natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Κατά τη διενέργεια εργαστηριακών εξετάσεων για τους σκοπούς της απόκτησης ή διατήρησης ορισμένων υγειονομικών καθεστώτων όσον αφορά τη ΛΑΣ, όπως ορίζεται στο παράρτημα I μέρος 3 τμήμα I ή για τους σκοπούς της επιβεβαίωσης της παρουσίας ή του αποκλεισμού της υπόνοιας για ΛΑΣ σύμφωνα με το άρθρο 57 στοιχείο β) της οδηγίας 2006/88/ΕΚ, με τη χρήση των διαγνωστικών μεθόδων που προβλέπονται στο παράρτημα I μέρος 3 τμήμα II, εφαρμόζονται οι λεπτομερείς μέθοδοι και διαδικασίες που προβλέπονται στα παρακάτω σημεία II.1 έως II.5.
Blood samples and tubes containing fish tissues for virological examination or RT-PCR analysis shall be placed in insulated containers, such as thick-walled polystyrene boxes, together with sufficient ice or freeze blocks to ensure chilling of the samples during transportation to the laboratory.
Εξέταση δειγμάτων με RT-PCR (αναστροφή μεταγραφάσης — αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης)
Freezing shall be avoided and ice must still be present in the transport box at receipt of the shipment or one or more of the ‘freeze blocks’ must still be partly or completely frozen.
Η διαγνωστική μέθοδος που θα χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση του ιού της ΛΑΣ είναι η RT-qPCR.
In exceptional circumstances, RT-PCR samples and samples for virological examination may be snap-frozen and transported to the laboratory at – 20 °C or below.
Επειδή τα αποτελέσματα της RT-qPCR μπορεί να διαφοροποιούνται ανάλογα με τις συνθήκες υπό τις οποίες εκτελέστηκε, συμπεριλαμβάνονται επαρκείς θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες, καθώς και αμπλικόνια της αλληλουχίας για την αποφυγή κάθε αμφιβολίας.
For RT-PCR analysis of tissues preserved in Ribonucleic acid(RNA)later, RNA extraction shall be carried out within the following time frames depending on the temperature the samples are stored at:
Εξαγωγή ολικού RNA
samples stored at – 20 °C: indefinitely.
Η εξαγωγή του ολικού RNA πραγματοποιείται με τη μέθοδο φαινόλης-χλωροφορμίου ή μέσω στηλών φυγοκέντρησης με συγγένεια RNA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.
If fish tissues are transported in fixative for histological examination, they shall be shipped in leak proof tubes in impact-resistant containers.
Πραγματοποιείται επανεναιώρηση του καθαρισμένου RNA σε αποσταγμένο νερό απαλλαγμένο από RΝΑάση, (ήτοι νερό που έχει υποστεί επεξεργασία με 0,1 % πυροκαρβονικό διαιθύλιο).
Freezing of those samples shall be avoided.
Η συγκέντρωση και η καθαρότητα του RNA που εξήχθη εκτιμάται μέσω μέτρησης της οπτικής πυκνότητας στα 260 nm και 280 nm.
Subject to the approval of the diagnostic laboratory, fish tissues other than those referred to in point I.1 may be collected and prepared for supplementary examination.
Μια εναλλακτική προσέγγιση μπορεί να είναι η συμπερίληψη εσωτερικών μαρτύρων που στοχεύουν έναντι του γονιδιώματος του ιού, όπως αναφέρεται στο σημείο II.1.3.
Detailed diagnostic methods and procedures for the surveillance and for the confirmation of the presence of or to rule out the suspicion of ISA
RT-PCR για την ανίχνευση του ιού της ΛΑΣ
When laboratory examination for the purpose of obtaining or maintaining a certain health status with regard to ISA as set out in Section I of Part 3 of Annex I, or for the purpose of the confirmation of the presence of or to rule out a suspicion of ISA in accordance with Article 57(b) of Directive 2006/88/EC, are carried out, using the diagnostic methods set out in Section II of Part 3 of Annex I, the detailed methods and procedures set out in the following points II.1 to II.5 shall apply.
Μπορούν να χρησιμοποιηθούν διάφορες μέθοδοι RT-PCR για την ενίσχυση του γονιδιώματος του ιού της ΛΑΣ.
Examination of samples by RT-PCR
Μπορεί να διεξαχθεί RT-PCR δύο βημάτων όπου τα βήματα της αντίδρασης RT και PCR εκτελούνται σε δύο ξεχωριστούς σωλήνες.
The diagnostic method to be used for the screening for ISAV shall be RT-qPCR.
Ωστόσο, μπορεί επίσης να διεξαχθεί αντίδραση ενός βήματος, όπου οι δύο αντιδράσεις εκτελούνται στον ίδιο σωλήνα.
As the results of the RT-qPCR can vary depending on the conditions under which it is performed, adequate positive and negative controls and amplicons shall be included to avoid any doubts.
Χρησιμοποιείται η μέθοδος ενός βήματος, όπου είναι δυνατόν, επειδή η δοκιμασία με ένα σωλήνα ελαχιστοποιεί τον κίνδυνο διασταυρούμενης μόλυνσης αφού δεν απαιτείται μεταφορά του περιεχομένου και θεωρείται το ίδιο ευαίσθητη με τη μέθοδο των δύο βημάτων.
Total RNA extraction
Χρησιμοποιούνται οι εκκινητές και η δοκιμασία που περιγράφονται στο παρόν σημείο, ήτοι το ζεύγος εκκινητών ILA1 ή ILA2 που στοχεύει το τμήμα 8 και έχει βρεθεί κατάλληλο για την ανίχνευση του ιού της ΛΑΣ σε περιπτώσεις εκδήλωσης της ασθένειας και σε ιχθύς φορείς.
Total RNA shall be extracted using the phenol-chloroform method or RNA affinity spin columns, according to the manufacturer's instructions.
Ο αντίστροφος εκκινητής ILA2 δεν ταιριάζει σε απομονώματα από τη Βόρεια Αμερική και σε αυτές τις περιπτώσεις χρησιμοποιείται εναλλακτικό σετ εκκινητών.
Purified RNA shall be re-suspended in distilled RNase-free water (namely water treated with 0,1 % diethyl pyrocarbonate).
Πρόσθιος εκκινητής (ILA1):
The concentration and purity of the extracted RNA shall be estimated by measuring the optical density at 260 nm and at 280 nm.
5′-GGCTATCTACCATGAACGAATC-3′, Αντίστροφος εκκινητής (ILA2):
An alternative approach may be to include internal controls targeted against the virus genome as referred to in point II.1.3.
5′-GCCAAGTGTAAGTAGCACTCC-3′.
RT-PCR for ISAV detection
Συνθήκες των κύκλων:
Several RT-PCR methods may be used for ISAV genome amplification.
Ένας κύκλος στους 50 °C επί 30 λεπτά, ένας κύκλος στους 94 °C επί 15 λεπτά, 40 κύκλοι στους 94 °C επί 30 δευτερόλεπτα, 55 °C επί 30 δευτερόλεπτα, 72 °C επί 60 δευτερόλεπτα.
A two-step RT-PCR may be performed whereby the RT and the PCR reactions steps are run in two separate tubes.
Ένας κύκλος στους 72 °C επί 5 λεπτά.
However, a one-step reaction, where the two reactions are run in one tube, may also be performed.
Ωστόσο, αντ' αυτής μπορούν να εφαρμόζονται και άλλες εκδοχές RT-PCR αποδεδειγμένης παρόμοιας αποτελεσματικότητας.
The one-step method shall be used where possible, as the one tube assay minimises the risk of cross-contamination as no transfer of content have to be made and it is regarded to be as sensitive as the two-step method.
RT-qPCR για ανίχνευση του ιού της ΛΑΣ
The primers and assay described in this point, namely the ILA1 or ILA2 primer pair that target segment 8 and which have been found suitable for detection of ISAV in outbreaks and in carrier fish, shall be used.
Η χρήση RT-qPCR μπορεί να αυξήσει την ειδικότητα και πιθανώς και την ευαισθησία.
The ILA2 reverse primer does not match isolates from North America and an alternative primer set shall be used in those cases.
Η μέθοδος μπορεί να διεξαχθεί ταχύτερα επειδή δεν απαιτείται βήμα ηλεκτροφόρησης σε πηκτή και επίσης μειώνει τον κίνδυνο διασταυρούμενης μόλυνσης επειδή είναι δυνατός ο υπολογισμός της ποσότητας του γονιδιωματικού RNA του ιού εντός του σωλήνα δείγματος.
Forward primer (ILA1): 5′-GGCTATCTACCATGAACGAATC-3′;
Μειονέκτημα της δοκιμασίας RT-qPCR αποτελεί το ότι συχνά δεν είναι δυνατός ο προσδιορισμός της αλληλουχίας των προϊόντων ενίσχυσης.
Reverse primer (ILA2): 5′-GCCAAGTGTAAGTAGCACTCC-3′.
Ωστόσο, σε περίπτωση που υπάρχει αμφιβολία σχετικά με την ειδικότητα του προϊόντος ενίσχυσης, πρέπει να εκτελεστεί μια άλλη δοκιμασία ειδική για τον ιό της ΛΑΣ για την επαλήθευση του αποτελέσματος.
Cycling conditions: one cycle of 50 °C for 30 minutes, 1 cycle of 94 °C for 15 minutes, 40 cycles of 94 °C for 30 seconds, 55 °C for 30 seconds, 72 °C for 60 seconds; one cycle of 72 °C for 5 min.
Χρησιμοποιείται η δοκιμασία που περιγράφεται στο παρόν σημείο, η οποία είναι μια δοκιμασία που στοχεύει στο τμήμα 8.
Product size 155 bp.
Η δοκιμασία αυτή καλύπτει τα απομονώματα από τις χώρες της Ευρωπαϊκής Ένωσης, της Ευρωπαϊκής Ζώνης Ελευθέρων Συναλλαγών, καθώς και τη Βόρεια Αμερική.
However, other RT-PCR versions of proven similar efficacy may be used instead.
Χρησιμοποιείται η μέθοδος ενός βήματος, όπου είναι δυνατόν, επειδή η δοκιμασία με ένα σωλήνα ελαχιστοποιεί τον κίνδυνο διασταυρούμενης μόλυνσης.
RT-qPCR for ISAV detection
Πρόσθιος εκκινητής:
The use of RT-qPCR may increase specificity and probably also sensitivity.
5′- CTACACAGCAGGATGCAGATGT -3′, Αντίστροφος εκκινητής:
The method can be performed more rapidly as no gel electrophoresis step is required and it reduces the risk of cross contamination as it is possible to estimate the amount of viral genomic RNA within the sample tube.
5′- CAGGATGCCGGAAGTCGAT -3′ και ανιχνευτής:
A drawback of the RT-qPCR assay is that it is often not possible to sequence amplified products.
5′-FAM- CATCGTCGCTGCAGTTC — MGBNFQ-3′.
However, if there is doubt on the specificity of the amplified product, another ISAV specific assay must be run to verify the result.
ένας κύκλος στους 50 °C επί 30 λεπτά, ένας κύκλος στους 95 °C επί 15 λεπτά, 40 κύκλοι στους 94 °C επί 15 δευτερόλεπτα, 60 °C επί 60 δευτερόλεπτα.
The assay described in this point, which is an assay that target segment 8, shall be used.
Γίνονται προσαρμογές, εφόσον είναι απαραίτητες.
This assay shall cover isolates from the European Union, the European Free Trade Association and North America.
Προσδιορισμός αλληλουχίας των ενισχυμένων προϊόντων PCR
The one-step method shall be used where possible, because the one tube assay minimises the risk of cross-contamination.
Πρόσθιος εκκινητής (ILAs6-3F): 5′-ATGAGGGAGGTAGCATTGCA -3′,
Forward primer: 5′- CTACACAGCAGGATGCAGATGT -3′;
Αντίστροφος εκκινητής (ILAs6-2R): 5′-CATGCTTTCCAACCTGCTAGGA -3′.
Reverse primer: 5′- CAGGATGCCGGAAGTCGAT -3′;
ένας κύκλος στους 50 °C επί 30 λεπτά, ένας κύκλος στους 94 °C επί 15 λεπτά, 40 κύκλοι στους 94 °C επί 30 δευτερόλεπτα, 55 °C επί 30 δευτερόλεπτα, 72 °C επί 60 δευτερόλεπτα, ένας κύκλος στους 72 °C επί 5 λεπτά.
and probe: 5′-FAM- CATCGTCGCTGCAGTTC – MGBNFQ-3′.
Γίνονται προσαρμογές, εφόσον είναι απαραίτητες.
Cycling conditions: one cycle of 50 °C for 30 minutes, one cycle of 95 °C for 15 minutes, 40 cycles of 94 °C for 15 seconds, 60 °C for 60 seconds; it shall be adjusted if necessary.
Εναλλακτικά, μπορεί να χρησιμοποιηθεί η ακόλουθη μέθοδος για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας του HPR στο τμήμα 6: Πρόσθιος εκκινητής:
Sequencing of amplified PCR products
5′-GAC-CAG-ACA-AGC-TTA-GGT-AAC-ACA-GA-3′, Αντίστροφος εκκινητής:
Forward primer (ILAs6-3F): 5′-ATGAGGGAGGTAGCATTGCA -3′;
5′-GAT-GGT-GGA-ATT-CTA-CCT-CTA-GAC-TTG-TA-3′, Μέγεθος προϊόντος:
Reverse primer (ILAs6-2R): 5′-CATGCTTTCCAACCTGCTAGGA -3′.
304 nt εάν είναι HPR0.
Cycling conditions (One-step RT-PCR): one cycle of 50 °C for 30 minutes, one cycle of 94 °C for 15 minutes, 40 cycles of 94 °C for 30 seconds, 55 °C for 30 seconds, 72 °C for 60 seconds, one cycle of 72 °C for 5 minutes; it shall be adjusted if necessary.
Μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν δοκιμασίες RT-PCR με παρόμοια ευαισθησία και ειδικότητα με τις δοκιμασίες που περιγράφονται στο παρόν σημείο.
Alternatively, the following method for sequencing HPR in segment 6 may be used:
Η καθαρότητα του ενισχυμένου προϊόντος RT-PCR ελέγχεται μέσω ηλεκτροφόρησης σε πηκτή πριν από τον προσδιορισμό της αλληλουχίας.
Forward primer: 5′-GAC-CAG-ACA-AGC-TTA-GGT-AAC-ACA-GA-3′;
Εάν εμφανιστεί μόνο ένα καθαρό θραύσμα, πραγματοποιείται κάθαρσή του απευθείας από την αντίδραση PCR.
Reverse primer: 5′-GAT-GGT-GGA-ATT-CTA-CCT-CTA-GAC-TTG-TA-3′;
Εάν υπάρχουν πολλά ενισχυμένα θραύσματα, πραγματοποιείται κάθαρση του θραύσματος ενδιαφέροντος με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή.
Product size: 304 nt if HPR0.
Η κάθαρση των θραυσμάτων PCR από τα διαλύματα ή τις πηκτές αγαρόζης πραγματοποιείται με τη χρήση στηλών φυγοκέντρησης με συγγένεια προς το θραύσμα PCR σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.
RT-PCR assays with similar sensitivities and specificities to the assays described in this point may also be used.
Ο προσδιορισμός της αλληλουχίας διεξάγεται με τη χρήση εκκινητών για την ενίσχυση σε εξωτερικές εξειδικευμένες εταιρείες προσδιορισμού αλληλουχίας.
The purity of the amplified RT-PCR product shall be checked by gel electrophoresis before sequencing.
Τα αποτελέσματα αναλύονται με χρήση του εργαλείου αναζήτησης BLAST και οι αλληλουχίες συγκρίνονται με άλλες γνωστές αλληλουχίες της βάσης δεδομένων νουκλεοτιδικών αλληλουχιών του Εθνικού Κέντρου Πληροφοριών Βιοτεχνολογίας των Η.Π.Α.
If only one pure fragment appears, it shall be purified directly from the PCR reaction.
(US National Centre for Biotechnical Information, NCBI).
If multiple amplified fragments are present, the fragment of interest shall be purified by gel electrophoresis.
Ο προσδιορισμός της αλληλουχίας πρέπει να εξαλείψει κάθε αμφιβολία σχετικά με την ειδικότητα ενός ενισχυμένου προϊόντος RT-PCR.
The purification of PCR fragments from solutions or agarose gels shall be made using PCR fragment affinity spin columns, according to the manufacturer's instructions.
Απομόνωση του ιού της ΛΑΣ σε κυτταροκαλλιέργειες
Sequencing shall be performed using amplification primers at external specialised sequencing companies.
Προετοιμασία των δειγμάτων
The results shall be analysed with the search tool BLAST and the sequences shall be compared with other known sequences in the US National Centre for Biotechnical Information (NCBI) nucleotide database.
Ο ιστός μπορεί να διατηρείται στους – 80 °C.
Sequencing must eliminate any doubt on the specificity of an amplified RT-PCR product.
Ο ιστός πρέπει να υποβάλλεται σε κατάψυξη και απόψυξη μόνο μία φορά πριν από την εξέταση.
ISAV isolation on cell cultures
Για σκοπούς επιτήρησης και ελέγχου, η εξέταση διεξάγεται το ταχύτερο δυνατόν.
Preparation of samples
Κάθε δείγμα (ενοποιημένος ιστός στο διάλυμα μεταφοράς) ομογενοποιείται πλήρως με τη βοήθεια επικυρωμένου ομογενοποιητή, φυγοκεντρείται στα 2000 έως 4000 × g επί 15 λεπτά στους 0 έως 6 °C και το υπερκείμενο υγρό διηθείται (0,45 μm) και επωάζεται με ίσο όγκο κατάλληλα αραιωμένης ομάδας αντιορών στους ενδογενείς ορότυπους του ιού IPNV.
The tissue may be kept at – 80 °C.
Ο τίτλος του αντιορού πρέπει να είναι τουλάχιστον 1:2000 σε δοκιμή εξουδετέρωσης πλακών 50 %.
The tissue shall only be frozen and thawed once before examination.
Το μείγμα επωάζεται επί μία ώρα στους 15 °C.
For surveillance and control purposes, the examination shall be undertaken as fast as possible.
Αυτό αντιπροσωπεύει το ενοφθάλμισμα.
Each sample (tissue pool in transport solution) shall be completely homogenised using a validated homogeniser, centrifuged at 2000 to 4000 × g for 15 minutes at 0 to 6 °C, and the supernatant shall be filtered (0,45 μm) and incubated with an equal volume of a suitably diluted pool of antisera to the indigenous serotypes of IPNV.
Η επεξεργασία όλων των ενοφθαλμισμάτων με τον αντιορό στον ιό της λοιμώδους παγκρεατικής νέκρωσης (ένας ιός ο οποίος, σε ορισμένα μέρη της Ευρώπης, εμφανίζεται στο 50 % των δειγμάτων ιχθύων) αποσκοπεί στην αποτροπή ανάπτυξης του κυτταροπαθολογικού φαινομένου (ΚΠΦ) οφειλόμενου στον ιό IPN, σε ενοφθαλμισμένες κυτταροκαλλιέργειες.
The titre of the antiserum must be at least 1:2000 in a 50 % plaque neutralisation test.
Η εν λόγω επεξεργασία μπορεί να διεξαχθεί προκειμένου να μειωθεί η διάρκεια των ιολογικών εξετάσεων, καθώς και ο αριθμός των περιπτώσεων όπου η παρουσία του ΚΠΦ θα έπρεπε να θεωρηθεί δυνητική ένδειξη παρουσίας του ιού της ΛΑΣ.
The mixture shall be incubated for one hour at 15 °C.
Όταν τα δείγματα προέρχονται από μονάδες παραγωγής που θεωρούνται μη προσβληθείσες από IPN, είναι δυνατόν να παραλειφθεί η επεξεργασία των ενοφθαλμισμάτων με τον αντιορό στον ιό IPN.
This shall represent the inoculum.
Ενοφθαλμισμός σε κυτταροκαλλιέργειες
Treatment of all inocula with antiserum to Infectious pancreatic necrosis virus (a virus which in some parts of the Europe occurs in 50 % of fish samples) aims at preventing cytopatic effect (CPE) due to IPN virus from developing in inoculated cell cultures.
Για την αρχική απομόνωση του ιού της ΛΑΣ χρησιμοποιούνται κύτταρα από το νεφρό του σολομού του Ατλαντικού (ASK).
To reduce the duration of the virological examinations as well as the number of cases in which occurrence of CPE would have to be considered potentially indicative of ISAV, such treatment may be carried out.
Ένα τρυβλίο παραμένει χωρίς ενοφθαλμισμό ώστε να χρησιμεύσει ως αρνητικός μάρτυρας.
Antiserum-treated organ suspension shall be inoculated into young actively growing cell cultures to give a final dilution of tissue material to culture medium of 1:1000.
Ενοφθαλμίζεται χωριστό τρυβλίο με απομόνωμα αναφοράς του ιού της ΛΑΣ, ως θετικός μάρτυρας, ως ακολούθως:
For each organ, suspension 40 μl of inoculum shall be added to one well containing 2 ml of culture medium.
Τα δείγματα επωάζονται σε 15 ± 2 °C για διάστημα μικρότερο ή ίσο των 15 ημερών.
To minimise the risk of cross-contamination, separate 12- or 24-well plates shall be used for samples from different fish farm sites.
Με τη βοήθεια μικροσκοπίου, οι κυτταροκαλλιέργειες εξετάζονται δύο φορές για ΚΠΦ, μεταξύ της 5ης και της 7ης ημέρας, καθώς και μεταξύ της 12ης και 14ης ημέρας από τον ενοφθαλμισμό.
One plate shall be left uninoculated to serve as a negative control.
Εάν κάποια ομάδα παρουσιάσει ΚΠΦ, αρχίζουν αμέσως διαδικασίες ταυτοποίησης του ιού σύμφωνα με το σημείο II.2.4.
A separate plate shall be inoculated with a reference isolate of ISAV as a positive control, as follows.
Σε περίπτωση που δεν διαπιστωθεί ΚΠΦ μέχρι και τη 14η ημέρα, διενεργείται δοκιμή έμμεσα φθοριζόντων αντισωμάτων (IFAT), αιμοπροσρόφηση ή RT-PCR.
One hundred μl of a stock preparation of ISAV (minimum titre 107 Tissue culture infective dose at the 50 % end point (TCID50 ml– 1)) shall be inoculated into the first well and mixed.
Διενεργείται υποκαλλιέργεια μεταξύ της 13ης και της 15ης ημέρας.
A volume of this material shall be transferred from the first well to the second well to make a 1:10 dilution and mixed.
Προστίθεται υπερκείμενο υγρό της καλλιέργειας σε κοιλότητες που περιέχουν φρέσκα, ενεργώς αναπτυσσόμενα κύτταρα στην κατάλληλη αραίωση (1/10) σε τρυβλία πολλαπλών κοιλοτήτων και ακολουθεί επώαση στους 14 ± 2 °C επί 18 ημέρες κατά μέγιστο όριο.
This shall be repeated across the plate to make six 10-fold dilutions.
Με τη βοήθεια μικροσκοπίου, οι κυτταροκαλλιέργειες εξετάζονται δύο φορές για ΚΠΦ, μεταξύ της 5ης και της 7ης ημέρας, καθώς και μεταξύ της 14ης και 18ης ημέρας από τον ενοφθαλμισμό.
Stock ISAV may be stored at – 80 °C for at least 2 years but once thawed must be used within 3 days.
Εάν δεν παρατηρηθεί ΚΠΦ μέχρι τη 14η και 18η ημέρα, διενεργείται δοκιμή αιμοπροσρόφησης ή RT-PCR.
Care shall be taken to prevent cross-contamination of test plates with positive control material.
Σε περίπτωση που εμφανιστεί κυτταροτοξικότητα εντός των πρώτων επτά ημερών της επώασης, διενεργείται υποκαλλιέργεια στο στάδιο εκείνο και τα κύτταρα επωάζονται επί 14 έως 18 ημέρες και υποβάλλονται εκ νέου σε υποκαλλιέργεια με περαιτέρω επώαση 14 έως 18 ημερών.
To avoid that risk, positive controls shall be set up and handled separately from test plates.
Εάν η κυτταροτοξικότητα εμφανιστεί μετά από επτά ημέρες, διενεργείται υποκαλλιέργεια μία φορά και τα κύτταρα επωάζονται, προκειμένου να συμπληρώσουν συνολικά 28 έως 36 ημέρες από τον αρχικό ενοφθαλμισμό.
A sensitivity test every 6 months of ASK cells towards ISAV isolates may replace the use of including a positive control at each inoculation.
Εάν εκδηλωθεί βακτηριακή μόλυνση στην αρχική καλλιέργεια, η δοκιμή διεξάγεται εκ νέου με τους ομογενοποιημένους ιστούς που έχουν φυλαχτεί στους – 80 °C.
Samples shall be incubated at 15 ± 2 °C for up to 15 days.
Πριν από τον ενοφθαλμισμό, ο ομογενοποιημένος ιστός φυγοκεντρείται στα 4000 × g επί 15 έως 30 λεπτά στους 0 έως 6 °C και το υπερκείμενο υγρό διηθείται σε φίλτρο των 0,22 μm.
Using a microscope, cell cultures shall be examined for CPE twice, between 5 to 7 and 12 to 14 days following inoculation.
Εάν εκδηλωθεί βακτηριακή μόλυνση στο στάδιο της υποκαλλιέργειας, το υπερκείμενο υγρό διηθείται σε φίλτρο των 0,22 μm, ενοφθαλμίζεται σε φρέσκα κύτταρα και επωάζεται για ένα περαιτέρω διάστημα 14 έως 18 ημερών.
If any pool shows CPE, virus identification procedures shall be initiated immediately in accordance with point II.2.4.
Δοκιμές ταυτοποίησης ιού
If no CPE is observed by day 14, an Indirect fluorescent antibody test (IFAT), haemadsorption or RT-PCR shall be performed.
Εάν, σε οιοδήποτε στάδιο, παρατηρηθούν ενδείξεις ΚΠΦ, ή εάν κάποια δοκιμή αιμοπροσρόφησης είναι θετική, διενεργείται ταυτοποίηση ιού.
Subcultivation shall be carried out between days 13 to 15.
Οι μέθοδοι επιλογής για την ταυτοποίηση του ιού της ΛΑΣ είναι η RT-PCR σύμφωνα με το σημείο II.1 και ο ανοσοφθορισμός (IF) σύμφωνα με το σημείο II.2.6.
Culture supernatant shall be added to wells containing fresh actively growing cells in appropriate dilution (1/10) in multi-well plates and incubated at 14 ± 2 °C for up to 18 days.
Εάν θεωρείται ενδεχόμενη η παρουσία άλλων ιών, διενεργούνται συμπληρωματικές δοκιμές ταυτοποίησης ιού.
Using a microscope, cell cultures shall be examined for CPE twice, between days five to seven and days 14 to 18 following inoculation.
Εάν οι δοκιμές αυτές δεν καταλήξουν σε οριστική ταυτοποίηση του ιού εντός μιας εβδομάδας, το υπερκείμενο υγρό αποστέλλεται για άμεση ταυτοποίηση:
If no CPE is observed by days 14 to 18, a haemadsorption or an RT-PCR test shall be performed.
στο εργαστήριο αναφοράς του Διεθνούς Οργανισμού Υγείας των Ζώων (OIE) για τη ΛΑΣ ή
If cytotoxicity occurs within the first 7 days of incubation, subcultivation shall be performed at that stage, and the cells shall be incubated for 14 to 18 days and sub cultivated again with a further period of 14 to 18 days incubation.
σε ένα εθνικό εργαστήριο αναφοράς ή στο εργαστήριο αναφοράς της ΕΕ για ασθένειες ιχθύων, όπως αναφέρεται στο παράρτημα VI της οδηγίας 2006/88/ΕΚ.
If cytotoxicity occurs after 7 days, subcultivation shall be performed once and the cells shall be incubated to achieve the total period of 28 to 36 days incubation from the primary inoculation.
Αιμοπροσρόφηση
If bacterial contamination occurs in the primary culture, the test shall be set up again using the tissue homogenate stored at – 80 °C.
Επειδή η αντιγραφή του ιού της ΛΑΣ σε κυτταροκαλλιέργειες δεν οδηγεί πάντα σε ΚΠΦ, κάθε κοιλότητα υποβάλλεται σε δοκιμή RT-PCR ή δοκιμή αιμοπροσρόφησης σύμφωνα με το παρόν σημείο ή σε δοκιμή IF σύμφωνα με το σημείο II.2.6.
Prior to inoculation, the tissue homogenate shall be centrifuged at 4000 × g for 15 to 30 minutes at 0 to 6 °C and the supernatant shall be filtered at 0,22 μm.
Αφαιρείται το υπόστρωμα των κυτταροκαλλιεργειών από κάθε κοιλότητα, συμπεριλαμβανομένων των θετικών και αρνητικών μαρτύρων, και τοποθετείται σε επισημασμένους αποστειρωμένους σωλήνες.
If bacterial contamination occurs during the subcultivation step the supernatant shall be filtered at 0,22 μm, inoculated onto fresh cells and incubated for a further 14 to 18 days.
Σε κάθε κοιλότητα προστίθενται 500 μl εναιωρήματος 0,2 % (vol:vol) εκπλυμένων ερυθρών αιμοσφαιρίων κουνελιού ή αλόγου ή εναιώρημα 0,05 % (vol:vol) εκπλυμένων ερυθρών αιμοσφαιρίων ιριδίζουσας πέστροφας ή σολομού του Ατλαντικού και ακολουθεί επώαση σε θερμοκρασία δωματίου επί 45 λεπτά.
Virus identification tests
Απομακρύνονται τα ερυθρά αιμοσφαίρια και κάθε κοιλότητα εκπλένεται δύο φορές με υπόστρωμα L-15.
If evidence of CPE is observed at any stage, or if a haemadsorption test is positive, virus identification shall be carried out.
Εξετάζεται κάθε κοιλότητα με τη βοήθεια μικροσκοπίου.
The methods of choice for the identification of ISAV shall be RT-PCR in accordance with point II.1 and Immunofluorescence (IF) in accordance with point II.2.6.
Η παρουσία συμπλέγματος ερυθρών αιμοσφαιρίων προσκολλημένων στην επιφάνεια κυττάρων ASK συνιστά ένδειξη πιθανής λοίμωξης με ορθομυξοϊό.
If it is considered that other viruses may be present, supplementary virus identification tests shall be carried out.
Εάν η δοκιμή αιμοπροσρόφησης είναι θετική, διενεργείται αμέσως δοκιμή ταυτοποίησης ιού σύμφωνα με το σημείο II.2.4.
If those tests have not resulted in a definitive identification of the virus within 1 week, the supernatant shall be forwarded for immediate identification to:
Ανοσοφθορισμός (IF)
the World Organisation for Animal Health (OIE) reference laboratory for ISA, or;