natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Προετοιμασία των δειγμάτων για εξέταση κυτταροκαλλιέργειας και RT-qPCR
Samples for reversed transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR or RT-qPCR) analysis
Κατάψυξη σε εξαιρετικές περιπτώσεις
Samples shall be taken from the fish in accordance with the procedure described in point I.1.1 using a sterile instrument and transferred to a sterile plastic tube containing transport medium.
Εάν προκύψουν πρακτικές δυσκολίες που καθιστούν αδύνατη την επεξεργασία των δειγμάτων εντός 48 ωρών από τη συλλογή των ιστών ιχθύων, μπορεί να γίνει αποδεκτή η κατάψυξη των δειγμάτων ιστού σε υπόστρωμα μεταφοράς στους – 20 °C ή σε χαμηλότερη θερμοκρασία και η διεξαγωγή της ιολογικής εξέτασης εντός 14 ημερών.
Tissue from 10 fish may be collected in one tube and shall represent one pooled sample.
Ωστόσο, ο ιστός ιχθύων επιτρέπεται να καταψυχθεί και να αποψυχθεί μόνο μία φορά πριν από την εξέταση.
However, in case the amount of inoculum is small, tissue from up to five fish may be used.
Πρέπει να τηρούνται αρχεία με λεπτομερή στοιχεία για τους λόγους που επέβαλαν κάθε κατάψυξη των δειγμάτων των ιστών ιχθύων.
Alternatively, samples may be pooled in RNA stabilization reagents, such as 0,2 g tissue/ml reagent according to the recommendation from the manufacturers, although each fish shall be processed individually and shall not be pooled in the samples because of the small amount of material to be used for extraction.
Ομογενοποίηση των οργάνων
Whole fish may also be sent to the laboratory.
Στο εργαστήριο ομογενοποιούνται πλήρως, με χωνευτήρα, αναμείκτη ή ιγδίο με αποστειρωμένη άμμο, οι ιστοί των ιχθύων που βρίσκονται στους σωλήνες και στη συνέχεια τοποθετούνται σε μορφή εναιωρήματος στο αρχικό υπόστρωμα μεταφοράς.
Shipment of samples for fish
Εάν το δείγμα αποτελείται από ολόκληρο ιχθύ μικρότερο από 4 cm, αυτός τεμαχίζεται με αποστειρωμένο ψαλίδι ή νυστέρι μετά την αφαίρεση του σώματος που βρίσκεται όπισθεν του ανοίγματος των εντοσθίων.
Tubes containing fish tissues in transport medium for cell cultivation or RT-PCR/RT-qPCR analysis shall be placed in insulated containers, such as thick-walled polystyrene boxes, together with sufficient ice or an alternative cooling medium with the similar cooling effect to ensure chilling of the samples during transportation to the laboratory.
Εάν το δείγμα αποτελείται από ολόκληρο ιχθύ με μήκος σώματος μεταξύ 4 και 6 cm, συλλέγονται τα εντόσθια, συμπεριλαμβανομένου του νεφρού.
However, freezing of the samples shall be avoided.
Εάν το δείγμα αποτελείται από ολόκληρο ιχθύ μήκους άνω των 6 cm, τα δείγματα ιστών συλλέγονται όπως περιγράφεται στο σημείο Ι.1.
The temperature of a sample during transit must never exceed 10 °C and ice must still be present in the transport box at receipt or one or more freeze blocks must still be partly or completely frozen.
Τα δείγματα ιστών τεμαχίζονται με αποστειρωμένο ψαλίδι ή νυστέρι, ομογενοποιούνται όπως περιγράφεται στην πρώτη παράγραφο του παρόντος σημείου και τοποθετούνται σε μορφή εναιωρήματος στο υπόστρωμα μεταφοράς.
Whole fish may be sent to the laboratory if the temperature requirements referred to in the first paragraph during transportation can be fulfilled.
Η τελική αναλογία μεταξύ του ιστολογικού υλικού και του υποστρώματος μεταφοράς προσαρμόζεται στο εργαστήριο σε 1:10.
Whole fish shall be wrapped up in paper with absorptive capacity and shall finally be shipped in a plastic bag.
Φυγοκέντρηση του πολτού
Live fish may also be shipped.
Ο πολτός φυγοκεντρείται σε καταψυχόμενο φυγόκεντρο στους 2 °C έως 5 °C στα 2000 έως 4000 × g επί 15 λεπτά και το υπερκείμενο υγρό συλλέγεται και μπορεί να εκτεθεί σε αντιβιοτικά είτε επί 4 ώρες στους 15 °C είτε ολόκληρη τη νύχτα στους 4 °C έως 8 °C.
Collection of supplementary diagnostic material
Εάν η αποστολή του δείγματος έγινε μέσα σε υπόστρωμα μεταφοράς, το υπερκείμενο υγρό δεν χρειάζεται περαιτέρω επεξεργασία με αντιβιοτικά.
When approved by the diagnostic laboratory, other fish tissues may be collected as well and prepared for supplementary examinations.
Εάν προκύψουν πρακτικές δυσκολίες, όπως βλάβη του επωαστή ή προβλήματα στις κυτταροκαλλιέργειες, που καθιστούν αδύνατο τον ενοφθαλμισμό των κυττάρων εντός 48 ωρών από τη δειγματοληψία των ιστών ιχθύων, επιτρέπεται η κατάψυξη του υπερκείμενου υγρού στους – 80 °C, αλλά θα πρέπει να πραγματοποιηθεί ιολογική εξέταση εντός 14 ημερών.
Preparation of samples for cell culture examination and RT-qPCR
Εάν το υπερκείμενο υγρό που συλλέχθηκε αποθηκευτεί στους – 80 °C εντός 48 ωρών από τη δειγματοληψία, μπορεί να ξαναχρησιμοποιηθεί μία μόνο φορά για ιολογική εξέταση.
Freezing in exceptional cases
Πριν από τον ενοφθαλμισμό των κυττάρων, το υπερκείμενο υγρό αναμειγνύεται με ίσα μέρη μιας κατάλληλα αραιωμένης ομάδας αντιορών στους ενδογενείς ορότυπους του ιού της λοιμώδους παγκρεατικής νέκρωσης (ΙΡΝ), και επωάζεται κατ' αυτόν τον τρόπο επί τουλάχιστον μία ώρα στους 15 °C ή το πολύ επί 18 ώρες στους 4 °C.
Where practical difficulties arise, which make it impossible to process the samples within 48 hours after the collection of the fish tissues, it may be acceptable to freeze the tissue specimens in transport medium at – 20 °C or below and to carry out virological examination within 14 days.
Ο τίτλος του αντιορού είναι τουλάχιστον 1/2000 σε δοκιμή εξουδετέρωσης 50 % της επιφανειακής πλάκας.
However, the fish tissue shall only be frozen and thawed once before examination.
Η επεξεργασία όλων των ενοφθαλμισμάτων με τον αντιορό στον ιό IPN αποσκοπεί στην αποτροπή ανάπτυξης του κυτταροπαθολογικού φαινομένου (ΚΠΦ), οφειλόμενου στον ιό ΙΡΝ, σε ενοφθαλμισμένες κυτταροκαλλιέργειες.
Records shall be kept with details on the reason for each freezing of fish tissue samples.
Αυτό θα μειώσει τη διάρκεια των ιολογικών εξετάσεων, καθώς και τον αριθμό των περιπτώσεων στις οποίες η εμφάνιση του ΚΠΦ θα θεωρείται εν δυνάμει ενδεικτική για VHSV ή ΙΗΝV.
Homogenisation of organs
Όταν τα δείγματα προέρχονται από μονάδες παραγωγής που θεωρούνται ως μη προσβληθείσες από IPN, είναι δυνατόν να παραλειφθεί η επεξεργασία των ενοφθαλμισμάτων με τον αντιορό στον ιό IPN.
In the laboratory, the fish tissue in the tubes shall be completely homogenised, either by stomacher, blender or mortar and pestle with sterile sand, and subsequently suspended in the original transport medium.
Προετοιμασία του δείγματος για προγράμματα επιτήρησης βασισμένα σε RT-PCR και RT-qPCR
If a sample consists of a whole fish less than 4 cm long, it shall be minced with sterile scissors or scalpel after removal of the body behind the gut opening.
Εάν η συλλογή των δειγμάτων έγινε σε υπόστρωμα μεταφοράς, διεξάγεται η διαδικασία που ορίζεται στα σημεία I.4.2 και I.4.3.
If a sample consists of a whole fish with body length between 4 cm and 6 cm, the viscera including kidney shall be collected.
Μετά τη φυγοκέντρηση, συλλέγεται το υπερκείμενο υγρό και πραγματοποιείται εξαγωγή του RNA.
If a sample consists of a whole fish more than 6 cm long, the tissue specimens shall be collected as described in point I.1.
Εφόσον δεν πρόκειται να διεξαχθεί περαιτέρω εξέταση αμέσως μετά τη φυγοκέντρηση, τα δείγματα καταψύχονται αμέσως σε θερμοκρασία – 20 °C ή χαμηλότερη.
The tissue specimens shall be minced with sterile scissors or scalpel and homogenised as described in the first paragraph of this point and suspended in transport medium.
Για ανάλυση των ιστών ιχθύων που διατηρούνται σε αντιδραστήριο σταθεροποίησης του RNA, διεξάγονται οι επακόλουθες εργασίες εντός των παρακάτω χρονικών ορίων για τα δείγματα που φυλάσσονται στις διάφορες θερμοκρασίες.
The final ratio between tissue material and transport medium shall be adjusted in the laboratory to 1:10.
δείγματα που φυλάσσονται στους 37 °C: μία ημέρα,
Centrifugation of homogenate
δείγματα που φυλάσσονται στους 25 °C: μία εβδομάδα,
The homogenate shall be centrifuged in a refrigerated centrifuge at 2 °C to 5 °C at 2000 to 4000 × g for 15 minutes and the supernatant collected and may be treated for either four hours at 15 °C or overnight at 4 to 8 °C with antibiotics.
δείγματα που φυλάσσονται στους 4 °C: ένας μήνας,
If the sample has been shipped in a transport medium, the treatment of the supernatant with antibiotics may be omitted.
δείγματα που φυλάσσονται στους – 20 °C: επ' αόριστον
Where practical difficulties arise, such as incubator breakdown or problems with cell cultures, which make it impossible to inoculate cells within 48 hours after the collection of the fish tissue samples, the supernatant may be frozen at – 80 °C and virological examination may be carried out within 14 days.
Τα δείγματα που έχουν ενοποιηθεί σε αντιδραστήριο σταθεροποίησης του RNA αντιμετωπίζονται ως μεμονωμένα δείγματα σε αντιδραστήριο σταθεροποίησης του RNA.
If the collected supernatant is stored at – 80 °C within 48 hours after the sampling, it may be reused only once for virological examination.
Για τα δείγματα που έχουν ενοποιηθεί σε αντιδραστήριο σταθεροποίησης του RNA, η ποσότητα δείγματος δεν υπερβαίνει την ποσότητα που συνιστάται από τον κατασκευαστή για την εξαγωγή με κιτ RNA, όπως τα κιτ RNeasy Mini (Qiagen) ή παρόμοια κιτ.
Prior to the inoculation of the cells, the supernatant shall be mixed with equal parts of a suitably diluted pool of antisera to the indigenous serotypes of Infectious pancreatic necrosis (IPN) virus and incubated with this for a minimum of one hour at 15 °C or a maximum of 18 hours at 4 °C.
Εάν έχουν ενοποιηθεί μεγαλύτερα δείγματα, τα κιτ ή οι μέθοδοι εξαγωγής πρέπει να ανταποκρίνονται σε αυτή την ενοποίηση.
The titre of the antiserum shall be at least 1/2000 in a 50 % plaque neutralisation test.
Τα δείγματα που συλλέγονται σε αντιδραστήρια σταθεροποίησης του RNA δεν χρησιμοποιούνται για κυτταροκαλλιέργειες.
Treatment of all inocula with antiserum to IPN virus aims at preventing cytopathic effect (CPE) due to IPN virus from developing in inoculated cell cultures.
Ενοποίηση δειγμάτων για RT-qPCR
This will reduce the duration of the virological examinations as well as the number of cases in which occurrence of CPE would have to be considered potentially indicative of VHSV or IHNV.
Λαμβάνοντας υπόψη ότι τα πρωτόκολλα RT-qPCR που παρέχονται είναι παρόμοιας ή υψηλότερης ευαισθησίας από τις μεθόδους κυτταροκαλλιέργειας, για την ανάλυση PCR μπορεί να είναι αποδεκτή η χρήση υπερκείμενου υγρού από ομογενοποιημένο ιστολογικό υλικό ιχθύων που προέρχεται από ενοποιημένα όργανα από έως 10 ιχθύς σε υπόστρωμα κυτταροκαλλιέργειας.
When samples come from production units, which are considered free from IPN, the treatment of inocula with antiserum to IPN virus may be omitted.
Ωστόσο, δεδομένου ότι το ενοφθάλμισμα που χρησιμοποιείται για την PCR είναι πολύ μικρότερο σε σύγκριση με αυτό της κυτταροκαλλιέργειας, γίνεται προσεκτική ομογενοποίηση όλων των ιστών ιχθύων πριν από την αντιπαραβολή του υλικού για εξαγωγή.
Sample preparation for RT-PCR and RT-qPCR based surveillance programmes
Η ίδια αρχή ισχύει και για δείγματα που συλλέγονται σε αντιδραστήρια σταθεροποίησης του RNA.
If samples were collected in transport medium, the procedure set out in points I.4.2 and I.4.3 shall be carried out.
Εντούτοις, στην περίπτωση αυτή συχνά είναι δύσκολο να συλλεχθεί αντιπροσωπευτικό υλικό από έως 10 ιχθύς σε έναν σωλήνα και επομένως ο αριθμός των ιχθύων ανά ομάδα μειώνεται σε 2 έως 5.
After centrifugation, supernatant shall be collected and RNA extracted.
Ιολογική εξέταση σε κυτταροκαλλιέργεια
If further examination is not to be undertaken directly after centrifugation, the samples shall be immediately frozen at – 20 °C or below.
Κυτταροκαλλιέργειες και υποστρώματα
For the analysis of fish tissues preserved in RNA stabilization reagent, subsequent work shall be carried out within the following time scales for samples stored at different temperatures:
Η κυτταρική σειρά BF-2 (Bluegill fry -2) ή RTG-2 (Rainbow trout gonad -2) και κύτταρα είτε EPC (Epithelioma papulosum cyprini) είτε FHM (Fathead minnow) αναπτύσσονται στους 20 έως 30 °C σε κατάλληλο υπόστρωμα, δηλαδή σε θρεπτικό υλικό ελάχιστων τροφικών απαιτήσεων Eagle (Eagle's Minimum essential medium — MEM) ή τροποποιήσεις αυτού, με συμπλήρωμα 10 % βοείου εμβρυακού ορού και αντιβιοτικών σε τυποποιημένες συγκεντρώσεις.
samples stored at 37 °C: 1 day;
Όταν τα κύτταρα καλλιεργούνται σε κλειστά φιαλίδια, το υπόστρωμα ρυθμίζεται με διττανθρακικό.
samples stored at 25 °C: 1 week;
Ωστόσο, είναι αποδεκτό ένα εύρος ηλικίας από 4 έως 48 ώρες.
samples stored at 4 °C: 1 month;
Τα κύτταρα πρέπει να αναπτύσσονται ενεργά κατά τον ενοφθαλμισμό.
samples stored at – 20 °C: indefinitely
Ενοφθαλμισμός κυτταροκαλλιεργειών
Pooled samples in RNA stabilization reagent shall be treated like single samples in RNA stabilization reagent.
Ενοφθαλμίζεται εναιώρημα οργάνου επεξεργασμένο με αντιβιοτικά μέσα σε κυτταροκαλλιέργειες σε δύο αραιώσεις, δηλαδή το αρχικό διάλυμα και, επιπρόσθετα, μια αραίωση 1:10 αυτού, η οποία δίνει αντίστοιχα τελικές αραιώσεις του ιστολογικού υλικού στο υπόστρωμα κυτταροκαλλιέργειας 1:100 και 1:1000 αντίστοιχα, για να αποφευχθεί ομόλογη αλληλεπίδραση.
For samples pooled in RNA stabilization reagent, the sample amount shall not exceed that recommended by the manufacturer for extraction with RNA kits, such as RNeasy Mini kits (Qiagen) or similar.
Ενοφθαλμίζονται τουλάχιστον δύο κυτταρικές σειρές, όπως αναφέρεται στο σημείο I.5.1.
If larger samples are pooled, the extraction kits or methods must reflect this pooling.
Η αναλογία μεγέθους ενοφθαλμίσματος και όγκου υποστρώματος κυτταροκαλλιέργειας πρέπει να είναι περίπου 1:10.
Samples collected in RNA stabilization reagents shall not be used for cell cultivation.
Χρησιμοποιούνται δίσκοι κυτταροκαλλιέργειας όπου είναι δυνατόν.
As the RT-qPCR protocols given are of similar or higher sensitivity than the cell cultivation methods, it may be acceptable to use supernatant from homogenised fish tissue material of pooled organs from up to 10 fish in cell culture medium for PCR.
Επώαση των κυτταροκαλλιεργειών
However, due to the much smaller inoculum used for PCR compared to cell cultivation, all fish tissues shall be carefully homogenised before collating material for extraction.
Οι ενοφθαλμισμένες κυτταροκαλλιέργειες επωάζονται στους 15 °C επί επτά έως δέκα ημέρες.
The same principle shall also be applied if samples are collected in RNA stabilization reagents.
Εάν το χρώμα του υποστρώματος της κυτταροκαλλιέργειας αλλάξει από κόκκινο σε κίτρινο, υποδηλώνοντας οξίνιση του υποστρώματος, πραγματοποιείται προσαρμογή του pH με αποστειρωμένο διάλυμα διττανθρακικού ή ισοδύναμες ουσίες, προκειμένου να εξασφαλιστεί η επιδεκτικότητα των κυττάρων στη μόλυνση από τον ιό.
However, in that case it is often difficult to collect representative material from up to 10 fish in one tube, and the number of fish per pool shall therefore be reduced to 2 to 5.
Ανά έξι μήνες τουλάχιστον, ή εφόσον υπάρχει υπόνοια μειωμένης επιδεκτικότητας των κυττάρων, πραγματοποιείται τιτλοδότηση κατεψυγμένων αποθεμάτων των VHSV και IHNV για να επαληθευτεί η επιδεκτικότητα των κυτταροκαλλιεργειών στη μόλυνση.
Virological examination on cell culture
Χρησιμοποιείται η διαδικασία που ορίζεται στο τμήμα III, εάν είναι δυνατόν.
Cell cultures and media
Μικροσκοπική εξέταση
Bluegill fry cell line -2 (BF-2) or Rainbow trout gonad cell line - 2 (RTG-2) and either Epithelioma papulosum cyprini (EPC) or Fathead minnow (FHM) cells shall be grown at 20 to 30 °C in suitable medium, namely Eagle's Minimum essential medium (MEM) or modifications thereof, with a supplement of 10 % foetal bovine serum and antibiotics in standard concentrations.
Οι ενοφθαλμισμένες κυτταροκαλλιέργειες επιθεωρούνται τακτικά, τουλάχιστον τρεις φορές την εβδομάδα, ως προς την εμφάνιση ΚΦΠ σε μεγέθυνση κατά 40 έως 150 φορές.
When the cells are cultivated in closed vials, the medium shall be buffered with bicarbonate.
Εάν παρατηρηθεί εμφανές ΚΠΦ, αρχίζουν αμέσως οι διαδικασίες ταυτοποίησης ιού σύμφωνα με το σημείο I.6.
The medium used for cultivation of cells in open units may be buffered with tris(hydroxymethyl)aminomethane-HCl (Tris-HCl) (23 mM) and sodium bicarbonate (6 mM).
Υποκαλλιέργεια
The pH must be 7,6 ± 0,2.
Εάν δεν έχει αναπτυχθεί ΚΠΦ μετά την αρχική επώαση επί 7 έως 10 ημέρες, πραγματοποιείται υποκαλλιέργεια σε πρόσφατες κυτταροκαλλιέργειες με τη χρήση κυτταρικής επιφάνειας παρόμοιας με αυτήν της αρχικής καλλιέργειας.
The cell cultures to be used for inoculation with fish tissue material shall be young, normally 1 day old cell culture monolayers where possible; however, a range between 4 to 48 hours old may be accepted.
Υποπολλαπλάσια του υποστρώματος (υπερκείμενου υγρού) από όλες τις καλλιέργειες ή κοιλότητες που συνιστούν την αρχική καλλιέργεια ενοποιούνται, σύμφωνα με την κυτταρική σειρά, 7 έως 10 ημέρες μετά τον ενοφθαλμισμό.
The cells must be actively growing at inoculation.
Στη συνέχεια, οι ομάδες ενοφθαλμίζονται σε ομόλογες κυτταροκαλλιέργειες, μη αραιωμένες και σε αραίωση 1:10 (δίνοντας τελικές αραιώσεις του υπερκείμενου υγρού 1:10 και 1:100 αντίστοιχα), όπως περιγράφεται στο σημείο I.5.2.
Inoculation of cell cultures
Εναλλακτικά, υποπολλαπλάσια της τάξης του 10 % του υποστρώματος, που αποτελούν την αρχική καλλιέργεια, ενοφθαλμίζονται απευθείας σε μια κοιλότητα με πρόσφατη κυτταροκαλλιέργεια (δηλαδή υποκαλλιέργεια κοιλότητας προς κοιλότητα).
Antibiotic-treated organ suspension shall be inoculated into cell cultures in two dilutions, namely the primary dilution and, in addition, a 1:10 dilution thereof, resulting in final dilutions of tissue material in cell culture medium of 1:100 and 1:1000, respectively, in order to prevent homologous interference.
Πριν από τον ενοφθαλμισμό μπορεί να προηγηθεί προεπώαση των αραιώσεων με αντιορό στον ιό ΙΡΝ σε κατάλληλη αραίωση, όπως περιγράφεται στο σημείο I.4.3.
At least two cell lines shall be inoculated as referred to in point I.5.1.
Στη συνέχεια, οι ενοφθαλμισμένες καλλιέργειες επωάζονται επί 7 έως 10 ημέρες στους 15 °C υπό παρακολούθηση σύμφωνα με το σημείο I.5.4.
The ratio between inoculum size and volume of cell culture medium shall be about 1:10.
Εάν παρατηρηθεί τοξικό ΚΠΦ κατά τις τρεις πρώτες ημέρες της επώασης, πραγματοποιείται σε αυτό το στάδιο υποκαλλιέργεια, αλλά στη συνέχεια τα κύτταρα επωάζονται επί επτά ημέρες και πραγματοποιείται ξανά υποκαλλιέργεια, ακολουθούμενη από άλλες επτά ημέρες επώασης.
For each dilution and each cell line, a minimum of about 2 cm2 cell area, corresponding to one well in a 24-well cell culture tray, shall be utilised.
Όταν παρατηρείται τοξικό ΚΠΦ μετά τις τρεις ημέρες, τα κύτταρα γίνονται δεκτά μία φορά και επωάζονται, προκειμένου να συμπληρώσουν συνολικά 14 ημέρες από τον αρχικό ενοφθαλμισμό.
Cell culture trays shall be used where possible.
Δεν θα πρέπει να παρατηρηθούν ενδείξεις τοξικότητας κατά τη διάρκεια των επτά τελευταίων ημερών επώασης.
Incubation of cell cultures
Εάν, παρά την αγωγή με αντιβιοτικά, παρουσιαστεί βακτηριακή μόλυνση, πριν από την υποκαλλιέργεια πραγματοποιείται φυγοκέντρηση στα 2000 έως 4000 × g επί 15 έως 30 λεπτά στους 2 έως 5 °C ή διήθηση του υπερκείμενου υγρού μέσω φίλτρου 0,45 μm ή και τα δύο (χαμηλή πρωτεϊνική σταθεροποίηση της μεμβράνης).
The inoculated cell cultures shall be incubated at 15 °C for seven to 10 days.
Επιπροσθέτως αυτής της διαδικασίας, για την υποκαλλιέργεια ακολουθούνται οι ίδιες διαδικασίες με αυτές που περιγράφονται για το τοξικό ΚΠΦ στο τέταρτο εδάφιο του παρόντος σημείου.
If the colour of the cell culture medium changes from red to yellow indicating medium acidification, pH adjustment with sterile bicarbonate solution or equivalent substances shall be performed to ensure cell susceptibility to virus infection.
Εάν δεν προκύψει ΚΠΦ, η δοκιμή μπορεί να θεωρηθεί αρνητική.
At least every 6 months or if decreased cell susceptibility is suspected, titration of frozen stocks of VHSV and IHNV shall be performed to verify the susceptibility of the cell cultures to infection.
Ταυτοποίηση του ιού
The procedure set out in Section III shall be used, if possible.
Εάν παρατηρηθούν ενδείξεις ΚΠΦ σε μια κυτταροκαλλιέργεια, το υπόστρωμα (υπερκείμενο υγρό) συλλέγεται και εξετάζεται σύμφωνα με μία ή περισσότερες από τις ακόλουθες τεχνικές: ενζυμική δοκιμασία ανοσοπροσρόφησης (ELISA), ανοσοφθορισμός (IF), εξουδετέρωση, RT-PCR ή RT-qPCR.
Microscopy
Εφόσον οι δοκιμές αυτές δεν επιτρέψουν την οριστική ταυτοποίηση του ιού εντός μιας εβδομάδας, το υπερκείμενο υγρό αποστέλλεται για άμεση ταυτοποίηση στο εθνικό εργαστήριο αναφοράς ή στο εργαστήριο αναφοράς της ΕΕ για ασθένειες ιχθύων που αναφέρεται στο παράρτημα VI της οδηγίας 2006/88/ΕΚ.
Inoculated cell cultures shall be inspected regularly, at least three times a week, for the occurrence of CPE at 40 to 150 × magnification.
Πραγματοποιείται δοκιμή ELISA τύπου σάντουιτς με χρήση διπλού αντισώματος προκειμένου να ταυτοποιηθεί το απομόνωμα ιού.
If obvious CPE is observed, virus identification procedures in accordance with point I.6 shall be initiated immediately.
Επιστρώνονται τρυβλία μικροτιτλοδότησης με 50 μl/κοιλότητα (0,9 pg) ανοσοσφαιρίνης (Ig) καθαρισμένης με πρωτεΐνη Α και αποδεδειγμένης ποιότητας που προέρχεται από αντιορό κουνελιού έναντι του IHNV ή του VSHV, η οποία έχει αραιωθεί σε ρυθμιστικό διάλυμα ανθρακικών (pH 9,6) που περιέχει 15 mM νατραζιδίου, και επωάζονται επί 18 ώρες έως 2 εβδομάδες στους 4 °C.
Subcultivation
Σε ένα τρυβλίο αραίωσης, κάθε δείγμα που περιέχει 1 % Triton X-100 καθώς και οι θετικοί μάρτυρες υποβάλλονται σε τετραπλή αραίωση με ρυθμιστικό διάλυμα (ήτοι ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών ιόντων (PBS)-T-BSA, 1 % BSA) ως εξής: χωρίς αραίωση, 1:4, 1:16, 1:64.
If no CPE has developed after the primary incubation for 7 to 10 days, subcultivation shall be performed to fresh cell cultures utilising a cell area similar to that of the primary culture.
Τα τρυβλία ELISA εκπλένονται σε PBS που περιέχει 0,05 % Tween-20 (PBS-T) και μεταφέρονται 50 μl κάθε αραίωσης από το τρυβλίο αραίωσης στο πλυμένο και επιστρωμένο τρυβλίο ELISA.
Aliquots of medium (supernatant) from all cultures or wells constituting the primary culture shall be pooled according to cell line 7 to 10 days after inoculation.
Στο τρυβλίο ELISA μεταφέρονται 50μl αντισωμάτων κουνελιού έναντι του ορού ποντικιού συζευγμένα με υπεροξειδάση (HRP) αφού προηγουμένως αραιωθούν σε PBS-T-BSA σε αναλογία 1:1000.
The pools shall then be inoculated into homologous cell cultures undiluted and diluted 1:10 (resulting in final dilutions of 1:10 and 1:100, respectively, of the supernatant) as described in point I.5.2.
Τέλος, ακολουθεί ένας νέος κύκλος έκπλυσης και, στη συνέχεια, οι αντιδράσεις αναπτύσσονται με την προσθήκη 50 μl ορθο-φαινυλενοδιαμίνης (OPD) σε κάθε κοιλότητα.
Alternatively, aliquots of 10 % of the medium constituting the primary culture shall be inoculated directly into a well with fresh cell culture (namely, well to well subcultivation).
Τα τρυβλία ELISA επωάζονται επί 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι και η αντίδραση διακόπτεται με την προσθήκη 100 μl H2SO4 0,5 M σε κάθε κοιλότητα.
The inoculation may be preceded by pre-incubation of the dilutions with the antiserum to IPN virus at appropriate dilution as described in point I.4.3.
Η απορρόφηση παρακολουθείται σε μήκος κύματος 492 και 620 nm σε συσκευή ανάγνωσης ELISA.
The inoculated cultures shall then be incubated for 7 to 10 days at 15 °C and inspected in accordance with point I.5.4.
Τα δείγματα χαρακτηρίζονται ως θετικά ή αρνητικά κατόπιν σύγκρισης των αποτελεσμάτων της δοκιμής με τις τιμές απορρόφησης των θετικών και αρνητικών μαρτύρων.
If toxic CPE occurs within the first 3 days of incubation, subcultivation shall be performed at that stage, but the cells shall then be incubated for 7 days and sub cultivated again with further 7 days incubation.
Γενικά, τα δείγματα με συνδυασμένη απορρόφηση (A) < 0,5 για υλικό χωρίς αραίωση θεωρούνται αρνητικά, τα δείγματα με τιμές A μεταξύ 0,5 και 1,0 θεωρούνται ύποπτα και τα δείγματα με τιμές A > 1,0 θεωρούνται θετικά.
When toxic CPE develops after 3 days, the cells shall be passed once and incubated to achieve the total of 14 days from the primary inoculation.
Μπορούν να χρησιμοποιηθούν άλλες εκδοχές ELISA αποδεδειγμένης παρόμοιας αποτελεσματικότητας αντί αυτών που αναφέρονται στο παρόν σημείο.
There must be no evidence of toxicity in the final 7 days of incubation.
Όταν γίνεται ταυτοποίηση του IHNV, του VHSV ή και των δύο μέσω της επιμόλυνσης κυττάρων σε καλυπτρίδες, εφαρμόζεται το ακόλουθο πρωτόκολλο:
If no CPE occurs, the test may be declared negative.