natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Specimen
Validointitutkimuksista saatujen tutkimusten perusteella tutkimuksen on osoitettu toimivan hyvin, kun testiveden jodin (I–) pitoisuudet vaihtelivat välillä 0,5–10 μg/l.
Store the liver specimens taken from the test fish at ≤ – 70 °C if they are not used for the pre-treatment shortly after the excision.
Ihannetapauksessa testiveden vähimmäisjodipitoisuuden tulisi olla 0,5 μg/l.
A cut is made just anterior to pectoral fins with scissors.
Jos testivesi valmistetaan deionisoidusta vedestä, jodia on lisättävä sen verran, että vähimmäispitoisuudeksi tulee 0,5 μg/l.
Figure 2
Jos testiveteen lisätään jodia tai muita suoloja, siitä on mainittava tutkimusraportissa.
The midline of abdomen is incised with scissors to a point approximately 2 mm cranial to the anus.
Eläinten hoito
Figure 3
Aikuisten eläinten hoito ja lisääntyminen
The abdominal walls are spread with forceps for exposure of the liver and other internal organs.
Aikuisten eläinten hoidossa ja lisääntymisessä sovelletaan vakio-ohjeita.
(Alternatively, the abdominal walls may be pinned laterally).
Lukijaa kehotetaan lukemaan tarkempia tietoja sammakon alkion teratogeneettista tutkimusta (FETAX) (6) koskevista vakio-ohjeista.
Figure 4
Nämä vakio-ohjeet ovat yksi esimerkki asianmukaisista hoito- ja lisääntymismenetelmistä, mutta niitä ei kuitenkaan tarvitse noudattaa tiukasti.
The liver is bluntly dissected and excised using forceps.
Lisääntymistä varten aikuisista naaraista ja koiraista koostuviin pareihin injektoidaan ihmisen koriongonadotropiinia (hCG:tä).
Figure 5
Naaraisiin injektoidaan noin 800–1000 IU ja koiraisiin 600–800 IU 0,6–0,9-prosenttiseen suolaliuokseen liuotettua hCG:tä.
The intestines are gently retracted using forceps.
Parit, joiden on määrä lisääntyä, pidetään suurissa säiliöissä häiriöittä ja staattisissa olosuhteissa, jotta eläimet hakeutuvat paritteluasentoon helpommin.
Testis 6
Jokaisessa lisääntymissäiliössä tulee olla ruostumattomasta teräksestä tai muoviverkosta valmistettu valepohja, jotta munamassa laskeutuu säiliön pohjalle.
Both ends of the intestines and any mesenteric attachments are severed using scissors.
Sammakot, joille injektio annetaan myöhään iltapäivällä, laskevat valtaosan munistaan yleensä seuraavan aamupäivän puolivälissä.
Testis 7 (female)
Kun munia on laskettu riittävästi ja kun ne on hedelmöitetty, aikuiset eläimet on otettava pois lisääntymissäiliöstä.
The procedure is identical for the female.
Toukkien hoito ja valinta
Testis 8
Kun eläimet on otettu pois lisääntymissäiliöistä, munat kerätään ja niiden kehityskelpoisuus arvioidaan käyttämällä edustavaa alaryhmää kaikista lisääntymissäiliöistä peräisin olevista alkioista.
The completed procedure.
Parhaat yksittäiset mädit (mätien laadun arviointiin suositellaan kahta tai kolmea mätiä) tulee säilyttää alkioiden kehityskelpoisuuden ja riittävän alkiomäärän (vähintään 1500) perusteella.
Procedure 2 B:
Kaikkien tutkimuksessa käytettävien organismien on oltava peräisin yhdeltä kutukerralta (ts. mätejä ei saa sekoittaa keskenään).
Japanese Medaka (Oryzias latipes), Liver Pre-treatment for Vitellogenin Analysis
Alkiot siirretään suureen laakeaan astiaan, ja kaikki selvästi kuolleet tai poikkeavat munat (ks. määritelmä lähdeviitteestä (5)) poistetaan pipetillä tai vastaavalla instrumentilla.
Take the bottle of homogenate buffer from the ELISA kit and cool it with crushed ice (temperature of the solution: ≤ 4 °C).
Jokaisen kolmen mädin hyväkuntoiset alkiot siirretään kolmeen erilliseen hautomisastiaan.
If homogenate buffer from EnBio ELISA system is used, thaw the solution at room temperature, and then cool the bottle with crushed ice.
Kun mäti on ollut neljä päivää hautomisastiassa, valitaan kehityskelpoisuuden ja hautomisen onnistumisen perusteella paras mäti, ja toukat siirretään niin moneen kasvatussäiliöön kuin on tarpeen (lämpötila 22 ± 1 °C).
Calculate the volume of homogenate buffer for the liver on the basis of its weight (add 50 μl of homogenate buffer per mg liver weight for homogenate).
Lisäksi muutamia toukkia siirretään ylimääräisiin säiliöihin, ja niillä korvataan kasvatussäiliöissä ensimmäisen viikon aikana mahdollisesti kuolevat toukat.
For example, if the weight of the liver is 4,5 mg, the volume of homogenate buffer for the liver is 225 μl.
Tässä menetelmässä organismin tiheys pysyy vakiona, mikä vähentää yksittäisestä mädistä koostuvan kohortin sisäisiä kehityksellisiä eroavuuksia.
Prepare a list of the volume of homogenate buffer for all livers.
Kaikki kasvatussäiliöt on puhdistettava lapolla päivittäin.
Preparation of the liver for pre-treatment
Varotoimenpiteenä suositellaan käytettäväksi vinyyli- tai nitriilikäsineitä lateksikäsineiden sijasta.
Take the 1,5 ml microtube containing the liver from the freezer just before the pre-treatment.
Kuolleet toukat on poistettava säiliöstä päivittäin, ja niiden tilalle on lisättävä korvaavia toukkia, jotta organismin tiheys pysyy samana ensimmäisen viikon ajan.
Pre-treatment of the liver from males should be performed before females to prevent vitellogenin contamination.
Toukkia on ruokittava vähintään kahdesti päivässä.
In addition, the pre-treatment for test groups should be conducted in the following order:
Esialtistusvaiheen aikana sammakonpoikaset totutetaan varsinaisen altistusvaiheen olosuhteisiin, mukaan luettuina tyypillinen ruoka, lämpötila, valoisan ja pimeän vaihteluväli sekä kasvatusalusta.
The number of 1,5 ml microtubes containing liver samples taken from the freezer at a given time should not exceed the number that can be centrifuged at that time.
Sen vuoksi on suositeltavaa, että esialtistusvaiheessa ja altistusvaiheessa käytetään samaa kasvatus-/laimennusvettä.
Arrange the 1,5 ml microtubes containing liver samples in the order of specimen number on the ice rack (no need to thaw the liver).
Jos sammakonpoikasten ylläpitämisessä käytetään esialtistusvaiheessa staattista kasvatusjärjestelmää, kasvatusalusta on vaihdettava kokonaan vähintään kahdesti viikossa.
Operation of the pre-treatment
Esialtistusvaiheen aikaisesta suuresta toukkatiheydestä johtuvaa tungosta on vältettävä, koska siihen liittyvät seikat saattavat vaikuttaa merkittävästi sammakonpoikasten kehitykseen myöhemmässä testausvaiheessa.
Addition of the homogenization buffer
Siksi kasvatustiheys ei saa olla enempää kuin noin neljä sammakonpoikasta litrassa kasvatusalustaa (staattinen altistusjärjestelmä) tai kymmenen sammakonpoikasta litrassa kasvatusalustaa (kun virtausnopeus esialtistus- tai kasvatusjärjestelmässä on esimerkiksi 50 ml/min).
Check the list for the volume of the homogenate buffer to be used for a particular sample of liver and adjust the micropipette (volume range: 100-1000 μl) to the appropriate volume.
Tällaisissa olosuhteissa sammakonpoikasten tulisi kehittyä vaiheista 45/46 vaiheeseen 51 kahdentoista päivän kuluessa.
Attach a clean tip to the micropipette.
Tätä varastopopulaatiota edustavien sammakonpoikasten kehitysvaihe on tutkittava päivittäin, jotta voidaan arvioida, milloin on sopiva ajankohta altistuksen aloittamiselle.
Take the homogenate buffer from the reagent bottle and add the buffer to the 1,5 ml microtube containing the liver.
Stressin ja traumojen aiheuttamista sammakonpoikasille on pyrittävä välttämään etenkin toukkien liikuttamisen ja käsittelyn sekä akvaarioiden puhdistamisen aikana.
Add the homogenate buffer to all of 1,5 ml microtubes containing the liver according to the procedure described above.
Stressaavia olosuhteita ja toimenpiteitä on vältettävä.
There is no need to change the micropipette tip to a new one.
Sellaisia ovat esimerkiksi kova ja/tai jatkuva melu, akvaarioihin koputtelu, akvaarioihin kohdistuva tärinä, liiallisen vilkas toiminta laboratoriossa sekä ympäristön muutokset (valaistus, lämpötila, pH, liuennut happi, veden virtausnopeudet jne.).
However, if the tip is contaminated or suspected to be contaminated, the tip should be changed.
Jos sammakonpoikaset eivät kehity vaiheeseen 51 seitsemäntoista päivän kuluessa hedelmöittymisestä, liiallinen stressi on otettava huomioon mahdollisena syynä.
Homogenisation of the liver
Toukkien kasvatus ja ruokinta
Attach a new pestle for homogenisation to the microtube homogeniser.
Sammakonpoikasia ruokitaan esimerkiksi kaupallisesti saatavalla, validointitutkimuksissa käytetyllä sammakonpoikasten ravinnolla koko esialtistusvaiheen ajan (Nieuwkoopin ja Faberin (NF) vaiheen 45/46 (8)) jälkeen) ja koko 21 päivän mittaisen testausvaiheen ajan.
Insert the pestle into the 1,5 ml microtube.
Myös muuta ravintoa voidaan käyttää, kunhan on osoitettu, että AMA-tutkimuksen suorituskyky pysyy sen avulla yhtä hyvänä.
Hold the microtube homogeniser to press the liver between the surface of the pestle and the inner wall of the 1,5 ml microtube.
Ravinnon annostelua esialtistusvaiheen aikana on mukautettava huolellisesti, jotta se täyttää kehittyvien sammakonpoikasten tarpeet.
Operate the microtube homogeniser for 10 to 20 seconds.
Toisin sanoen hiljattain kehittyneille sammakonpoikasille on annettava pieniä annoksia ravintoa useita kertoja päivässä (ainakin kahdesti).
Cool the 1,5 ml microtube with crushed ice during the operation.
On vältettävä antamasta ravintoa liikaa, jotta i) veden laatu pysyy hyvänä ja ii) jotta ruokahiukkaset ja jätökset eivät tuki suodattimia.
Lift up the pestle from the 1,5 ml microtube and leave it at rest for about 10 seconds.
Validointitutkimuksissa käytetyn sammakonpoikasten ravinnon osalta päivittäisiä ruoka-annoksia tulee suurentaa sammakonpoikasten kasvaessa siten, että annos on 30 mg/eläin/päivä hieman ennen tutkimuksen aloittamista.
Then conduct a visual check of the state of the suspension.
Validointitutkimuksissa tämän kaupallisesti saatavilla olevan ravinnon on osoitettu tukevan X. laevis -lajin sammakonpoikasten kasvua ja kehitystä asianmukaisesti.
If pieces of liver are observed in the suspension, repeat the operations (3) and (4) to prepare satisfactory liver homogenate.
Kyseessä on hienojakoinen aines, joka pysyy suspendoituneena vesipatsaassa pitkän aikaa, ja se huuhtoutuu pois vedenvirtauksen mukana.
Cool the suspended liver homogenate on the ice rack until centrifugation.
Siksi ravinnon päivittäinen kokonaismäärä on jaettava pienempiin annoksiin, ja ne on annettava eläimille vähintään kahdesti päivässä.
Change the pestle to the new one for each homogenate.
Tämän ravinnon annosteluohje on taulukossa 1.
Homogenise all livers with homogenate buffer according to the procedure described above.
Ruokintakerrat on merkittävä muistiin.
Centrifugation of the suspended liver homogenate
Ravinto voidaan antaa kuivana tai laimennusvedestä valmistettuna varastoliuoksena.
Confirm the temperature of the refrigerated centrifuge chamber at ≤ 5 °C.
Tuoretta varastoliuosta on valmistettava joka päivä, ja sitä on säilytettävä 4 °C:ssa, kun sitä ei käytetä.
However, if the supernatants are adequately separated, centrifugal force and time may be adjusted as needed.
Ruoka-annos (mg ruokaa eläintä kohti päivässä)
If the separation is not adequate, centrifuge the suspension again under the same conditions.
Ennen tutkimuksen tekemistä testikemikaalin stabiilius on arvioitava sen liukoisuudesta, hajoavuudesta ja haihtuvuudesta saatavilla olevien tietojen perusteella.
Remove all specimens from the refrigerated centrifuge and arrange them in the order of specimen number on the ice rack.
Jokaisesta rinnakkaistestisäiliön testausliuoksesta ja jokaisesta pitoisuudesta on otettava näyte analyyttisen kemian analyyseja varten testin alkaessa (päivänä 0), ja testin aikana on otettava vähintään neljä näytettä viikoittain.
Be careful not to resuspend each separated layer after the centrifugation.
On myös suositeltavaa, että jokainen testipitoisuus analysoidaan järjestelmän valmistelun aikana ennen testin aloittamista järjestelmän tehokkuuden varmentamiseksi.
Collect the supernatant and dispense it to other two 0,5 ml microtubes in the same manner as described above.
Vesiliukoiset kemikaalit voidaan liuottaa testausveden alikvootteihin sellaisena pitoisuutena, jolla saadaan aikaiseksi testin tavoitepitoisuus läpivirtausjärjestelmässä.
Collect the rest of the supernatant with the micropipette (if feasible: ≥ 100 μl).
Kemikaalit, jotka ovat nestemäisiä huonelämpötilassa ja jotka liukenevat heikosti veteen, voidaan annostella käyttämällä neste-nestekyllästinmenetelmiä.
Then dispense the supernatant to the remaining 0,5 ml microtube.
Kemikaalit, jotka ovat kiinteitä huonelämpötilassa ja jotka liukenevat heikosti veteen, voidaan annostella käyttämällä lasivillaisia kyllästinkolonneja.
Close the cap of the 0,5 ml microtube and write the volume of the supernatant on the label.
Ensisijaisesti tulee käyttää kantoaineetonta testausjärjestelmää.
Then immediately cool the microtubes on the ice rack.
Eri testikemikaaleilla on kuitenkin erilaisia fysikaalis-kemiallisia ominaisuuksia, jotka todennäköisesti edellyttävät eri toimintatapoja kemikaalialtistusveden valmistamiselle.
Change the tip of the micropipette to the new one for each supernatant.
Liuottimia ja kantoaineita on syytä välttää seuraavista syistä:
If a large amount of lipid becomes attached to the tip, change it to the new one immediately to avoid contamination of the liver extract with fat.
Tämän testin tarkoituksia varten suurimmaksi testipitoisuudeksi on asetettava testikemikaalin liukoisuusraja;
Dispense all of the centrifuged supernatant to four 0,5 ml microtubes according to the procedure described above.
suurin siedetty pitoisuus (MTC) välittömästi myrkyllisten kemikaalien osalta;
After dispensing the supernatant to the 0,5 ml microtubes, place all of them in the tube rack with the identification label, and then freeze them in the freezer immediately.
tai 100 mg/l sen mukaan, mikä arvo on pienin.
If the VTG concentrations are measured immediately after the pre-treatment, keep one 0,5 ml microtube (containing 30 μl of supernatant) cool in the tube rack and transfer it to the workstation where the ELISA assay is conducted.
MTC-arvo on kemikaalin suurin testauspitoisuus, jonka aiheuttama välitön kuolleisuus on alle 10 prosenttia.
In such case, place the remaining microtubes in the tube racks and freeze them in the freezer.
Tässä lähestymistavassa oletetaan, että välittömästä myrkyllisyydestä on käytettävissä empiirisiä tietoja, joiden perusteella MTC-arvo voidaan arvioida.
After the collection of the supernatant, discard the residue adequately.
Vaikka regressiomallien käyttö voi olla teknisesti paras tapa arvioida MTC-arvo, olemassa olevista välitöntä myrkyllisyyttä koskevista tiedoista voidaan johtaa siitä käyttökelpoinen arvio käyttämällä kolmasosaa (1/3) välittömästä LC50-arvosta.
Storage of the specimen
Välitöntä myrkyllisyyttä koskevia tietoja ei kuitenkaan välttämättä ole saatavilla testattavasta lajista.
Store the 0,5 ml microtubes containing the supernatant of the liver homogenate at ≤ – 70 °C until they are used for the ELISA.
Jos lajikohtaisia tietoja välittömästä myrkyllisyydestä ei ole saatavilla, voidaan tehdä 96 tunnin LC50-testi niillä sammakonpoikasilla, jotka ovat AMA-tutkimuksessa testattaviin sammakonpoikasiin nähden edustavia (eli samassa kehitysvaiheessa).
Zebrafish, Blood Collection from the Caudal Vein / Artery
Jos kemikaali ei ole välittömästi myrkyllinen ja jos sen liukoisuus on yli 100 mg/l, suurimpana testipitoisuutena tulee vaihtoehtoisesti pitää arvoa 100 mg/l, koska tätä pitoisuutta pidetään yleensä ’käytännössä myrkyttömänä’.
Immediately following anaesthesia, the caudal peduncle is severed transversely, and the blood is removed from the caudal artery/vein with a heparinised microhematocrit capillary tube.
Myös staattisia menetelmiä, joissa testiliuos ei vaihdu, voidaan käyttää – vaikka niiden käyttöä ei suositella –, jos läpivirtausmenetelmät ovat epätarkoituksenmukaiset MTC-arvon määrittämisessä.
Blood volumes range from 5 to 15 μl depending on fish size.
Jos käytetään staattisia menetelmiä, testikemikaalin pitoisuuden stabiilius on dokumentoitava, ja sen on pysyttävä vaadituissa rajoissa.
An equal volume of aprotinin buffer (6 μgml in PBS) is added to the microcapillary tube, and plasma is separated from the blood via centrifugation (5 minutes at 600 g).
Vaihtoväliksi suositellaan kahtakymmentäneljää tuntia.
Plasma is collected in the test tubes and stored at – 20 °C until analyzed for vitellogenin or other proteins of interest.
Yli 72 tunnin vaihtovälit eivät ole hyväksyttäviä.
Procedure 3B:
Lisäksi jokaisen vaihtovälin lopussa on mitattava veden laatua koskevat parametrit (ts. liuennut happi, lämpötila, pH jne.) välittömästi ennen vaihtoa.
Zebrafish, Blood Collection by Cardiac Puncture
Testipitoisuuden vaihteluväli
To avoid coagulation of blood and degradation of protein the samples are collected within Phosphate-buffered saline (PBS) buffer containing heparin (1000 units/ml) and the protease inhibitor aprotinin (2 TIU/ml).
Vähimmäisvaatimus on kolme testipitoisuutta ja puhdas vesi -kontrolli (ja kantaja-ainekontrolli, jos tarpeen).
As ingredients for the buffer, heparin ammonium salt and lyophilised aprotinin are recommended.
Suurimman ja pienimmän testipitoisuuden vähimmäiseron on oltava noin yksi suuruusluokka.
For blood sampling, a syringe (1 ml) with a fixed thin needle (e.g. Braun Omnikan-F) is recommended.
Annoksen erottelussa enimmäisarvo on 0,1 ja vähimmäisarvo 0,33.
The syringe should be prefilled with buffer (approximately 100 μl) to completely elute the small blood volumes from each fish.
Testin aloittaminen ja tekeminen
The blood samples are taken by cardiac puncture.
Altistus tulee aloittaa, kun riittävä määrä esialtistuksen varastopopulaation sammakonpoikasista on saavuttanut kehitysvaiheen 51 (Nieuwkoopin ja Faberin (8) mukaan) ja kun niiden ikä hedelmöittymisen jälkeen on jotakuinkin tai täsmälleen 17 päivää.
At first the fish should be anesthetized with MS-222 (100 mg/l).
Koe-eläimiksi valitaan varastopopulaatiosta terveitä ja normaalin näköisiä sammakonpoikasia.
The proper plane of anaesthesia allows the user to distinguish the heartbeat of the zebrafish.
Ne on laitettava yhteen astiaan, joka sisältää asianmukaisen määrän laimennusvettä.
While puncturing the heart, keep the syringe piston under weak tension.
Jotta kehitysvaihe voidaan määrittää, sammakonpoikaset on otettava yksitellen pois yhteissäiliöstä käyttämällä pientä haavia tai siivilää, ja ne on siirrettävä läpinäkyvään mittausastiaan (esimerkiksi 100 mm:n petrimaljaan), joka sisältää laimennusvettä.
Collectable blood volumes range between 20 - 40 microliters.
Kehitysvaiheen määrittämisessä ei suositella käyttämään nukutusta, mutta sammakonpoikaset voi nukuttaa yksitellen trikaiinimetaanisulfonaatilla (esimerkiksi MS-222:lla) (100 mg/l), joka on puskuroitu asianmukaisesti natriumbikarbonaatilla (pH 7,0) ennen käsittelyä.
After cardiac puncture, the blood/buffer-mixture should be filled into the test tube.
Jos koe-eläimet nukutetaan, asianmukainen menetelmä, jolla esimerkiksi MS-222:ta käytetään nukuttamiseen, on pyydettävä laboratorioista, joissa siitä on kokemusta, ja menetelmä on ilmoitettava testitulosten yhteydessä.
Plasma is separated from the blood via centrifugation (20 min; 5000 g) and should be stored at – 80 °C until required for analysis.
Eläimiä on käsiteltävä tämän siirtymän aikana varovasti, jotta käsittelystä aiheutuu mahdollisimman vähän stressiä ja jotta kaikki mahdolliset vammat vältetetään.
Procedure 3C:
Eläinten kehitysvaihe määritetään käyttämällä kaksiokulaarista dissektiomikroskooppia.
SOP:
Jotta kehitysvaiheen vaihtelu voidaan pitää mahdollisimman pienenä, on tärkeää, että tämä määritys tehdään niin tarkasti kuin mahdollista.
Zebrafish, homogenisation of head & tail
Nieuwkoopin ja Faberin (8) mukaan ensisijainen kehityksellinen tunnusmerkki, jonka perusteella vaiheessa 51 olevat organismit valitaan, on takajalan morfologia.
The fish are anaesthetised and euthanised in accordance with the test description.
Takajalkojen morfologiset ominaisuudet on tutkittava mikroskoopilla.
The head and tail are cut of the fish in accordance with Figure 1.
Vaikka Nieuwkoopin ja Faberin (8) oppaan täydellisestä versiosta saa tarkat tiedot sammakonpoikasten kehitysvaiheista, vaiheen voi kuitenkin määrittää luotettavasti selvien morfologisten tunnusmerkkien perusteella.
Important:
Seuraavassa taulukossa kehitysvaiheet on esitetty yksinkertaisesti ja vakioidusti, ja sitä voi käyttää koko tutkimuksen ajan, kun tavoitteena on tunnistaa eri kehitysvaiheisiin liittyvät selvät morfologiset tunnusmerkit, olettaen, että kehitys on normaalia.
All dissection instruments, and the cutting board should be rinsed and cleaned properly (e.g. with 96 % ethanol) between handling of each single fish to prevent “vitellogenin pollution” from females or induced males to uninduced males.
Nieuwkoopin ja Faberin ohjeisiin perustuvat selvät morfologiset kehitysvaiheiden tunnusmerkit.
Cut behind
Selvät morfologiset tunnusmerkit
Cut behind dorsal fin
Kehitysaste (vaihe)
For Vtg analysis
Takajalka
For gonad histology
Etujalka
The weight of the pooled head and tail from each fish is measured to the nearest mg.
Kraniofasiaalinen rakenne
After being weighed, the parts are placed in appropriate tubes (e.g. 1,5 ml eppendorf) and frozen at – 80 °C until homogenisation or directly homogenised on ice with two plastic pistils.
Hajuhermon morfologia
(Other methods can be used if they are performed on ice and the result is a homogenous mass).
Pyrstön pituus
The tubes should be numbered properly so that the head and tail from the fish can be related to their respective body-section used for gonad histology.
Testin alussa kaikkien sammakonpoikasten tulee olla vaiheessa 51.
When a homogenous mass is achieved, 4 x the tissue weight of ice-cold homogenisation buffer is added.
Selvin morfologinen tunnusmerkki tässä kehitysvaiheessa on takajalan morfologia, joka on esitetty kuvassa 1
Keep working with the pistils until the mixture is homogeneous.
laevis -lajin poikasen takajalan morfologia vaiheessa 51.
Important note:
Kehitysvaiheen valinnan lisäksi myös koe-eläinten kokoon perustuvaa valintaa voidaan käyttää.
New pistils are used for each fish.
Tällöin on mitattava koko ruumiin pituus (ei siis pelkästään kuonon ja peräaukon välistä pituutta) päivänä 0 alaryhmästä, joka koostuu noin kahdestakymmenestä (Nieuwkoopin ja Faberin) vaiheessa 51 olevasta sammakonpoikasesta.
The samples are placed on ice until centrifugation at 4 °C at 50000 × g for 30 min.
Kun tämän ryhmän eläinten koko ruumiin keskimääräinen pituus on laskettu, voidaan asettaa koe-eläinten koko ruumiin vähimmäis- ja enimmäisrajat siten, että keskiarvon vaihteluväli saa olla ± 3 mm (keskiarvot vaiheessa 51 olevien sammakonpoikasten koko ruumiin pituudesta, joka vaihtelee välillä 24,0–28,1 mm).
Use a pipette to dispense portions of 20 μl supernatant into at least two tubes by dipping the tip of the pipette below the fat layer on the surface and carefully sucking up the supernatant without fat- or pellet fractions.
Kunkin koe-eläimen kypsyyden määrittämisessä ensisijainen parametri on kuitenkin kehitysvaihe.
The tubes are stored at – 80 °C until use.
Sammakonpoikaset, joilla on selvästi näkyviä epämuodostumia tai vammoja, on suljettava pois tutkimuksesta.
Homogenisation buffer:(50 mM Tris-HCl pH 7,4; 1 % Protease inhibitor cocktail (Sigma)):
Edellä kuvatut kehitysvaihekriteerit täyttävät sammakonpoikaset pidetään puhdasta kasvatusvettä sisältävässä säiliössä siihen saakka, kunnes kehitysvaiheen määritys on tehty.
12 ml Tris-HCl pH 7,4 + 120 μl Protease inhibitor cocktail.TRIS:
Määrityksen jälkeen toukat jaetaan satunnaisesti altistuskäsittelysäiliöihin, kunnes jokaisessa säiliössä on 20 toukkaa.
TRIS-ULTRA PURE (ICN) e.g. from Bie & Berntsen, Denmark.Protease inhibitor cocktail:
Sen jälkeen jokaisesta säiliöstä tarkastetaan, onko siellä eläimiä, joiden ulkonäkö on poikkeava (niillä on esimerkiksi vammoja tai niiden uintikäyttäytyminen on poikkeavaa).
From Sigma (for mammalian tissue) Product number P 8340.Note:
Selvästi sairailta näyttävät sammakonpoikaset on poistettava käsittelysäiliöistä, ja niiden tilalle on laitettava keruusäiliöstä valitut uudet toukat.
The homogenisation buffer should be used the same day as manufactured.
Tarkempia tietoja testin päättämiseen liittyvistä menettelyistä ja sammakonpoikasten käsittelystä on OECD:n ohjeasiakirjassa ’Amphibian Thyroid Histology’ (9).