natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Πρόγραμμα:
The test results should be interpreted with caution where measured test chemical concentrations in test solutions occur at levels near the detection limit of the analytical method.
Κύκλος (35 φορές):
Relevant physical-chemical properties;
Αποδιάταξη του DNA
chemical identification data including purity and analytical method for quantification of the test chemical.
→ 45 δευτ. στους 95 °C
Test procedure used (e.g. flow-through semi-static/renewal);
Πρόσδεση των εκκινητών
test design including test concentrations, method of preparation of stock solutions (in an Annex), frequency of renewal (the solubilising agent and its concentration should be given, when used);
→ 45 δευτ. στους 56 °C
The nominal test concentrations, the means of the measured values and their standard deviations in the test chambers and the method by which these were attained (the analytical method used should be presented in an Annex);Evidence that the measurements refer to the concentrations of the test chemical in true solution;
Επιμήκυνση των εκκινητών
Water quality within test chambers:
→ 1 λεπτό στους 68 °C
Detailed information on feeding (e.g. type of food(s), source, amount given and frequency and analyses for contaminants (e.g. PCBs, PAHs and organochlorine pesticides) if relevant.
15 λεπτά στους 68 °C
Evidence that controls met the validity criteria:
Πρόγραμμα PCR των X και Y γονιδίων:
data on hatching rate should be presented in tables as percentage per replicate and per concentration.
Σε αυτό το πρόγραμμα PCR χρησιμοποιούνται δείγματα με άθικτο DNA για την ανίχνευση των X και Y γονιδίων.
Outliers from the acceptance criteria (in controls) should be highlighted.
Το DNA των αρσενικών ατόμων αναμένεται να εμφανίζει μία διπλή ζώνη και το DNA των θηλυκών ατόμων αναμένεται να εμφανίζει μία μονή ζώνη (μετά από χρώση και ηλεκτροφόρηση σε πηκτή).
Survival should be presented as percentage per replicate and per concentration.
Για αυτήν την εκτέλεση του προγράμματος, θα πρέπει να συμπεριλαμβάνεται ένας θετικός μάρτυρας για τα αρσενικά άτομα (δείγμα XY) και ένας θετικός μάρτυρας για τα θηλυκά άτομα (δείγμα XX).
Outliers from the validity criteria (in controls) should be highlighted;
“PG 17,5” (άνω/πρόσθιος) → CCG GGT GCC CAA GTG CTC CCG CTG
Clear indication of the results obtained on the different endpoints observed:
“PG 17,6” (κάτω/αντίστροφος) → GAT CGT CCC TCC ACA GAG AAG AGA
embryo survival and hatching success;
Κύκλος (40 φορές):
external abnormalities;
→ 45 δευτ. στους 55 °C
length and weight;
Με αυτό το πρόγραμμα PCR επαληθεύονται τα αποτελέσματα του “προγράμματος PCR των γονιδίων X και Y”.
incidence of any unusual reactions by the fish and any visible effects produced by the test chemical.
Τα “δείγματα αρσενικών ατόμων” αναμένεται να εμφανίζουν μία ζώνη και τα “δείγματα θηλυκών ατόμων” δεν αναμένεται να εμφανίζουν καμία ζώνη (μετά από χρώση και ηλεκτροφόρηση σε πηκτή).
The results should be presented as mean values ± standard deviation (SD) or standard error (SE).
“DMTYa (άνω/πρόσθιος)” → GGC CGG GTC CCC GGG TG
Statistics should be reported as a minimum as NOEC and LOEC and confidence intervals.
“DMTYd (κάτω/αντίστροφος)” → TTT GGG TGA ACT CAC ATG G
The statistical flow chart (Appendix 8) should be followed.
Χρώση των δειγμάτων PCR:
Sumpter, 1996, “Inhibition of testicular growth in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) exposed to estrogenic alkylphenolic chemicals”, Environmental Toxicology and Chemistry 15, pp. 194-202.
Διάλυμα χρώσης:
Sumpter, J.P. and S. Jobling, 1995, “Vitellogenesis As A Biomarker for Estrogenic Contamination of the Aquatic Environment”, Environmental Health Perspectives 103, pp. 173-178.
Γλυκερόλη 50 %
Hutchinson, S. Maddix, and H. Trip (1999), “An in vivo testing system for endocrine disruptors in fish early life stages using induction of vitellogenin”, Environmental Toxicology and Chemistry 18, pp. 337-347.
Κυανό της βρωμοφαινόλης 0,25 %
Pedersen, and P. Bjerregaard (2001a), “Development of an ELISA for vitellogenin in whole body homogenate of zebrafish (Danio rerio)”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 130, pp. 119-131.
Κυανόλη του ξυλενίου 0,25 %
Andersen, L., P. Bjerregaard, and B. Korsgaard (2003), “Vitellogenin induction and brain aromatase activity in adult male and female zebrafish exposed to endocrine disrupters”, Fish Physiology and Biochemistry 28, pp. 319-321.
Με σιφώνιο μεταφέρεται 1 μl του διαλύματος χρώσης σε κάθε σωλήνα
Petersen (2003), “Gonad development and vitellogenin production in zebrafish (Danio rerio) exposed to ethinylestradiol and methyltestosterone”, Aquatic Toxicology 65, pp. 397-411.
Έναρξη της ηλεκτροφόρησης σε πηκτή:
Tyler (2002), “Utility of a juvenile fathead minnow screening assay for detecting (anti-)estrogenic substances”, Environmental Toxicology and Chemistry 21, pp. 319-326.
Η έτοιμη πηκτή αγαρόζης 1 % μεταφέρεται σε θάλαμο ηλεκτροφόρησης σε πηκτή γεμάτο με 1x ρυθμιστικό διάλυμα TAE
Wang (2007), “Toxicity of the aromatase inhibitor letrozole to Japanese medaka (Oryzias latipes) eggs, larvae and breeding adults”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 145, pp. 533-541.
Σε κάθε υποδοχή της πηκτής αγαρόζης μεταφέρονται με σιφώνιο 10-15 μl κάθε χρωσμένου δείγματος PCR
LeBlanc, and C.V.Sullivan (1999), “Fathead minnow (Pimephales promelas) vitellogenin: purification, characterization and quantitative immunoassay for the detection of estrogenic compounds”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 123, pp. 113-125.
Επίσης, σε μια ξεχωριστή υποδοχή μεταφέρονται με σιφώνιο 5-15 μl ενός “Ladder” 1kb (Invitrogen)
Porcher (2002), “Development and validation of an enzyme-linked immunosorbent assay to measure vitellogenin in the zebrafish (Danio rerio)”, Environmental Toxicology and Chemistry 21, pp. 1699-1708.
Η ηλεκτροφόρηση εκκινείται στα 200 V
Hatano, H. Mizukami, M. Yamashita, R. Sakakibara, and E. Tamiya (2002), “Development and application of a monoclonal antibody-based sandwich ELISA for quantification of Japanese medaka (Oryzias latipes) vitellogenin”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 132, pp. 161-169.
Διακόπτεται μετά από 30-45 λεπτά
Bengtsson (2004), “The juvenile three-spined stickleback (Gasterosteus aculeatus L.) as a model organism for endocrine disruption — II — kidney hypertrophy, vitellogenin and spiggin induction”, Aquatic Toxicology 70, pp. 311-326.
Καθορισμός των ζωνών:
Tatarazako, N., M. Koshio, H. Hori, M. Morita, and T. Iguchi (2004), “Validation of an enzyme-linked immunosorbent assay method for vitellogenin in the medaka”, Journal of Health Science 50, pp. 301-308.
Η πηκτή αγαρόζης καθαρίζεται σε απεσταγμένο H2O
Eidem, J.K., H. Kleivdal, K. Kroll, N. Denslow, R. van Aerle, C. Tyler, G. Panter, T. Hutchinson, and A. Goksoyr (2006), “Development and validation of a direct homologous quantitative sandwich ELISA for fathead minnow (Pimephales promelas) vitellogenin.
Κατόπιν, φωτογραφίζεται η πηκτή αγαρόζης σε θάλαμο υπεριώδους ακτινοβολίας
Ankley (2006), “Evaluation of a commercial kit for measuring vitellogenin in the fathead minnow (Pimephales promelas)”, Ecotoxicology and Environmental Safety 64, pp. 101-105.
Τέλος, τα δείγματα εξετάζονται σε σύγκριση με τη ζώνη (ή τις ζώνες) του θετικού μάρτυρα και το ladder
Holbech, H., Petersen, G. I., Norman, A., Örn, S, Norrgren, L., and Bjerregaard, P (2001b), “Suitability of zebrafish as test organism for detection of endocrine disrupting chemicals.
Καθοδήγησή σχετικά με τη δειγματοληψία ιστού για τον προσδιορισμό του γενετικού φύλου με μέθοδο PCR στον τρικαντό ξαστερώστε
Porcher, and A. Goksoyr (2004), “Development of quantitative vitellogenin-ELISAs for fish test species used in endocrine disruptor screening”, Analytical and Bioanalytical Chemistry 378, pp. 621-633.
Δειγματοληψία ιστού και εκχύλιση DNA
Orn, S., S. Yamani, and L. Norrgren (2006), “Comparison of vitellogenin induction, sex ratio, and gonad morphology between zebrafish and Japanese medaka after exposure to 17 alpha-ethinylestradiol and 17 beta-trenbolone”, Archives of Environmental Contamination and Toxicology 51, pp. 237-243.
Η εκχύλιση του DNA μπορεί να πραγματοποιείται με τη χρήση διαφόρων αντιδραστηρίων που διατίθενται στο εμπόριο και με αυτοματοποιημένα ή μη αυτοματοποιημένα συστήματα εκχύλισης.
Scholz, S. and N. Kluver (2009), “Effects of Endocrine Disrupters on Sexual, Gonadal Development in Fish, Sexual Development 3”, pp. 136-151.
Με λεπτό ψαλίδι, αφαιρείται από κάθε ψάρι ένα μικρό κομμάτι ιστού (10-20 mg) από την οπισθοπλάγια περιοχή (μετά την αφαίρεση του κεφαλιού και της ουράς για ανάλυση VTG).
Nagahama (2004), “Two DM domain genes, DMY and DMRT1, involved in testicular differentiation and development in the medaka, Oryzias latipes”, Developmental Dynamics 231, pp. 518-526.
Ο ιστός μεταφέρεται σε έναν σωλήνα και τοποθετείται απευθείας σε υγρό άζωτο (για αποθήκευση στους – 80 °C) ή συμπληρώνεται με αιθανόλη 70 % (για μεταφορά και επακόλουθη αποθήκευση στους 4 °C).
Shinomiya, A., H. Otake, K. Togashi, S. Hamaguchi, and M. Sakaizumi (2004), “Field survey of sex-reversals in the medaka, Oryzias latipes: genotypic sexing of wild populations”, Zoological Science 21, pp. 613-619.
Το ψαλίδι καθαρίζεται μετά από τη χρήση σε κάθε ψάρι σε αιθανόλη 70 % και μετά σε απεσταγμένο νερό και, στη συνέχεια, στεγνώνεται με χαρτί.
Flick (2007), “Collapse of a fish population after exposure to a synthetic estrogen”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, pp. 8897-8901.
Η αιθανόλη (εάν υπάρχει) αφαιρείται με αναρρόφηση και ο ιστός υφίσταται χώνευση όλη τη νύχτα με πρωτεϊνάση K σε 400 μl ρυθμιστικού διαλύματος ATL (Qiagen).
Kidd (2009), “Interspecies differences in biochemical, histopathological, and population responses in four wild fish species exposed to ethynylestradiol added to a whole lake”, Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 66, pp. 1920-1935.
Ένα κλάσμα (200 μl) του διαλύματος χώνευσης μεταφέρεται σε μπλοκ S των 96 βοθρίων (Qiagen) και το DNA εκχυλίζεται από τη διάταξη 96 βοθρίων μέσω του κιτ Qiagen Universal BioRobot και QIamp Investigator BioRobot.
Tyler (2006), “Development of chronic tests for endocrine active chemicals — Part 1.
Το DNA εκλούεται σε 50 μl νερό απαλλαγμένο από DNAάση και RNAάση.
An extended fish early-life stage test for oestrogenic active chemicals in the fathead minnow (Pimephales promelas)”, Aquatic Toxicology 77, pp. 279-290.
Εάν το DNA εκχυλίζεται από σκληρούς ιστούς (όπως η ραχοκοκαλιά ή ένα θωρακικό πτερύγιο), μπορεί να χρειαστεί να γίνει ομογενοποίηση του δείγματος στο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης με τη χρήση ενός συστήματος λύσης ιστών FastPrep® ή ισοδύναμου συστήματος διάσπασης ιστών.
Petersen, P. Jackson, K. Hylland, L. Norrgren, and P. Bjerregaard (2006), “Detection of endocrine disrupters: Evaluation of a Fish Sexual Development Test (FSDT)”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 144, pp. 57-66.
Εναλλακτικά,
Andersen, L., K. Kinnberg, H. Holbech, B. Korsgaard, and P. Bjerregaard (2004), “Evaluation of a 40 day assay for testing endocrine disrupters: Effects of an anti-estrogen and an aromatase inhibitor on sex ratio and vitellogenin concentrations in juvenile zebrafish (Danio rerio)”, Fish Physiology and Biochemistry 30, pp. 257-266.
ο ιστός υφίσταται χώνευση όλη τη νύχτα με πρωτεϊνάση K σε 400 μl ρυθμιστικού διαλύματος λύσης G2 (Qiagen) και το DNA εκχυλίζεται από 200 μl του διαλύματος χώνευσης με χρήση είτε του κιτ EZ-1 DNA Easy Tissue και του EZ-1 BioRobot είτε του κιτ DNA Easy Tissue Mini Kit.
Morthorst, J.E., H. Holbech, and P. Bjerregaard (2010), “Trenbolone causes irreversible masculinization of zebrafish at environmentally relevant concentrations”, Aquatic Toxicology 98, pp. 336-343.
Το DNA εκλούεται σε όγκο 50 μl.
Metcalf (2003), “Effects of the antiandrogens, vinclozolin and cyproterone acetate on gonadal development in the Japanese medaka (Oryzias latipes)”, Aquatic Toxicology 63, pp. 391-403.
Οι ιστοί υφίστανται κατεργασία με το αντιδραστήριο DNAzol.
Tyler (2004), “Successful detection of (anti-) androgenic and aromatase inhibitors in pre-spawning adult fathead minnows (Pimephales promelas) using easily measured endpoints of sexual development”, Aquatic Toxicology 70, pp. 11-21.
Τα δείγματα ιστού υφίστανται σύντομη λύση σε 1 ml DNAzol για 10 λεπτά σε σωλήνα μικροφυγοκέντρησης των 1,5 ml και, στη συνέχεια, φυγοκεντρούνται στις 13000 σ.α.λ. για 5 λεπτά για την απομάκρυνση τυχόν σωματιδίων.
Petersen, and P. Bjerregaard (2007), “Effects of the fungicide prochloraz on the sexual development of zebrafish (Danio rerio)”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 145, pp. 165-170.
Στη συνέχεια, το δείγμα που έχει υποστεί λύση μεταφέρεται σε καινούριο σωλήνα μικροφυγοκέντρησης των 1,5 ml που περιέχει 500 μl αιθανόλη 100 % μοριακού βαθμού καθαρότητας και φυγοκεντρείται στις 13000 σ.α.λ. για 10 λεπτά για να επιτευχθεί καθίζηση του DNA.
Chapter C.14 of this Annex, Fish Juvenile Growth Test.
Η αιθανόλη αφαιρείται και αντικαθίσταται από 400 μl αιθανόλης 70 % μοριακού βαθμού καθαρότητας, φυγοκεντρείται στις 13000 σ.α.λ. για 5 λεπτά και το ίζημα DNA διαλύεται σε 50 μl νερό μοριακού βαθμού καθαρότητας απαλλαγμένο από DNAάση και RNAάση.
Chapter C.4 of this Annex, Ready Biodegradability.
Παρομοίως, όταν χρησιμοποιούνται σκληροί ιστοί (θωρακικό πτερύγιο) μπορεί να χρειαστεί να γίνει ομογενοποίηση του δείγματος στο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης με τη χρήση ενός συστήματος λύσης ιστών FastPrep® ή ισοδύναμου συστήματος διάσπασης ιστών πριν από την εκχύλιση του DNA.
Chapter C.37 of this Annex, 21-Day Fish Assay:
Το DNA αποθηκεύεται στους – 20 °C, όσο απαιτείται.
A Short Term Screening for Oestrogenic and Androgenic Activity, and Aromatase Inhibition.
Η εκτέλεση των διαδικασιών πρέπει να πραγματοποιείται με γάντια.
Schäfers, C., Teigeler, M., Wenzel, A., Maack, G., Fenske, M., Segner, H (2007), “Concentration- and time-dependent effects of the synthetic estrogen, 17 alpha-ethinylestradiol, on reproductive capabilities of the zebrafish, Danio rerio” Journal of Toxicology and Environmental Health-Part A, 70, 9-10 pp 768-779.
Ανάλυση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR)
Abbreviations and definitions
Πραγματοποιήθηκαν ενισχύσεις του DNA με χρήση 2,5 μl εκχυλίσματος DNA σε όγκο αντίδρασης 50 μl με εκκινητές για τη γενετική θέση Idh (όπως περιγράφηκε από τους Peichel κ.ά., 2004.
Apical endpoint
Current Biology 1:1416-1424):
Causing effect at population level
Πρόσθιος εκκινητής
Air saturation value
Αντίστροφος εκκινητής
Biomarker
Υπάρχουν πολλοί προμηθευτές κατάλληλων αντιδραστηρίων PCR.
Causing effect at individual level
Παρακάτω περιγράφεται η μέθοδος που χρησιμοποιείται επί του παρόντος στο εργαστήριο Cefas Weymouth.
A substance or a mixture.
Παρασκευή του μείγματος αντίδρασης (50 μl ανά δείγμα):
Days post hatch
Το Mastermix παρασκευάζεται όπως περιγράφεται παρακάτω.
Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish
Μπορεί να παρασκευάζεται από πριν και να αποθηκεύεται κατεψυγμένο στους – 20 °C όσο απαιτείται.
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
Πρέπει να παρασκευάζεται επαρκής ποσότητα Mastermix για αρνητικό μάρτυρα (μόνο νερό μοριακού βαθμού καθαρότητας).
Fish weight
Όγκος (συγκέντρωση διαλύματος παρακαταθήκης)/δείγμα
Fish wet weight (blotted dry)
Ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης 5xGoTaq®
FSDT
Νουκλεοτίδια (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Fish Sexual Development Test
0,5 μl (25 mM έκαστο)
Hypothalamic-pituitary-gonadal axis
250 μM έκαστο
Intersex fish
Πρόσθιος εκκινητής
Fish with more than one oocyte in testis per 6 sections analysed or spermatogenetic cells in ovaries (yes/no)
0,5 μl (0,1 nmol/μl)
Wet weight of fish per volume of water
Αντίστροφος εκκινητής
Mode of action
2,0 μM
Reverse Transcriptase Polymerase Chain-Reaction
Νερό μοριακού βαθμού καθαρότητας
Undifferentiated fish
Πολυμεράση GoTaq
Fish with gonads exhibiting no discernible germ cells.
Διανέμονται 47,5 μl σε έναν επισημασμένο σωλήνα PCR με λεπτά τοιχώματα των 0,5 ml.
Vitellogenin
Προστίθενται 2,5 μl κεκαθαρμένου DNA στον κατάλληλα επισημασμένο σωλήνα.
Experimental conditions for the FSDT (freshwater species)
Η διαδικασία επαναλαμβάνεται για όλα τα δείγματα και τον αρνητικό μάρτυρα.
Japanese medaka (Oryzias latipes)
Προστίθενται στην επιφάνεια 2 σταγόνες ορυκτελαίου.
Zebrafish (Danio rerio)
Εναλλακτικά, μπορεί να χρησιμοποιηθεί θερμοκυκλοποιητής με θερμαινόμενο καπάκι.
Three-spined Stickleback (Gasterostreus aculeatus)
Κλείνονται τα καπάκια.
Flow-through or semi-static
Η αποδιάταξη των δειγμάτων πραγματοποιείται σε θερμοκυκλοποιητή Peltier PTC-225 στους 94 ± 2 °C για 5 λεπτά και ακολουθούν 39 κύκλοι στους 94 ± 2 °C για 1 λεπτό, στους 55 ± 2 °C για 1 λεπτό, στους 72 ± 2 °C για 1 λεπτό και ένας τελικός κύκλος επέκτασης στους 72 ± 2 °C για 10 λεπτά.
Fluorescent bulbs (wide spectrum
Παρασκευή της πηκτής αγαρόζης (2 %):
Light intensity
Κατά κανόνα, τα προϊόντα της PCR αναλύονται σε πηκτή αγαρόζης 20 % που περιέχει βρωμιούχο αιθίδιο.
10-20 μE/m2/s, 540-1080 lux, or 50-100 ft-c (ambient laboratory levels)
Μπορούν ωστόσο να χρησιμοποιηθούν και συστήματα ηλεκτροφόρησης βασιζόμενα σε τριχοειδή.
12-16 h light, 8-12 h dark
2 g αγαρόζης προστίθενται σε 100 ml 1× ρυθμιστικού διαλύματος TAE.
Minimum chamber size
Το μείγμα θερμαίνεται σε φούρνο μικροκυμάτων (περίπου 2-3 λεπτά) για να διαλυθεί η αγαρόζη.
Individual chambers should contain a minimum of 7 l water volume
Προστίθενται 2 σταγόνες βρωμιούχου αιθιδίου τελικής συγκέντρωσης 0,5 μg/ml.
Age of test organisms at start of exposure
Το θερμό διάλυμα μεταφέρεται στον εξοπλισμό χύτευσης της πηκτής.
Newly fertilised eggs (Early blastula stage)
Η πηκτή αφήνεται να στερεοποιηθεί.
Newly fertilised eggs
Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή:
No. of eggs per treatment
Η πηκτή αγαρόζης μεταφέρεται στον εξοπλισμό ηλεκτροφόρησης και βυθίζεται σε 1× ρυθμιστικό διάλυμα TAE.
Minimum 120
20 μl από κάθε δείγμα φορτώνονται σε κάθε βοθρίο και προστίθεται ένας δείκτης μοριακού βάρους (100bp DNA ladder, Promega) σε ένα εφεδρικό βοθρίο.
Minimum 3 (plus appropriate controls)
Διεξάγεται ηλεκτροφόρηση στα 120 V για 30-45 λεπτά.
No. replicates per treatment
Οπτικοποίηση των προϊόντων ενίσχυσης
Minimum 4 (unless square root allocation to controls)
Εάν προστέθηκε βρωμιούχο αιθίδιο στην πηκτή αγαρόζης, όπως περιγράφεται ανωτέρω, τα προϊόντα DNA ανιχνεύονται κάτω από πηγή υπεριώδους ακτινοβολίας.
Live Artemia, frozen adult brine shrimp, flake food, etc.
Εναλλακτικά, γίνεται χρώση της πηκτής αγαρόζης με κάλυψη της πηκτής με αραιό διάλυμα βρωμιούχου αιθιδίου (0,5 μg/ml σε νερό) για 30 λεπτά πριν από την οπτικοποίηση.
It is recommended to feed twice daily
Προσάρτημα 11
Special fry food, live Artemia, frozen adult brine shrimp, flake food, etc.
Καθοδήγησή σχετικά με τη διαδικασία τεχνητής γονιμοποίησης για τον τρικαντό ξαστερώστε
It is recommended to feed twice daily
Σκοπός αυτής της ενότητας είναι η περιγραφή των διαδικασιών λήψης γονιμοποιημένων αυγών από τον τριάκανθο γαστερόστεο εν όψει της χρήσης τους στη δοκιμή FSDT.
None unless DO concentration falls below 60 % saturation
Διαδικασίες
None unless DO concentration falls below 70 % saturation
Λήψη σπέρματος από τα αρσενικά άτομα
Clean surface, well or reconstituted water
Ένα αρσενικό άτομο με καλό χρωματισμό από τον επιθυμητό πληθυσμό υποβάλλεται σε ευθανασία.
Test chemical exposure duration
Οι όρχεις διαχωρίζονται από την κάθε πλευρά του ψαριού.
Hatching success, Survival Gross- morphology, VTG gonadal histology, Genetic sex, Sex ratio
Οι όρχεις γενικά είναι ραβδοειδείς δομές έντονης χρώσης που είναι εύκολα αντιληπτοί στην πλευρική διάμεση γραμμή του σώματος.
Hatching success, Survival Gross- morphology, VTG gonadal histology, Sex ratio
Μπορεί να χρησιμοποιηθεί οποιαδήποτε από τις ακόλουθες μεθόδους:
Test acceptability criteria for pooled replicates of controls
Με ένα λεπτό ψαλίδι, ξεκινώντας από την αμάρα πραγματοποιείται τομή 1-1,5 cm με μία μοναδική περικοπή υπό γωνία περίπου 45 μοιρών.
Hatching success > 80 %
Με ένα νυστέρι, πραγματοποιείται μια μικρή τομή στο πλάι του ψαριού λίγο πιο πίσω από την πύελο και ελαφρώς κοιλιακά των πλευρικών πλακών.
Post hatch survival ≥ 70 %
Οι όρχεις αφαιρούνται με μια λεπτή λαβίδα και τοποθετούνται σε ένα τρυβλίο petri.
growth (Fish wet weight, blotted dry) > 150 mg
Κάθε όρχις καλύπτεται με 100 μl τελικού διαλύματος Hank που έχει παρασκευαστεί προσφάτως.
growth (Fish wet weight, blotted dry) > 75 mg
Οι όρχεις τεμαχίζονται σε κύβους με μια λεπίδα ή ένα νυστέρι.
growth (Fish wet weight, blotted dry) > 120 mg
Με αυτόν τον τρόπο, απελευθερώνεται το σπέρμα και το διάλυμα Hank αποκτά μια γαλακτώδη εμφάνιση.
Length (standard length) > 20mm
Το υγρό που περιέχει το σπέρμα προστίθεται σε έναν σωλήνα με προσοχή ώστε να αποφευχθεί η αναρρόφηση τμημάτων ιστών των όρχεων με το σιφώνιο.
Length (standard length) > 14 mm
Προστίθενται 800 μl τελικού διαλύματος Hank στον σωλήνα και το διάλυμα αναμειγνύεται καλά.
Length (standard length) > 20 mm
Εάν απαιτείται, το αρσενικό άτομο μπορεί να διατηρηθεί μέσω μονιμοποίησης σε αιθανόλη 100 % ή άλλο κατάλληλο μέσο μονιμοποίησης.
Sex ratio (% males or females) 30 %-70 %
Αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό να γίνεται εάν η μελέτη πρόκειται να εξετάσει τη γονική προέλευση των απογόνων.
Chemical characteristics of an acceptable dilution water
Ενώ σχεδόν όλα τα διαλύματα παρακαταθήκης μπορούν να παρασκευάζονται εκ των προτέρων, το διάλυμα παρακαταθήκης 5 και εν συνέχεια το τελικό διάλυμα θα πρέπει να είναι προσφάτως παρασκευασμένα την ημέρα της χρήσης.
CONCENTRATION
Διάλυμα παρακαταθήκης 1
Particular matter
Απεσταγμένο νερό (DW)
From test method C.14/Guidance on test concentrations
Διάλυμα παρακαταθήκης 2
Column (Number of concentrations between 100 and 10, or between 10 and 1) [1]
HPO4 (άνυδρο)
A series of three (or more) successive concentrations may be chosen from a column.
Διάλυμα παρακαταθήκης 3
Mid-points between concentrations in column (x) are found in column (2x + 1).
Διάλυμα παρακαταθήκης 4
The values listed can represent concentrations expressed as percentage per volume or weight (mg/l or μg/l).
Διάλυμα παρακαταθήκης 5 (προσφάτως παρασκευασμένο)
Values can be multiplied or divided by any power of 10 as appropriate.
Εάν ήδη υπάρχουν διαθέσιμα στο εργαστήριο μερικά από τα παραπάνω άλατα αλλά με διαφορετική περιεκτικότητα σε νερό (δηλ. 2H2O αντί για άνυδρο), μπορούν να χρησιμοποιηθούν αλλά πρέπει πρώτα να προσαρμοστεί το βάρος βάσει του μοριακού βάρους.
Column 1 might be used if there was considerable uncertainty on the toxicity level.
Για το τελικό διάλυμα Hank προστίθενται με την ακόλουθη σειρά τα εξής:
Guidance for homogenisation of head & tail from juvenile zebrafish, fathead minnow, three spined stickleback and Japanese medaka
διάλυμα παρακαταθήκης 1
The purpose of this section is to describe the procedures that occur prior to the quantification of the VTG concentration.
διάλυμα παρακαταθήκης 2
Other procedures that result in comparable VTG quantification can be used.
διάλυμα παρακαταθήκης 3
It is an option to determine the VTG concentration in blood plasma or liver instead of head/tail homogenate.
διάλυμα παρακαταθήκης 4
The head and tail are cut of the fish in accordance with the test description.
διάλυμα παρακαταθήκης 5
All dissection instruments, and the cutting board should be rinsed and cleaned properly (e.g. with 96 % ethanol) between handling of each single fish to prevent “VTG pollution” from females or induced males to un-induced males.
Αναμείξτε καλά πριν από τη χρήση.
When a homogenous mass is achieved an amount of 4-10 time the tissue weight of ice-cold homogenisation buffer is added (note the dilution).
Γονιμοποίηση
The samples are placed on ice until centrifugation at 4 °C at 50000 g for 30 min.
Προσδιορίζονται τα μεγάλα, κυοφορούντα θηλυκά άτομα από τον πληθυσμό-στόχο.
Use a pipette to dispense portions of 20 to 50 μl (note the amount) supernatant into at least two tubes by dipping the tip of the pipette below the fat layer on the surface and carefully sucking up the supernatant without fat- or pellet fractions.
Τα θηλυκά άτομα είναι έτοιμα για συμπίεση μόνο όταν φαίνονται αυγά να προεξέχουν από την αμάρα.
Place on ice during use
Τα έτοιμα θηλυκά άτομα έχουν τη χαρακτηριστική στάση με το κεφάλι προς τα επάνω.
Homogenisation buffer:50 mM Tris-HCl pH 7,4;
Τα αυγά απλώνονται (σχηματίζοντας μια μονή στιβάδα) με τη χρήση ενός λεπτού πινέλου.
TRIS-ULTRA PURE (ICN)Protease inhibitor cocktail: