (namely for VHSV identification, MAb IP5B11 and for IHNV, Hyb 136-3 respectively) shall be diluted in 0,01 M PBST, pH 7,2 in the dilution recommended by the provider of the MAbs; 50 to 100 μl/well shall be added to the fixed monolayer and plates shall be incubated for one hour at 37 °C in a humid chamber;
određena monoklonska protutijela (točnije za identifikaciju virusa VHS-a, MAb IP5B11 odnosno za virus IHN-a, Hyb 136-3) razrjeđuju se u 0,01 M PBST pri pH 7,2 u otopini koju je preporučio dobavljač MAbs-a; 50 do 100 μl/jažica dodaje se u fiksiran jednostruki sloj te se plitice inkubiraju jedan sat pri temperaturi od 37 °C u vlažnoj komori;
cover glasses shall be washed gently three times with PBS containing 0,05 % Tween-20 (PBS-T), and the buffer shall be removed completely after the last rinse.
pokrovna stakalca peru se oprezno tri puta PBS-om koji sadržava 0,05 % Tweena-20 (PBS-T), a pufer se u potpunosti uklanja nakon zadnjeg ispiranja.
The cells shall subsequently be incubated for one hour at 37 °C with fluorescein isothiocyanate (FITC) — or tetramethylrhodamine-5-(and-6-) isothiocyanate (TRITC)-conjugated antibodies against mouse immunoglobulin used as the primary antibody, diluted according to the supplier instructions, washed again in PBS-T, and dried.
Stanice se naknadno inkubiraju jedan sat pri temperaturi od 37 °C protutijelima konjugiranima fluorescein-izotiocijanatom (FITC) ili tetrametilrodamin-5- (i -6-) izotiocijanatom protiv mišjeg imunoglobulina upotrijebljenog kao primarno protutijelo, razrjeđuju u skladu s uputama dobavljača, ponovno ispiru u PBS-T a zatim suše.
Stained cultures shall be mounted onto glass slides using glycerol saline and examined under incident ultraviolet (UV) light.
Obojene kulture nanose se na staklene pločice upotrebom fiziološke otopine s dodatkom glicerola te ih se pregledava pod ulaznim ultraljubičastim (UV) svjetlom.
Use 10 × or 12 × eyepieces and a × 25 or × 40 objective lens with numerical apertures > 0,7 and > 1,3 respectively.
Upotrebljavajte okulare s povećanjem od 10 ili 12 puta te objektive s povećanjem od 25 ili 40 puta, s numeričkim otvorima > 0,7 odnosno > 1,3.
Other IF techniques, with regard to cell cultures, fixation and antibodies of reference quality, of proven similar efficacy may be used instead.
Umjesto njega mogu se upotrijebiti i drugi postupci imunofluorescencije s obzirom na stanične kulture, fiksiranje i protutijela referentne kvalitete dokazane slične učinkovitosti.
Neutralisation
Neutralizacija
Cells from the collected supernatant shall be removed by centrifugation (2000 to 4000 × g) or membrane filtration (0,45 μm) with a low protein binding membrane and the supernatant shall be diluted 1:100 and 1:10000 in cell culture medium.
Iz prikupljenog supernatanta uklanjaju se stanice centrifugiranjem (2000 do 4000 × g) ili membranskim filtriranjem kroz filtar s membranom (0,45 μm) s niskom apsorpcijom proteina, a supernatant se razrjeđuje u omjerima 1:100 i 1:10000 u mediju za staničnu kulturu.
Aliquots of a minimum of two supernatant dilutions shall be mixed and incubated for 60 minutes at 15 °C with equal parts of the following reagents separately:
Alikvoti najmanje dvaju razrjeđenja supernatanta pomiješaju se i odvojeno inkubiraju 60 minuta na 15 °C s jednakim dijelovima sljedećih reagensa:
serum containing group specific antibody against VHSV at a 1:50 (vol:vol) dilution;
serum koji sadržava skupinu specifičnih protutijela za virus VHS-a u razrjeđenju 1:50 (vol:vol);
serum containing group specific antibody against IHNV at a 1:50 (vol:vol) dilution;
serum koji sadržava skupinu specifičnih protutijela za virus IHN-a u razrjeđenju 1:50 (vol:vol);
pool of antisera against the indigenous serotypes of IPNV at a 1:50 (vol:vol) dilution;
skupni uzorak antiseruma za lokalne serotipove virusa IPN-a u razrjeđenju 1:50 (vol:vol);
medium alone (positive control).
sâm medij (pozitivna kontrola).
From each virus supernatant-serum mixture, at least two cell cultures shall be inoculated with 50 μl each and then incubated at 15 °C.
Za svaku mješavinu supernatanta i seruma inokuliraju se najmanje dvije stanične kulture svaka s 50 μl te se inkubiraju pri 15 °C.
The development of CPE shall be checked as described in point I.5.4.
Razvoj CPU-a provjerava se kako je opisano u točki I.5.4.
VHSV strains and isolates that do not react in neutralisation tests shall be identified by IF or ELISA.
Sojevi virusa VHS-a i izolati koji ne reagiraju u neutralizacijskim testovima identificiraju se IF-om ili ELISA-om.
Other neutralisation tests of proven similar efficacy may be used instead.
Mogu se upotrijebiti i drugi neutralizacijski testovi dokazane slične učinkovitosti.
Preparation of viral RNA
Priprema virusne RNA
All work with RNA shall be performed on ice, using gloves.
Sve radnje s RNA izvršavaju se na ledu, uz upotrebu rukavica.
RNA shall be extracted using the phenol-chloroform method or by RNA affinity spin columns, according to the manufacturer's instructions.
RNA se ekstrahira upotrebom fenol-kloroform metode ili afinitetnom kolonom za pročišćavanje RNA, u skladu s uputama proizvođača.
Commercially available RNA extraction kits that will produce high quality RNA suitable for use with the RT-PCR protocols detailed in the points below may be used.
Mogu se upotrebljavati komercijalno dostupni kompleti za ekstrakciju RNA kojima se dobiva RNA visoke kvalitete prikladan za upotrebu u protokolima za RT-PCR opisanima u nastavku.
RNA shall be re-suspended in distilled RNAse-free water, (namely water treated with 0,1 % diethyl pyrocarbonate) or an appropriate elution buffer.
RNA se resuspendira u destiliranoj vodi slobodnoj od RNAza (u prvom redu vodi tretiranoj 0,1 %-tnim dietil pirokarbonatom) ili odgovarajućim puferom za eluaciju.
The following primers shall be used for detection of IHNV:
Sljedeće početnice upotrebljavaju se za otkrivanje virusa IHN-a:
Forward Primer 5′-AGA-GAT-CCC-TAC-ACC-AGA-GAC-3′;
Prednja početnica 5′-AGA-GAT-CCC-TAC-ACC-AGA-GAC-3′;
Reverse Primer 5′-GGT-GGT-GTT-GTT-TCC-GTG-CAA-3′.
Stražnja početnica 5′-GGT-GGT-GTT-GTT-TCC-GTG-CAA-3′.
The following cycles shall be used (one-step RT-PCR): 1 cycle: 50 °C for 30 minutes; 1 cycle: 95 °C for 2 minutes; 30 cycles: 95 °C for 30 seconds, 50 °C for 30 seconds, 72 °C for 60 seconds; 1 cycle: 72 °C for 7 minutes and soak at 4 °C.
Upotrebljavaju se sljedeći ciklusi (RT-PCR u jednom koraku): 1 ciklus: 30 minuta na 50 °C; 1 ciklus: 2 minute na 95 °C; 30 ciklusa: 30 sekundi na 95 °C, 30 sekundi na 50 °C, 60 sekundi na 72 °C; 1 ciklus: 7 minuta na 72 °C i namakati na 4 °C.
The following primers shall be used for detection of VHSV:
Sljedeće početnice upotrebljavaju se za otkrivanje virusa VHS-a:
VN For 5′-ATG-GAA-GGA-GGA-ATT-CGT-GAA-GCG-3′;
Prednji VN 5′-ATG-GAA-GGA-GGA-ATT-CGT-GAA-GCG-3′;
VN Rev 5′-GCG-GTG-AAG-TGC-TGC-AGT-TCC-C-3′.
Stražnji VN 5′-GCG-GTG-AAG-TGC-TGC-AGT-TCC-C-3′.
The following cycles shall be used (one-step RT-PCR): 50 °C for 30 minutes, 95 °C for 15 minutes, 35 cycles at 94 °C for 30 seconds, 55 °C for 30 seconds, and 68 °C for 60 seconds.
Upotrebljavaju se sljedeći ciklusi (RT-PCR u jednom koraku): 30 minuta na 50 °C, 15 minuta na 95 °C, 35 ciklusa 30 sekundi na 94 °C, 30 sekundi na 55 °C i 60 sekundi na 68 °C.
Subsequently, the reaction shall be held at 68 °C for 7 minutes.
Naknadno se reakciju održava 7 minuta na 68 °C.
Quantity and specificity of the RT-PCR reactions shall be evaluated by gel electrophoresis in 1,5 % agarose gel with ethidium bromide and observed using UV transillumination.
Količina i specifičnost reakcija RT-PCR-a ocjenjuje se gel elektroforezom u 1,5 %-tnom agar gelu s etidijevim bromidom i promatra upotrebom UV transiluminacije.
A 693 bp PCR amplicon may be observed for IHNV.
Može se opaziti umnoženi produkt PCR-a od 693 bp za virus IHN-a.
For VHSV, the size shall be 505 bp.
Za virus VHS-a veličina je 505 bp.
The results of the PCR may vary depending on the conditions under which it is performed, namely the thermal protocols might need optimisation, depending on the thermal cycler in use.
Rezultati PCR-a mogu varirati ovisno o uvjetima u kojima ga se provodi, točnije o termalnim protokolima za koje može biti potrebna optimizacija, ovisno o uređaju za PCR (thermal cycler) koji se upotrebljava.
Furthermore, false-positive results may occur because of false primer annealing or laboratory contamination.
Nadalje, mogu se pojaviti lažni pozitivni rezultati zbog lažnog prianjanja početnica ili kontaminacije u laboratoriju.
Adequate positive and negative controls and sequence amplicons shall therefore be included to avoid any doubts.
Stoga se radi izbjegavanja bilo kakvih sumnji uključuje odgovarajuće pozitivne i negativne kontrole i sljedove umnoženih produkata.
For the VHSV primers, special care shall be taken when using BF-2 cells, as the primers may react with the cell line DNA/RNA producing false-positive results of similar size.
Kod početnica virusa VHS-a posebnu je pažnju potrebno obratiti na upotrebu stanica BF-2 jer početnice mogu reagirati sa staničnom linijom DNA/RNA te tako proizvesti lažne pozitivne rezultate slične veličine.
When testing supernatant from BF-2 cells, any amplified PCR fragments shall be sequenced.
Pri ispitivanju supernatanta iz stanica BF-2 sekvenciraju se svi umnoženi PCR fragmenti.
RT-qPCR for VHSV
RT-qPCR za virus VHS-a
For VHSV, amplification shall be performed using the following primers and probe:
Za virus VHS-a umnožavanje se provodi upotrebom sljedećih početnica i sonde:
Forward primer: 5′-AAA-CTC-GCA-GGA-TGT-GTG-CGT-CC-3′;
Prednja početnica: 5′-AAA-CTC-GCA-GGA-TGT-GTG-CGT-CC-3′;
Reverse primer: 5′-TCT-GCG-ATC-TCA-GTC-AGG-ATG-AA-3′;
Stražnja početnica: 5′-TCT-GCG-ATC-TCA-GTC-AGG-ATG-AA-3′;
and probe: 5′-FAM-TAG-AGG-GCC-TTG-GTG-ATC-TTC-TG-BHQ1.
i sonda: 5′-FAM-TAG-AGG-GCC-TTG-GTG-ATC-TTC-TG-BHQ1.
One-step RT-qPCR:
RT-qPCR u jednom koraku:
Negative template controls and positive controls shall be included on each plate run.
Negativne kontrole s matricom i pozitivne kontrole uključuju se u svaki ciklus plitica.