natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Για να εξασφαλιστεί επαρκής ανάμειξη, προτιμάται γενικά η ανάμειξη του κατάλληλου διαλύματος παρακαταθήκης της ελεγχόμενης χημικής ουσίας σε DMSO με το εμπλουτισμένο θρεπτικό μέσο για να ληφθεί η επιθυμητή τελική συγκέντρωση για κάθε δόση και η προσθήκη του μείγματος σε κάθε κοιλότητα αμέσως μετά την απομάκρυνση του παλαιού θρεπτικού μέσου.
If interference is less than 30 %, results may be corrected for the interference.
Εάν χρησιμοποιηθεί η επιλογή αυτή, η συγκέντρωση του DMSO (0,1 %) θα πρέπει να παραμείνει σταθερή σε όλες τις κοιλότητες.
If interference exceeds 30 %, the data are invalid and the data at these concentrations should be discarded.
Δοσολογικό σχήμα για την έκθεση κυττάρων H295R σε ελεγχόμενες χημικές ουσίες σε πλάκα των 24 κοιλοτήτων
Limit of Quantification (LOQ)
Διάλυμα 4
Hormone Extraction Efficiency (only when extraction is needed)
Διάλυμα 1
The average recovery rates (based on triplicate measures) for the spiked amounts of hormone should not deviate more than 30 % from amount that was added.
Διάλυμα 1
Chemical Interference (only antibody based systems)
Διάλυμα 5
No substantial (≥ 30 % of basal hormone production of the respective hormone) cross-reactivity with any of the hormones produced by the cells should occur [19] [20]
Διάλυμα 6
Before testing unknown chemicals, a laboratory should demonstrate that it is capable of achieving and maintaining appropriate cell culture and test conditions required for the successful conduct of the assay by running the laboratory proficiency test.
Διάλυμα 3
As the performance of an assay is directly linked to the laboratory personnel conducting the assay, these procedures should be partly repeated if a change in laboratory personnel occurs.
Διάλυμα 7
This proficiency test will be conducted under the same conditions listed in paragraphs 38 through 40 by exposing cells to 7 increasing concentrations of strong, moderate and weak inducers and inhibitors as well as a negative chemical (see Table 2).
Μετά από 48 ώρες, οι πλάκες έκθεσης απομακρύνονται από τον επωαστήρα και κάθε κοιλότητα εξετάζεται στο μικροσκόπιο για να διαπιστωθεί η κατάσταση των κυττάρων (προσκόλληση, μορφολογία, βαθμός συρροής) και για ενδείξεις κυτταροτοξικότητας.
Specifically, chemicals to be tested include the strong inducer forskolin (CAS No 66575-29-9);
Το θρεπτικό μέσο από κάθε κοιλότητα χωρίζεται σε δύο ίσες ποσότητες (490 μl περίπου), οι οποίες μεταγγίζονται σε δύο χωριστά φιαλίδια που φέρουν κατάλληλη σήμανση (δηλ. η μία από τις δύο γνωστές ποσότητες θα αποτελεί εφεδρικό δείγμα για κάθε κοιλότητα).
the strong inhibitor prochloraz (CAS No 67747-09-5);
Για να αποτραπεί η αφυδάτωση των κυττάρων, το θρεπτικό μέσο απομακρύνεται ανά σειρά ή στήλη και αντικαθίσταται με το θρεπτικό μέσο για τον προσδιορισμό κυτταρικής βιωσιμότητας/κυτταροτοξικότητας.
the moderate inducer atrazine (CAS No 1912-24-9);
Εάν δεν πρόκειται να μετρηθεί αμέσως η κυτταρική βιωσιμότητα/κυτταροτοξικότητα, προστίθενται σε κάθε κοιλότητα 200 μl PBS με ιόντα Ca2+ και Mg2+.
the moderate inhibitor aminoglutethimide (CAS No 125-84-8);
Τα θρεπτικά μέσα καταψύχονται στους – 80 °C έως ότου υποβληθούν σε περαιτέρω επεξεργασία για την ανάλυση ορμονών (βλ. παραγράφους 44-46).
the weak inducer (E2 production) and weak inhibitor (T production) bisphenol A (CAS No 80-05-7);
Παρόλο που η Τ και η Ε2 εντός θρεπτικού μέσου που διατηρείται στους – 80 °C είναι γενικά σταθερές για τουλάχιστον 3 μήνες, η σταθερότητα των ορμονών κατά τη φύλαξη θα πρέπει να τεκμηριώνεται σε κάθε εργαστήριο.
and the negative chemical human chorionic gonadotropin (HCG) (CAS No 9002-61-3) as shown in Table 2.
Αμέσως μετά την απομάκρυνση του θρεπτικού μέσου, προσδιορίζεται η κυτταρική βιωσιμότητα/κυτταροτοξικότητα για κάθε πλάκα έκθεσης.
Separate plates are run for all chemicals using the format as shown in Table 6.
Προσδιορισμός της κυτταρικής βιωσιμότητας
One QC plate (Table 4, paragraphs 36-37) should be included with each daily run for the proficiency chemicals.
Για να διαπιστωθούν οι δυνητικές επιπτώσεις της ελεγχόμενης χημικής ουσίας στη βιωσιμότητα των κυττάρων μπορεί να χρησιμοποιηθεί κατ' επιλογή προσδιορισμός κυτταρικής βιωσιμότητας/κυτταροτοξικότητας.
Proficiency chemicals and exposure concentrations
Ο προσδιορισμός θα πρέπει να είναι ικανός να παρέχει το πραγματικό ποσοστό βιώσιμων κυττάρων ανά κοιλότητα ή να έχει αποδειχθεί απευθείας συγκρίσιμος με τον προσδιορισμό Live/Dead® (γραμμική συνάρτηση αυτού) [βλ. προσάρτημα ΙΙΙ της έκθεσης επικύρωσης (4)].
Proficiency chemical
Ένας εναλλακτικός προσδιορισμός που έχει αποδειχθεί εξίσου αποτελεσματικός είναι η δοκιμή ΜΤΤ [βρωμιούχο 3-(4,5-διμεθυλοθειαζολ-2-υλο)-2,5-διφαινυλοτετραζόλιο] (18).
Test Concentrations [μM]
Η εκτίμηση της κυτταρικής βιωσιμότητας με τη χρήση των ανωτέρω μεθόδων αποτελεί σχετική μέτρηση που δεν παρουσιάζει απαραιτήτως γραμμικές σχέσεις με τον απόλυτο αριθμό κυττάρων σε μια κοιλότητα.
Prochloraz
Για τον λόγο αυτό, θα πρέπει παράλληλα να αξιολογείται υποκειμενικά κάθε κοιλότητα από τον αναλυτή με οπτική εξέταση και να λαμβάνονται και να αρχειοθετούνται ψηφιακές φωτογραφίες των κοιλοτήτων που περιέχουν τον ΜΔ και τις δύο μεγαλύτερες μη κυτταροτοξικές συγκεντρώσεις, ώστε να είναι δυνατή η μεταγενέστερη εκτίμηση της πραγματικής κυτταρικής πυκνότητας, εάν χρειαστεί.
Forskolin
Η κυτταρική βιωσιμότητα εκφράζεται σε σχέση με τη μέση απόκριση των ΜΔ, θεωρούμενη ως βιώσιμα κύτταρα σε ποσοστό 100 %, και υπολογίζεται όπως ενδείκνυται για τον χρησιμοποιούμενο προσδιορισμό κυτταρικής βιωσιμότητας/κυτταροτοξικότητας.
Atrazine
Για τον προσδιορισμό ΜΤΤ είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθεί ο ακόλουθος τύπος:
Aminoglutethimide
% βιώσιμων κυττάρων = (απόκριση στην κοιλότητα – μέση απόκριση στις κοιλότητες στις οποίες προστίθεται MeOH [= 100 % νεκρά κύτταρα]) ÷ (μέση απόκριση στις κοιλότητες με τον ΜΔ — μέση απόκριση στις κοιλότητες στις οποίες προστίθεται MeOH [= 100 % νεκρά κύτταρα])
Bisphenol A
Οι κοιλότητες που παρουσιάζουν βιωσιμότητα μικρότερη από 80 % σε σχέση με τη μέση βιωσιμότητα των ΜΔ (=100 %) δεν θα πρέπει να περιλαμβάνονται στην τελική ανάλυση δεδομένων.
Exposure of H295R to proficiency chemicals should be conducted in 24 well plates during the laboratory proficiency test.
Τυχόν αναστολή της στεροειδογένεσης που συνοδεύεται από κυτταροτοξικότητα σχεδόν 20 % θα πρέπει να αξιολογείται με προσοχή, ώστε να είναι βέβαιο ότι δεν οφείλεται στην κυτταροτοξικότητα.
Dosing is in μM for all test chemical doses.
Ανάλυση ορμονών
Doses should be administered in DMSO at 0,1 % v/v per well.
Κάθε εργαστήριο μπορεί να χρησιμοποιεί σύστημα μέτρησης ορμονών της επιλογής του για την ανάλυση της Τ και της Ε2.
All test concentrations should be tested in triplicate wells (Table 6).
Οι εφεδρικές γνωστές ποσότητες θρεπτικού μέσου από κάθε ομάδα αγωγής μπορούν να χρησιμοποιούνται για αραιώσεις ώστε να προκύπτουν συγκεντρώσεις εντός του ευθύγραμμου τμήματος της πρότυπης καμπύλης.
Separate plates are run for each chemical.
Όπως σημειώνεται στην παράγραφο 29, πριν από την εκτέλεση δοκιμών ποιοτικού ελέγχου ή χημικών ουσιών, κάθε εργαστήριο θα πρέπει να καταδεικνύει τη συμμόρφωση του συστήματος μέτρησης ορμονών που χρησιμοποιεί (π.χ. ELISA, RIA, LC-MS, LC-MS/MS) με τα κριτήρια ποιοτικού ελέγχου, αναλύοντας εμπλουτισμένο θρεπτικό μέσο που έχει εμβολιαστεί με εσωτερικό μάρτυρα ορμονών.
One QC plate is included with each daily run.
Για να εξασφαλιστεί ότι τα συστατικά του συστήματος δοκιμών δεν παρεμποδίζουν τη μέτρηση των ορμονών, ενδέχεται να πρέπει να εκχυλιστούν οι ορμόνες από το θρεπτικό μέσο πριν από τη μέτρησή τους (βλ. παράγραφο 30 για τις προϋποθέσεις υπό τις οποίες απαιτείται ή δεν απαιτείται εκχύλιση).
Cell viability and hormone analyses should be conducted as provided in paragraphs 42 through 46.
Συνιστάται να ακολουθούνται για την εκχύλιση οι διαδικασίες του προσαρτήματος ΙΙΙ της έκθεσης επικύρωσης (4).
The threshold value (lowest observed effect concentration, LOEC) and classification decision should be reported and compared with the values in Table 3.
Εάν χρησιμοποιούνται σύνολα έτοιμων αντιδραστηρίων (κιτ) του εμπορίου για τη μέτρηση της παραγωγής ορμονών, η ανάλυση των ορμονών θα πρέπει να διεξάγεται όπως υποδεικνύεται στα εγχειρίδια χρήσης των κιτ.
The data are considered acceptable if they meet the LOEC and decision classification in Table 3.
Οι περισσότεροι κατασκευαστές κιτ προβλέπουν μια συγκεκριμένη διαδικασία ανάλυσης ορμονών.
Threshold values (LOECs) and decision classifications for Proficiency Chemicals
Οι αραιώσεις των δειγμάτων πρέπει να ρυθμίζονται κατά τρόπο ώστε οι αναμενόμενες συγκεντρώσεις ορμονών στους μάρτυρες με τον διαλύτη να βρίσκονται στο κέντρο της γραμμικής περιοχής της πρότυπης καμπύλης κάθε προσδιορισμού [προσάρτημα ΙΙΙ της έκθεσης επικύρωσης (4)].
n/a:
Οι τιμές που βρίσκονται εκτός του ευθύγραμμου τμήματος της πρότυπης καμπύλης θα πρέπει να απορρίπτονται.
not applicable as no changes should occur after exposure to non-cytotoxic concentrations of negative control.
Οι τελικές συγκεντρώσεις των ορμονών υπολογίζονται ως εξής:
CAS No
Παράδειγμα:
Decision Classification
Εκχύλιση:
+ [22] (Inhibition)
450 μl θρεπτικού μέσου
+ (Inhibition)
Ανασύσταση σε:
+ (Induction)
Αραίωση στον προσδιορισμό:
Negative
1:10 (για να προκύψει δείγμα εντός της γραμμικής περιοχής της πρότυπης καμπύλης)
Quality Control Plate
Συγκέντρωση ορμόνης στον προσδιορισμό:
The quality control (QC) plate is used to verify the performance of the H295R cells under standard culture conditions, and to establish a historical database for hormone concentrations in solvent controls, positive and negative controls, as well as other QC measures over time.
150 pg/ml (έχει ήδη αναχθεί σε συγκέντρωση ανά ml δείγματος που υποβλήθηκε στον προσδιορισμό)
H295R cell performance should be assessed using a QC plate for each new ATCC batch or after using a previously frozen stock of cells for the first time unless the laboratory proficiency test (paragraphs 32-34) has been run with that batch of cells.
Ανάκτηση:
A QC plate provides a complete assessment of the assay conditions (e.g. cell viability, solvent controls, negative and positive controls, as well as intra- and inter-assay variability) when testing chemicals and should be part of each test run.
Τελική συγκέντρωση ορμόνης =
The QC test is conducted in a 24-well plate and follows the same incubation, dosing, cell viability/cytotoxicity, hormone extraction and hormone analysis procedures described in paragraphs 38 through 46 for testing chemicals.
(συγκέντρωση ορμονών (ανά ml) ÷ ανάκτηση) (συντελεστής αραίωσης)
The QC plate contains blanks, solvent controls, and two concentrations of a known inducer (forskolin, 1, 10 μM) and inhibitor (prochloraz, 0,1, 1 μM) of E2 and T synthesis.
Επιλογή συγκεντρώσεων δοκιμής
In addition, MeOH is used in select wells as a positive control for the viability/cytotoxicity assay.
Απαιτούνται τουλάχιστον δύο ανεξάρτητες εκτελέσεις του προσδιορισμού.
A detailed description of the plate layout is provided in Table 4.
Εάν δεν υπάρχουν προηγούμενες πληροφορίες, όπως πληροφορίες για τα όρια διαλυτότητας ή την κυτταροτοξικότητα, που μπορούν να χρησιμεύσουν ως βάση για την επιλογή των συγκεντρώσεων δοκιμής, οι συγκεντρώσεις για την πρώτη εκτέλεση της δοκιμής συνιστάται να απέχουν μεταξύ τους κατά δεκαδικό λογάριθμο, με μέγιστη συγκέντρωση τα 10–3 M.
The criteria to be met on the QC plate are listed in Table 5.
Εάν η χημική ουσία είναι διαλυτή και δεν είναι κυτταροτοξική σε καμία από τις ελεγχόμενες συγκεντρώσεις και εάν η πρώτη εκτέλεση είναι αρνητική για όλες τις συγκεντρώσεις, το συμπέρασμα πρέπει να επιβεβαιώνεται με μια ακόμα εκτέλεση του προσδιορισμού υπό τις ίδιες συνθήκες (πίνακας 7).
The minimum basal hormone production for T and E2 should be met in both the solvent control and blank wells.
Εάν τα αποτελέσματα της πρώτης εκτέλεσης είναι αμφίσημα (δηλ. η πολλαπλασιαστική μεταβολή σε σχέση με τον ΜΔ είναι στατιστικά σημαντική μόνο σε μία συγκέντρωση) ή θετικά (δηλ. η πολλαπλασιαστική μεταβολή είναι στατιστικά σημαντική σε δύο ή περισσότερες παρακείμενες συγκεντρώσεις), η δοκιμή θα πρέπει να επαναλαμβάνεται όπως υποδεικνύεται στον πίνακα 7, με βελτίωση των επιλεγμένων συγκεντρώσεων δοκιμής.
Table 4 Quality control plate layout for testing performance of unexposed H295R cells and cells exposed to known inhibitors (PRO = prochloraz) and stimulators (FOR = forskolin) of E2 and T production.
Οι συγκεντρώσεις δοκιμής για τη δεύτερη και την τρίτη (κατά περίπτωση) εκτέλεση της δοκιμής θα πρέπει να αναπροσαρμόζονται βάσει των αποτελεσμάτων της πρώτης εκτέλεσης, με ομαδοποίηση των συγκεντρώσεων που προκάλεσαν απόκριση με τη χρήση ημιλογαριθμικών διαστημάτων μεταξύ τους (π.χ. εάν η πρώτη εκτέλεση με συγκεντρώσεις 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100 και 1000 μM είχε ως αποτέλεσμα επαγωγή στο 1 και στα 10 μM, οι συγκεντρώσεις προς έλεγχο στη δεύτερη εκτέλεση θα πρέπει να είναι 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30 και 100 μM), εκτός εάν πρέπει να χρησιμοποιηθούν χαμηλότερες συγκεντρώσεις για την επίτευξη LOEC.
After termination of the exposure experiment and removal of medium, a 70 % methanol solution will be added to all MeOH wells to serve as a positive control for cytotoxicity (see cytotoxicity assay in Appendix III to the validation report (4))
Στην περίπτωση αυτή, θα πρέπει να χρησιμοποιούνται κατά τη δεύτερη εκτέλεση τουλάχιστον πέντε συγκεντρώσεις κατώτερες της χαμηλότερης συγκέντρωσης που ελέγχθηκε κατά την πρώτη εκτέλεση, με τη χρήση ημιλογαριθμικής κλίμακας.
Blank [23]
Εάν η δεύτερη εκτέλεση δεν επιβεβαιώσει την πρώτη (δηλ. εάν δεν προκύψει στατιστική σημαντικότητα στην προηγουμένως θετική συγκέντρωση ± 1 αύξηση συγκέντρωσης), απαιτείται τρίτο πείραμα υπό τις αρχικές συνθήκες δοκιμής.
Blank [23](+ MeOH) [24]
Τα αμφίσημα αποτελέσματα της πρώτης εκτέλεσης θεωρούνται αρνητικά εάν η παρατηρούμενη επίδραση δεν επιβεβαιωθεί σε καμία από τις δύο επόμενες εκτελέσεις της δοκιμής.
(+ MeOH) [24]
Τα αμφίσημα αποτελέσματα θεωρούνται θετικές αποκρίσεις (επίδραση) όταν η απόκριση μπορεί να επιβεβαιωθεί σε τουλάχιστον μία ακόμη δοκιμή με ± 1 αύξηση συγκέντρωσης (βλ. διαδικασία ερμηνείας των δεδομένων στην παράγραφο 55).
Table 5
Πίνακας 7
Performance criteria for the Quality Control Plate
Πίνακας λήψης αποφάσεων για πιθανά σενάρια αποτελεσμάτων
Basal Production of hormone in the solvent control (SC)
1η εκτέλεση
≥ 5 times the LOQ
2η εκτέλεση
≥ 2,5 times the LOQ
3η εκτέλεση
Induction (10 μM forskolin)
Απόφαση
≥ 1,5 times the SC
Σενάριο
≥ 7,5 times the SC
Θετική
Inhibition (1μM prochloraz)
Επιβεβαίωση [26]
≤ 0,5 times the SC
Διακοπή
CHEMICAL EXPOSURE PROCEDURE
Βελτίωση [27]
The pre-incubated cells are removed from the incubator (paragraph 21) and checked under a microscope to assure that they are in good condition (attachment, morphology) prior to dosing.
Αμφίσημη [28]
The cells are placed in a bio-safety cabinet and the supplemented medium removed and replaced with new supplemented medium (1 ml/well).
Ποιοτικός έλεγχος της πλάκας δοκιμής
DMSO is the preferred solvent for this test method.
Πέραν της εκπλήρωσης των κριτηρίων για την πλάκα ποιοτικού ελέγχου, θα πρέπει να πληρούνται και άλλα κριτήρια ποιότητας που αφορούν την αποδεκτή μεταβλητότητα μεταξύ επαναληπτικών κοιλοτήτων και επαναληπτικών πειραμάτων, τη γραμμικότητα και την ευαισθησία των συστημάτων μέτρησης ορμονών, τη μεταβλητότητα μεταξύ επαναληπτικών μετρήσεων ορμονών του ίδιου δείγματος και την ποσοστιαία ανάκτηση εμβολιασμένων ορμονικών δειγμάτων μετά την εκχύλιση του θρεπτικού μέσου (κατά περίπτωση — βλ. παράγραφο 30 σχετικά με τις απαιτήσεις εκχύλισης).
However, if there are reasons for using other solvents the scientific rationale should be described.
Τα κριτήρια αυτά παρατίθενται στον πίνακα 8.
Cells are exposed to the test chemical by adding 1 μl of the appropriate stock solution in DMSO (see Appendix II to the validation report (4)) per 1 ml supplemented medium (well volume).
Τα δεδομένα θα πρέπει να περικλείονται εντός των αποδεκτών πεδίων τιμών που έχουν καθοριστεί για κάθε παράμετρο για να ληφθούν υπόψη για περαιτέρω αξιολόγηση.
This results in a final concentration of 0,1 % DMSO in the wells.
Εάν δεν πληρούνται τα κριτήρια αυτά, θα πρέπει να αναφέρεται στο λογιστικό φύλλο ότι δεν πληρούνται τα κριτήρια ποιοτικού ελέγχου για το εξεταζόμενο δείγμα, το οποίο θα πρέπει να υποβάλλεται σε νέα ανάλυση ή να απαλείφεται από το σύνολο δεδομένων.
To assure adequate mixing it is generally preferred that the appropriate stock solution of the test chemical in DMSO is mixed with supplemented medium to yield the desired final concentration for each dose, and the mixture added to each well immediately after removal of old medium.
Πίνακας 8
If this option is used, the concentration of DMSO (0,1 %) should remain consistent among all wells.
Αποδεκτά πεδία τιμών και/ή μεταβλητότητα (%) για τις παραμέτρους των πλακών του προσδιορισμού H295R.
The wells containing the greatest two concentrations are visually assessed for formation of precipitates or cloudiness as an indication of incomplete solubility of the test chemical by using a stereo microscope.
LOQ: όριο ποσοτικού προσδιορισμού του συστήματος μέτρησης ορμονών.
If such conditions (cloudiness, formation precipitates) are observed, wells containing the next lesser concentrations are examined as well (and so forth) and concentrations that did not completely go into solution are to be excluded from further evaluation and analysis.
CV:
The plate is returned to the incubator at 37 °C under a 5 % CO2 in air atmosphere for 48 hours.
συντελεστής μεταβλητότητας.
The test chemical plate layout is shown in Table 6.
διασπάσεις ανά λεπτό Σύγκριση Τ E2
Stocks 1 -7 show placement of increasing doses of test chemical.
Βασική παραγωγή ορμονών στους ΜΔ Πολλαπλάσια του LOQ
Table 6
≥ 5πλάσια
Dosing schematic for the exposure of H295R cells to test chemicals in a 24 well plate
≥ 2,5πλάσια
Stock 4
Πειράματα έκθεσης — CV εντός της πλάκας για τους ΜΔ (επαναληπτικές κοιλότητες)
Stock 1
Απόλυτες συγκεντρώσεις
Stock1
Πειράματα έκθεσης — CV μεταξύ των πλακών για τους ΜΔ (επαναληπτικά πειράματα)
Stock 5
Πολλαπλασιαστική μεταβολή
Stock 2
Σύστημα μέτρησης ορμονών — CV επαναληπτικών μετρήσεων για τους ΜΔ [29]
Stock 7
Εκχύλιση θρεπτικού μέσου — Ανάκτηση εσωτερικού προτύπου 3Η (κατά περίπτωση)
After 48 hours the exposure plates are removed from the incubator and every well is checked under the microscope for cell condition (attachment, morphology, degree of confluence) and signs of cytotoxicity.
≥ 65 % της ονομαστικής τιμής
The medium from each well is split into two equal amounts (approximately 490 μl each) and transferred to two separate vials appropriately labelled (i.e. one aliquot to provide a spare sample for each well).
ΑΝΑΛΥΣΗ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ ΚΑΙ ΣΥΝΤΑΞΗ ΕΚΘΕΣΗΣ
To prevent cells from drying out, medium is removed a row or column at a time and replaced with the medium for the cell viability/cytotoxicity assay.
Ανάλυση δεδομένων
If cell viability/cytotoxicity is not to be measured immediately, 200 μl PBS with Ca2+ and Mg2+ is added to each well.
Για την αξιολόγηση της σχετικής αύξησης/μείωσης της παραγωγής ορμονών υπό την επίδραση χημικής ουσίας, τα αποτελέσματα θα πρέπει να κανονικοποιούνται στη μέση τιμή κάθε πλάκας δοκιμής για τους ΜΔ και να εκφράζονται ως μεταβολή σε σχέση με τους ΜΔ κάθε πλάκας δοκιμής.
The media are frozen at – 80 °C until further processing to analyse hormone concentrations (see paragraphs 44-46).
Όλα τα δεδομένα πρέπει να εκφράζονται ως μέση τιμή ± 1 τυπική απόκλιση (SD).
While T and E2 in medium kept at – 80 °C are generally stable for at least 3 months, hormone stability during storage should be documented within each laboratory.
Στην ανάλυση δεδομένων θα πρέπει να περιλαμβάνονται μόνο ορμονικά δεδομένα από κοιλότητες με κυτταροτοξικότητα μικρότερη από 20 %.
Immediately after removing the medium, cell viability/cytotoxicity is determined for each exposure plate.
Οι σχετικές μεταβολές υπολογίζονται ως εξής:
Cell Viability Determination
Σχετική μεταβολή = (συγκέντρωση ορμόνης σε κάθε κοιλότητα) ÷ (μέση συγκέντρωση ορμόνης στις κοιλότητες των μαρτύρων με διαλύτη).
A cell viability/cytotoxicity assay of choice can be used to determine the potential impact of the test chemical on cell viability.
Πριν από τη διεξαγωγή στατιστικών αναλύσεων, θα πρέπει να αξιολογούνται οι παραδοχές όσον αφορά την κανονικότητα και την ομοιογένεια διασποράς.
The assay should be able to provide a true measure of the percentage of viable cells present in a well, or it should be demonstrated that it is directly comparable to (a linear function of) the Live/Dead® Assay (see Appendix III to the validation report (4)).
Η κανονικότητα θα πρέπει να αξιολογείται με τη χρήση πρότυπων διαγραμμάτων πιθανότητας ή άλλης κατάλληλης στατιστικής μεθόδου (π.χ. δοκιμασία Shapiro-Wilk).
An alternative assay that has been shown to work equally well is the MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] test (18).
Εάν η κατανομή των δεδομένων (πολλαπλασιαστικές μεταβολές) δεν είναι κανονική, θα πρέπει να επιχειρείται μετασχηματισμός των δεδομένων ώστε να προσεγγίζουν την κανονική κατανομή.
The assessment of cell viability using the above methods is a relative measurement that does not necessarily exhibit linear relationships with the absolute number of cells in a well.
Εάν η κατανομή των δεδομένων είναι κανονική ή κατά προσέγγιση κανονική, οι διαφορές μεταξύ των ομάδων συγκέντρωσης της χημικής ουσίας και των ΜΔ θα πρέπει να αναλύονται με παραμετρική δοκιμασία (π.χ. δοκιμασία Dunnett), όπου η συγκέντρωση είναι η ανεξάρτητη μεταβλητή και η απόκριση (πολλαπλασιαστική μεταβολή) η εξαρτημένη.
Therefore, a subjective parallel visual assessment of each well by the analyst should be conducted, and digital pictures of the SCs and the two greatest non-cytotoxic concentrations are to be taken and archived to enable later assessment of true cell density if this should be required.
Εάν η κατανομή των δεδομένων δεν είναι κανονική, θα πρέπει να χρησιμοποιείται κατάλληλη μη παραμετρική δοκιμασία (π.χ. δοκιμασίες Kruskal-Wallis, Steel's Many-one rank test).
If by visual inspection or as demonstrated by the viability/cytotoxicity assay there appears to be an increase in cell number, the apparent increase needs to be verified.
Οι διαφορές θεωρούνται σημαντικές όταν p ≤ 0,05.
If an increase in cell numbers is verified, this should be stated in the test report.
Οι στατιστικές αξιολογήσεις βασίζονται σε μέσες τιμές για κάθε κοιλότητα που αντιπροσωπεύουν ανεξάρτητα επαναληπτικά σημεία δεδομένων.
Cell viability will be expressed relative to the average response in the SCs, which is considered 100 % viable cells, and is calculated as appropriate for the cell viability/cytotoxicity assay that is used.
Προβλέπεται ότι, λόγω των μεγάλων διαστημάτων μεταξύ των δόσεων κατά την πρώτη εκτέλεση της δοκιμής (λογαριθμική κλίμακα), σε πολλές περιπτώσεις δεν θα είναι δυνατή η περιγραφή σαφών σχέσεων συγκέντρωσης-απόκρισης, όπου οι δύο μεγαλύτερες δόσεις θα βρίσκονται στο ευθύγραμμο τμήμα της σιγμοειδούς καμπύλης.
For the MTT assay, the following formula may be used:
Ως εκ τούτου, για τα σύνολα δεδομένων από την πρώτη εκτέλεση ή για οποιοδήποτε άλλο σύνολο δεδομένων σε ανάλογη περίπτωση (π.χ. όταν δεν είναι δυνατόν να εκτιμηθεί η μέγιστη αποτελεσματικότητα), χρησιμοποιούνται στατιστικές τεχνικές σταθερής μεταβλητής τύπου Ι, όπως περιγράφεται ανωτέρω.
% viable cells = (response in well – average response in MeOH treated [= 100 % dead] wells) ÷ (average response in SC wells – average response in MeOH treated [= 100 % dead] wells)
Εάν στο ευθύγραμμο τμήμα της καμπύλης βρίσκονται περισσότερα από δύο σημεία δεδομένων και είναι δυνατόν να υπολογιστούν τιμές μέγιστης αποτελεσματικότητας -όπως αναμένεται για ορισμένες από τις δεύτερες εκτελέσεις με τη χρήση ημιλογαριθμικών διαστημάτων μεταξύ των συγκεντρώσεων έκθεσης-, θα πρέπει να χρησιμοποιείται το υπόδειγμα probit ή logit ή άλλο κατάλληλο υπόδειγμα παλινδρόμησης για τον υπολογισμό των αποτελεσματικών συγκεντρώσεων (π.χ. EC50 και EC20).
Wells with viability lower than 80 %, relative to the average viability in the SCs (= 100 % viability), should not be included in the final data analysis.