natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Wang (2007), “Toxicity of the aromatase inhibitor letrozole to Japanese medaka (Oryzias latipes) eggs, larvae and breeding adults”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 145, pp. 533-541.
PCR-puskuri 2:n aineosat:
LeBlanc, and C.V.Sullivan (1999), “Fathead minnow (Pimephales promelas) vitellogenin: purification, characterization and quantitative immunoassay for the detection of estrogenic compounds”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 123, pp. 113-125.
20 g Chelex (valmistaja esimerkiksi Biorad, München, Saksa)
Porcher (2002), “Development and validation of an enzyme-linked immunosorbent assay to measure vitellogenin in the zebrafish (Danio rerio)”, Environmental Toxicology and Chemistry 21, pp. 1699-1708.
Medakan geneettisen sukupuolen määrittäminen (PCR-menetelmällä) (menetelmä on laadittu Bayer CropScience AG:n vesieliöitä käsittelevässä laboratoriossa ja Würzburgin yliopiston biokeskuksessa)
Hatano, H. Mizukami, M. Yamashita, R. Sakakibara, and E. Tamiya (2002), “Development and application of a monoclonal antibody-based sandwich ELISA for quantification of Japanese medaka (Oryzias latipes) vitellogenin”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 132, pp. 161-169.
Valmistellut ja jäädytetyt putket (kuvattu edellisessä kohdassa) sulatetaan.
Bengtsson (2004), “The juvenile three-spined stickleback (Gasterosteus aculeatus L.) as a model organism for endocrine disruption — II — kidney hypertrophy, vitellogenin and spiggin induction”, Aquatic Toxicology 70, pp. 311-326.
Sen jälkeen ne sentrifugoidaan Eppendorfin sentrifugissa (30 sekuntia enimmäisnopeudella huoneenlämmössä).
Tatarazako, N., M. Koshio, H. Hori, M. Morita, and T. Iguchi (2004), “Validation of an enzyme-linked immunosorbent assay method for vitellogenin in the medaka”, Journal of Health Science 50, pp. 301-308.
PCR-menetelmässä käytetään sakasta erotettua kirkasta supernatanttia.
Eidem, J.K., H. Kleivdal, K. Kroll, N. Denslow, R. van Aerle, C. Tyler, G. Panter, T. Hutchinson, and A. Goksoyr (2006), “Development and validation of a direct homologous quantitative sandwich ELISA for fathead minnow (Pimephales promelas) vitellogenin.
Chelexin jäämien (joita on sakassa) siirtymistä PCR-reaktioon on ehdottomasti vältettävä, koska se häiritsee Taq-polymeraasin toimintaa.
Ankley (2006), “Evaluation of a commercial kit for measuring vitellogenin in the fathead minnow (Pimephales promelas)”, Ecotoxicology and Environmental Safety 64, pp. 101-105.
Reaktioseoksen valmistus (25 μl näytettä kohti):
Holbech, H., Petersen, G. I., Norman, A., Örn, S, Norrgren, L., and Bjerregaard, P (2001b), “Suitability of zebrafish as test organism for detection of endocrine disrupting chemicals.
Tilavuus
Porcher, and A. Goksoyr (2004), “Development of quantitative vitellogenin-ELISAs for fish test species used in endocrine disruptor screening”, Analytical and Bioanalytical Chemistry 378, pp. 621-633.
Templaatti-DNA
Orn, S., S. Yamani, and L. Norrgren (2006), “Comparison of vitellogenin induction, sex ratio, and gonad morphology between zebrafish and Japanese medaka after exposure to 17 alpha-ethinylestradiol and 17 beta-trenbolone”, Archives of Environmental Contamination and Toxicology 51, pp. 237-243.
0,5–2 μl
Scholz, S. and N. Kluver (2009), “Effects of Endocrine Disrupters on Sexual, Gonadal Development in Fish, Sexual Development 3”, pp. 136-151.
10 × PCR-puskuri + MgCl2
Fenske, M., G. Maack, C. Schafers, and H. Segner (2005), “An environmentally relevant concentration of estrogen induces arrest of male gonad development in zebrafish, Danio rerio”, Environmental Toxicology and Chemistry 24, pp. 1088-1098.
2,5 μl
Nagahama (2004), “Two DM domain genes, DMY and DMRT1, involved in testicular differentiation and development in the medaka, Oryzias latipes”, Developmental Dynamics 231, pp. 518-526.
4 μl (5 mM) 200 μM Etualuke (10 μM) (ks. kohdat 3–5)
Shinomiya, A., H. Otake, K. Togashi, S. Hamaguchi, and M. Sakaizumi (2004), “Field survey of sex-reversals in the medaka, Oryzias latipes: genotypic sexing of wild populations”, Zoological Science 21, pp. 613-619.
0,5 μl
Flick (2007), “Collapse of a fish population after exposure to a synthetic estrogen”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, pp. 8897-8901.
Taka-aluke (10 μM) (ks. kohdat 3–5)
Kidd (2009), “Interspecies differences in biochemical, histopathological, and population responses in four wild fish species exposed to ethynylestradiol added to a whole lake”, Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 66, pp. 1920-1935.
Vesi (PCR-laatu)
Tyler (2006), “Development of chronic tests for endocrine active chemicals — Part 1.
enintään 25 μl
An extended fish early-life stage test for oestrogenic active chemicals in the fathead minnow (Pimephales promelas)”, Aquatic Toxicology 77, pp. 279-290.
Taq E -polymeraasi
Petersen, P. Jackson, K. Hylland, L. Norrgren, and P. Bjerregaard (2006), “Detection of endocrine disrupters: Evaluation of a Fish Sexual Development Test (FSDT)”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 144, pp. 57-66.
0,3 μl
Andersen, L., K. Kinnberg, H. Holbech, B. Korsgaard, and P. Bjerregaard (2004), “Evaluation of a 40 day assay for testing endocrine disrupters: Effects of an anti-estrogen and an aromatase inhibitor on sex ratio and vitellogenin concentrations in juvenile zebrafish (Danio rerio)”, Fish Physiology and Biochemistry 30, pp. 257-266.
10 × PCR-puskuri + MgCl2:
Morthorst, J.E., H. Holbech, and P. Bjerregaard (2010), “Trenbolone causes irreversible masculinization of zebrafish at environmentally relevant concentrations”, Aquatic Toxicology 98, pp. 336-343.
670 mM Tris/HCl (pH 8,8 lämpötilassa 25 °C), 160 mM (NH4)2SO4, 25 mM MgCl2, 0,1 % Tween 20
Metcalf (2003), “Effects of the antiandrogens, vinclozolin and cyproterone acetate on gonadal development in the Japanese medaka (Oryzias latipes)”, Aquatic Toxicology 63, pp. 391-403.
Jokaisessa PCR:ssä (katso kohdat 3–5 jäljempänä) tarvitaan erikoisaluke uutena yhdistelmänä reaktioseoksesta ja tarvittavasta määrästä templaatti-DNA:ta jokaista näytettä (ks. edellä) varten.
Tyler (2004), “Successful detection of (anti-) androgenic and aromatase inhibitors in pre-spawning adult fathead minnows (Pimephales promelas) using easily measured endpoints of sexual development”, Aquatic Toxicology 70, pp. 11-21.
Nämä määrät siirretään uusiin putkiin pipeteillä.
Petersen, and P. Bjerregaard (2007), “Effects of the fungicide prochloraz on the sexual development of zebrafish (Danio rerio)”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 145, pp. 165-170.
Sen jälkeen kaikki putket suljetaan ja niitä sekoitetaan (n. 10 sekuntia) ja sentrifugoidaan (10 sekuntia huoneenlämmössä).
Chapter C.14 of this Annex, Fish Juvenile Growth Test.
Tämän jälkeen voidaan käynnistää PCR-ohjelmat.
Chapter C.4 of this Annex, Ready Biodegradability.
Jokaisessa PCR-ohjelmassa käytetään lisäksi positiivista kontrollia (esimerkinomaista DNA-näytettä, jonka aktiivisuus tiedetään ja jota koskevat tulokset ovat selvät) ja negatiivista kontrollia (1 μl tislattua vettä).
Chapter C.37 of this Annex, 21-Day Fish Assay:
Agaroosigeelin (1 %) valmistaminen käynnissä olevien PCR-ohjelmien aikana:
A Short Term Screening for Oestrogenic and Androgenic Activity, and Aromatase Inhibition.
Liuota 3 g agaroosia 300 ml:aan 1 × TAE-puskuria (1 %:n agaroosigeeli).
Abbreviations and definitions
Siirrä kuuma liuos jään päällä olevaan erikoisvalulaatikkoon.
Fish wet weight (blotted dry)
→ 45 sek., 95 °C
FSDT
Jäähdytys
Fish Sexual Development Test
→ 45 sek., 56 °C
Hypothalamic-pituitary-gonadal axis
Pidentäminen
Intersex fish
→ 1 min, 68 °C
Fish with more than one oocyte in testis per 6 sections analysed or spermatogenetic cells in ovaries (yes/no)
15 min, 68 °C
Wet weight of fish per volume of water
X- ja Y-geeni-PCR-ohjelma:
Mode of action
Näytteitä, joissa DNA on ehjä, käytetään tässä PCR-ohjelmassa X- ja Y-geenien löytämiseen.
Reverse Transcriptase Polymerase Chain-Reaction
Koiraan DNA:ssa tulee näkyä yksi kaksoisnauha ja naaraan DNA:ssa yksi yksinkertainen nauha (värjäyksen ja geelielektroforeesin jälkeen).
Undifferentiated fish
Tässä ohjelmassa on käytettävä yhtä positiivista kontrollia koiraille (XY-näyte) ja yhtä naaraille (XX-näyte).
Three-spined Stickleback (Gasterostreus aculeatus)
Y-geeni-PCR-ohjelma X- ja Y-geeni-PCR-ohjelman kontrollina:
Age of test organisms at start of exposure
0,25 % bromfenolisinistä
Newly fertilised eggs (Early blastula stage)
0,25 % ksyleenisyanolia
Newly fertilised eggs
Pipetoi 1 μl värjäysliuosta jokaiseen yksittäiseen putkeen.
No. of eggs per treatment
Geelielektroforeesin aloittaminen:
Minimum 120
Valmistettu 1-prosenttinen agaroosigeeli siirretään geelielektroforeesikammioon, joka on täytetty 1 × TAE-puskurilla.
Minimum 3 (plus appropriate controls)
Jokaisesta värjätystä PCR-näytteestä pipetoidaan 10–15 μl agaroosigeelikuoppaan.
No. replicates per treatment
Erilliseen kuoppaan pipetoidaan myös 5–15 μl 1kb-Ladder-valmistetta (Invitrogen).
Minimum 4 (unless square root allocation to controls)
Aloita elektroforeesi 200 V:lla.
Live Artemia, frozen adult brine shrimp, flake food, etc.
Lopeta se 30–45 minuutin kuluttua.
It is recommended to feed twice daily
Nauhojen määrittäminen
Special fry food, live Artemia, frozen adult brine shrimp, flake food, etc.
Puhdista agaroosigeeli tislatulla vedellä.
It is recommended to feed twice daily
Laita agaroosigeeli etidiumbromidiin 15–30 minuutin ajaksi.
None unless DO concentration falls below 60 % saturation
Ota agaroosigeelistä sen jälkeen kuva UV-valolaatikossa.
None unless DO concentration falls below 70 % saturation
Lopuksi näytteet analysoidaan vertaamalla niitä positiivisen kontrollin nauhaan (tai nauhoihin) ja kokostandardiin.
Clean surface, well or reconstituted water
Lisäys 10
Test chemical exposure duration
Ohjeet kudosnäytteiden ottamiseen kolmipiikiltä (geneettisen sukupuolen määrittäminen PCR-menetelmällä)
Hatching success, Survival Gross- morphology, VTG gonadal histology, Genetic sex, Sex ratio
Kudosnäytteiden ottaminen ja DNA:n uuttaminen
Hatching success > 80 %
Jokaiselta kalalta leikataan terävillä saksilla pieni pala kudosta (10–20 mg) dorsolateraaliselta alueelta (sen jälkeen, kun pää ja pyrstö on irrotettu vitellogeniinianalyysia varten).
Post hatch survival ≥ 70 %
Kudospala laitetaan putkeen, joka joko asetetaan suoraan nestemäiseen typpeen (säilytettäväksi – 80 °C:ssa) tai siihen lisätään 70-prosenttista etanolia (kuljetusta ja myöhempää säilytystä -4 °C:ssa varten).
growth (Fish wet weight, blotted dry) > 150 mg
Sakset puhdistetaan jokaisen kalan käsittelyn jälkeen 70-prosenttisella etanolilla ja tislatulla vedellä ja kuivataan paperipyyhkeellä.
growth (Fish wet weight, blotted dry) > 75 mg
Mahdolliset etanolijäämät poistetaan imulla, ja kudos hajotetaan yön yli kestävällä proteinaasi K -käsittelyllä 400 μl:ssa ATL-puskuria (Qiagen).
growth (Fish wet weight, blotted dry) > 120 mg
Alikvootti (200 μl) kudosjätteestä siirretään 96-kuoppaiseen S-blokkiin (Qiagen), ja DNA uutetaan 96-kuoppaiseen formaattiin käyttämällä Qiagen Universal BioRobotia ja QIamp Investigator BioRobot -menetelmää.
Length (standard length) > 20mm
DNA eluoidaan 50 μl:ssä vettä, jossa ei ole deoksiribonukleaasia eikä ribonukleaasia.
Length (standard length) > 14 mm
Jos DNA:n uuttamisessa käytetään kovaa kudosta (kuten selkärankaa tai rintaevää), näyte voi olla tarpeen homogenisoida lyysipuskurissa käyttämällä FastPrep®-laitetta tai muuta vastaavaa kudoksen hajottamismenetelmää.
Length (standard length) > 20 mm
Vaihtoehtoisesti voidaan toimia myös seuraavilla tavoilla:
Sex ratio (% males or females) 30 %-70 %
Kudos hajotetaan yön yli kestävällä proteinaasi K -käsittelyllä 400 μl:ssä G2-lyysipuskuria (Qiagen), ja DNA uutetaan 200 μl:sta kudosjätettä käyttämällä joko EZ 1 DNA Easy Tissue Kit -pakettia ja EZ 1 -biorobottia tai DNA Easy Tissue Mini Kit -pakettia.
Chemical characteristics of an acceptable dilution water
DNA eluoidaan 50 μl:n tilavuuteen.
CONCENTRATION
Kudokset käsitellään DNAzol-reagenssilla.
Particular matter
Kudosnäytteet hajotetaan pitämällä niitä 1 ml:ssa DNAzolia 10 minuutin ajan 1,5 ml:n mikrosentrifugiputkessa, minkä jälkeen niitä sentrifugoidaan (13000 kierrosta minuutissa) viiden minuutin ajan hiukkasaineksen poistamiseksi.
From test method C.14/Guidance on test concentrations
Näin hajotettu näyte laitetaan sen jälkeen uuteen 1,5 ml:n mikrosentrifugiputkeen, joka sisältää 500 μl molekyylibiologisesti puhdasta 100-prosenttista etanolia.
Column (Number of concentrations between 100 and 10, or between 10 and 1) [1]
Putkea sentrifugoidaan 13000 kierroksen nopeudella 10 minuutin ajan DNA:n saostamiseksi.
A series of three (or more) successive concentrations may be chosen from a column.
Etanoli poistetaan ja sen tilalle laitetaan 400 μl molekyylibiologisesti puhdasta 70-prosenttista etanolia.
Mid-points between concentrations in column (x) are found in column (2x + 1).
Tämän jälkeen putkea sentrifugoidaan taas 13000 kierroksen nopeudella viiden minuutin ajan, ja DNA-pelletti liuotetaan 50 μl:aan puhdasta vettä, jossa ei ole deoksiribonukleaasia eikä ribonukleaasia.
The values listed can represent concentrations expressed as percentage per volume or weight (mg/l or μg/l).
Jos käytetään kovia kudoksia (rintaevää), näyte voi tässäkin olla tarpeen homogenisoida lyysipuskurissa käyttämällä FastPrep®-laitetta tai muuta vastaavaa kudoksen hajottamismenetelmää ennen DNA:n uuttamista.
Values can be multiplied or divided by any power of 10 as appropriate.
DNA:ta säilytetään -20 °C:ssa käyttöön saakka.
Column 1 might be used if there was considerable uncertainty on the toxicity level.
Näiden käsittelyjen aikana on käytettävä suojakäsineitä.
Guidance for homogenisation of head & tail from juvenile zebrafish, fathead minnow, three spined stickleback and Japanese medaka
Polymeraasiketjureaktion (PCR:n) analyysi
The purpose of this section is to describe the procedures that occur prior to the quantification of the VTG concentration.
Monistukset tehtiin käyttämällä 2,5 μl DNA-uutetta 50 μl:ssa reaktiotilavuutta Idh-paikka-alukkeiden avulla (ks. tarkempi kuvaus julkaisusta Peichel et al., 2004.
Other procedures that result in comparable VTG quantification can be used.
Current Biology 1:1416–1424):
The samples are placed on ice until centrifugation at 4 °C at 50000 g for 30 min.
Reaktioseoksen valmistus (50 μl näytettä kohti):
Use a pipette to dispense portions of 20 to 50 μl (note the amount) supernatant into at least two tubes by dipping the tip of the pipette below the fat layer on the surface and carefully sucking up the supernatant without fat- or pellet fractions.
Master mix -reaktioseos valmistetaan jäljempänä kuvatulla tavalla.
Place on ice during use
Seos voidaan valmistaa etukäteen ja säilyttää käyttöön saakka jäädytettynä – 20 °C:ssa.
Homogenisation buffer:50 mM Tris-HCl pH 7,4;
Valmista master mix -seosta tarpeeksi myös negatiivista kontrollia varten (vain molekyylibiologisesti puhdas vesi).
TRIS-ULTRA PURE (ICN)Protease inhibitor cocktail:
Nukleotidit (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Purified zebrafish vitellogenin standard [1] is serially diluted to 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10 and 20 ng/ml in dilution buffer (**) and samples are diluted at least 200 times (to prevent matrix effect) in dilution buffer and applied to the plates.
0,5 μl (0,1 nmol/μl)
An assay control is applied in duplicate.
Taka-aluke
150 μl are applied to each well.
2,0 μM
Standards are applied in duplicate and samples in triplicate.
Molekyylibiologisesti puhdas vesi
Incubate over night at 4 °C on a shaker.
GoTaq-polymeraasi
The plates are washed 5 times with washing buffer (*)
Laita 47,5 μl liuosta ohutseinäiseen 0,5 ml:n PCR-putkeen, jossa on etiketti.
HRP coupled to a dextran chain (e.g. AMDEX A/S, Denmark) and conjugated antibodies are diluted in washing buffer;
Lisää 2,5 μl puhdistettua DNA:ta asianmukaisesti merkittyyn putkeen.
Actual dilution differs by batch and age.
Toista menettely kaikkien näytteiden ja negatiivisen kontrollin osalta.
150 μl are applied to each well and the plates are incubated for 1 hour at room temperature on a shaker.
Lisää putkiin kaksi tippaa mineraaliöljyä.
The plates are washed 5 times with washing buffer (*) and the bottom of the plates is carefully cleaned with ethanol.
Vaihtoehtoisesti voit käyttää PCR-laitetta, jossa on lämpökansi.
150 μl TMB plus (***) are applied to each well.
Sulje kannet.
Protect the plate against light with tinfoil, and watch the colour development on a shaker.
Näytteitä denaturoitiin Peltier PTC-225 -laitteessa 94 ± 2 °C:n lämpötilassa viisi minuuttia, sen jälkeen 39 sykliä 94 ± 2 °C:ssa 1 minuutti, 55 ± 2 °C:ssa 1 minuutti, 72 ± 2 °C:ssa 1 minuutti ja lopullinen pidentäminen 72 ± 2 °C:ssa 10 minuutin ajan.
When the standard curve is fully developed the enzyme activity is stopped by adding 150 μl 0,2 M H2SO4 to each well.
Agaroosigeelin (2 %) valmistaminen:
The absorbance is measured at 450 nm (e.g. on a Molecular Devices Thermomax plate reader).
Tavallisesti PCR-tuotteet analysoidaan 20-prosenttisessa agaroosigeelissä, joka sisältää etidiumbromidia.
Data are analysed on the associated software (e.g. Softmax).
Myös kapillaaripohjaista elektroforeesijärjestelmää voi käyttää.
Washing buffer:
Mittaa 2 g agaroosia 100 ml:aan 1 × TAE-puskuria.
PBS-stock (****)
Kuumenna liuos mikroaaltouunissa (n. 2–3 min), jotta agaroosi liukenee.
Adjust pH to 7,3 and fill to 5 l with millipore H2O.
Lisää kaksi tippaa etidiumbromidia (lopullinen pitoisuus 0,5 μg/ml).
Store at 4 °C.
Siirrä kuuma liuos geelivalulaitteeseen.
Dilution buffer:
Anna geelin kovettua.
PBS-Stock (****)
Geelielektroforeesi
Adjust pH to 7,3 and fill to 1 l with millipore H2O.
Laita agaroosigeeli elektroforeesilaitteeseen ja upota se 1 × TAE-puskuriin.
TMB plus is a “ready-to-use” substrate produced by KemEnTec (Denmark).
Laita 20 μl jokaisesta näytteestä erilliseen kuoppaan ja lisää molekyylipainomarkkeria (100 emäsparin DNA-kokostandardi, Promega) tyhjään kuoppaan.
It is sensitive to light.
Elektroforeesi tehdään 120 V:lla ja se kestää 30–45 minuuttia.
PBS stock
Monistustuotteiden visualisointi
HPO4 · 2H2O
Jos agaroosigeeliin lisättiin etidiumbromidia edellä kuvatun mukaisesti, DNA-tuotteet näkyvät UV-valon avulla.
Adjust pH to 6,8 and fill with millipore H2O to 2 l.
Toinen tapa värjätä agaroosigeeli on peittää geeli laimennetulla etidiumbromidiliuoksella (0,5 μg/ml vedessä) 30 minuutin ajaksi ennen visualisointia.
Store at room temperature.
Lisäys 11
Battelle AP4.6.04 (1,18 mg/ml (AAA)), purified according to:
Ohjeet kolmipiikin keinohedelmöitysmenettelyä varten
Guidance for the preparation of tissue sections for sex determination and staging of gonads
Tässä kohdassa kuvataan menetelmät, joiden avulla kolmipiikiltä saadaan hedelmöityneitä munasoluja, jotta niitä voidaan käyttää FSDT-tutkimuksessa.
The purpose of this section is to describe the procedures that occur prior to the evaluation of histological sections.
Menettelyt
Other procedures that result in similar sex determination and gonadal staging can be used.
Maidin ottaminen koirailta
With a few exceptions, these procedures are similar for Japanese medaka (JMD) and zebrafish (ZF).
Hyvänvärinen koiras toivotusta populaatiosta lopetetaan.
Euthanasia, Necropsy, and Tissue Fixation
Kivekset irrotetaan kalan kummaltakin puolelta.
Objectives:
Kivekset ovat yleensä voimakkaasti pigmentoituneita sauvan muotoisia rakenteita, jotka näkyvät selvästi ruumiin sivuittaisella keskiviivalla.
Provide for the humane sacrifice of fish.
Käytä jompaakumpaa seuraavista menetelmistä:
Obtain necessary body weights and measurements.
Käytä teräviä saksia.
Evaluate secondary sex characteristics.
Aloita yhteissuolen kohdalta ja tee 1–1,5 cm:n pituinen viilto yhdellä leikkauksella noin 45 asteen kulmassa.
Dissect tissues for VTG analysis.
Tee skalpellilla pieni viilto kalan kylkeen hieman lantion takapuolelta ja juuri ennen kylkipanssareita.
Fixation of the gonads.
Irrota kivekset pienillä pinseteillä ja laita ne petrimaljaan.
Fish should be sacrificed immediately prior to necropsy.
Kivekset leikataan pieniksi paloiksi käyttämällä partaterää tai skalpellia.
Therefore, unless multiple prosectors are available, multiple fish should not be sacrificed simultaneously.
Näin maiti pääsee kiveksistä ulos, ja HBSS-liuos muuttuu maitomaiseksi.
Using the small dip net, a fish is removed from the experimental chamber and transported to the necropsy area in the transport container.
Maitia sisältävä neste laitetaan putkeen, ja pipetoitaessa on yritettävä välttää kiveskudoksen joutumista mukaan.
The fish is removed from the solution when there is cessation of respiration and the fish is unresponsive to external stimuli.
Tarvittaessa koiraskalan voi säilöä kiinnittämällä se 100-prosenttisella etanolilla tai muulla halutulla kiinnitysaineella.
The fish is wet weighed.
Tämä on tärkeää etenkin silloin, jos tutkimuksessa tarkastellaan jälkeläisten alkuperää.
For preparation of tissues for VTG analysis, the fish can be placed on a corkboard on the stage of a dissecting microscope.
vaikka useimmat tarvittavat varastoliuokset voidaan tehdä etukäteen, varastoliuos 5 ja lopullinen liuos on valmistettava tuoreena sinä päivänä, kun ne käytetään.
For zebrafish the head is cut right behind the pectoral fin and tail is cut right behind the dorsal fin.
Varastoliuos 1
For Japanese medaka the abdomen is opened via a carefully made incision that extends along the ventral midline from the pectoral girdle to a point just cranial to the anus.
Tislattu vesi (TV)
Using the small forceps and small scissors, the liver is carefully removed.
Varastoliuos 2
Specimen for VTG analysis are placed in eppendorf tubes and immediately frozen in liquid nitrogen.
HPO4 (vedetön)
The carcass including the gonads is placed into a pre-labelled plastic tissue cassette, which is transferred into Davidson's or Bouin's fixative.
Varastoliuos 3
The volume of fixative should be at least 10 times the approximated volume of the tissues.
Varastoliuos 4
The fixative container is gently agitated for five seconds to dislodge air bubbles from the cassette.
Varastoliuos 5 (tuore)
All tissues remain in Davidson's fixative overnight, followed by transfer to individual containers of 10 % neutral buffered formalin the next day.
Jos sinulla on jo joitakin edellä mainituista suoloista mutta jos niiden vesipitoisuus on eri (esimerkiksi 2H2O vedettömän sijasta), voit käyttää niitä, kunhan mukautat ensin painon molekyylipainon perusteella.
Containers with cassettes are gently agitated for 5 seconds to ensure adequate penetration of formalin into cassettes.
Noudata Hankin lopullisen liuoksen osalta seuraavaa järjestystä:
Tissues remain in Bouins fixative for 24 h, followed by transfer to 70 % ethanol.
Varastoliuos 1
Dehydrate tissue for adequate penetration of paraffin.
Varastoliuos 3
Impregnate the tissue with paraffin to maintain tissue integrity and create a firm surface for microtomy.
Varastoliuos 4
Labelled tissue cassettes are removed from formalin/ethanol storage and the cassettes are placed in the processing basket(s).
Varastoliuos 5
The processing basket is loaded in the tissue processor.
Sekoita hyvin ennen käyttöä.
The processing schedule is selected.
Hedelmöitys
After the tissue processor has completed the processing cycle, the basket(s) may be transferred to the embedded station.
Halutusta populaatiosta valitaan suuria, kutevia naaraita.
Embedding
Niistä voi ottaa mätiä vasta, kun näet, että yhteissuolesta työntyy ulos mätimunia.
Objective:
Valmiit naaraat tunnistaa siitä, että ne uivat pää ylöspäin.
Properly orient the specimen in solidified paraffin for microtomy.
Painele kalaa varovasti sormella tai peukalolla kyljestä pyrstöä kohti, jotta se laskee munapussin puhtaaseen petrimaljaan.
The basket(s) of cassettes is/are removed from the processor and immersed in the paraffin-filled front chamber of the embedding station thermal console or the cassettes are moved to a separate paraffin heater.
Toista menettely kalan toiselle kyljelle ja laita kala takaisin omaan säiliöönsä.
The first cassette to be embedded is removed from the front chamber of the thermal console or the paraffin heater.
Munat voidaan levittää (yhteen kerrokseen) käyttämällä hienoharjaksista sivellintä.