natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Prepare a gel solution by mixing additives and ampholytes (*) with the stock gel solution (see 4.1.1).
Lahjendatud äädikhape (täiendada 25,0 ml jää-äädikhappe ruumala veega ruumalani 100 ml)
9,0 ml stock solution
Diklorometaan
24 mg β-alanine
Atsetoon
500 μl ampholyte pH 3,5-9,5
Valke lahustav puhver
250 μl ampholyte pH 5-7
Lahustada vees:
250 μl ampholyte pH 6-8
5,75 g 87massiprotsendilist glütserooli,
Mix the gel solution and de-gas for two to three minutes in an ultrasonic bath or in vacuum.
24,03 g karbamiidi,
Note: Prepare the gel solution immediately prior to pouring it (see 6.2).
250 mg ditiotreitooli
Catalyst solutions
ja täiendada ruumalani 50 ml.
N, N, N′ N′ — tetramethylethylenediamine (Temed)
Märkus: säilitada külmikus; säilimisaeg kuni üks nädal.
40 % w/v ammonium persulphate (PER):
Reaktiivid kaseiinide lõhustamiseks plasmiiniga
Dissolve 800 mg PER in water and make up to 2 ml.
Ammooniumkarbonaatpuhver
Note: Always use freshly prepared PER solution.
Tiitrida 0,2 mol/l ammooniumvesinikkarbonaadi lahus (1,58 g/100 ml vees, mis sisaldab 0,05 mol/l etüleendiamiintetraatsetaati (EDTA, 1,46 g/100 ml vees), 0,2 mol/l ammooniumkarbonaadi lahusega (1,92 g/100 ml vees, sisaldab 0,05 mol/l EDTAd) kuni pH-ni 8.
Contact fluid
Veise plasmiin (EC.
Kerosene or liquid paraffin
3.4.21.7) aktiivsusega vähemalt 5 U/ml
Anode solution
ε-aminokaproonhappe lahus ensüümi inhibeerimiseks
Dissolve 5,77 g phosphoric acid (85 % w/w) in water and dilute to 100 ml.
Lahustada 2,624 g ε-aminokaproonhapet (6-amino-n-heksaanhapet) 100 ml 40mahuprotsendilises etanoolis.
Cathode solution
Standardained
Dissolve 2,00 g sodium hydroxide in water and dilute to 100 ml with water.
Laabiga kalgendatud lamba- ja kitsepiimalõssi segust saadud sertifitseeritud etalonaineid, mis sisaldavad 0 % ja 1 % lehmapiima, on võimalik hankida Komisjoni Etalonainete ja Mõõtmiste Instituudist (Commission's Institute for Reference Materials and Measurements, B-2440 Geel, Belgia).
Sample preparation
0 % ja 1 % lehmapiima sisaldavate laboratoorsete vaheetalonainete valmistamine laabiga kalgendatud pühvlipiimast
Reagents for protein isolation
Lõssi saamiseks tsentrifuugida kas pühvli või veise toorpiima 37 °C ja 2500 g juures 20 minutit.
Dilute acetic acid (25,0 ml of glacial acetic acid made up to 100 ml with water)
Pärast tsentrifuugianuma ja selle sisu kiiret jahutamist temperatuurini 6–8 °C kõrvaldada ülemine rasvakiht täielikult.
Dichloromethane
1 %-lise etalonsegu valmistamiseks panna 1 l keeduklaasi 495 ml pühvlipiimalõssi, lisada 5,00 ml lehmapiimalõssi ja reguleerida piimhapet (massikontsentratsioon 10 %) lisades pH-le 6,4.
Acetone
Temperatuur reguleerida väärtusele 35 °C, lisada 100 μl vasika laapi (aktiivsus 1:10000, ligikaudu 3000 U/ml), segada üks minut ja jätta keeduklaas alumiiniumfooliumiga kaetuna 35 °C juures üheks tunniks seisma, et lõss kalgenduks.
Protein dissolving buffer
Kui kalgend on moodustunud, külmkuivatada kogu kalgendunud mass, seda eelnevalt homogeniseerimata ja vadakut eraldamata.
Dissolve
Jahvatada külmkuivatatud mass peeneks ühtlaseks pulbriks.
5,75 g glycerol (87 % w/w)
Nullprotsendiline etalonaine valmistatakse sama meetodi abil puhtast pühvlipiimalõssist.
24,03 g urea
Etalonaineid tuleb säilitada – 20 °C juures.
250 mg dithiothreitol,
Märkus: enne etalonainete valmistamist on soovitatav pühvlipiimalõssi puhtust kontrollida plasmiiniga töödeldud kaseiinide isoelektrilise fookustamise teel.
in water and make up to 50 ml
Reaktiivid valgu eraldamiseks
Note: Store in a refrigerator, maximum shelf-life one week.
Kinnisti
Reagents for plasmin cleavage of caseins
Lahustada 150 g trikloroäädikhapet vees ja täiendada ruumalani 1000 ml.
Ammonium carbonate buffer
Värvi väljapesemise lahus
Titrate a 0,2 mol/l ammonium hydrogencarbonate solution (1,58 g/100 ml water) containing 0,05 mol/l ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 1,46 g/100 ml with a 0,2 mol/l ammonium carbonate solution (1,92 g/100 ml water) containing 0,05 mol/l EDTA to pH 8.
Täiendada 500 ml metanooli ja 200 ml jää-äädikhappe segu destilleeritud veega ruumalani 2000 ml.
Bovine plasmin (EC.
Märkus: iga päev tuleb valmistada värske värvi väljapesemise lahus.
3.4.21.7), activity at least 5 U/ml
Seda saab valmistada, segades 50mahuprotsendilise metanooli ja 20mahuprotsendilise jää-äädikhappe põhilahuseid võrdsed ruumalad.
ε-Aminocaproic acid solution for enzyme inhibition
Värvimislahused
Dissolve 2,624 g ε-aminocaproic acid (6 amino-n-hexanoic acid) in 100 ml of 40 % (v/v) ethanol.
Värvimislahus (värvi põhilahus 1)
Standards
Lahustada magnetseguri abil 3,0 g Coomassie-briljantsinist G-250 (C.I. 42655) 1000 ml 90mahuprotsendilises metanoolis umbes 45 minuti jooksul ja filtreerida läbi kahe keskmise kiirusega toimiva kurdfiltri.
Certified reference standards of a mixture of renneted ewe's and goat's skimmed milk containing 0 % and 1 % of cow's milk are available from the Commission's Institute for Reference Materials and Measurements, B-2440 Geel, Belgium
Värvimislahus (värvi põhilahus 2)
Preparation of laboratory interim-standards of buffalo's renneted milk containing 0 % and 1 % of cow's milk
Lahustada 5,0 g vasksulfaatpentahüdraati 1000 ml 20mahuprotsendilises äädikhappes.
Skimmed milk is prepared by centrifuging of either buffalo or bovine raw bulk milk at 37 °C at 2500 g for 20 minutes.
Värvimislahus (töölahus)
After cooling the tube and contents rapidly to 6 to 8 °C, the upper fat layer is removed completely.
Segada vahetult enne värvimist kokku 125 ml kumbagi värvi põhilahust (4.11.1 ja 4.11.2).
For the preparation of the 1 % standard add 5,00 ml of bovine skimmed milk to a 495 ml of buffalo's skimmed milk in a 1 l beaker, adjust the pH to 6,4 by the addition of dilute lactic acid (10 % w/v).
Märkus: värvimislahus tuleb valmistada kasutamise päeval.
Adjust the temperature to 35 °C and add 100 μl of calf rennet (rennet activity 1: 10000, c.
SEADMED
3000 U/ml), stir for 1 minute and then leave the beaker covered with an aluminium foil at 35 °C for one hour to allow formation of the curd.
Klaasplaadid (265 × 125 × 4 mm), kummirull (laius 15 cm), nivelleerimislaud
After the curd has formed, the whole renneted milk is freeze-dried without prior homogenization or draining of the whey.
Geeli kandekile (265 × 125 mm)
After freeze-drying it is finely ground to produce a homogeneous powder.
Kattekile (280 × 125 mm).
For the preparation of the 0 % standard, carry out the same procedure using genuine buffalo skimmed milk.
Pikematele servadele panna riba kleeplinti (280 × 6 × 0,25 mm) (vt joonis 1).
The standards shall be stored at – 20 °C.
Elektrofookustamiskamber jahutusplaadiga (nt 265 × 125 mm) ja sobiva pingeallikaga (≥ 2,5 kV) või automaatne elektroforeesiseade
Note: It is advisable to check the purity of the buffalo milk by isoelectric focusing of the plasmin-treated caseins before preparation of the standards.
Tsirkulatsioonkrüostaat, mis võimaldab termostaadiga hoida temperatuuri 12 ± 0,5 °C
Reagents for protein staining
Tsentrifuug, mis võimaldab töötada 3000 g juures
Fixative
Elektroodribad (≥ 265 mm pikkused)
Dissolve 150 g trichloroacetic acid in water and make up to 1000 ml.
Plastist tilgapudelid anoodi- ja katoodilahustele
Destaining solution
Proovi aplikaatorid (10 × 5 mm, viskoosist või valke väheadsorbeerivast filterpaberist)
Dilute 500 ml methanol and 200 ml glacial acetic acid to 2000 ml with distilled water.
Roostevabast terasest või klaasist anumad värvimiseks ja värvi väljapesemiseks (nt 280 × 150 mm instrumendialused)
Note: Prepare the destaining solution fresh every day; it can be prepared by mixing equal volumes of stock solutions of 50 % (v/v) methanol and 20 % (v/v) glacial acetic acid.
Reguleeritav varrashomogenisaator (varda diameeter 10 mm, 8000 – 20000 pööret minutis)
Staining solutions
Kilekeevitusaparaat
Staining solution (stock solution 1)
25 μl mikropipetid
Dissolve 3,0 g Coomassie Brilliant Blue G-250 (C.I. 42655) in 1000 ml 90 % (v/v) methanol using a magnetic stirrer (approximately 45 minutes), filter through two medium-speed folded filters.
Vaakumtsentrifuug või külmkuivati
Staining solution (stock solution 2)
Temperatuuridele 35 ja 40 ± 1 °C reguleeritav loksutiga ja termostaadiga vesivann
Dissolve 5,0 g copper sulphate pentahydrate in 1000 ml 20 % (v/v) acetic acid.
Densitomeeter, mis võimaldab töötada lainepikkusel λ = 634 nm
Staining solution (working solution)
Kaseiinide eraldamine
Mix together 125 ml of each of the stock solutions (4.11.1, 4.11.2) immediately prior to staining.
Panna 100 ml tsentrifuugianumasse juustu või etalonaine kaalutis, mis on ekvivalentne 5 g kuivmassiga, lisada 60 ml destilleeritud vett ja homogeenida varrashomogenisaatori abil (8000 – 10000 pööret minutis).
Note: The staining solution should be prepared on the day that it is used.
Reguleerida pH lahjendatud äädikhappega (4.5.1) väärtusele 4,6 ja tsentrifuugida (5 minutit, 3000 g).
EQUIPMENT
Rasv ja vadak dekanteerida, jääk homogeenida kiirusel 20000 pööret minutis 40 ml destilleeritud vees, mille pH on lahjendatud äädikhappega (4.5.1) reguleeritud väärtusele 4,5, lisada 20 ml diklorometaani (4.5.2), homogeenida uuesti ja tsentrifuugida (5 minutit, 3000 g).
Glass plates (265 × 125 × 4 mm); rubber roller (width 15 cm); levelling table
Eraldada spaatliga kaseiinikiht, mis jääb vee- ja orgaanilise faasi vahele (vt joonis 2), ning kõrvaldada mõlemad faasid dekanteerimise teel.
Gel carrier sheet (265 × 125 mm)
Homogeenida kaseiin uuesti 40 ml destilleeritud vees (vt eespool) ja 20 ml diklorometaanis (4.5.2) ning tsentrifuugida.
Covering sheet (280 × 125 mm).
Seda protseduuri korrata seni (kaks või kolm korda), kuni mõlemad ekstraheerimisfaasid jäävad värvusetuks.
Stick on strip of adhesive tape (280 × 6 × 0,25 mm) to each long edge (see Figure 1)
Homogeenida valgujääk 50 ml atsetoonis (4.5.3) ja filtrida läbi keskmise kiirusega toimiva kurdpaberfiltri.
Electrofocusing chamber with cooling plate (e.g. 265 × 125 mm) and suitable power supply (≥ 2,5 kV) or automatic electrophoresis device
Filtrile kogutud jääki pesta kahe eraldi 25 ml atsetoonikogusega, kuivatada õhu käes või lämmastikuvoolus ja hõõruda uhmris peeneks.
Circulation cryostat, thermostatically controlled at 12 ± 0,5 °C
Märkus: kuivi kaseiinipreparaate tuleb säilitada – 20 °C juures.
Centrifuge, adjustable to 3000 g
β-kaseiinide lõhustamine plasmiini abil γ-kaseiinide intensiivistamiseks
Electrode strips (≥ 265 mm long)
Dispergeerida 25 mg kaseiinipreparaati (6.1.1) 0,5 ml ammooniumkarbonaatpuhvris (4.7.1) ja homogeenida 20 minutit näiteks ultraheliga töötlemise teel.
Plastic dropping bottles for the anode and cathode solutions
Soojendada temperatuurini 40 °C, lisada 10 μl plasmiini (4.7.2), segada ja inkubeerida 40 °C juures ühe tunni jooksul pidevalt loksutades.
Sample applicators (10 × 5 mm, viscose or low protein-adsorption filter paper)
Ensüümi inhibeerimiseks lisada 20 μl ε-aminokaproonhappe lahust (4.7.3), seejärel lisada 200 mg tahket karbamiidi ja 2 mg ditiotreitooli.
Stainless steel or glass staining and destaining dishes (e.g. 280 × 150 mm instrument trays)
Märkus: et fookustatud kaseiiniribad tuleksid sümmeetrilisemad, on soovitatav pärast ε-aminokaproonhappe lisamist lahus külmkuivatada ja kuivjääk lahustada 0,5 ml valke lahustavas puhvris (4.6).
Adjustable rod homogenizer (10 mm shaft diameter), rpm range 8000 to 20000
Karbamiidi sisaldavate polüakrüülamiidgeelide valmistamine
Film welder
Niisutada geeli kandekilet (5.2) mõne tilga veega ja rullida see klaasplaadile (5.1), kõrvaldades eralduva vee paberrätiku või lapiga.
25 μl micropipettes
Vaheribadega (0,25 mm) kattekile (5.3) rullida teisele klaasplaadile samal viisil.
Vacuum concentrator or freeze-dryer
Asetada plaat nivelleerimislauale horisontaalasendisse.
Thermostatically controlled water bath adjustable to 35 and 40 ± 1 °C with shaker
Ettevalmistatud deaereeritud geelilahusele (4.1.2) lisada 10 μl TEMEDi (4.1.3.1), segada, lisada 10 μl PERi lahust (4.1.3.2), segada hoolikalt ja valada kohe kattekile keskele ühtlaselt laiali.
Densitometer equipment reading at λ = 634 nm
Asetada geeli kandeplaadi üks serv, kilepind allpool, kattekilega plaadile ja lasta kandeplaat aeglaselt alla, nii et kahe kile vahel moodustub ühtlane mullideta geelikile (joonis 3).
Isolation of caseins
Lasta geeli kandeplaat õhukese spaatli abil ettevaatlikult lõpuni alla ja asetada selle peale raskuseks veel kolm klaasplaati.
Weigh the amount equivalent to 5 g dry mass of cheese or the reference standards into a 100 ml centrifuge tube, add 60 ml distilled water and homogenize with a rod homogenizer (8000 to 10000 rpm).
Umbes 60 minuti pärast, kui polümerisatsioon on lõppenud, eemaldada kergelt klaasplaate koputades kandekilele polümeriseerunud geel koos kattekilega.
Adjust to pH 4,6 with dil. acetic acid (4.5.1) and centrifuge (5 minutes, 3000 g).
Kandekile väline pind puhastada hoolikalt geelijääkidest ja karbamiidist.
Decant the fat and whey, homogenize the residue at 20000 rpm in 40 ml distilled water adjusted to pH 4,5 with dil. acetic acid (4.5.1), add 20 ml dichloromethane (4.5.2), homogenize again and centrifuge (5 minutes, 3000 g).
Kande- ja kattekile vahel olev geel keevitada kiletorusse ja säilitada külmikus (säilivusaeg kuni kuus nädalat).
Remove the casein layer that lies between the aqueous and organic phases (see Figure 2) with a spatula and decant off both phases.
Märkus: kleepribadega kattekilet võib kasutada korduvalt.
Rehomogenise the casein in 40 ml distilled water (see above) and 20 ml dichloromethane (4.5.2) and centrifuge.
Kui proove on vähe või kasutatakse automaatset elektroforeesiseadet, võib polüakrüülamiidgeeli lõigata väiksemateks tükkideks (kaks geeli 4,5 × 5 cm).
Repeat this procedure until both extraction phases are colourless (two to three times).
Isoelektriline fookustamine
Homogenize the protein residue with 50 ml acetone (4.5.3) and filter through a medium-speed folded filter paper.
Reguleerida jahutustermostaat temperatuurile 12 °C.
Wash the residue on the filter with two separate 25 ml portions of acetone each time and allow to dry in the air or a stream of nitrogen, then pulverize finely in a mortar.
Geeli kandekile väline pind puhastada petrooliga, lasta jahutusploki keskele mõned tilgad petrooli (4.2).
Note: Dry casein isolates should be kept at –20 °C.
Seejärel rullida geel selle peal lahti nii, et kandekile jääks allapoole ega tekiks mulle.
Plasmin cleavage of β-caseins to intensify γ-caseins
Pühkida liigne petrool ära ja eemaldada kattekile.
Disperse 25 mg of isolated caseins (6.1.1) in 0,5 ml ammonium carbonate buffer (4.7.1) and homogenize for 20 minutes by e.g. using ultrasonic treatment.
Niisutada elektroodribad elektroodilahustega (4.3, 4.4), lõigata geeliga ühepikkuseks ja asetada kohale (elektroodide vahekaugus 9,5 cm).
Heat to 40 °C and add 10 μl plasmin (4.7.2), mix and incubate for one hour at 40 °C with continuous shaking.
Isoelektrilise fookustamise tingimused
To inhibit the enzyme add 20 μl ε-aminoproic acid solution (4.7.3), then add 200 mg of solid urea and 2 mg of dithiothreitol.
Geeli suurus 265 × 125 × 0,25 mm
Note: To obtain more symmetry in the focused casein bands it is advisable to freeze-dry the solution after adding the ε-aminocaproic acid and then dissolving the residues in 0,5 ml protein dissolving buffer (4.6).
Etapp
Preparation of the urea containing polyacrylamide gels
Pinge
With the aid of a few drops of water roll the gel carrier sheet (5.2) onto a glass plate (5.1), removing any extraneous water with paper towel or tissue.
Voolutugevus
Roll the cover sheet (5.3) with spacers (0,25 mm) onto another glass plate in the same way.
Võimsus
Lay the plate horizontally on a levelling table.
Volttunnid
Add 10 μl Temed (4.1.3.1) to the prepared and de-aerated gel solution (4.1.2), stir and add 10 μl PER-solution (4.1.3.2), mix thoroughly and immediately pour out evenly onto the centre of the cover sheet.
Eelfookustamine
Place one edge of the gel carrier plate (sheet side down) on the cover sheet plate and lower it slowly so that a gel film forms between the sheets and spreads out regularly and free of bubbles (Figure 3).
maksimaalselt
Carefully lower the gel carrier plate completely using a thin spatula and place three more glass plates on top of it to act as weights.
konstantselt 4
After polymerization is complete (about 60 minutes) remove the gel polymerized onto the gel carrier sheet along with the cover sheet by tipping the glass plates.
Proovi fookustamine
Clean the reverse of the carrier sheet carefully to remove gel residues and urea.
Lõppfookustamine
Weld the gel sandwich into a film tube and store in a refrigerator (maximum six weeks).
Märkus: kui geeli paksust või laiust muudetakse, tuleb voolutugevust ja võimsust reguleerida sellele vastavalt (nt 265 × 125 × 0,5 mm geeli puhul tuleb voolutugevust ja võimsust kahekordistada).
Note: The cover sheet with the spacers can be re-used.
Automaatse elektroforeesiseadme pingeprogrammi näide (kaks 5,0 × 4,5 cm geeli; elektroodid on geelile asetatud vahetult, ilma elektroodribadeta)
The polyacrylamide gel can be cut to smaller sizes, recommended when there are few samples or if an automatic electrophoresis device is used (two gels, size 4,5 × 5 cm).
Temperatuur
lsoelectric focusing
Fookustamine
Set the cooling thermostat to 12 °C.
Proovi aplikaator asetada kohale 2. etapis, kui protsess on kestnud 0 volttundi.
Wipe off the reverse of the gel carrier sheet with kerosene, then drip a few drops of kerosene (4.2) onto the centre of the cooling block.
Proovi aplikaator eemaldada 2. etapis, kui protsess on kestnud 30 volttundi.
Then roll the gel sandwich, carrier side down, onto it, taking care to avoid bubbles.
Valkude värvimine
Wipe off any excess kerosene and remove the cover sheet.
Valkude kinnistamine
Soak the electrode strips with the electrode solutions (4.3, 4.4), cut to gel length and place in the positions provided (distance of electrodes 9,5 cm).
Pärast pinge väljalülitamist eemaldada viivitamatult elektroodribad ja asetada geel kohe värvimis-/pesemisküvetti, millesse on valatud 200 ml kinnistit (4.9).
Conditions for isoelectric focusing:
Hoida geeli kinnistis 15 minutit, loksutada pidevalt.
Gel size 265 × 125 × 0,25 mm
Geeli pesemine ja värvimine
Step
Nõrutada kogu kinnisti välja ja pesta geeli kaks korda 100 ml värvi väljapesemise lahusega (4.10), iga kord 30 sekundit.
Voltage
Valada värvi väljapesemise lahus ära ja asendada 250 ml värvimislahusega (4.11.3).
Current
Lasta geelil värvuda 45 minutit, lahust ettevaatlikult loksutades.
Power
Värvi väljapesemine geelist
Volt-hours
Valada värvimislahus välja, pesta geeli kaks korda 100 ml värvi väljapesemise lahusega (4.10), seejärel loksutada 200 ml värvi väljapesemise lahusega 15 minutit, korrata värvi väljapesemisetappi vähemalt 2–3 korda, kuni saadakse selge värvitu foon.
Pre-focusing
Seejärel loputada geeli destilleeritud vees (2 × 2 minutit) ja lasta sellel õhu käes kuivada (2–3 tundi) või kuivatada fööniga (10–15 minutit).
maximum
Märkus 1: kinnistada, pesta, värvida ja värvi välja pesta tuleb 20 °C juures.
constant 4
Kõrgemat temperatuuri mitte kasutada.
Sample focusing
Märkus 2: kui eelistatakse värvimist tundlikuma hõbedaga (nt Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, Code nr 17-1150-01), tuleb plasmiiniga töödeldud kaseiiniproove lahjendada kuni kontsentratsioonini 5 mg/ml.
Final focusing
HINDAMINE
Note: If thickness or width of the gels are changed, the values for current and power have to be suitably adjusted (e.g. double the values for electric current and power if a 265 × 125 × 0,5 mm gel is used).
Hindamiseks võrreldakse uuritava proovi valgumustreid etalonainete mustriga samal geelil.
Example of a voltage programme for an automatic electrophoresis device (2 gels of 5,0 × 4,5 cm), electrodes without strips applied directly to the gel
Lehmapiima olemasolu juustus, mis on valmistatud lamba-, kitse- või pühvlipiimast või lamba-, kitse- ja pühvlipiima segust, tehakse kindlaks γ2- ja γ3-kaseiini järgi, mille isoelektrilised punktid on pH 6,5 ja pH 7,5 vahel (joonised 4a, 4b ja 5).
Temp.
Avastamispiir on alla 0,5 %.
Focusing
Visuaalne hindamine
Place sample applicator in step 2 at 0 Vh.
Lehmapiima koguse visuaalseks hindamiseks on soovitav reguleerida proovide ja etalonainete kontsentratsioonid selliseks, et lamba-, kitse- ja/või pühvlipiima γ2- ja γ3-kaseiini ribade intensiivsus oleks ühesugune (vt γ2 E, G, B ja γ3 E, G, B joonistel 4a, 4b ja 5).
Remove sample applicator in step 2 at 30 Vh.
Sel juhul saab uuritava proovi lehmapiimasisaldust (mis võib olla suurem või väiksem kui 1 % või võrdne 1 %ga) hinnata otse, võrreldes lehmapiima γ3- ja γ2-kaseiini ribade intensiivsusi (vt γ3 C ja γ2 C joonistel 4a, 4b ja 5) 0- ja 1-protsendiliste etalonainete (lammas, kits) või laboratoorse vaheetalonaine (pühvel) vastavate intensiivsustega.
Protein staining
Densitomeetriline hindamine
Protein fixation
Võimaluse korral tuleks lehmapiima γ2- ja γ3-kaseiinile vastavate piikide pindalade suhted lamba-, kitse- ja pühvlipiima vastavate piikide pindaladesse (joonis 5) määrata densitomeetriliselt (5.19).
Remove the electrode strips immediately after turning off the power and put the gel immediately into a staining/destaining dish filled with 200 ml fixative (4.9); leave for 15 minutes, shaking continuously.
Neid suhteid võrreldakse γ2- ja γ3-kaseiinile vastavate piikide pindalade suhetega samal geelil analüüsitud 1-protsendiliste etalonainete (lammas, kits) või laboratoorse vaheetalonaine (pühvel) puhul.
Washing and staining the gel plate
Märkus: meetod toimib rahuldavalt, kui 1-protsendilise etalonaine puhul saadakse nii lehma γ2- kui ka γ3-kaseiini olemasolu kohta selge kinnitus, kuid 0-protsendilise etalonaine puhul seda ei saada.
Thoroughly drain off the fixative and wash the gel plate twice for 30 seconds each time with 100 ml destaining solution (4.10).
Kui selliseid tulemusi ei saada, tuleb määramisprotsessi optimeerida, pidades täpselt kinni meetodi tingimustest kõigis üksikasjades.
Pour off the destaining solution and fill the dish with 250 ml staining solution (4.11.3); allow to stain for 45 minutes with gentle shaking.
Proov loetakse positiivseks, kui nii lehma γ2- kui ka γ3-kaseiini ribade intensiivsused või piikide pindalad on samaväärsed või suuremad kui 1-protsendilise etalonaine vastavad näitajad.
Destaining the gel plate
Addeo, F., Moio, L., Chianese, L., Stingo, C., Resmini, P., Berner, I, Krause, I., Di Luccia, A., Bocca A. Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins.
Pour off the staining solution, wash the gel plate twice using a 100 ml destaining solution (4.10) each time, then shake with 200 ml destaining solution for 15 minutes and repeat the destaining step at least two or three times until the background is clear and uncoloured.
Milchwissenschaft, 45, 708–711 (1990).
Then rinse the gel plate with distilled water (2 × 2 minutes) and dry in the air (2 to 3 hours) or with a hairdryer (10 to 15 minutes).
Addeo, F., Nicolai, M.A., Chianese, L., Moio, L., Spagna Musso, S., Bocca, A., Del Giovine, L. A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting.
Note 1: Carry out fixing, washing, staining and destaining at 20 °C.
Milchwissenschaft, 50, 83–85 (1995).
Do not use elevated temperatures.
Krause, I., Berner, I., Klostermeyer, H. Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte – and carrier ampholyte/immobilized pH gradient – isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier.
Note 2: If more sensitive silver staining (e.g. Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, Code No 17-1150-01) is preferred, plasmin-treated casein samples have to be diluted to 5 mg/ml.
Electrophoresis-Forum, 89 (B. J. Radola, ed.) lk 389-393, Bode-Verlag, München (1989).
EVALUATION
Krause, Ι., Belitz, H.-D., Kaiser, K.-P.
Evaluation is performed by comparing the protein patterns of the unknown sample with reference standards on the same gel.
Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50–100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films.