natgillin/translations-raw huggingface dataset:
On the basis of the current data available the KeratinoSensTM assay was shown to be applicable to test chemicals covering a variety of organic functional groups, reaction mechanisms, skin sensitisation potency (as determined with in vivo studies) and physico-chemical properties (9) (12) (13) (14).
Ennen kuin laboratoriot ryhtyvät käyttämään tähän testimenetelmään liittyvää ARE-Nrf2-lusiferaasikoetta rutiininomaisesti, niiden pitäisi osoittaa tekninen pätevyytensä lisäyksessä 2 lueteltujen kymmenen aineen avulla.
Mainly mono-constituent substances were tested, although a limited amount of data also exist on the testing of mixtures (20).
Saatavana on suoritusarvostandardeja (PS) (28), jotka helpottavat KeratinoSens™-kokeen kaltaisten uusien tai muunnettujen in vitro -ARE-Nrf2-lusiferaasitestimenetelmien validointia ja mahdollistavat tämän menetelmän oikea-aikaisen muokkaamisen niin, että ne voidaan sisällyttää siihen.
The test method is nevertheless technically applicable to the testing of multi-constituent substances and mixtures.
OECD:n sopimuksen mukainen tietojen vastavuoroinen hyväksyntä (Mutual Acceptance of Data, MAD) taataan ainoastaan PS:n mukaisesti validoitujen testimenetelmien osalta, jos OECD on tarkistanut ja sisällyttänyt ne vastaavaan testausohjeeseen.
However, before use of this test method on a mixture for generating data for an intended regulatory purpose, it should be considered whether, and if so why, it may provide adequate results for that purpose.
Tällä hetkellä ainoa menetelmä, jonka tämä testimenetelmä kattaa, on tieteellisesti validoitu KeratinoSens™-koe (9) (12) (13) (14).
Moreover, when testing multi-constituent substances or mixtures, consideration should be given to possible interference of cytotoxic constituents with the observed responses.
KeratinoSens™-kokeen vakiomenettely (Standard Operating Procedures, SOP) on saatavana, ja sitä pitäisi käyttää, kun laboratorio ottaa testimenetelmän käyttöön ja käyttää sitä (15).
The test method is applicable to test chemicals soluble or that form a stable dispersion (i.e. a colloid or suspension in which the test chemical does not settle or separate from the solvent into different phases) either in water or DMSO (including all of the test chemical components in the case of testing a multi-constituent substance or a mixture).
Laboratoriot, jotka haluavat ottaa testimenetelmän käyttöön, voivat saada KeratinoSens™-kokeessa käytetyn rekombinanttisolulinjan tekemällä lisenssisopimuksen testimenetelmän kehittäjän kanssa.
Test chemicals that do not fulfil these conditions at the highest final required concentration of 2000 μM (cf. paragraph 22) may still be tested at lower concentrations.
Seuraavissa kappaleissa kuvaillaan ARE-Nrf2-lusiferaasitestimenetelmän tärkeimmät osat ja menettelyt.
In such a case, results fulfilling the criteria for positivity described in paragraph 39 could still be used to support the identification of the test chemical as a skin sensitiser, whereas a negative result obtained with concentrations < 1000 μM should be considered as inconclusive (see prediction model in paragraph 39).
Keratinosyyttiviljelmien valmistelu
In general substances with a LogP of up to 5 have been successfully tested whereas extremely hydrophobic substances with a LogP above 7 are outside the known applicability of the test method (14).
Viljelmien valmistelussa pitäisi käyttää transgeenistä solulinjaa, johon on insertoitu vakaasti ARE-elementin säätelemä lusiferaasireportterigeeni (esimerkiksi KeratinoSens™-solulinjaa).
For substances having a LogP falling between 5 and 7, only limited information is available.
Vastaanoton jälkeen soluja propagoidaan (esimerkiksi 2–4 jatkoviljelyä) ja säilytetään pakastettuina homogeenisena kantana.
Negative results should be interpreted with caution as substances with an exclusive reactivity towards lysine-residues can be detected as negative by the test method.
Tästä alkuperäisestä kannasta peräisin olevia soluja voidaan propagoida jatkoviljelyjen enimmäismäärään saakka (joka on KeratinoSensin™ tapauksessa 25), ja niitä käytetään rutiininomaiseen testaamiseen käyttämällä asianmukaista elatusainetta (KeratinoSensin™ tapauksessa kyseeseen tulevat DMEM:ää sisältävä seerumi ja Geneticin).
Furthermore, because of the limited metabolic capability of the cell line used (21) and because of the experimental conditions, pro-haptens (i.e. chemicals requiring enzymatic activation for example via P450 enzymes) and pre-haptens (i.e. chemicals activated by auto-oxidation) in particular with a slow oxidation rate may also provide negative results.
Testissä käytettävien solujen pitäisi olla 80–90-prosenttisen konfluentteja, ja on varmistettava, ettei solujen anneta koskaan kasvaa täysin konfluenteiksi.
Test chemicals that do not act as a sensitiser but are nevertheless chemical stressors may lead on the other hand to false positive results (14).
Päivä ennen testaamista solut kerätään ja jaetaan 96 kuopan levyihin (KeratinoSensin™ tapauksessa 10000 solua/kuoppa).
Furthermore, highly cytotoxic test chemicals cannot always be reliably assessed.
Jotta solut jakautuisivat kuoppalevylle määrältään tasaisesti, on pyrittävä välttämään solujen sedimentaatiota siirrostuksen aikana.
Finally, test chemicals that interfere with the luciferase enzyme can confound the activity of luciferase in cell-based assays causing either apparent inhibition or increased luminescence (22).
Ellei näin tehdä, erot kuoppien välillä voivat olla suuret.
For example, phytoestrogen concentrations higher than 1 μM were reported to interfere with the luminescence signals in other luciferase-based reporter gene assays due to over-activation of the luciferase reporter gene (23).
Kussakin toistossa käytetään kolmea rinnakkaisnäytettä lusiferaasiaktiviteetin mittaamiseen ja yhtä rinnakkaista rinnakkaisnäytettä solujen elinkyvyn testaamiseen.
As a consequence, luciferase expression obtained at high concentrations of phytoestrogens or similar chemicals suspected of producing phytoestrogen-like over-activation of the luciferase reporter gene needs to be examined carefully (23).
Testikemikaalien ja kontrolliaineiden valmistelu
In cases where evidence can be demonstrated on the non-applicability of the test method to other specific categories of test chemicals, the test method should not be used for those specific categories.
Testikemikaali ja kontrolliaineet valmistetaan testipäivänä.
In addition to supporting discrimination between skin sensitisers and non-sensitisers, the KeratinoSensTM assay also provides concentration-response information that may potentially contribute to the assessment of sensitising potency when used in integrated approaches such as IATA (19).
KeratinoSens™-kokeessa käytettävät testikemikaalit liuotetaan dimetyylisulfoksidiin (DMSO) halutun lopullisen pitoisuuden saavuttamiseksi (esimerkiksi 200 mM).
However, further work preferably based on reliable human data is required to determine how KeratinoSensTM assay results can contribute to potency assessment (24) and to sub-categorisation of sensitisers according to UN GHS/CLP.
Dimetyylisulfoksidiliuoksia voidaan pitää itsesteriloivina, joten steriilisuodatusta ei tarvita.
The ARE-Nrf2 luciferase test method makes use of an immortalised adherent cell line derived from HaCaT human keratinocytes stably transfected with a selectable plasmid.
Testikemikaali, joka ei liukene dimetyylisulfoksidiin, liuotetaan steriliin veteen tai viljelyalustaan ja liuokset steriloidaan esimerkiksi suodattamalla.
The cell line contains the luciferase gene under the transcriptional control of a constitutive promoter fused with an ARE element from a gene that is known to be up-regulated by contact sensitisers (25) (26).
Ellei testikemikaalille ole määritetty molekyylimassaa (MW), KeratinoSens™-kokeessa valmistetaan oletuspitoisuuden mukainen kantaliuos (40 mg/mL eli 4 painoprosenttia tilavuudesta).
The luciferase signal reflects the activation by sensitisers of endogenous Nrf2 dependent genes, and the dependence of the luciferase signal in the recombinant cell line on Nrf2 has been demonstrated (27).
Muiden liuottimien kuin dimetyylisulfoksidin, veden tai viljelyalustan käytölle on esitettävä riittävät tieteelliset perustelut.
This allows quantitative measurement (by luminescence detection) of luciferase gene induction, using well established light producing luciferase substrates, as an indicator of the activity of the Nrf2 transcription factor in cells following exposure to electrophilic substances.
Dimetyylisulfoksidiin liuotetusta testikemikaalista valmistettujen kantaliuosten pohjalta valmistetaan sarja laimennoksia käyttämällä dimetyylisulfoksidia, niin että testattavasta kemikaalista saadaan 12 master-pitoisuutta (jotka ovat KeratinoSens™-kokeessa 0,098–200 mM).
Test chemicals are considered positive in the KeratinoSens™ assay if they induce a statistically significant induction of the luciferase activity above a given threshold (i.e. > 1,5 fold or 50 % increase), below a defined concentration which does not significantly affect cell viability (i.e. below 1000 μM and at a concentration at which the cellular viability is above 70 % (9) (12)).
Ellei testikemikaali liukene dimetyylisulfoksidiin, master-pitoisuuksien saamiseksi tehtäviin laimennoksiin käytetään steriiliä vettä tai steriiliä viljelyalustaa.
For this purpose, the maximal fold induction of the luciferase activity over solvent (negative) control (Imax) is determined.
Käytetystä liuottimesta riippumatta master-pitoisuudet laimennetaan sitten edelleen 25-kertaisesti seerumia sisältävällä viljelyalustalla, ja lopuksi niitä laimennetaan edelleen 4-kertaisesti, jolloin testatun kemikaalin lopulliset pitoisuudet ovat 0,98–2000 μ–M KeratinoSens™-kokeessa.
Furthermore, since cells are exposed to series of concentrations of the test chemicals, the concentration needed for a statistically significant induction of luciferase activity above the threshold (i.e. EC1,5 value) should be interpolated from the dose-response curve (see paragraph 32 for calculations).
Muita pitoisuuksia voidaan käyttää, jos se on perusteltua (esimerkiksi sytotoksisuuden tai heikon liukenevuuden vuoksi).
Finally, parallel cytotoxicity measurements should be conducted to assess whether luciferase activity induction levels occur at sub-cytotoxic concentrations.
KeratinoSens™-kokeessa käytettävä negatiivinen kontrolli (liuotinkontrolli) on dimetyylisulfoksidi (CAS-nro 67-68-5, puhtaus ≥ 99 prosenttia), jota käytetään kuudessa kuopassa kullakin kuoppalevyllä.
Prior to routine use of the ARE-Nrf2 luciferase assay that adheres to this test method, laboratories should demonstrate technical proficiency, using the ten Proficiency Substances listed in Appendix 2.
Sille tehdään kohdassa 22 kuvattu sama laimennus kuin master-pitoisuuksille, minkä seurauksena negatiivisen kontrollin (liuotinkontrollin) lopullinen pitoisuus on 1 prosentti; tämä pitoisuus ei vaikuta solujen elinkykyyn, ja se vastaa testatun kemikaalin ja positiivisen kontrollin dimetyylisulfoksidipitoisuutta.
Performance standards (PS) (28) are available to facilitate the validation of new or modified in vitro ARE-Nrf2 luciferase test methods similar to the KeratinoSens™ assay and allow for timely amendment of this test method for their inclusion.
Ellei testikemikaali liukene dimetyylisulfoksidiin, vaan laimennuksessa on käytettävä vettä, lopullisen testiliuoksen dimetyylisulfoksidipitoisuutta on kaikissa kuopissa säädettävä 1 prosenttiin, niin kuin myös muiden testikemikaalien ja kontrolliaineiden kanssa tehdään.
Mutual Acceptance of Data (MAD) according to the OECD agreement will only be guaranteed for test methods validated according to the PS, if these test methods have been reviewed and included in the corresponding test guideline by OECD.
KeratinoSens™-kokeessa käytettävä positiivinen kontrolli on kanelialdehydi (CAS-nro 14371-10-9, puhtaus ≥ 98 prosenttia), josta valmistetaan dimetyylisulfoksidiin (6,4 mM:n kantaliuos) viiden master-pitoisuuden sarja, joiden pitoisuudet ovat 0,4–6,4 mM ja jotka kohdassa 22 kuvataan master-pitoisuuksien osalta kuvatulla tavalla, niin että positiivisen kontrollin lopullinen pitoisuus on 4–64 μM.
Currently, the only method covered by this test method is the scientifically valid KeratinoSensTM assay (9) (12) (13) (14).
Myös muita sopivia positiivisia kontrolleja, joiden tuottamat EC1,5-arvot ovat mieluiten keskitasoa, voidaan käyttää, jos saatavana on historiallisia tietoja, joista voidaan johtaa vastaavat ajon hyväksyntäperusteet.
The Standard Operating Procedures (SOP) for the KeratinoSensTM assay is available and should be employed when implementing and using the test method in the laboratory (15).
Testikemikaalin ja kontrolliaineiden annostelu
Laboratories willing to implement the test method can obtain the recombinant cell line used in the KeratinoSensTM assay by establishing a licence agreement with the test method developer.
Kutakin testikemikaalia ja positiivista kontrolliainetta kohden tarvitaan (positiivisen tai negatiivisen) ennusteen saamiseksi yksi koe; se muodostuu vähintään kahdesta riippumattomasta toistosta, joista kukin käsittää kolme rinnakkaisnäytettä (eli n = 6).
The following paragraphs provide with a description of the main components and procedures of the ARE-Nrf2 luciferase test method.
Jos kahden riippumattoman toiston tulokset ovat keskenään ristiriidassa, on tehtävä kolmas toisto, joka käsittää kolme rinnakkaisnäytettä (eli n = 9).
Preparation of the keratinocyte cultures
Kukin riippumaton toisto tehdään eri päivinä käyttämällä testikemikaalien tuoretta kantaliuosta ja erikseen kerättyjä soluja.
A transgenic cell line having a stable insertion of the luciferase reporter gene under the control of the ARE-element should be used (e.g. the KeratinoSens™ cell line).
Solut voivat kuitenkin olla peräisin samasta jatkoviljelystä.
Upon receipt, cells are propagated (e.g. 2 to 4 passages) and stored frozen as a homogeneous stock.
Kohdassa 20 kuvatun siirrostuksen jälkeen soluja viljellään 24 tuntia 96-kuoppaisissa kuoppalevyissä.
Cells from this original stock can be propagated up to a maximum passage number (i.e. 25 in the case of KeratinoSensTM) and are employed for routine testing using the appropriate maintenance medium (in the case of KeratinoSensTM this represents DMEM containing serum and Geneticin).
Tämän jälkeen viljelyaine poistetaan ja korvataan tuoreella viljelyaineella (KeratinoSensin™ tapauksessa 150 μl:n viljelyaine, joka sisältää seerumia, mutta ei Geneticinia), johon lisätään 50 μl 25-kertaisesti laimennettua testikemikaalia ja kontrolliaineita.
For testing, cells should be 80-90 % confluent, and care should be taken to ensure that cells are never grown to full confluence.
Jokaisesta levystä pitäisi jättää tyhjäksi ainakin yksi kuoppa (ei soluja eikä käsittelyä) tausta-arvojen arviointia varten.
One day prior to testing cells are harvested, and distributed into 96-well plates (10000 cells/well in the case of KeratinoSensTM).
Käsiteltyjä levyjä inkuboidaan sitten noin 48 tuntia 37 ± 1 °C:ssa, niin että CO2 -pitoisuus on 5 prosenttia, KeratinoSens™-kokeessa.
Attention should be paid to avoid sedimentation of the cells during seeding to ensure homogeneous cell number distribution across wells.
Haihtuvien testikemikaalien höyrystymistä ja testikemikaalien aiheuttamaa kuoppien välistä ristikontaminaatiota on vältettävä esimerkiksi peittämällä levyt kelmulla ennen inkubointia testikemikaalien kanssa.
If this is not the case, this step may give raise to high well-to-well variability.
Lusiferaasiaktiivisuuden mittaukset
For each repetition, three replicates are used for the luciferase activity measurements, and one parallel replicate used for the cell viability assay.
Asianmukaisten luminesenssilukemien saamiseen vaikuttavat keskeisesti kolme asiaa:
Preparation of the test chemical and control substances
herkän luminometrin valinta
The test chemical and control substances are prepared on the day of testing.
valoristikontaminaation välttämiseksi riittävän korkean levymallin valinta
For the KeratinoSensTM assay, test chemicals are dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) to the final desired concentration (e.g. 200 mM).
riittävästi valoa tuottavan lusiferaasisubstraatin käyttö riittävän herkkyyden ja vähäisen vaihtelevuuden varmistamiseksi.
The DMSO solutions can be considered self-sterilising, so that no sterile filtration is needed.
Ennen testaamista on varmistettava näiden kolmen kohdan täyttyminen tekemällä lisäyksessä 3 kuvatut kontrollikoejärjestelyt.
Test chemical not soluble in DMSO is dissolved in sterile water or culture medium, and the solutions sterilised by e.g. filtration.
Kun soluja on altistettu KeratinoSens™-kokeessa 48 tuntia testikemikaalille ja kontrolliaineille, ne pestään fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella, ja kuhunkin kuoppaan lisätään luminesenssilukemia varten asianmukaista lyysispuskuria 20 minuutiksi huoneenlämpötilassa.
For a test chemical which has no defined molecular weight (MW), a stock solution is prepared to a default concentration (40 mg/mL or 4 % (w/v)) in the KeratinoSensTM assay.
Tämän jälkeen levyt, joissa on solulysaattia, asetetaan luminometriin KeratinoSens™-koetta varten ohjelmoitujen lukemien ottamista varten: (i) kuhunkin kuoppaan lisätään lusiferaasisubstraattia (eli 50 μl), (ii) odotetaan yksi sekunti ja (iii) mitataan lusiferaasiaktiivisuutta kahden sekunnin ajan.
In case solvents other than DMSO, water or the culture medium are used, sufficient scientific rationale should be provided.
Jos esimerkiksi käytetyn luminometrin mallin vuoksi käytetään muita asetuksia, ne on perusteltava.
Based on the stock DMSO solutions of the test chemical, serial dilutions are made using DMSO to obtain 12 master concentrations of the chemical to be tested (from 0,098 to 200 mM in the KeratinoSensTM assay).
Lisäksi voidaan käyttää hohtosubstraattia, jos lisäyksen 3 mukainen laadunvalvontakoe on tehty onnistuneesti.
For a test chemical not soluble in DMSO, the dilutions to obtain the master concentrations are made using sterile water or sterile culture medium.
Sytotoksisuuden arviointi
Independent of the solvent used, the master concentrations, are then further diluted 25 fold into culture medium containing serum, and finally used for treatment with a further 4 fold dilution factor so that the final concentrations of the tested chemical range from 0,98 to 2000 μM in the KeratinoSensTM assay.
Solujen elinkykyisyyttä testaavaa KeratinoSens™ -koetta varten viljelyaine korvataan 48 tunnin altistusajan jälkeen tuoreella viljelyaineella, joka sisältää MTT:tä (3-(4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2,5-difenyylitetrasoliumbromidi; tiatsolyylisininen tetrasoliumbromidi; CAS-nro 298-93-1) ja soluja inkuboidaan 4 tuntia 37 °C:ssa, niin että ympäristön CO2-pitoisuus on 5 prosenttia.
Alternative concentrations may be used upon justification (e.g. in case of cytotoxicity or poor solubility).
Sitten MTT:tä sisältävä viljelyaine poistetaan ja solujen annetaan lysoitua yön yli (esimerkiksi lisäämällä 10-prosenttista SDS-liuosta kuhunkin kuoppaan).
The negative (solvent) control used in the KeratinoSensTM assay is DMSO (CAS No. 67-68-5, ≥ 99 % purity), for which six wells per plate are prepared.
Ravistuksen jälkeen mitataan absorptio 600 nm:ssa fotometrilla.
It undergoes the same dilution as described for the master concentrations in paragraph 22, so that the final negative (solvent) control concentration is 1 %, known not to affect cell viability and corresponding to the same concentration of DMSO found in the tested chemical and in the positive control.
KeratinoSens™-kokeessa lasketaan seuraavat parametrit:
For a test chemical not soluble in DMSO, for which the dilutions were made in water, the DMSO level in all wells of the final test solution must be adjusted to 1 % as for the other test chemicals and control substances.
testatun kemikaalin ja positiivisen kontrollin millä tahansa pitoisuudella havaitun lusiferaasiaktiivisuuden suurin keskimääräinen induktiokerroin (Imax);
The positive control used in the case of the KeratinoSensTM assay is cinnamic aldehyde (CAS No. 14371-10-9, ≥ 98 % purity), for which a series of 5 master concentrations ranging from 0,4 to 6,4 mM are prepared in DMSO (from a 6,4 mM stock solution) and diluted as described for the master concentrations in paragraph 22, so that the final concentration of the positive control range from 4 to 64 μM.
,5-arvo, joka edustaa pitoisuutta, jolla saatiin aikaan se, että lusiferaasiaktiivisuuden induktio ylittää kynnyksen vähintään 1,5-kertaisesti (eli lusiferaasiaktiivisuuden 50-prosenttinen kasvu); ja
Other suitable positive controls, preferentially providing EC1,5 values in the mid-range, may be used if historical data are available to derive comparable run acceptance criteria.
solujen elinkyvyn 50 prosentin ja 30 prosentin heikkenemisen IC50- ja IC30-pitoisuusarvot.
Application of the test chemical and control substances
lusiferaasiaktiivisuuden induktiokerroin lasketaan yhtälöllä 1, ja yleinen suurin induktiokerroin (Imax) on yksittäisten toistojen keskiarvo.
For each test chemical and positive control substance, one experiment is needed to derive a prediction (positive or negative), consisting of at least two independent repetitions containing each three replicates (i.e. n = 6).
Yhtälö 1:
In case of discordant results between the two independent repetitions, a third repetition containing three replicates should be performed (i.e. n = 9).
Induktiokerroin
Each independent repetition is performed on a different day with fresh stock solution of test chemicals and independently harvested cells.
Lnäyte
Cells may come from the same passage however.
Lnolla
After seeding as described in paragraph 20, cells are grown for 24 hours in the 96-wells microtiter plates.
Lliuotin
The medium is then removed and replaced with fresh culture medium (150 μl culture medium containing serum but without Geneticin in the case of KeratinoSensTM) to which 50 μl of the 25 fold diluted test chemical and control substances are added.
jossa
At least one well per plate should be left empty (no cells and no treatment) to assess background values.
L näyte
The treated plates are then incubated for about 48 hours at 37 ± 1 °C in the presence of 5 % CO2 in the KeratinoSensTM assay.
on testikemikaalikuopan luminesenssilukema
Care should be taken to avoid evaporation of volatile test chemicals and cross-contamination between wells by test chemicals by e.g. covering the plates with a foil prior to the incubation with the test chemicals.
L nolla
Luciferase activity measurements
on luminesenssilukema tyhjässä kuopassa, jossa ei ole soluja ja jota ei käsitellä
Three factors are critical to ensure appropriate luminescence readings:
L liuotin
the choice of a sensitive luminometer,
on keskimääräinen luminesenssilukema kuopissa, joissa on soluja ja liuotinkontrollia (negatiivinen kontrolli)
the use of a plate format with sufficient height to avoid light-cross-contamination; and
,5 lasketaan yhtälöllä 2 käyttämällä lineaarista interpolointia, ja yleinen EC1,5 on yksittäisten toistojen geometrinen keskiarvo.
the use of a luciferase substrate with sufficient light output to ensure sufficient sensitivity and low variability.
Yhtälö 2:
Prior to testing, a control experiment setup as described in Appendix 3 should be carried out to ensure that these three points are met.
on alhaisin pitoisuus (μM), jolla induktio on vähintään 1,5-kertainen
After the 48 hour exposure time with the test chemical and control substances in the KeratinoSensTM assay, cells are washed with a phosphate buffered saline, and the relevant lysis buffer for luminescence readings added to each well for 20 min at room temperature.
on korkein pitoisuus (μM), jolla induktio on alle 1,5-kertainen
Plates with the cell lysate are then placed in the luminometer for reading which in the KeratinoSensTM assay is programmed to: (i) add the luciferase substrate to each well (i.e. 50 μl), (ii) wait for 1 second, and (iii) integrate the luciferase activity for 2 seconds.
on induktiokerroin mitattuna alhaisimmasta pitoisuudesta, jolla induktio on vähintään 1,5-kertainen (kolmesta kuopasta otettujen rinnakkaisnäytteiden keskiarvo)