natgillin/translations-raw huggingface dataset:
When the cells are cultivated in closed vials, the medium shall be buffered with bicarbonate.
Kõikides primaarkultuuri sisaldavates kultuurides või kannudes olevatest söötme (supernatandi) alikvootidest moodustatakse 7–10 päeva pärast nakatamist iga rakuliini puhul koondproov.
The medium used for cultivation of cells in open units may be buffered with tris(hydroxymethyl)aminomethane-HCl (Tris-HCl) (23 mM) and sodium bicarbonate (6 mM).
Saadud koondprooviga nakatatakse homoloogilisi rakukultuure proovi eelnevalt lahjendamata ja 1:10 lahjendatuna (supernatandi lõpplahjendus vastavalt 1:10 ja 1:100), nagu on kirjeldatud punktis I.5.2.
The pH must be 7,6 ± 0,2.
Teise võimalusena viiakse primaarkultuuri söötme 10 % suurune alikvoot otse värsket rakukultuuri sisaldavasse kannu (subkultuuri loomine kannust kannu tõstmisega).
The cell cultures to be used for inoculation with fish tissue material shall be young, normally 1 day old cell culture monolayers where possible; however, a range between 4 to 48 hours old may be accepted.
Enne nakatamist võib lahuseid eelnevalt inkubeerida IPNi viiruse vastase sobivalt lahjendatud antiseerumiga, nagu on kirjeldatud punktis I.4.3.
The cells must be actively growing at inoculation.
Seejärel inkubeeritakse nakatatud kultuure 7–10 päeva 15 °C juures ja neid jälgitakse punkti I.5.4 kohaselt.
Inoculation of cell cultures
Kui toksiline tsütopaatiline efekt ilmneb inkubeerimise esimese kolme päeva jooksul, luuakse subkultuur juba sel ajal, kuid sellisel juhul inkubeeritakse rakke seitse päeva ja pärast seda luuakse uus subkultuur, mida inkubeeritakse veel seitse päeva.
Antibiotic-treated organ suspension shall be inoculated into cell cultures in two dilutions, namely the primary dilution and, in addition, a 1:10 dilution thereof, resulting in final dilutions of tissue material in cell culture medium of 1:100 and 1:1000, respectively, in order to prevent homologous interference.
Kui toksiline tsütopaatiline efekt ilmneb pärast kolme päeva möödumist, vahetatakse rakke ühe korra ja inkubeerimine kestab esimesest nakatamisest alates kokku 14 päeva.
At least two cell lines shall be inoculated as referred to in point I.5.1.
Inkubeerimise viimase seitsme päeva jooksul ei tohi toksilisust ilmneda.
The ratio between inoculum size and volume of cell culture medium shall be about 1:10.
Kui kultuur saastub bakteritega antibiootikumidega töötlemisest hoolimata, tsentrifuugitakse supernatanti enne subkultuuri loomist 15–30 minutit 2000–4000 g juures temperatuuril 2–5 °C ja/või filtritakse see läbi 0,45 μm suuruste pooridega filtri, mille membraan seob vähe valke.
For each dilution and each cell line, a minimum of about 2 cm2 cell area, corresponding to one well in a 24-well cell culture tray, shall be utilised.
Peale selle järgitakse subkultuuri loomisel käesoleva punkti neljandas lõigus seoses toksilise tsütopaatilise efektiga kirjeldatud korda.
Cell culture trays shall be used where possible.
Kui tsütopaatilist efekti ei täheldata, võib katsetulemuse lugeda negatiivseks.
Incubation of cell cultures
Viiruse tuvastamine
The inoculated cell cultures shall be incubated at 15 °C for seven to 10 days.
Kui rakukultuuris täheldatakse tsütopaatilist efekti, kogutakse sööde (supernatant) kokku ja selle analüüsimiseks kasutatakse ühte või mitut järgmistest meetoditest: ensüümimmuunsorptsioonanalüüs (ELISA), immunofluorestsentsanalüüs, neutraliseerimine, RT-PCR ja RT-qPCR.
If the colour of the cell culture medium changes from red to yellow indicating medium acidification, pH adjustment with sterile bicarbonate solution or equivalent substances shall be performed to ensure cell susceptibility to virus infection.
Kui kõnealuste meetoditega ei ole ühe nädala jooksul suudetud viirust kindlalt tuvastada, saadetakse supernatant viiruse koheseks tuvastamiseks kalahaigustega tegelevasse direktiivi 2006/88/EÜ VI lisas osutatud riiklikku referentlaborisse või ELi referentlaborisse.
At least every 6 months or if decreased cell susceptibility is suspected, titration of frozen stocks of VHSV and IHNV shall be performed to verify the susceptibility of the cell cultures to infection.
Viiruse isolaadi tuvastamiseks tehakse kihttehnikal põhinev kahe antikehaga ELISA.
The procedure set out in Section III shall be used, if possible.
Mikrotiiterplaadi pind kaetakse IHNi või VHSi viiruse vastasest küüliku antiseerumist proteiin A abil puhastatud tõendatud kvaliteediga immunoglobuliinidega, mis on lahjendatud naatriumasiidi kontsentratsioonis 15 mM sisaldavas karbonaatpuhvris (pH 9,6) nii, et igasse kannu lisatakse 0,9 pg antikehi 50 μl lahuses, ning plaati inkubeeritakse 4 °C juures 18 tundi kuni 2 nädalat.
Microscopy
Igast proovist, mis sisaldab 1 % Triton X-100, ja positiivsetest kontrollidest tehakse lahjendusplaadil puhverlahuses PBS-T-BSA (fosfaadiga puhverdatud soolalahus (PBS), mis sisaldab 1 % veise seerumi albumiini (BSA)) neljakordsed lahjendused: lahjendamata, 1:4, 1:16 ja 1:64.
Inoculated cell cultures shall be inspected regularly, at least three times a week, for the occurrence of CPE at 40 to 150 × magnification.
ELISA plaati pestakse PBSiga, mis sisaldab 0,05 % Tween-20 (PBS-T), ning antikehadega kaetud ja pestud ELISA plaadile kantakse lahjendusplaadilt igast lahjendusest 50 μl.
If obvious CPE is observed, virus identification procedures in accordance with point I.6 shall be initiated immediately.
ELISA plaati inkubeeritakse 30 minutit 37 °C juures.
Subcultivation
Seejärel plaati pestakse ja seda inkubeeritakse 30 minutit temperatuuril 37 °C spetsiifilise monoklonaalse antikehaga (VHSi viiruse tuvastamiseks monoklonaalse antikehaga IP5B11 ja IHNi viiruse tuvastamiseks Hyb 136–3).
If no CPE has developed after the primary incubation for 7 to 10 days, subcultivation shall be performed to fresh cell cultures utilising a cell area similar to that of the primary culture.
ELISA plaadile kantakse 50 μl hiire antikehade vastaste mädarõika peroksüdaasiga (HRP) konjugeeritud küüliku antikehade lahust, mis on valmistatud PBS-T-BSAs lahjendusel 1:1000.
Aliquots of medium (supernatant) from all cultures or wells constituting the primary culture shall be pooled according to cell line 7 to 10 days after inoculation.
Lõpuks lisatakse pärast uuesti pesemist värvusreaktsiooni esilekutsumiseks 50 μl o-fenüleendiamiini (OPD) lahust kannu kohta.
The pools shall then be inoculated into homologous cell cultures undiluted and diluted 1:10 (resulting in final dilutions of 1:10 and 1:100, respectively, of the supernatant) as described in point I.5.2.
ELISA plaati inkubeeritakse 20 minutit pimedas toatemperatuuril ja reaktsiooni peatamiseks lisatakse 100 μl 0,5 M H2SO4 kannu kohta.
Alternatively, aliquots of 10 % of the medium constituting the primary culture shall be inoculated directly into a well with fresh cell culture (namely, well to well subcultivation).
Neeldumist mõõdetakse ELISA plaadilugejas lainepikkustel 492 ja 620 nm.
The inoculation may be preceded by pre-incubation of the dilutions with the antiserum to IPN virus at appropriate dilution as described in point I.4.3.
Proov loetakse positiivseks või negatiivseks pärast katsetulemuste võrdlemist positiivse ja negatiivse kontrolli neeldumisnäitajatega.
The inoculated cultures shall then be incubated for 7 to 10 days at 15 °C and inspected in accordance with point I.5.4.
Proov, mille lahjendamata materjali puhul on summaarne neelduvus (A) < 0,5, loetakse üldjuhul negatiivseks, proov, mille puhul A on vahemikus 0,5–1,0, loetakse kahtlustäratavaks ning proov, mille puhul A > 1,0, loetakse positiivseks.
If toxic CPE occurs within the first 3 days of incubation, subcultivation shall be performed at that stage, but the cells shall then be incubated for 7 days and sub cultivated again with further 7 days incubation.
Käesolevas punktis kirjeldatud meetodi asemel võib kasutada mõnda muud tõendatud tõhususega ELISA meetodit.
When toxic CPE develops after 3 days, the cells shall be passed once and incubated to achieve the total of 14 days from the primary inoculation.
Immunofluorestsentsanalüüs
There must be no evidence of toxicity in the final 7 days of incubation.
Loetletud patogeenide hulka kuuluvate VHSi viiruse ja IHNi viiruse tuvastamiseks nakatatakse musta värvi 96-kannulisel plaadil, tavalisel 24-kannulisel plaadil või 24-kannulisse plaati asetatud katteklaasil kasvatatavaid rakke.
If bacterial contamination occurs despite treatment with antibiotics, subcultivation shall be preceded by centrifugation at 2000 to 4000 × g for 15 to 30 minutes at 2 to 5 °C, or filtration of the supernatant through a 0,45 μm filter or both (low protein-binding membrane).
Kui IHNi viiruse ja/või VHSi viiruse tuvastamiseks nakatatakse rakke katteklaasil, kohaldatakse järgmist meetodit:
In addition to this, subcultivation shall follow the same procedures as described for toxic CPE in the fourth paragraph of this point.
katteklaasile viiakse selline kogus rakke, et pärast 24 tunni pikkust kultiveerimist oleks rakukiht 60–90 % ulatuses konfluentne.
If no CPE occurs, the test may be declared negative.
Selleks otstarbeks kasutatakse võimaluse korral EPC rakke, sest need kinnituvad tugevalt klaaspinnale, kuid võib kasutada ka mõnda muud rakuliini, näiteks BF-2, RTG-2 või FHMi.
Virus identification
Ühe päeva vanuse ühekihilise rakukultuuri nakatamiseks lisatakse kahe paralleelproovina 150 μl rakukultuuri supernatanti kahes eri lahjenduses (1:10 ja 1:1000) ning rakke inkubeeritakse 24 tundi 15 °C juures;
If evidence of CPE has been observed in a cell culture, medium (supernatant) shall be collected and examined by one or more of the following techniques: Enzyme-linked immunosorbent essay (ELISA), Immunofluorescence (IF), neutralisation, RT-PCR or RT-qPCR.
seejärel eemaldatakse rakukultuurisööde ja nakatatud ühekihilise kultuuri rakud fikseeritakse 0,5 ml jääkülma atsetooni vesilahusega (80-mahuprotsendiline).
If these tests have not allowed definitive identification of the virus within 1 week, the supernatant shall be forwarded to the national reference laboratory or to the EU reference laboratory for fish diseases referred to in Annex VI to Directive 2006/88/EC for immediate identification.
Fikseerimine toimub tõmbekapis toatemperatuuril 15 minuti vältel; seejärel atsetoonilahus eemaldatakse ja katteklaasil lastakse vähemalt 30 minutit õhu käes kuivada.
A double antibody sandwich ELISA shall be performed in order to identify the virus isolate.
Selle etapi järel jätkatakse kohe rakkude töötlemist või külmutatakse need – 20 °C juures hilisemaks analüüsimiseks;
Microwell plates shall be coated with 50 μl/well (0,9 pg) of proven quality protein-A purified immunoglobulins(Ig) from rabbit antisera against IHNV or VSHV diluted in carbonate buffer (pH 9,6) containing 15 mM sodium azide and incubated from 18 hours to 2 weeks at 4 °C.
spetsiifiline monoklonaalne antikeha (VHSi viiruse tuvastamisel IP5B11 ja IHNi viiruse tuvastamisel Hyb 136–3) lahjendatakse 0,01 M PBSis, mis sisaldab 0,05 % Tween-20 (PBS-T) ja mille pH on 7,2; seejuures kasutatakse asjaomase antikeha tarnija soovitatavat lahjendust.
On a dilution plate, each sample containing 1 % Triton X-100 and the positive controls shall be diluted with buffer solution (namely, phosphate buffered saline (PBS)-T-BSA, 1 % BSA) in a 4-fold dilution: undiluted, 1:4, 1:16, 1:64.
Fikseeritud ühekihilisele kultuurile lisatakse 50–100 μl antikehalahust ja plaati inkubeeritakse niiskes kambris tund aega 37 °C juures;
The ELISA plates shall be washed in PBS containing 0,05 % Tween-20 (PBS-T) and 50 μl of each dilution shall be transferred from the dilution plate to the washed and coated ELISA-plate.
katteklaasi pestakse ettevaatlikult kolm korda PBS-T-ga ja pärast viimast loputamist eemaldatakse puhverlahus täielikult.
ELISA plates shall then be incubated for 30 minutes at 37 °C.
Seejärel inkubeeritakse rakke tund aega temperatuuril 37 °C primaarse antikehana kasutatud hiire immunoglobuliini vastase, tarnija juhiste kohaselt lahjendatud antikehaga, mis on konjugeeritud fluorestseiinisotiotsüanaadi (FITC) või tetrametüülrodamiin-5-(ja 6-)isotiotsüanaadiga (TRITC), ning rakke pestakse taas PBS-T-ga ja neil lastakse kuivada.
Subsequently plates shall be washed and incubated for 30 minutes at 37 °C with specific monoclonal antibodies (namely for VHSV identification MAb IP5B11 and for IHNV Hyb 136-3, respectively).
Sel viisil värvitud kultuur asetatakse glütserooli sisaldava soolalahuse abil alusklaasile ja seda analüüsitakse kaldnurga all saabuvas ultraviolettkiirguses.
50 μl of horseradish-peroxidase (HRP) conjugated rabbit anti mouse antibodies diluted 1:1000 in PBS-T-BSA shall be transferred to the ELISA plate.
Kasutatakse 10- või 12-kordse suurendusega okulaare ja 25- või 40-kordse suurendusega objektiivi, mille numbriline apertuur on vastavalt > 0,7 või > 1,3.
Finally, after renewed washing the reactions shall be developed adding 50 μl/well of ortho-phenylenediamine (OPD).
Eespool kirjeldatu asemel võib rakukultuuride, fikseerimise ja standardkvaliteediga antikehadega seoses kasutada mõnda muud sarnase tõendatud tõhususega immunofluorestsentsanalüüsi meetodit.
The ELISA plates shall be incubated for 20 minutes at room temperature in the dark and the reaction shall be stopped by adding 100 μl/well 0,5 M H2SO4.
Neutraliseerimine
The absorbance shall be monitored at a wavelength of 492 and 620 nm in an ELISA reader.
Kogutud supernatandist eraldatakse rakud tsentrifuugimise teel (2000–4000 g) või filtrimisega läbi membraani (0,45 μm), mis seob vähe valke, ning supernatandist tehakse rakukultuurisöötmes lahjendused 1:100 ja 1:10000.
Samples shall be designated positive or negative after comparing the test results to the absorbance values for the positive and negative controls.
Supernatandi vähemalt kahe lahjenduse alikvoot segatakse eraldi võrdse osa allpool loetletud reaktiividega ja segu inkubeeritakse 60 minutit 15 °C juures:
In general, samples with combined absorbance (A) < 0,5 for undiluted material shall be considered negative, samples with A values between 0,5 and 1,0 shall be considered suspicious and samples with A values > 1,0 shall be considered positive.
ruumalasuhtes 1:50 lahjendatud seerum, mis sisaldab rühmaspetsiifilist VHSi viiruse vastast antikeha;
Other ELISA versions with a proven similar efficacy may be used instead of those referred to in this point.
ruumalasuhtes 1:50 lahjendatud seerum, mis sisaldab rühmaspetsiifilist IHNi viiruse vastast antikeha;
Immunofluorescence- IF
ruumalasuhtes 1:50 lahjendatud segu IPNi viiruse kohalike serotüüpide vastastest antiseerumitest;
The identification of listed pathogens VHSV and IHNV shall be performed by infecting cells in ‘Black’ 96-well plates, conventional 24-well plates or cover slips into 24-well plates.
ainult sööde (positiivne kontroll).
When IHNV or VHSV or both are identified by infecting cells on cover slips, the following protocol shall apply:
Viirust sisaldava supernatandi ja seerumi iga seguga nakatatakse vähemalt kaks rakukultuuri igale kultuurile 50 μl segu lisamise teel ning kultuure inkubeeritakse 15 °C juures.
cover slips shall be seeded with cells at a density leading to between 60 % and 90 % confluence after 24 hours of cultivation.
Tsütopaatilise efekti ilmnemist kontrollitakse punktis I.5.4 kirjeldatud viisil.
EPC cells shall be used where possible for this purpose because of their strong adherence to glass surfaces, but other cell lines such as BF-2, RTG-2 or FHM may be used as well.
Sellised VHSi viiruse tüved ja isolaadid, mis neutraliseerimiskatses antikehaga ei reageeri, tuvastatakse immunofluorestsentsanalüüsi või ELISA abil.
150 μl cell culture supernatant in two different dilutions (1:10 and 1:1000) shall be inoculated in duplicate onto 1-day-old monolayers and incubated at 15 °C for 24 hours;
Eespool kirjeldatu asemel võib kasutada mõnda muud sarnase tõendatud tõhususega neutraliseerimismeetodit.
subsequently, cell culture medium shall be removed, and the infected cell monolayers fixed with 0,5 ml ice-cold, aqueous acetone solution (80 % vol:vol).
RT-PCR ja RT-qPCR
Fixation shall take place in fume hood for 15 minutes at room temperature, then the acetone solution shall be removed and the cover glasses shall be air dried for at least 30 minutes.
Viiruse RNA eraldamine
At this stage, the plates shall either be processed immediately or stored at – 20 °C for further use;
Kõik toimingud RNA eraldamiseks tehakse jääl ja kinnastega.
specific monoclonal antibodies (namely for VHSV identification, MAb IP5B11 and for IHNV, Hyb 136-3 respectively) shall be diluted in 0,01 M PBST, pH 7,2 in the dilution recommended by the provider of the MAbs; 50 to 100 μl/well shall be added to the fixed monolayer and plates shall be incubated for one hour at 37 °C in a humid chamber;
RNA eraldamiseks kasutatakse fenooli ja kloroformiga ekstraheerimise meetodit või tsentrifuugitavat RNA afiinsuskolonni vastavalt tootja juhistele.
cover glasses shall be washed gently three times with PBS containing 0,05 % Tween-20 (PBS-T), and the buffer shall be removed completely after the last rinse.
Võib kasutada turul kättesaadavat RNA eraldamise komplekti, mille abil saadakse kvaliteetne RNA, mida on võimalik kasutada allpool olevates punktides kirjeldatud RT-PCRi meetodite puhul.
The cells shall subsequently be incubated for one hour at 37 °C with fluorescein isothiocyanate (FITC) — or tetramethylrhodamine-5-(and-6-) isothiocyanate (TRITC)-conjugated antibodies against mouse immunoglobulin used as the primary antibody, diluted according to the supplier instructions, washed again in PBS-T, and dried.
Eraldatud RNA lahustatakse ribonukleaasivabas destilleeritud vees (täpsemalt 0,1 % dietüülpürokarbonaadiga töödeldud vees) või sobivas elueerimispuhvris.
Stained cultures shall be mounted onto glass slides using glycerol saline and examined under incident ultraviolet (UV) light.
IHNi viiruse tuvastamiseks kasutatakse järgmisi praimereid:
Use 10 × or 12 × eyepieces and a × 25 or × 40 objective lens with numerical apertures > 0,7 and > 1,3 respectively.
päripidine praimer: 5′-AGAGATCCCTACACCAGAGAC-3′;
Other IF techniques, with regard to cell cultures, fixation and antibodies of reference quality, of proven similar efficacy may be used instead.
äraspidine praimer: 5′-GGTGGTGTTGTTTCCGTGCAA-3′.
Neutralisation
Kasutatakse järgmisi tsükleid (üheetapiline RT-PCR): 1 tsükkel: 30 minutit 50 °C juures; 1 tsükkel: 2 minutit 95 °C juures; 30 tsüklit: 30 sekundit 95 °C juures, 30 sekundit 50 °C juures ja 60 sekundit 72 °C juures; 1 tsükkel: 7 minutit 72 °C juures ja jahutamine temperatuurini 4 °C.
Cells from the collected supernatant shall be removed by centrifugation (2000 to 4000 × g) or membrane filtration (0,45 μm) with a low protein binding membrane and the supernatant shall be diluted 1:100 and 1:10000 in cell culture medium.
VHSi viiruse tuvastamiseks kasutatakse järgmisi praimereid:
Aliquots of a minimum of two supernatant dilutions shall be mixed and incubated for 60 minutes at 15 °C with equal parts of the following reagents separately:
päripidine praimer: 5′-ATGGAAGGAGGAATTCGTGAAGCG-3′;
serum containing group specific antibody against VHSV at a 1:50 (vol:vol) dilution;
äraspidine praimer: 5′-GCGGTGAAGTGCTGCAGTTCCC-3′.
serum containing group specific antibody against IHNV at a 1:50 (vol:vol) dilution;
Kasutatakse järgmisi tsükleid (üheetapiline RT-PCR): 30 minutit 50 °C juures; 15 minutit 95 °C juures; 35 tsüklit: 30 sekundit 94 °C juures, 30 sekundit 55 °C juures ja 60 sekundit 68 °C juures.
pool of antisera against the indigenous serotypes of IPNV at a 1:50 (vol:vol) dilution;
Seejärel inkubeeritakse reaktsioonisegu 7 minutit 68 °C juures.
medium alone (positive control).
RT-PCRi spetsiifilisuse ja reaktsioonisaaduse koguse hindamiseks kasutatakse geelelektroforeesi etiidiumbromiidi sisaldavas 1,5 % agaroosgeelis, mida analüüsitakse läbivas ultraviolettkiirguses.
From each virus supernatant-serum mixture, at least two cell cultures shall be inoculated with 50 μl each and then incubated at 15 °C.
IHNi viiruse puhul võib täheldada 693 aluspaari (bp) pikkuse PCRi amplikoni esinemist.
The development of CPE shall be checked as described in point I.5.4.
VHSi viiruse puhul on amplikoni pikkus 505 bp.
VHSV strains and isolates that do not react in neutralisation tests shall be identified by IF or ELISA.
Fragmendi pikkus on 155 bp.
Other neutralisation tests of proven similar efficacy may be used instead.
PCRi tulemus võib olenevalt kasutatud reaktsioonitingimustest varieeruda, kuna võib tekkida vajadus tsükleerimisnäitajaid kasutatava termotsükleri jaoks optimeerida.
RT-PCR/RT-qPCR
Peale selle võidakse praimerite ebaõige anniilimise või labori saastumise tõttu saada valepositiivsed tulemused.
Preparation of viral RNA
Seepärast tuleb mis tahes kahtluste ärahoidmiseks kasutada asjakohaseid positiivseid ja negatiivseid kontrolle ja amplikone.
All work with RNA shall be performed on ice, using gloves.
VHSi viiruse jaoks ette nähtud praimerite puhul tuleb BF-2 rakkude kasutamisel olla eriti ettevaatlik, sest need praimerid võivad seonduda selle rakuliini DNAga/RNAga ja anda sarnase pikkusega amplikonide tekkimise tõttu valepositiivseid tulemusi.
RNA shall be extracted using the phenol-chloroform method or by RNA affinity spin columns, according to the manufacturer's instructions.
BF-2 rakkude kultuurist saadud supernatandi analüüsimisel sekveneeritakse kõik PCRi käigus amplifitseeritud fragmendid.
Commercially available RNA extraction kits that will produce high quality RNA suitable for use with the RT-PCR protocols detailed in the points below may be used.
VHSi viiruse tuvastamiseks kasutatav RT-qPCR
RNA shall be re-suspended in distilled RNAse-free water, (namely water treated with 0,1 % diethyl pyrocarbonate) or an appropriate elution buffer.
VHSi viiruse puhul kasutatakse amplifitseerimiseks järgmisi praimereid ja sondi:
The following primers shall be used for detection of IHNV:
päripidine praimer: 5′-AAACTCGCAGGATGTGTGCGTCC-3′;
Forward Primer 5′-AGA-GAT-CCC-TAC-ACC-AGA-GAC-3′;
äraspidine praimer: 5′-TCTGCGATCTCAGTCAGGATGAA-3′;
Reverse Primer 5′-GGT-GGT-GTT-GTT-TCC-GTG-CAA-3′.
sond: 5′-FAM-TAGAGGGCCTTGGTGATCTTCTG-BHQ1-3′.
The following cycles shall be used (one-step RT-PCR): 1 cycle: 50 °C for 30 minutes; 1 cycle: 95 °C for 2 minutes; 30 cycles: 95 °C for 30 seconds, 50 °C for 30 seconds, 72 °C for 60 seconds; 1 cycle: 72 °C for 7 minutes and soak at 4 °C.
Üheetapiline RT-qPCR
The following primers shall be used for detection of VHSV:
Iga plaadi analüüsimisel kasutatakse negatiivseid matriitsita kontrolle ja positiivseid kontrolle.
VN For 5′-ATG-GAA-GGA-GGA-ATT-CGT-GAA-GCG-3′;
Tsükleerimistingimused: 30 minutit 50 °C juures; 15 minutit 95 °C juures; 40 tsüklit: 15 sekundit 94 °C juures, 40 sekundit 60 °C juures ja 20 sekundit 72 °C juures; vajaduse korral neid tingimusi kohandatakse.
VN Rev 5′-GCG-GTG-AAG-TGC-TGC-AGT-TCC-C-3′.
Eespool kirjeldatu asemel võib kasutada mõnda muud sarnase tõendatud tõhususega RT-PCRi või RT-qPCRi meetodit.
The following cycles shall be used (one-step RT-PCR): 50 °C for 30 minutes, 95 °C for 15 minutes, 35 cycles at 94 °C for 30 seconds, 55 °C for 30 seconds, and 68 °C for 60 seconds.
IHNi viiruse tuvastamiseks kasutatav RT-qPCR
Subsequently, the reaction shall be held at 68 °C for 7 minutes.
IHNi viiruse puhul kasutatakse amplifitseerimiseks järgmisi praimereid ja sondi:
Quantity and specificity of the RT-PCR reactions shall be evaluated by gel electrophoresis in 1,5 % agarose gel with ethidium bromide and observed using UV transillumination.
päripidine praimer: 5′-AGAGCCAAGGCACTGTGCG-3′;
A 693 bp PCR amplicon may be observed for IHNV.
äraspidine praimer: 5′-TTCTTTGCGGCTTGGTTGA-3′;
For VHSV, the size shall be 505 bp.
sond: 5′-6FAM-TGAGACTGAGCGGGACA-NFQ/MGB-3′.
The results of the PCR may vary depending on the conditions under which it is performed, namely the thermal protocols might need optimisation, depending on the thermal cycler in use.
Kaheetapiline RT-qPCR
Furthermore, false-positive results may occur because of false primer annealing or laboratory contamination.
Kuna allpool kirjeldatud meetod põhineb kaheetapilisel amplifitseerimisel, tuleb olla eriti hoolikas, et hoida ära saastumist katsutite käsitsemisel ühelt reaktsioonilt teisele üleminekul.