natgillin/translations-raw huggingface dataset:
To reduce the duration of the virological examinations as well as the number of cases in which occurrence of CPE would have to be considered potentially indicative of ISAV, such treatment may be carried out.
IHC:n tulosten tulkinta
When samples come from production units which are considered free from IPN, the treatment of inocula with antiserum to IPN virus may be omitted.
IHC-testin tuloksia on tulkittava a ja b kohdassa vahvistetulla tavalla:
Inoculation on cell cultures
kontrollileikkeitä on pidettävä positiivisina, kun kontrollileikkeissä havaitaan selkeästi näkyvää punaista (punertavaa) sytomeriloplasmista ja intranukleaarista värjäytymää sydämen sisäkalvon verisuonten endoteelisoluissa.
Atlantic salmon kidney (ASK) cells shall be used for primary ISAV isolation.
Testinäyteleikettä on pidettävä positiivisena vain, jos tällaista endoteelisolujen selkeää, intranukleaarista punaista värjäytymistä havaitaan;
Other cell lines of proven efficacy and sensitivity in isolating ISAV may be used, taking into consideration strain variability and the ability of different strains to replicate in different cell lines.
kontrollileikkeitä on pidettävä negatiivisina, jos niissä ei ole mitään merkittäviä värireaktioita.
The ASK cells seem to support isolation and growth of the hitherto known virus isolates, as long as a low passage level is used.
Koska intranukleaarinen lokalisaatio on ominaista ortomyksoviruksen nukleoproteiinille viruksen replikaatiovaiheessa, mutta samanaikainen sytoplasminen värjäytyminen on usein vallitseva, sytoplasmisia ja muita värjäytymiskuvioita, joihin ei liity intranukleaarista lokalisaatiota, on pidettävä epäspesifisinä tai tuloksiltaan epävarmoina.
A more distinct cytopathic effect (CPE) may appear in ASK cells than in other susceptible cell lines like SHK-1 (Salmon head kidney-1).
Vahvin positiivinen värjäytymisreaktio saadaan yleensä sydämen ja munuaisen endoteelisoluissa.
ASK (pass 65 or lower) cells shall be grown in L-15 medium containing 10 % foetal bovine serum, 2 % (vol:vol) 200 mM L-glutamine, and 0,08 % (vol:vol) 50 mM 2-mercaptoethanol in multi-well plates.
Endoteeliset värjäytymisreaktiot hyvin laajoissa verenvuotovaurioissa voivat olla lieviä tai niitä ei ole, mahdollisesti siksi, että tartunnan saaneet endoteelisolut hajoavat.
Antiserum-treated organ suspension shall be inoculated into young actively growing cell cultures to give a final dilution of tissue material to culture medium of 1:1000.
YKSITYISKOHTAISET DIAGNOSTISET MENETELMÄT JA MENETTELYT NILVIÄISTEN MARTEILIOOSIN (MARTEILIA REFRINGENS -LOISEN AIHEUTTAMAN TARTUNNAN) SEURANTAA JA SEN ESIINTYMISEN VAHVISTAMISTA VARTEN
For each organ, suspension 40 μl of inoculum shall be added to one well containing 2 ml of culture medium.
I Yksityiskohtaiset diagnostiset menetelmät ja menettelyt nilviäisten marteilioosin (Marteilia refringens -loisen aiheuttaman tartunnan) diagnosointia varten
To minimise the risk of cross-contamination, separate 12- or 24-well plates shall be used for samples from different fish farm sites.
Kun suoritetaan näytteenotto ja laboratoriotutkimuksia, joiden tarkoituksena on saavuttaa tai säilyttää tietty terveystilanne nilviäisten marteilioosin osalta liitteessä I olevan 4 osan I jakson mukaisesti tai vahvistaa kyseisen luetellun taudin esiintyminen tai sulkea pois sen epäily direktiivin 2006/88/EY 57 artiklan b alakohdan mukaisesti ja joissa käytetään liitteessä I olevan 4 osan II jaksossa vahvistettuja diagnostisia menetelmiä, on sovellettava tämän osan II.1, II.2 ja II.3 kohdassa vahvistettuja yksityiskohtaisia menetelmiä ja menettelyjä.
One plate shall be left uninoculated to serve as a negative control.
Näytteenottoon on valittava ensisijaisesti kuori auki olevia tai äskettäin kuolleita nilviäisiä tartunnan saaneiden eläinten löytymismahdollisuuksien kasvattamiseksi.
A separate plate shall be inoculated with a reference isolate of ISAV as a positive control, as follows.
Kun näytteenotto on suoritettu, osterit tai simpukat on pidettävä 4 °C:ssa tai jäähauteessa enintään 24 tuntia, jos näytteessä on kuori auki olevia nilviäisiä, ja enintään 72 tuntia, jos ei ole, muovipussissa, joka on varustettu etiketillä, josta ilmenevät osterien tai simpukoiden luonnetta ja alkuperää koskevat tiedot.
One hundred μl of a stock preparation of ISAV (minimum titre 107 Tissue culture infective dose at the 50 % end point (TCID50 ml– 1)) shall be inoculated into the first well and mixed.
Kuori auki olevat tai äskettäin kuolleet nilviäiset on pidettävä erillään muista nilviäisistä.
A volume of this material shall be transferred from the first well to the second well to make a 1:10 dilution and mixed.
Nilviäisten marteilioosin määrittämiseen histologian avulla on käytettävä 3–5 mm:n paksuisia kudosleikkeitä, jotka sisältävät kidus- ja sydänkudosta.
This shall be repeated across the plate to make six 10-fold dilutions.
Eräissä testeissä, kuten leimausnäytteissä ja polymeraasiketjureaktiossa (PCR), on käytettävä ruoansulatusrauhasen palasta.
Stock ISAV may be stored at – 80 °C for at least 2 years but once thawed must be used within 3 days.
Sen jälkeen, kun ruoansulatusrauhasen kudokset on kuivattu imupaperilla, lasilevylle on tehtävä useita leimausnäytteitä.
Care shall be taken to prevent cross-contamination of test plates with positive control material.
Levyt on kuivattava ilmassa, kiinnitettävä metanolissa tai absoluuttisessa etanolissa ja värjättävä käyttäen kaupallisesti saatavilla olevaa hematologian värjäyskittiä, kuten Diff-Quik®/Hemacolor®, valmistajan ohjeiden mukaisesti.
To avoid that risk, positive controls shall be set up and handled separately from test plates.
Hanavedellä huuhtelun ja kuivaamisen jälkeen levyihin on kiinnitettävä peitelasi soveltuvan synteettisen hartsin avulla.
A sensitivity test every 6 months of ASK cells towards ISAV isolates may replace the use of including a positive control at each inoculation.
Levyjä on tarkkailtava ensin 200-kertaisena suurennoksena ja sitten öljyimmersiossa 1000-kertaisena suurennoksena.
Samples shall be incubated at 15 ± 2 °C for up to 15 days.
Positiiviseksi tulokseksi katsotaan 30–40 μm:n kokoisten solujen havaitseminen.
Using a microscope, cell cultures shall be examined for CPE twice, between 5 to 7 and 12 to 14 days following inoculation.
Solulima värjäytyy basofiiliseksi ja tuma eosinofiiliseksi.
If any pool shows CPE, virus identification procedures shall be initiated immediately in accordance with point II.2.4.
Suurten voimakkaasti värjäytyneiden (valoa taittavien) jyvästen ympärillä havaitaan heikko kehä ja suuremmissa soluissa soluja, joissa on solurakenteita.
If no CPE is observed by day 14, an Indirect fluorescent antibody test (IFAT), haemadsorption or RT-PCR shall be performed.
Tämä tekniikka ei ole spesifinen millekään loislajille.
Subcultivation shall be carried out between days 13 to 15.
Kudosleikkeet, joihin sisältyvät kidukset, ruoansulatusrauhanen, vaippa ja sukurauhaset, on kiinnitettävä vähintään 24 tuntia Davidsonin kiinnitysaineessa ennen tavanomaista käsittelyä parafiinihistologiaa ja värjäystä varten esimerkiksi hematoksyliinillä ja eosiinilla.
Culture supernatant shall be added to wells containing fresh actively growing cells in appropriate dilution (1/10) in multi-well plates and incubated at 14 ± 2 °C for up to 18 days.
Havainnot on tehtävä kasvavilla suurennoksilla 1000-kertaiseen asti.
Using a microscope, cell cultures shall be examined for CPE twice, between days five to seven and days 14 to 18 following inoculation.
Positiiviseksi tulokseksi katsotaan 4–40 μm:n kokoisten solujen havaitseminen.
If no CPE is observed by days 14 to 18, a haemadsorption or an RT-PCR test shall be performed.
Varhaiset vaiheet ovat monitumaiset pallomaiset tai pitkänomaiset solut.
If cytotoxicity occurs within the first 7 days of incubation, subcultivation shall be performed at that stage, and the cells shall be incubated for 14 to 18 days and sub cultivated again with a further period of 14 to 18 days incubation.
Niitä havaitaan pääasiassa ruokatorven ja vatsan ja joskus huulirihman epiteelisoluissa.
If cytotoxicity occurs after 7 days, subcultivation shall be performed once and the cells shall be incubated to achieve the total period of 28 to 36 days incubation from the primary inoculation.
Sporulaatio käsittää solunsisäisten solujen jakautumisia ja tapahtuu ruoansulatusrauhasen tubuluksissa ja tiehyeissä.
If bacterial contamination occurs in the primary culture, the test shall be set up again using the tissue homogenate stored at – 80 °C.
Valoa taittavat jyväset ilmestyvät sporulaation aikana, eikä niitä havaita varhaisvaiheissa.
Prior to inoculation, the tissue homogenate shall be centrifuged at 4000 × g for 15 to 30 minutes at 0 to 6 °C and the supernatant shall be filtered at 0,22 μm.
Tartunnan myöhemmissä vaiheissa itiöitä havaitaan vapaina ruoansulatuskanavan soluontelossa.
If bacterial contamination occurs during the subcultivation step the supernatant shall be filtered at 0,22 μm, inoculated onto fresh cells and incubated for a further 14 to 18 days.
Jyvästen väri voi vaihdella syvän oranssista syvän punaiseen.
Virus identification tests
Kaupallisesti saatavilla olevia DNA:n eristämiskittejä, jotka tuottavat korkealaatuisia DNA:ta, joka soveltuu käytettäväksi I.2 kohdassa tarkoitettujen PCR-protokollien kanssa, saa käyttää.
If evidence of CPE is observed at any stage, or if a haemadsorption test is positive, virus identification shall be carried out.
PCR-protokollia on kehitetty ja julkaistu useita.
The methods of choice for the identification of ISAV shall be RT-PCR in accordance with point II.1 and Immunofluorescence (IF) in accordance with point II.2.6.
On käytettävä ITS (ITS1) -alueelle kohdistuvia PCR-alukkeita, sillä ne kykenevät monistamaan ainoastaan M. refringens -loisen.
If it is considered that other viruses may be present, supplementary virus identification tests shall be carried out.
PCR on suoritettava 50 μl:n tilavudessa.
If those tests have not resulted in a definitive identification of the virus within 1 week, the supernatant shall be forwarded for immediate identification to:
PCR-seosten on sisällettävä puskuria (500 mM KCl, 100 mM Tris/HCl [pH 9,0 25 °C:ssa] ja 1 % Triton® X-100), 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP mix, 1 μM etu- ja taka-alukkeita, 0,02 yksikköä μl– 1 Taq DNA polymeraasia, ja 10–100 ng eristettyä DNA:ta.
the World Organisation for Animal Health (OIE) reference laboratory for ISA, or;
Kun DNA:ta on denaturoitu 94 °C:ssa 5 minuuttia, on ajettava 30 sykliä seuraavasti: denaturaatio 94 °C:ssa yhden minuutin ajan, kiinnitys 55 °C:ssa yhden minuutin ja elongaatio 72 °C:ssa yhden minuutin ajan kiloemäsparia kohti.
a national reference laboratory or the EU reference laboratory for fish diseases as referred to in Annex VI to Directive 2006/88/EC.
On suoritettava loppuelongaatiovaihe 72 °C:ssa 10 minuutin ajan.
Haemadsorption
M. refringens -loisen osoittamiseksi PCR on suoritettava sellaisilla alukkeilla, jotka kohdistuvat ITS1-alueeseen (5′-CCG-CAC-ACG-TTC-TTC-ACT-CC-3′ ja 5′-CTC-GCG-AGT-TTC-GAC-AGA-CG-3′).
As replication of ISAV in cell cultures does not always result in a CPE, every well shall be subject to an RT-PCR test or a haemadsorption test in accordance with this point, or an IF test in accordance with point II.2.6.
Positiivikontrollien on koostuttava vakavan tartunnan saaneen isännän genomi-DNA:sta tai plasmidi-DNA:sta mukaan luettuna kohdealue.
Cell culture medium shall be removed from each well, including those of positive and negative controls, and placed in labelled sterile tubes.
Negatiivikontrollien on koostuttava tartunnasta vapaiden isäntien genomi-DNA:sta tai PCR-reaktiiveista ilman kohde-DNA:ta.
500 μl of a 0,2 % (vol:vol) suspension of washed rabbit or horse red blood cells, or a 0,05 % (vol:vol) suspension of washed rainbow trout or Atlantic salmon red blood cells, shall be added to each well and incubated at room temperature for 45 minutes.
Positiivisen tuloksen on oltava odotetun kokoinen (412 bp) onnistunut PCR-monistus siten, että kaikki negatiivikontrollit ovat negatiivisia ja positiivikontrollit positiivisia.
The red blood cells shall be removed and each well shall be washed twice with L-15 medium.
ISH-protokollia on kehitetty ja julkaistu useita.
Each well shall be examined using a microscope.
On käytettävä koetinta, joka kohdistuu rRNA-geenikompleksin pieneen alayksikköön (SSU), sillä se on validoitu histologian avulla.
The presence of clusters of red blood cells attaching to the surface of ASK cells shall be indicative of presumptive infection with an orthomyxovirus.
Ne kudosleikkeet, joihin sisältyvät kidukset ja ruoansulatusrauhanen, on kiinnitettävä vähintään 24 tuntia Davidsonin kiinnitysaineessa ennen tavanomaista käsittelyä parafiinihistologiaa varten.
If a haemadsorption test is positive, a virus identification test shall be performed immediately in accordance with point II.2.4.
On leikattava 5 μm leikkeet, jotka on sijoitettava aminoalkyylisilaani-päällysteisille laseille, joita on sitten paistettava yli yön 40 °C:ssa.
Immunofluorescence (IF)
Leikkeet on deparafinoitava upottamalla ne ksyleeniin 10 minuutiksi.
ASK (pass 65 or lower) shall be grown in a L-15 medium containing 10 % foetal bovine serum, 2 % (vol:vol) 200 mM L-glutamine, and 0,08 % (vol:vol) 50 mM 2-mercaptoethanol in multi-well plates and used at greater than 50 % confluence.
Tämä vaihe on toistettava kerran, ja sitten liuote on poistettava upottamalla leikkeet kahteen peräkkäiseen 10 minuutin mittaiseen etanolihauteeseen.
Other cell lines or growth medium of proven efficacy may also be used.
Sitten leikkeet on dehydratoitava upottamalla ne etanoli-laimennossarjaan.
225 μl of putative virus-infected culture supernatant shall be added to each of two wells, mixed and 225 μl transferred to two further wells, namely a 1:5 dilution.
Leikkeet on käsiteltävä porteinaasi-K:lla (100 μg ml–1) TE-puskurissa (Tris [50 mM], EDTA [10 mM]), 37 °C:ssa 30 minuutin ajan.
Two additional wells shall be left uninoculated to act as controls.
Lasit on dehydratoitava upottamalla ne etanoli-laimennossarjaan ja sitten ilmakuivattava.
Samples from each fish farm site shall be handled on separate plates, as shall the virus control.
Leikkeet on inkuboitava 100 μl:ssa hybridisaatiopuskuria (4 × SSC [standardoitu suolasitraatti], 50 % formamidia, 1 × Denhardtin liuosta, 250 μg ml–1 hiivan siirtäjä-RNA, 10 % dekstraanisulfaattia), joka sisältää 10 ng (1 μl PCR-reaktantteja valmisteltuina I.3.2 kohdassa kuvatulla tavalla käyttäen alukkeita CCG-GTG-CCA-GGT-ATA-TCT-CG ja TTC-GGG-TGG-TCT-TGA-AAG-GC) digoksigeniini-leimattua koetinta.
A virus control shall be established using a reference isolate of ISAV.
Leikkeet on peitettävä in-situ muovisilla peitelaseilla ja sijoitettava lämpöblokkiin 95 °C:een 5 minuutiksi.
Plates shall be incubated at 14 ± 2 °C and examined microscopically for up to 7 days.
Sitten levyt on jäähdytettävä jäähauteessa yhden minuutin ajan ennen yli yön tapahtuvaa hybridisaatiota 42 °C:ssa kosteassa tilassa.
When early CPE is observed, or if no CPE is observed within 7 days, the next step shall be fixation.
Tämän jälkeen leikkeet on pestävä kahdesti 5 minuutin ajan 2 × SSC:ssä huoneenlämpötilassa ja kerran 10 minuutin ajan 0,4 × SSC:ssä 42 °C:ssa.
Wells shall be washed with Phosphate buffered saline (PBS) and fixed by incubation with 80 % acetone for 20 minutes at room temperature.
Detektiovaiheet on suoritettava valmistajan ohjeiden mukaisesti.
Plates shall be air-dried and stained immediately or stored at 0 to 6 °C for no more than 24 hours prior to staining.
Sitten lasit on huuhdeltava steriilissä tislatussa vedessä (dH2O).
Replicate wells shall be stained with a mix of monoclonal antibodies (MAb) 3H6F8 and 1OC9F5 against ISAV, or other MAb of proven efficacy and specificity, diluted in PBS and incubated at 37 ± 4 °C for 30 minutes.
Leikkeet on vastavärjättävä Bismarck Brown Yellow -värillä, huuhdottava dH2O:ssa ja levyt on kiinnitettävä käyttäen vesipitoista peittausainetta.
MAb shall be removed and plates washed three times with 0,05 % Tween 20 in PBS.
Positiivikontrollien on oltava tunnetuista saastuneista isännistä otetut leikkeet ja negatiivikontrollien tartunnasta vapaista isännistä otetut leikkeet.
Anti-mouse IgG Fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugate diluted in PBS shall be added to each well and incubated at 37 ± 4 °C for 30 minutes.
Positiivinen tulos on osoitettava tunnetuissa kohdekudoksissa violetinmusta-leimatuilla M. refringens -loisen soluilla siten, että kaikki negatiivikontrollit ovat negatiivisia ja kaikki positiivikontrollit positiivisia.
The dilutions of different batches of MAb and FITC conjugate shall be optimised in each laboratory.
Sekvensointi
Antibody shall be removed and plates shall be washed three times with 0,05 % Tween 20 in PBS.
Kohdealueet ovat SSU rDNA ja ITS1.
Wells shall be examined immediately using an inverted microscope set up for fluorescence microscopy with a suitable filter for excitation of FITC.
II Yksityiskohtaiset diagnostiset menetelmät ja menettelyt nilviäisten marteilioosin (Marteilia refringens -loisen aiheuttaman tartunnan) seurantaa ja sen esiintymisen vahvistamista varten Seurantaohjelmien tarkoituksiin ja nilviäisten marteilioosin esiintymisen vahvistamiseksi tai kyseisen luetellun taudin epäilyn poissulkemiseksi liitteessä I olevan 4 osan II jaksossa vahvistettujen vaatimusten mukaisesti käytettävien diagnostisten menetelmien ja niitä vastaavien menettelyjen on oltava seuraavassa taulukossa 4.1 vahvistettujen suuntaviivojenmukaiset:
A test shall be considered positive if fluorescent cells are observed.
Taulukko 4.1
For a test to be valid, the positive controls shall score positive and the negative controls shall score negative.
Diagnostisten menetelmien käytön suuntaviivat seurantaohjelmia varten ja nilviäisten marteilioosin esiintymisen vahvistamiseksi tai poissulkemiseksi
Examination of other tissues
Menetelmä
The technique referred to in point II.2.6 may be applied to other fish tissues such as liver, spleen and heart providing a reasonable quantity of endothelial cells, leucocytes or lymphocytes can be deposited on the slide.
Kohdennettu seuranta
The staining procedure shall remain the same for each tissue, although for some tissues it may be preferable to omit the propidium iodide staining and rely on the phase illumination to identify the cell types present in the imprint.
Alustava diagnoosi
Histology
Varmistava diagnoosi
Paraffin-embedded sections shall be cut at 5 μm and stained using haematoxylin and eosin.
Ruoansulatusrauhasen leimausnäytteet
Histological changes in clinically diseased Atlantic salmon are variable, but may include the following:
X, tai
numerous erythrocytes in the central venous sinus and lamellar capillaries of the gills, where erythrocyte thrombi also may be formed;
Hispatologia
multifocal to confluent petechiae or hepatocyte necrosis or both at some distance from larger vessels in the liver; multifocal accumulation of erythrocytes in dilated hepatic sinusoids;
In situ -hybridisaatio
accumulation of erythrocytes in blood vessels of the intestinal lamina propria and eventually haemorrhage into the lamina propria;
X, ja
spleen stroma distended by erythrocyte accumulation;
YKSITYISKOHTAISET DIAGNOSTISET MENETELMÄT JA MENETTELYT NILVIÄISTEN BONAMIOOSIN (BONAMIA OSTREAE -LOISEN AIHEUTTAMAN TARTUNNAN) SEURANTAA JA SEN ESIINTYMISEN VAHVISTAMISTA VARTEN
slight multifocal to extensive diffuse interstitial haemorrhage with tubular necrosis in the haemorrhagic areas, erythrocyte accumulation in the glomeruli in the kidney;
I Menettelyt nilviäisten bonamioosin diagnosointia varten
erythrophagocytosis in the spleen and secondary haemorrhages in liver and kidney.
Kun suoritetaan näytteenotto ja laboratoriotutkimuksia, joiden tarkoituksena on saavuttaa tai säilyttää tietty terveystilanne nilviäisten bonamioosin osalta liitteessä I olevan 5 osan I jakson mukaisesti tai vahvistaa kyseisen luetellun taudin esiintyminen tai sulkea pois sen epäily direktiivin 2006/88/EY 57 artiklan b alakohdan mukaisesti ja joissa käytetään liitteessä I olevan 5 osan II jaksossa vahvistettuja diagnostisia menetelmiä, on sovellettava seuraavissa II.1, II.2 ja II.3 kohdassa vahvistettuja yksityiskohtaisia menetelmiä ja menettelyjä.
Immunohistochemistry (IHC)
Näytteenottoprosessi
Polyclonal antibody against ISAV nucleoprotein shall be used on paraffin sections from formalin-fixed tissue.
Kun näytteenotto on suoritettu, osterit on pidettävä 4 °C:ssa tai jäähauteessa enintään 24 tuntia, jos näytteeseen sisältyy kuori auki olevia nilviäisiä, ja 72 tuntia, jos ei sisälly, muovipussissa, joka on varustettu etiketillä, josta ilmenevät osterien luonnetta ja alkuperää koskevat tiedot.
The organs to be examined shall be mid-kidney and heart (transitional area including all three chambers and valves).
Nilviäisten bonamioosin määrittämiseen histologisen tutkimuksen avulla on käytettävä 3–5 mm:n paksuisia kudosleikkeitä, jotka sisältävät kidus- ja sydänkudosta.
Suspected cases due to pathological signs shall be verified with a positive IHC.
Sen jälkeen, kun kidus- tai sydänkudokset on kuivattu imupaperilla, lasilevylle on tehtävä useita leimausnäytteitä.
Histological sections shall be prepared in accordance with standard methods.
Levyt on kuivattava ilmassa, kiinnitettävä metanolissa tai absoluuttisessa etanolissa ja värjättävä käyttäen kaupallisesti saatavilla olevaa hematologian värjäyskittiä (kuten Diff- Quik®/Hemacolor®) valmistajan ohjeiden mukaisesti.
Preparation of tissue sections
Levyjä on tarkkailtava ensin 200-kertaisena suurennoksena ja sitten öljyimmersiossa 1000-kertaisena suurennoksena.
The tissues shall be fixed in neutral phosphate-buffered 10 % formalin for at least 1 day, dehydrated in a graded ethanol series, cleared in xylene and embedded in paraffin, according to standard protocols.
Positiivisena tuloksena on pidettävä pienten pallomaisten tai munanmuotoisten (2–5 μm leveiden) organismien esiintymistä hemosyyteissä.
Approximately 5 μm thick sections (for IHC placed on poly-L-lysine-coated slides) shall be heated at 56 °C to 58 °C (maximum 60 °C) for 20 minutes, dewaxed in xylene, rehydrated through a graded ethanol series, and stained with haematoxylin and eosin for pathomorphology and IHC in accordance with point (2).
Loista saattaa kuitenkin esiintyä myös solujen ulkopuolella.
Staining procedure for IHC
Näillä organismeilla on basofiilinen solulima ja eosinofiilinen tuma (värit saattavat vaihdella käytetyn väriaineen mukaan), ja koska ne leviävät lasilla, ne voivat vaikuttaa laajemmilta leimanäytteissä kuin histologisessa tutkimuksessa.
All incubations shall be carried out at room temperature on a rocking platform, unless otherwise provided for in this decision:
Monitumaisia soluja voidaan havaita.
antigen retrieval shall be done by boiling sections in 0,1 M citrate buffer pH 6,0 for 2 × 6 minutes followed by blocking with 5 % non-fat dry milk and 2 % goat serum in 50 mM TBS (TBS; Tris/HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,6) for 20 minutes;
Kudosleikkeet, joihin sisältyvät kidukset ja ruoansulatusrauhanen, on kiinnitettävä vähintään 24 tuntia Davidsonin kiinnitysaineessa ennen tavanomaista käsittelyä parafiinihistologiaa ja värjäystä varten esimerkiksi hematoksyliinillä ja eosiinilla.
sections shall then be incubated overnight with primary antibody (monospecific rabbit antibody against ISAV nucleoprotein) diluted in TBS with 1 % non-fat dry milk, followed by three washes in TBS with 0,1 % Tween 20;
Positiivisena tuloksena on pidettävä loisen esiintymistä hyvin pieninä, 2–5 μm leveinä soluina hemosyyteissä tai vapaina kiduksen, suolen ja vaipan epiteelin tukikudoksessa tai sinuksissa, mihin usein liittyy raju tulehdusreaktio.
for detection of bound antibodies, sections shall be incubated with Alkaline phosphatase-conjugated antibodies to rabbit IgG for 60 minutes.
Loista on tarkkailtava hemosyytin sisässä positiivisen diagnoosin varmistamiseksi.
Following a final wash, Fast Red (1 mg ml– 1) and Naphthol AS-MX phosphate (0,2 mg ml– 1) with 1 mM Levamisole in 0,1 M TBS (pH 8,2) shall be added to develop for 20 minutes.
Kaupallisesti saatavilla olevia DNA:n eristämiskittejä, jotka tuottavat korkealaatuisia DNA:ta, joka soveltuu käytettäväksi jäljempänä kuvattujen PCR-protokollien kanssa, saa käyttää.