natgillin/translations-raw huggingface dataset:
95 °C 2 minutes
Kalalt eemaldatakse steriilse instrumendiga neeru keskosa tükk ja pannakse mikrokatsutisse, mis sisaldab 1 ml tõendatud tõhususega RNA säilituslahust.
40 cycles:
Ühte transpordilahusega katsutisse võib koguda kuni viielt kalalt võetud koed, mis moodustavad ühe koondproovi.
95 °C for 30 seconds
Koematerjali kaal ühes proovis peab olema 0,5 g.
55 °C for 30 seconds
Kui kalad on vajaliku kaaluga proovi saamiseks liiga väikesed, võib proovi kaalu viimiseks 0,5 grammini eemaldada kalalt neeru, südame, põrna, maksa või umbsoole tükid nimetatud eelistusjärjekorras.
72 °C for 45 seconds
Histoloogiliseks analüüsiks kasutatav kude võetakse üksnes äsja surmatud tavapärase välimusega kaladelt, kellel täheldatakse ISA esinemisele viitavaid kliinilisi sümptomeid või surmajärgseid ilminguid.
72 °C for 10 minutes
Proov võetakse kõikidest välistest ja sisemistest kahjustatud kudedest ning igalt kalalt võetakse skalpelli abil eraldi proov neeru keskosast, südamest, maksast, kõhunäärmest, soolestikust, lõpustest ja põrnast ning pannakse 8–10 mahuprotsenti formaldehüüdi sisaldavasse puhverdatud soolalahusesse.
CyHVpol-reverse
Kudede rahuldava säilimise tagamiseks peab fikseerimislahuse ja koematerjali suhe olema vähemalt 20:1.
CyHVpol-internal forward
Immunohistokeemiliseks analüüsiks võetakse proov neeru keskosast ja südamest.
Second round PCR
Kõikidelt proovivõtmiseks valitud kaladelt võetakse koed viroloogiliseks analüüsiks rakukultuuris.
95 °C 2 minutes,
Kalalt eemaldatakse steriilse instrumendiga maksa, neeru esi- või keskosa, südame ja põrna tükid ning pannakse plastkatsutisse, mis sisaldab 9 ml transpordisöödet.
CyHVpol-internal reverse
Ühte transpordilahusega katsutisse võib koguda kuni viielt kalalt võetud koed, mis moodustavad ühe koondproovi.
PCR versions of proven similar efficacy may be used instead.
Koematerjali kaal ühes proovis peab olema 1,0 ± 0,5 g.
Sequencing may be performed by the laboratory or at external specialised sequencing companies.
Kaladelt võetud proovide saatmine
Sequencing results shall be analysed by aligning the sequences to the known reference sequences of KHV (Gen Bank accession numbers AP008984, DQ657948 and DQ177346).
Laborisse võib saata terveid kalu, kui transpordi ajal on võimalik järgida käesoleva punkti kolmandas lõigus kirjeldatud temperatuurinõudeid.
The obtained clean consensus sequence must match at least to 98 % with those reference sequences.
Terved kalad mähitakse imavasse paberisse ning saadetakse teele plastkotis ja nimetatud lõigu kohaselt jahutatuna.
DETAILED DIAGNOSTIC METHODS AND PROCEDURES FOR THE SURVEILLANCE AND CONFIRMATION OF INFECTIOUS SALMON ANEMIA (ISA)
Võib saata ka elusaid kalu, kuid üksnes kalahaiguste riikliku referentlabori järelevalve all ja juhul, kui võetakse arvesse elusate kalade transportimisega seotud täiendavaid desinfitseerimise ja bioturvalisuse küsimusi.
I. Sampling procedures for the surveillance and control of ISA
Vereproovid ja viroloogiliseks analüüsiks või RT-PCRi abil analüüsimiseks ette nähtud kalakudesid sisaldavad katsutid pannakse soojusisolatsiooniga konteinerisse, näiteks paksuseinalisse polüstüreenkasti koos piisava koguse jää või piisava arvu jahutusplokkidega, et tagada laborisse transportimise ajal proovi püsimine jahutatuna.
When sampling and laboratory examination are carried out, for the purpose of the surveillance or eradication programmes set out in Part 3 of Annex I or to confirm or rule out the presence of ISA in accordance with Article 57(b) of Directive 2006/88/EC, the detailed methods and procedures set out in points I.1, I.2 and I.3 of this Section shall apply.
Tuleb vältida proovi külmumist ning saadetise vastuvõtmise ajal peab transpordikastis veel jääd olema või peab vähemalt üks jahutusplokk olema vähemalt osaliselt külmunud.
For the purpose of laboratory examination for the presence of ISA, fish samples shall not be pooled where possible.
Erandjuhul võib RT-PCRi jaoks või viroloogiliseks analüüsiks ette nähtud proovi kiirkülmutada ja transportida selle laborisse – 20 °C juures või madalamal temperatuuril.
However, for the purpose of surveillance for ISA, the pooling of 2 to be 5 fish is accepted.
Lahuses RNAlater säilitatavate kudede analüüsimisel RT-PCRi abil toimub RNA eraldamine proovide säilitustemperatuurist olenevalt järgmise ajavahemiku jooksul:
Samples for Reverse Transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis shall be taken from all of the fish sampled.
20 °C juures säilitatavad proovid: mis tahes ajal.
A piece of mid-kidney shall be removed from the fish using a sterile instrument and transferred to a microfuge tube containing one ml RNA preservative solution of proven efficacy.
Kui kalakudesid transporditakse histoloogilise analüüsi jaoks fikseerimislahuses, kasutatakse nende saatmiseks lekkekindlat katsutit, mis paigutatakse löögikindlasse konteinerisse.
Tissue from up to five fish may be collected in one tube of transport solution and shall represent one pooled sample.
Tuleb ära hoida selliste proovide külmumist.
The weight of tissue in one sample shall be 0,5 g.
Asjaomase diagnostikalabori heakskiidul võib täiendavateks uuringuteks koguda ja ette valmistada ka punktis I.1 nimetamata kalakudesid.
When the fish are too small to obtain a sample of the required weight, pieces of kidney, heart, spleen, liver or pyloric caeca may be taken, in that order of preference, to make up 0,5 g.
ISA kahtluse kinnitamiseks või ümberlükkamiseks ja ISA seireks kasutatavad üksikasjalikud diagnostikameetodid ja nende kohaldamise kord
Tissue for histological examination shall only be taken from freshly killed fish with a normal constitution, exhibiting clinical signs or post-mortem findings consistent with the presence of ISA.
Laborianalüüsi tegemisel vastavalt I lisa 3. osa II jaos sätestatud diagnostikameetoditele järgitakse nimetatud lisa 1. osa I jao kohaseks ISA suhtes teatud kindla staatuse saamiseks või säilitamiseks ja direktiivi 2006/88/EÜ artikli 57 punkti b kohaseks ISA kahtluse kinnitamiseks või ümberlükkamiseks järgmisi allpool punktides II.1–II.5 sätestatud üksikasjalikke diagnostikameetodeid ja nende kohaldamise korda.
Any external or internal lesions shall be sampled and in any case samples of mid-kidney, heart, liver, pancreas, gut, gills and spleen shall be removed from individual fish using a scalpel and transferred to 8 % to 10 % (vol:vol) buffered formol saline.
Proovide analüüsimine RT-PCRi abil
The ratio of fixative to tissue shall be at least 20:1 to ensure satisfactory preservation of the tissues.
ISA viiruse tuvastamiseks kasutatav diagnostikameetod on RT-qPCR.
For immunohistochemistry (IHC), samples from mid-kidney and heart shall be taken.
Kuna RT-qPCRi tulemused võivad kasutatud reaktsioonitingimustest sõltuvalt varieeruda, kasutatakse mis tahes kahtluste ärahoidmiseks sobivaid positiivseid ja negatiivseid kontrolle ja amplikone.
Tissues for virological examination on cell culture shall be taken from all of the fish sampled.
Kogu RNA eraldamine
Pieces of the liver, anterior or mid-kidney, heart and spleen shall be removed from the fish using a sterile instrument and transferred to plastic tubes containing 9 ml transport medium.
Kogu RNA eraldamiseks kasutatakse fenooli ja kloroformiga ekstraheerimise meetodit või tsentrifuugitavat RNA afiinsuskolonni vastavalt tootja juhistele.
Tissues from up to five fish may be collected in one tube containing transport solution and represent one pooled sample.
Eraldatud RNA lahustatakse ribonukleaasivabas destilleeritud vees (täpsemalt 0,1 % dietüülpürokarbonaadiga töödeldud vees).
The weight of tissue in one sample shall be 1,0 ± 0,5 g.
Eraldatud RNA kontsentratsiooni ja puhtuse hindamiseks kasutatakse optilise tiheduse mõõtmist lainepikkustel 260 ja 280 nm.
Shipment of samples from fish
Teise võimalusena võib kasutada viiruse genoomis leiduvale sihtjärjestusele vastavat sisemist kontrolli, nagu on märgitud punktis II.1.3.
Whole fish may be transported to the laboratory if the temperature requirements during transportation, as described in paragraph 3 of this point can be fulfilled.
ISA viiruse tuvastamiseks kasutatav RT-PCR
Whole fish shall be wrapped in absorbent paper and shipped in a plastic bag, chilled as described in that paragraph.
ISA viiruse genoomi amplifitseerimiseks võib kasutada mitut RT-PCRi meetodit.
Live fish may also be shipped, but only under the supervision of the National reference laboratory for fish diseases and taking into account the additional disinfection and biosecurity issues when transporting live fish.
Võib kasutada kaheetapilist RT-PCRi, mille puhul RT ja PCRi etapid viiakse läbi kahes eri katsutis.
Blood samples and tubes containing fish tissues for virological examination or RT-PCR analysis shall be placed in insulated containers, such as thick-walled polystyrene boxes, together with sufficient ice or freeze blocks to ensure chilling of the samples during transportation to the laboratory.
Võib järgida ka üheetapilist meetodit, mille puhul kõnealused kaks reaktsiooni viiakse läbi samas katsutis.
Freezing shall be avoided and ice must still be present in the transport box at receipt of the shipment or one or more of the ‘freeze blocks’ must still be partly or completely frozen.
Võimaluse korral kasutatakse üheetapilist meetodit, sest katse läbiviimisega ühes katsutis vähendatakse ristsaastumise ohtu, kuna katsuti sisu ei pea teise katsutisse üle viima, ning selle meetodi tundlikkust peetakse võrdseks kaheetapilise meetodi tundlikkusega.
In exceptional circumstances, RT-PCR samples and samples for virological examination may be snap-frozen and transported to the laboratory at – 20 °C or below.
Kasutatakse käesolevas punktis kirjeldatud meetodit ning praimeritest ILA1 ja ILA2 koosnevat praimeripaari, mille sihtjärjestus asub 8. segmendis ja mis on leitud olevat sobiv ISA viiruse tuvastamiseks taudipuhangute ja viirusekandjate kalade puhul.
For RT-PCR analysis of tissues preserved in Ribonucleic acid(RNA)later, RNA extraction shall be carried out within the following time frames depending on the temperature the samples are stored at:
Äraspidine praimer ILA2 ei seondu Põhja-Ameerikas esinevate isolaatidega ning sellisel juhul kasutatakse mõnda muud praimeripaari.
samples stored at – 20 °C: indefinitely.
Päripidine praimer (ILA1): 5′-GGCTATCTACCATGAACGAATC-3′;
If fish tissues are transported in fixative for histological examination, they shall be shipped in leak proof tubes in impact-resistant containers.
äraspidine praimer (ILA2): 5′-GCCAAGTGTAAGTAGCACTCC-3′.
Freezing of those samples shall be avoided.
Tsükleerimistingimused: üks tsükkel: 30 minutit 50 °C juures; üks tsükkel: 15 minutit 94 °C juures; 40 tsüklit: 30 sekundit 94 °C juures, 30 sekundit 55 °C juures ja 60 sekundit 72 °C juures; üks tsükkel: 5 minutit 72 °C juures.
Subject to the approval of the diagnostic laboratory, fish tissues other than those referred to in point I.1 may be collected and prepared for supplementary examination.
Eespool kirjeldatu asemel võib siiski kasutada ka mõnda muud sarnase tõendatud tõhususega RT-PCRi meetodit.
Detailed diagnostic methods and procedures for the surveillance and for the confirmation of the presence of or to rule out the suspicion of ISA
ISA viiruse tuvastamiseks kasutatav RT-qPCR
When laboratory examination for the purpose of obtaining or maintaining a certain health status with regard to ISA as set out in Section I of Part 3 of Annex I, or for the purpose of the confirmation of the presence of or to rule out a suspicion of ISA in accordance with Article 57(b) of Directive 2006/88/EC, are carried out, using the diagnostic methods set out in Section II of Part 3 of Annex I, the detailed methods and procedures set out in the following points II.1 to II.5 shall apply.
RT-qPCRi kasutamine võib suurendada spetsiifilisust ja suurendab tõenäoliselt ka tundlikkust.
Examination of samples by RT-PCR
See meetod võimaldab saada tulemused kiiremini, kuna elektroforeesietapp ei ole vajalik, samuti väheneb ristsaastumise oht, sest viiruse genoomse RNA kogust on võimalik hinnata proovi sisaldavas katsutis.
The diagnostic method to be used for the screening for ISAV shall be RT-qPCR.
RT-qPCRi meetodi ühe puudusena ei ole sageli võimalik amplifitseeritud fragmenti sekveneerida.
As the results of the RT-qPCR can vary depending on the conditions under which it is performed, adequate positive and negative controls and amplicons shall be included to avoid any doubts.
Kui tekib kahtlus fragmendi amplifitseerimise spetsiifilisuse suhtes, tuleb tulemuste kontrollimiseks viia läbi mõni muu ISA viiruse spetsiifilise tuvastamise katse.
Total RNA extraction
Kasutatakse käesolevas punktis kirjeldatud meetodit, mille puhul sihtjärjestus asub 8. segmendis.
Total RNA shall be extracted using the phenol-chloroform method or RNA affinity spin columns, according to the manufacturer's instructions.
Kõnealuse meetodiga tuvastatakse Euroopa Liidus, Euroopa Vabakaubanduse Assotsiatsiooni liikmesriikides ja Põhja-Ameerikas esinevaid isolaate.
Purified RNA shall be re-suspended in distilled RNase-free water (namely water treated with 0,1 % diethyl pyrocarbonate).
Võimaluse korral kasutatakse üheetapilist meetodit, kuna ühes katsutis toimuva katse puhul on ristsaastumise oht minimeeritud.
The concentration and purity of the extracted RNA shall be estimated by measuring the optical density at 260 nm and at 280 nm.
Päripidine praimer: 5′-CTACACAGCAGGATGCAGATGT-3′;
An alternative approach may be to include internal controls targeted against the virus genome as referred to in point II.1.3.
äraspidine praimer: 5′-CAGGATGCCGGAAGTCGAT-3′;
RT-PCR for ISAV detection
sond: 5′-FAM-CATCGTCGCTGCAGTTC-MGBNFQ-3′.
Several RT-PCR methods may be used for ISAV genome amplification.
Tsükleerimistingimused: üks tsükkel: 30 minutit 50 °C juures; üks tsükkel: 15 minutit 95 °C juures; 40 tsüklit: 15 sekundit 94 °C juures ja 60 sekundit 60 °C juures; vajaduse korral neid tingimusi kohandatakse.
A two-step RT-PCR may be performed whereby the RT and the PCR reactions steps are run in two separate tubes.
PCRi amplifitseerimissaaduste sekveneerimine
However, a one-step reaction, where the two reactions are run in one tube, may also be performed.
Päripidine praimer (ILAs6-3F): 5′-ATGAGGGAGGTAGCATTGCA-3′;
The one-step method shall be used where possible, as the one tube assay minimises the risk of cross-contamination as no transfer of content have to be made and it is regarded to be as sensitive as the two-step method.
äraspidine praimer (ILAs6-2R): 5′-CATGCTTTCCAACCTGCTAGGA-3′.
The primers and assay described in this point, namely the ILA1 or ILA2 primer pair that target segment 8 and which have been found suitable for detection of ISAV in outbreaks and in carrier fish, shall be used.
Tsükleerimistingimused (üheetapiline RT-PCR): üks tsükkel: 30 minutit 50 °C juures; üks tsükkel: 15 minutit 94 °C juures; 40 tsüklit: 30 sekundit 94 °C juures, 30 sekundit 55 °C juures ja 60 sekundit 72 °C juures; üks tsükkel: 5 minutit 72 °C juures; vajaduse korral neid tingimusi kohandatakse.
The ILA2 reverse primer does not match isolates from North America and an alternative primer set shall be used in those cases.
Teise võimalusena võib kasutada järgmist meetodit 6. segmendis paikneva HPRi sekveneerimiseks:
Forward primer (ILA1): 5′-GGCTATCTACCATGAACGAATC-3′;
päripidine praimer: 5′-GACCAGACAAGCTTAGGTAACACAGA-3′;
Reverse primer (ILA2): 5′-GCCAAGTGTAAGTAGCACTCC-3′.
äraspidine praimer: 5′-GATGGTGGAATTCTACCTCTAGACTTGTA-3′.
Cycling conditions: one cycle of 50 °C for 30 minutes, 1 cycle of 94 °C for 15 minutes, 40 cycles of 94 °C for 30 seconds, 55 °C for 30 seconds, 72 °C for 60 seconds; one cycle of 72 °C for 5 min.
Fragmendi pikkus: variandi HPR0 puhul 304 nukleotiidi.
Product size 155 bp.
Käesolevas punktis kirjeldatud meetodi asemel võib kasutada mõnda muud sarnase tundlikkuse ja spetsiifilisusega RT-PCRi meetodit.
However, other RT-PCR versions of proven similar efficacy may be used instead.
RT-PCRi amplifitseerimissaaduse puhtust kontrollitakse enne sekveneerimist geelelektroforeesi teel.
RT-qPCR for ISAV detection
Üheainsa puhta fragmendi esinemise korral puhastatakse see otse PCRi segust.
The use of RT-qPCR may increase specificity and probably also sensitivity.
Mitme amplifitseeritud fragmendi olemasolu korral puhastatakse huvipakkuv fragment geelelektroforeesi abil.
The method can be performed more rapidly as no gel electrophoresis step is required and it reduces the risk of cross contamination as it is possible to estimate the amount of viral genomic RNA within the sample tube.
PCRi fragmentide puhastamiseks lahusest või agaroosgeelist kasutatakse tsentrifuugitavaid PCRi fragmentide afiinsuskolonne vastavalt tootja juhistele.
A drawback of the RT-qPCR assay is that it is often not possible to sequence amplified products.
Sekveneerimiseks kasutatakse amplifitseerimispraimereid ja see toimub sekveneerimisele spetsialiseerunud välises ettevõttes.
However, if there is doubt on the specificity of the amplified product, another ISAV specific assay must be run to verify the result.
Sekveneerimistulemusi analüüsitakse programmi BLAST abil ja nukleotiidijärjestusi võrreldakse USA riikliku biotehnoloogiateabe keskuse (NCBI) nukleotiidijärjestuste andmebaasis olevate teiste teadaolevate järjestustega.
The assay described in this point, which is an assay that target segment 8, shall be used.
Sekveneerimistulemus peab olema selline, mille puhul ei jää mingit kahtlust RT-PCRi saaduse amplifitseerimise spetsiifilisuse suhtes.
This assay shall cover isolates from the European Union, the European Free Trade Association and North America.
ISA viiruse eraldamine rakukultuuris kasutamiseks
The one-step method shall be used where possible, because the one tube assay minimises the risk of cross-contamination.
Proovide ettevalmistamine
Forward primer: 5′- CTACACAGCAGGATGCAGATGT -3′;
Koematerjali võib säilitada – 80 °C juures.
Reverse primer: 5′- CAGGATGCCGGAAGTCGAT -3′;
See külmutatakse ja sulatatakse enne analüüsimist vaid korra.
and probe: 5′-FAM- CATCGTCGCTGCAGTTC – MGBNFQ-3′.
Seire ja tõrje tegemisel viiakse analüüs läbi nii kiiresti kui võimalik.
Cycling conditions: one cycle of 50 °C for 30 minutes, one cycle of 95 °C for 15 minutes, 40 cycles of 94 °C for 15 seconds, 60 °C for 60 seconds; it shall be adjusted if necessary.
Iga proov (kudede koondproov transpordisöötmes) homogeniseeritakse valideeritud homogenisaatoriga täielikult, proovi tsentrifuugitakse 15 minutit 2000–4000 g juures temperatuuril 0–6 °C, supernatant filtritakse (0,45 μm) ja seda inkubeeritakse võrdse osa IPNi viiruse kohalike serotüüpide vastaste antiseerumite sobivalt lahjendatud koondprooviga.
Sequencing of amplified PCR products
Antiseerumi tiiter peab 50 % plaagide neutraliseerimise katse kohaselt olema vähemalt 1/2000.
Forward primer (ILAs6-3F): 5′-ATGAGGGAGGTAGCATTGCA -3′;
Segu inkubeeritakse üks tund 15 °C juures.
Reverse primer (ILAs6-2R): 5′-CATGCTTTCCAACCTGCTAGGA -3′.
Saadakse inokulum.
Cycling conditions (One-step RT-PCR): one cycle of 50 °C for 30 minutes, one cycle of 94 °C for 15 minutes, 40 cycles of 94 °C for 30 seconds, 55 °C for 30 seconds, 72 °C for 60 seconds, one cycle of 72 °C for 5 minutes; it shall be adjusted if necessary.
Mõnes Euroopa osas 50 % kalaproovides esineva IPNi viiruse vastase antiseerumiga töödeldakse kõiki inokulume selleks, et hoida ära IPNi viirusest põhjustatud tsütopaatilise efekti ilmnemist inokulumiga nakatatud rakukultuurides.
Alternatively, the following method for sequencing HPR in segment 6 may be used:
Kõnealuse töötluse võib läbi viia selleks, et lühendada viroloogilise analüüsi kestust ja vähendada nende juhtude arvu, mille puhul tsütopaatilise efekti ilmnemist tuleb pidada ISA viiruse võimaliku esinemise märgiks.
Forward primer: 5′-GAC-CAG-ACA-AGC-TTA-GGT-AAC-ACA-GA-3′;
Kui proovid on pärit tootmisüksusest, mida peetakse IPNi-vabaks, võib inokulumide töötlemise IPNi viiruse vastase antiseerumiga ära jätta.
Reverse primer: 5′-GAT-GGT-GGA-ATT-CTA-CCT-CTA-GAC-TTG-TA-3′;
Rakukultuuride nakatamine
Product size: 304 nt if HPR0.
ISA viiruse algseks eraldamiseks kasutatakse atlandi lõhe neeru (ASK) rakke.
RT-PCR assays with similar sensitivities and specificities to the assays described in this point may also be used.
Võib kasutada ka muid rakuliine, mille puhul ISA viiruse eraldamise tõhusus ja rakuliini tundlikkus on tõendatud; seejuures võetakse arvesse tüvede varieeruvust ja eri tüvede võimet eri rakuliinides paljuneda.
The purity of the amplified RT-PCR product shall be checked by gel electrophoresis before sequencing.
Näib, et ASK rakud võimaldavad eraldada ja kasvatada praeguseks teada olevaid viirusisolaate, juhul kui kasutatakse väikese passaažide arvuga kultuuri.
If only one pure fragment appears, it shall be purified directly from the PCR reaction.
ASK rakkude puhul võib tsütopaatiline efekt väljenduda selgemini kui muude vastuvõtlike rakuliinide, näiteks SHK-1 (Salmon head kidney-1) puhul.
If multiple amplified fragments are present, the fragment of interest shall be purified by gel electrophoresis.
ASK rakke (passaažide arv kuni 65) kasvatatakse mitmekannulisel plaadil söötmes L-15, mis sisaldab 10 % veiselooteseerumit, 2 mahuprotsenti 200 mM L-glutamiini ja 0,08 mahuprotsenti 50 mM 2-merkaptoetanooli.
The purification of PCR fragments from solutions or agarose gels shall be made using PCR fragment affinity spin columns, according to the manufacturer's instructions.
Noor aktiivselt kasvav rakukultuur nakatatakse antiseerumiga töödeldud elundisuspensiooniga nii, et koematerjali lõpplahjendus rakukultuurisöötmes oleks 1:1000.
Sequencing shall be performed using amplification primers at external specialised sequencing companies.
Iga elundisuspensiooni puhul lisatakse ühte kannu, mis sisaldab 2 ml rakukultuurisöödet, 40 μl inokulumi.
The results shall be analysed with the search tool BLAST and the sequences shall be compared with other known sequences in the US National Centre for Biotechnical Information (NCBI) nucleotide database.
Ristsaastumise ohu minimeerimiseks kasutatakse kalakasvanduse eri kohtadest pärit proovide jaoks eri 12- või 24-kannulisi plaate.
Sequencing must eliminate any doubt on the specificity of an amplified RT-PCR product.
Üks negatiivse kontrollina kasutatav plaat jäetakse nakatamata.
ISAV isolation on cell cultures
Üks positiivse kontrollina kasutatav eraldi plaat nakatatakse ISA viiruse võrdlusisolaadiga järgmiselt.
Preparation of samples
Esimesse kannu lisatakse 100 μl ISA viiruse põhilahust, mille tiiter on vähemalt 107 TCID50 (viiruse hulk, mille puhul tsütopaatilise efekti ulatus nakatatud koekultuuris on 50 %) milliliitri kohta, ning segatakse söötmega.
The tissue may be kept at – 80 °C.
Osa saadud segust viiakse esimesest kannust teise nii, et saadakse lahjendus 1:10, ning segatakse söötmega.
The tissue shall only be frozen and thawed once before examination.
Seda toimingut korratakse kogu plaadi ulatuses, et saada kuus 10-kordset lahjendust.
For surveillance and control purposes, the examination shall be undertaken as fast as possible.
ISA viiruse põhilahust võib säilitada – 80 °C juures vähemalt kaks aastat, kuid pärast sulatamist tuleb see kolme päeva jooksul ära kasutada.
Each sample (tissue pool in transport solution) shall be completely homogenised using a validated homogeniser, centrifuged at 2000 to 4000 × g for 15 minutes at 0 to 6 °C, and the supernatant shall be filtered (0,45 μm) and incubated with an equal volume of a suitably diluted pool of antisera to the indigenous serotypes of IPNV.
Tuleb olla ettevaatlik, et hoida ära proovi sisaldavate plaatide ristsaastumist positiivse kontrolli materjaliga.
The titre of the antiserum must be at least 1:2000 in a 50 % plaque neutralisation test.
Sellise ohu ärahoidmiseks toimub positiivse kontrolli ettevalmistamine ja käsitsemine proovi sisaldavatest plaatidest eraldi.
The mixture shall be incubated for one hour at 15 °C.
Iga nakatamise puhul positiivse kontrolli kasutamise asemel võib iga kuue kuu järel määrata ASK rakkude tundlikkuse ISA viiruse isolaatide suhtes.
This shall represent the inoculum.
Proovi inkubeeritakse kuni 15 päeva temperatuuril 15 ± 2 °C.