natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Ο συνιστώμενος διαλύτης για τον προσδιορισμό είναι το DMSO.
Prior to use, Nu-serum (or a comparable serum of equal properties that has been demonstrated to produce data that meets the test performance and Quality Control (QC) requirements), which is a constituent of supplemented media, should be analysed for background T and E2 concentrations.
Εάν χρησιμοποιείται εναλλακτικός διαλύτης, θα πρέπει να προσδιορίζονται τα ακόλουθα:
The preparation of these solutions is described in Appendix II to the validation report (4).
η κυτταροτοξικότητα ως συνάρτηση της συγκέντρωσης του διαλύτη.
After initiation of an H295R cell culture from an original ATCC batch, cells should be grown for five passages (i.e.the cells are split 4 times).
Η μέγιστη επιτρεπόμενη συγκέντρωση του διαλύτη συνιστάται να μην υπερβαίνει την αραίωση 1:10 της ελάχιστης κυτταροτοξικής συγκέντρωσής του.
Passage five cells are then frozen in liquid nitrogen for storage.
Πριν από τη διεξαγωγή της δοκιμής για πρώτη φορά, το εργαστήριο θα πρέπει να εκτελεί κατάλληλο πείραμα που καταδεικνύει την ικανότητά του να διατηρεί και να επιτυγχάνει τις κατάλληλες συνθήκες κυτταροκαλλιέργειας και πειραματικές συνθήκες που απαιτούνται για τη δοκιμή χημικών ουσιών, όπως περιγράφονται στις παραγράφους 33-35.
Prior to freezing the cells, a sample of the previous passage four cells is run in a QC plate (See paragraph 36 and 37) to verify whether the basal production of hormones and the response to positive control chemicals meet the assay quality control criteria as defined in Table 5.
Όταν διεξάγεται δοκιμή με νέα παρτίδα κυττάρων, θα πρέπει να εκτελείται μέτρηση με πλάκα ποιοτικού ελέγχου πριν χρησιμοποιηθεί η νέα παρτίδα, ώστε να αξιολογούνται οι επιδόσεις των κυττάρων, όπως περιγράφεται στις παραγράφους 36 και 37.
H295R cells need to be cultured, frozen and stored in liquid nitrogen to make sure that there are always cells of the appropriate passage/age available for culture and use.
Επιδόσεις του συστήματος μέτρησης ορμονών
The maximum number of passages after taking a new [15] or frozen [16] batch of cells into culture that is acceptable for use in the H295R assay should not exceed 10.
Ευαισθησία, ορθότητα και ακρίβεια της μεθόδου και διασταυρούμενη δραστικότητα με τη μήτρα του δείγματος
For example, acceptable passages for cultures of cells from a batch frozen at passage 5 would be 4.5 through 10.5.
Κάθε εργαστήριο μπορεί να χρησιμοποιεί σύστημα μέτρησης ορμονών της επιλογής του για την ανάλυση της παραγωγής Τ και Ε2 από κύτταρα H295R, εφόσον αυτό πληροί κριτήρια επιδόσεων, μεταξύ των οποίων το όριο ποσοτικού προσδιορισμού (LOQ).
For cells started from these frozen batches, the procedure described in paragraph 19 should be followed.
Οι ονομαστικές τιμές του ορίου αυτού είναι 100 pg/ml για την Τ και 10 pg/ml για την E2 και στηρίζονται στα βασικά επίπεδα ορμονών που παρατηρούνται στις μελέτες επικύρωσης.
These cells should be cultured for at least four (4) additional passages (passage 4.5) prior to their use in testing.Starting Cells from the Frozen Stock
Ωστόσο, ενδέχεται να είναι σκόπιμα υψηλότερα ή χαμηλότερα επίπεδα, ανάλογα με τα βασικά ορμονικά επίπεδα που έχει επιτύχει το εργαστήριο που εκτελεί τη δοκιμή.
The procedure for starting the cells from frozen stock is to be used when a new batch of cells is removed from liquid nitrogen storage for the purpose of culture and testing.
Πριν από τη διεξαγωγή δοκιμής με πλάκα ποιοτικού ελέγχου και την εκτέλεση των δοκιμών, το εργαστήριο θα πρέπει να καταδεικνύει ότι με τον ορμονικό προσδιορισμό που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί είναι δυνατόν να μετρηθούν συγκεντρώσεις ορμονών σε εμπλουτισμένο θρεπτικό μέσο με επαρκή ορθότητα και ακρίβεια ώστε να πληρούνται τα κριτήρια ποιοτικού ελέγχου που καθορίζονται στους πίνακες 1 και 5, αναλύοντας εμπλουτισμένο θρεπτικό μέσο που έχει εμβολιαστεί με εσωτερικό μάρτυρα ορμονών.
Details for this procedure are set forth in Appendix III to the validation report (4).
Το εμπλουτισμένο θρεπτικό μέσο θα πρέπει να εμβολιάζεται με τρεις τουλάχιστον συγκεντρώσεις κάθε ορμόνης (π.χ. 100, 500 και 2500 pg/ml για την Τ και 10, 50 και 250 pg/ml για την E2· εναλλακτικά, μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως χαμηλότερες συγκεντρώσεις εμβολιασμού με T και E2 οι χαμηλότερες δυνατές συγκεντρώσεις βάσει των ορίων ανίχνευσης του επιλεγμένου συστήματος μέτρησης ορμονών) και να αναλύεται.
Cells are removed from liquid nitrogen storage, thawed rapidly, placed in supplemented medium in a centrifuge tube, centrifuged at room temperature, re-suspended in supplemented medium, and transferred to a culture flask.
Οι μετρούμενες συγκεντρώσεις ορμονών σε μη εκχυλισμένα δείγματα θα πρέπει να μη διαφέρουν κατά περισσότερο από 30 % από τις ονομαστικές συγκεντρώσεις, ενώ η μεταβλητότητα μεταξύ πολλαπλών μετρήσεων στο ίδιο δείγμα δεν πρέπει να υπερβαίνει το 25 % (βλ. επίσης πίνακα 8 για συμπληρωματικά κριτήρια ποιοτικού ελέγχου).
The medium should be changed the following day.
Εάν πληρούνται τα ανωτέρω κριτήρια, θεωρείται ότι ο επιλεγμένος ορμονικός προσδιορισμός είναι επαρκώς ορθός και ακριβής και δεν προκαλεί διασταυρούμενη αντίδραση με τα συστατικά του θρεπτικού μέσου (μήτρα δείγματος) ώστε να αναμένεται σημαντική μεταβολή του αποτελέσματος του προσδιορισμού.
The H295R cells are cultivated in an incubator at 37 °C with 5 % CO2 in air atmosphere and the medium is renewed 2-3 times per week.
Στην περίπτωση αυτή, δεν απαιτείται εκχύλιση των δειγμάτων πριν από τη μέτρηση των ορμονών.
When the cells are approximately 85-90 % confluent, they should be split.
Σε περίπτωση που δεν πληρούνται τα κριτήρια ποιοτικού ελέγχου των πινάκων 1 και 8, είναι πιθανόν να πρόκειται για σημαντική επίδραση της μήτρας του δείγματος και θα πρέπει να διεξάγεται πείραμα με εκχυλισμένο εμβολιασμένο θρεπτικό μέσο.
Splitting of the cells is necessary to ensure the health and growth of the cells and to maintain cells for performing bioassays.
Παράδειγμα της διαδικασίας εκχύλισης περιγράφεται στο προσάρτημα ΙΙ της έκθεσης επικύρωσης (4).
The cells are rinsed three times with phosphate-buffered saline (PBS, without Ca2+ Mg2+.) and freed from the culture flask by the addition of an appropriate detachment enzyme, e.g. trypsin, in PBS (without Ca2+ Mg2+).
Οι συγκεντρώσεις ορμονών θα πρέπει να μετρώνται στα εκχυλισμένα δείγματα εις τριπλούν [17].
Immediately after the cells detach from the culture flask, the enzyme action should be stopped with the addition of supplemented medium at a ratio of 3× the volume used for the enzyme treatment.
Εάν μπορεί να αποδειχθεί ότι, μετά την εκχύλιση, τα συστατικά του θρεπτικού μέσου δεν παρεμποδίζουν τη μέθοδο ανίχνευσης ορμονών, όπως ορίζεται στα κριτήρια ποιοτικού ελέγχου, όλα τα επόμενα πειράματα θα πρέπει να διεξάγονται με εκχυλισμένα δείγματα.
Cells are placed into a centrifuge tube, centrifuged at room temperature, the supernatant is removed and the pellet of cells is re-suspended in supplemented medium.
Εάν δεν είναι δυνατή η εκπλήρωση των κριτηρίων ποιοτικού ελέγχου μετά την εκχύλιση, το χρησιμοποιούμενο σύστημα μέτρησης ορμονών δεν είναι κατάλληλο για τον προσδιορισμό στεροειδογένεσης H295R και θα πρέπει να χρησιμοποιείται εναλλακτική μέθοδος ανίχνευσης ορμονών.Πρότυπη καμπύλη
The appropriate amount of cell solution is placed in the new culture flask.
Οι αραιώσεις του θρεπτικού μέσου (ή των εκχυλισμάτων) που πρόκειται να μετρηθούν πρέπει να επιλέγονται αναλόγως.
The amount of cell solution should be adjusted so that the cells are confluent within 5-7 days.
Η γραμμική σχέση πρέπει να προσδιορίζεται με κατάλληλη στατιστική προσέγγιση.
The recommended sub-cultivation ratio is 1:3 to 1:4.
Δοκιμή χημικής παρεμπόδισης
The plate should be carefully labelled.
Εάν πρόκειται να χρησιμοποιηθούν για τη μέτρηση των ορμονών προσδιορισμοί που βασίζονται σε αντισώματα, όπως ενζυμικοί ανοσοπροσροφητικοί προσδιορισμοί (ELISA) και ραδιοανοσοχημικοί προσδιορισμοί (RIA), κάθε χημική ουσία θα πρέπει να ελέγχεται, πριν από την έναρξη της πραγματικής δοκιμής της, για να διαπιστωθεί αν μπορεί να παρεμποδίσει το σύστημα μέτρησης ορμονών που θα χρησιμοποιηθεί [προσάρτημα ΙΙΙ της έκθεσης επικύρωσης (4)], διότι ορισμένες χημικές ουσίες μπορούν να παρεμποδίσουν τις δοκιμές αυτές (17).
The cells are now ready to be used in the assay and excess cells should be frozen in liquid nitrogen as described in paragraph 20.
Εάν προκύψει παρεμπόδιση ≥ 20 % της βασικής παραγωγής T και/ή E2, όπως προσδιορίζεται με ανάλυση των ορμονών, όλες οι αραιώσεις του διαλύματος παρακαταθήκης της ελεγχόμενης χημικής ουσίας θα πρέπει να υποβάλλονται στη δοκιμή χημικής παρεμπόδισης του ορμονικού προσδιορισμού (που περιγράφεται στο προσάρτημα III της έκθεσης επικύρωσης (4), σημείο 5.0) για τον καθορισμό της δόσης κατωφλίου στην οποία σημειώνεται σημαντική (≥ 20 %) παρεμπόδιση.
Freezing H295R Cells (preparing cells for liquid nitrogen storage)
Εάν η παρεμπόδιση είναι μικρότερη από 30 %, τα αποτελέσματα μπορούν να διορθώνονται ώστε να λαμβάνεται υπόψη.
To prepare H295R cells for freezing, the procedure described above for splitting cells should be followed until the step for re-suspending the pellet of cells in the bottom of the centrifuge tube.
Εάν η παρεμπόδιση υπερβαίνει το 30 %, τα δεδομένα για τις αντίστοιχες συγκεντρώσεις είναι άκυρα και θα πρέπει να απορρίπτονται.
Here, the pellet of cells is re-suspended in freezing medium.
Εάν μια ελεγχόμενη χημική ουσία παρεμποδίζει σημαντικά ένα σύστημα μέτρησης ορμονών σε περισσότερες από μία μη κυτταροτοξικές συγκεντρώσεις, θα πρέπει να χρησιμοποιείται διαφορετικό σύστημα.
The solution is transferred to a cryogenic vial, labelled appropriately, and frozen at – 80 °C for 24 hours after which the cryogenic vial is transferred to liquid nitrogen for storage.
Για να αποφευχθεί η παρεμπόδιση από χημικές προσμείξεις, συνιστάται να εκχυλίζονται οι ορμόνες από το θρεπτικό μέσο με τη χρήση κατάλληλου διαλύτη.
Plating and Pre-incubation of Cells for Testing
Σχετικές μέθοδοι αναφέρονται στην έκθεση επικύρωσης (4).
The number of 24-well plates, prepared as outlined in paragraph 19, that will be needed depends on the number of chemicals to be tested and the confluency of the cells in the culture dishes.
Κριτήρια επιδόσεων των συστημάτων μέτρησης ορμονών
As a general rule, one culture flask (75 cm2) of 80-90 % confluent cells will supply sufficient cells for one to 1,5 (24-well) plates at a target density of 200000 to 300000 cells per ml of medium resulting in approximately 50-60 % confluency in the wells at 24 hours (Figure 2).
Παράμετρος
This is typically the optimal cell density for hormone production in the assay.
Κριτήριο
At higher densities, T as well as E2 production patterns are altered.
Ευαισθησία της μεθόδου μετρήσεων
Before conducting the assay the first time, it is recommended that different seeding densities between 200000 and 300000 cells per ml be tested, and the density resulting in 50-60 % confluency in the well at 24 hours be selected for further experiments.
Όριο ποσοτικού προσδιορισμού (LOQ)
Photomicrograph of H295R cells at a seeding density of 50 % in a 24 well culture plate at 24 hours taken at the edge (A) and centre (B) of a well
Απόδοση της εκχύλισης ορμονών (μόνο όταν απαιτείται εκχύλιση)
Necropsy P animals
Τα μέσα ποσοστά ανάκτησης (βάσει μετρήσεων εις τριπλούν) για τις εμβολιαζόμενες ποσότητες ορμονών δεν θα πρέπει να αποκλίνουν κατά ποσοστό άνω του 30 % από την ποσότητα που προστίθεται.
Pre-mating
Χημική παρεμπόδιση (μόνο για συστήματα που βασίζονται σε αντισώματα)
Post-mating
Δεν θα πρέπει να σημειώνεται σημαντική διασταυρούμενη δραστικότητα (≥ 30 % της βασικής παραγωγής της αντίστοιχης ορμόνης) με οποιαδήποτε από τις ορμόνες που παράγουν τα κύτταρα [19] [20].
2 weeks
Δοκιμή ελέγχου ικανότητας εργαστηρίων
6 weeks
Πριν υποβάλει σε δοκιμή άγνωστες χημικές ουσίες, το εργαστήριο θα πρέπει να καταδεικνύει ότι είναι ικανό να επιτυγχάνει και να διατηρεί τις κατάλληλες συνθήκες κυταροκαλλιέργειας και δοκιμής που απαιτούνται για την επιτυχή διεξαγωγή του προσδιορισμού, εκτελώντας τη δοκιμή ελέγχου ικανότητας εργαστηρίων.
Pregnancy
Δεδομένου ότι οι επιδόσεις ενός προσδιορισμού συνδέονται άμεσα με το εργαστηριακό προσωπικό που τον διεξάγει, οι διαδικασίες αυτές θα πρέπει να επαναλαμβάνονται εν μέρει σε περίπτωση αλλαγής του προσωπικού του εργαστηρίου.
Lactation
Η παρούσα δοκιμή ελέγχου ικανότητας διεξάγεται υπό τις συνθήκες που αναφέρονται στις παραγράφους 38 έως 40, με την έκθεση κυττάρων σε 7 αυξανόμενες συγκεντρώσεις ισχυρών, μέτριων και ασθενών επαγωγέων και αναστολέων, καθώς και μιας αρνητικής χημικής ουσίας (βλ. πίνακα 2).
In-utero development
Εκτελούνται δοκιμές σε χωριστές πλάκες για όλες τις χημικές ουσίες με τη χρήση του σχήματος του πίνακα 6.
Pre-weaning
Σε κάθε καθημερινή εκτέλεση της δοκιμής για τις χημικές ουσίες ελέγχου ικανότητας θα πρέπει να συμπεριλαμβάνεται μια πλάκα ποιοτικού ελέγχου (πίνακας 4, παράγραφοι 36-37).
Post-weaning
Χημικές ουσίες ελέγχου ικανότητας και συγκεντρώσεις έκθεσης
Parental generation
Χημική ουσία ελέγχου ικανότητας
Cohort
Συγκεντρώσεις δοκιμής [μM]
Designation
Φορσκολίνη
Animals/cohort
Ατραζίνη
Approximate age at necropsy (weeks)
Αμινογλουταιθιμίδιο
Target is 20 litters per group
Δισφαινόλη Α
Surplus
Κατά τη δοκιμή ελέγχου ικανότητας εργαστηρίων, τα κύτταρα H295R θα πρέπει να εκτίθενται στις χημικές ουσίες ελέγχου ικανότητας σε πλάκες των 24 κοιλοτήτων.
Reproductive
Οι δόσεις εκφράζονται σε μΜ για όλες τις ελεγχόμενες χημικές ουσίες.
Neurotoxicity
Ως διαλύτης για τις δόσεις θα πρέπει να χρησιμοποιείται DMSO σε αναλογία 0,1 % κατ' όγκο ανά κοιλότητα.
Immunotoxicity
Καθεμία από τις συγκεντρώσεις δοκιμής θα πρέπει να ελέγχεται σε τρεις κοιλότητες (πίνακας 6).
Spares
Χρησιμοποιείται χωριστή πλάκα για κάθε χημική ουσία.
20 M + 20 F
Σε κάθε καθημερινή εκτέλεση της δοκιμής συμπεριλαμβάνεται μια πλάκα ποιοτικού ελέγχου.
10 M + 10 F @
Θα πρέπει να διεξάγονται αναλύσεις κυτταρικής βιωσιμότητας και ορμονών, όπως προβλέπεται στις παραγράφους 42 έως 46.
14 or 20-25 if triggered
Τα δεδομένα θεωρούνται αποδεκτά, εάν είναι σύμφωνα με την τιμή LOEC και την απόφαση ταξινόμησης που εμφαίνονται στον πίνακα 3.
The medium is pipetted off the culture flask, and the cells are rinsed 3 times with sterile PBS (without Ca2+Mg2+).
Τιμές κατωφλίου (LOEC) και αποφάσεις ταξινόμησης για τις χημικές ουσίες ελέγχου ικανότητας
An enzyme solution (in PBS) is added to detach the cells from the culture flask.
Α/Α:
Following an appropriate time for detachment of the cells, the enzyme action should be stopped with the addition of supplemented medium at a ratio of 3 × the volume used for the enzyme treatment.
άνευ αντικειμένου, δεδομένου ότι δεν πρέπει να επέρχονται αλλαγές μετά την έκθεση σε μη κυτταροτοξικές συγκεντρώσεις αρνητικού μάρτυρα.
Cells are placed into a centrifuge tube, centrifuged at room temperature, the supernatant is removed, and the pellet of cells is re-suspended in supplemented medium.
Αριθ. CAS
The cell density is calculated using e.g. a haemocytometer or cell counter.
Απόφαση ταξινόμησης
The cell solution should be diluted to the desired plating density and thoroughly mixed to assure homogenous cell density.
+ [22] (αναστολή)
The cells should be plated with 1 ml of the cell solution/well and the plates and wells labelled.
+ (αναστολή)
The seeded plates are incubated at 37 °C under 5 % CO2 in air atmosphere for 24 hours to allow the cells to attach to the wells.
+ (επαγωγή)
QUALITY CONTROL REQUIREMENTS
Α/Α
It is critical that exact volumes of solutions and samples are delivered into the wells during dosing because these volumes determine the concentrations used in the calculations of assay results.
Αρνητική
Prior to the initiation of cell culture and any subsequent testing, each laboratory should demonstrate the sensitivity of its hormone measurement system (paragraphs 29-31).
Πλάκα ποιοτικού ελέγχου
If antibody-based hormone measurement assays are to be used, the chemicals to be tested should be analysed for their potential to interfere with the measurement system used to quantify T and E2 as outlined in paragraph 32 prior to initiating testing.
Η πλάκα ποιοτικού ελέγχου χρησιμοποιείται για την εξακρίβωση των επιδόσεων των κυττάρων H295R υπό πρότυπες συνθήκες καλλιέργειας και για τη δημιουργία ιστορικής βάσης δεδομένων που αφορούν τις συγκεντρώσεις ορμονών σε μάρτυρες με διαλύτη, θετικούς και αρνητικούς μάρτυρες, καθώς και άλλα μέτρα ποιοτικού ελέγχου, με την πάροδο του χρόνου.
DMSO is the recommended solvent for the assay.
Οι επιδόσεις των κυττάρων H295R θα πρέπει να αξιολογούνται με τη χρήση πλάκας ποιοτικού ελέγχου για κάθε νέα παρτίδα προερχόμενη από τον ATCC ή μετά την πρώτη χρήση ενός αποθέματος κυττάρων που έχει προηγουμένως καταψυχθεί, εκτός εάν έχει διεξαχθεί δοκιμή ελέγχου ικανότητας εργαστηρίων (παράγραφοι 32-34) με τη συγκεκριμένη παρτίδα κυττάρων.
If an alternative solvent is utilised, the following should be determined:
Η πλάκα ποιοτικού ελέγχου εξασφαλίζει την πλήρη αξιολόγηση των συνθηκών προσδιορισμού (π.χ. βιωσιμότητα κυττάρων, μάρτυρες με διαλύτη, αρνητικοί και θετικοί μάρτυρες, καθώς και μεταβλητότητα εντός ενός προσδιορισμού και μεταξύ διαφορετικών προσδιορισμών) κατά τις δοκιμές χημικών ουσιών και θα πρέπει να συμπεριλαμβάνεται σε κάθε εκτέλεση της δοκιμής.
The solubility of the test chemical, forskolin and prochloraz in the solvent;
Η δοκιμή ποιοτικού ελέγχου διεξάγεται σε πλάκα των 24 κοιλοτήτων και σύμφωνα με τις διαδικασίες επώασης, έκθεσης στις δόσεις, βιωσιμότητας των κυττάρων/κυτταροτοξικότητας, εκχύλισης ορμονών και ανάλυσης ορμονών που περιγράφονται στις παραγράφους 38 έως 46 για τις δοκιμές χημικών ουσιών.
The cytotoxicity as a function of the concentration of solvent.
Η πλάκα ποιοτικού ελέγχου περιέχει τυφλά δείγματα, μάρτυρες με διαλύτη και δύο συγκεντρώσεις ενός γνωστού επαγωγέα (φορσκολίνη, 1 και 10 μΜ) και ενός γνωστού αναστολέα (prochloraz, 0,1 και 1 μΜ) της σύνθεσης Ε2 και Τ. Επιπλέον, χρησιμοποιείται μεθανόλη (MeOH) σε επιλεγμένες κοιλότητες ως θετικός μάρτυρας για τον προσδιορισμό βιωσιμότητας/κυτταροτοξικότητας.
It is recommended that the maximum allowable solvent concentration should not exceed a 10 × dilution of the least cytotoxic concentration of the solvent.
Αναλυτική περιγραφή της διάταξης των πλακών παρέχεται στον πίνακα 4.
Prior to conducting testing for the first time, the laboratory should conduct a qualifying experiment demonstrating that the laboratory is capable of maintaining and achieving appropriate cell culture and experimental conditions required for chemical testing as described in paragraphs 33-35.
Τα κριτήρια που πρέπει να πληροί η πλάκα ποιοτικού ελέγχου παρατίθενται στον πίνακα 5.
When initiating testing using a new batch, a control plate should be run before using a new batch of cells to evaluate the performance of the cells as described in paragraphs 36 and 37.
Διάταξη πλάκας ποιοτικού ελέγχου για τον έλεγχο των επιδόσεων κυττάρων H295R που δεν έχουν εκτεθεί και κυττάρων που έχουν εκτεθεί σε γνωστούς αναστολείς (PRO = prochloraz) και διεγέρτες (FOR = φορσκολίνη) της παραγωγής Ε2 και Τ. Μετά τη λήξη του πειράματος έκθεσης και την απομάκρυνση του θρεπτικού μέσου, προστίθεται σε όλες τις κοιλότητες MeOH διάλυμα μεθανόλης 70 % για να χρησιμεύει ως θετικός μάρτυρας κυτταροτοξικότητας [βλ. προσδιορισμό κυτταροτοξικότητας στο προσάρτημα ΙΙΙ της έκθεσης επικύρωσης (4)]
Each laboratory may use a hormone measurement system of its choice for the analysis of the production of T and E2 by H295R cells so long as it meets performance criteria, including the Limit of Quantification (LOQ).
Τυφλό δείγμα [23]
Nominally these are 100 pg/ml for T and 10 pg/ml for E2, which are based on the basal hormone levels observed in the validation studies.
Τυφλό δείγμα [23](+ MeOH) [24]
However, greater or lower levels may be appropriate depending upon the basal hormone levels achieved in the performing laboratory.
Πίνακας 5
Prior to initiation of QC plate and test runs, the laboratory should demonstrate that the hormone assay to be used can measure hormone concentrations in supplemented medium with sufficient accuracy and precision to meet the QC criteria specified in Tables 1 and 5 by analysing supplemented medium spiked with an internal hormone control.
Κριτήρια επιδόσεων για την πλάκα ποιοτικού ελέγχου
Supplemented medium should be spiked with at least three concentrations of each hormone (e.g. 100, 500 and 2500 pg/ml of T; 10, 50 and 250 pg/ml of E2; or the lowest possible concentrations based upon the detection limits of the chosen hormone measurement system can be used for the lowest spike concentrations for T and E2) and analysed.
Βασική παραγωγή ορμονών στο μάρτυρα με τον διαλύτη (ΜΔ)
Measured hormone concentrations of non-extracted samples should be within 30 % of nominal concentrations, and variation between replicate measurements of the same sample should not exceed 25 % (see also Table 8 for additional QC criteria).
≥ 5 επί το όριο ποσοτικού προσδιορισμού
If these QC criteria are fulfilled it is assumed that the selected hormone measurement assay is sufficiently accurate, precise and does not cross-react with components in the medium (sample matrix) such that a significant influence on the outcome of the assay would be expected.
≥ 2,5 επί το όριο ποσοτικού προσδιορισμού
In this case, no extraction of samples prior to measurement of hormones is required.
Επαγωγή (10 μΜ φορσκολίνης)
In the case that the QC criteria in Tables 1 and 8 are not fulfilled, a significant matrix effect may be occurring, and an experiment with extracted spiked medium should be conducted.
≥ 1,5 επί την τιμή του ΜΔ
An example of an extraction procedure is described in Appendix II to the validation report (4).
≥ 7,5 επί την τιμή του ΜΔ
Measurements of the hormone concentrations in the extracted samples should be made in triplicate.
Αναστολή (1 μΜ prochloraz)
If it can be shown that after extraction the components of the medium do not interfere with the hormone detection method as defined by the QC criteria, all further experiments should be conducted using extracted samples.
≤ 0,5 επί την τιμή του ΜΔ
If the QC criteria cannot be met after extraction, the utilised hormone measurement system is not suitable for the purpose of the H295R Steroidogenesis Assay, and an alternative hormone detection method should be used.Standard curve
ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΕΚΘΕΣΗΣ ΣΤΗ ΧΗΜΙΚΗ ΟΥΣΙΑ
The hormone concentrations of the solvent controls (SC) should be within the linear portion of the standard curve.
Τα προεπωασμένα κύτταρα απομακρύνονται από τον επωαστήρα (παράγραφος 21) και εξετάζονται στο μικροσκόπιο για να εξασφαλιστεί ότι βρίσκονται σε καλή κατάσταση (προσκόλληση, μορφολογία) πριν από την έκθεση στις δόσεις.
Preferably, the SC values should fall close to the centre of the linear portion to ensure that induction and inhibition of hormone synthesis can be measured.
Τα κύτταρα τοποθετούνται σε θάλαμο βιοασφάλειας και το εμπλουτισμένο θρεπτικό μέσο απομακρύνεται και αντικαθίσταται με νέο (1 ml/κοιλότητα).
Dilutions of medium (or extracts) to be measured are to be selected accordingly.
Ο προτιμώμενος διαλύτης για την παρούσα μέθοδο δοκιμών είναι το DMSO.
The linear relationship is to be determined by a suitable statistical approach.
Ωστόσο, εάν υπάρχουν λόγοι που επιβάλλουν τη χρήση άλλων διαλυτών, θα πρέπει να αναφέρονται.
Chemical interference test
Τα κύτταρα εκτίθενται στην ελεγχόμενη χημική ουσία με την προσθήκη 1 μl κατάλληλου διαλύματος παρακαταθήκης σε DMSO [βλ. προσάρτημα ΙΙ της έκθεσης επικύρωσης (4)] ανά 1 ml εμπλουτισμένου θρεπτικού μέσου (όγκος κοιλότητας).
If antibody-based assays such as Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISAs) and Radio-Immuno Assays (RIAs) are going to be used to measure hormones, each chemical should be tested for potential interference with the hormone measurement system to be utilised prior to initiation of the actual testing of chemicals (Appendix III to the validation report (4)) because some chemicals can interfere with these tests (17).
Με τον τρόπο αυτό προκύπτει τελική συγκέντρωση 0,1 % DMSO στις κοιλότητες.
If interference occurs that is ≥ 20 % of basal hormone production for T and/or E2 as determined by hormone analysis, the Chemical Hormone Assay Interference Test (such as described in Appendix III to the validation report (4) section 5.0) should be run on all test chemical stock solution dilutions to identify the threshold dose at which significant (≥ 20 % ) interference occurs.