natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Cycling conditions: 50 °C for 30 minutes, 95 °C for 15 minutes, 40 cycles of 94 °C for 15 seconds, 60 °C for 40 seconds, 72 °C for 20 seconds; adjust if necessary.
KH-viruksen seurantatarkoituksia varten testauksessa PCR-reaktioon perustuvilla menetelmillä voidaan käyttää kaloja, jotka lähetetään elävinä tai tapettuina ja erikseen pakattuina sinetöityihin aseptisiin säiliöihin, tai vaihtoehtoisesti jäädytettyjä elimiä tai elinten kappaleita, jotka on säilötty 80–100-prosenttiseen alkoholiin tai virusperäiseen kuljetuselatusaineeseen (käsiteltävä 48 tunnin kuluessa keräämisestä).
Other RT-PCR or RT-qPCR versions of proven similar efficacy may be used instead.
KHV-taudin seurantaa varten on kerättävä kidus- ja munuaiskudoksia.
RT-qPCR for IHNV
KHV-taudin seurantatarkoituksia varten on mahdollisuuksien mukaan vältettävä näytteiden yhdistämistä.
For IHNV, amplification shall be performed using the following primers and probe:
Jos yhdistäminen on välttämätöntä, enintään kahden kalan kudosainesta voidaan yhdistää.
Forward primer: 5′- AGA-GCC-AAG-GCA-CTG-TGC-G-3′;
Suuremmat näytteet on homogenisoitava huhmaren ja morttelin tai stomacher-homogenisaattorin avulla, ja osanäytteet on otettava talteen DNA:n eristämistä varten ennen kirkastamista.
Reverse primer: 5′- TTCTTTGCGGCTTGGTTGA - 3′;
Vaihtoehtoisesti osanäytteet voidaan kerätä kustakin näytteessä olevasta kudoksesta ja sijoittaa ”lyysaysputkiin”.
and probe: 5′ 6FAM-TGAGACTGAGCGGGACA-NFQ/MGB.
Kaupallisia DNA:n eristämiskittejä, jotka tuottavat korkealaatuisia DNA:ta, joka soveltuu käytettäväksi II.2 kohdassa vahvistettujen PCR-protokollien kanssa, saa käyttää.
Two-step RT-qPCR:
Hyväksyttävä kudos-elatusaine-suhde on 1:9 w/v.
As the following assay depends on a two-step amplification, extra care shall be taken when handling the tubes from one reaction to the other in order to prevent contamination.
Testeihin on otettava 20–25 mg kudosainesta.
Cycling conditions (after RT-step): 50 °C for 2 minutes, 95 °C for 10 minutes, followed by 40 cycles of 95 °C for 15 seconds and 60 °C for 1 minutes; adjustments shall be made if necessary.
2 KH-viruksen seuranta PCR-reaktioon perustuvilla menetelmillä
Detailed diagnostic methods and procedures for the confirmation of or to rule out the suspicion of VHS or IHN or both in suspected outbreaks
KH-viruksen seurannassa on käytettävä qPCR-menetelmää.
When a laboratory examination is required to confirm or rule out the presence of IHN or VHS or both in accordance with Article 57(b) of Directive 2006/88/EC using the diagnostic methods set out in point II.3 of Part 1 of Annex I, the following detailed diagnostic methods and procedures shall apply:
Jos alueella, jota ei ole aiemmin vahvistettu positiiviseksi, ilmenee positiivisia näytteitä, testitulokset on vahvistettava joko
conventional virus isolation with subsequent seroneutralisation, immune-chemical or molecular virus identification;
sekvensoimalla PCR:n tai nested PCR:n tuote näytteistä,
Conventional virus isolation with subsequent virus identification
qPCR-menetelmä KH-viruksen osoittamiseksi
Selection of samples
On käytettävä seuraavassa kuvattua qPCR-menetelmää:
At least 10 fish showing typical signs of IHN or VHS shall be selected for examination.
Ajo-olosuhteet: yksi sykli 95 °C 15 minuuttia, minkä jälkeen 50 sykliä 94 °C 15 sekuntia ja 60 °C 60 minuuttia.
The preparation and shipment for the purpose of conventional virus isolation shall follow the methods and procedures laid down in point I.2.
qPCR:n tulokset saattavat vaihdella suoritusolosuhteiden mukaan, joten lämpötilaprotokollat saatetaan joutua optimoimaan käytössä olevan lämpöblokin mukaan.
The collection of supplementary material for the purpose of conventional virus isolation shall follow the methods and procedures laid down in point I.3.
Tavanomainen PCR KH-viruksen osoittamisen vahvistamiseksi
Preparation of samples for cell culture examination
KH-virustartunnan vahvistamiseksi on käytettävä seuraavassa taulukossa 2.1 kuvattua geneeristä nested PCR:ää, minkä jälkeen monistettu tuote sekvensoidaan.
The preparation of samples for cell culture examination for the purpose of conventional virus isolation shall follow the methods and procedures laid down in point I.4.
Taulukko 2.1
The virological examination for the purpose of conventional virus isolation shall follow the methods and procedures laid down in point I.5.
Alukkeet ja ajo-olosuhteet kaikkiin koikarpin herpesviruksiin (CyHV-1, CyHV-2 ja CyHV-3) kohdistuvaa nested PCR-määritystä varten.
The virus identification for the purpose of conventional virus isolation shall follow the methods and procedures laid down in point I.6.
Alukkeen nimi
Virus detection by RT-qPCR
Sekvenssi
The selection of samples for the purpose of virus detection by RT-qPCR shall follow the methods and procedures laid down in point I.1.2.
Ajo-olosuhteet:
The preparation and shipment for the purpose of virus detection by RT-qPCR shall follow the methods and procedures laid down in point I.2.
Tuotteen koko
The collection of supplementary diagnostic material for the purpose of virus detection by RT-qPCR shall follow the methods and procedures laid down in point I.3.
PCR-reaktion ensimmäinen kierros
Sample preparation for RT-qPCR
1 sykli:
The sample preparation for the purpose of virus detection by RT-qPCR shall follow the methods and procedures laid down in point I.6.4.1.
95 °C 2 minuuttia
The virus detection by RT-qPCR shall follow the methods and procedures laid down in points I.6.4.1, I.6.4.3 and I.6.4.4.
40 sykliä:
Other diagnostic techniques
95 °C 30 sekuntia
Supernatant prepared as described in point I.4.3 may be submitted to ELISA, Indirect fluorescent antibody test (IFAT), or RT-PCR in accordance with point I.6.1, point I.6.2 or point I.6.4 respectively.
55 °C 30 sekuntia
Tissue material may be subjected to other diagnostic techniques, such as IFAT on frozen sections, immunohistochemistry on formalin fixed tissue material.
72 °C 45 sekuntia
Those rapid techniques shall be supplemented with a virological examination in accordance with either point II(a) or point II(b) within 48 hours after sampling, if:
72 °C 10 minuuttia
a negative result is obtained; or
PCR-reaktion toinen kierros:
a positive result is obtained with material representing the first case of IHN or VHS.
95 °C 2 minuuttia
Procedure for titration to verify the susceptibility of the cell cultures to infection
Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää muita yhtä tehokkaiksi osoitettuja PCR-versioita.
When titration to verify the susceptibility of the cell cultures to infection as referred to in point I.5.3 is carried out, the procedures set out in the following paragraphs of this point shall be followed.
Sekvensoinnin voi suorittaa laboratorio tai ulkopuolinen erikoistunut sekvensointiyritys.
At least two VHSV isolates and one isolate of IHNV shall be used.
Sekvensoinnin tulokset on analysoitava mukauttamalla sekvenssit KH-viruksen tunnettuihin vertailusekvensseihin (Gen Bank, tunnusnumerot AP008984, DQ657948 ja DQ177346).
The isolates shall represent the major group of viruses within the European Union, namely for VHSV one pathogenic isolate from rainbow trout in freshwater and one marine isolate pathogenic for turbot, and for IHNV one rainbow trout pathogenic strain from the European Union.
Saadun puhtaan konsensussekvenssin on vastattava (vähintään 98-prosenttisesti) näitä vertailusekvenssejä.
Well-defined isolates from the Member States shall be used.
YKSITYISKOHTAISET DIAGNOSTISET MENETELMÄT JA MENETTELYT LOHEN TARTTUVAN ANEMIAN (ISA-TAUDIN) SEURANTAA JA SEN ESIINTYMISEN VAHVISTAMISTA VARTEN
Batches of virus in low cell culture passage numbers shall be propagated in cell culture flasks on BF-2 or RTG-2 cells for VHSV and on EPC or FHM cells for IHNV.
I Näytteenottomenetelmät ISA-taudin seurantaa ja valvontaa varten
Cell culture medium with at least 10 % serum shall be used.
Kun suoritetaan näytteenotto tai laboratoriotutkimus tämän asetuksen liitteessä I olevassa 3 osassa vahvistettuja valvonta- tai hävittämisohjelmia varten tai ISA-taudin esiintymisen vahvistamiseksi tai poissulkemiseksi direktiivin 2006/88/EY 57 artiklan b alakohdan mukaisesti, on sovellettava tämän jakson I.1, I.2 ja I.3 kohdassa vahvistettuja yksityiskohtaisia menetelmiä ja menettelyjä.
Low MOI for inoculation (< 1) shall be used.
Jos mahdollista, kalanäytteitä ei pidä yhdistää ISA-taudin esiintymisen osoittamiseksi tehtävää laboratoriotutkimusta varten.
At total CPE, the virus shall be harvested by centrifugation of cell culture supernatant at 2000 × g for 15 minutes, filter sterilised through 0,45 μm membrane filter and distributed in labelled cryotubes.
ISA-taudin seurantaa varten 2–5 kalan yhdistäminen kuitenkin hyväksytään.
The virus shall be kept at – 80 °C.
Kaikista näytteenottoon kerätystä kaloista on otettava näytteet käänteistranskriptaasi- polymeraasiketjureaktioanalyysiä (RT-PCR) varten.
1 week after freezing, three replicate vials with each virus shall be thawed under cold water and titrated on their respective cell lines.
Munuaisen keskiosasta on poistettava pala käyttämällä steriiliä välinettä, ja se on siirrettävä mikrofugiputkeen, joka sisältää yhden millilitran tehokkaaksi osoitettua RNA-säilytysliuosta.
At least every 6 months, or if it is suspected that the susceptibility of a cell line has decreased, each virus isolate shall be thawed and titrated.
Yhteen kuljetuselatusainetta sisältävään putkeen saa kerätä yhteisnäytteeksi enintään viiden kalan kudosta.
Titration procedures must be described in detail and the same procedure followed each time.
Yhdessä näytteessä olevien kudosten painon on oltava 0,5 g. Jos kalat ovat liian pieniä vaaditun painoisen näytteen saamiseksi, voidaan ottaa paloja munuaisesta, sydämestä, pernasta, maksasta tai umpisuolesta, tässä järjestyksessä, jotta saadaan kokoon 0,5 grammaa.
Titration by end point dilution shall include at least six replicates at each dilution step.
Histologiseen tutkimukseen tarkoitetut kudokset saa ottaa ainoastaan juuri tapetusta normaalikuntoisesta kalasta, jossa havaitaan ISA-taudinkuvaan sopivia kliinisiä oireita tai post mortem -löydöksiä.
The titres shall be compared with previously obtained titres.
Kaikista ulkoisista tai sisäisistä leesioista ja joka tapauksessa yksittäisten kalojen munuaisen keskiosasta, sydämestä, maksasta, haimasta, suolesta, kiduksista ja pernasta on otettava skalpellin avulla näyte, joka siirretään puskuroituun suolaliuokseen, jossa on 8–10 % formolia (vol:vol).
If the titre of any of the three virus isolates drops by a factor of 2 logs or more, compared with the initial titre, the cell line shall no longer be used for surveillance purposes.
Kiinnitysaineen ja kudosmateriaalin välisen suhteen on oltava vähintään 20:1, jotta kudokset säilyisivät riittävän hyvin.
If different cell lines are kept in the laboratory each line shall be examined separately.
Immunohistokemiaa (IHC) varten näytteet on otettava munuaisen keskiosasta ja sydämestä.
Records shall be kept for a period of at least 10 years.
Soluviljelyn virologiseen tutkimukseen tarkoitetut kudosnäytteet otetaan kaikista niistä kaloista, jotka on kerätty näytteenottoa varten.
DETAILED DIAGNOSTIC METHODS AND PROCEDURES FOR THE SURVEILLANCE AND CONFIRMATION OF KHV DISEASE (KHVD)
Maksasta, munuaisen etu- tai keskiosasta, sydämestä ja pernasta otettavat kudosnäytteet on irrotettava kalasta steriilillä instrumentilla ja siirrettävä muoviputkiin, jotka sisältävät 9 ml kuljetuselatusainetta.
When a laboratory examination is required for the purpose of confirmation of the presence of or to rule out the suspicion of KHVD in accordance with Article 57(b) of Directive 2006/88/EC, using the diagnostic methods set out in Section III of Part 2 of Annex I, the detailed diagnostic methods and procedures set out in points I.1 – I.2 of this Part shall apply.
Yhdessä näytteessä olevien kudosten painon on oltava 1,0 ± 0,5 g.
Preparation of samples from fish
Laboratorioon voidaan lähettää kokonaisia kaloja, jos tämän kohdan 3 kohdassa määritellyt kuljetuslämpötilalle asetetut vaatimukset täyttyvät.
For diagnostic purposes the fish (sent alive or killed and packed separately in sealed aseptic containers) or alternatively frozen organs or organ pieces preserved in 80 % to absolute ethanol or viral transport medium (to be processed within 48 hours after collection) may be used for testing with conventional PCR or qPCR based methods.
Kokonaiset kalat on käärittävä imupaperiin ja lähetettävä muovipussissa kyseisessä kohdassa kuvatulla tavalla jäähdytettyinä.
For the detection of KHV, gill and kidney shall be collected; in addition spleen, encephalon and intestine may be included in an additional separated sample.
Myös eläviä kaloja voi lähettää, mutta ainoastaan kansallisen kalatauteja tutkivan vertailulaboratorion valvonnassa ja ottaen huomioon desinfiointiin ja bioturvaamiseen liittyvistä näkökohdat eläviä kaloja kuljetettaessa.
In acute cases, tissue material of up to five fish may be pooled.
Virologiseen tutkimukseen tai RT-PCR-analyysiin tarkoitetut verinäytteet ja kalan kudoksia sisältävät näyteputket on asetettava eristettyihin säiliöihin, kuten paksuseinäisiin polystyreenilaatikoihin, joissa on riittävästi jäätä tai kylmävaraajia sen varmistamiseksi, että näytteet pysyvät jäähdytettyinä laboratorioon kuljettamisen aikana.
Furthermore, non-lethal samples such as blood, gill swabs, gill biopsy, mucus scrape may be used in certain cases (namely very valuable fish may be used in the case of the suspicion of the presence of KHV).
Näytteitä on varjeltava jäätymiseltä, ja kuljetuslaatikossa on oltava jäätä vielä lähetyksen vastaanottopaikassa tai yhden tai useamman kylmävaraajan on vielä oltava osittain tai kokonaan jäätynyt.
DNA extraction
Poikkeustapauksissa RT-PCR-näytteet ja virologisesti tutkittavat näytteet voidaan pikajäädyttää ja kuljettaa laboratorioon – 20 °C:ssa tai sitä alemmassa lämpötilassa.
The commercially available DNA extraction kits that produce high quality DNA suitable for use with the PCR protocols referred to in point I.2 may be used.
20 °C:ssa säilytetyt näytteet: rajoittamaton.
Agent detection and identification by Polymerase chain reaction (PCR) based methods
Jos kalan kudoksia kuljetetaan histologiseen tutkimukseen kiinnitysaineessa, ne on lähetettävä vuotamattomissa putkissa iskunkestävissä säiliöissä.
I.2.1. qPCR for KHV detection
Näytteiden jäätymistä on vältettävä.
For qPCR detection of KHV, the following qPCR assay shall be used:
Diagnostisen laboratorion luvalla myös muita kuin I.1 kohdassa tarkoitettuja kalojen kudoksia voidaan kerätä ja valmistella lisätutkimuksia varten.
Forward primer (KHV-86f): 5′- GACGCCGGAGACCTTGTG -3′;
II Yksityiskohtaiset diagnostiset menetelmät ja menettelyt ISA-taudin seurantaa varten ja sen esiintymisen vahvistamiseksi tai sen epäilyn poissulkemiseksi
Reverse primer (KHV-163r): 5′- CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT -3′;
Kun suoritetaan laboratoriotutkimuksia, joiden tarkoituksena on saavuttaa tai säilyttää tietty terveystilanne ISA-taudin osalta liitteessä I olevan 3 osan I jakson mukaisesti tai vahvistaa ISA-taudin esiintyminen tai sulkea pois sen epäily direktiivin 2006/88/EY 57 artiklan b alakohdan mukaisesti ja joissa käytetään liitteessä I olevan 3 osan II jaksossa vahvistettuja diagnostisia menetelmiä, on sovellettava seuraavissa kohdissa II.1–II.5 vahvistettuja yksityiskohtaisia menetelmiä ja menettelyjä.
and probe (KHV-109p): 5′-FAM- CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG -3′.
1 Näytteiden tutkiminen RT-PRC-menetelmällä
Cycling conditions: one cycle of 95 °C at 15 minutes, followed by 40 cycles of 94 °C at 15 seconds and 60 °C for 60 seconds.
ISA-viruksen seulonnassa käytettävän diagnostisen menetelmän on oltava RT-qPCR.
The assay described in this point targeting the Thymine kinase (TK) gene of KHV shall be used.
Kokonais-RNA on eristettävä fenolikloroformimenetelmällä tai affiniteettipuhdistamalla RNA spin-kolonneilla valmistajan ohjeiden mukaisesti.
However, other PCR assays with demonstrated similar sensitivities and specificities to the described assay may be used instead.
Puhdistettu RNA on suspendoitava uudelleen tislattuun RNaasi-vapaaseen veteen (eli 0,1-prosenttisella dietyyli-pyrokarbonaatilla käsiteltyyn veteen).
Forward primer (KHV-TKf): 5′-GGGTTACCTGTAC GAG-3′;
Eristetyn RNA:n pitoisuus ja puhtaus on arvioitava mittaamalla optinen tiheys aallonpituuksilla 260 ja 280 nm.
Reverse primer (KHV-TKr): 5′-CACCCAGTAGATTA TGC-3′.
Vaihtoehtoisesti voidaan lisätä sisäisiä viruksen genomiin kohdistuvia kontrolleja II.1.3 kohdassa tarkoitetulla tavalla.
Cycling conditions: one cycle of 95 °C for 5 minutes followed by 35 cycles of 95 °C for 30 seconds, 52 °C for 30 seconds, 72 °C for one minute and one cycle of 72 °C for 10 minutes.
RT-PCR-menetelmä ISA-viruksen osoittamiseksi
Product size should be 409 bp.
ISA-viruksen genomin monistamisessa voidaan käyttää useita RT-PCR-menetelmiä.
Furthermore, false-positive results may occur because of false primer annealing or contamination.
Voidaan suorittaa kaksivaiheinen RT-PCR, jossa RT- ja PCR-reaktioiden vaiheet ajetaan kahdessa erillisessä koeputkessa.
However, other PCR versions of proven similar efficacy may be used instead.
Voidaan kuitenkin myös suorittaa yksivaiheinen reaktio, jossa kyseiset kaksi reaktiota ajetaan yhdessä koeputkessa.
The first detection in an area shall be confirmed by sequencing or sent to a to a national reference laboratory or to the EU reference laboratory for fish diseases referred to in Annex VI to Directive 2006/88/EC, for immediate identification.
Yksivaiheista menetelmää on käytettävä mahdollisuuksien mukaan, sillä määritys yhdessä koeputkessa minimoi ristikontaminaation, koska sisältöä ei tarvitse siirtää, ja sitä pidetään yhtä herkkänä kuin kaksivaiheista menetelmää.
Detailed diagnostic methods and procedures for the surveillance of KHVD
On käytettävä tässä kohdassa kuvattuja alukkeita ja määritystä eli ILA1- tai ILA2 -alukeparia, jotka kohdistuvat segmenttiin 8 ja joiden on todettu soveltuvan ISA-viruksen osoittamiseen taudinpurkauksissa ja tautia kantavissa kaloissa.
When sampling and laboratory examination for the purpose of obtaining or maintaining certain health statuses with regard to KHVD as set out in Section I of Part 2 of Annex I are carried out using the diagnostic methods set out in Sections II or III of Part 2 of that Annex, the detailed diagnostic methods and procedures set out in the following points II.1 and II.2 of this Part shall apply.
ILA2-taka-aluke ei sovellu Pohjois-Amerikasta peräisin oleville isolaateille, joten näissä tapauksissa on käytettävä vaihtoehtoista alukeyhdistelmää.
If possible, fish that have been kept for a prolonged time period at the virus permissive temperature range (namely, 2 to 3 weeks at 15 °C to 26 °C) shall be sampled.
Etualuke (ILA1): 5′-GGCTATCTACCATGAACGAATC-3′;
If possible, samples shall be collected 24 hours but not later than 72 hours after management practices that may reactivate the virus in fish with a carrier status, such as netting or transport, in order to enhance the chance of KHV detection.
Taka-aluke (ILA2): 5′-GCCAAGTGTAAGTAGCACTCC-3′.
For the purpose of the surveillance of KHVD, the fish may be sent alive or killed and packed separately in sealed aseptic containers or alternatively frozen organs or organ pieces preserved in 80 % to 100 % alcohol or viral transport medium (to be processed within 48 hours after collection) may be used for testing PCR based methods.
Ajo-olosuhteet: yksi sykli 50 °C 30 minuuttia, yksi sykli 94 °C 15 minuuttia, 40 sykliä 94 °C 30 sekuntia, 55 °C 30 sekuntia, 72 °C 60 sekuntia; yksi sykli 72 °C 5 minuuttia.
For the surveillance of KHVD, gill and kidney tissue shall be collected.
Tuotteen koko 155 bp.
For the purpose of surveillance of KHVD, pooling shall be avoided where possible.
Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää muita yhtä tehokkaiksi osoitettuja RT-PCR-versioita.
If pooling is necessary, tissue material from a maximum of two fish may be pooled.
RT-qPCR-menetelmä ISA-viruksen osoittamiseksi
Larger samples shall be homogenised in mortar and pestle or stomacher, and subsamples retrieved for DNA extraction before clarification.
RT-qPCR-menetelmän käyttö voi lisätä spesifisyyttä ja todennäköisesti myös herkkyyttä.
Alternatively, subsamples may be collected from each tissue included in the sample and placed in ‘lysis-tubes’.
Menetelmä voidaan suorittaa nopeammin, sillä geelielektroforeesivaihe ei ole tarpeen, ja se vähentää ristikontaminaation riskiä, koska on mahdollista arvioida viruksen genomi-RNA:n määrä näyteputkessa.
Commercially available DNA extraction kits that produce high quality DNA suitable for use with the PCR protocols set out in point II.2 may be used.
RT-qPCR-määrityksen haittapuolena on, että useinkaan ei ole mahdollista sekvensoida monistettuja tuotteita.
The acceptable tissue medium ratio shall be 1:9 w/v.
Jos monistetun tuotteen spesifisyydestä on kuitenkin epäilyksiä, tuloksen tarkistamiseksi on ajettava toinen ISA-virukselle spesifinen määritys.
20 to 25 mg tissue material shall be included in the tests.
On käytettävä tässä kohdassa kuvattua määritystä, joka on segmenttiin 8 kohdistuva määritys.
Surveillance of KHVD by PCR based methods
Tämä määritelmä kattaa Euroopan unionista, Euroopan vapaakauppaliiton maista ja Pohjois-Amerikasta peräisin olevat isolaatit.
For the surveillance of KHV, a qPCR shall be used.
Yksivaiheista menetelmää on käytettävä mahdollisuuksien mukaan, sillä määritys yhdessä koeputkessa minimoi ristikontaminaation.
If positive samples appear in an area not previously confirmed positive, the test results shall be confirmed either:
Etualuke: 5′- CTACACAGCAGGATGCAGATGT -3′;
by sequencing of a PCR or nested PCR product from the samples.
Taka-aluke: 5′- CAGGATGCCGGAAGTCGAT -3′;
The obtained clean consensus sequence shall match (by at least 98 %) with these reference sequences.
ja koetin: 5′-FAM- CATCGTCGCTGCAGTTC – MGBNFQ-3′.
or alternatively, samples may be sent to a national reference laboratory for confirmation.
Ajo-olosuhteet: yksi sykli 50 °C 30 minuuttia, yksi sykli 95 °C 15 minuuttia, 40 sykliä 94 °C 15 sekuntia, 60 °C 60 sekuntia; mukautettava tarvittaessa.
qPCR for KHV detection
Monistettujen PCR-tuotteiden sekvensointi
The qPCR described as follows shall be used:
Etualuke (ILAs6-3F): 5′-ATGAGGGAGGTAGCATTGCA -3′;
The results of the qPCR may vary depending on the conditions under which it is performed, namely the thermal protocols might need optimisation, depending on the thermal cycler in use.
Ajo-olosuhteet (yksivaiheinen RT-PCR-menetelmä): yksi sykli 50 °C 30 minuuttia, yksi sykli 94 °C 15 minuuttia, 40 sykliä 94 °C 30 sekuntia, 55 °C 30 sekuntia, 72 °C 60 sekuntia, yksi sykli 72 °C 5 minuuttia; mukautettava tarvittaessa.
Conventional PCR for confirmation of KHV detection
Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää seuraavaa menetelmää HPR:n sekvensointiin segmentissä 6:
For confirmation of the presence of infection with KHV, the generic nested PCR described in the following Table 2.1 shall be used followed by sequencing of the amplified product.
Etualuke: 5′-GAC-CAG-ACA-AGC-TTA-GGT-AAC-ACA-GA-3′;
Table 2.1
Taka-aluke: 5′-GAT-GGT-GGA-ATT-CTA-CCT-CTA-GAC-TTG-TA-3′;.
Primers and conditions for the nested PCR assay targeting all cyprinid herpesviruses (CyHV-1, CyHV-2 and CyHV-3)
Tuotteen koko: 304 nt jos HPR0.
Primer name
Voidaan käyttää myös muita RT-PCR-määrityksiä, joilla on tässä kohdassa kuvattuja määritelmiä vastaava herkkyys ja spesifisyys.
Sequence
Monistettujen RT-PCR-tuotteiden puhtaus on tarkastettava geelielektroforeesilla ennen sekvensointia.
Cycling conditions
Jos ilmaantuu ainoastaan yksi puhdas fragmentti, se on puhdistettava suoraan PCR-reaktiosta.
First round PCR
Sekvensointi on suoritettava monistusalukkeita käyttämällä ulkopuolisessa erikoistuneessa sekvensointiyrityksessä.
1 cycle:
Tulokset on analysoitava BLAST-ohjelman avulla, ja sekvenssejä on verrattava muihin tunnettuihin sekvensseihin US National Centre for Biotechnical Information -keskuksen (NCBI) nukleotiditietokannassa.
40 cycles:
2 ISA-viruksen eristäminen soluviljelmissä
95 °C for 30 seconds
Näytteiden valmistelu
55 °C for 30 seconds
Kudosta voidaan säilyttää – 80 °C:ssa.
72 °C for 45 seconds
Kudoksen saa jäädyttää ja sulattaa vain kerran ennen tutkimusta.
72 °C for 10 minutes
Seuranta- ja valvontatarkoituksia varten tutkimus on suoritettava mahdollisimman nopeasti.