natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Για την ανίχνευση του M. refringens, η PCR πραγματοποιείται με εκκινητές που στοχεύουν την περιοχή ITS1 (5′-CCG-CAC-ACG-TTC-TTC-ACT-CC-3′ και 5′-CTC-GCG-AGT-TTC-GAC-AGA-CG-3′).
Molecular techniques
Οι θετικοί μάρτυρες αποτελούνται από γονιδιωματικό DNA προερχόμενο από έντονα μολυσμένο ξενιστή ή πλασμιδιακό DNA που περιλαμβάνει την περιοχή-στόχο.
DNA extraction kits, which are available commercially and usually produce high quality DNA suitable for use with the PCR protocols as described in point I.3.2, may be used.
Οι αρνητικοί μάρτυρες αποτελούνται από γονιδιωματικό DNA προερχόμενο από μη μολυσμένους ξενιστές και αντιδρώντα της PCR που δεν περιλαμβάνουν το DNA-στόχο.
Polymerase chain reaction (PCR)
Ένα θετικό αποτέλεσμα δίνει προϊόν του αναμενόμενου μεγέθους (412 bp) κατά την ενίσχυση με PCR, ενώ όλοι οι αρνητικοί μάρτυρες πρέπει να δώσουν αρνητικό αποτέλεσμα και όλοι οι θετικοί μάρτυρες πρέπει να δώσουν θετικό αποτέλεσμα.
Several PCR protocols have been developed and published.
In-situ υβριδισμός (ISH)
PCR primers that target the internal transcribed spacer (ITS1) region shall be used as they are able to amplify only M. refringens.
Έχουν αναπτυχθεί και δημοσιευθεί αρκετά πρωτόκολλα ISH.
PCR shall be carried out in a 50 μl volume.
Χρησιμοποιείται ανιχνευτής που στοχεύει τη μικρή υπομονάδα (SSU) του συμπλέγματος rRNA επειδή έχει επικυρωθεί ιστολογικά.
PCR mixtures shall contain buffer (500 mM KCl, 100 mM Tris/HCl [pH 9,0 at 25 °C] and 1 % Triton® X-100), 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP mix, 1 μM forward and reverse primers, 0,02 units μl– 1 Taq DNA polymerase, and 10 to100 ng of extracted DNA.
Τμήματα ιστού που περιλαμβάνουν βράγχια και πεπτικό αδένα σταθεροποιούνται για τουλάχιστον 24 ώρες σε υλικό σταθεροποίησης Davidson και ακολουθεί η συνήθης επεξεργασία για ιστολογική εξέταση σε μπλοκ παραφίνης.
After denaturation of DNA at 94 °C for five minutes, 30 cycles shall be run as follows: denaturation at 94 °C for one minute, annealing at 55 °C for one minute, and elongation at 72 °C for one minute per kilo-base pair.
Τμήματα των 5 μm κόβονται και τοποθετούνται σε αντικειμενοφόρες πλάκες επιστρωμένες με αμινοαλκυλοσιλάνιο, οι οποίες στη συνέχεια τοποθετούνται σε φούρνο στους 40 °C ολονυχτίς.
A final elongation step of 10 minutes at 72 °C shall be performed.
Τα τμήματα υφίστανται αποκήρωση μέσω εμβάπτισης σε ξυλόλιο επί 10 λεπτά.
For the detection of M. refringens, PCR shall be performed with primers that target the ITS1 region (5′-CCG-CAC-ACG-TTC-TTC-ACT-CC-3′ and 5′-CTC-GCG-AGT-TTC-GAC-AGA-CG-3′).
Το βήμα αυτό επαναλαμβάνεται μία φορά και, στη συνέχεια, ο διαλύτης εξαλείφεται μέσω εμβάπτισης σε δύο διαδοχικά λουτρά απόλυτης αιθανόλης επί 10 λεπτά έκαστο.
Positive controls shall consist of genomic DNA from a highly infected host or plasmidic DNA including the target region.
Κατόπιν, τα τμήματα επανενυδατώνονται μέσω εμβάπτισης σε διαβαθμισμένη σειρά αιθανόλης.
Negative controls shall consist of genomic DNA from non-infected hosts and PCR reactives without target DNA.
Τα τμήματα υφίστανται επεξεργασία με πρωτεϊνάση Κ (100 μg ml–1) σε ρυθμιστικό διάλυμα TE [Tris (50 mM), EDTA (10 mM)], στους 37 °C επί 30 λεπτά.
A positive result shall be positive PCR amplification at the expected size (412 bp), with all negative controls being negative and all positive controls being positive.
Οι αντικειμενοφόρες πλάκες αφυδατώνονται μέσω εμβάπτισης σε διαβαθμισμένη σειρά αιθανόλης και, στη συνέχεια, ξηραίνονται δι' αέρος.
In-situ hybridisation (ISH)
Τα τμήματα επωάζονται με 100 μl ρυθμιστικού διαλύματος υβριδισμού [4 × SSC (standard saline citrate), 50 % φορμαμίδιο, 1 × διάλυμα Denhardt, 250 μg ml–1 tRNA ζυμομυκήτων, 10 % θειικό άλας δεξτρανών] που περιέχει 10 ng (1 μl των αντιδρώντων PCR προετοιμάζεται όπως περιγράφεται στο σημείο I.3.2 με τη χρήση των εκκινητών CCG-GTG-CCA-GGT-ATA-TCT-CG και TTC-GGG-TGG-TCT-TGA-AAG-GC) του επισημασμένου με διγοξιγενίνη ανιχνευτή.
Several ISH protocols have been developed and published.
Τα τμήματα σκεπάζονται με πλαστικές καλυπτρίδες in-situ και τοποθετούνται σε θερμικό μπλοκ στους 95 °C για 5 λεπτά.
Probe that targets the SSU of the rRNA gene complex shall be used because it has been validated against histology.
Κατόπιν, οι αντικειμενοφόρες πλάκες ψύχονται σε πάγο για 1 λεπτό και ακολουθεί υβριδισμός ολονυχτίς στους 42 °C σε υγρό θάλαμο.
Sections of tissue that include gills, digestive gland, shall be fixed for at least 24 hours in Davidson's fixative followed by normal processing for paraffin histology.
Τα τμήματα εκπλένονται δύο φορές για 5 λεπτά σε 2 × SSC σε θερμοκρασία δωματίου και μία φορά για 10 λεπτά σε 0,4 × SSC στους 42 °C.
Sections of 5 μm shall be cut and placed on aminoalkylsilane-coated slides, which shall then be baked overnight in an oven at 40 °C.
Τα βήματα ανίχνευσης πραγματοποιούνται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.
The sections shall be dewaxed by immersing in xylene for 10 minutes.
Στη συνέχεια, οι αντικειμενοφόρες πλάκες εκπλένονται σε αποστειρωμένο αποσταγμένο νερό (dH2O).
This step shall be repeated once and then the solvent shall be eliminated by immersion in two successive absolute ethanol baths for 10 minutes each.
Τα τμήματα υφίστανται αντιχρώση με Bismarck Brown Yellow, εκπλένονται με dH2O και τοποθετούνται καλυπτρίδες με τη χρήση υδατικού υποστρώματος στερέωσης.
The sections shall then be dehydrated by immersion in a graded ethanol series.
Οι θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες θα είναι τμήματα που προέρχονται από γνωστούς μολυσμένους και μη μολυσμένους ξενιστές, αντίστοιχα.
The sections shall be treated with proteinase K (100 μg ml– 1) in TE buffer (Tris [50 mM], EDTA [10 mM]), at 37 °C for 30 minutes.
Ένα θετικό αποτέλεσμα τεκμηριώνεται από τη μαύρη ιώδη χρώση των κυττάρων M. refringens στο πλαίσιο γνωστών ιστών-στόχων, ενώ όλοι οι αρνητικοί μάρτυρες πρέπει να δώσουν αρνητικό αποτέλεσμα και όλοι οι θετικοί μάρτυρες πρέπει να δώσουν θετικό αποτέλεσμα.
Slides shall be dehydrated by immersion in a graded ethanol series and then air dried.
Προσδιορισμός αλληλουχίας
Sections shall be incubated with 100 μl of hybridisation buffer (4 × SSC [standard saline citrate], 50 % formamide, 1 × Denhardt's solution, 250 μg ml– 1 yeast tRNA, 10 % dextran sulphate) containing 10 ng (1 μl of the PCR reactants prepared as described in point I.3.2 using primers CCG-GTG-CCA-GGT-ATA-TCT-CG and TTC-GGG-TGG-TCT-TGA-AAG-GC) of the digoxigenin-labelled probe.
Ο προσδιορισμός αλληλουχίας διεξάγεται ως ένα από τα τελικά βήματα των επιβεβαιωτικών διαγνωστικών διαδικασιών.
Sections shall be covered with in-situ plastic cover-slips and placed on a heating block at 95 °C for five minutes.
Οι περιοχές-στόχοι είναι το SSU rDNA και η ITS1.
Slides shall then be cooled on ice for one minute before overnight hybridisation at 42 °C in a humid chamber.
Λεπτομερείς διαγνωστικές μέθοδοι και διαδικασίες για την επιτήρηση και επιβεβαίωση λοίμωξης από Marteilia refringens
Sections shall be washed twice for five minutes in 2 × SSC at room temperature, and once for 10 minutes in 0,4 × SSC at 42 °C.
Για τους σκοπούς των προγραμμάτων επιτήρησης και για την επιβεβαίωση της παρουσίας λοίμωξης από Marteilia refringens ή για τον αποκλεισμό της υπόνοιας για την εν λόγω ασθένεια που περιλαμβάνεται στον κατάλογο, σύμφωνα με τις απαιτήσεις που προβλέπονται στο παράρτημα I μέρος 4 τμήμα II, οι διαγνωστικές μέθοδοι και οι αντίστοιχες διαδικασίες που θα χρησιμοποιηθούν είναι σύμφωνες με τις κατευθυντήριες γραμμές που προβλέπονται στον πίνακα 4.1, ως εξής:
The detection steps shall be performed according to the manufacturer's instructions.
Πίνακας 4.1
The slides shall then be rinsed in sterile distilled water (dH2O).
Κατευθυντήριες γραμμές σχετικά με τη χρήση των διαγνωστικών μεθόδων για τα προγράμματα επιτήρησης και για την επιβεβαίωση ή τον αποκλεισμό λοίμωξης από Marteilia refringens
The sections shall be counter-stained with Bismarck Brown Yellow, rinsed in dH2O, and cover-slips shall be applied using an aqueous mounting medium.
Μέθοδος
Positive and negative controls shall be sections from known infected and non-infected hosts respectively.
Στοχευμένη επιτήρηση
A positive result shall be demonstrated by the purple-black labelling of M. refringens cells within known target tissues, with all negative controls being negative and all positive controls being positive.
Πιθανολογούμενη διάγνωση
Sequencing
Επιβεβαιωτική διάγνωση
Sequencing shall be carried out as one of the final steps for confirmatory diagnostic.
Αποτυπώματα πεπτικού αδένα
Targeted regions are the SSU rDNA and ITS1.
X, ή
Detailed diagnostic methods and procedures for surveillance and confirmation of infection with Marteilia refringens
Ιστοπαθολογία
For the purpose of surveillance programmes and to confirm the presence of an infection with Marteilia refringens or to rule out a suspicion of that listed disease, in accordance with the requirements laid down in Section II of Part 4 to Annex I, the diagnostic methods and corresponding procedures to be used shall be in accordance with the guidelines laid down in Table 4.1 as follows:
In situ υβριδισμός
Table 4.1
X, και
Guidelines for the use of diagnostic methods for the surveillance programmes and to confirm or rule out infection with Marteilia refringens
ΛΕΠΤΟΜΕΡΕΙΣ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΑΙ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΕΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΠΙΤΗΡΗΣΗ ΚΑΙ ΕΠΙΒΕΒΑΙΩΣΗ ΛΟΙΜΩΞΗΣ ΑΠΟ BONAMIA OSTREAE
Method
I.
Targeted surveillance
Διαδικασίες για τη διάγνωση λοίμωξης από Bonamia ostreae
Presumptive diagnosis
Κατά τη διενέργεια της δειγματοληψίας και των εργαστηριακών εξετάσεων για τους σκοπούς της απόκτησης ή διατήρησης ενός συγκεκριμένου υγειονομικού καθεστώτος όσον αφορά τις λοιμώξεις από Bonamia ostreae, όπως ορίζεται στο παράρτημα I μέρος 5 τμήμα I, ή για την επιβεβαίωση ή τον αποκλεισμό της παρουσίας της εν λόγω ασθένειας που περιλαμβάνεται στον κατάλογο σύμφωνα με το άρθρο 57 στοιχείο β) της οδηγίας 2006/88/ΕΚ, με τη χρήση των διαγνωστικών μεθόδων που προβλέπονται στο παράρτημα I μέρος 5 τμήμα II, εφαρμόζονται οι λεπτομερείς διαγνωστικές μέθοδοι και διαδικασίες που προβλέπονται στα σημεία I.1, I.2 και I.3 αυτού του μέρους.
Confirmatory diagnosis
Επεξεργασία του δείγματος
Digestive gland imprints
Μετά τη δειγματοληψία, τα στρείδια διατηρούνται στους 4 °C ή στο ψυγείο επάνω σε πάγο για 24 ώρες το μέγιστο εάν τα δείγματα περιλαμβάνουν ανοιχτά μαλάκια και για έως 72 ώρες στην αντίθετη περίπτωση, μέσα σε πλαστική σακούλα που φέρει επισήμανση, η οποία περιλαμβάνει στοιχεία που αφορούν τη φύση και την προέλευση των στρειδιών.
X, or
Για τη διάγνωση του Bonamia ostreae μέσω ιστολογικής ανάλυσης χρησιμοποιείται τμήμα ιστών πάχους 3 έως 5 mm που περιλαμβάνει βράγχια και καρδιακό ιστό.
Histopathology
Μετά την ξήρανση των βραγχίων και των καρδιακών ιστών σε απορροφητικό χαρτί, πραγματοποιούνται αρκετά αποτυπώματα σε μια αντικειμενοφόρο πλάκα.
In situ hybridisation
Οι αντικειμενοφόρες πλάκες ξηραίνονται δι' αέρος, σταθεροποιούνται σε μεθανόλη ή απόλυτη αιθανόλη και υφίστανται χρώση με ένα εμπορικά διαθέσιμο κιτ χρώσης του αίματος (όπως το Diff-Quik®/Hemacolor®), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.
X, and
Οι αντικειμενοφόρες πλάκες αρχικά εξετάζονται σε μεγέθυνση × 200 και, στη συνέχεια, σε μεγέθυνση × 1000 με τη χρήση ελαίου κατάδυσης.
DETAILED DIAGNOSTIC METHODS AND PROCEDURES FOR THE SURVEILLANCE AND CONFIRMATION OF INFECTION WITH BONAMIA OSTREAE
Ένα θετικό αποτέλεσμα θεωρείται η παρουσία μικρών σφαιρικών ή ωοειδών οργανισμών (πλάτους 2 έως 5 μm) εντός των αιμοκυττάρων.
I. Procedures for diagnosis of Infection with Bonamia ostreae
Ωστόσο, το παράσιτο μπορεί να βρίσκεται και στην εξωκυττάρια περιοχή.
When sampling and laboratory examination are carried out for the purpose of obtaining or maintaining a certain health status with regard to Bonamia ostreae as set out in Section I of Part 5 of Annex I or to confirm or rule out the presence of that listed disease in accordance with Article 57(b) of Directive 2006/88/EC, using the diagnostic methods set out in Section II of Part 5 of Annex I, the detailed diagnostic methods and procedures set out in following points I.1, I.2 and I.3 shall apply.
Οι οργανισμοί αυτοί διαθέτουν βασεόφιλο κυτταρόπλασμα και ηωσινόφιλο πυρήνα (τα χρώματα ενδέχεται να διαφέρουν ανάλογα με τη χρώση που χρησιμοποιείται) και, επειδή απλώνονται στην αντικειμενοφόρο πλάκα, μπορεί να εμφανίζονται με μεγαλύτερο πλάτος στα αποτυπώματα απ' ό,τι στην ιστολογική εξέταση.
Sample process
Μπορεί να παρατηρηθούν πολυπύρηνα κύτταρα.
Once sampled, oysters shall be maintained at 4 °C or on refrigerated ice for no more than 24 hours if samples include gaping molluscs and 72 hours if not, in a plastic bag including a label with details related to the nature and the origin of the oysters.
Τμήματα ιστού που περιλαμβάνουν βράγχια και πεπτικό αδένα σταθεροποιούνται για διάστημα τουλάχιστον 24 ωρών σε υλικό σταθεροποίησης Davidson και ακολουθεί η συνήθης επεξεργασία για ιστολογική εξέταση σε μπλοκ παραφίνης και χρώση, για παράδειγμα αιματοξυλίνη και εωσίνη.
A 3 to 5 mm thick section of tissues including gills and heart tissue shall be used for the diagnostic of Bonamia ostreae by histology.
Για την αποφυγή κάθε αμφιβολίας, γίνεται παρατήρηση για την παρουσία του παρασίτου εντός των αιμοκυττάρων για θετική διάγνωση.
Slides shall be air-dried, fixed in methanol or in absolute ethanol and stained using a commercially available blood-staining kit (namely such as Diff- Quik®/Hemacolor®.), in accordance with the manufacturer's instructions.
Μπορούν να χρησιμοποιηθούν κιτ εξαγωγής DNA, τα οποία διατίθενται στο εμπόριο και συνήθως παράγουν DNA υψηλής ποιότητας κατάλληλο για χρήση με τα πρωτόκολλα PCR όπως περιγράφονται κατωτέρω.
Slides shall be observed first at × 200 magnification and then under oil immersion at × 1000 magnification.
Μπορούν να χρησιμοποιηθούν δύο πρωτόκολλα PCR που στοχεύουν τη μικρή υπομονάδα (SSU) του rDNA:
A positive result shall be the presence of small spherical or ovoid organisms (2 to 5 μm wide) within haemocytes.
Τα μείγματα PCR αποτελούνται από ρυθμιστικό διάλυμα [500 mM KCl, 100 mM Tris/HCl (pH 9,0 στους 25 °C) και 1 % Triton® X-100], 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM μείγματος dNTP, 1 μM πρόσθιων και αντίστροφων εκκινητών, 0,02 μονάδες μl–1 Taq DNA πολυμεράση και 0,2 ng μl–1 του εκμαγείου DNA συνολικού όγκου 50 μl.
However, the parasite might also occur extracellularly.
Τα δείγματα αποδιατάσσονται σε θερμικό κυκλοποιητή επί 5 λεπτά στους 94 °C, στη συνέχεια υποβάλλονται σε 30 κύκλους (94 °C επί 1 λεπτό, 55 °C επί 1 λεπτό, 72 °C επί 1 λεπτό) και ακολουθεί τελική επιμήκυνση επί 10 λεπτά στους 72 °C.
These organisms show a basophilic cytoplasm and an eosinophilic nucleus (colours may vary with the stain used) and, because they spread on the slide, they can appear wider on imprints than on histological examination.
Ένα θετικό αποτέλεσμα δίνει προϊόν του αναμενόμενου μεγέθους (δηλαδή 300 bp) κατά την ενίσχυση με PCR, ενώ όλοι οι αρνητικοί μάρτυρες πρέπει να δώσουν αρνητικό αποτέλεσμα και όλοι οι θετικοί μάρτυρες πρέπει να δώσουν θετικό αποτέλεσμα.
Multinucleated cells may be observed.
το δεύτερο πρωτόκολλο PCR είναι μια δοκιμασία PCR σε πραγματικό χρόνο SYBR® Green.
Sections of tissue that include gills and digestive gland, shall be fixed for a period of at least 24 hours in Davidson's fixative followed by normal processing for paraffin histology and staining, for example with haematoxylin and eosin.
Επιτρέπει την ειδική ανίχνευση του B. ostreae (περιγράφεται κατωτέρω) και μπορεί να συνδυαστεί με δοκιμασία PCR σε πραγματικό χρόνο SYBR® Green ώστε να είναι δυνατή η ειδική ανίχνευση του B. exitiosa (Ramilo et al.
A positive result shall be the presence of parasites as very small cells of 2 to 5 μm wide within the haemocytes or free in the connective tissue or sinuses of gill, gut and mantle epithelium, often associated with an intense inflammatory reaction.
2013).
To avoid any doubt, the parasite shall be observed inside the haemocyte for a positive diagnosis.
Οι εκκινητές BOSTRE-F (5′- TTACGTCCCTGCCCTTTGTA-3′) και BOSTRE-R (5′- TCGCGGTTGAATTTTATCGT-3′) ενισχύουν ένα προϊόν μεγέθους 208 bp.
DNA extraction kits, which are available commercially and usually produce high quality DNA suitable for use with the PCR protocols as detailed below, may be used.
Τα μείγματα PCR αποτελούνται από SYBR® Green Master Mix (1X), 0,3 μM πρόσθιων και αντίστροφων εκκινητών και 200 ng του εξαχθέντος DNA.
Two PCR protocols targeting the small subunit (SSU) rDNA may be used:
Τα δείγματα αποδιατάσσονται σε σύστημα ανίχνευσης πραγματικού χρόνου επί 10 λεπτά στους 95 °C και, στη συνέχεια, υποβάλλονται σε 35 κύκλους (95 °C επί 30 δευτερόλεπτα, 55 °C επί 45 δευτερόλεπτα και 72 °C επί 1 λεπτό).
the first one is a conventional PCR that amplify several members of the Haplosporidia including Bonamia spp.
Η ανάλυση της καμπύλης θερμοκρασίας αποδιάταξης διεξάγεται με αυξήσεις της θερμοκρασίας των 0,5 °C, ξεκινώντας από τους 55 °C και φθάνοντας στους 95 °C, ενώ γίνεται καταγραφή του φθορισμού σε κάθε θερμοκρασιακή αλλαγή.
Primers designated Bo and Boas are 5′-CAT-TTA-ATT-GGT-CGG-GCC-GC-3′ and 5′-CTG-ATC-GTC-TTC-GAT-CCC-CC-3′ respectively, and amplify a 300 bp product.
Οι θετικοί μάρτυρες αποτελούνται από γονιδιωματικό DNA προερχόμενο από έντονα μολυσμένο ξενιστή ή πλασμιδιακό DNA που περιλαμβάνει την περιοχή-στόχο.
PCR mixtures contain buffer (500 mM KCl, 100 mM Tris/HCl [pH 9,0 at 25 °C] and 1 % Triton® X-100), 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP mix, 1 μM forward and reverse primers, 0,02 units μl– 1 Taq DNA polymerase, and 0,2 ng μl– 1 of the DNA template in a total volume of 50 μl.
Οι αρνητικοί μάρτυρες αποτελούνται από γονιδιωματικό DNA προερχόμενο από μη μολυσμένους ξενιστές και αντιδρώντα της PCR που δεν περιλαμβάνουν το DNA-στόχο.
Samples shall be denatured in a thermocycler for five minutes at 94 °C before being submitted to 30 cycles (94 °C for one minute, 55 °C for one minute, 72 °C for one minute) followed by a final extension of 10 minutes at 72 °C.
Ένα θετικό αποτέλεσμα δίνει προϊόν ενίσχυσης με PCR το οποίο θα χαρακτηρίζεται από μια μοναδική μέγιστη θερμοκρασία αποδιάταξης (78,25 ± 0,25 °C υπό τις συνθήκες που δημοσιεύτηκαν από τους Ramilo et al.
A positive result shall be positive PCR amplification at the expected size (namely, 300 bp), with all negative controls being negative and all positive controls being positive;
2013), ενώ όλοι οι αρνητικοί μάρτυρες πρέπει να δώσουν αρνητικό αποτέλεσμα και όλοι οι θετικοί μάρτυρες πρέπει να δώσουν θετικό αποτέλεσμα.
the second PCR protocol is a SYBR® Green Real time PCR assay.
Χρησιμοποιείται ένας ανιχνευτής που στοχεύει την SSU του συμπλέγματος rDNA παρότι βρέθηκε ότι παρουσιάζει διασταυρούμενη αντίδραση με άλλα μέλη της οικογένειας των Haplosporidia.
It allows the specific detection of B. ostreae (described below) and may be combined with a SYBR® Green Real time PCR assay allowing the specific detection of B. exitiosa (Ramilo et al.
Τμήματα ιστού που περιλαμβάνουν βράγχια και πεπτικό αδένα σταθεροποιούνται για διάστημα τουλάχιστον 24 ωρών σε υλικό σταθεροποίησης Davidson και ακολουθεί η συνήθης επεξεργασία για ιστολογική εξέταση σε μπλοκ παραφίνης.
2013).
Τα τμήματα επωάζονται με 100 μl ρυθμιστικού διαλύματος υβριδισμού [4 × SSC (standard saline citrate), 50 % φορμαμίδιο, 1 × διάλυμα Denhardt, 250 μg ml–1 tRNA ζυμομυκήτων, 10 % θειικό άλας δεξτρανών] που περιέχει 20 ng (2 μl του μείγματος αντίδρασης PCR προετοιμάζεται όπως περιγράφεται στο σημείο 1.3.2 με τη χρήση εκκινητών Bo και Boas) του επισημασμένου με διγοξιγενίνη ανιχνευτή.
Primers BOSTRE-F (5′- TTACGTCCCTGCCCTTTGTA-3′) and BOSTRE-R (5′- TCGCGGTTGAATTTTATCGT-3′) amplify a 208 bp product.
Τα τμήματα εκπλένονται δύο φορές για 5 λεπτά σε 2 × SSC σε θερμοκρασία δωματίου και μία φορά για 10 λεπτά σε 0,4 × SSC στους 42 °C.
PCR mixtures contain SYBR® Green Master Mix (1X), 0,3 μM forward and reverse primers, and 200 ng of extracted DNA.
Ένα θετικό αποτέλεσμα αντιστοιχεί στην παρουσία επισημασμένων παρασίτων εντός των αιμοκυττάρων, ενώ όλοι οι αρνητικοί μάρτυρες πρέπει να δώσουν αρνητικό αποτέλεσμα και όλοι οι θετικοί μάρτυρες πρέπει να δώσουν θετικό αποτέλεσμα.
Samples shall be denatured in a Real Time Detection System for 10 minutes at 95 °C before being submitted to 35 cycles (95 °C for 30 seconds, 55 °C for 45 seconds and 72 °C for one minute).
Οι περιοχές-στόχοι είναι το SSU rDNA και η ITS1.
Melting temperature curve analysis shall be carried out with temperature increments of 0,5 °C/s starting at 55 °C and ending at 95 °C and recording fluorescence at each change of temperature.
Διαδικασίες για την επιτήρηση και επιβεβαίωση λοίμωξης από Bonamia ostreae
Positive controls shall consist in genomic DNA from a highly infected host or plasmidic DNA including the target region.
Για τους σκοπούς επιτήρησης και επιβεβαίωσης της παρουσίας ή αποκλεισμού της υπόνοιας για λοίμωξη από Bonamia ostreae σύμφωνα με τις απαιτήσεις που προβλέπονται στο παράρτημα I μέρος 5 τμήμα II, οι διαγνωστικές μέθοδοι και οι αντίστοιχες διαδικασίες που θα χρησιμοποιηθούν είναι σύμφωνες με τις κατευθυντήριες γραμμές που προβλέπονται στον πίνακα 5.1.
Negative controls shall consist in genomic DNA from non-infected hosts and PCR reactives without target DNA.
Πίνακας 5.1
A positive result shall be positive PCR amplification with a unique melting temperature peak (78,25 ± 0,25 °C in the conditions published by Ramilo et al.
Κατευθυντήριες γραμμές σχετικά με τη χρήση των διαγνωστικών μεθόδων για τα προγράμματα επιτήρησης και για την επιβεβαίωση ή τον αποκλεισμό λοίμωξης από Bonamia ostreae
2013), with all negative controls being negative and all positive controls being positive.
Αποτυπώματα καρδιάς ή βραγχίων
A probe that targets the SSU of the rDNA gene complex shall be used although it was shown to cross react with some other members of the family Haplosporidia.
ΛΕΠΤΟΜΕΡΕΙΣ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΑΙ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΕΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΠΙΤΗΡΗΣΗ ΚΑΙ ΕΠΙΒΕΒΑΙΩΣΗ ΤΗΣ ΙΧΘΥΟΦΘΕΙΡΙΑΣΗΣ (WSD)
Sections of tissue that include gills and digestive gland shall be fixed for a period of at least 24 hours in Davidson's fixative followed by normal processing for paraffin histology.
Διαγνωστικές διαδικασίες για την ανίχνευση του WSSV
Sections shall be incubated with 100 μl of hybridisation buffer (4 × SSC [standard saline citrate], 50 % formamide, 1 × Denhardt's solution, 250 μg ml– 1 yeast tRNA, 10 % dextran sulphate) containing 20 ng (2 μl of the PCR reaction prepared as described in point I.3.2 using primers Bo and Boas) of the digoxigenin-labelled probe.
Όταν η δειγματοληψία και οι εργαστηριακές εξετάσεις για τους σκοπούς των προγραμμάτων επιτήρησης και εξάλειψης που ορίζονται στο παράρτημα I μέρος 6 τμήμα I, και για την επιβεβαίωση της παρουσίας ή τον αποκλεισμό υπόνοιας λοίμωξης από WSSV διενεργούνται σύμφωνα με το άρθρο 57 στοιχείο β) της οδηγίας 2006/88/ΕΚ, με τη χρήση των διαγνωστικών μεθόδων που προβλέπονται στο παράρτημα I μέρος 6 τμήμα II, εφαρμόζονται οι λεπτομερείς διαγνωστικές μέθοδοι και διαδικασίες που προβλέπονται στα σημεία 2 έως 7 του παρόντος μέρους.
Sections shall be washed twice for five minutes in 2 × SSC at room temperature, and once for 10 minutes in 0,4 × SSC at 42 °C.
Οι μέθοδοι και οι διαδικασίες που περιγράφονται στο παρόν μέρος του παραρτήματος II αποτελούν προσαρμογή της διαπιστευμένης κατά ISO 17025 δοκιμής που εφαρμόζεται στο εργαστήριο αναφοράς της Ευρωπαϊκής Ένωσης για τις ασθένειες των καρκινοειδών.
A positive result shall correspond to labelled parasites inside the haemocytes, with all negative controls negative and all positive controls positive.
Μπορούν να εφαρμοστούν εναλλακτικές προσεγγίσεις με τη χρήση ισοδύναμων συνθηκών ή κιτ από διαφορετικούς κατασκευαστές, τα οποία ωστόσο πρέπει να παρέχουν ισοδύναμη ευαισθησία και ειδικότητα με αυτά που περιγράφονται στο παρόν μέρος.
Targeted regions shall be the SSU rDNA and ITS1.
Σε κάθε περίπτωση, προσδιορίζεται η αλληλουχία του προϊόντος ενίσχυσης της PCR για να επιβεβαιωθεί η ταυτότητα του ιού της ιχθυοφθειρίασης (WSSV).
Procedures for surveillance and confirmation of infection with Bonamia ostreae