natgillin/translations-raw huggingface dataset:
This proficiency test will be conducted under the same conditions listed in paragraphs 38 through 40 by exposing cells to 7 increasing concentrations of strong, moderate and weak inducers and inhibitors as well as a negative chemical (see Table 2).
H295R:n altistaminen pätevyyden osoittamiseen tarkoitetuille kemikaaleille olisi tehtävä 24-kuoppalevyllä laboratorion pätevyyttä koskevan testin aikana.
Specifically, chemicals to be tested include the strong inducer forskolin (CAS No 66575-29-9);
Annosteluyksikkö on μM kaikissa testikemikaalin annoksissa.
the strong inhibitor prochloraz (CAS No 67747-09-5);
Annokset olisi annosteltava DMSO:hon 0,1 % v/v kuoppaa kohti.
the moderate inducer atrazine (CAS No 1912-24-9);
Kaikkia testipitoisuuksia olisi testattava kolmessa eri kuopassa (taulukko 6).
the moderate inhibitor aminoglutethimide (CAS No 125-84-8);
Kustakin kemikaalista tehdään testiajo erillisellä levyllä.
the weak inducer (E2 production) and weak inhibitor (T production) bisphenol A (CAS No 80-05-7);
Kuhunkin päivittäiseen testiajoon sisältyy yksi laadunvalvontalevy.
and the negative chemical human chorionic gonadotropin (HCG) (CAS No 9002-61-3) as shown in Table 2.
Solujen elinkykyä ja hormoneja koskevat analyysit olisi suoritettava siten kuin 42–46 kohdassa esitetään.
Separate plates are run for all chemicals using the format as shown in Table 6.
Raja-arvo (alhaisin havaittavan vaikutuksen aiheuttava pitoisuus, LOEC) ja luokittelu olisi ilmoitettava ja sitä olisi verrattava taulukossa 3 esitettyihin arvoihin.
One QC plate (Table 4, paragraphs 36-37) should be included with each daily run for the proficiency chemicals.
Tietoja pidetään hyväksyttävinä, jos niissä noudatetaan LOEC-arvoja ja luokittelupäätöstä, joka esitetään taulukossa 3.
Proficiency chemicals and exposure concentrations
Raja-arvot (LOEC-arvot) ja pätevyyden osoittamiseen tarkoitettuja kemikaaleja koskeva luokittelupäätös
Proficiency chemical
ei sovelleta:
Test Concentrations [μM]
Ei sovelleta, koska mitään muutoksia ei pitäisi tapahtua negatiivisen kontrollin ei-sytotoksisille pitoisuuksille altistamisen jälkeen.
Prochloraz
CAS-nro
Forskolin
Luokittelupäätös
Atrazine
+ [22] (inhibitio)
Aminoglutethimide
+ (inhibitio)
Bisphenol A
+ (induktio)
Exposure of H295R to proficiency chemicals should be conducted in 24 well plates during the laboratory proficiency test.
ei sovelleta
Dosing is in μM for all test chemical doses.
Negatiivinen
Doses should be administered in DMSO at 0,1 % v/v per well.
Laadunvalvontalevy
All test concentrations should be tested in triplicate wells (Table 6).
Laadunvalvontalevyä käytetään varmistamaan H295R-solujen toiminta vakiomuotoisissa soluviljelyolosuhteissa ja laatimaan määritystiedot hormonipitoisuuksille liuotinkontrolleissa, positiivisissa ja negatiivisissa kontrolleissa sekä ajan mittaan suoritettavissa muissa laadunvalvontatoimissa.
Separate plates are run for each chemical.
H295R-solujen tehokkuutta olisi testattava käyttämällä laadunvalvontalevyä kustakin uudesta ATCC-erästä, tai sen jälkeen, kun aikaisemmin pakastettuja soluja käytetään ensimmäisen kerran, ellei tälle soluerälle ole tehty laboratorion pätevyyttä koskevaa testiajoa (32–34 kohta).
One QC plate is included with each daily run.
Laadunvalvontalevyllä tehdään täydellinen arviointi testiolosuhteista (kuten solujen elinkyky, liuotinkontrollit, negatiiviset ja positiiviset kontrollit sekä testin sisäinen ja testien välinen vaihtelu) kemikaaleja testattaessa, ja sen pitäisi sisältyä kuhunkin testiajoon.
Cell viability and hormone analyses should be conducted as provided in paragraphs 42 through 46.
Laadunvalvontatesti tehdään 24-kuoppalevyllä.
The threshold value (lowest observed effect concentration, LOEC) and classification decision should be reported and compared with the values in Table 3.
Sen osalta noudatetaan samaa inkubointia, annostusta, solujen elinkykyä/sytotoksisuutta, hormonien uuttamista ja hormonien analyysiä koskevia menettelyitä, joita kuvattiin testikemikaalien osalta 38–46 kohdassa.
The data are considered acceptable if they meet the LOEC and decision classification in Table 3.
Yksityiskohtainen kuvaus levyn asettelusta esitetään taulukossa 4.
n/a:
Hormonin perustuotannon vähimmäismäärä T:n ja E2:n osalta olisi täytettävä liuotinkontrollikuopissa ja nollakoekuopissa.
not applicable as no changes should occur after exposure to non-cytotoxic concentrations of negative control.
Alistamiskokeen päätyttyä ja kasvatusliuoksen poiston jälkeen kaikkiin MeOH-kuoppiin lisätään 70 % metanoliliuosta positiivisena kontrollina sytotoksisuudelle (ks. sytotoksisuutta koskeva koe, validointiraportin lisäys III (4))
CAS No
Nollakoe [23]
+ [22] (Inhibition)
(+ MeOH) [24]
+ (Inhibition)
Taulukko 5
+ (Induction)
Laadunvalvontalevyn suorituskriteerit
n/a
Hormonin perustuotanto liuotinkontrollissa
Negative
≥ 5 kertaa määritysraja
Quality Control Plate
≥ 2,5 kertaa määritysraja
The quality control (QC) plate is used to verify the performance of the H295R cells under standard culture conditions, and to establish a historical database for hormone concentrations in solvent controls, positive and negative controls, as well as other QC measures over time.
Induktio (10 μM forskoliini)
H295R cell performance should be assessed using a QC plate for each new ATCC batch or after using a previously frozen stock of cells for the first time unless the laboratory proficiency test (paragraphs 32-34) has been run with that batch of cells.
≥ 1,5 kertaa liuotinkontrolli
A QC plate provides a complete assessment of the assay conditions (e.g. cell viability, solvent controls, negative and positive controls, as well as intra- and inter-assay variability) when testing chemicals and should be part of each test run.
≥ 7,5 kertaa liuotinkontrolli
The QC test is conducted in a 24-well plate and follows the same incubation, dosing, cell viability/cytotoxicity, hormone extraction and hormone analysis procedures described in paragraphs 38 through 46 for testing chemicals.
Inhibitio (1μM prokloratsi)
The QC plate contains blanks, solvent controls, and two concentrations of a known inducer (forskolin, 1, 10 μM) and inhibitor (prochloraz, 0,1, 1 μM) of E2 and T synthesis.
≤ 0,5 kertaa liuotinkontrolli
In addition, MeOH is used in select wells as a positive control for the viability/cytotoxicity assay.
KEMIKAALIALTISTUSTA KOSKEVA MENETTELY
A detailed description of the plate layout is provided in Table 4.
Esi-inkuboinnin jälkeen solut otetaan pois inkubaattorista (21 kohta) ja niitä tarkastellaan mikroskoopilla.
The criteria to be met on the QC plate are listed in Table 5.
Tarkoitus on varmistaa, että ne ovat hyvässä kunnossa (kiinnittyminen, morfologia) ennen annostelua.
The minimum basal hormone production for T and E2 should be met in both the solvent control and blank wells.
Solut sijoitetaan biosuojakaappiin, lopullinen kasvatusliuos poistetaan ja korvataan uudella lopullisella kasvatusliuoksella (1 ml/kuoppa).
Table 4 Quality control plate layout for testing performance of unexposed H295R cells and cells exposed to known inhibitors (PRO = prochloraz) and stimulators (FOR = forskolin) of E2 and T production.
DMSO:ta pidetään parhaana liuottimena tätä testimenetelmää varten.
After termination of the exposure experiment and removal of medium, a 70 % methanol solution will be added to all MeOH wells to serve as a positive control for cytotoxicity (see cytotoxicity assay in Appendix III to the validation report (4))
Jos on syitä käyttää muita liuottimia, tieteellisiä perusteita olisi selvitettävä.
Blank [23]
Solut altistetaan testikemikaalille lisäämällä 1 μl asianmukaista kantaliuosta DMSO:hon (ks. validointiraportin lisäys II (4)) 1 ml lopullista kasvatusliuosta kohti (kuopan tilavuus).
Blank [23](+ MeOH) [24]
Tämän perusteella DMSO:n lopullinen pitoisuus kuopissa on 0,1 %.
(+ MeOH) [24]
Riittävän sekoituksen varmistamiseksi yleensä pidetään etusijaisena, että testikemikaalin asianmukaista kantaliuosta DMSO:ssa sekoitetaan lopullisen kasvatusliuoksen kanssa, jotta kunkin annoksen osalta saadaan haluttu lopullinen pitoisuus, ja että seos lisätään kuhunkin kuoppaan välittömästi vanhan lopullisen kasvatusliuoksen poistamisen jälkeen.
Table 5
Jos tätä vaihtoehtoa käytetään, DMSO:n pitoisuuden (0,1 %) pitäisi pysyä tasaisena kaikissa kuopissa.
Performance criteria for the Quality Control Plate
Kuoppia, joihin sisältyy kaksi suurinta pitoisuutta, arvioidaan visuaalisesti saostumien tai sameuden muodostumisen osalta.
Basal Production of hormone in the solvent control (SC)
Tämä on merkki siitä, että testikemikaalin liukoisuus on puutteellista.
≥ 5 times the LOQ
Arvioinnissa käytetään binokulaariluuppia.
≥ 2,5 times the LOQ
Jos tällaisia olosuhteita (saostumat, sameuden muodostumat) havaitaan, tutkitaan myös kuopat, joihin sisältyy alempia pitoisuuksia (ja niin edelleen), ja pitoisuudet, jotka eivät täysin liuenneet liuokseen, poistetaan myöhemmistä arvioinneista ja analyyseistä.
Induction (10 μM forskolin)
Levy siirretään jälleen inkubaattoriin 37 oC:een ja ilman seokseen, johon sisältyy 5 % CO2:ta normaali-ilmanpaineessa, 48 tunnin ajaksi.
≥ 1,5 times the SC
Testikemikaalin levyn asettelu esitetään taulukossa 6.
≥ 7,5 times the SC
Kantaliuokset 1–7 osoittavat testikemikaalin annoksien kasvavan määrän sijainnin.
Inhibition (1μM prochloraz)
Taulukko 6
≤ 0,5 times the SC
Annostelukaava H295R-solujen altistamiselle testikemikaaleilla 24-kuoppalevyllä
CHEMICAL EXPOSURE PROCEDURE
Kantaliuos 4
The pre-incubated cells are removed from the incubator (paragraph 21) and checked under a microscope to assure that they are in good condition (attachment, morphology) prior to dosing.
Kantaliuos 1
The cells are placed in a bio-safety cabinet and the supplemented medium removed and replaced with new supplemented medium (1 ml/well).
Kantaliuos 1
DMSO is the preferred solvent for this test method.
Kantaliuos 5
However, if there are reasons for using other solvents the scientific rationale should be described.
Kantaliuos 2
Cells are exposed to the test chemical by adding 1 μl of the appropriate stock solution in DMSO (see Appendix II to the validation report (4)) per 1 ml supplemented medium (well volume).
Kantaliuos 6
This results in a final concentration of 0,1 % DMSO in the wells.
Kantaliuos 3
To assure adequate mixing it is generally preferred that the appropriate stock solution of the test chemical in DMSO is mixed with supplemented medium to yield the desired final concentration for each dose, and the mixture added to each well immediately after removal of old medium.
Kantaliuos 7
If this option is used, the concentration of DMSO (0,1 %) should remain consistent among all wells.
Altistukseen käytetyt levyt poistetaan inkubaattorista 48 tunnin jälkeen ja jokainen levy tutkitaan mikroskoopilla solujen kunnon (kiinnittyminen, morfologia, solutiheys) ja sytotoksisuutta koskevien merkkien osalta.
The wells containing the greatest two concentrations are visually assessed for formation of precipitates or cloudiness as an indication of incomplete solubility of the test chemical by using a stereo microscope.
Kunkin kuopan kasvatusliuos jaetaan kahteen yhtä suureen annokseen (kukin noin 490 μl) ja siirretään kahteen erilliseen asianmukaisesti merkittyyn pulloon (eli yhtenä eränä, jotta kutakin kuoppaa varten tarjotaan ylimääräinen näyte).
If such conditions (cloudiness, formation precipitates) are observed, wells containing the next lesser concentrations are examined as well (and so forth) and concentrations that did not completely go into solution are to be excluded from further evaluation and analysis.
Kasvatusliuos poistetaan solujen kuivumisen estämiseksi vaaka- tai pystyrivi kerrallaan ja korvataan kasvatusliuoksella, joka on tarkoitettu solun elinkykyä/sytotoksisuutta koskevaan testiin.
The plate is returned to the incubator at 37 °C under a 5 % CO2 in air atmosphere for 48 hours.
Jos solun elinkykyä/sytotoksisuutta ei mitata välittömästi, kuhunkin kuoppaan lisätään 200 μl PBS:ää, johon sisältyy Ca2+ ja Mg2+.
The test chemical plate layout is shown in Table 6.
Kasvatusliuokset pakastetaan – 80 °C:een jatkokäsittelyyn, jossa analysoidaan hormonien pitoisuuksia (ks. 44–46 kohta).
Stocks 1 -7 show placement of increasing doses of test chemical.
Kasvatusliuoksessa – 80 °C:een pakastettu T ja E2 pysyy yleensä vakaana ainakin kolme kuukautta, ja kussakin laboratoriossa olisi dokumentoitava hormonien vakautta varastoinnin aikana.
Table 6
Välittömästi kasvatusliuoksesta poistamisen jälkeen kunkin altistukseen käytetyn levyn solujen elinkyky/sytotoksisuus arvioidaan.
Dosing schematic for the exposure of H295R cells to test chemicals in a 24 well plate
Solujen elinkyvyn määrittäminen
Stock 4
Solujen elinkykyä/sytotoksisuutta koskevaa testiä voidaan käyttää määrittämään testikemikaalin potentiaalinen vaikutus solujen elinkykyyn.
Stock 1
Testillä pitäisi pystyä tarjoamaan todellinen järjestelmä kuopassa olevien elinkykyisten solujen (elävien solujen) prosenttiosuuden määrittämiseksi, tai sillä pitäisi osoittaa, että se on suoraan verrattavissa Live/Dead®-testiin (sen lineaariseen funktioon) (ks. validointiraportin lisäys III (4)).
Stock1
Vaihtoehtoinen testi, jonka on osoitettu toimivan yhtä hyvin, on MTT-testi (3-(4,5-dimetyylitiatsoli-2-yyli)-2,5-difenyylitetratsoliumbromidi-testi) (18).
Stock 5
Solujen elinkyvyn (elävien solujen) arviointi edellä esitettyjä menetelmiä soveltamalla on suhteellinen mittaus, joka ei välttämättä osoita lineaarisia suhteita kuopan solujen absoluuttisen määrän kanssa.
Stock 2
Tästä syystä analyysin suorittajan olisi tehtävä samanaikainen subjektiivinen silmämääräinen arvio kustakin kuopasta.
Stock 6
Liuotinkontrolleista ja kahdesta suurimmasta ei-sytotoksisesta pitoisuudesta olisi otettava digitaalikuvia ja ne olisi arkistoitava, jotta myöhemmin voidaan arvioida todellista solutiheyttä, jos tätä edellytetään.
Stock 3
Jos silmämääräinen arvio tai elinkykyyn/sytotoksisuutta koskeva testi osoittaa, että solujen määrä on nähtävästi lisääntynyt, tämä on tarkistettava.
Stock 7
Jos solujen määrän lisääntyminen tarkistetaan, tämä olisi mainittava tutkimusselosteessa.
After 48 hours the exposure plates are removed from the incubator and every well is checked under the microscope for cell condition (attachment, morphology, degree of confluence) and signs of cytotoxicity.
Solujen elinkyky ilmaistaan suhteessa liuotinkontrollien keskimääräiseen vasteeseen, missä elinkykyisten (elävien) solujen osuus on 100 %.
The medium from each well is split into two equal amounts (approximately 490 μl each) and transferred to two separate vials appropriately labelled (i.e. one aliquot to provide a spare sample for each well).
Tämä lasketaan tarvittaessa käytettyä solujen elinkykyä/sytotoksisuutta koskevaa testiä varten.
To prevent cells from drying out, medium is removed a row or column at a time and replaced with the medium for the cell viability/cytotoxicity assay.
MTT-testin osalta voidaan käyttää seuraavaa kaavaa:
If cell viability/cytotoxicity is not to be measured immediately, 200 μl PBS with Ca2+ and Mg2+ is added to each well.
% elinkykyisiä (eläviä) soluja = (vaste kuopassa – keskimääräinen MeOH-käsitellyssä (= 100 % kuolleita) kuopissa) ÷ (keskimääräinen vaste liuotinkontrollin kuopissa – keskimääräinen vaste MeOH-käsitellyissä (= 100 % kuolleita) kuopissa)
The media are frozen at – 80 °C until further processing to analyse hormone concentrations (see paragraphs 44-46).
Kuoppia, joissa elävien solujen osuus on 80 % alhaisempi kuin liuotinkontrollin kuoppien keskimääräinen elinkyky (= 100 % eläviä soluja), ei pitäisi sisällyttää lopulliseen tietojen analyysiin.
While T and E2 in medium kept at – 80 °C are generally stable for at least 3 months, hormone stability during storage should be documented within each laboratory.
Steroidogeneesin inhibitiota, jota esiintyy, kun sytotoksisuus on lähes 20 %, olisi arvioitava huolellisesti, jotta varmistetaan, ettei sytotoksisuus ole syy inhibitioon.
Immediately after removing the medium, cell viability/cytotoxicity is determined for each exposure plate.
Hormonien analyysi
Cell Viability Determination
Kukin laboratorio voi käyttää valitsemaansa hormonien mittausjärjestelmää T:n ja E2:n analyysiin.
A cell viability/cytotoxicity assay of choice can be used to determine the potential impact of the test chemical on cell viability.
Kasvatusliuoksen ylimääräisiä eriä kustakin koeryhmästä voidaan käyttää valmistelemaan laimennoksia, jotta pitoisuus saadaan sisällytettyä standardikäyrän lineaarisen osan puitteisiin.
The assay should be able to provide a true measure of the percentage of viable cells present in a well, or it should be demonstrated that it is directly comparable to (a linear function of) the Live/Dead® Assay (see Appendix III to the validation report (4)).
Kuten 29 kohdassa todettiin, kaikkien laboratorion olisi osoitettava, että niiden hormonimittaukseen käytetty järjestelmä (kuten ELISA, RIA, LC-MS, LC-MS/MS) täyttää laadunvalvontakriteerit siten, että siinä analysoidaan lopullista kasvatusliuosta — johon on lisätty kontrollihormoni –, ennen kuin laadunvalvontaa koskevat testiajot tai kemikaalien testaus suoritetaan.
An alternative assay that has been shown to work equally well is the MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] test (18).
Jotta varmistetaan, että testijärjestelmän komponentit eivät häiritse hormonimittausta, hormonit voidaan joutua uuttamaan kasvatusliuoksesta ennen mittausta (ks. 30 kohta olosuhteista, joiden vallitessa siirtoa edellytetään tai sitä ei edellytetä).
The assessment of cell viability using the above methods is a relative measurement that does not necessarily exhibit linear relationships with the absolute number of cells in a well.
On suositeltavaa, että uuttaminen suoritetaan validointiraportin liitteessä III (4) tarkoitettuja menettelyitä noudattaen.
Therefore, a subjective parallel visual assessment of each well by the analyst should be conducted, and digital pictures of the SCs and the two greatest non-cytotoxic concentrations are to be taken and archived to enable later assessment of true cell density if this should be required.
Jos hormonituotannon mittaukseen käytetään kaupallista testipakkausta, hormonianalyysi olisi suoritettava testipakkauksen valmistajan antaman käsikirjan mukaisesti.
If by visual inspection or as demonstrated by the viability/cytotoxicity assay there appears to be an increase in cell number, the apparent increase needs to be verified.
Useimmilla valmistajilla on oma menettely, jolla hormonianalyysit suoritetaan.
If an increase in cell numbers is verified, this should be stated in the test report.
Näytteiden laimennoksia on muutettava niin, että liuotinkontrollin odotettavissa olevat hormonipitoisuudet sijoittuvat yksittäisen testin standardikäyrän lineaarisen mittausalueen keskelle (validointiraportin lisäys III (4)).
Cell viability will be expressed relative to the average response in the SCs, which is considered 100 % viable cells, and is calculated as appropriate for the cell viability/cytotoxicity assay that is used.
Standardikäyrän lineaarisen mittausalueen ulkopuolella olevat arvot olisi hylättävä.
For the MTT assay, the following formula may be used:
Lopulliset hormonipitoisuudet lasketaan seuraavasti:
% viable cells = (response in well – average response in MeOH treated [= 100 % dead] wells) ÷ (average response in SC wells – average response in MeOH treated [= 100 % dead] wells)
Esimerkki:
Wells with viability lower than 80 %, relative to the average viability in the SCs (= 100 % viability), should not be included in the final data analysis.
Uutettu:
Inhibition of steroidogenesis occurring in the presence of almost 20 % cytotoxicity should be carefully evaluated to ensure that cytotoxicity is not the cause for the inhibition.
450 μl kasvatusliuosta
Hormone Analysis
Sekoitetaan määrään:
Each laboratory can use a hormone measurement system of its choice for the analysis of T and E2.
250 μl testin puskuriainetta
Spare aliquots of medium from each treatment group may be used to prepare dilutions to bring the concentration within the linear part of the standard curve.
Laimennus testissä:
As noted in paragraph 29, each laboratory should demonstrate the conformance of their hormone measurement system (e.g. ELISA, RIA, LC-MS, LC-MS/MS) with the QC criteria by analysing supplemented medium spiked with an internal hormone control prior to conducting QC runs or testing of chemicals.
1:10 (näyte tuodaan standardikäyrän lineaarisen mittausalueen sisälle)
In order to ensure that the components of the test system do not interfere with measurement of hormones, the hormones may need to be extracted from the media prior to their measurement (see paragraph 30 for the conditions under which an extraction is or is not required).
Hormonien pitoisuus testissä:
It is recommended to conduct extraction following the procedures in Appendix III to the validation report (4).
150 pg/ml (on jo mukautettu pitoisuuteen ml testattua näytettä kohti)
If a commercial test kit is being used to measure the hormone production, the hormone analysis should be conducted as specified in the manuals provided by the test kit manufacturer.
Talteenotto:
Most manufacturers have a unique procedure by which the hormone analyses are conducted.
Lopullinen hormonipitoisuus =
Dilutions of samples need to be adjusted such that expected hormone concentrations for the solvent controls fall within the centre of the linear range of the standard curve of the individual assay (Appendix III to the validation report (4)).
(Hormonipitoisuus (ml kohti) ÷ talteenotto) (laimennustekijä)
Values outside of the linear portion of the standard curve should be rejected.
(150 pg/ml) ÷ (0,89) × (250 μl/450 μl) × 10 = 936,3 pg/ml
Example:
Olisi tehtävä ainakin kaksi toisistaan riippumatonta testiajoa.
Extracted:
Jos ensimmäisen testiajon tulokset ovat epävarmoja (eli kerrannaismuutos on tilastollisesti merkitsevä liuotinkontrolliin nähden ainoastaan yhdessä pitoisuudessa) tai positiivinen (eli kerrannaismuutos kahdessa tai useammassa vierekkäisessä pitoisuudessa on tilastollisesti merkittävä), testi olisi toistettava taulukossa 7 esitetyllä tavalla mukauttamalla valittuja testipitoisuuksia.
450 μl medium
Testipitoisuuksia testiajoissa kaksi ja kolme (jos ne tehdään) olisi mukautettava ensimmäisen testiajon sellaisten näytepitoisuuksien perusteella, jotka aiheuttivat vaikutuksia puolen log:n pitoisuusvälejä käyttämällä (eli jos alkuperäinen testiajo pitoisuuksilla 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100, 1000 μM johti induktioihin 1 ja 10 μM käsittelypitoisuuksilla, toisella testiajolla testattavien pitoisuuksien olisi oltava 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 μM), ellei alempia pitoisuuksia pidä käyttää alhaisimman havaittavan vaikutuksen aiheuttavan pitoisuuden saavuttamiseksi.
Reconstituted in:
Jälkimmäisessä tapauksessa ainakin viittä pitoisuutta, jotka alittavat ensimmäisessä testiajossa testatun alimman pitoisuuden, olisi käytettävä toisessa testiajossa käyttäen puolen log:n välejä.
250 μl assay buffer
Jos toisessa testiajossa ei vahvisteta ensimmäistä testiajoa (eli tilastollista merkitsevyyttä ei esiinny aikaisemmin positiiviseksi testatussa pitoisuudessa ± 1 pitoisuuden lisäys), kolmas koe voidaan suorittaa käyttäen alkuperäisiä testiolosuhteita.
Dilution in Assay:
Epäselviä tuloksia ensimmäisessä testiajossa pidetään negatiivisina, jos havaittua vaikutusta ei voida vahvistaa missään kahdessa peräkkäisessä testiajossa.
1:10 (to bring the sample within the linear range of the standard curve)
Epäselviä tuloksia pidetään positiivisina vasteina (vaikutus), kun vaste voidaan vahvistaa ainakin yhdessä muussa testiajossa, jossa on ± 1 pitoisuuden lisäys (ks. 55 kohta tietojen tulkintaa koskevan menettelyn osalta)
Hormone Concentration in Assay:
Taulukko 7
150 pg/ml (already adjusted to concentration per ml sample assayed)
Päätösmatriisi mahdollisille tuloksia koskeville skenaarioille
Recovery:
Testiajo 1
Final hormone concentration =
Testiajo 2
(Hormone concentration (per ml) ÷ recovery) (dilution factor)
Testiajo 3
(150 pg/ml) ÷ (0,89) × (250 μl/450 μl) × 10 = 936,3 pg/ml
Päätös
Selection of test concentrations
Skenaario
A minimum of two independent runs of the assay should be conducted.
Positiivinen