natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Chromogen/Substrate
Konkurentsist lähtuval blokeerimisel põhinev ELISA on ette nähtud spetsiifiliste HAKV vastaste antikehade tuvastamiseks kõikide hobuslaste, st hobuste, eeslite, sebrade ja nende ristandite seerumis ning võimaldab ära hoida kaudse ELISA kasutamisel kohati esile kerkivat vähese spetsiifilisuse probleemi.
Add 200 μl/well of chromogen/substrate solution (10 ml of 80,6 mM DMAB (dimethyl aminobenzaldehyde) + 10 ml of 1,56 mM MBTH (3-methyl-2-benzo-thiazoline hydrazone hydrochlorid) + 5 μl H2O2).
See meetod põhineb ELISA plaadile absorbeerunud rekombinantse VP7 ja HAKV-VP7 vastase spetsiifilise konjugeeritud monoklonaalse antikeha vahelise reaktsiooni blokeerimisel.
Colour development is stopped by adding 50 μl of 3N H2SO4 after approximately 5 to 10 minutes (before the negative control begins to be coloured).
Uuritavas seerumis sisalduvad antikehad pärsivad antigeeni ja monoklonaalse antikeha vahelist reaktsiooni, mille tulemusena tekib vähem värvainet.
Other chromogens such as ABTS (2,2′-Azino-bis-[3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid]), TMB (tetramethyl benzidine), or OPD (ortho-phenyldiamine) can also be used.
Kuna kõnealuse monoklonaalse antikeha sihtmärk on VP7, on see meetod väga tundlik ja spetsiifiline.
Read the plates at 600 nm (or 620 nm).
Konkurentsist lähtuval blokeerimisel põhinev ELISA komplekt on turul kättesaadav.
Interpretation of the results
Tahke faas
Calculate the cut-off value by adding 0,06 to the value of the negative control (0,06 is the standard deviation derived with a group of 30 negative sera).
ELISA plaadid kaetakse 50–100 ng rekombinantse HAKV-4 VP7-ga, mis on lahjendatud karbonaadi/vesinikkarbonaadi puhverlahuses, mille pH on 9,6.
Test samples giving absorbance values lower than the cut-off are regarded as negative.
Plaate inkubeeritakse öö läbi 4 °C juures.
Test samples giving absorbance values greater than the cut-off + 0,15 are regarded as positive.
Plaate pestakse kolm korda fosfaadiga puhverdatud, 10 korda lahjendatud soolalahusega (PBS), mis sisaldab 0,135 M NaCl ja 0,05 mahuprotsenti Tween 20 (PBST).
Test samples giving intermediate absorbance values are considered to be inconclusive and a second technique must be employed to confirm the result.
Pesemisjääkide eemaldamiseks koputatakse plaate õrnalt vastu kuivatuspaberit.
Blocking ELISA for the detection of antibodies to African horse sickness virus (AHSV)
Uuritavad proovid ja kontrollid
The competitive blocking ELISA is designed to detect specific AHSV antibodies in sera from animals of any equine species, i.e. horses, donkeys, zebra and their crosses, preventing the problem of specificity experienced occasionally using the indirect ELISAs.
Uuritavad seerumiproovid ning positiivsed ja negatiivsed kontrollseerumid lahjendatakse vahekorras 1:5 lahjendusvedelikus, mille koostis on järgmine: 0,35 M NaCl, 0,05 mahuprotsenti Tween 20 ja 0,1 % säilitusainet Kathon; igasse kannu kantakse 100 μl lahust.
The principle of the test is the blocking of the reaction between the recombinant VP7 protein absorbed to the ELISA plate and a conjugated AHS-VP7 specific monoclonal antibody (Mab).
Tiitrimiseks tehakse uuritavatest seerumitest kaheksasse kannu kahekordsete lahjenduste rida, mis hõlmab lahjendusastmeid 1:10 kuni 1:280 (100 μl kannu kohta), plaadi iga veeru kohta üks seerum, ja sama tehakse positiivse ja negatiivse kontrollseerumiga.
Antibody in the test sera will block the reaction between the antigen and the Mab resulting in a reduction in colour.
Inkubeeritakse 1 tund 37 °C juures.
Because the Mab is directed against the VP7, the assay will give a high level of sensitivity and specificity.
Plaate pestakse viis korda fosfaadiga puhverdatud, 10 korda lahjendatud soolalahusega (PBS), mis sisaldab 0,135 M NaCl ja 0,05 mahuprotsenti Tween 20 (PBST).
The competitive blocking ELISA is commercially available.
Inkubeeritakse 30 minutit 37 °C juures.
Solid Phase
Igasse kannu lisatakse 100 μl kromogeeni/substraadi lahust, st 1 ml ABTSi (2,2′-asino-bis-[3-etüülbensotiasoliin-6-sulfoonhape]) lahust kontsentratsiooniga 5 mg/ml + 9 ml substraadi puhverlahust (0,1 M fosfaadi-tsitraadi puhverlahus, pH 4, mis sisaldab 0,03 % H2O2) ja inkubeeritakse 10 minutit toatemperatuuril.
Coat ELISA plates with 50-100 ng of recombinant AHSV-4 VP7 diluted in carbonate/bicarbonate buffer, pH 9,6.
Värvusreaktsiooni peatamiseks lisatakse igasse kannu 100 μl lahust, mis sisaldab 2 massiprotsenti naatriumdodetsüülsulfaati (SDS) ruumalaühiku kohta.
Incubate overnight at 4 °C.
Lugemine
Wash the plates three times with phosphate buffered saline (PBS) 0,1× containing 0,135 M NaCl and 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST).
Näitusid loetakse 405 nm juures ELISA plaadilugeja abil.
Gently tap the plates on to absorbent material to remove any residual wash.
Blokeerimise protsentuaalse määra (BP) leidmiseks igas proovis kasutatakse järgmist valemit, kus „AKd“ tähistab antikehasid:
Test samples and controls
Akdkontroll
Serum samples to be tested, and positive and negative control sera, are diluted 1 in 5 in diluent containing 0,35 M NaCl, 0,05 % (v/v) Tween 20 and 0,1 % Kathon, 100 μl per well.
Akdproov
For titration, make a twofold dilution series of the test sera from 1 in 10 to 1 in 280 across 8 wells (100 μl/well), one serum per plate column, and do the same with positive and negative controls.
Proovid, mille BP väärtus on üle 50 %, tuleks lugeda HAKV vastaste antikehade suhtes positiivseks.
Incubate for 1 hour at 37 °C.
Proovid, mille BP väärtus on alla 45 %, tuleks lugeda HAKV vastaste antikehade suhtes negatiivseks.
In advance, this Mab has been diluted 1/5000-1/15000 in a 1/1 solution of StabiliZyme Select® Stabilizer (SurModics.
B OSA
Reference: SZ03) in distilled water.
Haigusetekitaja kindlakstegemine
Incubate for 30 minutes at 37 °C.
Pöördtranskriptsiooniga reaalajas jälgitav polümeraasi ahelreaktsioon (rRT-PCR)
Add 100 μl/well chromogen/substrate solution, i.e. 1 ml of ABTS (2,2′-Azino-bis-[3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid]) 5 mg/ml + 9 ml of substrate buffer (0,1 M Phosphate-Citrate buffer of pH 4 containing 0,03 % H2O2), and incubate for 10 minutes at room temperature.
Nukleiinhapetega seotud meetoditel põhinevad haigusetekitaja kindlakstegemise testid peavad võimaldama tuvastada HAKV üheksa serotüübi võrdlustüved.
Colour development is stopped by adding 100 μl/well of 2 % (w/v) SDS (sodium dodecyl sulphate).
Punktis 2.1 kirjeldatud meetod põhineb OIE delegaatide ülemaailmsel assambleel 2012. aasta maikuus vastu võetud OIE maismaaloomade diagnostiliste testide ja vaktsiinide käsiraamatu 2016. aasta väljaande peatüki 2.5.1 B jao punktil 1.2.
Reading
Vere- või põrnaproovide testimiseks kasutatav mis tahes RT-PCRi meetod peab direktiivi 2009/156/EÜ kohaldamisel olema sama tundlik või tundlikum kui punktis 2 kirjeldatud meetodid.
Read at 405 nm in an ELISA reader.
Serotüüpide 1–9 võrdlustüvede inaktiveeritud viirused on kättesaadavad hobuste Aafrika katku Euroopa Liidu referentlaborist või Hispaanias Algetes asuvast OIE hobuste Aafrika katku referentlaborist.
Determine the blocking percentage (BP) of each sample by applying the following formula, where “Abs” stands for antibodies:
Viiruse RNA eraldamine
Abscontrol
Tõhusa reaktsiooni tagamiseks on vaja proovist eraldada kvaliteetne HAKV RNA.
Abssample
Nukleiinhappeid saab kliinilistest proovidest eraldada mitmesuguste kohapeal välja töötatud või turul kättesaadavate meetodite abil.
Samples showing a BP value higher than 50 % should be considered as positive for AHSV antibodies.
Müügil olevate komplektide puhul kasutatakse erinevaid RNA eraldamise viise.
Samples showing a BP value lower than 45 % should be considered as negative for AHSV antibodies.
Enamik neist põhineb ühel järgmistest meetoditest:
Samples showing a BP value between 45 % and 50 % should be considered as inconclusive and must be retested.
nukleiinhapete eraldamine fenooli ja kloroformi abil;
If the result is again inconclusive, the animals should be retested on samples taken not earlier than two weeks after the sample which was considered to be inconclusive was taken.
nukleiinhapete filtrile adsorbeerimise süsteem;
PART B
nukleiinhapete magnetkerakestele adsorbeerimise süsteem.
Identification of the agent
Allpool on esitatud üks kohapeal välja töötatud RNA eraldamise meetod.
Real-time Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction (rRT-PCR)
1 g koeproovi homogeniseeritakse 1 ml denatureerimislahuses (4 M guanidiintiotsüanaat, 25 mM naatriumtsitraat, 0,1 M 2-merkaptoetanool, 0,5 % sarkosüüli).
Agent identification tests based on nucleic acid methods must detect reference strains from the nine virus serotypes of the AHSV.
Pärast tsentrifuugimist lisatakse supernatandile 1 μg pärmi RNA-d, 0,1 ml 2 M naatriumatsetaati (pH 4), 1 ml fenooli ning 0,2 ml kloroformi ja isoamüülalkoholi segu (49:1).
The method described in point 2.1 is based on point 1.2 of Section B in Chapter 2.5.1 of the Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, Edition 2016 as adopted by the World Assembly of Delegates of the OIE in May 2012.
Suspensiooni loksutatakse tugevasti ja seda hoitakse jahutamiseks 15 minutit jääl.
Any RT-PCR detection method used for the testing of samples, either blood or spleen, in the context of Directive 2009/156/EC must perform equal to or exceed the sensitivity of the methodologies described in point 2.
Pärast tsentrifuugimist ekstraheeritakse veefaasis olev RNA fenooliga, sadestatakse etanooliga ja lahustatakse uuesti steriilses vees.
Inactivated virus of serotypes 1 to 9 reference strains may be obtained from the European Union Reference Laboratory or the OIE Reference Laboratory for African horse sickness, Algete, Spain.
Reaalajas jälgitava RT-PCRi meetodid
Extraction of viral RNA
Agüero et al.
To assure a good reaction it is necessary to extract from the sample an AHSV RNA of high quality.
(2008) [3] kirjeldatud rühmaspetsiifiline reaalajas jälgitav RT-PCR
The extraction of nucleic acids from clinical samples can be performed by a variety of in-house and commercially available methods.
Selle rühmaspetsiifilise reaalajas jälgitava RT-PCRi eesmärk on HAKV VP7 tuvastamine ja sellega on võimalik tuvastada kõiki teadaolevaid praegu esinevaid HAKV serotüüpe ja tüvesid.
Commercial kits use different approaches for RNA isolation.
HAKV tuvastamiseks kasutatavad praimeri- ja sondijärjestused:
Most are based on one of the following procedures:
päripidine praimer: 5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′
Phenol-chloroform extraction of nucleic acids;
äraspidine praimer: 5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′
Adsorption of nucleic acids to filter system;
sond MGB-TaqMan: 5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′
Adsorption of nucleic acids to magnetic beads system.
Praimeri lähtelahusest saadakse lahjendamise teel töölahus kontsentratsiooniga 8 μM (edaspidi „praimeri 8 μM töölahus“), sondi aga lahjendatakse nii, et saadakse 50 μM töölahus (edaspidi „sondi 50 μM töölahus“).
An example of an in-house RNA extraction is given below:
Tuleks koostada katseplaadi skeem ja laadida see reaalajas jälgitava PCRi seadme tarkvarasse.
1 g of tissue sample is homogenised in 1 ml of denaturing solution (4 M guanidium thiocyanate, 25 mM sodium citrate, 0,1 M 2-mercaptoethanol, 0,5 % sarcosyl).
Skeemi alusel lisatakse igasse kannu, mis sisaldab uuritavat RNA proovi või positiivset või negatiivset kontrollproovi, 2,5 μl kummagi praimeri 8 μM töölahust (praimerite lõppkontsentratsioon 20 μl RT-PCRi segus on 1 μM).
After centrifugation, 1 μg of yeast RNA, 0,1 ml of 2 M sodium acetate pH 4, 1 ml of phenol and 0,2 ml of chloroform/isoamyl alcohol mixture (49/1) are added to the supernatant.
Plaati hoitakse jää peal.
The suspension is vigorously shaken and cooled on ice for 15 minutes.
2 μl eraldatud RNAd (uuritavad proovid ja positiivsed kontrollproovid) või 2 μl ribonukleaasivaba vett (negatiivsed kontrollproovid) segatakse päripidise ja äraspidise praimeriga.
After centrifugation, the RNA present in the aqueous phase is phenol extracted, ethanol precipitated and resuspended in sterile water.
Segu denatureeritakse kuumutamisega 95 °C juures 5 minuti kestel ja viiakse seejärel jahutamiseks kiiresti vähemalt 5 minutiks jää peale.
Real-time RT-PCR Procedure
Vastavalt tootja juhistele valmistatakse uuritavate proovide arvu jaoks piisav kogus üheetapilise reaalajas jälgitava RT-PCRi põhisegu.
This group-specific real-time RT-PCR targets VP7 of the AHSV and is able to detect all known AHSV serotypes and strains currently circulating.
Igasse denatureeritud praimereid ja RNA-d sisaldavasse PCRi plaadi kannu pannakse 13 μl üheetapilise reaalajas jälgitava RT-PCRi põhisegu.
It has been employed with very good results by the participating national reference laboratories of the European Union Member States in the proficiency tests annually organised by the European Union Reference Laboratory for the period 2009-2015.
Plaat asetatakse reaalajas jälgitavat PCRi võimaldavasse termotsüklerisse, mis on programmeeritud töötama pöördtranskriptsiooni ja cDNA amplifitseerimise/fluorestsentssignaali tuvastamise režiimis.
Moreover, in an international ring trial organised in 2015 in the framework of the OIE reference laboratories network this protocol was ranked very high amongst others.
Amplifitseerimistingimustega nähakse ette algne 25 minuti pikkune pöördtranskriptsioonietapp 48 °C juures, millele järgneb inkubeerimine 10 minutit 95 °C juures („kuumstart“) ning 40 tsüklit, igas tsüklis 15 sekundit 95 °C juures, 35 sekundit 55 °C juures ja 30 sekundit 72 °C juures (või 40 tsüklit, igas tsüklis 2 sekundit 97 °C juures ja 30 sekundit 55 °C juures, kui kasutatakse kiireid reaktsioone võimaldavaid reaktiive ja termotsüklerit).
Primer and probe sequences for the detection of AHSV species viruses:
Fluorestsentssignaali mõõdetakse 55 °C juures toimuva etapi lõpus.
forward Primer 5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′
Kui saadakse ebatüüpiline amplifikatsioonikõver, loetakse analüüs kehtetuks ja seda tuleb korrata.
reverse Primer 5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′
Proov loetakse positiivseks, kui proovi Ct-väärtus (selle tsükli järjekorranumber, mille juures reaktsioonis tekkinud fluorestsentssignaal ületab fluorestsentssignaali läviväärtuse) on 40 PCRi tsükli vältel Ct kindlaksmääratud läviväärtusest (35) väiksem või sellega võrdne (Ct ≤ 35).
MGB-TaqMan probe 5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′
Tulemus loetakse ebaselgeks, kui proovi Ct-väärtus on 40 PCRi tsükli vältel Ct kindlaksmääratud läviväärtusest (35) suurem (Ct > 35).
Primer stock concentration is diluted to a working concentration of 8 μM (“primer working stock 8 μM”) whereas probe is diluted to a working concentration of 50 μM (“probe working stock 50 μM”).
Proov loetakse negatiivseks, kui saadakse horisontaalne amplifikatsioonikõver, mis ei tõuse 40 PCRi tsükli jooksul signaali läviväärtusele vastavast sirgjoonest ülespoole.
A test plate layout should be designed and loaded into the real time PCR machine software.
Guthrie et al.
Using the layout as a guide, 2,5 μl of each primer working stock 8 μM is added to each well that will contain RNA samples, positive and/or negative controls (final concentration of the primer will be 1 μM in the 20 μl RT-PCR mix).
(2013) [4] kirjeldatud rühmapetsiifiline reaalajas jälgitav RT-PCR
The plate is held on ice.
Tegemist on reaalajas jälgitava RT-PCR-ga, mille puhul HAKV nukleiinhappe tuvastamiseks kasutatakse Försteri resonantsenergia ülekannet (FRET) võimaldavaid sonde.
2 μl of isolated RNA (test samples and positive control), or 2 μl of RNAse-free water in negative reaction controls, is mixed with forward and reverse primers.
RT-PCR-l põhineva kirjeldatud HAKV testi väljatöötamiseks kasutati mitmesuguste praegu esinevate HAKV välitüvede järjestusi (Quan et al., 2010) [5].
This mixture is denatured by heating at 95 °C for 5 minutes, followed by rapid cooling on ice for at least 5 minutes.
päripidine praimer: 5′-AGA-GCT-CTT-GTG-CTA-GCA-GCC-T-3′
An appropriate volume of real time one-step RT-PCR master mix for the number of samples to be tested is prepared following manufacturer's instructions.
äraspidine praimer: 5′-GAA-CCG-ACG-CGA-CAC-TAA-TGA-3′
0,1 μl of probe working stock 50 μM is added to each well containing RNA samples (final concentration of the probe will be 0,25 μM in each well containing RNA samples).
Praimerite ja sondi segu lähtelahus valmistatakse 25 korda kontsentreeritumana: päripidise ja äraspidise praimeri kontsentratsioon selles on 5 μΜ ning sondi kontsentratsioon 3 μΜ.
13 μl of real time one-step RT-PCR master mix is distributed in each well on the PCR plate containing the denatured primers and RNA.
Tuleks koostada katseplaadi skeem ja laadida see reaalajas jälgitava PCRi seadme tarkvarasse.
The plate is placed in a real time thermal cycler programmed for reverse transcription and cDNA amplification/fluorescence detection.
Skeemi alusel lisatakse plaadi asjaomastesse kannudesse 5 μl uuritavat RNA proovi või positiivset või negatiivset kontrollproovi.
Amplification conditions consist of a first reverse-transcription step at 48 °C for 25 minutes, followed by 10 minutes at 95 °C (“hot start”) and 40 cycles of 15 seconds at 95 °C, 35 seconds at 55 °C and 30 seconds at 72 °C (or 40 cycles at 97 °C for 2 seconds and 55 °C for 30 seconds if reagents and thermocycler allowing fast reactions are used).
2.2.2.
Fluorescence data are acquired at the end of the 55 °C step.
RNA denatureerimiseks kuumutatakse seda 5 minutit 95 °C juures ja seejärel viiakse proov jahutamiseks kiiresti vähemalt 3 minutiks jää peale.
The assay is considered not valid if atypical amplification curves are obtained, and must be repeated.
Igasse denatureeritud RNA-d sisaldavasse PCRi plaadi kannu pannakse 20 μl põhisegu.
Samples are considered positives, if the Ct value (cycle number at which the fluorescence generated within a reaction crosses the fluorescence threshold) is lower than or equal to the defined Ct threshold (35) within 40 PCR cycles (Ct ≤ 35).
Plaat asetatakse reaalajas jälgitavat PCRi võimaldavasse termotsüklerisse, mis on vastavalt tootja juhistele programmeeritud töötama pöördtranskriptsiooni ja cDNA amplifitseerimise/fluorestsentssignaali tuvastamise režiimis.
Samples are considered inconclusive, if the Ct value is higher than the defined Ct threshold (35) within 40 PCR cycles (Ct > 35).
Amplifitseerimistingimustega nähakse ette näiteks algne 10 minuti pikkune pöördtranskriptsioonietapp 48 °C juures, millele järgneb inkubeerimine 10 minutit 95 °C juures ning 40 tsüklit, igas tsüklis 15 sekundit 95 °C juures ja 45 sekundit 60 °C juures.
Samples are considered negative, if a horizontal amplification curve is obtained which does not cross the threshold line within 40 PCR cycles.
Proov loetakse positiivseks, kui HAKV tuvastamiseks tehtud RT-PCRi käigus saadud normaliseeritud fluorestsentssignaal ületab 36 PCRi tsükli jooksul proovi kõikides paralleelides läviväärtuse 0,1.
Kits for the one-step real-time PCR are available commercially.
Methods 125 (1): 55–65.
Below are some basic steps as described by Guthrie et al.
Methods 189 (1): 30–35.
MGB-TaqMan probe 5′-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3′
Agüero, M., Gomez-Tejedor, C., Angeles Cubillo, M., Rubio, C., Romero, E., ja Jimenez-Clavero, A. (2008).
Primer and probe mix stock solutions are made up in a 25× concentration at 5 μΜ for the forward and reverse primers and 3 μΜ for the probe.
Osalevad Euroopa Liidu liikmesriikide referentlaborid on seda ajavahemikul 2009–2015 Euroopa Liidu referentlabori korraldatud iga-aastastes pädevuskontrollides kasutades saanud väga häid tulemusi.
The RNA is denatured by heating at 95 °C for 5 minutes, followed by rapid cooling on ice for at least 3 minutes.
Preparation of recombinant African horse sickness virus VP7 antigen via a simple method and validation of a VP7-based indirect ELISA for the detection of group-specific IgG antibodies in horse sera.
An appropriate volume of real-time one-step RT-PCR master mix for the number of samples to be tested is prepared, following the manufacturer's instructions.
Guthrie, A. J., MacLachlan, N. J., Joone, C., Lourens, C. W., Weyer, C. T., Quan, M., Monyai, M. S., ja Gardner, I. A. (2013).
1 μl of 25× primer probe mix stock solution (from point 2.2.1 above) is included in the master mix to give a final concentration in each well of 200 nM for each primer and 120 nM of the probe.
Laviada, M. D., Roy, P., ja Sanchez-Vizcaino, J. M. (1992b).
20 μl of the master mix is distributed in each well on the PCR plate containing the denatured RNA.
Quan, M., Lourens, C. W., MacLachlan, N. J., Gardner, I. A., ja Guthrie, A. J. (2010).
The plate is placed in a real-time thermal cycler programmed for reverse transcription and cDNA amplification/fluorescence detection as suggested by the manufacturers.
Diagn.
Amplification conditions consist of, for example, a first reverse-transcription step at 48 °C for 10 minutes, followed by 10 minutes at 95 °C and 40 cycles of 15 seconds at 95 °C and 45 seconds at 60 °C.
Kuigi kõik kättesaadavad RT-PCR meetodid hobuste Aafrika katku genoomi avastamiseks on piisavalt tundlikud, kasutavad laborid kõige rohkem Agüero et al.
Samples are considered positives, if the normalised fluorescence for the AHSV RT-PCR assay exceeds a 0,1 threshold within 36 PCR cycles in all replicates of a sample.
(2008) [4] poolt kirjeldatud menetlust.
Samples are considered inconclusive, if the normalised fluorescence for the AHSV RT-PCR assay exceeds a 0,1 threshold between 36 and 40 PCR cycles in any replicate of a sample.
Seepärast tuleks direktiivi 2009/156/EÜ IV lisa muuta, jättes sellest välja konkurentsivõimelise ELISA testi ja ajakohastades kaudse ja blokeeriva ELISA testi menetlusi kooskõlas OIE maismaaloomade diagnostiliste testide ja vaktsiinide käsiraamatu (2016. aasta väljaanne, mis põhineb OIE delegaatide ülemaailmsel assambleel 2012. aasta maikuus vastuvõetud versioonil) peatükiga 2.5.1 [7].
Samples are considered negative, if the normalised fluorescence for the AHSV RT-PCR assay did not exceed a 0,1 threshold within 40 PCR cycles in all replicates of a sample and if the normalised fluorescence for the proprietary synthetic external control assay exceeded a 0,1 threshold within 33 PCR cycles.’
Samal ajal tuleks kõnealusesse lisasse lisada Agüero et al.
CRC Press, Boca Raton, Florida, USA, 646-650.
(2008) ning ka Guthrie et al.
Methods, 125 (1), 55-65.
(2013) poolt kirjeldatud reaalaja RT-PCR menetlused, et teha need haigusetekitaja tuvastamise testid loomade liikumiseelse testimise eesmärgil kättesaadavaks.
2013;189(1):30-5.
Allpool on esitatud mõned Guthrie et al.
In addition, most of the national reference laboratories of the European Union Member States use real-time RT-PCR methods, including for the diagnosis of African horse sickness, which have proven to be fit for purpose in the annual Proficiency Test exercises performed from 2009 to 2014.
komisjoni liige
The method described by Guthrie et al.
Testikomplekt hõlmab ka ühte omandiõigusega kaitstud sünteetilist välist kontrolli, mis võimaldab kontrollida komplekti koostisosade nõuetekohast toimimist.Üheetapilise reaalajas jälgitava RT-PCRi komplektid on turul kättesaadavad.
Agüero M., Gomez-Tejedor C., Angeles Cubillo M., Rubio C., Romero E. and Jimenez-Clavero A. (2008).
sond MGB-TaqMan: 5′-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3′
Diagnostic accuracy of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay for detection of African horse sickness virus.
Vastavalt tootja juhistele valmistatakse uuritavate proovide arvu jaoks piisav kogus üheetapilise reaalajas jälgitava RT-PCRi põhisegu, millesse on lisatud 1 μl praimerite ja sondi segu 25 korda kontsentreeritumat lähtelahust (kirjeldatud eespool punktis 2.2.1), nii et igas kannus on kummagi praimeri lõppkontsentratsioon 200 nM ja sondi lõppkontsentratsioon 120 nM.
Add 100 μl/well chromogen/substrate solution, i.e. 1 ml of ABTS (2,2′-Azino-bis-[3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid]) 5 mg/ml + 9 ml of substrate buffer (0,1 M Phosphate-Citrate buffer of pH 4 containing 0,03 % H2O2), and incubate for 10 minutes at room temperature.
Väljaandes „Bluetongue, African Horse Sickness and Related Orbiviruses: Proceedings of the Second International Symposium“.