natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Treatment of all inocula with antiserum to Infectious pancreatic necrosis virus (a virus which in some parts of the Europe occurs in 50 % of fish samples) aims at preventing cytopatic effect (CPE) due to IPN virus from developing in inoculated cell cultures.
Rakukultuuri analüüsitakse tsütopaatilise efekti esinemise suhtes mikroskoobi abil kaks korda: ajavahemikul 5–7 ja 12–14 päeva pärast nakatamist.
To reduce the duration of the virological examinations as well as the number of cases in which occurrence of CPE would have to be considered potentially indicative of ISAV, such treatment may be carried out.
Kui ükskõik millise koondproovi puhul täheldatakse tsütopaatilist efekti, alustatakse viivitamata punkti II.2.4 kohast viiruse tuvastamist.
When samples come from production units which are considered free from IPN, the treatment of inocula with antiserum to IPN virus may be omitted.
Kui tsütopaatilist efekti ei ole 14 päeva jooksul ilmnenud, viiakse läbi kaudne immunofluorestsentsanalüüs, hemadsorptsioonanalüüs või RT-PCR.
Inoculation on cell cultures
Subkultuuri loomine toimub 13.–15. päeval.
Atlantic salmon kidney (ASK) cells shall be used for primary ISAV isolation.
Rakukultuuri supernatant lisatakse mitmekannulisel plaadil aktiivselt kasvavat värsket rakukultuuri sisaldavasse kannu, et saada sobiv lahjendus (1:10), ning plaati inkubeeritakse kuni 18 päeva temperatuuril 14 ± 2 °C.
Other cell lines of proven efficacy and sensitivity in isolating ISAV may be used, taking into consideration strain variability and the ability of different strains to replicate in different cell lines.
Rakukultuuri analüüsitakse tsütopaatilise efekti esinemise suhtes mikroskoobi abil kaks korda: ajavahemikul 5–7 ja 14–18 päeva pärast nakatamist.
The ASK cells seem to support isolation and growth of the hitherto known virus isolates, as long as a low passage level is used.
Kui tsütopaatilist efekti ei ole 14–18 päeva jooksul ilmnenud, viiakse läbi hemadsorptsioonanalüüs või RT-PCR.
A more distinct cytopathic effect (CPE) may appear in ASK cells than in other susceptible cell lines like SHK-1 (Salmon head kidney-1).
Kui tsütotoksilisus ilmneb inkubeerimise esimese seitsme päeva jooksul, luuakse subkultuur juba sel ajal ning rakke inkubeeritakse 14–18 päeva ja pärast seda luuakse uus subkultuur, mida inkubeeritakse veel 14–18 päeva.
ASK (pass 65 or lower) cells shall be grown in L-15 medium containing 10 % foetal bovine serum, 2 % (vol:vol) 200 mM L-glutamine, and 0,08 % (vol:vol) 50 mM 2-mercaptoethanol in multi-well plates.
Kui tsütotoksilisus ilmneb pärast seitsme päeva möödumist, luuakse subkultuur ühel korral ja rakke inkubeeritakse esimesest nakatamisest alates kokku 28–36 päeva.
Antiserum-treated organ suspension shall be inoculated into young actively growing cell cultures to give a final dilution of tissue material to culture medium of 1:1000.
Kui primaarkultuur saastub bakteritega, alustatakse katset – 80 °C juures säilitatava koehomogenaadiga uuesti.
For each organ, suspension 40 μl of inoculum shall be added to one well containing 2 ml of culture medium.
Enne nakatamist tsentrifuugitakse koehomogenaati 15–30 minutit 4000 g juures temperatuuril 0–6 °C ja supernatant filtritakse läbi 0,22 μm suuruste pooridega filtri.
To minimise the risk of cross-contamination, separate 12- or 24-well plates shall be used for samples from different fish farm sites.
Kui bakteriaalne saastus ilmneb subkultuuri kasvatamise ajal, filtritakse supernatant läbi 0,22 μm suuruste pooridega filtri ja sellega nakatatakse värsket rakukultuuri, mida inkubeeritakse veel 14–18 päeva.
One plate shall be left uninoculated to serve as a negative control.
Viiruse tuvastamise meetodid
A separate plate shall be inoculated with a reference isolate of ISAV as a positive control, as follows.
Kui mis tahes etapis täheldatakse tsütopaatilist efekti või hemadsorptsioonanalüüsi tulemus on positiivne, viiakse läbi viiruse tuvastamine.
One hundred μl of a stock preparation of ISAV (minimum titre 107 Tissue culture infective dose at the 50 % end point (TCID50 ml– 1)) shall be inoculated into the first well and mixed.
ISA viiruse tuvastamiseks sobivad meetodid on punkti II.1 kohane RT-PCR ja punkti II.2.6 kohane immunofluorestsentsanalüüs.
A volume of this material shall be transferred from the first well to the second well to make a 1:10 dilution and mixed.
Kui kahtlustatakse muude viiruste esinemist, viiakse läbi täiendavad viiruse tuvastamise katsed.
This shall be repeated across the plate to make six 10-fold dilutions.
Kui kõnealuste meetoditega ei ole ühe nädala jooksul suudetud viirust kindlalt tuvastada, saadetakse supernatant viiruse koheseks tuvastamiseks:
Stock ISAV may be stored at – 80 °C for at least 2 years but once thawed must be used within 3 days.
Maailma Loomatervise Organisatsiooni ISA referentlaborisse või
Care shall be taken to prevent cross-contamination of test plates with positive control material.
kalahaigustega tegelevasse direktiivi 2006/88/EÜ VI lisas osutatud riiklikku referentlaborisse või ELi referentlaborisse.
To avoid that risk, positive controls shall be set up and handled separately from test plates.
Hemadsorptsioonanalüüs
A sensitivity test every 6 months of ASK cells towards ISAV isolates may replace the use of including a positive control at each inoculation.
Kuna ISA viiruse paljunemisega rakukultuuris ei kaasne alati tsütopaatilist efekti, viiakse iga kannu puhul läbi RT-PCR, käesoleva punkti kohane hemadsorptsioonanalüüs või punkti II.2.6 kohane immunofluorestsentsanalüüs.
Samples shall be incubated at 15 ± 2 °C for up to 15 days.
Kõikidest kannudest, sealhulgas positiivse ja negatiivse kontrolliga kannust eemaldatakse rakukultuurisööde ja viiakse märgistatud steriilsesse katsutisse.
Using a microscope, cell cultures shall be examined for CPE twice, between 5 to 7 and 12 to 14 days following inoculation.
Igasse kannu lisatakse 500 μl 0,2 mahuprotsendilist küüliku või hobuse pestud erütrotsüütide suspensiooni või 0,05 mahuprotsendilist vikerforelli või atlandi lõhe pestud erütrotsüütide suspensiooni ja plaati inkubeeritakse 45 minutit toatemperatuuril.
If any pool shows CPE, virus identification procedures shall be initiated immediately in accordance with point II.2.4.
Erütrotsüüdid eemaldatakse ja iga kannu pestakse kaks korda söötmega L-15.
If no CPE is observed by day 14, an Indirect fluorescent antibody test (IFAT), haemadsorption or RT-PCR shall be performed.
Iga kannu analüüsitakse mikroskoobi all.
Subcultivation shall be carried out between days 13 to 15.
ASK rakkude pinnale kinnitunud erütrotsüütide kogumite olemasolu annab märku eeldatavast ortomüksoviirusega nakatumisest.
Culture supernatant shall be added to wells containing fresh actively growing cells in appropriate dilution (1/10) in multi-well plates and incubated at 14 ± 2 °C for up to 18 days.
Kui hemadsorptsioonanalüüsi tulemus on positiivne, alustatakse viivitamata punkti II.2.4 kohast viiruse tuvastamist.
Using a microscope, cell cultures shall be examined for CPE twice, between days five to seven and days 14 to 18 following inoculation.
Immunofluorestsentsanalüüs
If no CPE is observed by days 14 to 18, a haemadsorption or an RT-PCR test shall be performed.
ASK rakke (passaažide arv kuni 65) kasvatatakse mitmekannulisel plaadil söötmes L-15, mis sisaldab 10 % veiselooteseerumit, 2 mahuprotsenti 200 mM L-glutamiini ja 0,08 mahuprotsenti 50 mM 2-merkaptoetanooli, ning nende kasutamisel peab rakukiht olema enam kui 50 % ulatuses konfluentne.
If cytotoxicity occurs within the first 7 days of incubation, subcultivation shall be performed at that stage, and the cells shall be incubated for 14 to 18 days and sub cultivated again with a further period of 14 to 18 days incubation.
Võib kasutada ka mõnda muud tõendatud tõhususega rakuliini või söödet.
If cytotoxicity occurs after 7 days, subcultivation shall be performed once and the cells shall be incubated to achieve the total period of 28 to 36 days incubation from the primary inoculation.
Kahte kannu lisatakse kummassegi 225 μl eeldatavalt viirusega nakatunud kultuuri supernatanti, segatakse söötmega ja saadud segust viiakse 225 μl järgmisse kahte kannu, et saada 1:5 lahjendus.
If bacterial contamination occurs in the primary culture, the test shall be set up again using the tissue homogenate stored at – 80 °C.
Kaks järgmist kannu jäetakse nakatamata ja neid kasutatakse kontrollina.
Prior to inoculation, the tissue homogenate shall be centrifuged at 4000 × g for 15 to 30 minutes at 0 to 6 °C and the supernatant shall be filtered at 0,22 μm.
Kalakasvanduse eri kohtadest pärit proove ja viirusega kontrolli käsitsetakse eri plaatidel.
If bacterial contamination occurs during the subcultivation step the supernatant shall be filtered at 0,22 μm, inoculated onto fresh cells and incubated for a further 14 to 18 days.
Viirusega kontrollis kasutatakse ISA viiruse võrdlusisolaati.
Virus identification tests
Plaate inkubeeritakse temperatuuril 14 ± 2 °C ja analüüsitakse mikroskoobi all kuni 7 päeva jooksul.
If evidence of CPE is observed at any stage, or if a haemadsorption test is positive, virus identification shall be carried out.
Kui täheldatakse varajast tsütopaatilist efekti või kui tsütopaatilist efekti ei täheldata seitsme päeva jooksul, järgneb rakkude fikseerimine.
The methods of choice for the identification of ISAV shall be RT-PCR in accordance with point II.1 and Immunofluorescence (IF) in accordance with point II.2.6.
Kanne pestakse fosfaadiga puhverdatud soolalahusega (PBS) ja rakkude fikseerimiseks inkubeeritakse neid 80 % atsetoonis 20 minutit toatemperatuuril.
If it is considered that other viruses may be present, supplementary virus identification tests shall be carried out.
Plaadil lastakse õhu käes kuivada ja rakud värvitakse kohe või pärast kuni 24 tunni pikkust seismist 0–6 °C juures.
If those tests have not resulted in a definitive identification of the virus within 1 week, the supernatant shall be forwarded for immediate identification to:
Paralleelkannude rakkude värvimiseks lisatakse ISA viiruse vastaste monoklonaalsete antikehade 3H6F8 ja 1OC9F5 segu või mõni muu tõendatud tõhususe ja spetsiifilisusega monoklonaalne antikeha, mis on lahjendatud PBSis, ning plaati inkubeeritakse 30 minutit temperatuuril 37 ± 4 °C.
the World Organisation for Animal Health (OIE) reference laboratory for ISA, or;
Monoklonaalne antikeha eemaldatakse ja plaati pestakse kolm korda PBSiga, mis sisaldab 0,05 % Tween 20.
a national reference laboratory or the EU reference laboratory for fish diseases as referred to in Annex VI to Directive 2006/88/EC.
Igasse kannu lisatakse hiire IgG vastane PBSis lahjendatud fluorestseiinisotiotsüanaadiga (FITC) konjugeeritud antikeha ja plaati inkubeeritakse 30 minutit temperatuuril 37 ± 4 °C.
Haemadsorption
Monoklonaalse antikeha ja FITCga konjugeeritud antikeha eri partiide optimaalne lahjendus määratakse igas laboris eraldi kindlaks.
As replication of ISAV in cell cultures does not always result in a CPE, every well shall be subject to an RT-PCR test or a haemadsorption test in accordance with this point, or an IF test in accordance with point II.2.6.
Antikeha eemaldatakse ja plaati pestakse kolm korda PBSiga, mis sisaldab 0,05 % Tween 20.
Cell culture medium shall be removed from each well, including those of positive and negative controls, and placed in labelled sterile tubes.
Kanne kontrollitakse viivitamata fluorestsentsanalüüsi võimaldava invertmikroskoobi all, mis on varustatud FITCi ergastamiseks sobiva filtriga.
500 μl of a 0,2 % (vol:vol) suspension of washed rabbit or horse red blood cells, or a 0,05 % (vol:vol) suspension of washed rainbow trout or Atlantic salmon red blood cells, shall be added to each well and incubated at room temperature for 45 minutes.
Fluorestseeruvate rakkude esinemise korral loetakse analüüsi tulemus positiivseks.
The red blood cells shall be removed and each well shall be washed twice with L-15 medium.
Analüüsi tulemus on kehtiv, kui positiivsed kontrollid on positiivsed ja negatiivsed kontrollid on negatiivsed.
Each well shall be examined using a microscope.
Muude kudede analüüs
The presence of clusters of red blood cells attaching to the surface of ASK cells shall be indicative of presumptive infection with an orthomyxovirus.
Punktis II.2.6 osutatud meetodit võib kohaldada muude kalakudede, näiteks maksa, põrna ja südame puhul, kui katteklaasile on võimalik kanda piisav kogus endoteelirakke, leukotsüüte või lümfotsüüte.
If a haemadsorption test is positive, a virus identification test shall be performed immediately in accordance with point II.2.4.
Värvimismeetod on kõikide kudede puhul sama, ehkki mõne koe puhul võib olla soovitatav propiidiumjodiidiga värvimine ära jätta ja kasutada koejäljendis esindatud rakutüüpide kindlaksmääramiseks faasikontrasti meetodit.
Immunofluorescence (IF)
Histoloogiline analüüs
ASK (pass 65 or lower) shall be grown in a L-15 medium containing 10 % foetal bovine serum, 2 % (vol:vol) 200 mM L-glutamine, and 0,08 % (vol:vol) 50 mM 2-mercaptoethanol in multi-well plates and used at greater than 50 % confluence.
Koematerjalist lõigatakse 5 μm paksused parafiinlõigud ning värvitakse need hematoksüliini ja eosiiniga.
Other cell lines or growth medium of proven efficacy may also be used.
Kliiniliste haigustunnustega atlandi lõhel täheldatavad histoloogilised muutused varieeruvad, kuid võivad hõlmata järgmist:
225 μl of putative virus-infected culture supernatant shall be added to each of two wells, mixed and 225 μl transferred to two further wells, namely a 1:5 dilution.
suur arv erütrotsüüte venoosses kesksiinuses ja lõpuseliistakute kapillaarides, kus võivad tekkida ka erütrotsüütide trombid;
Two additional wells shall be left uninoculated to act as controls.
maksas esinevad suurematest veresoontest eemale jäävad multifokaalsed või kokkuvalgunud täppverevalumid ja/või hepatotsüütide nekroos; erütrotsüütide multifokaalne kogum laienenud maksasinusoidides;
Samples from each fish farm site shall be handled on separate plates, as shall the virus control.
erütrotsüütide kogunemine soole limaskesta päriskihi veresoontes ja sellele järgnev limaskesta päriskihi hemorraagia;
A virus control shall be established using a reference isolate of ISAV.
põrna strooma laienemine erütrotsüütide kogunemise tõttu;
Plates shall be incubated at 14 ± 2 °C and examined microscopically for up to 7 days.
kerge multifokaalne kuni ulatuslik difuusne interstitsiaalne verejooks koos tubulaarse nekroosiga hemorraagilises piirkonnas, erütrotsüütide kogunemine neerupäsmakestes;
When early CPE is observed, or if no CPE is observed within 7 days, the next step shall be fixation.
erütrotsüütide fagotsüteerimine põrnas ning sekundaarne verejooks maksas ja neerus.
Wells shall be washed with Phosphate buffered saline (PBS) and fixed by incubation with 80 % acetone for 20 minutes at room temperature.
Immunohistokeemiline analüüs
Plates shall be air-dried and stained immediately or stored at 0 to 6 °C for no more than 24 hours prior to staining.
Formaliinis fikseeritud koe parafiinlõike analüüsitakse ISA viiruse nukleoproteiini vastase polüklonaalse antikeha abil.
Replicate wells shall be stained with a mix of monoclonal antibodies (MAb) 3H6F8 and 1OC9F5 against ISAV, or other MAb of proven efficacy and specificity, diluted in PBS and incubated at 37 ± 4 °C for 30 minutes.
Uuritavad elundid on neeru keskosa ja süda (kõiki kolme kambrit ja kõiki klappe hõlmav piirkond).
MAb shall be removed and plates washed three times with 0,05 % Tween 20 in PBS.
Haigustunnustel põhineva taudikahtluse korral tehakse immunohistokeemiline analüüs, mille positiivne tulemus kinnitab taudi esinemist.
Anti-mouse IgG Fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugate diluted in PBS shall be added to each well and incubated at 37 ± 4 °C for 30 minutes.
Histoloogilised koelõigud valmistatakse standardmeetodil.
The dilutions of different batches of MAb and FITC conjugate shall be optimised in each laboratory.
Koelõikude valmistamine
Antibody shall be removed and plates shall be washed three times with 0,05 % Tween 20 in PBS.
Koe fikseerimiseks standardmeetodil hoitakse seda vähemalt üks päev neutraalses fosfaadiga puhverdatud 10 % formaliinilahuses, veetustatakse reas eri kontsentratsiooniga etanoolilahustes, pestakse ksüleenis ja sulundatakse parafiini.
Wells shall be examined immediately using an inverted microscope set up for fluorescence microscopy with a suitable filter for excitation of FITC.
Koelõike paksusega umbes 5 μm (paigutatud immunohistokeemiliseks analüüsiks polü-L-lüsiiniga kaetud alusklaasile) kuumutatakse 20 minutit 56–58 °C (maksimaalselt 60 °C) juures, lõigud deparafiinitakse ksüleenis, rehüdreeritakse reas eri kontsentratsiooniga etanoolilahustes ning värvitakse patomorfoloogilise ja immunohistokeemilise analüüsi tegemiseks hematoksüliini ja eosiiniga vastavalt jaotisele 2.
A test shall be considered positive if fluorescent cells are observed.
Värvimine immunohistokeemiliseks analüüsiks
For a test to be valid, the positive controls shall score positive and the negative controls shall score negative.
Kui käesolevas rakendusotsuses ei ole ette nähtud teisiti, tehakse kõik inkubeerimised toatemperatuuril plaatloksutil:
Examination of other tissues
antigeeni kättesaadavaks tegemiseks keedetakse lõike 2 × 6 minutit 0,1 M tsitraatpuhvris, mille pH on 6,0, ning inkubeeritakse blokeerimiseks 20 minutit 50 mM TBSis (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,6), mis sisaldab 5 % rasvata piimapulbrit ja 2 % kitseseerumit;
The technique referred to in point II.2.6 may be applied to other fish tissues such as liver, spleen and heart providing a reasonable quantity of endothelial cells, leucocytes or lymphocytes can be deposited on the slide.
seejärel inkubeeritakse lõike öö läbi primaarse antikehaga (ISA viiruse nukleoproteiini vastane monospetsiifiline küüliku antikeha), mis on lahjendatud 1 % rasvata piimapulbrit sisaldavas TBSis, ning lõike pestakse kolm korda TBSis, mis sisaldab 0,1 % Tween 20;
The staining procedure shall remain the same for each tissue, although for some tissues it may be preferable to omit the propidium iodide staining and rely on the phase illumination to identify the cell types present in the imprint.
seondunud antikeha tuvastamiseks inkubeeritakse lõike 60 minutit küüliku IgG vastase antikehaga, mis on konjugeeritud aluselise fosfataasiga.
Histology
Pärast viimast pesu lisatakse 0,1 M TBSis (pH 8,2) lahjendatud Fast Red (1 mg/ml), naftool-AS-MX-fosfaat (0,2 mg/ml) ja levamisool (1 mM) ning lõike inkubeeritakse 20 minutit.
Paraffin-embedded sections shall be cut at 5 μm and stained using haematoxylin and eosin.
Seejärel pestakse lõike kraaniveega, tehakse kontrastvärvimine Harrise hematoksüliiniga ja lõigud kaetakse veepõhise kattevedelikuga.
Histological changes in clinically diseased Atlantic salmon are variable, but may include the following:
Iga analüüsi puhul kasutatakse ka ISA viiruse suhtes positiivseid ja ISA viiruse suhtes negatiivseid koelõike.
numerous erythrocytes in the central venous sinus and lamellar capillaries of the gills, where erythrocyte thrombi also may be formed;
Immunohistokeemilise analüüsi tulemuste tõlgendamine
multifocal to confluent petechiae or hepatocyte necrosis or both at some distance from larger vessels in the liver; multifocal accumulation of erythrocytes in dilated hepatic sinusoids;
Immunohistokeemilise analüüsi tulemusi tõlgendatakse alapunktides a ja b sätestatud viisil:
accumulation of erythrocytes in blood vessels of the intestinal lamina propria and eventually haemorrhage into the lamina propria;
kontroll-lõik loetakse positiivseks, kui selles on endokardi veresoonte endoteelirakkude tsütoplasma ja tuum selgesti nähtavalt punaseks (punakaks) värvunud.
spleen stroma distended by erythrocyte accumulation;
Uuritav koeproov loetakse positiivseks üksnes juhul, kui selline tuumasisene värvumine on endoteelirakkudes selgesti nähtav;
slight multifocal to extensive diffuse interstitial haemorrhage with tubular necrosis in the haemorrhagic areas, erythrocyte accumulation in the glomeruli in the kidney;
kontroll-lõik loetakse negatiivseks, kui see ei ole märkimisväärselt värvunud.
erythrophagocytosis in the spleen and secondary haemorrhages in liver and kidney.
Kuna kõnealusele ortomüksoviirusele on replikatsioonietapis iseloomulik viiruse nukleoproteiini paiknemine tuumas, ent sageli on domineeriv tsütoplasma samaaegne värvumine, loetakse tsütoplasma ja muude rakuosade värvumist ilma tuumasisese värvumiseta mittespetsiifiliseks või ebaveenvaks.
Immunohistochemistry (IHC)
Kõige tugevamat positiivset värvusreaktsiooni täheldatakse tavaliselt südame ja neeru endoteelirakkudes.
Polyclonal antibody against ISAV nucleoprotein shall be used on paraffin sections from formalin-fixed tissue.
Väga ulatuslike hemorraagiliste kahjustuste puhul võib endoteel nõrgalt või üldse mitte värvuda, ilmselt seetõttu, et nakatunud endoteelirakud on lüüsunud.
The organs to be examined shall be mid-kidney and heart (transitional area including all three chambers and valves).
4.
Suspected cases due to pathological signs shall be verified with a positive IHC.
OSA
Histological sections shall be prepared in accordance with standard methods.
MARTEILIA REFRINGENS'I NAKKUSE SEIREKS JA NAKKUSE ESINEMISE KINNITAMISEKS KASUTATAVAD ÜKSIKASJALIKUD DIAGNOSTIKAMEETODID JA NENDE KOHALDAMISE KORD I. Marteilia refringens'i nakkuse üksikasjalikud diagnostikameetodid ja nende kohaldamise kord
Preparation of tissue sections
Proovivõtmine
The tissues shall be fixed in neutral phosphate-buffered 10 % formalin for at least 1 day, dehydrated in a graded ethanol series, cleared in xylene and embedded in paraffin, according to standard protocols.
Nakatunud loomade leidmise tõenäosuse suurendamiseks valitakse proovivõtmiseks eelkõige avatud kojapoolmetega või äsja surnud üksikud molluskid.
Approximately 5 μm thick sections (for IHC placed on poly-L-lysine-coated slides) shall be heated at 56 °C to 58 °C (maximum 60 °C) for 20 minutes, dewaxed in xylene, rehydrated through a graded ethanol series, and stained with haematoxylin and eosin for pathomorphology and IHC in accordance with point (2).
Valitud austreid või rannakarpe hoitakse nende andmeid ja päritoluteavet sisaldava märgisega kilekotis jahutatult 4 °C juures või jääl kuni 24 tundi, kui valim hõlmab avatud kojapoolmetega molluskeid, või muul juhul kuni 72 tundi.
Staining procedure for IHC
Avatud kojapoolmetega ja äsja surnud molluskeid hoitakse teistest molluskitest eraldi.
All incubations shall be carried out at room temperature on a rocking platform, unless otherwise provided for in this decision:
Marteilia refringens'i nakkuse diagnoosimisel kasutatakse histoloogiliseks analüüsiks muu hulgas lõpustest ja südamest saadud 3–5 mm paksust koelõiku.
antigen retrieval shall be done by boiling sections in 0,1 M citrate buffer pH 6,0 for 2 × 6 minutes followed by blocking with 5 % non-fat dry milk and 2 % goat serum in 50 mM TBS (TBS; Tris/HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,6) for 20 minutes;
Mõne uuringu, sealhulgas koejäljendite analüüsi ja polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) jaoks kasutatakse seedenäärme tükki.
sections shall then be incubated overnight with primary antibody (monospecific rabbit antibody against ISAV nucleoprotein) diluted in TBS with 1 % non-fat dry milk, followed by three washes in TBS with 0,1 % Tween 20;
Mikroskoopiameetodid
ISAV positive and ISAV negative tissue sections shall be included as controls in every setup.
Pärast alusklaasi kraaniveega loputamist ja kuivatamist paigutatakse sellele sobiva sünteetilise vaigu abil katteklaas.
Interpretation of the result of IHC
Alusklaasi vaadeldakse esmalt 200-kordsel suurendusel ja seejärel õliimmersiooniga 1000-kordsel suurendusel.
The interpretation of the result of the IHC test shall be as set out in points (a) and (b):
Tulemus on positiivne, kui leitakse rakke suurusega kuni 30–40 μm.
control sections shall be considered as positive, when it is observed that the control sections have clearly visible red-coloured (reddish) cytoplasmic and intranuclear staining of endothelia cells in blood vessels of endocardium.
Nende tsütoplasma värvub basofiilselt, tuum aga eosinofiilselt.