natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Hatano, H. Mizukami, M. Yamashita, R. Sakakibara, and E. Tamiya (2002), “Development and application of a monoclonal antibody-based sandwich ELISA for quantification of Japanese medaka (Oryzias latipes) vitellogenin”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 132, pp. 161-169.
i.
Bengtsson (2004), “The juvenile three-spined stickleback (Gasterosteus aculeatus L.) as a model organism for endocrine disruption — II — kidney hypertrophy, vitellogenin and spiggin induction”, Aquatic Toxicology 70, pp. 311-326.
Labori nimi
Tatarazako, N., M. Koshio, H. Hori, M. Morita, and T. Iguchi (2004), “Validation of an enzyme-linked immunosorbent assay method for vitellogenin in the medaka”, Journal of Health Science 50, pp. 301-308.
Proovi nr / preparaadi nr
Eidem, J.K., H. Kleivdal, K. Kroll, N. Denslow, R. van Aerle, C. Tyler, G. Panter, T. Hutchinson, and A. Goksoyr (2006), “Development and validation of a direct homologous quantitative sandwich ELISA for fathead minnow (Pimephales promelas) vitellogenin.
Kemikaal / kontsentratsioonirühm
Ankley (2006), “Evaluation of a commercial kit for measuring vitellogenin in the fathead minnow (Pimephales promelas)”, Ecotoxicology and Environmental Safety 64, pp. 101-105.
≤ 3 paralleeli konts. kohta
Holbech, H., Petersen, G. I., Norman, A., Örn, S, Norrgren, L., and Bjerregaard, P (2001b), “Suitability of zebrafish as test organism for detection of endocrine disrupting chemicals.
Tamhane-Dunnetti test pesastatud ANOVA kohta
Comparison of vitellogenin in plasma and whole body homogenate from zebrafish (Danio rerio) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)”, Nordic Council of Ministers, TemaNord 2001:597, pp. 48-51.
Parall. keskväärtuste jaotus on normaalne ja ühtlane
Porcher, and A. Goksoyr (2004), “Development of quantitative vitellogenin-ELISAs for fish test species used in endocrine disruptor screening”, Analytical and Bioanalytical Chemistry 378, pp. 621-633.
dispersiooni stabiliseeriv teisendus?
Orn, S., S. Yamani, and L. Norrgren (2006), “Comparison of vitellogenin induction, sex ratio, and gonad morphology between zebrafish and Japanese medaka after exposure to 17 alpha-ethinylestradiol and 17 beta-trenbolone”, Archives of Environmental Contamination and Toxicology 51, pp. 237-243.
Dispersioonid ei ole võrdsed
Scholz, S. and N. Kluver (2009), “Effects of Endocrine Disrupters on Sexual, Gonadal Development in Fish, Sexual Development 3”, pp. 136-151.
≤ 3 paralleeli konts. kohta
Fenske, M., G. Maack, C. Schafers, and H. Segner (2005), “An environmentally relevant concentration of estrogen induces arrest of male gonad development in zebrafish, Danio rerio”, Environmental Toxicology and Chemistry 24, pp. 1088-1098.
Monotoonne
Nagahama (2004), “Two DM domain genes, DMY and DMRT1, involved in testicular differentiation and development in the medaka, Oryzias latipes”, Developmental Dynamics 231, pp. 518-526.
Dunni või Mann-Whitney test parall. keskväärtustega
Shinomiya, A., H. Otake, K. Togashi, S. Hamaguchi, and M. Sakaizumi (2004), “Field survey of sex-reversals in the medaka, Oryzias latipes: genotypic sexing of wild populations”, Zoological Science 21, pp. 613-619.
Dunni test parall. keskväärtustega Dunni test
Flick (2007), “Collapse of a fish population after exposure to a synthetic estrogen”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, pp. 8897-8901.
Astmeliselt Jonckheere’i test
Tyler (2006), “Development of chronic tests for endocrine active chemicals — Part 1.
Võrrelda kontrolle Wilcoxoni või T-testiga.
Petersen, P. Jackson, K. Hylland, L. Norrgren, and P. Bjerregaard (2006), “Detection of endocrine disrupters: Evaluation of a Fish Sexual Development Test (FSDT)”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 144, pp. 57-66.
On olemas nii lahustiga kui ka ilma lahustita kontroll
Andersen, L., K. Kinnberg, H. Holbech, B. Korsgaard, and P. Bjerregaard (2004), “Evaluation of a 40 day assay for testing endocrine disrupters: Effects of an anti-estrogen and an aromatase inhibitor on sex ratio and vitellogenin concentrations in juvenile zebrafish (Danio rerio)”, Fish Physiology and Biochemistry 30, pp. 257-266.
Soolise jaotumise määramise tulemuste statistilise analüüsi otsustusskeem
Morthorst, J.E., H. Holbech, and P. Bjerregaard (2010), “Trenbolone causes irreversible masculinization of zebrafish at environmentally relevant concentrations”, Aquatic Toxicology 98, pp. 336-343.
Rakendada NOEC määramiseks astmeliselt Jonckheere’i-Terpstra testi (+)
Metcalf (2003), “Effects of the antiandrogens, vinclozolin and cyproterone acetate on gonadal development in the Japanese medaka (Oryzias latipes)”, Aquatic Toxicology 63, pp. 391-403.
NOEC määrata Dunni või Mann-Whitney U-testiga koos Bonferroni-Holmi kohandusega
Tyler (2004), “Successful detection of (anti-) androgenic and aromatase inhibitors in pre-spawning adult fathead minnows (Pimephales promelas) using easily measured endpoints of sexual development”, Aquatic Toxicology 70, pp. 11-21.
Kasutada NOEC määramiseks homogeense dispersiooni (*) korral Dunnetti testi, vastasel juhul Tamhane-Dunnetti (T3) testi
Petersen, and P. Bjerregaard (2007), “Effects of the fungicide prochloraz on the sexual development of zebrafish (Danio rerio)”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 145, pp. 165-170.
Kas andmed on normaaljaotusega?
Chapter C.14 of this Annex, Fish Juvenile Growth Test.
Kas andmed toetavad doosi-toime monotoonset sõltuvust?
Chapter C.4 of this Annex, Ready Biodegradability.
(‡) Või muu kokkulepitud kontrollvalim.
Chapter C.37 of this Annex, 21-Day Fish Assay:
Pärast arcsin-ruutjuure teisendust.
A Short Term Screening for Oestrogenic and Androgenic Activity, and Aromatase Inhibition.
(+) Kui katseühikuid on vähem kui 5 ühe kontsentratsiooni kohta, tuleks kasutada J-T või M-W testi, kui need on kättesaadavad.
Schäfers, C., Teigeler, M., Wenzel, A., Maack, G., Fenske, M., Segner, H (2007), “Concentration- and time-dependent effects of the synthetic estrogen, 17 alpha-ethinylestradiol, on reproductive capabilities of the zebrafish, Danio rerio” Journal of Toxicology and Environmental Health-Part A, 70, 9-10 pp 768-779.
Ühendada kontrollid
Abbreviations and definitions
Jätta vee kontroll kõrvale (‡)
Apical endpoint
Võrrelda kontrolle T-testiga.
Causing effect at population level
Kas kasutatakse lahustit?
Air saturation value
liide
Biomarker
Geneetilise soo määramiseks vajalike koeproovide võtmise ja PCR-meetodiga geneetilise soo määramise juhend
Causing effect at individual level
Jaapani riisikala koeproovide võtmine, ettevalmistamine ja säilitamine enne geneetilise soo määramist PCR-meetodiga (koostanud Bayer CropScience AG veeorganismide labor)
A substance or a mixture.
Iga kala päraku- või seljauim lõigatakse väikeste kääridega ära ja pannakse katseklaasi, milles on 100 μl ekstraheerimispuhvrit 1 (puhvri valmistamise üksikasjad on esitatud allpool).
Days post hatch
Kääre puhastatakse pärast iga kala lõikamist destilleeritud veega täidetud keeduklaasis ja kuivatatakse pabersalvrätiga.
Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish
Uimekoed homogeenitakse nüüd mikrotorus teflonvarda abil rakkude lüüsi saavutamiseks.
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
Iga toru puhul kasutatakse uut varrast, et vältida saastamist.
Fish weight
Vardad pannakse ööseks 0,5 M NaOH sisse, loputatakse viis minutit destilleeritud vees ja hoitakse etanoolis või steriilsena pärast autoklaavimist kuni kasutamiseni.
Fish wet weight (blotted dry)
Uimekudet on võimalik hoida ilma ekstraheerimispuhvrita 1 kuival jääl ja seejärel külmkapis – 80 °C juures, et vältida DNA lagunemist.
FSDT
Kuid ekstraheerimine läheb paremini, kui te ekstraheerite DNA kohe samal ajal (käsitsemine vt eespool; proovid tuleks sulatada jääl pärast säilitamist – 80 °C juures, enne kui puhver viiakse torudesse).
Fish Sexual Development Test
Pärast homogeenimist viiakse kõik torud vesivanni ja keedetakse 15 minutit 100 °C juures.
Hypothalamic-pituitary-gonadal axis
Seejärel lisatakse igasse torusse pipetiga 100 μl ekstraktsioonipuhvrit 2 (puhvri valmistamise üksikasjad vt allpool).
Intersex fish
Proove hoitakse toatemperatuuril 15 minutit ja selle aja jooksul neid aeg-ajalt loksutatakse käsitsi.
Fish with more than one oocyte in testis per 6 sections analysed or spermatogenetic cells in ovaries (yes/no)
Seejärel pannakse kõik torud jälle vesivanni keedetakse veel 15 minutit 100 °C juures.
Wet weight of fish per volume of water
Kuni edasise analüüsini torud külmutatakse – 20 °C juures.
Mode of action
Puhvrite valmistamine
Reverse Transcriptase Polymerase Chain-Reaction
PCR-puhver 1:
Undifferentiated fish
500 mg N-lauroüülsarkosiini (nt Merck KGaA, Darmstadt, Saksamaa)
Fish with gonads exhibiting no discernible germ cells.
→ autoklaavida
Vitellogenin
PCR-puhver 2:
Experimental conditions for the FSDT (freshwater species)
20 g Chelex'it (nt Biorad, München, Saksamaa)
Japanese medaka (Oryzias latipes)
lasta paisuda 100 ml-s dest. vees
Zebrafish (Danio rerio)
Jaapani riisikala geneetilise soo määramine PCR-meetodiga (koostanud Bayer CropScience AG veeorganismide labor ja Würzburgi ülikooli biokeskus)
Three-spined Stickleback (Gasterostreus aculeatus)
Ettevalmistatud ja külmutatud torud (vt eelmine jagu) sulatatakse jää peal.
Flow-through or semi-static
Pärast seda need tsentrifuugitakse Eppendorfi tsentrifuugis (30 s maksimaalse kiirusega, toatemperatuuril).
Fluorescent bulbs (wide spectrum
PCR-analüüsi jaoks kasutatakse sademest eraldatud selget supernatanti.
Light intensity
Tuleb kindlalt vältida sademes oleva Chelex'i vähimategi jälgede ülekandmist PCR-reaktsiooni, kuna see segab Taq-polümeraasi aktiivsust.
10-20 μE/m2/s, 540-1080 lux, or 50-100 ft-c (ambient laboratory levels)
Supernatanti kasutatakse kas kohe või seda võib säilitada külmutatult (– 20 °C juures) ja uuesti üles sulatada (ka mitu korda), ilma et see mõjutaks DNA hilisemat analüüsi.
12-16 h light, 8-12 h dark
„Reaktsioonisegu” ettevalmistamine (25 μl ühe proovi kohta):
Minimum chamber size
Maht
Individual chambers should contain a minimum of 7 l water volume
Lõppkontsentratsioon
Age of test organisms at start of exposure
Maatriks-DNAd
Newly fertilised eggs (Early blastula stage)
0,5–2 μl
Newly fertilised eggs
PCR-puhvrit MgCl2-ga
No. of eggs per treatment
2,5 μl
Minimum 120
Nukleotiide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP, igaühte)
Minimum 3 (plus appropriate controls)
Päripidist praimerit (10 μM) (vt allpool 3–5)
No. replicates per treatment
0,5 μl
Minimum 4 (unless square root allocation to controls)
Äraspidist praimerit (10 μM) (vt allpool 3–5)
Live Artemia, frozen adult brine shrimp, flake food, etc.
Vett (PCR jaoks sobiva puhtusega)
It is recommended to feed twice daily
kuni 25 μl-ni
Special fry food, live Artemia, frozen adult brine shrimp, flake food, etc.
Taq E-polümeraasi
It is recommended to feed twice daily
0,3 μl
None unless DO concentration falls below 60 % saturation
PCR-puhver MgCl2-ga:
None unless DO concentration falls below 70 % saturation
670 mM Tris/HCl (pH 8,8 25 °C juures), 160 mM (NH4)2SO4, 25 mM MgCl2, 0,1 % Tween 20
Clean surface, well or reconstituted water
Iga PCR-reaktsiooni jaoks (vt allpool 3–5) on vaja spetsiaalset praimerit, mis on uus „reaktsioonisegu” ja matriits-DNA piisava vajaliku koguse kombinatsioon.
Test chemical exposure duration
Vastavad kogused kantakse üle uutesse torudesse pipettidega.
Hatching success, Survival Gross- morphology, VTG gonadal histology, Genetic sex, Sex ratio
Pärast seda kõik katseklaasid suletakse, segatakse (umbes 10 sekundit) ja tsentrifuugitakse (10 sekundit, toatemperatuuril).
Hatching success, Survival Gross- morphology, VTG gonadal histology, Sex ratio
Nüüd võib alustada vastavaid PCR-programme.
Test acceptability criteria for pooled replicates of controls
Lisaks kasutatakse igas PCR-programmis veel üht positiivset kontrolli (näidis-DNA-proov, millel on teadaolev aktiivsus ja selged tulemused), ja üht negatiivset kontrolli (1 μl dest.
Hatching success > 80 %
H2O).
Post hatch survival ≥ 70 %
Agaroosgeeli (1 %) valmistamine – PCR-programmi toimumise ajal:
growth (Fish wet weight, blotted dry) > 150 mg
Lahustage 3 g agaroosi 300 ml-s 1 × TAE-puhvris (1 % agaroosgeel)
growth (Fish wet weight, blotted dry) > 75 mg
Seda lahust tuleks keeta mikrolaineahjus (ligikaudu 2–3 minutit)
growth (Fish wet weight, blotted dry) > 120 mg
Viige kuum lahus üle spetsiaalsesse valamiskarpi, mis asub jää peal
Length (standard length) > 20mm
Umbes 20 minuti pärast on agaroosgeel valmis kasutamiseks
Length (standard length) > 14 mm
Säilitage agaroosgeeli 1 × TAE-puhvris kuni PCR-programmide lõpuni
Length (standard length) > 20 mm
Aktiin-PCR-programm:
Sex ratio (% males or females) 30 %-70 %
Selle PCR-reaktsiooni eesmärk on tõendada, et proovis olev DNA ei ole kahjustatud.
Chemical characteristics of an acceptable dilution water
Spetsiaalne praimer:
CONCENTRATION
„Mact1 (upper/forward)” → TTC AAC AGC CCT GCC ATG TA
Particular matter
„Mact 2 (lower/reverse)” → GCA GCT CAT AGC TCT TCT CCA GGG AG
From test method C.14/Guidance on test concentrations
Programm:
Column (Number of concentrations between 100 and 10, or between 10 and 1) [1]
Tsükkel (35 korda):
A series of three (or more) successive concentrations may be chosen from a column.
Denatureerimine
Mid-points between concentrations in column (x) are found in column (2x + 1).
→ 45 s 95 °C juures
The values listed can represent concentrations expressed as percentage per volume or weight (mg/l or μg/l).
Anniilimine
Values can be multiplied or divided by any power of 10 as appropriate.
→ 45 s 56 °C juures
Column 1 might be used if there was considerable uncertainty on the toxicity level.
Elongatsioon
Guidance for homogenisation of head & tail from juvenile zebrafish, fathead minnow, three spined stickleback and Japanese medaka
→ 1 minut 68 °C juures
The purpose of this section is to describe the procedures that occur prior to the quantification of the VTG concentration.
15 minutit temperatuuril 68 °C
Other procedures that result in comparable VTG quantification can be used.
X- ja Y-geeni PCR-programm:
It is an option to determine the VTG concentration in blood plasma or liver instead of head/tail homogenate.
Selles PCR-programmis kasutatakse terve DNA proove selleks, et kontrollida X- ja Y-geene.
The head and tail are cut of the fish in accordance with the test description.
Isaskala DNA peaks ilmuma kahe vöödina ja emaskala DNA üheainsa vöödina (pärast värvimist ja geel-elektroforeesi).
All dissection instruments, and the cutting board should be rinsed and cleaned properly (e.g. with 96 % ethanol) between handling of each single fish to prevent “VTG pollution” from females or induced males to un-induced males.
Selle programmi tegemisel kasutatakse ühte isaskala (XY-näidis) ja üht emaskala (XX-näidis) positiivset kontrolli.
When a homogenous mass is achieved an amount of 4-10 time the tissue weight of ice-cold homogenisation buffer is added (note the dilution).
„PG 17.5” (upper/forward) → CCG GGT GCC CAA GTG CTC CCG CTG
The samples are placed on ice until centrifugation at 4 °C at 50000 g for 30 min.
„PG 17.6” (lower/reverse) → GAT CGT CCC TCC ACA GAG AAG AGA
Use a pipette to dispense portions of 20 to 50 μl (note the amount) supernatant into at least two tubes by dipping the tip of the pipette below the fat layer on the surface and carefully sucking up the supernatant without fat- or pellet fractions.
Tsükkel (40 korda):
Place on ice during use
→ 45 s 55 °C juures
Homogenisation buffer:50 mM Tris-HCl pH 7,4;
→ 1 min 30 s 68 °C juures
TRIS-ULTRA PURE (ICN)Protease inhibitor cocktail:
Isaskala proovidel peaks ilmuma üks vööt ja emaskala proovidel mitte ühtegi vööti (pärast värvimist ja geel-elektroforeesi).
From Sigma (for mammalian tissue) Product number P 8340.
„DMTYa (upper/forward)” → GGC CGG GTC CCC GGG TG
Guidance for quantification of head & tail homogenate vitellogenin in zebrafish (Danio rerio) (modified from Holbech et al., 2001). other procedures using homologous antibodies and standards can be used
„DMTYd (lower/reverse)” → TTT GGG TGA ACT CAC ATG G
Purified zebrafish vitellogenin standard [1] is serially diluted to 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10 and 20 ng/ml in dilution buffer (**) and samples are diluted at least 200 times (to prevent matrix effect) in dilution buffer and applied to the plates.
Värvimislahus:
An assay control is applied in duplicate.
50 % glütserool
150 μl are applied to each well.
0,25 % broomfenoolsinist
Standards are applied in duplicate and samples in triplicate.
0,25 % ksüleentsüanooli
Incubate over night at 4 °C on a shaker.
Pipetiga kantakse 1 μl värvimislahust igasse torusse
The plates are washed 5 times with washing buffer (*)
Geel-elektroforeesi alustamine:
HRP coupled to a dextran chain (e.g. AMDEX A/S, Denmark) and conjugated antibodies are diluted in washing buffer;
Ettevalmistatud 1 % agaroosgeel kantakse üle geel-elektroforeesikambrisse, mis on täidetud 1 × TAE-puhvriga
Actual dilution differs by batch and age.
10–15 μl igast värvitud PCR-proovist viiakse pipetiga agaroosgeeli pilusse
150 μl are applied to each well and the plates are incubated for 1 hour at room temperature on a shaker.
Eraldi pilusse kantakse ka 5–15 μl 1kb-„redelit” (Invitrogen)
The plates are washed 5 times with washing buffer (*) and the bottom of the plates is carefully cleaned with ethanol.
Elektroforeesi alustatakse 200 V juures
150 μl TMB plus (***) are applied to each well.
Elektroforees peatatakse 30-45 minuti pärast
Protect the plate against light with tinfoil, and watch the colour development on a shaker.
Vöötide määramine:
When the standard curve is fully developed the enzyme activity is stopped by adding 150 μl 0,2 M H2SO4 to each well.
Agaroosgeel puhastatakse destilleeritud vees
The absorbance is measured at 450 nm (e.g. on a Molecular Devices Thermomax plate reader).
Seejärel kantakse agaroosgeel etiidiumbromiidi sisse 15–30 minutiks
Data are analysed on the associated software (e.g. Softmax).
Seejärel pildistatakse agaroosgeeli UV-valguse all
Washing buffer:
Lõpuks analüüsitakse proove ja võrreldakse neid positiivse kontrolli vöödi (või vöötidega) ja redeliga
PBS-stock (****)
liide
Adjust pH to 7,3 and fill to 5 l with millipore H2O.
Juhend koeproovide võtmiseks, et määrata polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR-) meetodil ogaliku geneetiline sugu
Store at 4 °C.
Koeproovide võtmine ja DNA eraldamine
Dilution buffer:
DNA saab eraldada mitmesuguste müügil olevate reaktiivide abil kas käsitsi või automaatse DNA-eraldussüsteemiga.
PBS-Stock (****)
Allpool on esitatud Cefas Weymouthi laboris kasutatav eeskiri; sobival juhul on lisatud ka alternatiivseid võimalusi.
Adjust pH to 7,3 and fill to 1 l with millipore H2O.
Väikeste kääridega lõigatakse igast kalast väike tükk kude (10–20 mg) seljakülgmisest osast (pärast pea ja saba eemaldamist vitellogeniini analüüsiks).
TMB plus is a “ready-to-use” substrate produced by KemEnTec (Denmark).
Kude pannakse viaali ja paigutatakse kas vedelasse lämmastikku säilitamiseks temperatuuril – 80 °C või täidetakse viaal 70 % etanooliga (transpordiks ja säilitamiseks temperatuuril 4 °C).
It is sensitive to light.
Käärid puhastatakse pärast iga kala lõikamist 70 % etanooliga, seejärel destilleeritud veega ja kuivatatakse kuivatuspaberiga.
PBS stock
Etanool (kui see lisati) eemaldatakse aspireerimisega ja kudesid lagundatakse hommikuni proteinaas K-ga 400 μl-s ATL-puhvris (Qiagen).
HPO4 · 2H2O
Lagundatud koe alikvoot (200 μl) kantakse üle 96 süvendiga S-plokile (Qiagen) ja DNA eraldatakse 96 süvendiga vormist, kasutades Qiagen'i universaalbiorobotit ja QIamp'i teadlase bioroboti komplekti.
Adjust pH to 6,8 and fill with millipore H2O to 2 l.
DNA-d elueeritakse 50 μl veega, milles ei tohi olla DNaase ega RNaase.
Store at room temperature.
Kui DNA eraldamiseks kasutatakse kõvu kudesid (nt lülisammast või rinnauime), võib olla vajalik proovi homogeenimine lüüsipuhvris, kasutades FastPrep® koelagundajat või muud samaväärset kudede purustamise süsteemi.
Battelle AP4.6.04 (1,18 mg/ml (AAA)), purified according to:
Teised võimalused
Guidance for the preparation of tissue sections for sex determination and staging of gonads
Kude lagundatakse öö läbi proteinaas K-ga 400 μl-s lüüsipuhvris G2 (Qiagen) ja DNA eraldatakse 200 μl-st lüüsitud lahusest, kasutades kas EZ-1 DNA easy tissue komplekti ja biorobotit EZ-1 või DNA easy tissue minikomplekti.
The purpose of this section is to describe the procedures that occur prior to the evaluation of histological sections.
DNA elueeritakse 50 μl veega.
Other procedures that result in similar sex determination and gonadal staging can be used.
Kudesid töödeldakse reaktiiviga DNAzol.
With a few exceptions, these procedures are similar for Japanese medaka (JMD) and zebrafish (ZF).
Lühidalt öeldes lüüsitakse koeproove 1 ml DNAzol'iga 10 minutit 1,5 ml mikrotsentrifuugitopsis ja tsentrifuugitakse siis kiirusega 13000 p/min 5 minutit, et eemaldada kõik tahked osakesed.
Euthanasia, Necropsy, and Tissue Fixation
Lüüsitud proov viiakse seejärel üle uude 1,5 ml mikrotsentrifuugitopsi, milles on 500 μl 100 % molekulaarbioloogias vajaliku puhtusastmega etanooli ja seejärel tsentrifuugitakse kiirusega 13000 p/min 10 minutit, et sadestada DNA.
Objectives:
Etanool eemaldatakse ja asendatakse 400 μl 70 % molekulaarbioloogias vajaliku puhtusastmega etanooliga, tsentrifuugitakse kiirusega 13000 p/min 5 minutit ja DNAd sisaldav sade lahustatakse 50 μl vees, milles ei tohi olla DNaase ega RNaase.
Provide for the humane sacrifice of fish.
Jällegi, kui kasutatakse kõvu kudesid (nt rinnauime), võib olla vajalik proovi homogeenimine lüüsipuhvris, kasutades FastPrep® koelagundajat või muud samaväärset kudede purustamise süsteemi.
Obtain necessary body weights and measurements.
DNA säilitatakse – 20 °C juures, kuni seda läheb vaja.
Evaluate secondary sex characteristics.
töö ajal tuleb kanda kindaid.
Dissect tissues for VTG analysis.
Polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) analüüs
Fixation of the gonads.
Amplifitseerimine viidi läbi 2,5 μl eraldatud DNA-ga reaktsioonisegu 50 μl mahu juures, kasutades Idh-lookuse praimereid (nagu on kirjeldatud Peichel et al., 2004.
Fish should be sacrificed immediately prior to necropsy.
Päripidine praimer
Therefore, unless multiple prosectors are available, multiple fish should not be sacrificed simultaneously.
Äraspidine praimer
Using the small dip net, a fish is removed from the experimental chamber and transported to the necropsy area in the transport container.
Sobivate PCR-reaktiivide pakkujaid on palju.
The fish is placed in the euthanasia solution.
Allpool kirjeldatud meetodid kasutatakse praegusel ajal Cefas Weymouthi laboris.
The fish is removed from the solution when there is cessation of respiration and the fish is unresponsive to external stimuli.
„Reaktsioonisegu” ettevalmistamine (50 μl ühe proovi kohta):
The fish is wet weighed.
Põhisegu valmistatakse järgmiselt.
For preparation of tissues for VTG analysis, the fish can be placed on a corkboard on the stage of a dissecting microscope.
Selle saab ette valmistada ja säilitada külmutatult – 20 °C juures, kuni seda vaja läheb.
For zebrafish the head is cut right behind the pectoral fin and tail is cut right behind the dorsal fin.
Valmistage piisav kogus põhisegu negatiivse kontrolli jaoks (molekulaarbioloogias vajaliku kvaliteediga vesi).
For Japanese medaka the abdomen is opened via a carefully made incision that extends along the ventral midline from the pectoral girdle to a point just cranial to the anus.
Ruumala (põhilahuse konts) /proov
Using the small forceps and small scissors, the liver is carefully removed.
® reaktsioonipuhver
Specimen for VTG analysis are placed in eppendorf tubes and immediately frozen in liquid nitrogen.
Nukleotiidid (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
The carcass including the gonads is placed into a pre-labelled plastic tissue cassette, which is transferred into Davidson's or Bouin's fixative.
0,5 μl (25 mM igaühte)
The volume of fixative should be at least 10 times the approximated volume of the tissues.
250 μM igaühte
The fixative container is gently agitated for five seconds to dislodge air bubbles from the cassette.
Päripidine praimer
All tissues remain in Davidson's fixative overnight, followed by transfer to individual containers of 10 % neutral buffered formalin the next day.
0,5 μl (0,1 nmol/μl)