natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Salt
MENETELMÄ LEHMÄNMAIDON JA KASEINAATIN OSOITTAMISEKSI LAMPAAN-, VUOHEN- TAI PUHVELINMAIDOSTA TAI LAMPAAN-, VUOHEN- JA PUHVELINMAIDON SEOKSISTA VALMISTETUISSA JUUSTOISSA
The method to be applied shall be approved by the paying agency.
SOVELTAMISALA
ANNEX VII
Lehmänmaidon ja kaseinaatin osoittaminen lampaan-, vuohen- tai puhvelinmaidosta tai lampaan-, vuohen- ja puhvelinmaidon seoksista valmistetuissa juustoissa plasminolyysissä muodostuvien γ-kaseiinien isoelektrisellä fokusoinnilla.
Methods of analysis of skimmed milk powder under private storage
SOVELTAMISALA
ANNEX VIII
Menetelmä sopii käsittelemättömän ja lämpökäsitellyn lehmänmaidon ja kaseinaatin osoittamiseen hyvällä herkkyydellä ja spesifistisesti lampaan-, vuohen- tai puhvelinmaidosta tai lampaan-, vuohen- ja puhvelinmaidon seoksista valmistetuissa tuoreissa ja kypsytetyissä juustoissa.
Methods of analysis of cheeses under private storage
Se ei sovellu niiden osoittamiseen, jos maito tai juusto on väärennetty lämpökäsitellyillä naudan heraproteiinikonsentraateilla.
The method of analysis laid down in the Appendix shall be used to ensure that cheese made exclusively from ewe's milk, goat's milk or buffalo milk or from a mixture of ewe's milk, goat's milk and buffalo milk does not contain cow's milk casein.
Kaseiinien eristäminen juustosta ja vertailustandardeista
Cow's milk casein is considered to be present if the cow's milk casein content of the analysed sample is equal to or higher than the content of the reference sample containing 1 % cow's milk as laid down in the Appendix.
Eristettyjen kaseiinien liuottaminen ja pilkkominen plasmiinilla (EC.3.4.21.7)
Methods for detecting cow's milk casein in cheeses referred to in paragraph 1 may be used provided that:
Plasmiinilla käsiteltyjen kaseiinien isoelektrinen fokusointi urean läsnäollessa ja proteiinien värjäys
the detection limit is maximum 0,5 % and
Värjättyjen γ3- ja γ2-kaseiinikuvioiden (näyttö lehmänmaidosta) arviointi vertaamalla näytteestä saatua kuviota kuvioihin, jotka on saatu samassa geelissä 0 % ja 1 % lehmänmaitoa sisältävistä vertailustandardeista
there are no false-positive results and
On käytettävä analyysilaatuisia kemikaaleja, ellei toisin mainita.
cow's milk casein is detectable with the required sensitivity even after long ripening periods, as may occur in usual commercial conditions.
Veden on oltava kahdesti tislattua tai puhtaudeltaan sitä vastaavaa.
If any of the above mentioned requirements is not met, the methods laid down in the Appendix shall be used.
Huomautus: Seuraavia yksityiskohtaisia ohjeita sovelletaan laboratoriossa valmistettuihin ureaa sisältäviin polyakryyliamidigeeleihin, joiden mitat ovat 265 × 125 × 0,25 mm.
Appendix
Jos käytetään muunkokoisia ja -tyyppisiä geelejä, erotusolosuhteita voidaan joutua säätämään.
METHOD FOR THE DETECTION OF COW'S MILK AND CASEINATE IN CHEESES FROM EWE'S MILK, GOAT'S MILK OR BUFFALO MILK OR MIXTURES OF EWE'S MILK, GOAT'S MILK AND BUFFALO MILK
Isoelektrinen fokusointi
SCOPE
Reagenssit ureaa sisältävien polyakryyliamidigeelien valmistamiseksi
Detection of cow's milk and caseinate in cheeses made from ewe's milk, goat's milk, buffalo milk or mixtures of ewe's, goat's and buffalo milk by isoelectric focusing of γ-caseins after plasminolysis.
Geelin kantaliuos
FIELD OF APPLICATION
Liuotetaan
The method is suitable for sensitive and specific detection of native and heat-treated cow's milk and caseinate in fresh and ripened cheeses made from ewe's milk, goat's milk, buffalo milk or mixtures of ewe's, goat's and buffalo milk.
4,85 g akryyliamidia
It is not suitable for the detection of milk and cheese adulteration by heat-treated bovine whey protein concentrates.
0,15 g N, N′-metyleeni-bis-akryyliamidia (BIS)
Isolation of caseins from cheese and the reference standards
48,05 g ureaa
Dissolving of the isolated caseins and submitting to plasmin (EC.3.4.21.7) cleavage
15,00 g glyserolia (87 % w/w)
Isoelectric focusing of plasmin-treated caseins in the presence of urea and staining of proteins
veteen ja täytetään 100 ml:aan, säilytetään ruskeassa lasipullossa jääkaapissa.
Evaluation of stained γ3 and γ2 -casein patterns (evidence of cow's milk) by comparison of the pattern obtained from the sample with those obtained in the same gel from the reference standards containing 0 % and 1 % cow's milk.
Huomautus: Painoltaan määrättyjen hermomyrkyllisten akryyliamidien sijasta voi käyttää myös kaupallisesti saatavaa esisekoitettua akryyliamidi/BIS-liuosta.
Unless otherwise indicated, analytical grade chemicals shall be used.
Kun tällainen liuos sisältää 30 % w/v akryyliamidia ja 0,8 % w/v BIS:ä, tätä on käytettävä 16,2 ml varastoliuokseen määrättyjen painojen sijaan.
Water shall be double-distilled or of equivalent purity.
Varastoliuoksen säilyvyys on enintään 10 päivää; jos sen johtokyky on suurempi kuin 5 μS, on suoritettava ioninpoisto sekoittamalla sitä 2 g:n Amberlite MB-3:n kanssa 30 minuutin ajan ja sitten suodatettava 0,45 μm:n kalvon läpi.
Note: The following details apply to laboratory prepared polyacrylamide gels containing urea, of dimensions 265 × 125 × 0,25 mm.
Geeliliuos
Where other sizes and types of gel are used, the separation conditions may have to be adjusted.
Valmistetaan geeliliuos sekoittamalla varastoliuokseen lisäaineita ja amfolyyttejä (*) (ks. 4.1.1).
Isoelectric focusing
9,0 ml varastoliuosta
Reagents for production of the urea containing polyacrylamide gels
24 mg de β-alaniinia
Stock gel solution
500 μl amfolyyttiä, pH 3,5–9,5
Dissolve:
250 μl amfolyyttiä, pH 5-7
4,85 g acrylamide
250 μl amfolyyttiä, pH 6-8
0,15 g N, N′-methylene-bis-acrylamide (BIS)
Geeliliuosta sekoitetaan ja poistetaan ilmaa 2–3 minuutin ajan ultraäänihauteessa tai tyhjiössä.
48,05 g urea
Huomautus: Geeliliuos valmistetaan välittömästi ennen sen kaatamista (ks. 6.2).
15,00 g glycerol (87 % w/w),
Katalyyttiliuokset
in water and make up to 100 ml and store in a brown glass bottle in the refrigerator.
N, N, N′, N′-tetrametyylietyleenidiamiini (TEMED)
Note: A commercially available pre-blended acrylamide/BIS solution may be used in preference to the quoted fixed weights of the neurotoxic acrylamides.
40 % w/v ammoniumpersulfaatti (PER):
Where such a solution contains 30 % w/v acrylamide and 0,8 % w/v BIS, a volume of 16,2 ml shall be used for the formulation instead of the fixed weights.
Liuotetaan 800 mg PER:ää veteen ja täytetään 2 ml:aan.
The shelf life of the stock solution is a maximum of 10 days; if its conductivity is more than 5 μS, de-ionize by stirring with 2 g Amberlite MB-3 for 30 minutes, then filter through a 0,45 μm membrane.
Huomautus: Aina on käytettävä juuri valmistettua PER-liuosta.
Gel solution
Kontaktineste
Prepare a gel solution by mixing additives and ampholytes (*) with the stock gel solution (see 4.1.1).
Petroli tai parafiiniöljy.
9,0 ml stock solution
Anodiliuos
24 mg β-alanine
Liuotetaan 5,77 g fosforihappoa (85 % w/w) veteen ja laimennetaan 100 ml:ksi.
500 μl ampholyte pH 3,5-9,5
Katodiliuos
250 μl ampholyte pH 5-7
Liuotetaan 2,00 g natriumhydroksia veteen ja laimennetaan 100 ml:ksi vedellä.
250 μl ampholyte pH 6-8
Näytteen valmistus
Mix the gel solution and de-gas for two to three minutes in an ultrasonic bath or in vacuum.
Reagenssit proteiinien eristämiseksi
Note: Prepare the gel solution immediately prior to pouring it (see 6.2).
Laimea etikkahappo (25,0 ml jääetikkaa täytetään 100 ml:aan vedellä)
Catalyst solutions
Dikloorimetaani
N, N, N′ N′ — tetramethylethylenediamine (Temed)
Asetoni
40 % w/v ammonium persulphate (PER):
Proteiinia liuottava puskuriliuos
Dissolve 800 mg PER in water and make up to 2 ml.
Liuotetaan
Note: Always use freshly prepared PER solution.
5,75 g glyserolia (87 % w/w)
Contact fluid
24,03 g ureaa
Kerosene or liquid paraffin
250 mg ditiotreitolia
Anode solution
veteen ja täytetään 50 ml:aan.
Dissolve 5,77 g phosphoric acid (85 % w/w) in water and dilute to 100 ml.
Huomautus: Säilytetään jääkaapissa, säilyvyys enintään 1 viikko.
Cathode solution
Reagenssit kaseiinien pilkkomiseksi plasmiinilla
Dissolve 2,00 g sodium hydroxide in water and dilute to 100 ml with water.
Ammoniumkarbonaattipuskuri
Sample preparation
Titrataan 0,2 mol/l ammoniumvetykarbonaattiliuos (1,58 g/100 ml vettä), joka sisältää 0,05 mol/l etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA, 1,46 g/100 ml vettä), 0,2 mol/l ammoniumkarbonaattiliuoksella (1,92 g/100 ml vettä), joka sisältää 0,05 mol/l EDTA:a, siten että pH:ksi saadaan 8.
Reagents for protein isolation
Naudan plasmiini (E.C.3.4.21.7), aktiivisuus vähintään 5 U/ml
Dilute acetic acid (25,0 ml of glacial acetic acid made up to 100 ml with water)
ε-Aminokapronihappoliuos entsyymi-inhibitiota varten
Dichloromethane
Liuotetaan 2624 g ε-aminokapronihappoa (6-amino-n-heksaanihappoa) 100 ml:aan 40 % (v/v) etanolia.
Acetone
Standardit
Protein dissolving buffer
Varmennettuja vertailustandardeja juoksetetusta rasvattomasta lampaan- ja vuohenmaidon seoksesta, joka sisältää 0 % ja 1 % lehmänmaitoa, on saatavana vertailumateriaalien ja -mittausten tutkimuslaitoksesta (IRMM), B-2440 Geel, Belgia.
Dissolve
Laboratorion välistandardien valmistaminen puhvelin juoksutetusta maidosta, joka sisältää 0 % ja 1 % lehmänmaitoa
5,75 g glycerol (87 % w/w)
Rasvaton maito valmistetaan sentrifugoimalla joko puhvelin tai naudan käsittelemätöntä irtomaitoa 37 °C:ssa, 2500 g 20 minuutin ajan.
24,03 g urea
Kun koeputki ja sen sisältö on jäähdytetty nopeasti lämpötilaan 6–8 °C, poistetaan ylempi rasvakerros kokonaan.
250 mg dithiothreitol,
1 % standardin valmistamiseksi lisätään 5,00 ml naudan rasvatonta maitoa 495 ml:aan puhvelin rasvatonta maitoa 1 l:n dekantterilasissa, säädetään pH:n arvoksi 6,4 laimeaa maitohappoa (10 % w/v) lisäämällä.
in water and make up to 50 ml
Säädetään lämpötila 35 °C:seen ja lisätään 100 μl vasikanjuoksetetta (juoksetteen aktiivisuus 1:10000, n. 3000 U/ml), sekoitetaan 1 minuutin ajan ja sen jälkeen dekantterilasi jätetään seisomaan alumiinifoliolla päällystettynä 35 °C:seen yhdeksi tunniksi juustomassan muodostamiseksi.
Note: Store in a refrigerator, maximum shelf-life one week.
Kun juustomassa on muodostunut, juoksettunut maito kylmäkuivataan kokonaisuudessaan ilman enempää homogenointia tai heran valuttamista.
Reagents for plasmin cleavage of caseins
Kylmäkuivauksen jälkeen se jauhetaan hienoksi homogeenisen jauheen saamiseksi.
Ammonium carbonate buffer
Sama menettely suoritetaan 0 %:n standardin valmistamiseksi aitoa rasvatonta puhvelinmaitoa käyttäen.
Titrate a 0,2 mol/l ammonium hydrogencarbonate solution (1,58 g/100 ml water) containing 0,05 mol/l ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 1,46 g/100 ml with a 0,2 mol/l ammonium carbonate solution (1,92 g/100 ml water) containing 0,05 mol/l EDTA to pH 8.
Standardeja on säilytettävä lämpötilassa – 20 °C.
Bovine plasmin (EC.
Huomautus: On suositeltavaa tarkistaa puhvelinmaidon puhtaus plasmiini-käsiteltyjen kaseiinien isoelektrisellä fokusoinnilla ennen standardien valmistamista.
3.4.21.7), activity at least 5 U/ml
Reagenssit proteiinien värjäykseen
ε-Aminocaproic acid solution for enzyme inhibition
Kiinnitysaine
Dissolve 2,624 g ε-aminocaproic acid (6 amino-n-hexanoic acid) in 100 ml of 40 % (v/v) ethanol.
Liuotetaan 150 g trikloorietikkahappoa veteen ja täytetään 1000 ml:aan.
Standards
Värinpoistoliuos
Certified reference standards of a mixture of renneted ewe's and goat's skimmed milk containing 0 % and 1 % of cow's milk are available from the Commission's Institute for Reference Materials and Measurements, B-2440 Geel, Belgium
Laimennetaan 500 ml metanolia ja 200 ml jääetikkaa 2000 ml:ksi tislatulla vedellä.
Preparation of laboratory interim-standards of buffalo's renneted milk containing 0 % and 1 % of cow's milk
Huomautus: Tuore värinpoistoliuos on valmistettava joka päivä; se voidaan valmistaa sekoittamalla yhtä suuret tilavuudet varastoliuoksia, 50 % (v/v) metanolia ja 20 % (v/v) jääetikkaa.
Skimmed milk is prepared by centrifuging of either buffalo or bovine raw bulk milk at 37 °C at 2500 g for 20 minutes.
Värjäysliuokset
After cooling the tube and contents rapidly to 6 to 8 °C, the upper fat layer is removed completely.
Värjäysliuos (kantaliuos 1)
For the preparation of the 1 % standard add 5,00 ml of bovine skimmed milk to a 495 ml of buffalo's skimmed milk in a 1 l beaker, adjust the pH to 6,4 by the addition of dilute lactic acid (10 % w/v).
Liuotetaan 3,0 g Coomassie-briljanttisinistä G 250 (C.I. 42655) 1000 ml:aan 90 % (v/v) metanolia magneettisekoittajaa käyttäen (n. 45 minuuttia), suodatetaan kahden keskinopean taitetun suodatinpaperin läpi.
Adjust the temperature to 35 °C and add 100 μl of calf rennet (rennet activity 1: 10000, c.
Värjäysliuos (kantaliuos 2)
3000 U/ml), stir for 1 minute and then leave the beaker covered with an aluminium foil at 35 °C for one hour to allow formation of the curd.
Liuotetaan 5,0 g kuparisulfaattipentahydraattia 1000 ml:aan 20 % (v/v) etikkahappoa.
After the curd has formed, the whole renneted milk is freeze-dried without prior homogenization or draining of the whey.
Värjäysliuos (työskentelyliuos)
After freeze-drying it is finely ground to produce a homogeneous powder.
Sekoitetaan yhteen 125 ml kumpaakin varastoliuosta (4.11.1, 4.11.2) välittömästi ennen värjäystä.
For the preparation of the 0 % standard, carry out the same procedure using genuine buffalo skimmed milk.
Huomautus: Värjäysliuos tulisi valmistaa sinä päivänä, jona sitä käytetään.
The standards shall be stored at – 20 °C.
LAITTEET JA TARVIKKEET
Note: It is advisable to check the purity of the buffalo milk by isoelectric focusing of the plasmin-treated caseins before preparation of the standards.
Lasilevyjä (265 × 125 × 4 mm); kumitela (leveys 15 cm); vaakatasopöytä
Reagents for protein staining
Kantaja-arkki geelille (265 × 125 mm)
Fixative
Peitearkki (280 × 125 mm).
Dissolve 150 g trichloroacetic acid in water and make up to 1000 ml.
Kiinnitetään teippinauha (280 × 6 × 0,25 mm) kummallekin pitkälle sivulle (ks. kuva 1).
Destaining solution
Elektrofokusointikammio, jossa on jäähdytyslevy (esim. 265 × 125 mm) ja sopiva virtalähde (≥ 2,5 kV) tai automaattinen elektroforeesilaite
Dilute 500 ml methanol and 200 ml glacial acetic acid to 2000 ml with distilled water.
Kiertokryostaatti, säädetty termostaatilla lämpötilaan 12 ± 0,5 °C
Note: Prepare the destaining solution fresh every day; it can be prepared by mixing equal volumes of stock solutions of 50 % (v/v) methanol and 20 % (v/v) glacial acetic acid.
Sentrifugi, säädettävissä nopeuteen 3000 g
Staining solutions
Elektrodiliuskat (pituus ≥ 265 mm)
Staining solution (stock solution 1)
Muovisia tippapulloja anodi- ja katodiliuoksille
Dissolve 3,0 g Coomassie Brilliant Blue G-250 (C.I. 42655) in 1000 ml 90 % (v/v) methanol using a magnetic stirrer (approximately 45 minutes), filter through two medium-speed folded filters.
Näyteapplikaattoreita (10 × 5 mm, viskoosia tai suodatinpaperia, joka ei absorboi proteiineja)
Staining solution (stock solution 2)
Ruostumatonta terästä olevia tai lasisia värjäys- ja värinpoistoastioita (esim. 280 × 150 mm instrumenttitarjottimia)
Dissolve 5,0 g copper sulphate pentahydrate in 1000 ml 20 % (v/v) acetic acid.
Säädettävissä oleva sauvahomogenisaattori (varren halkaisija 10 mm), rpm alueella 8000–20000
Staining solution (working solution)
Kalvojen saumaukseen sopiva laite
Mix together 125 ml of each of the stock solutions (4.11.1, 4.11.2) immediately prior to staining.
Mikropipettejä, 25 μl
Note: The staining solution should be prepared on the day that it is used.
Tyhjiöhaihdutin tai kylmäkuivain
EQUIPMENT
Vesihaude, joka on termostaatilla säädeltävissä lämpötiloihin 35 ja 40 ± 1 °C, ravistelijalla varustettuna
Glass plates (265 × 125 × 4 mm); rubber roller (width 15 cm); levelling table
Tiheysmittari, luettavissa aallonpituudella λ = 634 nm
Gel carrier sheet (265 × 125 mm)
Kaseiinien eristäminen
Covering sheet (280 × 125 mm).
Punnitaan 5:ttä g:aa juuston kuiva-ainetta vastaava määrä näytettä tai vertailustandardeja 100 ml:n sentrifugiputkeen, lisätään 60 ml tislattua vettä ja homogenoidaan sauvahomogenisaattorilla (8000–10000 rpm).
Stick on strip of adhesive tape (280 × 6 × 0,25 mm) to each long edge (see Figure 1)
Säädetään pH-arvoon 4,6 laimealla etikkahapolla (4.5.1) ja sentrifugoidaan (5 min., 3000 g).
Electrofocusing chamber with cooling plate (e.g. 265 × 125 mm) and suitable power supply (≥ 2,5 kV) or automatic electrophoresis device
Dekantoidaan rasva ja hera, homogenoidaan jäännös kierrosnopeudella 20000 rpm 40 ml:n kanssa tislattua vettä, jonka pH on säädetty arvoon 4,5 laimealla etikkahapolla (4.5.1), lisätään 20 ml dikloorimetaania (4.5.2), homogenoidaan jälleen ja sentrifugoidaan (5 min., 3000 g).
Circulation cryostat, thermostatically controlled at 12 ± 0,5 °C
Poistetaan lastalla kaseiinikerros, joka kelluu vesifaasin ja orgaanisen faasin välissä (ks. kuva 2) ja dekantoidaan molemmat faasit pois.
Centrifuge, adjustable to 3000 g
Homogenoidaan kaseiini uudelleen 40 ml:n tislattua vettä (ks. edellä) ja 20 ml:n dikloorimetaania (4.5.2) kanssa ja sentrifugoidaan.
Electrode strips (≥ 265 mm long)
Toistetaan menettely, kunnes molemmat uuttofaasit ovat värittömiä (2–3 kertaa).
Plastic dropping bottles for the anode and cathode solutions
Homogenoidaan proteiinijäännös 50 ml:lla asetonia (4.5.3) ja suodatetaan keskinopean taitetun suodatinpaperin läpi.
Sample applicators (10 × 5 mm, viscose or low protein-adsorption filter paper)
Pestään suodatinpaperille jäävä jäännös kahdesti kahdella erillisellä 25 ml:n annoksella asetonia ja annetaan kuivua ilmassa tai typpivirrassa; tämän jälkeen jauhetaan hienoksi huhmareessa.
Stainless steel or glass staining and destaining dishes (e.g. 280 × 150 mm instrument trays)
Huomautus: Eristetyt kuivat kaseiinit on säilytettävä lämpötilassa – 20 °C.
Adjustable rod homogenizer (10 mm shaft diameter), rpm range 8000 to 20000
β-kaseiinien pilkkominen plasmiinilla γ-kaseiinin vahvistamiseksi
Film welder
Dispergoidaan 25 mg eristettyjä kaseiineja (6.1.1) 0,5 ml:aan ammoniumkarbonaattipuskuria (4.7.1) ja homogenoidaan 20 minuutin ajan esim. ultraäänellä.
25 μl micropipettes
Kuumennetaan lämpötilaan 40 °C ja lisätään 10 μl plasmiinia (4.7.2), sekoitetaan ja inkuboidaan tunnin ajan 40 °C:ssa jatkuvasti ravistellen.
Vacuum concentrator or freeze-dryer
Entsyymin inhiboimiseksi lisätään 20 μl ε-kapronihappoliuosta (4.7.3), tämän jälkeen lisätään 200 mg kiinteää ureaa ja 2 mg ditiotreitolia.
Thermostatically controlled water bath adjustable to 35 and 40 ± 1 °C with shaker
Huomautus: Symmetrisempien kaseiinijuovien saamiseksi fokusoinnissa on suositeltavaa kylmäkuivata liuos ε-kapronihappoliuoksen lisäämisen jälkeen ja liuottaa sitten jäännökset 0,5 ml:aan proteiinia liuottavaan puskuriin (4.6).
Densitometer equipment reading at λ = 634 nm
Ureaa sisältävien polyakryyliamidigeelien valmistus
Isolation of caseins
Muutaman vesipisaran avulla levitetään geelin kantaja-arkki (5.2) lasilevyn (5.1) päälle ja kuivataan kaikki ylimääräinen vesi paperipyyhkeellä.
Weigh the amount equivalent to 5 g dry mass of cheese or the reference standards into a 100 ml centrifuge tube, add 60 ml distilled water and homogenize with a rod homogenizer (8000 to 10000 rpm).
Samoin levitetään peitearkki (5.3), jossa on välikkeet (0,25 mm), toisen lasilevyn päälle.
Adjust to pH 4,6 with dil. acetic acid (4.5.1) and centrifuge (5 minutes, 3000 g).
Asetetaan levy vaakasuoraan vaakatasopöydälle.
Decant the fat and whey, homogenize the residue at 20000 rpm in 40 ml distilled water adjusted to pH 4,5 with dil. acetic acid (4.5.1), add 20 ml dichloromethane (4.5.2), homogenize again and centrifuge (5 minutes, 3000 g).
Lisätään 10 μl TEMED:tä (4.1.3.1) valmistettuun ilmattomaan geeliliuokseen (4.1.2), sekoitetaan ja lisätään 10 μl PER-liuosta (4.1.3.2), sekoitetaan huolellisesti ja kaadetaan välittömästi tasaisesti peitearkin keskikohtaan.
Remove the casein layer that lies between the aqueous and organic phases (see Figure 2) with a spatula and decant off both phases.
Asetetaan geelin kantajalevyn yksi reuna (arkkipuoli alaspäin) peitearkin päälle ja lasketaan sitä hitaasti niin, että geelikerros muodostuu arkkien väliin ja leviää tasaisesti ja ilman kuplien muodostumista (kuva 3).
Rehomogenise the casein in 40 ml distilled water (see above) and 20 ml dichloromethane (4.5.2) and centrifuge.
Lasketaan varovasti geelin kantajalevy kokonaan alas ohutta lastaa käyttäen ja asetetaan vielä kolme lasilevyä sen päälle painoksi.
Repeat this procedure until both extraction phases are colourless (two to three times).
Kun polymeroituminen on tapahtunut (noin 60 min), poistetaan geelin kantaja-arkille polymeroitunut geeli yhdessä peitearkin kanssa lasilevyjä koputellen.
Homogenize the protein residue with 50 ml acetone (4.5.3) and filter through a medium-speed folded filter paper.
Puhdistetaan kantaja-arkin kääntöpuolelta huolellisesti geelijäännökset ja urea.
Wash the residue on the filter with two separate 25 ml portions of acetone each time and allow to dry in the air or a stream of nitrogen, then pulverize finely in a mortar.
Saumataan geeli-sandwich kalvoon ja säilytetään jääkaapissa (enintään 6 viikkoa).
Note: Dry casein isolates should be kept at –20 °C.
Huomautus: Välikkeellistä peitearkkia voidaan käyttää uudelleen.
Plasmin cleavage of β-caseins to intensify γ-caseins
Polyakryyliamidigeeli voidaan leikata pienempiin osiin, mitä suositellaan, kun näytteitä on ainoastaan muutama tai jos käytetään automaattista elektroforeesilaitetta (2 geeliä, koko 4,5 × 5 cm).
Disperse 25 mg of isolated caseins (6.1.1) in 0,5 ml ammonium carbonate buffer (4.7.1) and homogenize for 20 minutes by e.g. using ultrasonic treatment.
Isoelektrinen fokusointi
Heat to 40 °C and add 10 μl plasmin (4.7.2), mix and incubate for one hour at 40 °C with continuous shaking.
Säädetään jäähdyttävä termostaatti 12 °C:seen.
To inhibit the enzyme add 20 μl ε-aminoproic acid solution (4.7.3), then add 200 mg of solid urea and 2 mg of dithiothreitol.
Pyyhkäistään geelin kantaja-arkin kääntöpuoli petrolilla, tipautetaan sitten muutama pisara petrolia (4.2) jäähdytyslohkon keskelle.
Note: To obtain more symmetry in the focused casein bands it is advisable to freeze-dry the solution after adding the ε-aminocaproic acid and then dissolving the residues in 0,5 ml protein dissolving buffer (4.6).
Sen jälkeen geeli-sandwich levitetään kantajapuoli alaspäin lohkon päälle siten, ettei muodostu kuplia.
Preparation of the urea containing polyacrylamide gels
Pyyhkäistään ylimääräinen petroli pois ja poistetaan peitearkki.
With the aid of a few drops of water roll the gel carrier sheet (5.2) onto a glass plate (5.1), removing any extraneous water with paper towel or tissue.
Imeytetään elektrodinauhoihin elektrodiliuoksia (4.3, 4.4), leikataan geelin pituisiksi ja asetetaan asianmukaisille paikoille (elektrodien etäisyys 9,5 cm).
Roll the cover sheet (5.3) with spacers (0,25 mm) onto another glass plate in the same way.
Isoelektrisen fokusoinnin olosuhteet:
Lay the plate horizontally on a levelling table.
Geelikoko 265 × 125 × 0,25 mm
Add 10 μl Temed (4.1.3.1) to the prepared and de-aerated gel solution (4.1.2), stir and add 10 μl PER-solution (4.1.3.2), mix thoroughly and immediately pour out evenly onto the centre of the cover sheet.
Vaihe
Place one edge of the gel carrier plate (sheet side down) on the cover sheet plate and lower it slowly so that a gel film forms between the sheets and spreads out regularly and free of bubbles (Figure 3).
Jännite
Carefully lower the gel carrier plate completely using a thin spatula and place three more glass plates on top of it to act as weights.
Sähkövirta
After polymerization is complete (about 60 minutes) remove the gel polymerized onto the gel carrier sheet along with the cover sheet by tipping the glass plates.
Teho
Clean the reverse of the carrier sheet carefully to remove gel residues and urea.
Volttituntia
Weld the gel sandwich into a film tube and store in a refrigerator (maximum six weeks).
Esifokusointi
Note: The cover sheet with the spacers can be re-used.
enintään
The polyacrylamide gel can be cut to smaller sizes, recommended when there are few samples or if an automatic electrophoresis device is used (two gels, size 4,5 × 5 cm).
vak. 4
lsoelectric focusing
Näytteen fokusointi
Set the cooling thermostat to 12 °C.
Lopullinen fokusointi