natgillin/translations-raw huggingface dataset:
«ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ IV
Done at Brussels, 14 October 2016.
ΑΦΡΙΚΑΝΙΚΗ ΠΑΝΩΛΗ ΤΩΝ ΙΠΠΟΕΙΔΩΝ
For the Commission
ΔΙΑΓΝΩΣΗ
Member of the Commission
ΜΕΡΟΣ A
OJ L 192, 23.7.2010, p. 1.
Ορολογικές δοκιμασίες
Council Directive 92/35/EEC of 29 April 1992 laying down control rules and measures to combat African horse sickness (OJ L 157, 10.6.1992, p. 19).
Η πρωτεΐνη VP7 του ιού είναι ανοσοκυρίαρχο μείζον αντιγόνο του ιού της αφρικανικής πανώλης των ίππων (AHSV), που διατηρείται και στους εννέα ορότυπους του AHSV.
Journal of Virological Methods.
Η έμμεση ELISA και η παρεμποδιστική ELISA είναι δύο δοκιμασίες ELISA AHS-VP7 κατάλληλες για την ορολογική διάγνωση της AHS.
http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahc/current/chapitre_ahs.pdf
Έμμεση μέθοδος ELISA για την ανίχνευση αντισωμάτων κατά του ιού AHSV
See footnote 2.
Το σύζευγμα που χρησιμοποιείται στη μέθοδο αυτή είναι υπεροξειδάση του αγριοράπανου με γ-σφαιρίνη εναντίον πρωτεϊνών αλόγου που αντιδρά με τον ορό αλόγου, ημίονου και όνου.
ANNEX
Η μέθοδος που περιγράφεται από τους Maree & Paweska (2005) [2] χρησιμοποιεί πρωτεΐνη G ως σύζευγμα που αντιδρά επίσης με ορό ζέβρας.
‘ANNEX IV
Το αντιγόνο μπορεί να παρασχεθεί από το ισπανικό Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA), μέσα σε 4 έως 6 μήνες από την υποβολή του αιτήματος.
AFRICAN HORSE SICKNESS
Διαδικασία δοκιμασίας
DIAGNOSIS
Στερεά φάση
PART A
Επιστρώνονται πλάκες ELISA με ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη VP7 από AHSV-4, αραιωμένη σε ρυθμιστικό διάλυμα ανθρακικού/διττανθρακικού με pH 9,6.
Serological tests
Οι πλάκες επωάζονται επί μία νύκτα σε θερμοκρασία 4 °C.
The serological method described hereinafter are enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) based on point 2 of Section B in Chapter 2.5.1 of the Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, Edition 2016 as adopted by the World Assembly of Delegates of the OIE in May 2012.
Οι πλάκες εκπλένονται πέντε φορές με απεσταγμένο νερό που περιέχει Tween 20 (διάλυμα έκπλυσης) σε αναλογία 0,01 % (κ.ό).
The VP7 viral protein is an immuno-dominant major antigen of the African horse sickness virus (AHSV) and is conserved across the nine AHSV serotypes.
Οι πλάκες κτυπώνται ελαφρά σε απορροφητικό υλικό για να απομακρυνθούν τυχόν υπολείμματα έκπλυσης.
Recombinant AHSV-VP7 proteins have been shown to be stable and innocuous and suitable to be used as antigens in ELISA procedures for determination of AHSV antibodies with a high degree of sensitivity and specificity (Laviada et al., 1992b [1]; Maree and Paweska, 2005).
Οι πλάκες παρεμποδίζονται (μπλοκάρονται) με την προσθήκη, σε κάθε κοιλότητα, 200 μl αλατούχου ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (PBS) με pH 7,2 + αποκορυφωμένο γάλα (Nestlé Dry Skim MilkTM), σε αναλογία 5 %, επί μία ώρα σε θερμοκρασία 37 °C.
The indirect ELISA and the blocking ELISA are the two AHS-VP7 ELISA tests suitable for serological diagnosis of African horse sickness (AHS).
Απομακρύνεται το παρεμποδιστικό διάλυμα και οι πλάκες κτυπώνται ελαφρά σε απορροφητικό υλικό.
Indirect ELISA for the detection of antibodies to African horse sickness virus (AHSV)
Δείγματα δοκιμασίας
The conjugate used in this method is a horseradish peroxidase anti-horse gamma-globulin reacting with the serum of horses, mules and donkeys.
Τα δείγματα ορού που πρόκειται να υποβληθούν σε δοκιμασία, καθώς και οι οροί θετικού ή αρνητικού μάρτυρα, αραιώνονται σε 1 προς 25 με PBS + αποκορυφωμένο γάλα σε αναλογία 5 % (κ.β.) + Tween 20 σε αναλογία 0,05 % (κ.ό.), και κατόπιν προστίθενται σε κάθε κοιλότητα 100 μl.
The method described by Maree & Paweska (2005) [2] uses protein G as conjugate that also reacts with zebra serum.
Ακολουθεί επώαση επί μία ώρα σε θερμοκρασία 37 °C.
The antigen may be provided by the Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA), Spain, within 4 to 6 months of request.
Για την τιτλοδότηση, δημιουργείται σειρά αραιώσεων 1:1, αρχίζοντας από 1 προς 25 (100 μl/κοιλότητα), με έναν ορό ανά στήλη πλάκας, και επαναλαμβάνεται η ίδια διαδικασία με τους θετικούς και τους αρνητικούς μάρτυρες.
Test procedure
Σύζευγμα
Solid phase
Διανέμονται 100 μl/κοιλότητα γ-σφαιρίνης εναντίον πρωτεϊνών αλόγου συζευγμένης με υπεροξειδάση του αγριοράπανου (HRP), αφού αραιωθούν με PBS + γάλα 5 % + Tween 20 σε αναλογία 0,05 %, με pH 7,2.
Coat ELISA plates with recombinant AHSV-4 VP7 diluted in carbonate/bicarbonate buffer, pH 9,6.
Χρωμογόνο/υπόστρωμα
Incubate plates overnight at 4 °C.
Προστίθενται 200 μl/κοιλότητα διαλύματος χρωμογόνου/υποστρώματος [10 ml διαλύματος DMAB (διμεθυλαμινοβενζαλδεΰδη) 80,6 mM + 10 ml διαλύματος MBTH (υδροχλωρική 3-μεθυλο-2-βενζοθειαζολινοϋδραζόνη) 1,56 mM + 5 μl H2O2].
Wash the plates five times with distilled water containing 0,01 % (v/v) Tween 20 (washing solution).
Ύστερα από 5-10 λεπτά περίπου (πριν αρχίσει να χρωματίζεται ο αρνητικός μάρτυρας), η εμφάνιση χρώματος διακόπτεται με την προσθήκη 50 μl 3N H2SO4.
Gently tap the plates onto absorbent material to remove any residual wash.
Επίσης, είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν και άλλα χρωμογόνα, όπως ABTS (2,2′-αζινο-δις[3-αιθυλοβενζοθειαζολινο-6-σουλφονικό οξύ]), TMB (τετραμεθυλοβενζιδίνη) ή OPD (ορθο-φαινυλοδιαμίνη).
Block the plates with phosphate buffered saline (PBS) pH 7,2 + 5 % (w/v) skimmed milk (Nestlé Dry Skim MilkTM), 200 μl/well, for 1 hour at 37 °C.
Ανάγνωση των αποτελεσμάτων σε μήκος κύματος 600 nm (ή 620 nm).
Remove the blocking solution and gently tap the plates onto absorbent material.
Ερμηνεία των αποτελεσμάτων
Test samples
Υπολογίζεται η τιμή αποκοπής, προσθέτοντας τον αριθμό 0,06 στην τιμή που αντιστοιχεί στον αρνητικό μάρτυρα (0,06 είναι η τυπική απόκλιση που προκύπτει από ομάδα 30 αρνητικών ορών).
Serum samples to be tested, and positive and negative control sera, are diluted 1 in 25 in PBS + 5 % (w/v) skimmed milk + 0,05 % (v/v) Tween 20, 100 μl per well.
Τα δείγματα της δοκιμασίας που δίνουν τιμές απορρόφησης χαμηλότερες από την τιμή αποκοπής θεωρούνται αρνητικά.
Incubate for 1 hour at 37 °C.
Τα δείγματα της δοκιμασίας που δίνουν τιμές απορρόφησης υψηλότερες από την τιμή αποκοπής + 0,15 θεωρούνται θετικά.
For titration, make a twofold dilution series from 1 in 25 (100 μl/well), one serum per plate column, and do the same with positive and negative controls.
Από τα δείγματα της δοκιμασίας που δίνουν ενδιάμεσες τιμές απορρόφησης θεωρείται ότι δεν συνάγονται ασφαλή συμπεράσματα και πρέπει να χρησιμοποιείται δεύτερη μέθοδος για την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων.
Conjugate
Παρεμποδιστική μέθοδος ELISA για την ανίχνευση αντισωμάτων κατά του ιού AHSV
Dispense 100 μl/well of horseradish-peroxidase (HRP) -conjugated anti-horse gamma-globulin diluted in PBS + 5 % milk + 0,05 % Tween 20, pH 7,2.
Η ανταγωνιστική παρεμποδιστική δοκιμή ELISA έχει σχεδιαστεί για την ανίχνευση ειδικών αντισωμάτων κατά του AHSV σε ορούς όλων των ιπποειδών, δηλαδή άλογα, όνοι, ζέβρες και απόγονοι διασταυρώσεών τους, ώστε να αποφεύγεται το πρόβλημα της ειδικότητας που αντιμετωπίζεται σε ορισμένες περιπτώσεις κατά τη χρήση της έμμεσης ELISA.
Chromogen/Substrate
Η αρχή αυτής της δοκιμασίας συνίσταται στην παρεμπόδιση της αντίδρασης μεταξύ της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης VP7 που απορροφάται από την πλάκα ELISA, και ενός ειδικού συζευγμένου μονοκλωνικού αντισώματος (Mab).
Add 200 μl/well of chromogen/substrate solution (10 ml of 80,6 mM DMAB (dimethyl aminobenzaldehyde) + 10 ml of 1,56 mM MBTH (3-methyl-2-benzo-thiazoline hydrazone hydrochlorid) + 5 μl H2O2).
Το αντίσωμα που περιέχει ο ορός δοκιμής θα παρεμποδίσει την αντίδραση αντιγόνου-Mab, προκαλώντας εξασθένηση του χρώματος.
Colour development is stopped by adding 50 μl of 3N H2SO4 after approximately 5 to 10 minutes (before the negative control begins to be coloured).
Δεδομένου ότι το Mab στρέφεται εναντίον της VP7, η δοκιμασία χαρακτηρίζεται από υψηλό βαθμό ευαισθησίας και ειδικότητας.
Other chromogens such as ABTS (2,2′-Azino-bis-[3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid]), TMB (tetramethyl benzidine), or OPD (ortho-phenyldiamine) can also be used.
Η ανταγωνιστική παρεμποδιστική ELISA είναι διαθέσιμη στο εμπόριο.
Read the plates at 600 nm (or 620 nm).
Στερεά φάση
Interpretation of the results
Επιστρώνονται πλάκες ELISA με 50-100 ng ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης VP7 από AHSV-4, αραιωμένης σε ρυθμιστικό διάλυμα ανθρακικού/διττανθρακικού, με pH 9,6.
Calculate the cut-off value by adding 0,06 to the value of the negative control (0,06 is the standard deviation derived with a group of 30 negative sera).
Επωάζονται επί μία νύκτα σε θερμοκρασία 4 °C.
Test samples giving absorbance values lower than the cut-off are regarded as negative.
Οι πλάκες εκπλένονται τρεις φορές με αλατούχο ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS) 0,1 × που περιέχει 0,135 M NaCl και Tween 20 σε αναλογία 0,05 % (κ.ό.)
Test samples giving absorbance values greater than the cut-off + 0,15 are regarded as positive.
(PBST).
Test samples giving intermediate absorbance values are considered to be inconclusive and a second technique must be employed to confirm the result.
Οι πλάκες κτυπώνται ελαφρά σε απορροφητικό υλικό για να απομακρυνθούν τυχόν υπολείμματα έκπλυσης.
Blocking ELISA for the detection of antibodies to African horse sickness virus (AHSV)
Δείγματα δοκιμασίας και μάρτυρες
The competitive blocking ELISA is designed to detect specific AHSV antibodies in sera from animals of any equine species, i.e. horses, donkeys, zebra and their crosses, preventing the problem of specificity experienced occasionally using the indirect ELISAs.
Τα δείγματα ορού που θα υποβληθούν σε δοκιμασία, καθώς και οι θετικοί και αρνητικοί οροί μάρτυρα, αραιώνονται σε αναλογία 1 προς 5 με διάλυμα αραίωσης που περιέχει 0,35 M NaCl, Tween 20 σε αναλογία 0,05 % (κ.ό.) και 0,1 % Kathon, και κατόπιν προστίθενται 100 μl σε κάθε κοιλότητα.
The principle of the test is the blocking of the reaction between the recombinant VP7 protein absorbed to the ELISA plate and a conjugated AHS-VP7 specific monoclonal antibody (Mab).
Για την τιτλοδότηση, δημιουργείται σειρά αραιώσεων 1:1 των δοκιμαστικών ορών, αρχίζοντας από 1 προς 10 έως 1 προς 280, σε 8 κοιλότητες (100 μl/κοιλότητα), έναν ορό ανά στήλη πλάκας, και επαναλαμβάνεται η ίδια διαδικασία με τους θετικούς και τους αρνητικούς μάρτυρες.
Antibody in the test sera will block the reaction between the antigen and the Mab resulting in a reduction in colour.
Ακολουθεί επώαση επί μία ώρα σε θερμοκρασία 37 °C.
Because the Mab is directed against the VP7, the assay will give a high level of sensitivity and specificity.
Οι πλάκες εκπλένονται πέντε φορές με αλατούχο ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS) 0,1 × που περιέχει 0,135 M NaCl και Tween 20 σε αναλογία 0,05 % (κ.ό.)
The competitive blocking ELISA is commercially available.
(PBST).
Solid Phase
Διανέμονται 100 μl/κοιλότητα Mab εναντίον της πρωτεΐνης VP7 συζευγμένου με υπεροξειδάση αγριοράπανου.
Coat ELISA plates with 50-100 ng of recombinant AHSV-4 VP7 diluted in carbonate/bicarbonate buffer, pH 9,6.
Εκ των προτέρων, το Mab έχει αραιωθεί σε αναλογία 1/5000 – 1/15000 σε διάλυμα 1/1 σταθεροποιητή StabiliZyme Select® (SurModics, αριθ. αναφοράς: SZ03) σε απεσταγμένο νερό.
Incubate overnight at 4 °C.
Ακολουθεί επώαση για 30 λεπτά σε θερμοκρασία 37 °C.
Wash the plates three times with phosphate buffered saline (PBS) 0,1× containing 0,135 M NaCl and 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST).
Προστίθενται 100 μl/κοιλότητα διαλύματος χρωμογόνου/υποστρώματος, δηλαδή 1 ml διαλύματος ABTS (2,2′-αζινο-δισ[3-αιθυλοβενζοθειαζολινο-6-σουλφονικό οξύ]) συγκέντρωσης 5 mg/ml + 9 ml ρυθμιστικού διαλύματος υποστρώματος (ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών-κιτρικών 0,1M με pH 4 που περιέχει H2O2 σε αναλογία 0,03 %)] και ακολουθεί επώαση επί 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου.
Gently tap the plates on to absorbent material to remove any residual wash.
Η εμφάνιση χρώματος διακόπτεται με την προσθήκη, σε κάθε κοιλότητα, 100 μl SDS (δωδεκυλοθειικού νατρίου) συγκέντρωσης 2 % (κ.β.).
Test samples and controls
Ανάγνωση
Serum samples to be tested, and positive and negative control sera, are diluted 1 in 5 in diluent containing 0,35 M NaCl, 0,05 % (v/v) Tween 20 and 0,1 % Kathon, 100 μl per well.
Ανάγνωση σε μήκος κύματος 405 nm με συσκευή ανάγνωσης ELISA.
For titration, make a twofold dilution series of the test sera from 1 in 10 to 1 in 280 across 8 wells (100 μl/well), one serum per plate column, and do the same with positive and negative controls.
Προσδιορίζεται το ποσοστό παρεμπόδισης (BP) κάθε δείγματος βάσει του ακόλουθου τύπου, όπου «Abs» συμβολίζει τα αντισώματα:
Incubate for 1 hour at 37 °C.
Absθετικός μάρτυρας
Wash the plates five times with phosphate buffered saline (PBS) 0,1× containing 0,135 M NaCl and 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST).
Absδείγμα
Dispense 100 μl/well of horseradish peroxidase-conjugated Mab anti-VP7.
Τα δείγματα που εμφανίζουν τιμή BP που υπερβαίνει το 50 % θα πρέπει να θεωρούνται θετικά ως προς τα αντισώματα κατά του AHSV.
In advance, this Mab has been diluted 1/5000-1/15000 in a 1/1 solution of StabiliZyme Select® Stabilizer (SurModics.
Τα δείγματα που εμφανίζουν τιμή BP κάτω από το 45 % θα πρέπει να θεωρούνται αρνητικά ως προς τα αντισώματα κατά του AHSV.
Reference: SZ03) in distilled water.
Τα δείγματα που εμφανίζουν τιμή BP μεταξύ 45 % και 50 % θα πρέπει να θεωρείται ότι δεν μπορούν να οδηγήσουν σε ασφαλή συμπεράσματα και πρέπει να υποβάλλονται εκ νέου σε δοκιμασία.
Incubate for 30 minutes at 37 °C.
Αν βάσει του αποτελέσματος πάλι δεν συνάγονται ασφαλή συμπεράσματα, τα ζώα θα πρέπει να υποβάλλονται εκ νέου σε δοκιμασία με δειγματοληψία που πραγματοποιείται τουλάχιστον δύο εβδομάδες μετά τη δειγματοληψία που θεωρήθηκε ότι δεν οδήγησε σε ασφαλή συμπεράσματα.
Add 100 μl/well chromogen/substrate solution, i.e. 1 ml of ABTS (2,2′-Azino-bis-[3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid]) 5 mg/ml + 9 ml of substrate buffer (0,1 M Phosphate-Citrate buffer of pH 4 containing 0,03 % H2O2), and incubate for 10 minutes at room temperature.
ΜΕΡΟΣ Β
Colour development is stopped by adding 100 μl/well of 2 % (w/v) SDS (sodium dodecyl sulphate).
Ταυτοποίηση του παράγοντα
Reading
Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης με αντίστροφη μεταγραφή σε πραγματικό χρόνο (rRT-PCR)
Read at 405 nm in an ELISA reader.
Οι δοκιμασίες ταυτοποίησης παράγοντα με βάση μεθόδους νουκλεϊκού οξέος πρέπει να ανιχνεύουν στελέχη αναφοράς από τους εννέα ορότυπους του ιού AHSV.
Determine the blocking percentage (BP) of each sample by applying the following formula, where “Abs” stands for antibodies:
Η μέθοδος που περιγράφεται στο σημείο 2.1 βασίζεται στο σημείο 1.2 του τμήματος Β του κεφαλαίου 2.5.1 του εγχειριδίου διαγνωστικών δοκιμασιών και εμβολίων για χερσαία ζώα, έκδοση 2016, όπως εγκρίθηκε από τη συνέλευση των αντιπροσώπων του OIE τον Μάιο του 2012.
Abscontrol
Κάθε μέθοδος ανίχνευσης RT-PCR που χρησιμοποιείται για τη δοκιμή των δειγμάτων, είτε αίματος είτε σπλήνα, στο πλαίσιο της οδηγίας 2009/156/ΕΚ, πρέπει να επιτυγχάνει ίση ή μεγαλύτερη ευαισθησία από τις μεθόδους που περιγράφονται στο σημείο 2.
Abssample
Αδρανοποιημένοι ιοί των οροτύτων 1 έως 9 των στελεχών αναφοράς μπορούν να ληφθούν από το εργαστήριο αναφοράς της Ευρωπαϊκής Ένωσης ή από το εργαστήριο αναφοράς του OIE για την αφρικανική πανώλη των ιπποειδών, στην Algete της Ισπανίας.
Samples showing a BP value higher than 50 % should be considered as positive for AHSV antibodies.
Εξαγωγή ιικού RNA
Samples showing a BP value lower than 45 % should be considered as negative for AHSV antibodies.
Για να διασφαλιστεί η ορθή αντίδραση πρέπει να εξαχθεί υψηλής ποιότητας RNA του AHSV από το δείγμα.
Samples showing a BP value between 45 % and 50 % should be considered as inconclusive and must be retested.
Η εξαγωγή νουκλεϊκών οξέων από κλινικά δείγματα μπορεί να διεξαχθεί με διάφορες εσωτερικές μεθόδους και μεθόδους διαθέσιμες στο εμπόριο.
If the result is again inconclusive, the animals should be retested on samples taken not earlier than two weeks after the sample which was considered to be inconclusive was taken.
Τα κιτ που κυκλοφορούν στο εμπόριο χρησιμοποιούν διαφορετικές προσεγγίσεις για την απομόνωση του RNA.
PART B
Οι περισσότερες βασίζονται σε μία από τις ακόλουθες διαδικασίες:
Identification of the agent
εξαγωγή νουκλεϊκών οξέων με φαινόλη-χλωροφόρμιο·
Real-time Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction (rRT-PCR)
προσρόφηση νουκλεϊκών οξέων σε σύστημα διήθησης·
Agent identification tests based on nucleic acid methods must detect reference strains from the nine virus serotypes of the AHSV.
προσρόφηση νουκλεϊκών οξέων σε σύστημα μαγνητικών σφαιριδίων.
The method described in point 2.1 is based on point 1.2 of Section B in Chapter 2.5.1 of the Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, Edition 2016 as adopted by the World Assembly of Delegates of the OIE in May 2012.
Ένα παράδειγμα εσωτερικής μεθόδου εξαγωγής RNA παρατίθεται κατωτέρω:
Any RT-PCR detection method used for the testing of samples, either blood or spleen, in the context of Directive 2009/156/EC must perform equal to or exceed the sensitivity of the methodologies described in point 2.
1 g δείγματος ιστού ομογενοποιείται σε 1 ml διαλύματος μετουσίωσης (θειοκυανικό άλας γουανιδίου 4 M, κιτρικό νάτριο 25 mM, 2-μερκαπτοαιθανόλη 0,1 M, λαουροϋλοσαρκοσινικό νάτριο 0,5 %).
Inactivated virus of serotypes 1 to 9 reference strains may be obtained from the European Union Reference Laboratory or the OIE Reference Laboratory for African horse sickness, Algete, Spain.
Μετά από φυγοκέντρηση, 1 μg RNA ζυμομύκητα, 0,1 ml διαλύματος οξικού νατρίου 2 Μ με pH 4, 1 ml φαινόλης και 0,2 ml μείγματος χλωροφορμίου/ισοαμυλικής αλκοόλης (σε αναλογία 49/1) προστίθενται στο υπερκείμενο υγρό.
Extraction of viral RNA
Το υπερκείμενο υγρό ανακινείται ζωηρά και ψύχεται με πάγο για 15 λεπτά.
To assure a good reaction it is necessary to extract from the sample an AHSV RNA of high quality.
Μετά από φυγοκέντρηση, το RNA που βρίσκεται στην υδατική φάση εκχυλίζεται με φαινόλη, κατακρημνίζεται με αιθανόλη και επανεναιωρείται σε αποστειρωμένο νερό.
The extraction of nucleic acids from clinical samples can be performed by a variety of in-house and commercially available methods.
Διαδικασία RT-PCR σε πραγματικό χρόνο
Commercial kits use different approaches for RNA isolation.
Ειδική ανά ομάδα RT-PCR σε πραγματικό χρόνο, από Agüero κ.ά., 2008 [3]
Most are based on one of the following procedures:
Αυτή η ειδική ανά ομάδα RT-PCR σε πραγματικό χρόνο στοχεύει την πρωτεΐνη VP7 του AHSV και μπορεί να ανιχνεύσει όλους τους γνωστούς ορότυπους και τα στελέχη του AHSV που κυκλοφορούν σήμερα.
Phenol-chloroform extraction of nucleic acids;
Αλληλουχίες εκκινητών και ανιχνευτή για την ανίχνευση ειδών ιών AHSV:
Adsorption of nucleic acids to filter system;
πρόσθιος εκκινητής 5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′
Adsorption of nucleic acids to magnetic beads system.
αντίστροφος εκκινητής 5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′
An example of an in-house RNA extraction is given below:
ανιχνευτής MGB-TaqMan 5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′
1 g of tissue sample is homogenised in 1 ml of denaturing solution (4 M guanidium thiocyanate, 25 mM sodium citrate, 0,1 M 2-mercaptoethanol, 0,5 % sarcosyl).
Η συγκέντρωση αποθέματος εκκινητών αραιώνεται μέχρι μια συγκέντρωση εργασίας στα 8 μM («απόθεμα εργασίας εκκινητή στα 8 μM») ενώ ο ανιχνευτής αραιώνεται μέχρι μια συγκέντρωση εργασίας στα 50 μM («απόθεμα εργασίας ανιχνευτή στα 50 μΜ»).
After centrifugation, 1 μg of yeast RNA, 0,1 ml of 2 M sodium acetate pH 4, 1 ml of phenol and 0,2 ml of chloroform/isoamyl alcohol mixture (49/1) are added to the supernatant.
Μια διάταξη πλάκας δοκιμής θα πρέπει να σχεδιαστεί και να φορτωθεί στο λογισμικό του μηχανήματος PCR σε πραγματικό χρόνο.
The suspension is vigorously shaken and cooled on ice for 15 minutes.
Με τη χρήση της διάταξης ως οδηγού, 2,5 μl από κάθε απόθεμα εργασίας εκκινητή στα 8 μM προστίθενται σε κάθε κοιλότητα που πρόκειται να περιέχει δείγματα RNA, θετικού και/ή αρνητικού μάρτυρα (η τελική συγκέντρωση του εκκινητή θα είναι 1 μM στα 20 μl μείγματος RT-PCR).
After centrifugation, the RNA present in the aqueous phase is phenol extracted, ethanol precipitated and resuspended in sterile water.
Η πλάκα φυλάσσεται σε πάγο.
Real-time RT-PCR Procedure
Αυτό το μείγμα μετουσιώνεται με θέρμανση στους 95 °C επί 5 λεπτά και κατόπιν ψύχεται ταχέως σε πάγο για 5 λεπτά τουλάχιστον.
This group-specific real-time RT-PCR targets VP7 of the AHSV and is able to detect all known AHSV serotypes and strains currently circulating.
Παρασκευάζεται όγκος διαλύματος Master Mix για RT-PCR ενός βήματος σε πραγματικό χρόνο, κατάλληλος για τον αριθμό δειγμάτων προς δοκιμή, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.
It has been employed with very good results by the participating national reference laboratories of the European Union Member States in the proficiency tests annually organised by the European Union Reference Laboratory for the period 2009-2015.
Προστίθενται 0,1μl αποθέματος εργασίας του ανιχνευτή στα 50 μΜ σε κάθε κοιλότητα που περιέχει δείγματα RNA (η τελική συγκέντρωση του ανιχνευτή πρόκειται να είναι 0,25 μM σε κάθε κοιλότητα που περιέχει δείγματα RNA).
Moreover, in an international ring trial organised in 2015 in the framework of the OIE reference laboratories network this protocol was ranked very high amongst others.
13 μl διαλύματος Master Mix για RT-PCR ενός βήματος κατανέμονται σε κάθε κοιλότητα στην πλάκα PCR που περιέχει τους μετουσιωμένους εκκινητές και το RNA.
Primer and probe sequences for the detection of AHSV species viruses:
Η πλάκα τοποθετείται σε θερμικό κυκλοποιητή πραγματικού χρόνου που έχει προγραμματιστεί για αντίστροφη μεταγραφή και ενίσχυση συμπληρωματικού DΝΑ/ανίχνευση φθορισμού.
forward Primer 5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′
Οι συνθήκες ενίσχυσης συνίσταται σε ένα πρώτο βήμα αντίστροφης μεταγραφής στους 48 °C επί 25 λεπτά, που ακολουθείται από 10 λεπτά στους 95 °C («hot start») και 40 κύκλους 15 δευτερολέπτων στους 95 °C, 35 δευτερολέπτων στους 55 °C και 30 δευτερολέπτων στους 72 °C (ή 40 κύκλους στους 97 °C επί 2 δευτερόλεπτα και στους 55 °C επί 30 δευτερόλεπτα εάν χρησιμοποιούνται αντιδραστήρια και θερμικός κυκλοποιητής που επιτρέπουν ταχείες αντιδράσεις).
reverse Primer 5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′
Τα δεδομένα για τον φθορισμό συλλέγονται στο τέλος του βήματος των 55 °C.
MGB-TaqMan probe 5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′
Εάν προκύπτουν άτυπες καμπύλες ενίσχυσης, η δοκιμή δεν θεωρείται έγκυρη και πρέπει να επαναληφθεί.
Primer stock concentration is diluted to a working concentration of 8 μM (“primer working stock 8 μM”) whereas probe is diluted to a working concentration of 50 μM (“probe working stock 50 μM”).
Τα δείγματα θεωρούνται θετικά εάν η τιμή Ct (αριθμός κύκλου στον οποίον ο φθορισμός που παράγεται από μια αντίδραση υπερβαίνει το όριο φθορισμού) είναι μικρότερη ή ίση με το καθορισμένο όριο Ct (35) εντός 40 κύκλων PCR (Ct ≤ 35).
A test plate layout should be designed and loaded into the real time PCR machine software.
Τα δείγματα θεωρείται ότι δεν οδηγούν σε ασφαλή συμπεράσματα εάν η τιμή Ct είναι υψηλότερη από το καθορισμένο όριο Ct (35) εντός 40 κύκλων PCR (Ct ≥ 35).
Using the layout as a guide, 2,5 μl of each primer working stock 8 μM is added to each well that will contain RNA samples, positive and/or negative controls (final concentration of the primer will be 1 μM in the 20 μl RT-PCR mix).
Τα δείγματα θεωρούνται αρνητικά εάν προκύπτει οριζόντια καμπύλη ενίσχυσης η οποία δεν τέμνει τη γραμμή ορίου εντός 40 κύκλων PCR.
The plate is held on ice.
Ειδική ανά ομάδα RT-PCR σε πραγματικό χρόνο, από Guthrie κ.ά., 2013 [4]
2 μl of isolated RNA (test samples and positive control), or 2 μl of RNAse-free water in negative reaction controls, is mixed with forward and reverse primers.
RT-PCR σε πραγματικό χρόνο που χρησιμοποιεί μεταφορά ενέργειας συντονισμού φθορισμού (FRET) για την ανίχνευση νουκλεϊκών οξέων του AHSV.
This mixture is denatured by heating at 95 °C for 5 minutes, followed by rapid cooling on ice for at least 5 minutes.
Η δοκιμασία RT-PCR AHSV που περιγράφεται σχεδιάστηκε με τη χρήση αλληλουχιών από μεγάλη ποικιλία στελεχών του AHSV που κυκλοφορούν σήμερα (Quan κ.ά., 2010 [5]).
An appropriate volume of real time one-step RT-PCR master mix for the number of samples to be tested is prepared following manufacturer's instructions.