natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Cell lines without cytoB
Solulinjat ilman sytoB:tä
Cells should be treated for 3-6 hrs in the presence and absence of S9.
Soluja on käsiteltävä 3–6 tunnin ajan S9:n läsnä ollessa ja ilman sitä.
The treatment medium is removed and replaced with fresh medium, and the cells are harvested 1,5-2,0 normal cell cycles later.
Käsittelyväliaine poistetaan ja korvataan uudella väliaineella, ja solut kerätään 1,5–2,0 normaalia solusykliä myöhemmin.
If both initial tests of the short (3-6 hrs) treatment are negative or equivocal, a subsequent, extended exposure treatment (without S9) is used.
Jos molemmista lyhyistä (3–6 tunnin) käsittelyistä saadaan negatiiviset tai epäselvät tulokset, soluja altistetaan uudelleen pidennetylle käsittelylle (ilman S9:ää).
Two treatment options are available, both of which are equally acceptable:
Käytettävissä on kaksi yhtä hyvää käsittelyvaihtoehtoa:
In monolayers, mitotic cells (identifiable as being round and detaching from the surface) may be present at the end of the 3-6 hr treatment.
Yhden solun vahvuisissa kerroksissa voi esiintyä mitoosissa olevia soluja (pyöreitä, irtoavat pinnasta) 3–6 tuntia kestävän käsittelyn päättyessä.
Because these mitotic cells are easily detached, they can be lost when the medium containing the test substance is removed.
Koska mitoosissa olevat solut irtoavat helposti, ne voivat hävitä väliaineen mukana, kun se kaadetaan pois.
Care should be taken to collect these when cultures are washed, and to return them to the cultures, to avoid losing cells that are in mitosis, and at risk for micronuclei, at the time of harvest.
Nämä solut on kerättävä huolellisesti viljelmien huuhtelun yhteydessä ja palautettava viljelmiin, jotta mitoosivaiheessa olevia soluja, joissa mikrotumia voi muodostua, ei menetetä keruuvaiheessa.
Number of cultures
Viljelmien määrä
Duplicate cultures should be used for each test substance concentration and for the vehicle/solvent and NC cultures.
Testiaineen jokaista pitoisuutta sekä kantaja-aine-/liuotinkontrollia ja negatiivista kontrollia varten on käytettävä kaksi rinnakkaisviljelmää.
Where minimal variation between duplicate cultures can be demonstrated from historical laboratory data, it may be acceptable for single cultures to be used.
Mikäli laboratorion aikaisemmat tutkimustulokset osoittavat, että rinnakkaisviljelmien välillä on vain hyvin vähäisiä eroja, yhden viljelmän käyttö voi olla hyväksyttävää.
If single cultures are used, it is recommended that an increased number of concentrations be analysed.
Yhtä viljelmää käytettäessä suositellaan, että pitoisuuksia analysoidaan tavallista suurempi määrä.
Cell harvest and slide preparation
Solujen kerääminen ja objektilasien preparointi
Each culture is harvested and processed separately.
Jokainen viljelmä kerätään ja käsitellään erikseen.
Cell preparation may involve hypotonic treatment, but this step is not necessary if adequate cell spreading is otherwise achieved.
Solujen preparointiin voidaan käyttää hypotonista käsittelyä, mutta tämä vaihe ei ole tarpeen, jos solut levittäytyvät lasille riittävästi.
Different techniques can be used in slide preparation provided that high-quality cell preparations for scoring are obtained.
Objektilasien preparoinnissa voidaan käyttää erilaisia tekniikoita edellyttäen, että pisteytystä varten saadaan korkealaatuisia solupreparaatteja.
Cell cytoplasm should be retained to allow the detection of micronuclei and (in the cytokinesis-block method) reliable identification of binucleate cells.
Solulima on säilytettävä mikrotumien osoittamista ja (sytokineesin estämiseen perustuvassa menetelmässä) kaksitumaisten solujen luotettavaa tunnistamista varten.
The slides can be stained using various methods, such as Giemsa or fluorescent DNA specific dyes (59).
Objektilasit voidaan värjätä erilaisilla menetelmillä, kuten Giemsa-menetelmällä tai fluorisoivilla DNA-spesifisillä väriaineilla (59).
All slides, including those of the solvent/vehicle and the controls, should be independently coded before the microscopic analysis.
Kaikki objektilasit, myös positiivisia ja negatiivisia kontrolleja sisältävät, on koodattava ennen mikroskooppitutkimusta.
Alternatively, coded samples can be analysed using a validated, automated flow cytometric or image analysis system.
Koodattuja näytteitä voidaan analysoida myös validoidulla, automaattisella virtaussytometria- tai kuva-analyysijärjestelmällä.
In cytoB-treated cultures, micronucleus frequencies should be analysed in at least 2000 binucleated cells per concentration (at least 1000 binucleated cells per culture; two cultures per concentration).
SytoB-käsiteltyjen viljelmien mikrotumien määrä on analysoitava vähintään 2000 kaksitumaisessa solussa kutakin pitoisuutta kohti (vähintään 1000 kaksitumaista solua viljelmää kohti; kaksi viljelmää pitoisuutta kohti).
If single cultures are used, at least 2000 binucleated cells per concentration should be scored from that culture.
Jos käytetään yhtä erillistä viljelmää, viljelmästä on laskettava vähintään 2000 kaksitumaista solua pitoisuutta kohti.
If substantially fewer than 1000 binucleate cells per culture, or 2000 if a single culture is used, are available for scoring at each concentration, and if a significant increase in micronuclei is not detected, the test should be repeated using more cells, or at less toxic concentrations, whichever is appropriate.
Jos kussakin pitoisuudessa laskettavissa on huomattavasti vähemmän kuin 1000 kaksitumaista solua viljelmää kohti (tai 2000 solua, jos käytetään yhtä viljelmää) ja jos mikrotumien määrä ei havaintojen mukaan ole kasvanut merkittävästi, testi on toistettava useammilla soluilla tai vähätoksisemmilla pitoisuuksilla sen mukaisesti, kumpi vaihtoehto soveltuu tarkoitukseen paremmin.
Care should be taken not to score binucleate cells with irregular shapes or where the two nuclei differ greatly in size; neither should binucleate cells be confused with poorly spread multi-nucleate cells.
On varmistettava, että muodoltaan epäsäännöllisiä kaksitumaisia soluja tai soluja, joiden kaksi tumaa poikkeaa kooltaan huomattavasti toisistaan, ei lasketa; kaksitumaisia soluja ei myöskään saa sekoittaa huonosti levittyneisiin monitumaisiin soluihin.
Cells containing more than two main nuclei should not be analysed for micronuclei, as the baseline micronucleus frequency may be higher in these cells (63) (64) Scoring of mononucleate cells is acceptable if the test substance is shown to interfere with cytoB activity.
Useampia kuin kaksi päätumaa sisältävistä soluista ei pitäisi analysoida mikrotumia, koska mikrotumien määrä voi olla tällaisissa soluissa suurempi (63) (64). Yksitumaisten solujen laskeminen hyväksytään, jos testiaineen on osoitettu häiritsevän sytoB:n aktiivisuutta.
In cell lines assayed without cytoB treatment, micronuclei should be scored in at least 2000 cells per concentration (at least 1000 cells per culture; two cultures per concentration).
Solulinjoissa, joilla tehdään määritys ilman sytoB-käsittelyä, mikrotumat olisi pisteytettävä vähintään 2000 solussa pitoisuutta kohti (vähintään 1000 solua viljelmää kohti; kaksi viljelmää pitoisuutta kohti).
Where only one culture per concentration is used, at least 2000 cells should be scored from that culture.
Jos yhtä pitoisuutta kohti käytetään vain yhtä viljelmää, kyseisestä viljelmästä on laskettava vähintään 2000 solua.
When cytoB is used, a CBPI or an RI should be determined to assess cell proliferation (see Appendix 2) using at least 500 cells per culture.
Kun sytoB:tä käytetään, sytokineesin eston proliferaatioindeksi tai RI on määritettävä solujen proliferaation arvioimiseksi (katso lisäys 2) käyttämällä vähintään 500:aa solua viljelmää kohti.
When treatments are performed in the absence of cytoB, it is essential to provide evidence that the cells being scored have proliferated, as discussed in Paragraphs 24-27.
Kun käsittely tehdään ilman sytoB:tä, on tärkeää esittää todisteet siitä, että laskettavat solut ovat proliferoituneet (ks. 24–27 kohta).
Acceptability criteria
Hyväksyttävyysperusteet
A laboratory proposing to use the MNvit assay described in this TM should demonstrate its ability to reliably and accurately detect chemicals of known aneugenic and clastogenic activity, with and without metabolic activation, as well as known negative chemicals, using the reference chemicals in Appendix 3.
Tässä kuvatun MNvit-määritysmenetelmän käyttöä ehdottavan laboratorion on osoitettava valmiutensa osoittaa luotettavasti ja täsmällisesti kemikaalit, jotka tunnetusti toimivat aneugeenisesti ja klastogeenisesti metabolisen aktivaation läsnä ollessa ja ilman sitä, sekä tunnetut negatiiviset kemikaalit. Tässä on käytettävä lisäyksessä 3 lueteltuja vertailukemikaaleja.
As evidence of its ability to perform this TM correctly, the laboratory should provide evidence that the cells being scored for micronucleus formation have completed one nuclear division if the test is performed without the use of cytoB.
Laboratorio voi osoittaa valmiutensa käyttää tätä testimenetelmää asianmukaisesti esittämällä todisteet siitä, että mikrotumien muodostumisen pisteytykseen käytetyissä soluissa on tapahtunut yksi tuman jakautuminen, jos testi tehdään ilman sytoB:tä.
The chemicals in Appendix 3 are recommended for use as reference chemicals.
Vertailukemikaaleina käytettäväksi suositellaan lisäyksessä 3 lueteltuja kemikaaleja.
Substitute or additional chemicals can be included if their activity is known and if they induce micronuclei by the same mechanisms of action, and if they are shown to be relevant to the chemicals that will be tested using the MNvit procedure.
Korvaavia tai täydentäviä kemikaaleja voidaan käyttää, jos niiden vaikutus tunnetaan, jos ne indusoivat mikrotumia samoilla toimintamekanismeilla ja jos ne on osoitettu merkityksellisiksi MNvit-menetelmällä testattavien kemikaalien suhteen.
Justification could include a validation study employing a broad variety of substances or focused on a narrower spectrum based on the chemical class of the test substance or the mechanism of damage being studied.
Perusteluna voidaan esittää muun muassa validointitutkimusta, jossa testiaineen kemikaaliluokan tai tutkittavan vauriomekanismin perusteella on käytetty useita eri aineita tai vähäisempää ainemäärää.
Solvent/vehicle control and untreated cultures should give reproducibly low and consistent micronuclei frequencies (typically 5-25 micronuclei/1000 cells for the cell types identified in paragraph 11).
Liuotin-/kantaja-ainekontrollien ja käsittelemättömien viljelmien olisi annettava tulokseksi toistettavasti vähäinen ja yhdenmukainen mikrotumien määrä (yleensä 5–25 mikrotumaa tuhatta solua kohti 11 kohdassa mainittujen solutyyppien osalta).
Other cell types may have different ranges of responses which should be determined when validating them for use in the MNvit assay.
Muiden solutyyppien tuotosten vaihteluvälit voivat olla erilaisia, ja ne on määritettävä, kun solutyyppejä validoidaan MNvit-määritysmenetelmässä käyttämistä varten.
Data from negative, solvent, and PC should be used to establish historical control ranges.
Kontrollien vaihteluvälit on määritettävä pitkältä ajalta negatiivisista kontrolleista, liuotinkontrolleista ja positiivisista kontrolleista saatujen tietojen perusteella.
These values should be used in deciding the adequacy of the concurrent NC/PC for an experiment.
Näitä arvoja olisi käytettävä arvioitaessa, ovatko samanaikaiset negatiiviset tai positiiviset kontrollit asianmukaisia.
If minor changes to the protocol (e.g. use of automated instead of manual scoring techniques; use of a new cell type) are proposed for the assay, then the effectiveness of the change should be demonstrated before the modified protocol can be considered acceptable for use.
Jos määritysmenetelmän tutkimussuunnitelmaan ehdotetaan pieniä muutoksia (esimerkiksi automaattisten pisteytystekniikoiden käyttämistä manuaalisten laskentatekniikoiden asemesta tai uuden solutyypin käyttämistä), muutoksen vaikutus on osoitettava, ennen kuin tutkimussuunnitelman muutos voidaan hyväksyä.
Demonstration of effectiveness includes demonstration that the major mechanisms of chromosome breakage and gain or loss can be detected, and that appropriate positive and negative results can be achieved for the class of the individual substance, or the broad range of substances, to be tested.
Vaikutuksen osoittamisella tarkoitetaan, että on muun muassa osoitettava, että kromosomin katkeamisen, liittymän tai häviämän tärkeimmät mekanismit voidaan osoittaa ja että testattavan yksittäisen aineen luokalle tai monille erilaisille aineille voidaan saada asianmukaiset positiiviset ja negatiiviset tulokset.
If the cytokinesis-block technique is used, only the frequencies of binucleate cells with micronuclei (independent of the number of micronuclei per cell) are used in the evaluation of micronucleus induction.
Jos käytetään sytokineesin inhibiittoritekniikkaa, mikrotumien indusoitumisen arvioinnissa käytetään vain sellaisia kaksitumaisia soluja, joissa esiintyy mikrotumia (riippumatta mikrotumien määrästä solua kohti).
Scoring of the numbers of cells with one, two, or more micronuclei could provide useful information, but is not mandatory.
Yksi, kaksi tai monta mikrotumaa omaavien solujen määrän laskemisella voidaan saada hyödyllistä tietoa, mutta se ei ole pakollista.
Concurrent measures of cytotoxicity and/or cytostasis for all treated and solvent/vehicle control cultures should be determined (58).
Kaikille käsitellyille viljelmille ja liuotin-/kantajakontrolleille olisi tehtävä samanaikaisesti sytotoksisuus- ja/tai sytostaasimääritykset (58).
The CBPI or the RI should be calculated for all treated and control cultures as measurements of cell cycle delay when the cytokinesis-block method is used.
Sytokineesin eston proliferaatioindeksi tai RI on laskettava kaikille käsitellyille viljelmille ja kontrolliviljelmille määrittämällä solusyklin viivästyminen, kun käytetään sytokineesin estomenetelmää.
In the absence of cytoB, the RPD or the RICC or PI should be used (see Appendix 2).
Jos sytoB:tä ei käytetä, on määritettävä populaation suhteellinen kaksinkertaistuminen, solumäärän suhteellisen lisääntyminen tai PI (katso lisäys 2).
Individual culture data should be provided.
Kustakin viljelmästä on esitettävä tiedot erikseen.
Additionally, all data should be summarised in tabular form.
Kaikista tiedoista on lisäksi esitettävä yhteenveto taulukkomuodossa.
Chemicals that induce micronuclei in the MNvit assay may do so because they induce chromosome breakage, chromosome loss, or a combination of the two.
MNvit-määritysmenetelmässä kemikaalit voivat aiheuttaa mikrotumien muodostumista indusoimalla kromosomien katkeamista, niiden häviämistä tai molempia.
Further analysis using anti-kinetochore antibodies, centromere specific in situ probes, or other methods may be used to determine whether the mechanism of micronucleus induction is due to clastogenic and/or aneugenic activity.
Antikinetokorivasta-aineilla, sentromeerispesifisillä in situ -koettimilla tai muilla menetelmillä voidaan yrittää määrittää, johtuuko mikrotumien indusoitumismekanismi klastogeenisesta ja/tai aneugeenisesta vaikutuksesta.
Evaluation and interpretation of results
Tulosten arviointi ja tulkinta
There is no requirement for verification by additional testing of a clear positive or negative response.
Selviä positiivisia tai negatiivisia tuloksia ei tarvitse vahvistaa täydentävillä testeillä.
Equivocal results may be clarified by analysis of another 1000 cells from all the cultures to avoid loss of blinding.
Epäselviä tuloksia voidaan selventää analysoimalla vielä tuhat solua kaikista viljelmistä, jotta vältetään satunnaisuuden vääristyminen.
If this approach does not resolve the result, further testing should be performed.
Jos tulosta ei saada selville tällä tavalla, viljelmille on tehtävä uusia testejä.
Modification of study parameters over an extended or narrowed range of conditions, as appropriate, should be considered in follow-up experiments.
Niissä olisi harkittava tutkimusparametrien muuttamista tapauksesta riippuen laajemmin tai suppeammin.
Study parameters that might be modified include the test concentration spacing, the timing of treatment and cell harvest, and/or the metabolic activation conditions.
Tutkimusparametreja, joita voitaisiin muuttaa, ovat muun muassa testipitoisuuksien erot, viljelmien käsittelyajankohta ja solujen keräämisajankohta ja/tai metabolisen aktivaation olosuhteet.
There are several criteria for determining a positive result, such as a concentration-related increase or a statistically significant increase in the number of cells containing micronuclei.
Positiivinen tulos voidaan päätellä useiden perusteiden avulla. Näitä ovat esimerkiksi mikrotumallisten solujen määrän pitoisuuteen sidottu kasvu tai tilastollisesti merkittävä kasvu.
The biological relevance of the results should be considered first.
Aluksi on tarkasteltava tulosten biologista merkityksellisyyttä.
Consideration of whether the observed values are within or outside of the historical control range can provide guidance when evaluating the biological significance of the response.
Sen arvioimiseksi voidaan tarkastella sitä, ovatko havaitut arvot aiemman kontrollivaihteluvälin sisällä vai sen ulkopuolella.
Appropriate statistical methods may be used as an aid in evaluating the test results (65).
Testitulosten arvioinnissa voidaan käyttää asianmukaisia tilastollisia menetelmiä (65).
However, the results of statistical testing should be assessed with respect to dose-response relationship.
Tilastollisen testauksen tuloksia on kuitenkin arvioitava suhteessa annos-vastesuhteeseen.
Reproducibility and historical data should also be taken into consideration.
Myös uusittavuus ja aiemmat tulokset on otettava huomioon.
Although most experiments will give clearly positive or negative results, in some cases the data set will preclude making a definite judgement about the activity of the test substance.
Useimmissa testeissä saadaan selvästi positiivisia tai negatiivisia tuloksia, mutta joissakin tapauksissa mittaustulosten pohjalta ei voida tehdä varmoja päätelmiä testiaineen aktiivisuudesta.
These equivocal or questionable responses may occur regardless of the number of times the experiment is repeated.
Tulokset saattavat jäädä epäselviksi tai kyseenalaisiksi kokeen toistokertojen määrästä riippumatta.
Positive results from the MNvit assay indicate that the test substance induces chromosome breakage or chromosome loss, in cultured mammalian cells.
MNvit-määritysmenetelmässä saadut positiiviset tulokset osoittavat, että testiaine indusoi kromosomien katkeamista tai häviämää viljellyissä nisäkässoluissa.
Negative results indicate that, under the test conditions used, the test substance does not induce chromosome breaks and/or gain or loss in cultured mammalian cells.
Negatiiviset tulokset osoittavat, että testiaine ei käytetyissä testiolosuhteissa indusoi kromosomien katkeamista ja/tai liittymää tai häviämää viljellyissä nisäkässoluissa.
The test report should include at least the following information, if relevant to the conduct of the study:
Testiraportissa on annettava vähintään seuraavat tiedot, jos ne ovat merkityksellisiä tutkimuksen suorituksen kannalta:
Test chemical:
Testikemikaali
identification data and Chemical Abstract Services Registry Number and EC Number;
tunnistetiedot sekä CAS-numero ja EC-numero fysikaalinen olomuoto ja puhtaus
reactivity of the test chemical with the solvent/vehicle or cell culture media;
testikemikaalin reagointi liuottimen/kantaja-aineen tai solujen kasvatusväliaineen kanssa
Solvent/Vehicle:
Liuotin/kantaja-aine
justification for choice of solvent/vehicle;
liuottimen/kantaja-aineen valintaperusteet
solubility and stability of the test substance in solvent/vehicle;
testiaineen liukoisuus ja stabiliteetti liuottimessa/kantaja-aineessa
Cells:
Solut
type and source of cells used;
käytettyjen solujen tyyppi ja alkuperä
suitability of the cell type used;
käytetyn solutyypin soveltuvuus
absence of mycoplasma, if applicable;
mahdollinen mykoplasmakontaminaatio
information on cell cycle length, doubling time or proliferation index;
tiedot solusyklin kestosta, jakautumisaika tai proliferaatioindeksi
where lymphocytes are used, sex, age and number of blood donors, if applicable;
lymfosyyttien osalta verenluovuttajien sukupuoli, ikä ja tarvittaessa määrä
where lymphocytes are used, whether whole blood or separated lymphocytes are exposed;
lymfosyyttien osalta tieto siitä, onko testissä altistettu kokoverta vai eristettyjä lymfosyyttejä
number of passages, if applicable;
tarvittaessa siirrostusten lukumäärä
methods for maintenance of cell cultures, if applicable;
tarvittaessa soluviljelymenetelmät
modal number of chromosomes;
kromosomien modaalinen lukumäärä
normal (negative control) cell cycle time;
tavallinen (negatiivisen kontrollin) solusyklin kesto
identity of cytokinesis blocking substance (e.g. cytoB), if used, and its concentration and duration of cell exposure;
mahdollinen sytokineesin inhibiittori (esimerkiksi sytoB), sen pitoisuus ja solujen altistuksen kesto
rationale for selection of concentrations and number of cultures, including cytotoxicity data and solubility limitations, if available;
pitoisuuksien ja soluviljelmien lukumäärän valintaperusteet, joihin sisältyvät esimerkiksi sytotoksisuustiedot ja liukoisuusrajoitukset, mikäli tiedot ovat käytettävissä
composition of media, CO2 concentration, if applicable;
väliaineen koostumus ja tarvittaessa CO2-pitoisuus
concentrations of test substance;
testiaineen pitoisuudet
concentration (and/or volume) of vehicle and test substance added;
lisätyn kantaja-aineen ja testiaineen pitoisuus (ja/tai tilavuus)
incubation temperature and time;
inkubaatiolämpötila ja -aika
duration of treatment;
käsittelyn kesto
harvest time after treatment;
käsittelyn jälkeinen keräämisajankohta
cell density at seeding, if applicable;
tarvittaessa solutiheys inokuloitaessa
type and composition of metabolic activation system, including acceptability criteria;
metabolisen aktivaatiojärjestelmän tyyppi ja koostumus, myös sen hyväksyttävyysperusteet
positive control chemicals and negative controls;
positiiviset kontrollikemikaalit ja negatiiviset kontrollit
methods of slide preparation and staining technique used;
objektilasien preparointimenetelmät ja käytetyt värjäystekniikat
criteria for micronucleus identification;
mikrotumien tunnistusperusteet
numbers of cells analysed;
analysoitujen solujen määrät
methods for the measurements of cytotoxicity;
sytotoksisuuden mittausmenetelmät
any supplementary information relevant to cytotoxicity;
muut sytotoksisuuteen liittyvät tiedot
criteria for considering studies as positive, negative, or equivocal;
tutkimusten positiivisuuden, negatiivisuuden tai epäselvyyden arviointiperusteet
method(s) of statistical analysis used;
käytetyt tilastoanalyysimenetelmät
methods, such as use of kinetochore antibody, to characterise whether micronuclei contain whole or fragmented chromosomes, if applicable;
tarvittaessa menetelmät sen määrittämiseksi, sisältävätkö mikrotumat kokonaisia kromosomeja vai kromosomifragmentteja, esimerkiksi kinetokorivasta-aineen käyttö
measurement of cytotoxicity used, e.g. CBPI or RI in the case of cytokinesis-block method; RICC, RPD or PI when cytokinesis-block methods are not used; other observations when applicable, e.g. cell confluency, apoptosis, necrosis, metaphase counting, frequency of binucleated cells;
käytetyt sytotoksisuuden määritysmenetelmät, esimerkiksi sytokineesin eston proliferaatioindeksi tai RI (sytokineesin estoon perustuva menetelmä); solumäärän suhteellinen lisääntyminen, populaation suhteellinen kaksinkertaistuminen tai PI (muu kuin sytokineesin estoon perustuva menetelmä); tarvittaessa muut havainnot, esimerkiksi solujen konfluenssi, apoptoosi, nekroosi, metafaasien määrä ja kaksitumaisten solujen määrä
signs of precipitation;
saostumisen merkit
data on pH and osmolality of the treatment medium, if determined;
tiedot käsittelyväliaineen pH:sta ja osmolaliteetista, jos määritetty
definition of acceptable cells for analysis;
analysoitavaksi hyväksyttävien solujen määritelmä
distribution of mono-, bi-, and multi-nucleated cells if a cytokinesis block method is used;
yksi-, kaksi- ja monitumaisten solujen osuudet, jos sytokineesin estoon perustuvaa menetelmää on käytetty