natgillin/translations-raw huggingface dataset:
CyHVpol-reverse
Jokainen näyte (yhteisnäyte kuljetuselatusaineessa) on täydellisesti homogenoitava validoidulla homogenaattorilla ja sentrifugoitava kierrosnopeudella 2000–4000 × g 15 minuutin ajan 0–6 °C:n lämpötilassa, ja supernatantti on suodatettava 0,45 μm:n suodattimella ja inkuboitava vastaavassa tilavuudessa sopivana laimennuksena olevan, IPN-viruksen kotoperäisten serotyyppien antiseerumiseoksen kanssa.
CyHVpol-internal forward
Antiseerumin titterin on oltava vähintään 1:2000 50 prosentin plakkineutralisaatiokokeessa.
Second round PCR
Seosta on inkuboitava yhden tunnin ajan 15 °C:n lämpötilassa.
95 °C 2 minutes,
Näin saadaan inokulaatti.
CyHVpol-internal reverse
Kaikki inokulaatit on käsiteltävä tarttuvan haimakuoliotauviruksen (IPN-viruksen) antiseerumilla (tietyillä alueilla Euroopassa tätä virusta esiintyy 50 prosentissa kalanäytteistä), jotta voidaan ehkäistä IPN-viruksen aiheuttaman sytopaattisen vaikutuksen muodostuminen inokuloiduissa soluviljelmissä.
PCR versions of proven similar efficacy may be used instead.
Tällainen käsittely voidaan suorittaa virologisten tutkimusten keston lyhentämiseksi ja sellaisten tapausten lukumäärän vähentämiseksi, joissa sytopaattisen vaikutuksen ilmeneminen olisi katsottava VHS- tai IHN-viruksen mahdolliseksi indikaatioksi.
Sequencing may be performed by the laboratory or at external specialised sequencing companies.
Jos näytteet ovat lähtöisin IPN-vapaiksi katsotuista tuotantoyksiköistä, inokulaatteja ei tarvitse käsitellä IPN-viruksen antiseerumilla.
Sequencing results shall be analysed by aligning the sequences to the known reference sequences of KHV (Gen Bank accession numbers AP008984, DQ657948 and DQ177346).
Soluviljelmien inokulaatio
The obtained clean consensus sequence must match at least to 98 % with those reference sequences.
ASK-soluja (Atlantic salmon kidney cells, merilohen munuaissolut) on käytettävä ISA-viruksen primaariseen eristämiseen.
DETAILED DIAGNOSTIC METHODS AND PROCEDURES FOR THE SURVEILLANCE AND CONFIRMATION OF INFECTIOUS SALMON ANEMIA (ISA)
Myös muita solulinjoja voidaan käyttää, jos niiden on osoitettu olevan tehokkaita ja herkkiä ISA-viruksen eristyksessä.
I. Sampling procedures for the surveillance and control of ISA
Tällöin on myös otettava huomioon kantojen vaihtelu ja eri kantojen kyky replikoitua eri solulinjoissa.
When sampling and laboratory examination are carried out, for the purpose of the surveillance or eradication programmes set out in Part 3 of Annex I or to confirm or rule out the presence of ISA in accordance with Article 57(b) of Directive 2006/88/EC, the detailed methods and procedures set out in points I.1, I.2 and I.3 of this Section shall apply.
ASK-solut näyttävät tukevan tähän asti tunnettujen virusisolaattien isolaatiota ja kasvua, kunhan käytetään matalaa siirrostustasoa.
For the purpose of laboratory examination for the presence of ISA, fish samples shall not be pooled where possible.
ASK-soluissa voi ilmetä selkeämpi sytopaattinen vaikutus kuin muissa taudille alttiissa solulinjoissa kuten SHK-1:ssa (lohen munuaisen etuosan solut, Salmon head kidney-1).
However, for the purpose of surveillance for ISA, the pooling of 2 to be 5 fish is accepted.
ASK-soluja (pasaasi 65. tai pienempi) on viljeltävä monikuoppaisilla soluviljelylevyillä L-15-elatusaineessa, joka sisältää 10 % naudan sikiön seerumia (FBS), 2 % (vol:vol) 200 mM L-glutamiinia ja 0,08 % (vol:vol) 50 mM 2-merkaptoetanolia.
Samples for Reverse Transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis shall be taken from all of the fish sampled.
Tuoreisiin aktiivisessa kasvuvaiheessa oleviin soluviljelmiin on inokuloitava antiseerumikäsiteltyä elinsuspensiota siten, että elatusaineen lopullinen laimennussuhde on 1:1000.
A piece of mid-kidney shall be removed from the fish using a sterile instrument and transferred to a microfuge tube containing one ml RNA preservative solution of proven efficacy.
Kustakin elinsuspensiosta on inokuloitava 40 μl yhteen kuoppaan, joka sisältää 2 ml elatusainetta.
The weight of tissue in one sample shall be 0,5 g.
Toinen levy on inokuloitava ISA-viruksen vertailuisolaatilla ja sitä käytetään positiivikontrollina seuraavasti: Ensimmäiseen kuoppaan on inokuloitava 100 μl ISA-viruksen kantaliuosta (vähimmäistitteri 107, 50 % soluviljelmästä infektoiva annos (TCID50 ml– 1)) ja sekoitettava hyvin.
When the fish are too small to obtain a sample of the required weight, pieces of kidney, heart, spleen, liver or pyloric caeca may be taken, in that order of preference, to make up 0,5 g.
Tätä liuosta on siirrettävä yksi tilavuusyksikkö ensimmäisestä kuopasta toiseen kuoppaan, jotta saadaan laimennussuhde 1:10 ja sekoitettava.
Tissue for histological examination shall only be taken from freshly killed fish with a normal constitution, exhibiting clinical signs or post-mortem findings consistent with the presence of ISA.
Tätä menettelyä on toistettava levyn päähän asti, jolloin saadaan kuusi 10-kertaista laimennosta.
Any external or internal lesions shall be sampled and in any case samples of mid-kidney, heart, liver, pancreas, gut, gills and spleen shall be removed from individual fish using a scalpel and transferred to 8 % to 10 % (vol:vol) buffered formol saline.
ISA-viruksen kantaliuosta voidaan säilyttää – 80 °C:n lämpötilassa ainakin 2 vuoden ajan, mutta sulatuksen jälkeen se on käytettävä 3 päivän kuluessa.
The ratio of fixative to tissue shall be at least 20:1 to ensure satisfactory preservation of the tissues.
Tutkittavat levyt on pidettävä erillään positiivikontrollista ristikontaminaation estämiseksi.
For immunohistochemistry (IHC), samples from mid-kidney and heart shall be taken.
Kyseisen riskin välttämiseksi positiivikontrollit on valmistettava ja niitä on käsiteltävä erillään tutkittavista levyistä.
Tissues for virological examination on cell culture shall be taken from all of the fish sampled.
Joka kuudes kuukausi tehtävä ASK-solujen herkkyystesti ISA-virusisolaatteja kohtaan voi korvata positiivikontrollin sisällyttämisen jokaiseen inokulaatioon.
Pieces of the liver, anterior or mid-kidney, heart and spleen shall be removed from the fish using a sterile instrument and transferred to plastic tubes containing 9 ml transport medium.
Näytteitä on inkuboitava 15 ± 2 °C:n lämpötilassa enintään 15 päivän ajan.
Tissues from up to five fish may be collected in one tube containing transport solution and represent one pooled sample.
Soluviljelmät on tarkastettava kaksi kertaa mikroskoopilla sytopaattisen vaikutuksen osoittamiseksi, 5.–7 päivänä ja 12.–14 päivänä inokulaatiosta.
The weight of tissue in one sample shall be 1,0 ± 0,5 g.
Jos jossakin yhteisnäytteessä näkyy merkkejä sytopaattisesta vaikutuksesta, viruksen tunnistamismenettelyt on aloitettava välittömästi II.2.4 kohdan mukaisesti.
Shipment of samples from fish
Jos sytopaattista vaikutuksta ei havaita 14. päivään mennessä, on suoritettava epäsuora fluoresenssivasta-ainetesti (IFAT), hemadsorptiokoe tai RT-PCR.
Whole fish may be transported to the laboratory if the temperature requirements during transportation, as described in paragraph 3 of this point can be fulfilled.
Jatkoviljely on suoritettava 13.–15. päivänä.
Whole fish shall be wrapped in absorbent paper and shipped in a plastic bag, chilled as described in that paragraph.
Tuoreita aktiivisessa kasvuvaiheessa olevia soluja sisältäviin kuoppiin on lisättävä viljelmästä saatua supernatanttia soveltuvana laimennuksena (1:10) monikuoppaisilla soluviljelylevyillä ja inkuboitava 14 ± 2 °C:n lämpötilassa enintään 18 päivän ajan.
Live fish may also be shipped, but only under the supervision of the National reference laboratory for fish diseases and taking into account the additional disinfection and biosecurity issues when transporting live fish.
Soluviljelmistä on tutkittava sytopaattiset vaikutukset mikroskoopilla kaksi kertaa, ensin 5–7 päivän ja sitten 14–18 päivän kuluttua inokulaatiosta.
Blood samples and tubes containing fish tissues for virological examination or RT-PCR analysis shall be placed in insulated containers, such as thick-walled polystyrene boxes, together with sufficient ice or freeze blocks to ensure chilling of the samples during transportation to the laboratory.
Jos sytopaattista vaikutusta ei havaita 14–18 päivän kuluttua, on tehtävä hemadsorptiokoe tai RT-PCR-testi.
Freezing shall be avoided and ice must still be present in the transport box at receipt of the shipment or one or more of the ‘freeze blocks’ must still be partly or completely frozen.
Jos sytotoksisuutta esiintyy ensimmäisten seitsemän päivän sisällä inkubaatiosta, jatkoviljely on tehtävä tässä vaiheessa ja soluja on inkuboitava 14–18 päivää, jatkoviljeltävä uudelleen ja inkuboitava taas 14–18 päivää.
In exceptional circumstances, RT-PCR samples and samples for virological examination may be snap-frozen and transported to the laboratory at – 20 °C or below.
Jos sytotoksisuutta esiintyy 7. päivän jälkeen, jatkoviljely on suoritettava kerran ja soluja on inkuboitava, kunnes ensimmäisestä inokulaatiosta on kulunut kaikkiaan 28–36 päivää.
For RT-PCR analysis of tissues preserved in Ribonucleic acid(RNA)later, RNA extraction shall be carried out within the following time frames depending on the temperature the samples are stored at:
Jos primaariviljelmässä tapahtuu bakteerikontaminaatiota, testi on valmistettava uudelleen käyttämällä – 80 °C:n lämpötilassa säilytettyä kudoshomogenaattia.
samples stored at – 20 °C: indefinitely.
Ennen inokulaatiota kudoshomogenaattia on sentrifugoitava kierrosnopeudella 4000 × g 30 minuutin ajan 0–6 °C:n lämpötilassa ja supernatantti on suodatettava 0,22 μm:n suodattimella.
If fish tissues are transported in fixative for histological examination, they shall be shipped in leak proof tubes in impact-resistant containers.
Jos jatkoviljelyvaiheen aikana tapahtuu bakteerikontaminaatiota, supernatantti on suodatettava 0,22 μm:n suodattimella, inokuloitava tuoreisiin soluihin ja inkuboitava vielä 14–18 päivän ajan.
Freezing of those samples shall be avoided.
Viruksen tunnistustestit
Subject to the approval of the diagnostic laboratory, fish tissues other than those referred to in point I.1 may be collected and prepared for supplementary examination.
Jos jossain soluviljelyn vaiheessa havaitaan sytopaattista vaikutusta tai jos hemadsorptiokoe on positiivinen, on suoritettava viruksen tunnistaminen.
Detailed diagnostic methods and procedures for the surveillance and for the confirmation of the presence of or to rule out the suspicion of ISA
ISA-viruksen ensisijaisia tunnistusmenetelmiä ovat RT-PCR II.1 kohdan mukaisesti ja immunofluoresenssi (IF) II.2.6 kohdan mukaisesti.
When laboratory examination for the purpose of obtaining or maintaining a certain health status with regard to ISA as set out in Section I of Part 3 of Annex I, or for the purpose of the confirmation of the presence of or to rule out a suspicion of ISA in accordance with Article 57(b) of Directive 2006/88/EC, are carried out, using the diagnostic methods set out in Section II of Part 3 of Annex I, the detailed methods and procedures set out in the following points II.1 to II.5 shall apply.
Jos näytteessä epäillään olevan muitakin viruksia, on tehtävä lisätestejä virusten tunnistamiseksi.
Examination of samples by RT-PCR
Jos testeissä ei ole tunnistettu virusta varmuudella viikon kuluessa, supernatantti on toimitettava välitöntä tunnistusta varten
The diagnostic method to be used for the screening for ISAV shall be RT-qPCR.
Maailman eläintautijärjestön (OIE) ISA-tautia tutkivaan vertailulaboratorioon tai;
As the results of the RT-qPCR can vary depending on the conditions under which it is performed, adequate positive and negative controls and amplicons shall be included to avoid any doubts.
direktiivin 2006/88/EY liitteessä VI tarkoitettuun kansalliseen vertailulaboratorioon tai EU:n kalatauteja tutkivaan vertailulaboratorioon.
Total RNA extraction
Hemadsorptio
Total RNA shall be extracted using the phenol-chloroform method or RNA affinity spin columns, according to the manufacturer's instructions.
Koska ISA-viruksen replikaatio soluviljelmässä ei aina johda sytopaattiseen vaikutukseen, jokaiselle kuopalle on tehtävä RT-PCR-testi tai hemadsorptiokoe tämän kohdan mukaisesti taikka IF-testi II.2.6 kohdan mukaisesti.
Purified RNA shall be re-suspended in distilled RNase-free water (namely water treated with 0,1 % diethyl pyrocarbonate).
Jokainen kuoppa, positiivi- ja negatiivikontrollia sisältävät kuopat mukaan lukien, on tyhjennettävä soluviljelyssä käytetystä elatusaineesta, joka on siirrettävä etiketillä varustettuihin steriileihin putkiin.
The concentration and purity of the extracted RNA shall be estimated by measuring the optical density at 260 nm and at 280 nm.
Jokaiseen kuoppaan on lisättävä 500 μl 0,2-prosenttista (vol:vol) kaniinin tai hevosen pestyjä punasoluja sisältävää suspensiota tai 0,05-prosenttista (vol:vol) kirjolohen tai merilohen pestyjä punasoluja sisältävää suspensiota ja inkuboitava huoneenlämmössä 45 minuutin ajan.
An alternative approach may be to include internal controls targeted against the virus genome as referred to in point II.1.3.
Punasolut on poistettava, ja jokainen kuoppa on pestävä kaksi kertaa L-15-elatusaineella.
RT-PCR for ISAV detection
Jokaista kuoppaa on tutkittava mikroskoopilla.
Several RT-PCR methods may be used for ISAV genome amplification.
ASK-solujen pintaan kiinnittyneitä punasolukertymiä on pidettävä alustavasti ortomyksovirusinfektiona.
A two-step RT-PCR may be performed whereby the RT and the PCR reactions steps are run in two separate tubes.
Jos hemadsorptiokoe on positiivinen, viruksen tunnistamistesti on tehtävä välittömästi II.2.4 kohdan mukaisesti.
However, a one-step reaction, where the two reactions are run in one tube, may also be performed.
Immunofluoresenssi (IF)
The one-step method shall be used where possible, as the one tube assay minimises the risk of cross-contamination as no transfer of content have to be made and it is regarded to be as sensitive as the two-step method.
ASK-soluja (pasaasi 65. tai pienempi) on viljeltävä monikuoppalevyllä L-15-elatusaineessa, joka sisältää 10 % naudan sikiön seerumia (FBS), 2 % (vol:volv/v) 200 mM L-glutamiinia ja 0,08 % (vol:vol) 50 mM 2-merkaptoetanolia, ja ne on käytettävä, kun solut peittävät vähintään 50 prosenttia viljelypinta-alasta.
The primers and assay described in this point, namely the ILA1 or ILA2 primer pair that target segment 8 and which have been found suitable for detection of ISAV in outbreaks and in carrier fish, shall be used.
Myös muita teholtaan tutkittuja solulinjoja tai elatusaineita voidaan käyttää.
The ILA2 reverse primer does not match isolates from North America and an alternative primer set shall be used in those cases.
Kahteen rinnakkaiseen kuoppaan on lisättävä 225 μl mahdollisesti virusta sisältävää supernatanttia, sekoitettava ja siirrettävä 225 μl kahteen uuteen kuoppaan (1:5-laimennus).
Forward primer (ILA1): 5′-GGCTATCTACCATGAACGAATC-3′;
Kaksi muuta kuoppaa on jätettävä inokuloimatta, ja niitä käytetään kontrolleina.
Reverse primer (ILA2): 5′-GCCAAGTGTAAGTAGCACTCC-3′.
Eri kalanviljelylaitosten näytteitä ja viruskontrollinäytteitä on käsiteltävä erillisillä levyillä.
Cycling conditions: one cycle of 50 °C for 30 minutes, 1 cycle of 94 °C for 15 minutes, 40 cycles of 94 °C for 30 seconds, 55 °C for 30 seconds, 72 °C for 60 seconds; one cycle of 72 °C for 5 min.
Viruskontrollina on käytettävä ISAV-vertailuisolaattia.
Product size 155 bp.
Levyjä on inkuboitava 14 ± 2 °C:ssa, ja niitä on tarkasteltava mikroskoopilla enintään 7 päivän ajan.
However, other RT-PCR versions of proven similar efficacy may be used instead.
Kun havaitaan varhaista sytopaattista vaikutusta tai jos sytopaattista vaikutusta ei havaita 7 päivän aikana, näytteet on kiinnitettävä.
RT-qPCR for ISAV detection
Kuopat on pestävä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja kiinnitettävä inkuboimalla niitä 80-prosenttisessa asetonissa 20 minuutin ajan huoneenlämmössä.
The use of RT-qPCR may increase specificity and probably also sensitivity.
Levyt on kuivattava ilmassa, minkä jälkeen ne on värjättävä välittömästi tai niitä on säilytettävä 0–6 °C:ssa enintään 24 tunnin ajan ennen värjäystä.
The method can be performed more rapidly as no gel electrophoresis step is required and it reduces the risk of cross contamination as it is possible to estimate the amount of viral genomic RNA within the sample tube.
Rinnakkaiskuopat on värjättävä ISA-viruksen monoklonaalisten vasta-aineiden 3H6F8 ja 1OC9F5 sekoituksella tai muulla monoklonaalisella vasta-aineella, jonka teho ja spesifisyys on osoitettu, laimennettava PBS:ään ja inkuboitava 37 ± 4 °C:ssa 30 minuutin ajan.
A drawback of the RT-qPCR assay is that it is often not possible to sequence amplified products.
Monoklonaalinen vasta-aine on poistettava ja levyt pestävä kolme kertaa PBS:lla, johon on lisätty 0,05 % Tween 20:tä.
However, if there is doubt on the specificity of the amplified product, another ISAV specific assay must be run to verify the result.
Jokaiseen kuoppaan on lisättävä PBS:ään laimennettua anti-hiiri-IgG-fluoreseiini-isotiosyanaatti- (FITC) -konjugaattia ja inkuboitava 37 ± 4 °C:ssa 30 minuutin ajan.
The assay described in this point, which is an assay that target segment 8, shall be used.
Monoklonaalisten vasta-aineiden ja FITC-konjugaatin eri erien laimennokset on optimoitava jokaisessa laboratoriossa erikseen.
This assay shall cover isolates from the European Union, the European Free Trade Association and North America.
Vasta-aine on poistettava ja levyt pestävä kolme kertaa PBS:lla, johon on lisätty 0,05 % Tween 20:tä.
The one-step method shall be used where possible, because the one tube assay minimises the risk of cross-contamination.
Kuoppia on välittömästi tarkasteltava käänteisfluoresenssimikroskoopilla, joka on varustettu FITC:n virittymiseen sopivalla suotimella.
Forward primer: 5′- CTACACAGCAGGATGCAGATGT -3′;
Jos fluoresoivia soluja havaitaan, testin tulosta on pidettävä positiivisena.
Reverse primer: 5′- CAGGATGCCGGAAGTCGAT -3′;
Testi on luotettava, jos positiivikontrollit ovat positiivisia ja negatiivikontrollit negatiivisia.
and probe: 5′-FAM- CATCGTCGCTGCAGTTC – MGBNFQ-3′.
3 Muiden kudosten tutkiminen
Cycling conditions: one cycle of 50 °C for 30 minutes, one cycle of 95 °C for 15 minutes, 40 cycles of 94 °C for 15 seconds, 60 °C for 60 seconds; it shall be adjusted if necessary.
kohdassa tarkoitettua tekniikkaa voidaan soveltaa kalan muihin kudoksiin kuten maksa-, perna- ja sydänkudoksiin, jos objektilasille saadaan riittävä määrä endoteelisoluja, leukosyyttejä tai lymfosyyttejä.
Sequencing of amplified PCR products
Värjäysmenetelmän on pysyttävä samana kaikille kudoksille, vaikka joidenkin kudosten kohdalla on suositeltavaa jättää pois propidiumjodidivärjäys ja käyttää leimausnäytteen solutyyppien tunnistukseen vain faasikontrastivalaistusta.
Forward primer (ILAs6-3F): 5′-ATGAGGGAGGTAGCATTGCA -3′;
4 Histologinen tutkimus
Reverse primer (ILAs6-2R): 5′-CATGCTTTCCAACCTGCTAGGA -3′.
Parafiiniin valetut leikkeet on leikattava 5 μm:n viipaleiksi ja värjättävä hematoksyliinillä ja eosiinilla.
Cycling conditions (One-step RT-PCR): one cycle of 50 °C for 30 minutes, one cycle of 94 °C for 15 minutes, 40 cycles of 94 °C for 30 seconds, 55 °C for 30 seconds, 72 °C for 60 seconds, one cycle of 72 °C for 5 minutes; it shall be adjusted if necessary.
Histologiset muutokset kliinisesti sairaissa merilohissa ovat vaihtelevia, mutta niihin kuuluu seuraavaa:
Alternatively, the following method for sequencing HPR in segment 6 may be used:
lukuisia punasoluja laskimonlaajennuksessa ja kidusten lamellien hiussuonissa, joissa voi myös muodostua punasolutrombiineja;
Forward primer: 5′-GAC-CAG-ACA-AGC-TTA-GGT-AAC-ACA-GA-3′;
multifokaalisia tai konfluentteja petekioita tai maksasolunekroosi tai molempia jonkin matkan päässä maksan suurista verisuonista; multifokaalisia punasolukertymiä laajenneissa hepaattisissa sinusoideissa;
Reverse primer: 5′-GAT-GGT-GGA-ATT-CTA-CCT-CTA-GAC-TTG-TA-3′;
punasolukertymiä suoliston limakalvon tukikerroksen verisuonissa ja mahdollista verenvuotoa suoliston limakalvon tukikerrokseen;
Product size: 304 nt if HPR0.
punasolujen kertymisen laajentama pernan strooma;
RT-PCR assays with similar sensitivities and specificities to the assays described in this point may also be used.
lievän multifokaalisesta laajaan diffuusia interstitiaalista verenvuotoa, tubulaarinen kuolio verenvuotoalueilla, punasolukertymää munuaisen hiussuonikeräsissä;
The purity of the amplified RT-PCR product shall be checked by gel electrophoresis before sequencing.
erytrofagosytoosi pernassa ja sekundaarista verenvuotoa maksassa ja munuaisessa.
If only one pure fragment appears, it shall be purified directly from the PCR reaction.
5 Immunohistokemia (IHC)
If multiple amplified fragments are present, the fragment of interest shall be purified by gel electrophoresis.
ISA-viruksen nukleoproteiinin polyklonaalisia vasta-aineita on käytettävä formaliiniin kiinnitetyn kudoksen parafiinileikkeisiin.
The purification of PCR fragments from solutions or agarose gels shall be made using PCR fragment affinity spin columns, according to the manufacturer's instructions.
Tutkittavien elinten on oltava munuaisen keskiosa ja sydän (eteinen sekä kaikki kolme kammiota ja läpät).
Sequencing shall be performed using amplification primers at external specialised sequencing companies.
Patologisten merkkien vuoksi epäilyttävät tapaukset on tarkistettava positiivisella IHC:llä.
The results shall be analysed with the search tool BLAST and the sequences shall be compared with other known sequences in the US National Centre for Biotechnical Information (NCBI) nucleotide database.
Histologiset leikkeet on valmisteltava standardimenetelmien mukaisesti.
Sequencing must eliminate any doubt on the specificity of an amplified RT-PCR product.
Kudosleikkeiden valmistelu
ISAV isolation on cell cultures
Kudokset on kiinnitettävä neutraalissa fosfaattipuskuroidussa 10 % formaliinissa vähintään yhden päivän ajan, dehydratoitava etanoli-laimennossarjassa, kirkastettava ksyleenissä ja valettava parafiiniin standardiprotokollien mukaisesti.
Preparation of samples
Noin 5 μm paksuja leikkeitä (sijoitettu poly-L-lysiini-päällysteisille laseille IHC:tä varten) on kuumennettava 56–58 °C:ssa (enintään 60 °C:ssa) 20 minuutin ajan, ne on deparanifoitava ksyleenissä, rehydratoitava etanoli-laimennossarjassa ja värjättävä hematoksylinillä ja eosiinilla patomorfologiaa ja IHC:tä varten 2 kohdan mukaisesti.
The tissue may be kept at – 80 °C.
Värjäysmenettely IHC:tä varten
The tissue shall only be frozen and thawed once before examination.
Kaikki inkuboinnit on suoritettava huoneenlämpötilassa keinuvalla alustalla, jollei tässä päätöksessä toisin säädetä:
For surveillance and control purposes, the examination shall be undertaken as fast as possible.
antigeeni on osoitettava keittämällä leikkeitä 0,1 M:ssä sitraattipuskuria, pH 6,0, 2 × 6 minuutin ajan, ja sen jälkeen blokkaamalla 5-prosenttisella maidon rasvattomalla kuiva-aineella ja 2-prosenttisella vuohiseerumilla 50 mM:ssä TBS:ää (TBS; Tris/HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,6) 20 minuutin ajan;
Each sample (tissue pool in transport solution) shall be completely homogenised using a validated homogeniser, centrifuged at 2000 to 4000 × g for 15 minutes at 0 to 6 °C, and the supernatant shall be filtered (0,45 μm) and incubated with an equal volume of a suitably diluted pool of antisera to the indigenous serotypes of IPNV.
sitten leikkeitä on inkuboitava yön yli primaarisen vasta-aineen kanssa (ISA-viruksen nukleoproteiinin monospesifinen kanin vasta-aine), joka on laimennettu TBS:llä, jossa on 1-prosenttista maidon rasvatonta kuiva-ainetta, ja sen jälkeen pestävä kolme kertaa TBS:llä, johon on lisätty 0,1 % Tween 20:tä;
The titre of the antiserum must be at least 1:2000 in a 50 % plaque neutralisation test.
sidottujen vasta-aineiden osoittamiseksi leikkeet on inkuboitava alkaliini-forfataasi-konjugoiduilla kanin igG-vasta-aineilla 60 minuutin ajan.
The mixture shall be incubated for one hour at 15 °C.
Viimeisen pesun jälkeen on lisättävä Fast Red (1 mg ml– 1) ja naftoli-AS-MX-fosfaatti (0,2 mg ml– 1) 1 mM levamisoliliuoksessa (0,1 M TBS, pH 8,2) ja annettava kehittyä 20 minuutin ajan.