natgillin/translations-raw huggingface dataset:
θερμοκρασία κατά τον χρόνο συλλογής,
Dunnett test
αλατότητα,
variances stabilising transform?
χρόνος που μεσολάβησε μεταξύ της συλλογής και της χρήσης του δείγματος στη δοκιμή.
Variances unequal Variances equal No Yes
Εάν η περιεκτικότητα σε DOC του δείγματος θαλάσσιου νερού αποδειχθεί υψηλή (παράγραφος 8), συνιστάται το θαλάσσιο νερό να υφίσταται παλαίωση για περίπου μία εβδομάδα πριν από τη χρήση.
Yes Step-down trend test on replicate means
Η παλαίωση πραγματοποιείται με τη φύλαξη του δείγματος κάτω από αερόβιες συνθήκες στη θερμοκρασία δοκιμής, είτε στο σκοτάδι είτε σε διάχυτο φως.
<=3 reps per conc
Εάν είναι απαραίτητο, εφαρμόζεται ήπιος αερισμός για τη διατήρηση των αερόβιων συνθηκών.
Normalising transform?
Κατά τη διάρκεια της παλαίωσης, η περιεκτικότητα της ευκόλως αποικοδομήσιμης οργανικής ύλης μειώνεται.
Nested ANOVA not normal
Στην κυκλική δοκιμή (3), δεν αποδείχθηκε καμία διαφορά μεταξύ του δυναμικού αποικοδόμησης των παλαιωμένων και προσφάτως συλλεγμένων δειγμάτων θαλάσσιου νερού.
Nested ANOVA normal Monotone
Πριν από τη χρήση του δείγματος, το θαλάσσιο νερό υποβάλλεται σε προκατεργασία για την αφαίρεση των χονδρόκοκκων σωματιδίων, π.χ. με διήθηση μέσω ηθμού νάιλον ή μέσω αδρού χάρτινου ηθμού (όχι μεμβράνη ή φίλτρα GF-C) ή μέσω καθίζησης και μετάγγισης.
Drop water control
Πρέπει να αναφέρεται η διαδικασία που χρησιμοποιήθηκε.
Dunn test
Σε περίπτωση παλαίωσης, η διαδικασία προκατεργασίας διεξάγεται μετά την παλαίωση.
Step-down Jonckheere or Williams' test
Διαλύματα παρακαταθήκης για ανόργανα θρεπτικά συστατικά
Rep means not normal or not homogenous
Παρασκευάζονται τα ακόλουθα διαλύματα παρακαταθήκης, με χρήση αντιδραστηρίων αναλυτικής καθαρότητας:
Rep means not normally distributed
Δισόξινο ορθοφωσφορικό κάλιο, KH2PO4
Combine controls, retains subgroups
Μονόξινο ορθοφωσφορικό κάλιο, K2HPO4
Compare controls using Wilcoxon or T-test.
Διένυδρο μονόξινο ορθοφωσφορικό νάτριο, Na2HPO4 · 2H2O
Do controls differ?
Χλωριούχο αμμώνιο, NH4Cl
Both solvent and non-solvent control are present
Διαλύεται σε όγκο 1 λίτρου με απεσταγμένο νερό.
Statistical Flow Chart for sex ratio analysis
Χλωριούχο ασβέστιο, CaCl2
Apply step-down Jonckheere-Terpstra test (+) to determine NOEC
Επταένυδρο θειικό μαγνήσιο, MgSO4 · 7H2O
Dunn or Mann-Whitney U-test w/Bonferroni-Holm adjustment to determine NOEC
Εξάνυδρος χλωριούχος σίδηρος (III), FeCl3 · 6H2O
Use Dunnett test if homogenous variances (*), Tamhane-Dunnett (T3) test otherwise, to determine NOEC
Μπορεί να αποτραπεί ο σχηματισμός ιζήματος στο διάλυμα (δ) με την προσθήκη μίας σταγόνας συμπυκνωμένου HCl ή 0,4 g αιθυλενοδιαμινοτετραοξικού οξέος (EDTA, δινάτριο άλας) ανά λίτρο.
Are data normally distributed?
Εάν σχηματιστεί ίζημα στο διάλυμα παρακαταθήκης, παρασκευάζεται καινούριο διάλυμα.
Are data consistent with monotone dose-response?
Παρασκευή του μέσου δοκιμής
(‡) Or other agreed control selection
Προστίθεται 1 ml από κάθε ένα από τα παραπάνω διαλύματα παρακαταθήκης ανά λίτρο προκατεργασμένου θαλάσσιου νερού.
After arcsin square-root transform
Δεν προστίθεται ειδικό εμβόλιο επιπλέον των μικροοργανισμών που υπάρχουν ήδη στο θαλάσσιο νερό.
(+) With fewer than 5 experimental units per treatment exact J-T or M-W test should be used if available
Προσδιορίζεται (προαιρετικά) στο μέσο δοκιμής του θαλάσσιου νερού ο αριθμός των ετεροτρόφων που σχηματίζουν αποικίες (και κατά προτίμηση και στα αρχικά δείγματα θαλάσσιου νερού), π.χ. μέσω μέτρησης της περιεκτικότητας σε μικρόβια (plate count), με χρήση του θρεπτικού υλικού Marine Agar.
Combine controls
Αυτό είναι ιδιαίτερα επιθυμητό για δείγματα από παράκτιες ή μολυσμένες περιοχές.
Drop water control (‡)
Ελέγχεται η ετεροτροφική μικροβιακή δραστηριότητα στο θαλάσσιο νερό με τη διεξαγωγή μιας δοκιμής με ουσία αναφοράς.
Compare controls using t-Test.
Προετοιμασία των φιαλών
Is solvent used?
Πριν από τη χρήση, όλα τα γυάλινα σκεύη πρέπει να καθαρίζονται πάρα πολύ καλά, όχι απαραιτήτως να αποστειρώνονται (π.χ. με τη χρήση αλκοολικού διαλύματος υδροχλωρικού οξέος), να εκπλένονται και να στεγνώνονται για την αποφυγή μόλυνσης από κατάλοιπα προηγούμενων δοκιμών.
Appendix 9
Οι φιάλες πρέπει επίσης να καθαρίζονται πριν από την πρώτη χρήση.
Guidance for tissue sampling for genetic sex determination and for genetic sex determination by PCR-method
Οι υπό δοκιμή ουσίες αξιολογούνται ταυτόχρονα σε διπλές φιάλες, μαζί με μία φιάλη για την ουσία αναφοράς.
Tissue sampling, preparation and storage before determination of genetic sex by PCR-method in medaka (Prepared by the Laboratory for Aquatic Organisms of Bayer CropScience AG)
Διεξάγεται μια δοκιμή τυφλού, εις διπλούν, που δεν περιέχει ούτε υπό δοκιμή ουσία ούτε ουσία αναφοράς για τον καθορισμό των τυφλών δειγμάτων της ανάλυσης.
With fine scissors the anal or the dorsal fin will be cut off in each individual fish and placed into a tube filled with 100 μl of extraction-buffer 1 (details on buffer preparation see below).
Οι υπό δοκιμή ουσίες διαλύονται στο μέσο της δοκιμής.
The scissors will be cleaned after each single fish in a beaker filled up with distilled H2O and dried with a paper tissue.
Η προσθήκη τους μπορεί να γίνει με πρακτικό τρόπο μέσω ενός συμπυκνωμένου διαλύματος παρακαταθήκης για να επιτευχθούν οι επιθυμητές αρχικές συγκεντρώσεις, κατά κανόνα, των 5-40 mg DOC/l.
Now the fin-tissues will be homogenised by a micro tube teflon pistil for the lysis of cells.
Διεξάγεται δοκιμή της ουσίας αναφοράς, κατά κανόνα, σε αρχική συγκέντρωση των 20 mg DOC/l.
For each tube a new pistil will be used to prevent any contaminations.
Εάν χρησιμοποιούνται διαλύματα παρακαταθήκης της υπό δοκιμή ουσίας ή/και της ουσίας αναφοράς, πρέπει να διασφαλίζεται ότι δεν τροποποιείται σημαντικά η αλατότητα του μέσου του θαλάσσιου νερού.
The pistils will be placed overnight in 0,5 M NaOH, rinse for 5 minutes in distilled H2O and stored in ethanol or sterile after autoclave until use.
Εάν αναμένονται ή δεν μπορούν να αποκλειστούν τοξικές επιδράσεις, ίσως θα ήταν σκόπιμο να συμπεριληφθεί ένα πείραμα αναστολής, εις διπλούν, στον σχεδιασμό της δοκιμής.
It is also possible to store the fin tissue without any extraction-buffer 1 on dry-ice and then at – 80 °C refrigerator to prevent any degeneration of the DNA.
Η υπό δοκιμή ουσία και η ουσία αναφοράς προστίθενται στο ίδιο δοχείο, ενώ η συγκέντρωση της ουσίας αναφοράς είναι συνήθως ίδια με αυτήν της δοκιμής-μάρτυρα (δηλ. 20 mg DOC/l) ώστε να είναι δυνατή η σύγκριση.
But the extraction runs better, if you extract the DNA at the same time (handling see above; samples should be thawed on ice after storaging at – 80 °C before the buffer will be filled in the tubes).
Κατανέμονται επαρκείς ποσότητες των διαλυμάτων δοκιμής στις φιάλες Erlenmeyer (μια πρακτική ποσότητα είναι περίπου το μισό του όγκου της φιάλης) και, στη συνέχεια, κάθε φιάλη καλύπτεται με ένα χαλαρό κάλυμμα (π.χ. αλουμινόχαρτο) ώστε να είναι δυνατή η ανταλλαγή αερίων μεταξύ της φιάλης και του αέρα του περιβάλλοντος.
After homogenizing all tubes will be placed in a water bath and boiled for 15 minutes at 100 °C.
(Τα βύσματα από υαλοβάμβακα δεν είναι κατάλληλα εάν διεξάγεται ανάλυση DOC).
Then 100 μl of the extraction buffer 2 (details on buffer preparation see below) will be pipetted into each tube.
Τα δοχεία τοποθετούνται στο τάρακτρο και ακολουθεί συνεχής και ήπια ανάδευση (π.χ. στις 100 σ.α.λ.) καθ' όλη τη διάρκεια της δοκιμής.
The samples will be stored at room temperature for 15 minutes and in the meantime they will be sometimes gently shaken by hand.
Απαιτείται έλεγχος της θερμοκρασίας (15-20 °C με αποκλίσεις όχι μεγαλύτερες από ± 2 °C) και προστασία των δοχείων από το φως για την αποφυγή ανάπτυξης φυκών.
Afterwards all tubes will be placed in the water bath again and boiled for another 15 minutes at 100 °C.
Πρέπει να διασφαλίζεται ότι ο αέρας είναι απαλλαγμένος από τοξικά υλικά.
Until further analysis the tubes will be frozen at – 20 °C.
Φυσικοχημική δοκιμή-μάρτυρας (προαιρετική)
Buffer preparation
Εάν υπάρχει υποψία αβιοτικής αποικοδόμησης ή μηχανισμών απώλειας, όπως υδρόλυση (αποτελεί πρόβλημα μόνο για ειδική ανάλυση), πτητικότητα ή προσρόφηση, θα ήταν σκόπιμη η διεξαγωγή ενός φυσικοχημικού πειράματος ελέγχου.
PCR-buffer 1:
Αυτό μπορεί να διεξαχθεί με την προσθήκη χλωριούχου υδραργύρου (II) (HgCl2) [10] (50-100 mg/l) στα δοχεία με την υπό δοκιμή ουσία, προκειμένου να διακοπεί η μικροβιακή δραστηριότητα.
500 mg N-Lauroylsarcosine (e.g. Merck KGaA, Darmstadt, GE)
Μια σημαντική μείωση της συγκέντρωσης του DOC ή της ειδικής ουσίας στη φυσικοχημική δοκιμή-μάρτυρα υποδεικνύει την παρουσία αβιοτικών μηχανισμών απομάκρυνσης.
ad 100 ml dest.
(Εάν χρησιμοποιείται χλωριούχος υδράργυρος, θα πρέπει να δίνεται προσοχή στις αλληλεπιδράσεις ή στη δηλητηρίαση από καταλύτη κατά την ανάλυση DOC.)
→ autoclave
Αριθμός φιαλών
PCR-buffer 2:
Σε μια τυπική εκτέλεση, χρησιμοποιούνται οι ακόλουθες φιάλες:
20 g Chelex (e.g. Biorad, Munich, GE)
Φιάλες 1 και 2 περιέχουν την υπό δοκιμή ουσία (εναιώρημα δοκιμής),
To swell in 100 ml dest.
Φιάλες 3 και 4 περιέχουν μόνο θαλάσσιο νερό (τυφλό),
Determination of genetic sex (by PCR-method) in medaka (Prepared by the Laboratory for Aquatic Organisms of Bayer CropScience AG and Universität Würzburg Biozentrum)
Φιάλη 5 περιέχει την ουσία αναφοράς (μάρτυρας διαδικασίας),
The prepared and frozen tubes (described in the above section) will be thawed on ice.
Φιάλη 6 περιέχει την υπό δοκιμή ουσία και την ουσία αναφοράς (μάρτυρας τοξικότητας) — προαιρετική,
After that, they will be centrifuged using an Eppendorf centrifuge (30 sec at max. speed, at room temperature).
Φιάλη 7 περιέχει την υπό δοκιμή ουσία και τον φορέα αποστείρωσης (στείρος αβιοτικός μάρτυρας) — προαιρετική.
For the PCR, the clear supernatant separated from the precipitate will be used.
Ανάλυση DOC
It has absolutely to be avoided that any traces of Chelex (localized in the precipitate) are transferred to the PCR reaction, because this will interfere with the “Taq”-polymerase activity.
Κατά τη διάρκεια της δοκιμής, τα δείγματα αποσύρονται σε κατάλληλα χρονικά διαστήματα για την ανάλυση DOC (προσάρτημα 1).
The supernatant will be used directly or can be stored frozen (at – 20 °C) and rethawed again in several cycles without negative impact on the DNA for later analyses.
Τα δείγματα πρέπει πάντα να λαμβάνονται κατά την έναρξη της δοκιμής (ημέρα 0) και την 60η ημέρα.
Preparation of the “Reaction Mix” (25 μl per sample):
Απαιτούνται συνολικά τουλάχιστον πέντε δείγματα για να περιγραφεί η χρονική πορεία της αποικοδόμησης.
Volume
Δεν είναι δυνατόν να καθοριστεί πάγιο χρονοδιάγραμμα για τη δειγματοληψία, δεδομένου ότι η ταχύτητα βιοαποικοδόμησης ποικίλλει.
Final Concentration
Ο προσδιορισμός DOC πρέπει να διεξάγεται εις διπλούν σε κάθε δείγμα.
Template DNA
Ο απαιτούμενος όγκος των δειγμάτων εξαρτάται από την αναλυτική μέθοδο (ειδική ανάλυση), τον αναλυτή άνθρακα που χρησιμοποιείται και τη διαδικασία (διήθηση με μεμβράνη ή φυγοκέντρηση) που επιλέγεται για την κατεργασία των δειγμάτων πριν από τον προσδιορισμό του άνθρακα (παράγραφοι 25 και 26).
0,5μl-2μl
Πριν από τη δειγματοληψία, πρέπει να διασφαλίζεται η καλή ανάμειξη του μέσου δοκιμής και η διάλυση ή διασπορά τυχόν υλικού που έχει προσκολληθεί στο τοίχωμα της φιάλης.
buffer with MgCl2
Αμέσως μετά τη δειγματοληψία διεξάγεται διήθηση με μεμβράνη ή φυγοκέντρηση.
2,5μl
Εάν είναι απαραίτητο, τα δείγματα που έχουν υποστεί διήθηση ή φυγοκέντρηση φυλάσσονται στους 2-4 °C για έως 48 ώρες ή κάτω από τους – 18°C για μεγαλύτερα χρονικά διαστήματα (εάν είναι γνωστό ότι η ουσία δεν θα επηρεαστεί, εκτελείται οξίνιση σε pH 2 πριν από τη φύλαξη).
Nucleotides (each of dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Οι διηθητικές μεμβράνες (0,2-0,45 μm) θεωρούνται κατάλληλες, εφόσον εξασφαλίζεται ότι δεν ελευθερώνουν άνθρακα ούτε προσροφούν την ουσία στο στάδιο της διήθησης, π.χ. διηθητικές μεμβράνες πολυανθρακικών πολυμερών.
Forward Primer (10μM) (see below 3-5)
Μερικές διηθητικές μεμβράνες είναι εμποτισμένες με επιφανειοδραστικές ουσίες για υδροφιλίωση και ενδέχεται να ελευθερώνουν σημαντικές ποσότητες διαλυμένου άνθρακα.
0,5μl
Τα εν λόγω φίλτρα προετοιμάζονται με βρασμό σε απιονισμένο νερό για τρεις διαδοχικές χρονικές περιόδους, διάρκειας μίας ώρας η κάθε μία.
Reverse Primer (10μM) (see below 3-5)
Μετά τον βρασμό, τα φίλτρα φυλάσσονται σε απιονισμένο νερό.
Water (PCR grade)
Τα πρώτα 20 ml του διηθήματος απορρίπτονται.
up to 25μl
Μπορεί να διεξαχθεί φυγοκέντρηση των δειγμάτων ως εναλλακτική επιλογή της διήθησης μέσω μεμβράνης.
Taq E- Polymerase
Τα δείγματα φυγοκεντρούνται σε 40000 m.s– 2 (~ 4000 g) για 15 λεπτά, κατά προτίμηση σε καταψυχόμενο φυγόκεντρο.
0,3μl
Η διαφοροποίηση του ολικού οργανικού άνθρακα (TOC) έναντι του DOC (TOC/DOC) μέσω φυγοκέντρησης σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις δεν φαίνεται να είναι αποτελεσματική, αφού είτε δεν απομακρύνονται όλα τα βακτήρια είτε ο άνθρακας ως μέρος του βακτηριακού πλάσματος επαναδιαλύεται.
buffer with MgCl2:
Σε υψηλότερες συγκεντρώσεις δοκιμής (> 10 mg C ανά λίτρο), το σφάλμα φυγοκέντρησης φαίνεται να είναι σχετικά μικρό.
Tris/HCl (pH8,8 at 25 °C), 160mM (NH4)2SO4, 25mM MgCl2, 0,1 %Tween 20
Συχνότητα της δειγματοληψίας
For each PCR (see below 3-5) the special primer as a new combination of “Reaction-Mix” and the adequate needed amount of template DNA for each sample (see above) is needed.
Εάν οι αναλύσεις πραγματοποιούνται αμέσως μετά τη δειγματοληψία, ο χρόνος μέχρι την επόμενη δειγματοληψία εκτιμάται λαμβάνοντας υπόψη το αποτέλεσμα του αναλυτικού προσδιορισμού.
The respective volumes will be transferred into new tubes using pipettes.
Εάν τα δείγματα διατηρούνται (παράγραφος 24) ώστε να αναλυθούν κάποια άλλη στιγμή, πρέπει να λαμβάνεται μεγαλύτερος αριθμός δειγμάτων από τον ελάχιστο απαιτούμενο αριθμό των πέντε δειγμάτων.
After that all tubes will be closed, stirred (ca.
Πρέπει να αναλύονται τα τελευταία δείγματα πρώτα και, ακολουθώντας μια στρατηγική σταδιακής επιλογής “προς τα πίσω” των κατάλληλων δειγμάτων προς ανάλυση, είναι δυνατό να εξασφαλιστεί μια καλή περιγραφή της καμπύλης βιοαποικοδόμησης με σχετικά μικρό αριθμό αναλυτικών προσδιορισμών.
10 sec) and centrifuged (10 sec, at room temperature).
Εάν δεν έχει πραγματοποιηθεί αποικοδόμηση μέχρι το τέλος της δοκιμής, δεν χρειάζεται να αναλυθούν άλλα δείγματα και, σε αυτήν την περίπτωση, η στρατηγική της “προς τα πίσω” επιλογής ενδέχεται να εξοικονομήσει σημαντικές δαπάνες για αναλύσεις.
Now the respective PCR-programmes can be started.
Εάν παρατηρηθεί φάση οριζοντίωσης (σταθερή κατάσταση) στην καμπύλη αποικοδόμησης πριν από την 60ή ημέρα, η δοκιμή τερματίζεται.
Additionally a positive control (exemplary DNA sample with known activity and clear results) and a negative control (1 μl dest.
Εάν η έναρξη της αποικοδόμησης είναι εμφανής μέχρι την 60ή ημέρα, αλλά δεν έχει επιτευχθεί φάση οριζοντίωσης, το πείραμα παρατείνεται για μεγαλύτερη χρονική περίοδο.
H2O) will be used in each PCR-programme.
Τα αναλυτικά αποτελέσματα καταγράφονται στο συνημμένο φύλλο δεδομένων (προσάρτημα 2) και υπολογίζονται οι τιμές βιοαποικοδόμησης τόσο για την υπό δοκιμή ουσία όσο και για την ουσία αναφοράς βάσει της εξίσωσης:
Preparation of the agarose gel (1 %) — During running PCR-programmes:
αποικοδόμηση σε ποσοστιαία απομάκρυνση DOC ή ειδικής ουσίας κατά τον χρόνο t,
Solve 3 g agarose in 300 ml 1 × TAE-buffer (1 % agarose gel)
αρχική συγκέντρωση του DOC ή της ειδικής ουσίας στο μέσο δοκιμής,
This solution should be boiled using an microwave (ca.
συγκέντρωση του DOC ή της ειδικής ουσίας στο μέσο δοκιμής κατά τον χρόνο t,
2-3 min)
αρχική συγκέντρωση του DOC ή της ειδικής ουσίας στο τυφλό,
Transfer the hot solution into a special casting box, which lies on ice
συγκέντρωση του DOC ή της ειδικής ουσίας στο τυφλό κατά τον χρόνο t.
After ca.
Η πορεία της αποικοδόμησης απεικονίζεται γραφικά σε μορφή διαγράμματος, όπως εμφανίζεται στο σχήμα της ενότητας “Εγκυρότητα και ερμηνεία των αποτελεσμάτων”.
Actin-PCR-programme:
Η έκθεση δοκιμής πρέπει να περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:
Special primer:
Υπό δοκιμή ουσία:
“Mact1(upper/forward)” → TTC AAC AGC CCT GCC ATG TA
κατάσταση ρύπανσης και θρεπτικών συστατικών (αριθμός αποικιών, συγκέντρωση νιτρικών, αμμωνιακών και φωσφορικών ιόντων, εάν απαιτείται),
Cycle (35-times):
μέθοδος που χρησιμοποιείται για την προκατεργασία (φιλτράρισμα/καθίζηση) του θαλάσσιου νερού,
Annealing
μέθοδος που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό του αριθμού των ετεροτρόφων στο θαλάσσιο νερό [μέθοδος μέτρησης της περιεκτικότητας σε βακτήρια (plate count) ή εναλλακτική διαδικασία] (προαιρετική),
→ 1 min at 68 °C
η πορεία της δοκιμής αποικοδόμησης απεικονίζεται γραφικά σε μορφή διαγράμματος όπου παρουσιάζεται η λανθάνουσα φάση (tL), η κλίση και ο χρόνος (ξεκινώντας από το τέλος της λανθάνουσας φάσης) μέχρι την επίτευξη 50 τοις εκατό απομάκρυνσης (t50).
The samples with intact DNA will be used in this PCR-programme to detect the X- and Y-Genes.
Η λανθάνουσα φάση μπορεί να εκτιμηθεί γραφικά όπως εμφανίζεται στο σχήμα της ενότητας “Εγκυρότητα και ερμηνεία των αποτελεσμάτων” ή μπορεί να θεωρηθεί ευκόλως ως ο χρόνος που απαιτείται για αποικοδόμηση της τάξεως του 10 τοις εκατό,
Male DNA should show one double-band and female DNA should show one single band (after staining and gel-electrophoresis).
ποσοστιαία αποικοδόμηση μετρηθείσα μετά από 60 ημέρες ή στο τέλος της δοκιμής.
For this programme-run one positive control for males (XY-sample) and one for females (XX-sample) should be included.
Εγκυρότητα και ερμηνεία των αποτελεσμάτων
“PG 17,6” (lower/reverse) → GAT CGT CCC TCC ACA GAG AAG AGA
Εάν τα αποτελέσματα που λαμβάνονται με τις ουσίες αναφοράς είναι ασυνήθιστα, η δοκιμή θα πρέπει να επαναλαμβάνεται με χρήση άλλου δείγματος θαλάσσιου νερού.
→ 45 sec at 55 °C
Λόγω των σχετικά υψηλών συγκεντρώσεων δοκιμής που χρησιμοποιούνται σε σχέση με τα περισσότερα φυσικά συστήματα (και κατά συνέπεια της δυσμενούς αναλογίας μεταξύ των συγκεντρώσεων των υπό δοκιμή ουσιών και άλλων πηγών άνθρακα), η μέθοδος πρέπει να θεωρείται μια προκαταρκτική δοκιμή που μπορεί να χρησιμοποιείται για να διαπιστωθεί εάν μια ουσία είναι εύκολα βιοαποικοδομήσιμη ή όχι.
Y-Gene-PCR-programme as “control” for X- and Y-Gene-PCR-programme:
Αντίστοιχα, ένα χαμηλό αποτέλεσμα δεν σημαίνει απαραιτήτως ότι η υπό δοκιμή ουσία δεν είναι βιοαποικοδομήσιμη στα θαλάσσια περιβάλλοντα, αλλά υποδεικνύει ότι χρειάζεται περισσότερη εργασία προκειμένου να αποδειχθεί αυτό.
This PCR-programme verifies the results of the “X- and Y-Gene-PCR-programme”.
Στο παρακάτω σχήμα παρέχεται ένα παράδειγμα ενός πειράματος θεωρητικής αποικοδόμησης όπου απεικονίζεται ένας εφικτός τρόπος εκτίμησης της τιμής tL (διάρκεια της “λανθάνουσας φάσης”) και της τιμής t50 (διάστημα χρόνου, ξεκινώντας από tL) που απαιτείται για να επιτευχθεί απομάκρυνση 50 τοις εκατό.
The “male-samples” should show one band and the “female-samples” shouldn't show any band (after staining and gel-electrophoresis).
Έναρξη
“DMTYa (upper/forward)” → GGC CGG GTC CCC GGG TG
Η παρούσα μέθοδος είναι μια παραλλαγή σε θαλάσσιο νερό της δοκιμής κλειστής φιάλης (5) και οριστικοποιήθηκε μετά από μια κυκλική δοκιμή που οργανώθηκε για την Ευρωπαϊκή Επιτροπή από το Water Quality Institute της Δανίας (3).
“DMTYd (lower/reverse)” → TTT GGG TGA ACT CAC ATG G
Από κοινού με την αντίστοιχη θαλάσσια μέθοδο ανακινούμενης φιάλης, τα αποτελέσματα από αυτήν τη δοκιμή δεν πρέπει να θεωρούνται ενδείξεις άμεσης βιοαποικοδομησιμότητας, αλλά πρέπει να χρησιμοποιούνται ειδικά για τη λήψη πληροφοριών σχετικά με τη βιοαποικοδομησιμότητα ουσιών σε θαλάσσια περιβάλλοντα.
Staining of the PCR-samples:
Μια προκαθορισμένη ποσότητα της υπό δοκιμή ουσίας διαλύεται στο μέσο δοκιμής συνήθως σε συγκέντρωση 2-10 mg υπό δοκιμή ουσίας ανά λίτρο (μπορούν να χρησιμοποιούνται μία ή περισσότερες συγκεντρώσεις).
Staining solution:
Το διάλυμα διατηρείται σε μια γεμάτη κλειστή φιάλη στο σκοτάδι, εντός ενός λουτρού ή θαλάμου σταθερής θερμοκρασίας, η οποία κυμαίνεται μεταξύ 15 και 20 °C με αποκλίσεις όχι μεγαλύτερες από ± 1 °C.
50 % Glycerol
Σε περιπτώσεις όπου ο στόχος της μελέτης είναι η προσομοίωση περιβαλλοντικών συνθηκών, οι δοκιμές μπορούν να διεξάγονται εκτός αυτού του συνήθους εύρους θερμοκρασίας, υπό την προϋπόθεση ότι πραγματοποιούνται κατάλληλες ρυθμίσεις για τον έλεγχο της θερμοκρασίας.
0,25 % Bromphenolblue
Μετά την αποικοδόμηση διεξάγονται αναλύσεις οξυγόνου κατά τη διάρκεια χρονικής περιόδου 28 ημερών.
0,25 % Xylenecyanol
Από την κυκλική δοκιμή διαπιστώθηκε ότι εάν η δοκιμή παραταθεί πέραν των 28 ημερών, δεν είναι δυνατή η συλλογή χρήσιμων πληροφοριών, στις περισσότερες περιπτώσεις, λόγω σοβαρών παρεμβολών.
Pipette 1 μl of the staining solution into each single tube
Οι τιμές του βιολογικά απαιτούμενου οξυγόνου (BOD) του τυφλού ήταν υπερβολικά υψηλές, πιθανώς λόγω της ανάπτυξης βακτηρίων στο τοίχωμα που προκλήθηκε από την έλλειψη ανάδευσης, καθώς και της νιτροποίησης.
Start of the Gel-Electrophoresis:
Επομένως, η συνιστώμενη διάρκεια είναι 28 ημέρες, αλλά εάν η τιμή BOD του τυφλού διατηρείται εντός του ορίου του 30 τοις εκατό (παράγραφοι 15 και 40) η δοκιμή μπορεί να παραταθεί.
The prepared 1 % agarose gel will be transferred into a gel-electrophoresis-chamber filled with 1 × TAE-Buffer
Προκειμένου να υπολογιστεί το θεωρητικά απαιτούμενο οξυγόνο (ThOD) απαιτείται ο εμπειρικός τύπος (βλ. προσάρτημα 3).
10 - 15 μl of each stained PCR-sample will be pipetted into an agarose gel slot
Διαφορετικά, πρέπει να προσδιοριστεί το χημικά απαιτούμενο οξυγόνο (COD) της ουσίας ώστε να χρησιμοποιηθεί ως τιμή αναφοράς.
Also 5 - 15 μl of the 1kb-“Ladder”(Invitrogen) will be pipetted into a separate slot
Η χρήση του COD είναι λιγότερο ικανοποιητική επειδή μερικές ουσίες δεν οξειδώνονται πλήρως στη δοκιμή COD.
Start the electrophoresis by 200 V
Η διαλυτότητα της ουσίας θα πρέπει να είναι τουλάχιστον 2 mg/l.
Stop after 30-45 min
Ωστόσο, κατ' αρχήν, μπορούν να υποβάλλονται σε δοκιμή λιγότερο διαλυτές ουσίες (π.χ. με κατεργασία με υπερήχους), καθώς και πτητικές ουσίες.
Determination of the bands:
Οι πληροφορίες που αφορούν την τοξικότητα της ουσίας για βακτήρια, π.χ. σύμφωνα με μετρήσεις βραχυχρόνιων δοκιμών αναπνοής (4), μπορεί να είναι χρήσιμες κατά την επιλογή κατάλληλων συγκεντρώσεων δοκιμής και να έχουν ουσιαστική σημασία για την ορθή ερμηνεία χαμηλών τιμών βιοαποικοδόμησης.
Clean the agarose gel in distilled H2O
Ωστόσο, για την ερμηνεία των αποτελεσμάτων της δοκιμής βιοαποικοδόμησης, δεν επαρκούν πάντα οι εν λόγω πληροφορίες και η διαδικασία που περιγράφεται στην παράγραφο 27 είναι καταλληλότερη.
Now transfer the agarose gel into Ethidium bromide for 15 - 30 min
Για τον σκοπό αυτό μπορούν να χρησιμοποιούνται (για παράδειγμα) η ανιλίνη, το οξικό νάτριο ή το βενζοϊκό νάτριο.
After that, a picture of the agarose gel should be taken in an UV-light-box
Οι ουσίες αυτές πρέπει να αποικοδομούνται κατά τουλάχιστον 60 τοις εκατό (του ThOD τους) σε ένα ευλόγως σύντομο χρονικό διάστημα, διαφορετικά συνιστάται να επαναλαμβάνεται η δοκιμή με χρήση άλλου δείγματος θαλάσσιου νερού.
Finally the samples are analysed in comparison to the positive control-band (or bands) and the ladder
Στην κυκλική δοκιμή της Ευρωπαϊκής Επιτροπής όπου τα δείγματα θαλάσσιου νερού ελήφθησαν από διαφορετικές τοποθεσίες και σε διαφορετικές χρονικές στιγμές μέσα στο έτος, η λανθάνουσα φάση (tL) και ο χρόνος για να επιτευχθεί αποικοδόμηση κατά 50 τοις εκατό (t50), μη συμπεριλαμβανομένης της λανθάνουσας φάσης, ήταν 0 έως 2 ημέρες και 1 έως 4 ημέρες αντίστοιχα για το βενζοϊκό νάτριο.
Appendix 10
Για την ανιλίνη, οι τιμές tL και t50 ήταν 0 έως 7 και 2 έως 12 ημέρες αντίστοιχα.
Guidance on tissue sampling for genetic sex determination by PCR method in the three-spined stickleback
ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΙΜΟΤΗΤΑ
Tissue sampling and DNA extraction
Η αναπαραγωγιμότητα των μεθόδων καθορίστηκε στην κυκλική δοκιμή της Ευρωπαϊκής Επιτροπής (3).
DNA can be extracted using a variety of commercially available reagents and both manual and automated extraction systems.
Συνήθης εργαστηριακός εξοπλισμός, καθώς και τα εξής:
The protocol used at the Cefas Weymouth laboratory is outlined below, and the alternative approaches have been added where appropriate.
Μπορούν να χρησιμοποιούνται φιάλες BOD των 250-300 ml με γυάλινα πώματα ή φιάλη με στενό στόμιο των 250 ml με γυάλινα πώματα,
With fine scissors, a small piece of tissue (10-20 mg) from the dorsolateral area (after removing the head and tail for VTG analysis), is removed from each individual fish.