natgillin/translations-raw huggingface dataset:
The cassette lid is removed and discarded, and the cassette label is checked against the animal records to resolve potential discrepancies prior to embedding.
On tärkeää, että mahdollisimman paljon munia altistuu maidille.
An appropriately sized embedding mould is selected.
Tässä auttaa munien levittäminen mahdollisimman suurelle alalle.
The mould is held under the spout of the dispensing console and filled with molten paraffin.
Pidä munat kosteina peittämällä ne kauttaaltaan kostealla liinalla (on tärkeää, etteivät munat kosketa suoraan veteen, koska se voi kovettaa suonikalvon ennenaikaisesti, jolloin hedelmöityminen estyy).
The specimen is removed from the cassette and placed in the molten paraffin in the mould.
Se, miten paljon munia kukin naaras voi tuottaa, vaihtelee suuresti, mutta yhdeltä kutevalta naaraalta pitäisi saada helposti keskimäärin 150 munaa.
This is repeated with 4-8 specimens for each paraffin mould.
Munien pinnalle levitetään siveltimellä tasaisesti 25μl Hankin seoksessa olevaa maitia.
The position of individual fish is marked by putting fish no 1 in 180 degrees to fish 2-4/8.
Kun hedelmöittyminen on alkanut, munat kovettuvat nopeasti ja muuttavat väriään (minuutin kuluessa).
Additional paraffin is added to cover the specimen.
Jos munien arvioitu määrä on yli 150, toista menettely.
The mould with the cassette base is placed on the cooling plate of the cryo console.
Jos munat eivät kovetu minuutissa, lisää maitia hieman.
After the paraffin has solidified, the block (i.e., the hardened paraffin containing the tissues and the cassette base) is removed from the mould.
jos maitia lisätään paljon, se ei välttämättä paranna hedelmöittymisastetta.
Microtomy
Munien ja maitinesteen on annettava olla ’vuorovaikutuksessa’ vähintään 15 minuuttia, ja hedelmöityneet munat on asetettava altistusakvaarioihin 1,5 tunnin kuluessa hedelmöittymisen jälkeen.
Cut and mount histological sections for staining.
Menettely toistetaan käyttämällä toista naarasta, kunnes haluttu määrä munia on saatu.
The initial phase of microtomy termed “facing” is conducted as follows:
Säästä muutama muna viimeisestä erästä ja kiinnitä ne 10-prosenttiseen etikkahappoon.
The paraffin block is placed in the chuck of the microtome.
Munien laskeminen ja jakaminen testausakvaarioihin
The chuck is advanced by rotating the microtome wheel and thick sections are cut from the paraffin surface of the block until the knife reaches the embedded tissues.
Munat tulee jakaa tasaisesti jokaiseen käsittelytasoon geneettisten poikkeamien välttämiseksi.
The section thickness on the microtome is set between 3 - 5 microns.
Jokainen erä hedelmöityneitä munia on eroteltava yhtä suuriin ryhmiin (joita on yhtä monta kuin käsittelytasoja) käyttämällä tylppäkärkistä instrumenttia (esimerkiksi leveäteräisiä hyönteispinsettejä tai rengaspäistä inokulointi-instrumenttia).
The chuck is advanced and multiple sections are cut from the block to remove any artefacts created on the cut surface of the tissue during rough trimming.
Jos tarvitset neljä rinnakkaisnäytettä käsittelyä kohti ja jos jokaisessa käsittelyssä on 20 munaa, yhteen altistusakvaarioon on siis jaettava 80 munaa.
The block can be removed from the chuck and placed facedown on ice to soak the tissue.
munia kannattaa lisätä 20 prosenttia enemmän (ts. 96 munaa käsittelytasoa kohti), kunnes olet varma, että hedelmöitysaste on 100 prosenttia.
The next phase of microtomy is final sectioning and mounting of tissue sections on slides.
Kolmipiikin munat ovat hyvin herkkiä sieni-infektioille koiraskalan vartioiman pesän ulkopuolella.
These procedures are conducted as follows:
Tämän vuoksi on erittäin tärkeää, että kaikki munat käsitellään metyleenisinellä testin viiden ensimmäisen päivän aikana.
If the block has been placed on ice, the block is removed from the ice and replaced in the chuck of the microtome.
Metyleenisinestä valmistetaan varastoliuos, jonka vahvuus on 1 mg/ml, ja se lisätään altistusakvaarioihin, jolloin lopullinen enimmäispitoisuus on 2,125 mg/l.
With the section thickness on the microtome set to 3 - 5 microns, the chuck is advanced by rotating the microtome wheel.
kolmipiikit eivät saa altistua metyleenisinelle kuoriutumisen jälkeen, eikä järjestelmässä saa olla metyleenisineä päivästä 6 alkaen.
Sections are cut from the block until a “ribbon” containing at least one acceptable section including the gonads has been produced.
Munat tutkitaan päivittäin, ja kaikki kuolleet tai hedelmöittymättömät munat kirjataan muistiin.
(As necessary during sectioning, the block may be removed from the chuck, placed on ice to soak the tissue, and replaced in the chuck.)
ennen kuoriutumista munia ei saa ottaa pois vedestä edes lyhyeksi aikaa.
The sections are floated flat on the surface of the water in the water bath.
Hank's Buffered Salt Solution (Hankin puskuroitu suolaliuos, HBSS):HBSS:ää tarvitaan maidin säilömiseen hedelmöitystä valmisteltaessa.
An attempt is made to obtain at least one section that contains no wrinkles and has no air bubbles trapped beneath it.
C.42 BIOHAJOAVUUS MERIVEDESSÄ
A microscope slide is immersed beneath the best section, which is lifted out of the water using the slide.
YLEISJOHDANTO
This process is referred to as “mounting” the section on the slide.
Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta (TG) nro 306 (1992).
Three sections are prepared for a set of fish.
Kun alkuperäisiä testimenetelmiä laadittiin, ei tiedetty, miten nopeaa biohajoavuutta koskevien seulontatutkimusten, joissa siirrosaineen lähteinä käytettiin makeaa vettä sekä jätevettä tai aktiivilietettä, tuloksia voitaisiin soveltaa meriympäristöön.
The second and third sections are taken at 50 micron intervals following the first section.
Vaihtelevia tuloksia on raportoitu (esimerkiksi (1)).
If the fish are not embedded with their gonads in the same sectioning level, more sections are to be made to ensure that at least six sections including the gonads are obtained from each fish.
Monet teollisuuden jätevedet, jotka sisältävät erilaisia kemikaaleja, päätyvät mereen joko suorina päästöinä tai suistoalueilta tai joista, joissa viipymisajat ovat lyhyitä verrattuna siihen aikaan, jota monien kemikaalien täydellinen biohajoaminen edellyttää.
With a slide-marking pen, the block number from which the slide was produced is recorded on the slide.
Koska tietoisuus tarpeesta suojella meriympäristöä alati kasvavalta kemikaalikuormitukselta ja tarpeesta arvioida merien todennäköinen kemikaalipitoisuus lisääntyy, on kehitetty testimenetelmiä, joilla tutkitaan biohajoavuutta merivedessä.
The slide is placed in a staining rack.
Tässä luvussa kuvatuissa menetelmissä käytetään luonnollista merivettä sekä vesifaasina että mikro-organismien lähteenä.
The block is removed from the chuck and placed facedown for storage.
Koska tavoitteena oli, että menetelmät olisivat yhdenmukaisia nopeaa biohajoavuutta makeassa vedessä koskevien menetelmien kanssa, tutkittiin ultrasuodatetun ja sentrifugoidun meriveden sekä merisedimenttien käyttöä siirrosaineen lähteenä.
Staining, Cover slipping, and Slide Labelling
Nämä tutkimukset eivät kuitenkaan onnistuneet.
Stain the sections for histopathological examination
Sen vuoksi testiaineena käytetään luonnollista merivettä, joka on esikäsitelty suurhiukkasten poistamiseksi.
Permanently seal mounted and stained tissues.
Jotta lopullista biohajoavuutta voidaan arvioida ravistuspullomenetelmällä, testiainetta on käytettävä melko suurina pitoisuuksina, koska liuennutta orgaanista hiiltä (DOC) koskevan analyysimenetelmän herkkyys on vähäinen.
Permanently identify stained sections in a manner that allows complete traceability.
Tämän vuoksi meriveteen on lisättävä mineraaliravinteita (N ja P), joiden pienet pitoisuudet rajoittaisivat muutoin liuenneen orgaanisen hiilen poistumista.
Staining
Myös suljetun pullon menetelmässä veteen on lisättävä ravinteita lisätyn testiaineen pitoisuuden vuoksi.
Slides are air-dried overnight before staining.
Näin ollen menetelmillä ei voida testata nopeaa biohajoavuutta, koska meriveteen ei lisätä siirrosainetta siinä jo olevien mikro-organismien lisäksi.
The sections are stained by Hematoxylin-Eosin.
Testeillä ei myöskään simuloida meriympäristöä, koska veteen lisätään ravinteita ja koska testiaineen pitoisuus on hyvin paljon suurempi kuin se olisi meressä.
Cover slipping
Näistä syistä menetelmien kuvaamiseksi ehdotetaan uutta alakohtaa ’Biohajoavuus merivedessä’.
Cover slips can be applied manually or automatically.
SOVELTAMINEN
A slide is dipped in xylene or TissueClear, and the excess xylene/TissueClear is gently knocked off the slide.
Niiden testien, joita sovelletaan, kun tutkittavan aineen käyttötavat ja hävittäminen osoittavat sitä joutuvan mereen, tuloksista saadaan alustavaa tietoa aineen biohajoavuudesta merivedessä.
Approximately 0,1 ml of mounting medium is applied near the end of the slide opposite to the frosted end or on the cover slip.
Jos tulos on positiivinen (liuenneen orgaanisen hiilen poistuminen >70 %; teoreettinen hapenkulutus ThOD >60 %), voidaan päätellä, että biohajoaminen meriympäristössä on mahdollista.
The cover slip is tilted at a shallow angle as it is applied to the slide.
Negatiivinen tulos ei kuitenkaan tarkoita, että tämä mahdollisuus olisi poissuljettu, vaan se osoittaa, että tarvitaan lisätutkimuksia, joissa esimerkiksi käytetään testiaineesta mahdollisimman pientä pitoisuutta.
Labelling
Jos biohajoavuusasteesta merivedessä tietyssä paikassa tarvitaan jommassakummassa tapauksessa kuitenkin tarkempi arvo, on sovellettava monimutkaisempia ja kehittyneempiä ja siksi myös kalliimpia menetelmiä.
Each slide label should contain the following information.
Esimerkiksi voidaan soveltaa simulaatiotestiä, jossa testiaineesta käytetään todennäköistä ympäristöpitoisuutta lähempänä olevaa pitoisuutta.
Laboratory name
Myös tietystä paikasta otettua rikastamatonta esikäsittelemätöntä merivettä voidaan käyttää, ja primaarinen biohajoavuus voidaan määrittää tietyllä kemiallisella analyysilla.
Specimen No./Slide No.
Lopullisen biohajoavuuden määrittämisessä 14C--leimatut aineet ovat tarpeen, jotta voidaan mitata liukenevan orgaanisen 14C:n häviämisnopeus ja 14CO2:n tuotanto ympäristön kannalta realistisina pitoisuuksina.
Chemical/Treatment group
MENETELMIEN VALINTA
Statistical Flow Chart for vitellogenin analysis
Käytettävän menetelmän valinta määräytyy useiden tekijöiden perusteella.
Dunnett test
Seuraava taulukko on tarkoitettu avuksi menetelmän valintaan.
variances stabilising transform?
Koska aineita, joiden vesiliukoisuus on vähemmän kuin noin 5 mg C/l, ei voida testata ravistuspullomenetelmällä, ainakin huonosti liukenevia aineita voidaan periaatteessa testata suljetun pullon menetelmällä.
Variances unequal Variances equal No Yes
Taulukko
Yes Step-down trend test on replicate means
Ravistuspullo- ja suljettu pullo -testin edut ja haitat
<=3 reps per conc
III MENETELMÄ
Normalising transform?
EDUKSI KATSOTTAVAT OMINAISUUDET
Nested ANOVA not normal
HAITAT
Nested ANOVA normal Monotone
RAVISTUS-PULLO
Drop water control
yksinkertainen laitteisto hiilianalysaattoria lukuun ottamatta
Dunn test
60 päivän kesto ei ongelmallinen
Step-down Jonckheere or Williams' test
ei häiriötä nitrifikaatiosta
Rep means not normal or not homogenous
voidaan mukauttaa haihtuville aineille
Rep means not normally distributed
tarvitaan hiilianalysaattori
Combine controls, retains subgroups
käyttää 5–40 mg liuennutta orgaanista hiiltä litrassa, mahdollinen inhibitiovaikutus
Compare controls using Wilcoxon or T-test.
liuenneen orgaanisen hiilen määrittäminen vaikeaa, kun pitoisuudet merivedessä ovat pienet (kloridivaikutus)
Do controls differ?
liuenneen orgaanisen hiilen pitoisuus joskus suurempi merivedessä.
Both solvent and non-solvent control are present
SULJETTU PULLO
Statistical Flow Chart for sex ratio analysis
yksinkertainen laitteisto
Apply step-down Jonckheere-Terpstra test (+) to determine NOEC
yksinkertainen loppumääritys
Dunn or Mann-Whitney U-test w/Bonferroni-Holm adjustment to determine NOEC
käyttää testiaineesta pieniä pitoisuuksia (2 mg/l), jolloin inhibition mahdollisuus on pienempi
Use Dunnett test if homogenous variances (*), Tamhane-Dunnett (T3) test otherwise, to determine NOEC
helposti mukautettavissa haihtuville aineille
Are data normally distributed?
pullojen ilmatiiviyden säilyttäminen voi olla hankalaa
Are data consistent with monotone dose-response?
seinämien bakteerikasvu voi johtaa vääriin arvoihin
(‡) Or other agreed control selection
puhtaan O2:n kertymäarvot voivat olla suuret etenkin 28 päivän kuluttua;
After arcsin square-root transform
mahdollisesti ratkaistavissa merivettä vanhentamalla
(+) With fewer than 5 experimental units per treatment exact J-T or M-W test should be used if available
mahdollinen häiriö nitrifikaation aiheuttamasta O2-kertymästä.
Combine controls
RAVISTUSPULLOMENETELMÄ
Drop water control (‡)
Tämä menetelmä on merivedelle tarkoitettu muunnos OECD:n muokatusta seulontatestistä, joka on kuvattu tämän liitteen luvussa C.4B (2).
Compare controls using t-Test.
Se viimeisteltiin rengastestissä, jonka tanskalainen vedenlaatua tutkiva laitos järjesti Euroopan komission puolesta (3).
Is solvent used?
Kuten merivedellä tehtävässä suljettu pullo -menetelmässä, myöskään tämän testin tuloksia ei tule pitää merkkeinä nopeasta biohajoavuudesta, vaan niitä on käytettävä pikemminkin keinona hankkia tietoa aineiden biohajoavuudesta meriympäristössä.
Appendix 9
Ennalta määritetty määrä testiainetta liuotetaan testiväliaineeseen siten, että liuenneen orgaanisen hiilen pitoisuudeksi saadaan 540 mg.
Guidance for tissue sampling for genetic sex determination and for genetic sex determination by PCR-method
Jos orgaanisen hiilen analyysien herkkyysrajat paranevat, testiaineen käyttämisestä pienempinä pitoisuuksina voi olla hyötyä etenkin sellaisten aineiden kannalta, joilla on inhiboivia ominaisuuksia.
Tissue sampling, preparation and storage before determination of genetic sex by PCR-method in medaka (Prepared by the Laboratory for Aquatic Organisms of Bayer CropScience AG)
Testiväliaineessa olevaa testiaineliuosta inkuboidaan hämmentämällä pimeässä tai hajavalossa aerobisissa olosuhteissa kiinteässä lämpötilassa (vaihteluväli ± 2 °C), joka on yleensä 15–20 °C.
With fine scissors the anal or the dorsal fin will be cut off in each individual fish and placed into a tube filled with 100 μl of extraction-buffer 1 (details on buffer preparation see below).
Kun tutkimuksen tavoitteena on simuloida ympäristötilanteita, testit voidaan tehdä tämän normaalin lämpötila-alueen ulkopuolellakin.
The scissors will be cleaned after each single fish in a beaker filled up with distilled H2O and dried with a paper tissue.
Testin suositeltu enimmäiskesto on noin 60 päivää.
Now the fin-tissues will be homogenised by a micro tube teflon pistil for the lysis of cells.
Hajoamista arvioidaan mittaamalla liuenneen orgaanisen hiilen pitoisuus (lopullinen hajoaminen) ja joissakin tapauksissa tekemällä ominaisanalyysi (primaarinen hajoaminen).
For each tube a new pistil will be used to prevent any contaminations.
Jotta tiedetään, voidaanko testiä soveltaa tiettyyn aineeseen, sen joidenkin ominaisuuksien on oltava tiedossa.
The pistils will be placed overnight in 0,5 M NaOH, rinse for 5 minutes in distilled H2O and stored in ethanol or sterile after autoclave until use.
Aineen orgaanisen hiilen pitoisuus on määritettävä, ja sen haihtuvuuden on oltava sellainen, ettei merkittävää häviötä tapahdu testin aikana.
It is also possible to store the fin tissue without any extraction-buffer 1 on dry-ice and then at – 80 °C refrigerator to prevent any degeneration of the DNA.
Lisäksi sen vesiliukoisuuden on oltava suurempi kuin 2540 mg C/l.
But the extraction runs better, if you extract the DNA at the same time (handling see above; samples should be thawed on ice after storaging at – 80 °C before the buffer will be filled in the tubes).
Testiaine ei saa myöskään imeytyä lasipintoihin merkittävästi.
After homogenizing all tubes will be placed in a water bath and boiled for 15 minutes at 100 °C.
Tiedot testiaineen tärkeimpien ainesosien puhtaudesta tai niiden suhteellisista osuuksista ovat tarpeen, jotta saatuja tuloksia voidaan tulkita, etenkin jos tulos on lähellä hyväksyttävää raja-arvoa.
Then 100 μl of the extraction buffer 2 (details on buffer preparation see below) will be pipetted into each tube.
Tieto testiaineen myrkyllisyydestä bakteereille, esimerkiksi mitattuna lyhytaikaisissa soluhengitystesteissä (4), voi olla hyödyllinen asianmukaisia testipitoisuuksia valittaessa, ja se voi olla olennainen pienten biohajoavuusarvojen oikean tulkinnan kannalta.
The samples will be stored at room temperature for 15 minutes and in the meantime they will be sometimes gently shaken by hand.
Nämä tiedot eivät kuitenkaan aina riitä biohajoavuustesteistä saatujen tulosten tulkintaan, ja 18 kohdassa kuvattu menettely voi olla sopivampi.
Afterwards all tubes will be placed in the water bath again and boiled for another 15 minutes at 100 °C.
Sopivia vertailuaineita on käytettävä, jotta merivesinäytteen mikrobien toiminta voidaan tarkistaa.
Until further analysis the tubes will be frozen at – 20 °C.
Esimerkkejä tähän tarkoitukseen sopivista aineista ovat natriumbentsoaatti, natriumasetaatti ja aniliini.
Buffer preparation
Vertailuaineiden tulee hajota suhteellisen lyhyen ajan kuluessa; muutoin on suositeltavaa toistaa testi käyttämällä toista merivesinäytettä.
PCR-buffer 1:
Euroopan komission rengastestissä, jossa merivesinäytteitä otettiin eri paikoista ja eri aikoina vuodesta (3), natriumbentsoaatin osalta lag-vaihe (tL) oli 1–4 päivää ja 50 prosentin biohajoamisen saavuttamiseen tarvittu aika (t50), lag-vaihe pois lukien, oli 1–7 päivää.
500 mg N-Lauroylsarcosine (e.g. Merck KGaA, Darmstadt, GE)
Aniliinin osalta tL vaihteli välillä 0–10 päivää, kun taas t50 vaihteli välillä 1–10 päivää.
ad 100 ml dest.
MENETELMÄN TOISTETTAVUUS JA HERKKYYS
→ autoclave
Menetelmän toistettavuus todettiin rengastestissä (3).
PCR-buffer 2:
Testiaineen pienin pitoisuus, jota varten tätä menetelmää voidaan käyttää DOC-analyysin kanssa, määräytyy pitkälti orgaanisen hiilen analyysissa mahdollisen havaitsemisrajan (tällä hetkellä noin 0,5 mg C/l) sekä käytetyssä merivedessä olevan liuenneen orgaanisen hiilen pitoisuuden (avomereltä otetussa vedessä yleensä suunnilleen 35 mg/l) perusteella.
20 g Chelex (e.g. Biorad, Munich, GE)
Liuenneen orgaanisen hiilen taustapitoisuus saisi olla enintään 20 prosenttia liuenneen orgaanisen hiilen kokonaispitoisuudesta testiaineen lisäämisen jälkeen.
To swell in 100 ml dest.
Jos tämä ei ole mahdollista, liuenneen orgaanisen hiilen taustapitoisuutta voi joskus pienentää vanhentamalla merivettä ennen testausta.
Determination of genetic sex (by PCR-method) in medaka (Prepared by the Laboratory for Aquatic Organisms of Bayer CropScience AG and Universität Würzburg Biozentrum)
Jos menetelmää käytetään ainoastaan tietyn kemiallisen analyysin kanssa (jolla mitataan primaarinen hajoaminen), tutkijan on dokumentoitava (lisätietoja antamalla), onko lopullinen hajoaminen odotettavissa.
The prepared and frozen tubes (described in the above section) will be thawed on ice.
Nämä lisätiedot voivat koostua muista nopeaa tai luontaista biohajoavuutta koskevista testeistä saaduista tuloksista.
After that, they will be centrifuged using an Eppendorf centrifuge (30 sec at max. speed, at room temperature).
Tavallinen laboratoriolaite ja lisäksi:
For the PCR, the clear supernatant separated from the precipitate will be used.
a. ravistuskone, johon mahtuu 0,52 litran Erlenmeyer-pulloja ja jossa on joko automaattinen lämpötilansäätö tai jota käytetään huoneessa, jonka vakiolämpötila on 15–20 °C (vaihteluväli ± 2 °C)
It has absolutely to be avoided that any traces of Chelex (localized in the precipitate) are transferred to the PCR reaction, because this will interfere with the “Taq”-polymerase activity.
b. kapeakaulaisia 0,52 litran Erlenmeyer-pulloja
The supernatant will be used directly or can be stored frozen (at – 20 °C) and rethawed again in several cycles without negative impact on the DNA for later analyses.
c. kalvosuodatin tai sentrifugi
Preparation of the “Reaction Mix” (25 μl per sample):
d. kalvosuodattimia (0,2-0–0,45 μm)
Volume
e. hiilianalysaattori
Final Concentration
f. ominaisanalyysia varten tarvittava laitteisto (valinnainen).
Template DNA
Merivesi
0,5μl-2μl
Kerää merivesinäyte huolellisesti puhdistettuun säiliöön ja kuljeta se laboratorioon mieluiten yhden tai kahden päivän kuluessa keräämisestä.
buffer with MgCl2
Kuljetuksen aikana näytteen lämpötila ei saa ylittää testissä käytettävää lämpötilaa kovin paljoa.
2,5μl
Määritä näytteenottopaikka tarkasti ja kuvaa myös sen saastumis- ja ravinnetilaa.
Nucleotides (each of dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Sisällytä luonnehdintaan etenkin rannikkovesien osalta heterotrofinen pesäkeluku sekä liuenneen nitraatin, ammoniumin ja fosfaatin pitoisuusmääritykset.
Forward Primer (10μM) (see below 3-5)
Ilmoita merivesinäytteestä myös seuraavat tiedot:
0,5μl
keräyspäivä
Reverse Primer (10μM) (see below 3-5)
näytteenottosyvyys;
Water (PCR grade)
näytteen ulkonäkö – sameus jne.
up to 25μl
lämpötila näytteenottoaikana
Taq E- Polymerase
suolaisuus
0,3μl
näytteenoton ja testissä käyttämisen välinen aika.
buffer with MgCl2:
Jos merivesinäytteen liuenneen orgaanisen hiilen pitoisuus todetaan liian suureksi (8 kohta), on suositeltavaa, että meriveden annetaan vanheta noin viikon ajan ennen käyttöä.
Tris/HCl (pH8,8 at 25 °C), 160mM (NH4)2SO4, 25mM MgCl2, 0,1 %Tween 20
Näytettä vanhennetaan säilyttämällä sitä aerobisissa olosuhteissa testilämpötilassa joko pimeässä tai hajavalossa.
For each PCR (see below 3-5) the special primer as a new combination of “Reaction-Mix” and the adequate needed amount of template DNA for each sample (see above) is needed.
Ylläpidä aerobisia olosuhteita tarvittaessa varovaisella ilmastuksella.
The respective volumes will be transferred into new tubes using pipettes.
Vanhentamisen aikana helposti hajoavan orgaanisen aineksen pitoisuus pienenee.
After that all tubes will be closed, stirred (ca.
Rengastestissä (3) vanhennettujen ja tuoreena kerättyjen merivesinäytteiden hajoavuuspotentiaalissa ei havaittu eroa.
10 sec) and centrifuged (10 sec, at room temperature).
Esikäsittele merivesi ennen käyttöä suurhiukkasten poistamiseksi esimerkiksi suodattamalla se nailonsuodattimen tai karkean paperisuodattimen läpi (ei kalvo- tai lasikuitusuodattimien läpi) tai sedimentoimalla ja dekantoimalla.
Now the respective PCR-programmes can be started.
Käytetty menetelmä on raportoitava.
Additionally a positive control (exemplary DNA sample with known activity and clear results) and a negative control (1 μl dest.
Jos merivettä on vanhennettu, esikäsittele vesi sen jälkeen.
H2O) will be used in each PCR-programme.
Mineraaliravinteiden varastoliuokset
Preparation of the agarose gel (1 %) — During running PCR-programmes:
Valmista seuraavat varastoliuokset analyyttisen puhtaita reagensseja käyttäen:
Solve 3 g agarose in 300 ml 1 × TAE-buffer (1 % agarose gel)
Kaliumdivetyortofosfaatti, KH2PO4
This solution should be boiled using an microwave (ca.
Dikaliumvetyortofosfaatti, K2HPO4
2-3 min)
Dinatriumvetyortofosfaattidihydraatti, Na2HPO4 · 2H2O
Transfer the hot solution into a special casting box, which lies on ice
Ammoniumkloridi, NH4Cl
After ca.
Liuota ja valmista yhdeksi litraksi tislatulla vedellä.
Actin-PCR-programme:
Rauta(III)kloridiheksahydraatti, FeCl3 · 6H2O
Special primer:
Jos varastoliuokseen muodostuu sakkaa, vaihda se tuoreeseen liuokseen.
“Mact1(upper/forward)” → TTC AAC AGC CCT GCC ATG TA
Testiväliaineen valmistelu
Cycle (35-times):
Määritä (valinnaisesti) pesäkkeitä muodostavien heterotrofien määrä merivesitestiväliaineessa (ja mielellään myös alkuperäisissä merivesinäytteissä) esimerkiksi laskemalla pesäkeluku Marine Agaria käyttäen.
Annealing
Pullojen valmistelu
→ 1 min at 68 °C
Pullot on pestävä myös ennen ensimmäistä käyttökertaa.
The samples with intact DNA will be used in this PCR-programme to detect the X- and Y-Genes.
Liuota testiaineet testiväliaineeseen – ne voidaan lisätä kätevästi konsentroidun varastoliuoksen kautta, jolloin saavutetaan halutut aloituspitoisuudet (liuenneen orgaanisen hiilen pitoisuus yleensä 540 mg/l).