natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Κύτταρα ASK (επίπεδο διέλευσης 65 ή μικρότερο) καλλιεργούνται σε υπόστρωμα L-15 το οποίο περιέχει 10 % εμβρυακό βόειο ορρό, 2 % (vol:vol) 200 mM L-γλουταμίνη και 0,08 % (vol:vol) 50 mM 2-μερκαπτοαιθανόλη σε τρυβλία πολλαπλών κοιλοτήτων και χρησιμοποιούνται με συμβολή μεγαλύτερη του 50 %.
a national reference laboratory or the EU reference laboratory for fish diseases as referred to in Annex VI to Directive 2006/88/EC.
Μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν άλλες κυτταρικές σειρές ή υπόστρωμα ανάπτυξης αποδεδειγμένης αποτελεσματικότητας.
Haemadsorption
Σε καθεμία από δύο κοιλότητες προστίθενται 225 μl υπερκείμενου υγρού καλλιέργειας για την οποία υπάρχουν υπόνοιες μόλυνσης από ιό, αναμειγνύονται και 225 μl μεταφέρονται σε δύο άλλες κοιλότητες, προκύπτει δηλαδή αραίωση 1:5.
As replication of ISAV in cell cultures does not always result in a CPE, every well shall be subject to an RT-PCR test or a haemadsorption test in accordance with this point, or an IF test in accordance with point II.2.6.
Δύο επιπλέον κοιλότητες παραμένουν χωρίς ενοφθαλμισμό, προκειμένου να χρησιμεύσουν ως μάρτυρες.
Cell culture medium shall be removed from each well, including those of positive and negative controls, and placed in labelled sterile tubes.
Τα δείγματα από κάθε ιχθυοεκμετάλλευση τυγχάνουν επεξεργασίας σε ξεχωριστά τρυβλία, όπως και ο έλεγχος για ιούς.
500 μl of a 0,2 % (vol:vol) suspension of washed rabbit or horse red blood cells, or a 0,05 % (vol:vol) suspension of washed rainbow trout or Atlantic salmon red blood cells, shall be added to each well and incubated at room temperature for 45 minutes.
Διενεργείται έλεγχος ιών με τη χρήση απομονώματος αναφοράς του ιού της ΛΑΣ.
The red blood cells shall be removed and each well shall be washed twice with L-15 medium.
Τα τρυβλία επωάζονται στους 14 ± 2 °C και εξετάζονται μικροσκοπικά μέσα σε διάστημα όχι μεγαλύτερο των επτά ημερών.
Each well shall be examined using a microscope.
Εάν παρατηρηθεί πρώιμο ΚΠΦ ή αν δεν παρατηρηθεί καθόλου ΚΠΦ εντός επτά ημερών, το επόμενο βήμα είναι η σταθεροποίηση.
The presence of clusters of red blood cells attaching to the surface of ASK cells shall be indicative of presumptive infection with an orthomyxovirus.
Οι κοιλότητες εκπλένονται με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών ιόντων (PBS) και σταθεροποιούνται μέσω επώασης με 80 % ακετόνη επί 20 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου.
If a haemadsorption test is positive, a virus identification test shall be performed immediately in accordance with point II.2.4.
Τα τρυβλία ξηραίνονται δι' αέρος και υποβάλλονται αμέσως σε χρώση ή αποθηκεύονται στους 0 έως 6 °C, για διάστημα όχι μεγαλύτερο των 24 ωρών, προτού υποβληθούν σε χρώση.
Immunofluorescence (IF)
Οι εις διπλούν κοιλότητες υποβάλλονται σε χρώση με μείγμα μονοκλωνικών αντισωμάτων (MAb) 3H6F8 και 1OC9F5 έναντι του ιού της ΛΑΣ, ή με άλλο μονοκλωνικό αντίσωμα αποδεδειγμένης αποτελεσματικότητας και ειδικότητας, αραιώνονται σε PBS και επωάζονται στους 37 ± 4 °C επί 30 λεπτά.
ASK (pass 65 or lower) shall be grown in a L-15 medium containing 10 % foetal bovine serum, 2 % (vol:vol) 200 mM L-glutamine, and 0,08 % (vol:vol) 50 mM 2-mercaptoethanol in multi-well plates and used at greater than 50 % confluence.
Αφαιρείται το μονοκλωνικό αντίσωμα και τα τρυβλία εκπλένονται τρεις φορές με 0,05 % Tween 20, σε PBS.
Other cell lines or growth medium of proven efficacy may also be used.
Σε κάθε κοιλότητα προστίθεται σύμπλοκο ισοθειοκυανικής φλουορεϊσίνης και αντι-ανοσοσφαιρίνης G ποντικιού (FITC) αραιωμένο σε PBS και ακολουθεί επώαση στους 37 ± 4 °C επί 30 λεπτά.
225 μl of putative virus-infected culture supernatant shall be added to each of two wells, mixed and 225 μl transferred to two further wells, namely a 1:5 dilution.
Σε κάθε εργαστήριο προσδιορίζονται οι βέλτιστες αραιώσεις των διαφόρων παρτίδων μονοκλωνικών αντισωμάτων και συμπλόκου FITC.
Two additional wells shall be left uninoculated to act as controls.
Απομακρύνονται τα αντισώματα και τα τρυβλία εκπλένονται τρεις φορές με 0,05 % Tween 20 σε PBS.
Samples from each fish farm site shall be handled on separate plates, as shall the virus control.
Οι κοιλότητες εξετάζονται αμέσως με τη χρήση ανεστραμμένου μικροσκοπίου κατάλληλου για μικροσκοπία ανοσοφθορισμού, με ειδικό φίλτρο διέγερσης του FITC.
A virus control shall be established using a reference isolate of ISAV.
Το αποτέλεσμα της δοκιμής θεωρείται θετικό εάν παρατηρηθούν φθορίζοντα κύτταρα.
Plates shall be incubated at 14 ± 2 °C and examined microscopically for up to 7 days.
Για να είναι έγκυρη η δοκιμή, οι θετικοί μάρτυρες πρέπει να δώσουν θετικό αποτέλεσμα και οι αρνητικοί μάρτυρες αρνητικό αποτέλεσμα.
When early CPE is observed, or if no CPE is observed within 7 days, the next step shall be fixation.
Εξέταση άλλων ιστών
Wells shall be washed with Phosphate buffered saline (PBS) and fixed by incubation with 80 % acetone for 20 minutes at room temperature.
Η τεχνική που αναφέρεται στο σημείο II.2.6 μπορεί να εφαρμοστεί σε άλλους ιστούς ιχθύων, όπως το ήπαρ, ο σπλήνας και η καρδιά, εφόσον είναι δυνατή η εναπόθεση εύλογης ποσότητας ενδοθηλιακών κυττάρων, λευκοκυττάρων ή λεμφοκυττάρων στην αντικειμενοφόρο πλάκα.
Plates shall be air-dried and stained immediately or stored at 0 to 6 °C for no more than 24 hours prior to staining.
Η διαδικασία χρώσης παραμένει η ίδια για κάθε ιστό, μολονότι για ορισμένους ιστούς μπορεί να είναι προτιμότερο να παραλειφθεί η χρώση με ιωδιούχο προπίδιο και η διαδικασία να βασιστεί στον φωτισμό φάσεως για τον προσδιορισμό των κυτταρικών τύπων που είναι παρόντες στο αποτύπωμα.
Replicate wells shall be stained with a mix of monoclonal antibodies (MAb) 3H6F8 and 1OC9F5 against ISAV, or other MAb of proven efficacy and specificity, diluted in PBS and incubated at 37 ± 4 °C for 30 minutes.
Ιστολογία
MAb shall be removed and plates washed three times with 0,05 % Tween 20 in PBS.
Τα εγκλεισμένα σε παραφίνη τμήματα κόβονται σε μέγεθος 5 μm και υφίστανται χρώση με αιματοξυλίνη και εωσίνη.
Anti-mouse IgG Fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugate diluted in PBS shall be added to each well and incubated at 37 ± 4 °C for 30 minutes.
Οι ιστολογικές αλλαγές στον κλινικά νοσούντα σολομό του Ατλαντικού ποικίλλουν, αλλά μπορεί να περιλαμβάνουν τις εξής:
The dilutions of different batches of MAb and FITC conjugate shall be optimised in each laboratory.
μεγάλο αριθμό ερυθροκυττάρων στον κεντρικό φλεβικό κόλπο και τα ελασματοειδή τριχοειδή των βραγχίων, όπου τα ερυθροκύτταρα ενδέχεται να σχηματίζουν και θρόμβους·
Antibody shall be removed and plates shall be washed three times with 0,05 % Tween 20 in PBS.
πολυεστιακά έως συρρέοντα πετέχεια ή νέκρωση ηπατοκυττάρων ή και τα δύο σε κάποια απόσταση από τα μεγαλύτερα αγγεία του ήπατος, πολυεστιακή συσσώρευση ερυθροκυττάρων σε διεσταλμένα ηπατικά κολποειδή·
Wells shall be examined immediately using an inverted microscope set up for fluorescence microscopy with a suitable filter for excitation of FITC.
συσσώρευση ερυθροκυττάρων σε αιμοφόρα αγγεία του εντερικού χορίου του βλεννογόνου και, εντέλει, αιμορραγία στο χόριο του βλεννογόνου·
A test shall be considered positive if fluorescent cells are observed.
διόγκωση του στρώματος του σπλήνα λόγω συσσώρευσης ερυθροκυττάρων·
For a test to be valid, the positive controls shall score positive and the negative controls shall score negative.
ελαφρώς πολυεστιακή έως εκτεταμένη διάχυτη εντερική αιμορραγία με σωληνοειδή νέκρωση στις περιοχές αιμορραγίας, συσσώρευση ερυθροκυττάρων στα σπειράματα του νεφρού·
Examination of other tissues
στ) ερυθροφαγοκυττάρωση στο σπλήνα και δευτερογενείς αιμορραγίες στο ήπαρ και το νεφρό.
The technique referred to in point II.2.6 may be applied to other fish tissues such as liver, spleen and heart providing a reasonable quantity of endothelial cells, leucocytes or lymphocytes can be deposited on the slide.
Ανοσοϊστοχημεία (IHC)
The staining procedure shall remain the same for each tissue, although for some tissues it may be preferable to omit the propidium iodide staining and rely on the phase illumination to identify the cell types present in the imprint.
Χρησιμοποιούνται πολυκλωνικά αντισώματα έναντι νουκλεοπρωτεϊνών του ιού της ΛΑΣ σε τμήματα παραφίνης από ιστό σταθεροποιημένο σε φορμαλίνη.
Histology
Τα όργανα που πρόκειται να εξεταστούν είναι ο μεσόνεφρος και η καρδιά (μεταβατική περιοχή που συμπεριλαμβάνει και τους τρεις θαλάμους καθώς και τις βαλβίδες).
Paraffin-embedded sections shall be cut at 5 μm and stained using haematoxylin and eosin.
Ύποπτες περιπτώσεις λόγω παθολογικών ενδείξεων επιβεβαιώνονται με θετικό έλεγχο IHC.
Histological changes in clinically diseased Atlantic salmon are variable, but may include the following:
Οι ιστολογικές τομές προετοιμάζονται σύμφωνα με τις τυπικές μεθόδους.
numerous erythrocytes in the central venous sinus and lamellar capillaries of the gills, where erythrocyte thrombi also may be formed;
Προετοιμασία των τμημάτων ιστών
multifocal to confluent petechiae or hepatocyte necrosis or both at some distance from larger vessels in the liver; multifocal accumulation of erythrocytes in dilated hepatic sinusoids;
Οι ιστοί σταθεροποιούνται σε ουδέτερο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλδεΰδης 10 % για τουλάχιστον μία ημέρα, αφυδατώνονται σε διαβαθμισμένη σειρά αιθανόλης, υφίστανται διαύγαση σε ξυλόλιο και εγκλείονται σε παραφίνη, σύμφωνα με τα καθιερωμένα πρωτόκολλα.
accumulation of erythrocytes in blood vessels of the intestinal lamina propria and eventually haemorrhage into the lamina propria;
Τμήματα πάχους περίπου 5 μm (για IHC το δείγμα τοποθετείται σε αντικειμενοφόρες πλάκες επιστρωμένες με πολυ-L-λυσίνη) θερμαίνονται στους 56 °C έως 58 °C (μέγιστη θερμοκρασία 60 °C) επί 20 λεπτά, υφίστανται αποκήρωση σε ξυλόλιο, επανενυδατώνονται μέσω διαβαθμισμένης σειράς αιθανόλης και υφίστανται χρώση με αιματοξυλίνη και εωσίνη για έλεγχο των μορφολογικών αλλαγών λόγω παθολογικών καταστάσεων και της IHC σύμφωνα με το σημείο (2).
spleen stroma distended by erythrocyte accumulation;
Διαδικασία χρώσης για IHC
slight multifocal to extensive diffuse interstitial haemorrhage with tubular necrosis in the haemorrhagic areas, erythrocyte accumulation in the glomeruli in the kidney;
Όλες οι επωάσεις διεξάγονται σε θερμοκρασία δωματίου σε πλατφόρμα δόνησης, εκτός εάν ορίζεται διαφορετικά στην παρούσα απόφαση:
erythrophagocytosis in the spleen and secondary haemorrhages in liver and kidney.
η ανάκτηση αντιγόνου πραγματοποιείται με βρασμό των τμημάτων σε ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικών 0,1 M, pH 6,0 επί 2 × 6 λεπτά και, στη συνέχεια, αποκλεισμό με 5 % αποξηραμένο γάλα χωρίς λίπος και ορό αίγας 2 % σε 50 mM TBS (TBS: Tris/HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,6) επί 20 λεπτά.
Immunohistochemistry (IHC)
Στη συνέχεια, τα τμήματα επωάζονται ολονυχτίς με το κύριο αντίσωμα (μονοειδικά αντισώματα κουνελιού έναντι νουκλεοπρωτεΐνης του ιού της ΛΑΣ) αραιωμένο σε TBS με 1 % αποξηραμένο γάλα χωρίς λίπος και ακολουθούν τρεις πλύσεις σε TBS με 0,1 % Tween 20.
Polyclonal antibody against ISAV nucleoprotein shall be used on paraffin sections from formalin-fixed tissue.
Για την ανίχνευση των δεσμευμένων αντισωμάτων, τα τμήματα επωάζονται με αντισώματα έναντι ανοσοσφαιρίνης G κουνελιού συζευγμένα με αλκαλική φωσφατάση επί 60 λεπτά.
The organs to be examined shall be mid-kidney and heart (transitional area including all three chambers and valves).
Μετά από μια τελική πλύση, προστίθενται Fast Red (1 mg ml– 1) και φωσφορική ναφθόλη AS-MX (0,2 mg ml– 1) με 1 mM λεβαμιζόλη σε 0,1 M TBS (pH 8,2) και η αντίδραση αναπτύσσεται επί 20 λεπτά.
Suspected cases due to pathological signs shall be verified with a positive IHC.
Στη συνέχεια, τα τμήματα εκπλένονται με νερό βρύσης και υφίστανται αντιχρώση με αιματοξυλίνη Harris και στερεώνονται σε υδατικό υπόστρωμα στερέωσης.
Histological sections shall be prepared in accordance with standard methods.
Σε κάθε προετοιμασία συμπεριλαμβάνονται τμήματα ιστών θετικά για τον ιό της ΛΑΣ και αρνητικά για τον ιό της ΛΑΣ ως μάρτυρες.
Preparation of tissue sections
Ερμηνεία του αποτελέσματος της IHC
The tissues shall be fixed in neutral phosphate-buffered 10 % formalin for at least 1 day, dehydrated in a graded ethanol series, cleared in xylene and embedded in paraffin, according to standard protocols.
Η ερμηνεία του αποτελέσματος της δοκιμής IHC ορίζεται στα σημεία α) και β):
Approximately 5 μm thick sections (for IHC placed on poly-L-lysine-coated slides) shall be heated at 56 °C to 58 °C (maximum 60 °C) for 20 minutes, dewaxed in xylene, rehydrated through a graded ethanol series, and stained with haematoxylin and eosin for pathomorphology and IHC in accordance with point (2).
Τα τμήματα του μάρτυρα θεωρούνται θετικά όταν η κυτταροπλασματική και ενδοπυρηνική χρώση των ενδοθηλιακών κυττάρων στα αιμοφόρα αγγεία του ενδοκαρδίου στα τμήματα του μάρτυρα εμφανίζει σαφές κόκκινο (ερυθρωπό) χρώμα.
Staining procedure for IHC
Ένα τμήμα του εξεταζόμενου δείγματος θα θεωρείται θετική μόνο εάν υπάρχει σαφής, ενδοπυρηνική κόκκινη χρώση των ενδοθηλιακών κυττάρων.
All incubations shall be carried out at room temperature on a rocking platform, unless otherwise provided for in this decision:
Τα τμήματα του μάρτυρα θεωρούνται αρνητικά αν δεν εμφανίζουν καμία σημαντική αντίδραση χρώσης.
antigen retrieval shall be done by boiling sections in 0,1 M citrate buffer pH 6,0 for 2 × 6 minutes followed by blocking with 5 % non-fat dry milk and 2 % goat serum in 50 mM TBS (TBS; Tris/HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,6) for 20 minutes;
Δεδομένου ότι η ενδοπυρηνική τοποθέτηση αφορά συγκεκριμένα τη νουκλεοπρωτεΐνη του ορθομυξοϊού κατά τη διάρκεια ενός σταδίου της ιικής αντιγραφής αλλά η ταυτόχρονη κυτταροπλασματική χρώση είναι συχνά επικρατούσα, η κυτταροπλασματική χρώση και άλλα μοτίβα χρώσης χωρίς ενδοπυρηνική τοποθέτηση θεωρούνται μη ειδικά ή μη καταληκτικά.
sections shall then be incubated overnight with primary antibody (monospecific rabbit antibody against ISAV nucleoprotein) diluted in TBS with 1 % non-fat dry milk, followed by three washes in TBS with 0,1 % Tween 20;
Οι πιο έντονες θετικές αντιδράσεις χρώσης συνήθως λαμβάνονται στα ενδοθηλιακά κύτταρα της καρδιάς και του νεφρού.
for detection of bound antibodies, sections shall be incubated with Alkaline phosphatase-conjugated antibodies to rabbit IgG for 60 minutes.
Οι αντιδράσεις χρώσης στα ενδοθηλιακά κύτταρα σε πολύ εκτεταμένες αιμορραγικές αλλοιώσεις ενδέχεται να είναι ασήμαντες ή να απουσιάζουν, πιθανώς λόγω της λύσης των προσβεβλημένων ενδοθηλιακών κυττάρων.
Following a final wash, Fast Red (1 mg ml– 1) and Naphthol AS-MX phosphate (0,2 mg ml– 1) with 1 mM Levamisole in 0,1 M TBS (pH 8,2) shall be added to develop for 20 minutes.
ΛΕΠΤΟΜΕΡΕΙΣ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΑΙ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΕΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΠΙΤΗΡΗΣΗ ΚΑΙ ΕΠΙΒΕΒΑΙΩΣΗ ΛΟΙΜΩΞΗΣ ΑΠΟ MARTEILIA REFRINGENS
Sections shall then be washed in tap water before counterstaining with Harris haematoxylin and mounted in aqueous mounting medium.
I.
ISAV positive and ISAV negative tissue sections shall be included as controls in every setup.
Λεπτομερείς διαγνωστικές μέθοδοι και διαδικασίες για τη διάγνωση λοίμωξης από Marteilia refringens
Interpretation of the result of IHC
Κατά τη διενέργεια της δειγματοληψίας και των εργαστηριακών εξετάσεων για τους σκοπούς της απόκτησης ή διατήρησης υγειονομικού καθεστώτος όσον αφορά τη λοίμωξη από Marteilia refringens, όπως ορίζεται στο παράρτημα I μέρος 4 τμήμα I ή για τους σκοπούς της επιβεβαίωσης ή του αποκλεισμού της παρουσίας της εν λόγω ασθένειας που περιλαμβάνεται στον κατάλογο σύμφωνα με το άρθρο 57 στοιχείο β) της οδηγίας 2006/88/ΕΚ, με τη χρήση των διαγνωστικών μεθόδων που προβλέπονται στο παράρτημα I μέρος 4 τμήμα II, εφαρμόζονται οι λεπτομερείς διαγνωστικές μέθοδοι και διαδικασίες που προβλέπονται στα σημεία I.1, I.2 και I.3 του παρόντος μέρους.
The interpretation of the result of the IHC test shall be as set out in points (a) and (b):
Τρόπος δειγματοληψίας
control sections shall be considered as positive, when it is observed that the control sections have clearly visible red-coloured (reddish) cytoplasmic and intranuclear staining of endothelia cells in blood vessels of endocardium.
Λαμβάνεται δείγμα από ανοιχτά ή πρόσφατα νεκρωθέντα μαλάκια βάσει προτεραιότητας, προκειμένου να αυξηθεί η πιθανότητα εύρεσης προσβεβλημένων ζώων.
A test sample section shall only be regarded as positive if such clear, intranuclear red staining of endothelial cells is found;
Μετά τη δειγματοληψία, τα στρείδια ή τα μύδια διατηρούνται στους 4 °C ή στο ψυγείο επάνω σε πάγο για 24 ώρες το μέγιστο εάν τα δείγματα περιλαμβάνουν ανοιχτά μαλάκια και για έως 72 ώρες στην αντίθετη περίπτωση, μέσα σε πλαστική σακούλα που φέρει επισήμανση, η οποία περιλαμβάνει στοιχεία που αφορούν τη φύση και την προέλευση των στρειδιών ή των μυδιών.
control sections shall be considered as negative if they don't have any significant colour reaction.
Τα ανοικτά ή πρόσφατα νεκρωθέντα μαλάκια διατηρούνται ξεχωριστά από άλλα μαλάκια.
Since the intranuclear localisation is particular to the orthomyxovirus nucleoprotein during a stage of virus replication but concurrent cytoplasmic staining is often dominant, cytoplasmic and other staining patterns without intranuclear localisation shall be considered as nonspecific or inconclusive.
Για τη διάγνωση του Marteilia refringens μέσω ιστολογικής ανάλυσης χρησιμοποιείται τμήμα ιστών πάχους 3 έως 5 mm που περιλαμβάνει βράγχια και καρδιακό ιστό.
The strongest positive staining reactions are usually obtained in endothelial cells of heart and kidney.
Ένα τμήμα του πεπτικού αδένα χρησιμοποιείται για μερικές δοκιμές, συμπεριλαμβανομένων των αποτυπωμάτων και της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR).
Endothelial staining reactions within very extensive haemorrhagic lesions may be slight or absent, possibly because of lysis of infected endothelial cells.
Τεχνικές μικροσκοπίου
DETAILED DIAGNOSTIC METHODS AND PROCEDURES FOR THE SURVEILLANCE AND CONFIRMATION OF INFECTION WITH MARTEILIA REFRINGENS
Κυτταρολογία (κυτταρολογικό αποτύπωμα)
I. Detailed diagnostic methods and procedures for the diagnosis of infection with Marteilia refringens
Μετά την ξήρανση των ιστών του πεπτικού αδένα σε απορροφητικό χαρτί, πραγματοποιούνται αρκετά αποτυπώματα σε μια αντικειμενοφόρο πλάκα.
When sampling and laboratory examination are carried out for the purpose of obtaining or maintaining a health status with regard to infection with Marteilia refringens as set out in Section I of Part 4 of Annex I or to confirm or rule out the presence of that listed disease in accordance with Article 57(b) of Directive 2006/88/EC, using the diagnostic methods set out in Section II of Part 4 of Annex I, the detailed diagnostic methods and procedures set out in points I.1, I.2 and I.3 of this Part shall apply.
Οι αντικειμενοφόρες πλάκες ξηραίνονται δι' αέρος, σταθεροποιούνται σε μεθανόλη ή απόλυτη αιθανόλη και υφίστανται χρώση με ένα εμπορικά διαθέσιμο κιτ χρώσης του αίματος, όπως το Diff-Quik®/Hemacolor®, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.
Sampling procedure
Μετά την έκπλυση σε νερό βρύσης και την ξήρανση, οι αντικειμενοφόρες πλάκες καλύπτονται με μια καλυπτρίδα με τη χρήση κατάλληλης συνθετικής ρητίνης.
Gaping or freshly dead individual molluscs shall be sampled by priority, to increase the chances of finding infected animals.
Οι αντικειμενοφόρες πλάκες αρχικά εξετάζονται σε μεγέθυνση × 200 και, στη συνέχεια, σε μεγέθυνση × 1000 με τη χρήση ελαίου κατάδυσης.
Once sampled, oysters or mussels shall be maintained at 4 °C or on refrigerated ice for no more than 24 hours if samples include gaping molluscs and no more than 72 hours if not, in a plastic bag including a label with details related to the nature and the origin of the oysters or mussels.
Θετικό αποτέλεσμα θεωρείται η παρουσία κυττάρων με μέγεθος που κυμαίνεται από 30 έως 40 μm.
Gaping or freshly dead molluscs shall be maintained separately from other molluscs.
Στο κυτταρόπλασμα εμφανίζονται χρωσμένα τα βασεόφιλα, ενώ στον πυρήνα τα ηωσινόφιλα.
A 3 to 5 mm thick section of tissues including gills and heart tissue shall be used for the diagnostic of Marteilia refringens by histology.
Παρατηρούνται ωχρά φωτοστέφανα γύρω από μεγάλα, έντονα χρωσμένα (διαθλαστικά) κοκκία και, σε μεγαλύτερα κύτταρα, παρατηρείται κύτταρο εντός κυτταρικών διαμορφώσεων.
A piece of digestive gland shall be used for some tests, including imprints and polymerase chain reaction (PCR).
Η τεχνική δεν παρουσιάζει ειδικότητα ως προς το είδος των παρασίτων.
Microscopic techniques
Τμήματα ιστού που περιλαμβάνουν βράγχια, πεπτικό αδένα, μανδύα και γονάδες σταθεροποιούνται για τουλάχιστον 24 ώρες σε υλικό σταθεροποίησης Davidson και ακολουθεί η συνήθης επεξεργασία για ιστολογική εξέταση σε μπλοκ παραφίνης και χρώση, για παράδειγμα αιματοξυλίνη και εωσίνη.
Cytology (imprint cytology)
Η μικροσκοπική παρατήρηση πραγματοποιείται αυξάνοντας τη μεγέθυνση σταδιακά έως τη μεγέθυνση × 1000.
After drying digestive gland tissues on absorbent paper, several imprints shall be made on a glass slide.
Θετικό αποτέλεσμα θεωρείται η παρουσία κυττάρων με μέγεθος που κυμαίνεται από 4 έως 40 μm.
Slides shall be air-dried, fixed in methanol or in absolute ethanol and stained using a commercially available blood-staining kit such as Diff-Quik®/Hemacolor®, in accordance with the manufacturer's instructions.
Τα αρχικά στάδια της λοίμωξης συνίστανται από σφαιρικά έως επιμηκυσμένα πολυπύρηνα κύτταρα.
After rinsing in tap water and drying, the slides shall be mounted with a cover-slip using an appropriate synthetic resin.
Αυτά συναντώνται κυρίως στο επιθήλιο του οισοφάγου και του στομάχου, και μερικές φορές και στις χειλικές προσακτρίδες.
The slides shall be observed first at × 200 magnification and then under oil immersion at × 1000 magnification.
Η σπορογένεση περιλαμβάνει κυτταρικές διαιρέσεις εντός των κυττάρων και πραγματοποιείται στα σωληνάρια και τους πόρους του πεπτικού αδένα.
A positive result shall be the observation of cells ranging in size up to between 30 to 40 μm.
Διαθλαστικά κοκκία εμφανίζονται στην πορεία της σπορογένεσης, ωστόσο δεν παρατηρούνται στα αρχικά στάδια.
The cytoplasm stains basophilic, whereas the nucleus stains eosinophilic.
Στα προχωρημένα στάδια της λοίμωξης, παρατηρούνται ελεύθερα σποραγγεία στον αυλό του πεπτικού σωλήνα.
Pale halos around large, strongly stained (refringent) granules and, in larger cells, cell within cell arrangements are observed.
Το χρώμα των κοκκίων κυμαίνεται από βαθύ πορτοκαλί έως βαθύ κόκκινο.
The technique is not parasite species specific.
Μοριακές τεχνικές
Sections of tissue that include gills, digestive gland, mantle, and gonad shall be fixed for at least 24 hours in Davidson's fixative followed by normal processing for paraffin histology and staining, for example with haematoxylin and eosin.
Μπορούν να χρησιμοποιηθούν κιτ εξαγωγής DNA, τα οποία διατίθενται στο εμπόριο και συνήθως παράγουν DNA υψηλής ποιότητας κατάλληλο για χρήση με τα πρωτόκολλα PCR που περιγράφονται στο σημείο I.3.2.
Observations shall be made at increasing magnifications up to × 1000.
Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)
A positive result shall be the observation of cells ranging in size from 4 up to 40 μm.
Έχουν αναπτυχθεί και δημοσιευθεί αρκετά πρωτόκολλα PCR.
Early stages consist of multinucleate, spheric to elongated cells.
Χρησιμοποιούνται εκκινητές PCR που στοχεύουν την εσωτερική μεταγραφόμενη διαχωριστική περιοχή (ITS1) καθώς έχουν τη δυνατότητα να ενισχύουν μόνο το M. refringens.
These are mainly found in the epithelium of oesophagus and stomach and sometimes of labial palps.
Η PCR πραγματοποιείται σε όγκο 50 μl.
Sporulation involves divisions of cells within cells and takes place in the digestive gland tubules and ducts.
Τα μείγματα PCR αποτελούνται από ρυθμιστικό διάλυμα [500 mM KCl, 100 mM Tris/HCl (pH 9,0 στους 25 °C) και 1 % Triton® X-100], 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM μείγματος dNTP, 1 μM πρόσθιων και αντίστροφων εκκινητών, 0,02 μονάδες μl– 1 Taq DNA πολυμεράση και 10 έως 100 ng του εξαχθέντος DNA.
Refringent granules appear in the course of sporulation, but are not observed in early stages.
Μετά την αποδιάταξη του DNA στους 94 °C επί 5 λεπτά, εκτελούνται 30 κύκλοι ως εξής: αποδιάταξη στους 94 °C για 1 λεπτό, πρόσδεση των εκκινητών στους 55 °C για 1 λεπτό και επιμήκυνση στους 72 °C για 1 λεπτό ανά χίλια ζεύγη βάσεων (kbp).
In late phases of infection, sporangia are observed free in the lumen of the digestive tract.
Εκτελείται ένα τελικό βήμα επιμήκυνσης επί 10 λεπτά στους 72 °C.
The granules can range from deep orange to deep red.