natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Pooled samples in RNA stabilization reagent shall be treated like single samples in RNA stabilization reagent.
Supernatantin vähintään kahden laimennoksen osanäytteet on sekoitettava, ja niitä on inkuboitava erikseen 60 minuutin ajan 15 °C:ssa yhdessä seuraavien reagenssien samansuuruisten osien kanssa:
If larger samples are pooled, the extraction kits or methods must reflect this pooling.
seerumi, joka sisältää IHN-viruksen ryhmäspesifistä vasta-ainetta 1:50-laimennoksena (vol:vol);
Samples collected in RNA stabilization reagents shall not be used for cell cultivation.
IPN-viruksen kotoperäisten serotyyppien antiseerumiseosta 1:50-laimennoksena (vol:vol);
Pooling of samples for RT-qPCR
pelkkää elatusainetta (positiivikontrolli).
As the RT-qPCR protocols given are of similar or higher sensitivity than the cell cultivation methods, it may be acceptable to use supernatant from homogenised fish tissue material of pooled organs from up to 10 fish in cell culture medium for PCR.
Kustakin viruksen supernatantti-seerumi-seoksesta on inokuloitava vähintään kaksi soluviljelmää 50 μl:lla kukin ja sitten inkuboitava 15 °C:ssa.
However, due to the much smaller inoculum used for PCR compared to cell cultivation, all fish tissues shall be carefully homogenised before collating material for extraction.
Sytopaattisen vaikutuksen kehittyminen on tarkastettava I.5.4 kohdassa kuvatulla tavalla.
However, in that case it is often difficult to collect representative material from up to 10 fish in one tube, and the number of fish per pool shall therefore be reduced to 2 to 5.
Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää muita yhtä tehokkaiksi osoitettuja neutralisaatiotestejä.
Virological examination on cell culture
Kaikki RNA:han liittyvä työ on suoritettava jäähauteessa käsineet kädessä.
Cell cultures and media
RNA on eristettävä käyttämällä fenolikloroformimenetelmää tai affiniteettipuhdistamalla RNA spin-kolonneilla valmistajan ohjeiden mukaisesti.
Bluegill fry cell line -2 (BF-2) or Rainbow trout gonad cell line - 2 (RTG-2) and either Epithelioma papulosum cyprini (EPC) or Fathead minnow (FHM) cells shall be grown at 20 to 30 °C in suitable medium, namely Eagle's Minimum essential medium (MEM) or modifications thereof, with a supplement of 10 % foetal bovine serum and antibiotics in standard concentrations.
Kaupallisia RNA-eristämiskittejä, jotka tuottavat korkealaatuisia RNA:ta, joka soveltuu käytettäväksi jäljempänä esitettyjen PCR-protokollien kanssa, saa käyttää.
When the cells are cultivated in closed vials, the medium shall be buffered with bicarbonate.
RNA on suspendoitava uudelleen tislattuun RNase-vapaaseen veteen (eli 0,1-prosenttisella dietyyli-pyrokarbonaatilla käsiteltyyn veteen) tai soveltuvaan eluointipuskuriin.
The pH must be 7,6 ± 0,2.
Etualuke 5′-AGA-GAT-CCC-TAC-ACC-AGA-GAC-3′;
The cell cultures to be used for inoculation with fish tissue material shall be young, normally 1 day old cell culture monolayers where possible; however, a range between 4 to 48 hours old may be accepted.
Taka-aluke 5′-GGT-GGT-GTT-GTT-TCC-GTG-CAA-3′.
The cells must be actively growing at inoculation.
On käytettävä seuraavia syklejä (yksivaiheinen RT-PCR): 1 sykli: 50 °C 30 minuuttia; 1 sykli: 95 °C 2 minuuttia; 30 sykliä: 95 °C 30 sekuntia, 50 °C 30 sekuntia, 72 °C 60 sekuntia; 1 sykli: 72 °C 7 minuuttia ja liotus 4 °C:ssa.
Inoculation of cell cultures
VHS-viruksen osoittamiseksi on käytettävä seuraavia alukkeita:
At least two cell lines shall be inoculated as referred to in point I.5.1.
Tämän jälkeen reaktiota on pidettävä vähintään 68 ƒC:n lämpötilassa 7 minuutin ajan.
The ratio between inoculum size and volume of cell culture medium shall be about 1:10.
RT-PCR-reaktioiden määrä ja spesifisyys on arvioitava geelielektroforeesilla 1,5-prosenttisessa agaroosigeelissä, jossa on etidiumbromidia, ja todettava käyttämällä UV-läpivalaisua.
For each dilution and each cell line, a minimum of about 2 cm2 cell area, corresponding to one well in a 24-well cell culture tray, shall be utilised.
IHN-viruksen osalta voidaan havaita 693 emäsparin PCR-amplikoni.
Cell culture trays shall be used where possible.
VHS-viruksen osalta sen on oltava kooltaan 505 emäsparia.
Incubation of cell cultures
PCR-reaktion tulokset saattavat vaihdella suoritusolosuhteiden mukaan, joten lämpötilaprotokollat saatetaan joutua optimoimaan käytössä olevan lämpöblokin mukaan.
The inoculated cell cultures shall be incubated at 15 °C for seven to 10 days.
Lisäksi voi ilmetä vääriä positiivisia tuloksia alukkeen väärän kiinnittymisen tai laboratorion saastumisen vuoksi.
If the colour of the cell culture medium changes from red to yellow indicating medium acidification, pH adjustment with sterile bicarbonate solution or equivalent substances shall be performed to ensure cell susceptibility to virus infection.
Siksi on varmuuden vuoksi otettava mukaan asianmukaiset positiivi- ja negatiivikontrollit sekä sekvenssiamplikonit.
At least every 6 months or if decreased cell susceptibility is suspected, titration of frozen stocks of VHSV and IHNV shall be performed to verify the susceptibility of the cell cultures to infection.
VHS-virusalukkeiden osalta on oltava erityisen varovainen käytettäessä BF-2-soluja, sillä alukkeet voivat reagoida solulinjan DNA/RNA:n kanssa ja antaa samansuuruisia vääriä positiivisia tuloksia.
The procedure set out in Section III shall be used, if possible.
Kun testataan supernatanttia BF-2-soluista, mahdolliset monistetut PCR-fragmentit on sekvensoitava.
Microscopy
VHS-virusmääritystä varten on suoritettava monistus käyttämällä seuraavia alukkeita ja koettimia:
Inoculated cell cultures shall be inspected regularly, at least three times a week, for the occurrence of CPE at 40 to 150 × magnification.
Etualuke: 5′-AAA-CTC-GCA-GGA-TGT-GTG-CGT-CC-3′;
If obvious CPE is observed, virus identification procedures in accordance with point I.6 shall be initiated immediately.
Taka-aluke: 5′-TCT-GCG-ATC-TCA-GTC-AGG-ATG-AA-3′;
Subcultivation
ja koetin: 5′-FAM-TAG-AGG-GCC-TTG-GTG-ATC-TTC-TG-BHQ1.
If no CPE has developed after the primary incubation for 7 to 10 days, subcultivation shall be performed to fresh cell cultures utilising a cell area similar to that of the primary culture.
Yksivaiheinen RT-qPCR:
Aliquots of medium (supernatant) from all cultures or wells constituting the primary culture shall be pooled according to cell line 7 to 10 days after inoculation.
Negatiiviset templaattikontrollit ja positiivikontrollit on sisällytettävä kuhunkin levyajoon.
The pools shall then be inoculated into homologous cell cultures undiluted and diluted 1:10 (resulting in final dilutions of 1:10 and 1:100, respectively, of the supernatant) as described in point I.5.2.
Ajo-olosuhteet: 50 °C 30 minuuttia, 95 °C 15 minuuttia, 40 sykliä 94 °C 15 sekuntia, 60 °C 40 sekuntia ja 72 °C 20 sekuntia; mukautettava tarvittaessa.
Alternatively, aliquots of 10 % of the medium constituting the primary culture shall be inoculated directly into a well with fresh cell culture (namely, well to well subcultivation).
Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää muita yhtä tehokkaiksi osoitettuja RT-PCR- tai RT-qPCR-versioita.
The inoculation may be preceded by pre-incubation of the dilutions with the antiserum to IPN virus at appropriate dilution as described in point I.4.3.
IHN-viruksen osalta on suoritettava monistus käyttämällä seuraavia alukkeita ja koetinta:
The inoculated cultures shall then be incubated for 7 to 10 days at 15 °C and inspected in accordance with point I.5.4.
Etualuke: 5′- AGA-GCC-AAG-GCA-CTG-TGC-G-3′;
If toxic CPE occurs within the first 3 days of incubation, subcultivation shall be performed at that stage, but the cells shall then be incubated for 7 days and sub cultivated again with further 7 days incubation.
Taka-aluke: 5′- TTCTTTGCGGCTTGGTTGA – 3′;
When toxic CPE develops after 3 days, the cells shall be passed once and incubated to achieve the total of 14 days from the primary inoculation.
ja koetin: 5′ 6FAM-TGAGACTGAGCGGGACA-NFQ/MGB.
There must be no evidence of toxicity in the final 7 days of incubation.
Kaksivaiheinen RT-qPCR:
If bacterial contamination occurs despite treatment with antibiotics, subcultivation shall be preceded by centrifugation at 2000 to 4000 × g for 15 to 30 minutes at 2 to 5 °C, or filtration of the supernatant through a 0,45 μm filter or both (low protein-binding membrane).
Koska seuraava määritys riippuu kaksivaiheisesta monistuksesta, on noudatettava erityistä varovaisuutta käsiteltäessä putkia yhdestä reaktiosta toiseen saastumisen ehkäisemiseksi.
In addition to this, subcultivation shall follow the same procedures as described for toxic CPE in the fourth paragraph of this point.
Ajo-olosuhteet (RT-vaiheen jälkeen): 50 °C 2 minuuttia, 95 °C 10 minuuttia, minkä jälkeen 40 sykliä 95 °C 15 sekuntia ja 60 °C 1 minuutti; mukautettava tarvittaessa.
If no CPE occurs, the test may be declared negative.
II Yksityiskohtaiset diagnostiset menetelmät ja menettelyt VHS- tai IHN- tai molempien epäilyn vahvistamiseksi tai poissulkemiseksi epäillyissä taudinpurkauksissa
Virus identification
Kun IHN- tai VHS-taudin tai molempien esiintymisen vahvistamiseksi tai poissulkemiseksi direktiivin 2006/88/EY 57 artiklan b alakohdan mukaisesti edellytetään laboratoriotutkimusta, jossa käytetään liitteessä I olevan 1 osan II.3 kohdassa vahvistettuja diagnostisia menetelmiä, on sovellettava seuraavia yksityiskohtaisia diagnostisia menetelmiä ja menettelyjä:
If evidence of CPE has been observed in a cell culture, medium (supernatant) shall be collected and examined by one or more of the following techniques: Enzyme-linked immunosorbent essay (ELISA), Immunofluorescence (IF), neutralisation, RT-PCR or RT-qPCR.
tavanomainen viruseristys ja sen jälkeen virusneutralisaatio, viruksen immunokemiallinen tai molekulaarinen tunnistaminen,
If these tests have not allowed definitive identification of the virus within 1 week, the supernatant shall be forwarded to the national reference laboratory or to the EU reference laboratory for fish diseases referred to in Annex VI to Directive 2006/88/EC for immediate identification.
viruksen osoittaminen RT-PCR- tai RT-qPCR-menetelmällä;
A double antibody sandwich ELISA shall be performed in order to identify the virus isolate.
muut diagnostiset menetelmät, kuten IFAT, ELISA, RT-PCR, IHC.
Microwell plates shall be coated with 50 μl/well (0,9 pg) of proven quality protein-A purified immunoglobulins(Ig) from rabbit antisera against IHNV or VSHV diluted in carbonate buffer (pH 9,6) containing 15 mM sodium azide and incubated from 18 hours to 2 weeks at 4 °C.
1 Tavanomainen viruseristys ja sitä seuraava viruksen serologinen tunnistaminen
On a dilution plate, each sample containing 1 % Triton X-100 and the positive controls shall be diluted with buffer solution (namely, phosphate buffered saline (PBS)-T-BSA, 1 % BSA) in a 4-fold dilution: undiluted, 1:4, 1:16, 1:64.
Näytteiden valinta
50 μl of horseradish-peroxidase (HRP) conjugated rabbit anti mouse antibodies diluted 1:1000 in PBS-T-BSA shall be transferred to the ELISA plate.
Näytteiden valmistelu soluviljelytutkimusta varten
Finally, after renewed washing the reactions shall be developed adding 50 μl/well of ortho-phenylenediamine (OPD).
Näytteiden valmistelussa soluviljelytutkimusta varten tavanomaista viruseristystä varten on noudatettava I.4 kohdassa vahvistettuja menetelmiä ja menettelyjä.
The ELISA plates shall be incubated for 20 minutes at room temperature in the dark and the reaction shall be stopped by adding 100 μl/well 0,5 M H2SO4.
Virologisessa tutkimuksessa tavanomaista viruseristystä varten on noudatettava I.5 kohdassa vahvistettuja menetelmiä ja menettelyjä.
The absorbance shall be monitored at a wavelength of 492 and 620 nm in an ELISA reader.
2 Viruksen osoittaminen RT-qPCR-menetelmällä
Samples shall be designated positive or negative after comparing the test results to the absorbance values for the positive and negative controls.
Näytteiden valinnassa tavanomaista viruseristystä varten on noudatettava I.1.2 kohdassa vahvistettuja menetelmiä ja menettelyjä.
In general, samples with combined absorbance (A) < 0,5 for undiluted material shall be considered negative, samples with A values between 0,5 and 1,0 shall be considered suspicious and samples with A values > 1,0 shall be considered positive.
II.2.2 Kaloista otettujen näytteiden valmistelu ja lähettäminen
Other ELISA versions with a proven similar efficacy may be used instead of those referred to in this point.
Diagnostisen lisäaineiston keräämisessä viruksen osoittamiseksi RT-qPCR-menetelmällä on noudatettava I.3 kohdassa vahvistettuja menetelmiä ja menettelyjä.
Immunofluorescence- IF
Näytteiden valmistelu RT-qPCR-menetelmää varten
The identification of listed pathogens VHSV and IHNV shall be performed by infecting cells in ‘Black’ 96-well plates, conventional 24-well plates or cover slips into 24-well plates.
Näytteiden valmistelussa viruksen osoittamiseksi RT-qPCR-menetelmällä on noudatettava I.6.4.1 kohdassa vahvistettuja menetelmiä ja menettelyjä.
When IHNV or VHSV or both are identified by infecting cells on cover slips, the following protocol shall apply:
Viruksen osoittamisessa RT-qPCR-menetelmällä on noudatettava I.6.4.1, I.6.4.3 ja I.6.4.4 kohdassa vahvistettuja menetelmiä ja menettelyjä.
cover slips shall be seeded with cells at a density leading to between 60 % and 90 % confluence after 24 hours of cultivation.
3 Muut diagnostiset menetelmät
EPC cells shall be used where possible for this purpose because of their strong adherence to glass surfaces, but other cell lines such as BF-2, RTG-2 or FHM may be used as well.
I.4.3 kohdassa kuvatulla tavalla valmistetulle supernatantille voidaan tehdä I.6.1 kohdan mukaisesti ELISA, I.6.2 kohdan mukaisesti epäsuora fluoresenssivasta-ainetesti (IFAT) tai I.6.4 kohdan mukaisesti RT-PCR-menetelmä.
subsequently, cell culture medium shall be removed, and the infected cell monolayers fixed with 0,5 ml ice-cold, aqueous acetone solution (80 % vol:vol).
Kyseisiä nopeita menetelmiä on täydennettävä virologisella tutkimuksella II kohdan joko a tai b alakohdan mukaisesti 48 tunnin kuluessa näytteenotosta, jos
Fixation shall take place in fume hood for 15 minutes at room temperature, then the acetone solution shall be removed and the cover glasses shall be air dried for at least 30 minutes.
on saatu negatiivinen tulos; tai
At this stage, the plates shall either be processed immediately or stored at – 20 °C for further use;
ensimmäistä IHN- tai VHS-tapausta edustavasta aineksesta on saatu positiivinen tulos.
specific monoclonal antibodies (namely for VHSV identification, MAb IP5B11 and for IHNV, Hyb 136-3 respectively) shall be diluted in 0,01 M PBST, pH 7,2 in the dilution recommended by the provider of the MAbs; 50 to 100 μl/well shall be added to the fixed monolayer and plates shall be incubated for one hour at 37 °C in a humid chamber;
III Titraatiomenettely soluviljelmien infektioherkkyyden tarkistamiseksi
cover glasses shall be washed gently three times with PBS containing 0,05 % Tween-20 (PBS-T), and the buffer shall be removed completely after the last rinse.
Kun suoritetaan I.5.3 kohdassa tarkoitettu titraatio soluviljelmien infektioherkkyyden tarkistamiseksi, on noudatettava tämän kohdan seuraavissa kohdissa vahvistettuja menettelyjä.
The cells shall subsequently be incubated for one hour at 37 °C with fluorescein isothiocyanate (FITC) — or tetramethylrhodamine-5-(and-6-) isothiocyanate (TRITC)-conjugated antibodies against mouse immunoglobulin used as the primary antibody, diluted according to the supplier instructions, washed again in PBS-T, and dried.
On käytettävä ainakin kahta VHS-virusisolaattia ja yhtä IHN-virusisolaattia.
Stained cultures shall be mounted onto glass slides using glycerol saline and examined under incident ultraviolet (UV) light.
Isolaattien on edustettava tärkeimpiä Euroopan unionissa esiintyviä virusryhmiä, esimerkiksi VHS-viruksen osalta on mukana oltava yksi kirjolohen patogeeninen isolaatti makeasta vedestä ja yksi piikkikampelan patogeeninen isolaatti merivedestä ja IHN-viruksen osalta yksi kirjolohen patogeeninen kanta Euroopan unionista.
Use 10 × or 12 × eyepieces and a × 25 or × 40 objective lens with numerical apertures > 0,7 and > 1,3 respectively.
On käytettävä jäsenvaltioista peräisin olevia hyvin määriteltyjä isolaatteja.
Other IF techniques, with regard to cell cultures, fixation and antibodies of reference quality, of proven similar efficacy may be used instead.
Viruksia, jotka ovat peräisin vain muutaman kerran siirrostetuista viljelmistä, on viljeltävä solusviljelypulloissa, joissa on BF-2- tai RTG-2-soluja VHS-virusmääritystä varten tai EPC- tai FHM-soluja IHN-virusmääritystä varten.
Neutralisation
Soluviljelyelatusaineessa on oltava vähintään 10 % seerumia.
serum containing group specific antibody against VHSV at a 1:50 (vol:vol) dilution;
Virus on säilytettävä – 80 °C:ssa.
serum containing group specific antibody against IHNV at a 1:50 (vol:vol) dilution;
Viikon kuluttua jäädyttämisestä kolme rinnakkaisnäytepulloa on sulatettava kylmässä vedessä, ja virusnäytteet on titrattava vastaavilla solulinjoillaan.
pool of antisera against the indigenous serotypes of IPNV at a 1:50 (vol:vol) dilution;
Vähintään 6 kuukauden välein tai aina, kun epäillään solulinjan herkkyyden vähentyneen, kukin virusisolaatti on sulatettava ja titrattava.
medium alone (positive control).
Titraatiomenettelyt on kuvattava yksityiskohtaisesti, ja joka kerran on noudatettava samaa menettelyä.
From each virus supernatant-serum mixture, at least two cell cultures shall be inoculated with 50 μl each and then incubated at 15 °C.
Jos titrauksessa määritetään loppupistelaimennos, määritykseen on otettava vähintään 6 rinnakkaisnäytettä kustakin laimennusvaiheesta.
The development of CPE shall be checked as described in point I.5.4.
Tittereitä on verrattava aiemmin saatuihin tittereihin.
VHSV strains and isolates that do not react in neutralisation tests shall be identified by IF or ELISA.
Jos jollekin kyseisiin kolmeen virusisolaattiin kuuluvista isolaateista saadaan titteri, joka laskee 2 log-kertaluvun verran tai enemmän kuin alkuperäinen titteri, kyseistä solulinjaa ei saa enää käyttää seurantatarkoituksiin.
Other neutralisation tests of proven similar efficacy may be used instead.
Jos laboratoriossa pidetään erilaisia solulinjoja, kukin linja on tutkittava erikseen.
RT-PCR/RT-qPCR
Kirjanpito on säilytettävä vähintään 10 vuotta.
RNA shall be extracted using the phenol-chloroform method or by RNA affinity spin columns, according to the manufacturer's instructions.
Kun KHV-taudin esiintymisen vahvistamiseksi tai sen epäilyn poissulkemiseksi direktiivin 2006/88/EY 57 artiklan b alakohdan mukaisesti edellytetään laboratoriotutkimusta, jossa käytetään liitteessä I olevan 2 osan III jaksossa vahvistettuja diagnostisia menetelmiä, on sovellettava tämän osan I.1–I.2 kohdassa vahvistettuja yksityiskohtaisia diagnostisia menetelmiä ja menettelyjä:
Commercially available RNA extraction kits that will produce high quality RNA suitable for use with the RT-PCR protocols detailed in the points below may be used.
1 Kaloista otettujen näytteiden valmistelu
RNA shall be re-suspended in distilled RNAse-free water, (namely water treated with 0,1 % diethyl pyrocarbonate) or an appropriate elution buffer.
Diagnostisia tarkoituksia varten testauksessa tavanomaisilla PCR- tai qPCR-reaktioon perustuvilla menetelmillä voidaan käyttää kaloja (lähetettyinä elävinä tai tapettuina ja erikseen pakattuina aseptisiin sinetöityihin säiliöihin) tai vaihtoehtoisesti jäädytettyjä elimiä tai elinten kappaleita, jotka on säilötty absoluuttiseen etanoliin tai virusperäiseen kuljetuselatusaineeseen (käsiteltävä 48 tunnin kuluessa keräämisestä).
The following primers shall be used for detection of IHNV:
KH-viruksen osoittamiseksi on kerättävä kidukset ja munuaiset; erilliseen lisänäytteeseen voidaan sisällyttää lisäksi perna, aivot ja suolet.
Forward Primer 5′-AGA-GAT-CCC-TAC-ACC-AGA-GAC-3′;
Akuuteissa tapauksissa voidaan yhdistää enintään viiden kalan kudosainesta.
Reverse Primer 5′-GGT-GGT-GTT-GTT-TCC-GTG-CAA-3′.
Lisäksi ei-tappavia näytteitä, kuten verta, kiduspyyhkäisynäytteitä, kidusbiopsiaa tai limakalvon kaavintanäytteitä, voidaan käyttää tietyissä tapauksissa (eli hyvin arvokkaita kaloja voidaan käyttää, jos epäillään KH-viruksen esiintymistä).
The following cycles shall be used (one-step RT-PCR): 1 cycle: 50 °C for 30 minutes; 1 cycle: 95 °C for 2 minutes; 30 cycles: 95 °C for 30 seconds, 50 °C for 30 seconds, 72 °C for 60 seconds; 1 cycle: 72 °C for 7 minutes and soak at 4 °C.
DNA:n eristäminen
The following primers shall be used for detection of VHSV:
DNA on eristettävä standardimenettelyjen mukaisesti.
VN For 5′-ATG-GAA-GGA-GGA-ATT-CGT-GAA-GCG-3′;
Kaupallisesti saatavilla olevia DNA:n eristämiskittejä, jotka tuottavat korkealaatuisia DNA:ta, joka soveltuu käytettäväksi I.2 kohdassa tarkoitettujen PCR-protokollien kanssa, saa käyttää.
VN Rev 5′-GCG-GTG-AAG-TGC-TGC-AGT-TCC-C-3′.
I.2.1 qPCR-menetelmä KH-viruksen osoittamista varten
Subsequently, the reaction shall be held at 68 °C for 7 minutes.
Etualuke (KHV-86f): 5′- GACGCCGGAGACCTTGTG -3′;
Quantity and specificity of the RT-PCR reactions shall be evaluated by gel electrophoresis in 1,5 % agarose gel with ethidium bromide and observed using UV transillumination.
Taka-aluke (KHV-163r): 5′- CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT -3′;
A 693 bp PCR amplicon may be observed for IHNV.
ja koetin (KHV-109p): 5′-FAM- CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG -3′.
For VHSV, the size shall be 505 bp.
Ajo-olosuhteet: yksi sykli 95 °C 15 minuuttia, minkä jälkeen 40 sykliä 94 °C 15 sekuntia ja 60 °C 60 minuuttia.
The results of the PCR may vary depending on the conditions under which it is performed, namely the thermal protocols might need optimisation, depending on the thermal cycler in use.
Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää muita yhtä tehokkaiksi osoitettuja qPCR-versioita.
Furthermore, false-positive results may occur because of false primer annealing or laboratory contamination.
On käytettävä tässä kohdassa kuvattua KH-viruksen tymidiinikinaasi (TK) -geeniin kohdistuvaa määritystä.
Adequate positive and negative controls and sequence amplicons shall therefore be included to avoid any doubts.
Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää muita PCR-määrityksiä, jolla on osoitettu olevan vastaava herkkyys ja spesifisyys.
For the VHSV primers, special care shall be taken when using BF-2 cells, as the primers may react with the cell line DNA/RNA producing false-positive results of similar size.
Etualuke (KHV-TKf): 5′-GGGTTACCTGTAC GAG-3′;
RT-qPCR for VHSV
Ajo-olosuhteet: yksi sykli 95 °C 5 minuuttia ja sen jälkeen 35 sykliä 95 °C 30 sekuntia, 52 °C 30 sekuntia, 72 °C yksi minuutti ja yksi sykli 72 °C 10 minuuttia.
For VHSV, amplification shall be performed using the following primers and probe:
Tuotteen koon olisi oltava 409 bp.
Forward primer: 5′-AAA-CTC-GCA-GGA-TGT-GTG-CGT-CC-3′;
Lisäksi voi ilmetä vääriä positiivisia tuloksia alukkeen väärän kiinnittymisen tai laboratorion saastumisen vuoksi.
Reverse primer: 5′-TCT-GCG-ATC-TCA-GTC-AGG-ATG-AA-3′;
Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää muita yhtä tehokkaiksi osoitettuja PCR-versioita.
and probe: 5′-FAM-TAG-AGG-GCC-TTG-GTG-ATC-TTC-TG-BHQ1.
II Yksityiskohtaiset diagnostiset menetelmät ja menettelyt KHV-taudin seurantaa varten Kun taudista vapaan aseman saavuttamiseksi tai säilyttämiseksi KHV-taudin osalta liitteessä I olevan 2 osan I jakson mukaisesti suoritetaan näytteenotto ja laboratoriotutkimukset, joissa käytetään kyseisen liitteen 2 osan II tai III jaksossa määrättyjä diagnostisia menetelmiä, on sovellettava tämän osan II.1 ja II.2 kohdassa vahvistettuja yksityiskohtaisia diagnostisia menetelmiä ja menettelyjä.
One-step RT-qPCR:
Jos mahdollista, näytteet on otettava kaloista, joita on pidetty pitkään virukselle otollisessa lämpötilassa, eli kaksi–kolme viikkoa 15–26 °C:n lämpötilassa.
Negative template controls and positive controls shall be included on each plate run.
Jos mahdollista, KH-viruksen detektiomahdollisuuksien parantamiseksi näytteet on kerättävä 24 tuntia ja viimeistään 72 tuntia sellaisten hoitokäytäntöjen jälkeen, jotka saattavat reaktivoida viruksen tautia kantavissa kaloissa, kuten verkkojen käyttö tai kuljetus.