natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Πρέπει να χρησιμοποιούνται χημικές ουσίες αναλυτικής καθαρότητας, εκτός αντίθετων υποδείξεων.
Unless otherwise indicated, analytical grade chemicals must be used.
Το νερό πρέπει να είναι δισαπεσταγμένο ή ισοδύναμης καθαρότητας.
Water must be double-distilled or of equivalent purity.
Σημείωση: Οι περιγραφές που ακολουθούν ισχύουν για πηκτές πολυακρυλαμιδίου με ουρία, διαστάσεων 265 × 125 × 0,25 mm, που παρασκευάζονται στο εργαστήριο. Σε περίπτωση χρήσης πηκτών άλλων διαστάσεων και τύπων, ενδέχεται να χρειαστεί προσαρμογή των συνθηκών διαχωρισμού.
Note: The following details apply to laboratory prepared polyacrylamide gels containing urea, of dimensions 265 × 125 × 0,25 mm. Where other sizes and types of gel are used, the separation conditions may have to be adjusted.
Ισοηλεκτρική εστίαση
Isoelectric focusing
Αντιδραστήρια για την παρασκευή των πηκτών πολυακρυλαμιδίου που περιέχουν ουρία
Reagents for production of the urea containing polyacrylamide gels
Μητρικό διάλυμα πηκτής
Stock gel solution
Διαλύονται σε νερό:
Dissolve:
4,85 g ακρυλαμιδίου
4,85 g acrylamide
0,15 g Ν, Ν'-μεθυλενο-δις-ακρυλαμιδίου (BIS)
0,15 g N, N'-methylene-bis-acrylamide (BIS)
48,05 g ουρίας
48,05 g urea
15,00 g γλυκερίνης (87 % w/w),
15,00 g glycerol (87 % w/w),
συμπληρώνεται ο όγκος μέχρι τα 100 ml και το διάλυμα φυλάσσεται στο ψυγείο μέσα σε σκοτεινόχρωμη φιάλη.
in water and make up to 100 ml and store in a brown glass bottle in the refrigerator.
Σημείωση: Αντί των νευροτοξικών ακρυλαμιδίων στις ανωτέρω καθοριζόμενες ποσότητες, είναι προτιμότερο να χρησιμοποιείται διάλυμα προαναμεμειγμένου ακρυλαμιδίου/BIS, το οποίο διατίθεται στο εμπόριο.
Note: A commercially available preblended acrylamide/BIS solution can be used in preference to the quoted fixed weights of the neurotoxic acrylamides.
Εφόσον η περιεκτικότητα του εν λόγω διαλύματος σε ακρυλαμίδιο και σε BIS είναι 30 % w/v και 0,8 % w/v, αντίστοιχα, πρέπει να χρησιμοποιούνται για το παρασκεύασμα 16,2 ml αντί των ανωτέρω καθοριζόμενων ποσοτήτων.
Where such a solution contains 30 % w/v acrylamide and 0,8 % w/v BIS, a volume of 16,2 ml must be used for the formulation instead of the fixed weights.
Ο μέγιστος χρόνος διατήρησης του μητρικού διαλύματος είναι 10 ημέρες. Εάν η αγωγιμότητά του υπερβαίνει τα 5μS, απιονίζεται με ανάδευση με 2 g Amberlite ΜΒ-3 επί 30 λεπτά και, στη συνέχεια, διηθείται μέσω μεμβράνης των 0,45 μm.
The shelf life of the stock solution is a maximum of 10 days; if its conductivity is more than 5 μS, de-ionize by stirring with 2 g Amberlite MB-3 for 30 minutes, then filter through a 0,45 μm membrane.
Διάλυμα πηκτής
Gel solution
Παρασκευάζεται διάλυμα πηκτής με ανάμιξη προσθέτων και αμφολυτών με το μητρικό διάλυμα πηκτής (βλέπε σημείο 4.1.1.).
Prepare a gel solution by mixing additives and ampholytes with the stock gel solution (see 4.1.1).
9,0 ml μητρικού διαλύματος
9,0 ml stock solution
24 mg β-αλανίνης
24 mg β-alanine
500 μl αμφολύτη με pH 3,5-9,5 [1]
500 μl ampholyte pH 3,5-9,5 [1]
250 μl αμφολύτη με pH 5-7 [1] Τα προϊόντα Ampholine® pH 3,5-9,5 (Pharmacia) και Resolyte® pH 5-7 και pH 6-8 (BDH, Merck) έχουν αποδειχθεί ιδιαιτέρως κατάλληλα για την επίτευξη του απαιτούμενου διαχωρισμού των γ-καζεϊνών.
250 μl ampholyte pH 5-7 [1] The produce Ampholine® pH 3,5-9,5 (Pharmacia) and Resolyte® pH 5-7 and pH 6-8 (BDH, Merck) have proved particularly suitable for obtaining the required separation of γ-caseins.
Το διάλυμα πηκτής αναμειγνύεται και στη συνέχεια απαερώνεται επί 2 έως 3 λεπτά σε λουτρό υπερήχων ή υπό κενό.
Mix the gel solution and de-gas for two to three minutes in an ultrasonic bath or in vacuum.
Σημείωση: Το διάλυμα πηκτής παρασκευάζεται αμέσως πριν χυθεί πάνω στην πλάκα (βλέπε σημείο 6.2).
Note: Prepare the gel solution immediately prior to pouring it (see 6.2).
Διαλύματα καταλυτών
Catalyst solutions
Ν, Ν, Ν', Ν'-τετραμεθυλ-αιθυλενοδιαμίνη (TEMED)
N, N, N' N' — tetramethylethylenediamine (Temed)
Διάλυμα υπερθειικού αμμωνίου (PER) 40 % w/v:
40 % w/v ammonium persulphate (PER):
Διαλύονται σε νερό 800 mg PER και συμπληρώνεται ο όγκος μέχρι τα 2 ml.
Dissolve 800 mg PER in water and make up to 2 ml.
Σημείωση: Να χρησιμοποιείται πάντοτε πρόσφατα παρασκευασμένο διάλυμα PER.
Note: Always use freshly prepared PER solution.
Λιπαντικό ρευστό
Contact fluid
Κηροζίνη ή υγρή παραφίνη
Kerosene or liquid paraffin
Διάλυμα της ανόδου
Anode solution
Διαλύονται σε νερό 5,77 g φωσφορικού οξέος (85 % w/w) και το διάλυμα αραιώνεται μέχρι τα 100 ml.
Dissolve 5,77 g phosphoric acid (85 % w/w) in water and dilute to 100 ml.
Διάλυμα της καθόδου
Cathode solution
Διαλύονται σε νερό 2,00 g υδροξειδίου του νατρίου και το διάλυμα αραιώνεται με νερό μέχρι τα 100 ml.
Dissolve 2,00 g sodium hydroxide in water and dilute to 100 ml with water.
Αντιδραστήρια για την απομόνωση των πρωτεϊνών
Reagents for protein isolation
Αραιό οξικό οξύ (25,0 ml παγόμορφου οξικού οξέος αραιώνονται με νερό μέχρι τα 100 ml)
Dilute acetic acid (25,0 ml of glacial acetic acid made up to 100 ml with water)
Ρυθμιστικό διάλυμα για τη διάλυση πρωτεϊνών
Protein dissolving buffer
Διαλύονται σε νερό
Dissolve
5,75 g γλυκερίνης (87 % w/w)
5,75 g glycerol (87 % w/w)
24,03 g ουρίας
24,03 g urea
250 mg διθειοθρεϊτόλης
250 mg dithiothreitol,
και συμπληρώνεται ο όγκος μέχρι τα 50 ml.
in water and make up to 50 ml
Σημείωση: Το διάλυμα φυλάσσεται στο ψυγείο και ο μέγιστος χρόνος διατήρησής του είναι μία εβδομάδα.
Note: Store in a refrigerator, maximum shelf-life one week.
Αντιδραστήρια για την πλασμινόλυση των καζεϊνών
Reagents for plasmin cleavage of caseins
Ρυθμιστικό διάλυμα ανθρακικού αμμωνίου
Ammonium carbonate buffer
Τιτλοδοτείται διάλυμα όξινου ανθρακικού αμμωνίου 0,2 mol/l (1,58 g/100 ml νερού) που περιέχει 0,05 mol/l αιθυλενοδιαμινοτετραοξικού οξέος (EDTA, 1,46 g/100 ml) με διάλυμα ανθρακικού αμμωνίου 0,2 mol/l (1,92 g/100 ml νερού) που περιέχει 0,05 mol/l EDTA έως pH 8.
Titrate a 0,2 mol/l ammonium hydrogencarbonate solution (1,58 g/100 ml water) containing 0,05 mol/l ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 1,46 g/100 ml with a 0,2 mol/l ammonium carbonate solution (1,92 g/100 ml water) containing 0,05 mol/l EDTA to ph 8.
Βόειος πλασμίνη (EC.
Bovine plasmin (EC.
3.4.21.7), δραστικότητας τουλάχιστον 5 U/ml
3.4.21.7), activity at least 5 U/ml
Διάλυμα ε-αμινοκαπρονικού οξέος για αναστολή ενζύμου
ε-Aminocaproic acid solution for enzyme inhibition
Διαλύονται 2,624 g ε-αμινοκαπρονικού οξέος (6-αμινο-κ-εξανικό οξύ) σε 100 ml αιθανόλης 40 % (v/v).
Dissolve 2,624 g ε-aminocaproic acid (6 amino-n-hexanoic acid) in 100 ml of 40 % (v/v) ethanol.
Πρότυπα υλικά
Standards
Πιστοποιημένα πρότυπα υλικά αναφοράς που συνίστανται σε μείγμα αποκορυφωμένου αιγοπρόβειου γάλακτος με προσθήκη πυτιάς, το οποίο περιέχει αγελαδινό γάλα σε αναλογία 0 % και 1 %, διατίθενται από το Ινστιτούτο Υλικών και Μετρήσεων Αναφοράς της Επιτροπής, B -2440 Geel, Βέλγιο.
Certified reference standards of a mixture of renneted ewes’ and goats’ skimmed milk containing 0 % and 1 % of cows’ milk are available from the Commission’s Institute for Reference Materials and Measurements, B-2440 Geel, Belgium
Παρασκευή ενδιάμεσων προτύπων υλικών του εργαστηρίου που συνίστανται σε γάλα βουβάλων με προσθήκη πυτιάς, το οποίο περιέχει αγελαδινό γάλα σε αναλογία 0 % και 1 %
Preparation of laboratory interim-standards of buffalos’ renneted milk containing 0 % and 1 % of cows’ milk
Αποκορυφωμένο γάλα λαμβάνεται με φυγοκέντρηση ακατέργαστου και ασυσκεύαστου γάλακτος βουβάλων ή αγελαδινού στους 37 °C και σε 2500 g επί 20 λεπτά.
Skimmed milk is prepared by centrifuging of either buffalo or bovine raw bulk milk at 37 °C at 2500 g for 20 minutes.
Μετά από ταχεία ψύξη του σωλήνα και του περιεχομένου του σε θερμοκρασία 6-8 °C, αφαιρείται τελείως η ανώτερη λιπαρή στιβάδα.
After cooling the tube and contents rapidly to 6 to 8 °C, the upper fat layer is removed completely.
Για την παρασκευή του προτύπου υλικού 1 %, προστίθενται 5,00 ml αποκορυφωμένου αγελαδινού γάλακτος σε 495 ml αποκορυφωμένου γάλακτος βουβάλων μέσα σε ποτήρι ζέσεως του 1 λίτρου και ρυθμίζεται το pH στην τιμή 6,4 με την προσθήκη αραιού γαλακτικού οξέος (10 % w/v).
For the preparation of the 1 % standard add 5,00 ml of bovine skimmed milk to a 495 ml of buffalos’ skimmed milk in a 1 l beaker, adjust the pH to 6,4 by the addition of dilute lactic acid (10 % w/v).
Ρυθμίζεται η θερμοκρασία στους 35 °C, προστίθενται 100 μl πυτιάς μόσχου (δραστικότητα πυτιάς 1:10000, περίπου 3000 U/ml), το σύνολο αναδεύεται επί ένα λεπτό και στη συνέχεια το ποτήρι ζέσεως, καλυμμένο με αλουμινόχαρτο, αφήνεται στους 35 °C επί μία ώρα για να σχηματισθεί το τυρόπηγμα.
Adjust the temperature to 35 °C and add 100 μl of calf rennet (rennet activity 1: 10000, c. 3000 U/ml), stir for 1 minute and then leave the beaker covered with an aluminium foil at 35 °C for one hour to allow formation of the curd.
Αφού σχηματισθεί το τυρόπηγμα, το πηγμένο γάλα λυοφιλοποιείται χωρίς προηγούμενη ομογενοποίηση ούτε στράγγιση του ορού.
After the curd has formed, the whole renneted milk is freeze-dried without prior homogenization or draining of the whey.
Μετά τη λυοφιλίωση, λειοτριβείται προς σχηματισμό ομοιογενούς σκόνης.
After freeze-drying it is finely ground to produce a homogeneous powder.
Για την παρασκευή του προτύπου υλικού 0 % ακολουθείται η ίδια διαδικασία με αμιγές αποκορυφωμένο γάλα βουβάλων.
For the preparation of the 0 % standard, carry out the same procedure using genuine buffalo skimmed milk.
Τα πρότυπα υλικά πρέπει να φυλάσσονται σε θερμοκρασία –20 °C.
The standards must be stored at –20 °C.
Σημείωση: Πριν από την παρασκευή των προτύπων υλικών, συνιστάται να ελέγχεται η καθαρότητα του γάλακτος βουβάλων με ισοηλεκτρική εστίαση των καζεϊνών μετά από κατεργασία με πλασμίνη.
Note: It is advisable to check the purity of the buffalos’ milk by isoelectric focusing of the plasmin-treated caseins before preparation of the standards.
Αντιδραστήρια για τη χρώση των πρωτεϊνών
Reagents for protein staining
Αντιδραστήριο στερέωσης
Fixative
Διαλύονται σε νερό 150 g τριχλωροξικού οξέος και συμπληρώνεται ο όγκος μέχρι τα 1000 ml.
Dissolve 150 g trichloroacetic acid in water and make up to 1000 ml.
Διάλυμα αποχρωματισμού
Destaining solution
Αραιώνονται με απεσταγμένο νερό 500 ml μεθανόλης και 200 ml παγόμορφου οξικού οξέος μέχρις όγκου 2000 ml. Σημείωση: Παρασκευάζεται νέο διάλυμα αποχρωματισμού καθημερινά.
Dilute 500 ml methanol and 200 ml glacial acetic acid to 2000 ml with distilled water.
Μπορεί να παρασκευαστεί με ανάμειξη ίσων όγκων μητρικών διαλυμάτων μεθανόλης 50 % (v/v) και παγόμορφου οξικού οξέος 20 % (v/v).
Note: Prepare the destaining solution fresh every day; it can be prepared by mixing equal volumes of stock solutions of 50 % (v/v) methanol and 20 % (v/v) glacial acetic acid.
Διαλύματα χρώσης
Staining solutions
Διάλυμα χρώσης (μητρικό διάλυμα 1)
Staining solution (stock solution 1)
Διαλύονται 3,0 g χρωστικής Coomassie Brilliant Blue G-250 (Color Index 42655) σε 1000 ml μεθανόλης 90 % (v/v) με τη βοήθεια μαγνητικού αναδευτήρα (45 λεπτά περίπου) και το διάλυμα διηθείται μέσω δύο πτυχωτών ηθμών μεσαίας ταχύτητας.
Dissolve 3,0 g Coomassie Brilliant Blue G-250 (C.I. 42655) in 1000 ml 90 % (v/v) methanol using a magnetic stirrer (approximately 45 minutes), filter through two medium-speed folded filters.
Διάλυμα χρώσης (μητρικό διάλυμα 2)
Staining solution (stock solution 2)
Διαλύονται 5,0 g πενταένυδρου θειικού χαλκού σε 1000 ml οξικού οξέος 20 % (v/v).
Dissolve 5,0 g copper sulphate pentahydrate in 1000 ml 20 % (v/v) acetic acid.
Διάλυμα χρώσης (διάλυμα εργασίας)
Staining solution (working solution)
Αναμειγνύονται 125 ml από κάθε μητρικό διάλυμα (4.11.1 και 4.11.2) αμέσως πριν από τη χρώση.
Mix together 125 ml of each of the stock solutions (4.11.1, 4.11.2) immediately prior to staining.
Σημείωση: Το διάλυμα χρώσης πρέπει να παρασκευάζεται την ημέρα που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί.
Note: The staining solution should be prepared on the day that it is used.
ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΣ ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ
EQUIPMENT
Γυάλινες πλάκες (διαστάσεις 265 × 125 × 4 mm), ελαστικός κύλινδρος (πλάτος 15 cm), τραπέζι οριζοντίωσης
Glass plates (265 × 125 × 4 mm); rubber roller (width 15 cm); levelling table
Φύλλο συγκράτησης πηκτής (διαστάσεις 265 × 125 mm)
Gel carrier sheet (265 × 125 mm)
Φύλλο κάλυψης (διαστάσεις 280 × 125 mm).
Covering sheet (280 × 125 mm).
Σε κάθε μεγάλη πλευρά επικολλάται λωρίδα αυτοκόλλητης ταινίας διαστάσεων 280 × 6 × 0,25 mm (βλέπε σχήμα 1)
Stick on strip of adhesive tape (280 × 6 × 0,25 mm) to each long edge (see Figure 1)
Θάλαμος ηλεκτροεστίασης με ψυκτική πλάκα (π.χ. 265 × 125 mm) και κατάλληλο τροφοδοτικό (τάσης ≥ 2,5 kV) ή αυτόματη συσκευή ηλεκτροφόρησης.
Electrofocusing chamber with cooling plate (e.g. 265 × 125 mm) and suitable power supply (≥ 2,5 kV) or automatic electrophoresis device
Κρυοστάτης κυκλοφορίας, ρυθμισμένος στους 12 ±0,5 °C
Circulation cryostat, thermostatically controlled at 12 ± 0,5 °C
Φυγόκεντρος, ρυθμιζόμενη σε 3000 g
Centrifuge, adjustable to 3000 g
Ταινίες ηλεκτροδίων (μήκος ≥ 265 mm)
Electrode strips (≥ 265 mm long)
Πλαστικές σταγονομετρικές φιάλες για το διάλυμα της ανόδου και της καθόδου
Plastic dropping bottles for the anode and cathode solutions
Εφαρμογείς δείγματος (διαστάσεις 10 × 5 mm, διηθητικός χάρτης βισκόζης ή χαμηλής προσρόφησης πρωτεϊνών)
Sample applicators (10 × 5 mm, viscose or low protein-adsorption filter paper)
Ψαλίδια, νυστέρια και λαβίδες από ανοξείδωτο χάλυβα
Stainless steel scissors, scalpels and tweezers
Τρυβλία χρώσης και αποχρωματισμού από ανοξείδωτο χάλυβα ή γυαλί (π.χ. δίσκοι οργάνων, διαστάσεων 280 × 150 mm)
Stainless steel or glass staining and destaining dishes (e.g. 280 × 150 mm instrument trays)
Ρυθμιζόμενος ομοιογενοποιητής με ράβδο (διάμετρος ατράκτου 10 mm), που λειτουργεί στις 8000 έως 20000 rpm
Adjustable rod homogenizer (10 mm shaft diameter), rpm range 8000 to 20000
Λουτρό υπερήχων
Ultrasonic bath
Συγκολλητής μεμβράνης
Film welder
Μικροσιφώνια των 25 μl
25 μl micropipettes
Συμπυκνωτής κενού ή συσκευή λυοφιλίωσης
Vacuum concentrator or freeze-dryer
Θερμοστατούμενο υδατόλουτρο ρυθμιζόμενο στους 35 και 40 ±1 °C με τάρακτρο
Thermostatically controlled water bath adjustable to 35 and 40 ± 1 °C with shaker
Πυκνόμετρο για μήκος κύματος λ = 634 nm
Densitometer equipment reading at λ = 634 nm
Απομόνωση καζεϊνών
Isolation of caseins
Σε σωλήνα φυγοκέντρου των 100 ml ζυγίζεται ποσότητα ισοδύναμη με 5 g ξηρής μάζας τυριού ή προτύπων υλικών αναφοράς, προστίθενται 60 ml απεσταγμένου νερού και το σύνολο ομογενοποιείται σε ομογενοποιητή με ράβδο (8000 έως 10000 rpm).
Weigh the amount equivalent to 5 g dry mass of cheese or the reference standards into a 100 ml centrifuge tube, add 60 ml distilled water and homogenize with a rod homogenizer (8000 to 10000 rpm).
Ρυθμίζεται το pH σε 4,6 με αραιό οξικό οξύ (4.5.1) και ακολουθεί φυγοκέντρηση (5 λεπτά, 3000 g).
Adjust to pH 4,6 with dil. acetic acid (4.5.1) and centrifuge (5 minutes, 3000 g).
Το λίπος και ο ορός αποχύνονται, το υπόλειμμα ομογενοποιείται στις 20000 rpm με 40 ml απεσταγμένου νερού του οποίου το pH έχει ρυθμιστεί σε 4,5 με αραιό οξικό οξύ (4.5.1), προστίθενται 20 ml διχλωρομεθανίου (4.5.2) και ακολουθεί νέα ομογενοποιήσει και φυγοκέντρηση (5 λεπτά, 3000 g).
Decant the fat and whey, homogenize the residue at 20000 rpm in 40 ml distilled water adjusted to pH 4,5 with dil. acetic acid (4.5.1), add 20 ml dichloromethane (4.5.2), homogenize again and centrifuge (5 minutes, 3000 g).
Αφαιρείται με σπάτουλα η στιβάδα της καζεΐνης που επιπλέει μεταξύ της υδατικής και της οργανικής φάσης (βλέπε σχήμα 2) και απορρίπτονται οι δύο αυτές φάσεις.
Remove the casein layer that lies between the aqueous and organic phases (see Figure 2) with a spatula and decant off both phases.
Η καζεΐνη ομογενοποιείται εκ νέου με 40 ml απεσταγμένου νερού (βλέπε ανωτέρω) και 20 ml διχλωρομεθανίου (4.5.2) και φυγοκεντρείται.
Rehomogenize the casein in 40 ml distilled water (see above) and 20 ml dichloromethane (4.5.2) and centrifuge.
Η διαδικασία αυτή επαναλαμβάνεται έως ότου και οι δύο εκχυλιστικές φάσεις είναι άχρωμες (2 έως 3 φορές).
Repeat this procedure until both extraction phases are colourless (two to three times).
Το πρωτεϊνικό υπόλειμμα ομογενοποιείται με 50 ml ακετόνης (4.5.3) και διηθείται μέσω πτυχωτού χάρτινου ηθμού μεσαίας ταχύτητας.
Homogenize the protein residue with 50 ml acetone (4.5.3) and filter through a medium-speed folded filter paper.
Το υπόλειμμα εκπλύνεται πάνω στον ηθμό δύο φορές με 25 ml ακετόνης κάθε φορά, αφήνεται να ξηρανθεί στον αέρα ή σε ρεύμα αζώτου και κατόπιν κονιοποιείται σε γουδί.
Wash the residue on the filter with two separate 25 ml portions of acetone each time and allow to dry in the air or a stream of nitrogen, then pulverize finely in a mortar.
Σημείωση: Οι ξηρές απομονωμένες καζεΐνες πρέπει να φυλάσσονται σε θερμοκρασία –20 °C.
Note: Dry casein isolates should be kept at –20 °C.
Πλασμινόλυση των ß-καζεϊνών προς ενίσχυση των γ-καζεϊνών
Plasmin cleavage of β-caseins to intensify γ-caseins
Παρασκευάζεται εναιώρημα 25 mg απομονωμένων καζεϊνών (6.1.1) σε 0,5 ml ρυθμιστικού διαλύματος ανθρακικού αμμωνίου (4.7.1) και ομογενοποιείται επί 20 λεπτά, π.χ. με υπερήχους.
Disperse 25 mg of isolated caseins (6.1.1) in 0,5 ml ammonium carbonate buffer (4.7.1) and homogenize for 20 minutes by e.g. using ultrasonic treatment.
Ακολουθεί θέρμανση στους 40 °C, προσθήκη 10 μl πλασμίνης (4.7.2), ανάμιξη και επώαση στους 40 °C επί μία ώρα με συνεχή ανακίνηση.
Heat to 40 °C and add 10 μl plasmin (4.7.2), mix and incubate for one hour at 40 °C with continuous shaking.
Για την αναστολή του ενζύμου προστίθενται 20 μl διαλύματος ε-αμινοκαπρονικού οξέος (4.7.3) και, στη συνέχεια, 200 mg στερεάς ουρίας και 2 mg διθειοθρεϊτόλης.
To inhibit the enzyme add 20 μl ε-aminoproic acid solution (4.7.3), then add 200 mg of solid urea and 2 mg of dithiothreitol.
Σημείωση: Για να προκύψουν πιο συμμετρικές ταινίες εστιασμένης καζεΐνης, συνιστάται λυοφιλίωση του διαλύματος μετά την προσθήκη του ε-αμινοκαπρονικού οξέος και, στη συνέχεια, διάλυση των υπολειμμάτων σε 0,5 ml ρυθμιστικού διαλύματος για διάλυση πρωτεϊνών (4.6).
Note: To obtain more symmetry in the focused casein bands it is advisable to freeze-dry the solution after adding the ε-aminocaproic acid and then dissolving the residues in 0,5 ml protein dissolving buffer (4.6).
Παρασκευή των πηκτών πολυακρυλαμιδίου που περιέχουν ουρία
Preparation of the urea containing polyacrylamide gels
Το φύλλο συγκράτησης πηκτής (5.2) κυλίεται με τη βοήθεια μερικών σταγόνων νερού πάνω σε γυάλινη πλάκα (5.1), ενώ η εξωτερική υγρασία απομακρύνεται με χαρτοπετσέτα ή χαρτομάντιλο.
With the aid of a few drops of water roll the gel carrier sheet (5.2) onto a glass plate (5.1), removing any extraneous water with paper towel or tissue.
Το φύλλο κάλυψης (5.3) με αποστάτες (0,25 mm) κυλίεται κατά τον ίδιο τρόπο πάνω σε άλλη γυάλινη πλάκα.
Roll the cover sheet (5.3) with spacers (0,25 mm) onto another glass plate in the same way.
Η πλάκα τοποθετείται οριζοντίως σε τραπέζι οριζοντίωσης.
Lay the plate horizontally on a levelling table.
Προστίθενται 10 μl διαλύματος TEMED (4.1.3.1) στο διάλυμα πηκτής που έχει παρασκευασθεί και απαερωθεί (4.1.2), αναδεύονται και προστίθενται 10 μl διαλύματος PER (4.1.3.2). Το σύνολο αναμειγνύεται πλήρως και αμέσως χύνεται ομοιόμορφα στο κέντρο του φύλλου κάλυψης.
Add 10 μl Temed (4.1.3.1) to the prepared and de-aerated gel solution (4.1.2), stir and add 10 μl PER-solution (4.1.3.2), mix thoroughly and immediately pour out evenly onto the centre of the cover sheet.
Το ένα άκρο της πλάκας συγκράτησης πηκτής (η πλευρά με το φύλλο προς τα κάτω) τοποθετείται πάνω στην πλάκα με το φύλλο κάλυψης και χαμηλώνεται αργά, έτσι ώστε να σχηματιστεί ένα υμένιο πηκτής μεταξύ των φύλλων και να απλωθεί ομαλά χωρίς φυσαλίδες (βλέπε σχήμα 3).
Place one edge of the gel carrier plate (sheet side down) on the cover sheet plate and lower it slowly so that a gel film forms between the sheets and spreads out regularly and free of bubbles (Figure 3).
Η πλάκα συγκράτησης πηκτής χαμηλώνεται τελείως με προσοχή και με τη βοήθεια μιας λεπτής σπάτουλας και πάνω της τοποθετούνται τρεις ακόμη γυάλινες πλάκες σαν βάρος.
Carefully lower the gel carrier plate completely using a thin spatula and place three more glass plates on top of it to act as weights.
Αφού ολοκληρωθεί ο πολυμερισμός (60 λεπτά περίπου), απομακρύνεται το φύλλο συγκράτησης που φέρει την πολυμερισμένη πηκτή μαζί με το φύλλο κάλυψης, με ελαφρά κτυπήματα στις γυάλινες πλάκες.
After polymerization is complete (about 60 minutes) remove the gel polymerized onto the gel carrier sheet along with the cover sheet by tipping the glass plates.
Η οπίσθια πλευρά του φύλλου συγκράτησης καθαρίζεται επιμελώς για να απομακρυνθούν τα υπολείμματα πηκτής και η ουρία.
Clean the reverse of the carrier sheet carefully to remove gel residues and urea.
Το «σάντουιτς» της πηκτής συσκευάζεται με συγκόλληση μέσα σε σωλήνα από πλαστική μεμβράνη και φυλάσσεται στο ψυγείο (έξι εβδομάδες κατ’ ανώτατο όριο).
Weld the gel sandwich into a film tube and store in a refrigerator (maximum six weeks).
Σημείωση: Το φύλλο κάλυψης με τους αποστάτες μπορεί να χρησιμοποιηθεί εκ νέου.
Note: The cover sheet with the spacers can be re-used.
Η πηκτή πολυακρυλαμιδίου μπορεί να κοπεί σε μικρότερες διαστάσεις, κοπή που συνιστάται όταν τα δείγματα είναι λίγα ή όταν χρησιμοποιείται αυτόματη συσκευή ηλεκτροφόρησης (δύο πηκτές διαστάσεων 4,5 × 5 cm).
The polyacrylamide gel can be cut to smaller sizes, recommended when there are few samples or if an automatic electrophoresis device is used (two gels, size 4,5 × 5 cm).
Ισοηλεκτρική εστίαση
lsoelectric focusing
Ο θερμοστάτης του κρυοστάτη ρυθμίζεται στους 12 °C.
Set the cooling thermostat to 12 °C.
Η οπίσθια πλευρά του φύλλου συγκράτησης πηκτής επαλείφεται με κηροζίνη και στη συνέχεια ενσταλάζονται μερικές σταγόνες κηροζίνης (4.2) στο κέντρο του ψυχόμενου τμήματος.
Wipe off the reverse of the gel carrier sheet with kerosene, then drip a few drops of kerosene (4.2) onto the centre of the cooling block.
Κυλίεται κατόπιν πάνω σ’ αυτό το «σάντουιτς» της πηκτής, με το φύλλο συγκράτησης προς τα κάτω, προσέχοντας να μην σχηματιστούν φυσαλίδες.
Then roll the gel sandwich, carrier side down, onto it, taking care to avoid bubbles.
Σφουγγίζεται η τυχόν περίσσεια κηροζίνης και αφαιρείται το φύλλο κάλυψης.
Wipe off any excess kerosene and remove the cover sheet.
Διαβρέχονται οι ταινίες ηλεκτροδίων με το διάλυμα της ανόδου και της καθόδου (4.3 και 4.4), κόβονται στο μήκος της πηκτής και τοποθετούνται στις προβλεπόμενες θέσεις (απόσταση ηλεκτροδίων 9,5 cm).
Soak the electrode strips with the electrode solutions (4.3, 4.4), cut to gel length and place in the positions provided (distance of electrodes 9,5 cm).
Συνθήκες ισοηλεκτρικής εστίασης:
Conditions for isoelectric focusing:
Διαστάσεις πηκτής 265 × 125 × 0,25 mm
Gel size 265 × 125 × 0,25 mm
Τάση
Voltage
Ένταση
Current
Βολτώρες
Volt-hours
Προεστίαση
Pre-focusing
μέγιστη 2500
maximum 2500
μέγιστη 15
maximum 15
σταθερή 4
constant 4
Εστίαση δείγματος [2]
Sample focusing [2]
Τελική εστίαση
Final focusing
μέγιστη 5
maximum 5
μέγιστη 20
maximum 20
μέγιστη 6
maximum 6
μέγιστη 7
maximum 7
μέγιστη 25
maximum 25
Σημείωση: Σε περίπτωση μεταβολής του πάχους ή του πλάτους των πηκτών, πρέπει να προσαρμόζονται κατάλληλα οι τιμές της έντασης και της ισχύος του ρεύματος (π.χ. οι τιμές της έντασης και της ισχύος διπλασιάζονται εάν χρησιμοποιηθεί πηκτή διαστάσεων 265 × 125 × 0,5 mm).
Note: If thickness or width of the gels are changed, the values for current and power have to be suitably adjusted (e.g. double the values for electric current and power if a 265 × 125 × 0,5 mm gel is used).
Παράδειγμα προγραμματισμού τάσης για αυτόματη συσκευή ηλεκτροφόρησης (2 πηκτές διαστάσεων 5,0 × 4,5 cm) με ηλεκτρόδια που εφαρμόζονται κατευθείαν στην πηκτή, χωρίς ταινίες ηλεκτροδίων
Example of a voltage programme for an automatic electrophoresis device (2 gels of 5,0 × 4,5 cm), electrodes without strips applied directly to the gel
Θερμοκρασία
Temp.
Εστίαση δείγματος
Sample focusing
Εστίαση
Focusing
Ο εφαρμογέας δείγματος τοποθετείται στο στάδιο 2 στις 0 Vh.
Place sample applicator in step 2 at 0 Vh.
Ο εφαρμογέας δείγματος απομακρύνεται στο στάδιο 2 στις 30 Vh.
Remove sample applicator in step 2 at 30 Vh.
Χρώση πρωτεϊνών
Protein staining
Στερέωση πρωτεϊνών
Protein fixation