natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Διχλωρομεθάνιο
24 mg β-alanine
Ακετόνη
500 μl ampholyte pH 3,5-9,5
Ρυθμιστικό διάλυμα για τη διάλυση πρωτεϊνών
250 μl ampholyte pH 5-7
Διαλύονται σε νερό
250 μl ampholyte pH 6-8
5,75 g γλυκερίνης (87 % w/w)
Mix the gel solution and de-gas for two to three minutes in an ultrasonic bath or in vacuum.
24,03 g ουρίας
Note: Prepare the gel solution immediately prior to pouring it (see 6.2).
250 mg διθειοθρεϊτόλης,
Catalyst solutions
και συμπληρώνεται ο όγκος μέχρι τα 50 ml.
N, N, N′ N′ — tetramethylethylenediamine (Temed)
Σημείωση: Το διάλυμα φυλάσσεται στο ψυγείο και ο μέγιστος χρόνος διατήρησής του είναι μία εβδομάδα.
40 % w/v ammonium persulphate (PER):
Αντιδραστήρια για την πλασμινόλυση των καζεϊνών
Dissolve 800 mg PER in water and make up to 2 ml.
Ρυθμιστικό διάλυμα ανθρακικού αμμωνίου
Note: Always use freshly prepared PER solution.
Τιτλοδοτείται διάλυμα όξινου ανθρακικού αμμωνίου 0,2 mol/l (1,58 g/100 ml νερού) που περιέχει 0,05 mol/l αιθυλενοδιαμινοτετραοξικού οξέος (EDTA, 1,46 g/100 ml) με διάλυμα ανθρακικού αμμωνίου 0,2 mol/l (1,92 g/100 ml νερού) που περιέχει 0,05 mol/l EDTA έως pH 8.
Contact fluid
Βόειος πλασμίνη (EC.
Kerosene or liquid paraffin
3.4.21.7), δραστικότητας τουλάχιστον 5 U/ml
Anode solution
Διάλυμα ε-αμινοκαπρονικού οξέος για αναστολή ενζύμου
Dissolve 5,77 g phosphoric acid (85 % w/w) in water and dilute to 100 ml.
Διαλύονται 2,624 g ε-αμινοκαπρονικού οξέος (6-αμινο-κ-εξανικό οξύ) σε 100 ml αιθανόλης 40 % (v/v).
Cathode solution
Πρότυπα υλικά
Dissolve 2,00 g sodium hydroxide in water and dilute to 100 ml with water.
Πιστοποιημένα πρότυπα υλικά αναφοράς που συνίστανται σε μείγμα αποκορυφωμένου αιγοπρόβειου γάλακτος με προσθήκη πυτιάς, το οποίο περιέχει αγελαδινό γάλα σε αναλογία 0 % και 1 %, διατίθενται από το Ινστιτούτο Υλικών και Μετρήσεων Αναφοράς της Επιτροπής, B-2440 Geel, Βέλγιο.
Sample preparation
Παρασκευή ενδιάμεσων προτύπων υλικών του εργαστηρίου που συνίστανται σε γάλα βουβάλων με προσθήκη πυτιάς, το οποίο περιέχει αγελαδινό γάλα σε αναλογία 0 % και 1 %
Reagents for protein isolation
Αποκορυφωμένο γάλα λαμβάνεται με φυγοκέντρηση ακατέργαστου και ασυσκεύαστου γάλακτος βουβάλων ή αγελαδινού στους 37 °C και σε 2500 g επί 20 λεπτά.
Dilute acetic acid (25,0 ml of glacial acetic acid made up to 100 ml with water)
Μετά από ταχεία ψύξη του σωλήνα και του περιεχομένου του σε θερμοκρασία 6-8 °C, αφαιρείται τελείως η ανώτερη λιπαρή στιβάδα.
Dichloromethane
Για την παρασκευή του προτύπου υλικού 1 %, προστίθενται 5,00 ml αποκορυφωμένου αγελαδινού γάλακτος σε 495 ml αποκορυφωμένου γάλακτος βουβάλων μέσα σε ποτήρι ζέσεως του 1 λίτρου και ρυθμίζεται το pH στην τιμή 6,4 με την προσθήκη αραιού γαλακτικού οξέος (10 % w/v).
Acetone
Ρυθμίζεται η θερμοκρασία στους 35 °C, προστίθενται 100 μl πυτιάς μόσχου (δραστικότητα πυτιάς 1: 10000, περίπου 3000 U/ml), το σύνολο αναδεύεται επί ένα λεπτό και στη συνέχεια το ποτήρι ζέσεως, καλυμμένο με αλουμινόχαρτο, αφήνεται στους 35 °C επί μία ώρα για να σχηματισθεί το τυρόπηγμα.
Protein dissolving buffer
Αφού σχηματισθεί το τυρόπηγμα, το πηγμένο γάλα λυοφιλοποιείται χωρίς προηγούμενη ομογενοποίηση ούτε στράγγιση του ορού.
Dissolve
Μετά τη λυοφιλίωση, λειοτριβείται προς σχηματισμό ομοιογενούς σκόνης.
5,75 g glycerol (87 % w/w)
Για την παρασκευή του προτύπου υλικού 0 % ακολουθείται η ίδια διαδικασία με αμιγές αποκορυφωμένο γάλα βουβάλων.
24,03 g urea
Τα πρότυπα υλικά φυλάσσονται σε θερμοκρασία – 20 °C.
250 mg dithiothreitol,
Σημείωση: Πριν από την παρασκευή των προτύπων υλικών, συνιστάται να ελέγχεται η καθαρότητα του γάλακτος βουβάλων με ισοηλεκτρική εστίαση των καζεϊνών μετά από κατεργασία με πλασμίνη.
in water and make up to 50 ml
Αντιδραστήρια για τη χρώση των πρωτεϊνών
Note: Store in a refrigerator, maximum shelf-life one week.
Αντιδραστήριο στερέωσης
Reagents for plasmin cleavage of caseins
Διαλύονται σε νερό 150 g τριχλωροξικού οξέος και συμπληρώνεται ο όγκος μέχρι τα 1000 ml.
Ammonium carbonate buffer
Διάλυμα αποχρωματισμού
Titrate a 0,2 mol/l ammonium hydrogencarbonate solution (1,58 g/100 ml water) containing 0,05 mol/l ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 1,46 g/100 ml with a 0,2 mol/l ammonium carbonate solution (1,92 g/100 ml water) containing 0,05 mol/l EDTA to pH 8.
Αραιώνονται με απεσταγμένο νερό 500 ml μεθανόλης και 200 ml παγόμορφου οξικού οξέος μέχρις όγκου 2000 ml.
Bovine plasmin (EC.
Σημείωση: Το διάλυμα αποχρωματισμού παρασκευάζεται σε ημερήσια βάση. μπορεί να παρασκευαστεί με ανάμειξη ίσων όγκων μητρικών διαλυμάτων μεθανόλης 50 % (v/v) και παγόμορφου οξικού οξέος 20 % (v/v).
3.4.21.7), activity at least 5 U/ml
Διαλύματα χρώσης
ε-Aminocaproic acid solution for enzyme inhibition
Διάλυμα χρώσης (μητρικό διάλυμα 1)
Dissolve 2,624 g ε-aminocaproic acid (6 amino-n-hexanoic acid) in 100 ml of 40 % (v/v) ethanol.
Διαλύονται 3,0 g χρωστικής Coomassie Brilliant Blue G-250 (Color Index 42655) σε 1000 ml μεθανόλης 90 % (v/v) με τη βοήθεια μαγνητικού αναδευτήρα (45 λεπτά περίπου) και το διάλυμα διηθείται μέσω δύο πτυχωτών ηθμών μεσαίας ταχύτητας.
Standards
Διάλυμα χρώσης (μητρικό διάλυμα 2)
Certified reference standards of a mixture of renneted ewe's and goat's skimmed milk containing 0 % and 1 % of cow's milk are available from the Commission's Institute for Reference Materials and Measurements, B-2440 Geel, Belgium
Διαλύονται 5,0 g πενταένυδρου θειικού χαλκού σε 1000 ml οξικού οξέος 20 % (v/v).
Preparation of laboratory interim-standards of buffalo's renneted milk containing 0 % and 1 % of cow's milk
Διάλυμα χρώσης (διάλυμα εργασίας)
Skimmed milk is prepared by centrifuging of either buffalo or bovine raw bulk milk at 37 °C at 2500 g for 20 minutes.
Αναμειγνύονται 125 ml από κάθε μητρικό διάλυμα (4.11.1 και 4.11.2) αμέσως πριν από τη χρώση.
After cooling the tube and contents rapidly to 6 to 8 °C, the upper fat layer is removed completely.
Σημείωση: Το διάλυμα χρώσης πρέπει να παρασκευάζεται την ημέρα που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί.
For the preparation of the 1 % standard add 5,00 ml of bovine skimmed milk to a 495 ml of buffalo's skimmed milk in a 1 l beaker, adjust the pH to 6,4 by the addition of dilute lactic acid (10 % w/v).
ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ
Adjust the temperature to 35 °C and add 100 μl of calf rennet (rennet activity 1: 10000, c.
Γυάλινες πλάκες (διαστάσεις 265 × 125 × 4 mm), ελαστικός κύλινδρος (πλάτος 15 cm), τραπέζι οριζοντίωσης
3000 U/ml), stir for 1 minute and then leave the beaker covered with an aluminium foil at 35 °C for one hour to allow formation of the curd.
Φύλλο συγκράτησης πηκτής (διαστάσεις 265 × 125 mm)
After the curd has formed, the whole renneted milk is freeze-dried without prior homogenization or draining of the whey.
Φύλλο κάλυψης (διαστάσεις 280 × 125 mm).
After freeze-drying it is finely ground to produce a homogeneous powder.
Σε κάθε μεγάλη πλευρά επικολλάται λωρίδα αυτοκόλλητης ταινίας διαστάσεων 280 × 6 × 0,25 mm (βλέπε σχήμα 1)
For the preparation of the 0 % standard, carry out the same procedure using genuine buffalo skimmed milk.
Θάλαμος ηλεκτροεστίασης με ψυκτική πλάκα (π.χ. 265 × 125 mm) και κατάλληλο τροφοδοτικό (τάσης ≥ 2,5 kV) ή αυτόματη συσκευή ηλεκτροφόρησης
The standards shall be stored at – 20 °C.
Κρυοστάτης κυκλοφορίας, ρυθμισμένος στους 12 ± 0,5 °C
Note: It is advisable to check the purity of the buffalo milk by isoelectric focusing of the plasmin-treated caseins before preparation of the standards.
Φυγόκεντρος, ρυθμιζόμενη σε 3000 g
Reagents for protein staining
Ταινίες ηλεκτροδίων (μήκος ≥ 265 mm)
Fixative
Πλαστικές σταγονομετρικές φιάλες για το διάλυμα της ανόδου και της καθόδου
Dissolve 150 g trichloroacetic acid in water and make up to 1000 ml.
Εφαρμογείς δείγματος (διαστάσεις 10 × 5 mm, διηθητικός χάρτης βισκόζης ή χαμηλής προσρόφησης πρωτεϊνών)
Destaining solution
Τρυβλία χρώσης και αποχρωματισμού από ανοξείδωτο χάλυβα ή γυαλί (π.χ. δίσκοι οργάνων, διαστάσεων 280 × 150 mm)
Dilute 500 ml methanol and 200 ml glacial acetic acid to 2000 ml with distilled water.
Ρυθμιζόμενος ομοιογενοποιητής με ράβδο (διάμετρος ατράκτου 10 mm), που λειτουργεί στις 8000 έως 20000 rpm
Note: Prepare the destaining solution fresh every day; it can be prepared by mixing equal volumes of stock solutions of 50 % (v/v) methanol and 20 % (v/v) glacial acetic acid.
Συγκολλητής μεμβράνης
Staining solutions
Μικροσιφώνια των 25 μl
Staining solution (stock solution 1)
Συμπυκνωτής κενού ή συσκευή λυοφιλίωσης
Dissolve 3,0 g Coomassie Brilliant Blue G-250 (C.I. 42655) in 1000 ml 90 % (v/v) methanol using a magnetic stirrer (approximately 45 minutes), filter through two medium-speed folded filters.
Θερμοστατούμενο υδατόλουτρο ρυθμιζόμενο στους 35 και 40 ± 1 °C με τάρακτρο
Staining solution (stock solution 2)
Πυκνόμετρο για μήκος κύματος λ = 634 nm
Dissolve 5,0 g copper sulphate pentahydrate in 1000 ml 20 % (v/v) acetic acid.
Απομόνωση καζεϊνών
Staining solution (working solution)
Σε σωλήνα φυγοκέντρου των 100 ml ζυγίζεται ποσότητα ισοδύναμη με 5 g ξηρής μάζας τυριού ή προτύπων υλικών αναφοράς, προστίθενται 60 ml απεσταγμένου νερού και το σύνολο ομογενοποιείται σε ομογενοποιητή με ράβδο (8000 έως 10000 rpm).
Mix together 125 ml of each of the stock solutions (4.11.1, 4.11.2) immediately prior to staining.
Ρυθμίζεται το pH σε 4,6 με αραιό οξικό οξύ (4.5.1) και ακολουθεί φυγοκέντρηση (5 λεπτά, 3000 g).
Note: The staining solution should be prepared on the day that it is used.
Το λίπος και ο ορός αποχύνονται, το υπόλειμμα ομογενοποιείται στις 20000 rpm με 40 ml απεσταγμένου νερού του οποίου το pH έχει ρυθμιστεί σε 4,5 με αραιό οξικό οξύ (4.5.1), προστίθενται 20 ml διχλωρομεθανίου (4.5.2) και ακολουθεί νέα ομογενοποιήσει και φυγοκέντρηση (5 λεπτά, 3000 g).
EQUIPMENT
Αφαιρείται με σπάτουλα η στιβάδα της καζεΐνης που επιπλέει μεταξύ της υδατικής και της οργανικής φάσης (βλέπε σχήμα 2) και απορρίπτονται οι δύο αυτές φάσεις.
Glass plates (265 × 125 × 4 mm); rubber roller (width 15 cm); levelling table
Η καζεΐνη ομογενοποιείται εκ νέου με 40 ml απεσταγμένου νερού (βλέπε ανωτέρω) και 20 ml διχλωρομεθανίου (4.5.2) και φυγοκεντρείται.
Gel carrier sheet (265 × 125 mm)
Η διαδικασία αυτή επαναλαμβάνεται έως ότου και οι δύο εκχυλιστικές φάσεις είναι άχρωμες (2 έως 3 φορές).
Covering sheet (280 × 125 mm).
Το πρωτεϊνικό υπόλειμμα ομογενοποιείται με 50 ml ακετόνης (4.5.3) και διηθείται μέσω πτυχωτού χάρτινου ηθμού μεσαίας ταχύτητας.
Stick on strip of adhesive tape (280 × 6 × 0,25 mm) to each long edge (see Figure 1)
Το υπόλειμμα εκπλύνεται πάνω στον ηθμό δύο φορές με 25 ml ακετόνης κάθε φορά, αφήνεται να ξηρανθεί στον αέρα ή σε ρεύμα αζώτου και κατόπιν κονιοποιείται σε γουδί.
Electrofocusing chamber with cooling plate (e.g. 265 × 125 mm) and suitable power supply (≥ 2,5 kV) or automatic electrophoresis device
Σημείωση: Οι ξηρές απομονωμένες καζεΐνες πρέπει να φυλάσσονται σε θερμοκρασία – 20 °C.
Circulation cryostat, thermostatically controlled at 12 ± 0,5 °C
Πλασμινόλυση των ß-καζεϊνών προς ενίσχυση των γ-καζεϊνών
Centrifuge, adjustable to 3000 g
Παρασκευάζεται εναιώρημα 25 mg απομονωμένων καζεϊνών (6.1.1) σε 0,5 ml ρυθμιστικού διαλύματος ανθρακικού αμμωνίου (4.7.1) και ομογενοποιείται επί 20 λεπτά, π.χ. με υπερήχους.
Electrode strips (≥ 265 mm long)
Ακολουθεί θέρμανση στους 40 °C, προσθήκη 10 μl πλασμίνης (4.7.2), ανάμιξη και επώαση στους 40 °C επί μία ώρα με συνεχή ανακίνηση.
Plastic dropping bottles for the anode and cathode solutions
Για την αναστολή του ενζύμου προστίθενται 20 μl διαλύματος ε-αμινοκαπρονικού οξέος (4.7.3) και, στη συνέχεια, 200 mg στερεάς ουρίας και 2 mg διθειοθρεϊτόλης.
Sample applicators (10 × 5 mm, viscose or low protein-adsorption filter paper)
Σημείωση: Για να προκύψουν πιο συμμετρικές ταινίες εστιασμένης καζεΐνης, συνιστάται λυοφιλίωση του διαλύματος μετά την προσθήκη του ε-αμινοκαπρονικού οξέος και, στη συνέχεια, διάλυση των υπολειμμάτων σε 0,5 ml ρυθμιστικού διαλύματος για διάλυση πρωτεϊνών (4.6).
Stainless steel or glass staining and destaining dishes (e.g. 280 × 150 mm instrument trays)
Παρασκευή των πηκτών πολυακρυλαμιδίου που περιέχουν ουρία
Adjustable rod homogenizer (10 mm shaft diameter), rpm range 8000 to 20000
Το φύλλο συγκράτησης πηκτής (5.2) κυλίεται με τη βοήθεια μερικών σταγόνων νερού πάνω σε γυάλινη πλάκα (5.1), ενώ η εξωτερική υγρασία απομακρύνεται με χαρτοπετσέτα ή χαρτομάντιλο.
Film welder
Το φύλλο κάλυψης (5.3) με αποστάτες (0,25 mm) κυλίεται κατά τον ίδιο τρόπο πάνω σε άλλη γυάλινη πλάκα.
25 μl micropipettes
Η πλάκα τοποθετείται οριζοντίως σε τραπέζι οριζοντίωσης.
Vacuum concentrator or freeze-dryer
Προστίθενται 10 μl διαλύματος TEMED (4.1.3.1) στο διάλυμα πηκτής που έχει παρασκευασθεί και απαερωθεί (4.1.2), αναδεύονται και προστίθενται 10 μl διαλύματος PER (4.1.3.2).
Thermostatically controlled water bath adjustable to 35 and 40 ± 1 °C with shaker
Το σύνολο αναμειγνύεται πλήρως και αμέσως χύνεται ομοιόμορφα στο κέντρο του φύλλου κάλυψης.
Densitometer equipment reading at λ = 634 nm
Το ένα άκρο της πλάκας συγκράτησης πηκτής (η πλευρά με το φύλλο προς τα κάτω) τοποθετείται πάνω στην πλάκα με το φύλλο κάλυψης και χαμηλώνεται αργά, έτσι ώστε να σχηματιστεί ένα υμένιο πηκτής μεταξύ των φύλλων και να απλωθεί ομαλά χωρίς φυσαλίδες (βλέπε σχήμα 3).
Isolation of caseins
Η πλάκα συγκράτησης πηκτής χαμηλώνεται τελείως με προσοχή και με τη βοήθεια μιας λεπτής σπάτουλας και πάνω της τοποθετούνται τρεις ακόμη γυάλινες πλάκες σαν βάρος.
Weigh the amount equivalent to 5 g dry mass of cheese or the reference standards into a 100 ml centrifuge tube, add 60 ml distilled water and homogenize with a rod homogenizer (8000 to 10000 rpm).
Αφού ολοκληρωθεί ο πολυμερισμός (60 λεπτά περίπου), απομακρύνεται το φύλλο συγκράτησης που φέρει την πολυμερισμένη πηκτή μαζί με το φύλλο κάλυψης, με ελαφρά κτυπήματα στις γυάλινες πλάκες.
Adjust to pH 4,6 with dil. acetic acid (4.5.1) and centrifuge (5 minutes, 3000 g).
Η οπίσθια πλευρά του φύλλου συγκράτησης καθαρίζεται επιμελώς για να απομακρυνθούν τα υπολείμματα πηκτής και η ουρία.
Decant the fat and whey, homogenize the residue at 20000 rpm in 40 ml distilled water adjusted to pH 4,5 with dil. acetic acid (4.5.1), add 20 ml dichloromethane (4.5.2), homogenize again and centrifuge (5 minutes, 3000 g).
Το “σάντουιτς” της πηκτής συσκευάζεται με συγκόλληση μέσα σε σωλήνα από πλαστική μεμβράνη και φυλάσσεται στο ψυγείο (έξι εβδομάδες κατ' ανώτατο όριο).
Remove the casein layer that lies between the aqueous and organic phases (see Figure 2) with a spatula and decant off both phases.
Σημείωση: Το φύλλο κάλυψης με τους αποστάτες μπορεί να χρησιμοποιηθεί εκ νέου.
Rehomogenise the casein in 40 ml distilled water (see above) and 20 ml dichloromethane (4.5.2) and centrifuge.
Η πηκτή πολυακρυλαμιδίου μπορεί να κοπεί σε μικρότερες διαστάσεις, κοπή που συνιστάται όταν τα δείγματα είναι λίγα ή όταν χρησιμοποιείται αυτόματη συσκευή ηλεκτροφόρησης (δύο πηκτές διαστάσεων 4,5 × 5 cm).
Repeat this procedure until both extraction phases are colourless (two to three times).
Ισοηλεκτρική εστίαση
Homogenize the protein residue with 50 ml acetone (4.5.3) and filter through a medium-speed folded filter paper.
Ο θερμοστάτης του κρυοστάτη ρυθμίζεται στους 12 °C.
Wash the residue on the filter with two separate 25 ml portions of acetone each time and allow to dry in the air or a stream of nitrogen, then pulverize finely in a mortar.
Η οπίσθια πλευρά του φύλλου συγκράτησης πηκτής επαλείφεται με κηροζίνη και στη συνέχεια ενσταλάζονται μερικές σταγόνες κηροζίνης (4.2) στο κέντρο του ψυχόμενου τμήματος.
Note: Dry casein isolates should be kept at –20 °C.
Κυλίεται κατόπιν πάνω σ' αυτό το “σάντουιτς” της πηκτής, με το φύλλο συγκράτησης προς τα κάτω, προσέχοντας να μην σχηματιστούν φυσαλίδες.
Plasmin cleavage of β-caseins to intensify γ-caseins
Σφουγγίζεται η τυχόν περίσσεια κηροζίνης και αφαιρείται το φύλλο κάλυψης.
Disperse 25 mg of isolated caseins (6.1.1) in 0,5 ml ammonium carbonate buffer (4.7.1) and homogenize for 20 minutes by e.g. using ultrasonic treatment.
Διαβρέχονται οι ταινίες ηλεκτροδίων με το διάλυμα της ανόδου και της καθόδου (4.3 και 4.4), κόβονται στο μήκος της πηκτής και τοποθετούνται στις προβλεπόμενες θέσεις (απόσταση ηλεκτροδίων 9,5 cm).
Heat to 40 °C and add 10 μl plasmin (4.7.2), mix and incubate for one hour at 40 °C with continuous shaking.
Συνθήκες ισοηλεκτρικής εστίασης:
To inhibit the enzyme add 20 μl ε-aminoproic acid solution (4.7.3), then add 200 mg of solid urea and 2 mg of dithiothreitol.
Διαστάσεις πηκτής 265 × 125 × 0,25 mm
Note: To obtain more symmetry in the focused casein bands it is advisable to freeze-dry the solution after adding the ε-aminocaproic acid and then dissolving the residues in 0,5 ml protein dissolving buffer (4.6).
Στάδιο
Preparation of the urea containing polyacrylamide gels
Τάση
With the aid of a few drops of water roll the gel carrier sheet (5.2) onto a glass plate (5.1), removing any extraneous water with paper towel or tissue.
Ένταση
Roll the cover sheet (5.3) with spacers (0,25 mm) onto another glass plate in the same way.
Ισχύς
Lay the plate horizontally on a levelling table.
Βολτώρες
Add 10 μl Temed (4.1.3.1) to the prepared and de-aerated gel solution (4.1.2), stir and add 10 μl PER-solution (4.1.3.2), mix thoroughly and immediately pour out evenly onto the centre of the cover sheet.
Προεστίαση
Place one edge of the gel carrier plate (sheet side down) on the cover sheet plate and lower it slowly so that a gel film forms between the sheets and spreads out regularly and free of bubbles (Figure 3).
μέγιστη
Carefully lower the gel carrier plate completely using a thin spatula and place three more glass plates on top of it to act as weights.
σταθερή 4
After polymerization is complete (about 60 minutes) remove the gel polymerized onto the gel carrier sheet along with the cover sheet by tipping the glass plates.
Εστίαση δείγματος
Clean the reverse of the carrier sheet carefully to remove gel residues and urea.
Τελική εστίαση
Weld the gel sandwich into a film tube and store in a refrigerator (maximum six weeks).
Σημείωση: Σε περίπτωση μεταβολής του πάχους ή του πλάτους των πηκτών, πρέπει να προσαρμόζονται κατάλληλα οι τιμές της έντασης και της ισχύος του ρεύματος (π.χ. οι τιμές της έντασης και της ισχύος διπλασιάζονται εάν χρησιμοποιηθεί πηκτή διαστάσεων 265 × 125 × 0,5 mm).
Note: The cover sheet with the spacers can be re-used.
Παράδειγμα προγραμματισμού τάσης για αυτόματη συσκευή ηλεκτροφόρησης (2 πηκτές διαστάσεων 5,0 × 4,5 cm) με ηλεκτρόδια που εφαρμόζονται κατευθείαν στην πηκτή, χωρίς ταινίες ηλεκτροδίων
The polyacrylamide gel can be cut to smaller sizes, recommended when there are few samples or if an automatic electrophoresis device is used (two gels, size 4,5 × 5 cm).
Θερμοκρασία
lsoelectric focusing
Εστίαση
Set the cooling thermostat to 12 °C.
Ο εφαρμογέας δείγματος τοποθετείται στο στάδιο 2 στις 0 Vh.
Wipe off the reverse of the gel carrier sheet with kerosene, then drip a few drops of kerosene (4.2) onto the centre of the cooling block.
Ο εφαρμογέας δείγματος απομακρύνεται στο στάδιο 2 στις 30 Vh.
Then roll the gel sandwich, carrier side down, onto it, taking care to avoid bubbles.
Χρώση πρωτεϊνών
Wipe off any excess kerosene and remove the cover sheet.
Στερέωση πρωτεϊνών
Soak the electrode strips with the electrode solutions (4.3, 4.4), cut to gel length and place in the positions provided (distance of electrodes 9,5 cm).
Απομακρύνονται οι ταινίες ηλεκτροδίων αμέσως μετά τη διακοπή του ρεύματος και η πηκτή τοποθετείται αμέσως σε τρυβλίο χρώσης/αποχρωματισμού που έχει πληρωθεί με 200 ml σταθεροποιητή (4.9), όπου και παραμένει επί 15 λεπτά υπό συνεχή ανακίνηση.
Conditions for isoelectric focusing:
Έκπλυση και χρώση της πλάκας της πηκτής
Gel size 265 × 125 × 0,25 mm
Το αντιδραστήριο στερέωσης στραγγίζεται τελείως και η πλάκα της πηκτής εκπλύνεται δύο φορές επί 30 δευτερόλεπτα με 100 ml διαλύματος αποχρωματισμού (4.10) κάθε φορά.
Step
Το διάλυμα αποχρωματισμού αποχύνεται και το τρυβλίο πληρούται με 250 ml διαλύματος χρώσης (4.11.3), το οποίο αφήνεται να ενεργήσει επί 45 λεπτά υπό ήπια ανακίνηση.
Voltage
Αποχρωματισμός της πλάκας της πηκτής
Current
Αποχύνεται το διάλυμα χρώσης, εκπλύνεται η πλάκα της πηκτής δύο φορές με 100 ml διαλύματος αποχρωματισμού (4.10) κάθε φορά και κατόπιν ανακινείται με 200 ml διαλύματος αποχρωματισμού επί 15 λεπτά.
Power
Το στάδιο αποχρωματισμού επαναλαμβάνεται τουλάχιστον δυο-τρεις φορές, μέχρις ότου το υπόβαθρο είναι διαυγές και άχρωμο.
Volt-hours
Στη συνέχεια, η πλάκα της πηκτής εκπλύνεται με απεσταγμένο νερό (δύο φορές επί 2 λεπτά) και αφήνεται να ξηρανθεί στον αέρα (2 έως 3 ώρες) ή ξηραίνεται με στεγνωτήρα μαλλιών (10 έως 15 λεπτά).
Pre-focusing
Σημείωση 2: Εάν προτιμηθεί πιο ευαίσθητη μέθοδος χρώσης με άργυρο (π.χ. αντιδραστήριο Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, κωδικός αριθ. 17-1150-01), τα δείγματα καζεΐνης που έχουν υποστεί κατεργασία με πλασμίνη πρέπει να αραιωθούν μέχρι τα 5 mg/ml.
maximum
ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ
constant 4
Η αξιολόγηση διεξάγεται με σύγκριση των πρωτεϊνικών ταινιών του άγνωστου δείγματος με εκείνες των προτύπων υλικών αναφοράς στην ίδια πηκτή.
Sample focusing
Το αγελαδινό γάλα ανιχνεύεται σε τυριά από γάλα προβάτων, αιγών ή βουβάλων και από μείγματα γάλακτος προβάτων, αιγών και βουβάλων μέσω των γ3- και γ2-καζεϊνών, των οποίων τα ισοηλεκτρικά σημεία κυμαίνονται μεταξύ των τιμών pH 6,5 και pH 7,5 (σχήματα 4α, 4β και 5).
Final focusing
Το όριο ανίχνευσης είναι κατώτερο του 0,5 %.
Note: If thickness or width of the gels are changed, the values for current and power have to be suitably adjusted (e.g. double the values for electric current and power if a 265 × 125 × 0,5 mm gel is used).
Οπτική εκτίμηση
Example of a voltage programme for an automatic electrophoresis device (2 gels of 5,0 × 4,5 cm), electrodes without strips applied directly to the gel
Πυκνομετρικός υπολογισμός
Place sample applicator in step 2 at 0 Vh.
Εφόσον υπάρχει δυνατότητα, χρησιμοποιείται πυκνόμετρο (5.19) για τον προσδιορισμό του λόγου των εμβαδών των κορυφών των βόειων γ2- και γ3-καζεϊνών προς εκείνες των αιγοπροβάτων ή/και βουβάλων (βλέπε σχήμα 5).
Remove sample applicator in step 2 at 30 Vh.
Η τιμή αυτή συγκρίνεται με το λόγο των εμβαδών των κορυφών των γ2- και γ3-καζεϊνών του προτύπου υλικού αναφοράς με περιεκτικότητα 1 % (προβάτων, αιγών) ή του προσωρινού πρότυπου υλικού του εργαστηρίου (βουβάλων) που αναλύθηκε στην ίδια πηκτή.
Protein staining
Σημείωση: Η μέθοδος παρέχει ικανοποιητικά αποτελέσματα, εφόσον υπάρχει σαφής θετική ένδειξη βόειων γ2- και γ3-καζεϊνών στο πρότυπο υλικό 1 %, όχι όμως στο πρότυπο υλικό 0 %.
Protein fixation
Σε αντίθετη περίπτωση, η διαδικασία βελτιστοποιείται με επακριβή εφαρμογή των λεπτομερειών της μεθόδου.
Remove the electrode strips immediately after turning off the power and put the gel immediately into a staining/destaining dish filled with 200 ml fixative (4.9); leave for 15 minutes, shaking continuously.
Ένα δείγμα κρίνεται θετικό, εάν οι βόειες γ2- και γ3-καζεΐνες βοοειδών ή οι αντίστοιχοι λόγοι των εμβαδών των κορυφών είναι ίσοι ή μεγαλύτεροι από το επίπεδο του προτύπου υλικού αναφοράς 1 %.
Washing and staining the gel plate
Σχεδιάγραμμα του φύλλου κάλυψης
Thoroughly drain off the fixative and wash the gel plate twice for 30 seconds each time with 100 ml destaining solution (4.10).
Πολυεστερικό φύλλο
Pour off the destaining solution and fill the dish with 250 ml staining solution (4.11.3); allow to stain for 45 minutes with gentle shaking.
Ταινία-αποστάτης
Destaining the gel plate
Σχήμα 2
Pour off the staining solution, wash the gel plate twice using a 100 ml destaining solution (4.10) each time, then shake with 200 ml destaining solution for 15 minutes and repeat the destaining step at least two or three times until the background is clear and uncoloured.
Στιβάδα καζεΐνης που επιπλέει μεταξύ υδατικής και οργανικής φάσης μετά από φυγοκέντρηση
Then rinse the gel plate with distilled water (2 × 2 minutes) and dry in the air (2 to 3 hours) or with a hairdryer (10 to 15 minutes).
Υδατική φάση
Note 1: Carry out fixing, washing, staining and destaining at 20 °C.
Καζεΐνη
Do not use elevated temperatures.
Φάση CH2Cl2
Note 2: If more sensitive silver staining (e.g. Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, Code No 17-1150-01) is preferred, plasmin-treated casein samples have to be diluted to 5 mg/ml.