natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Σε περίπτωση παρέκκλισης της χρώσης, η δοκιμή IF (ενότητα VI.A.5.) επαναλαμβάνεται.
The IF test (Section VI.A.5.) must be repeated if the staining is aberrant.
Εξετάζεται εάν υπάρχουν λαμπρώς φθορίζοντα κύτταρα με τη χαρακτηριστική μορφολογία του R. solanacearum στα φατνία δοκιμής των αντικειμενοφόρων πλακών δοκιμής (βλ. ιστοχώρο http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
Observe for bright fluorescing cells with characteristic morphology of R. solanacearum in the test windows of the test slides (see website http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
Η ένταση του φθορισμού πρέπει να είναι ισοδύναμη με εκείνη του θετικού μάρτυρα με ίδια αραίωση αντισώματος.
The fluorescence intensity must be equivalent to the positive control strain at the same antibody dilution.
Κάτι τέτοιο υπάρχει περίπτωση να συμβεί εάν όλες οι αντικειμενοφόροι μιας παρτίδας δείχνουν θετικά κύτταρα λόγω μόλυνσης του ρυθμιστικού διαλύματος ή εάν βρεθούν θετικά κύτταρα (εκτός των φατνίων της αντικειμενοφόρου) στην επικάλυψη της αντικειμενοφόρου.
This may be the case when all slides in a batch show positive cells due to the contamination of buffer or if positive cells are found (outside of the slide windows) on the slide coating.
Τα ιζήματα των κώνων από το σημείο πρόσφυσης του στολονίου και των τμημάτων των στελεχών περιέχουν συχνά πληθυσμούς φθοριζόντων κυττάρων μη τυπικής μορφολογίας καθώς και μη ειδικώς αντιδρώντα σαπροφυτικά βακτήρια όμοιου μεγέθους και μορφολογίας με το R. solanacearum.
Background populations of fluorescing cells with atypical morphology and cross reacting saprophytic bacteria with size and morphology similar to R. solanacearum are likely to occur in potato heel end core and stem segment pellets.
Λαμβάνονται υπόψη μόνον τα φθορίζοντα κύτταρα με τυπικό μέγεθος και μορφολογία στον τίτλο ή την αραίωση εργασίας των αντισωμάτων όπως στο σημείο 5.3.
Consider only fluorescing cells with typical size and morphology at the titre or working dilution of the antibodies as in 5.3.
Εάν βρίσκονται λαμπρώς φθορίζοντα κύτταρα με χαρακτηριστική μορφολογία, εκτιμάται ο μέσος αριθμός τυπικών κυττάρων ανά πεδίο μικροσκοπίου και υπολογίζεται ο αριθμός των τυπικών κυττάρων ανά ml του αναδιαλυμένου ιζήματος (προσάρτημα 5).
If bright fluorescing cells with characteristic morphology are found, estimate the average number of typical cells per microscope field and calculate the number of typical cells per ml of resuspended pellet (Appendix 5).
Η ανάγνωση IF είναι θετική για δείγματα με τουλάχιστον 5x103 τυπικά κύτταρα ανά ml του αναδιαλυμένου ιζήματος.
The IF reading is positive for samples with at least 5 × 103 typical cells per ml of resuspended pellet.
Το δείγμα θεωρείται ενδεχομένως μολυσμένο και απαιτείται η διενέργεια περαιτέρω δοκιμών.
The sample is considered potentially contaminated and further testing is required.
Η ανάγνωση IF είναι αρνητική για δείγματα με λιγότερα από 5x103 κύτταρα ανά ml αναδιαλυμένου ιζήματος και το δείγμα θεωρείται αρνητικό.
The IF reading is negative for samples with less than 5 × 103 cells per ml of resuspended pellet and the sample is considered negative.
Δοκιμές PCR
PCR tests
Όταν η δοκιμή PCR χρησιμοποιείται ως αρχική δοκιμή διαλογής και έχει θετικά αποτελέσματα, πρέπει να πραγματοποιηθεί η απομόνωση ή IF ως δεύτερη υποχρεωτική δοκιμή διαλογής.
When the PCR test is used as the principal screening test and found to be positive, isolation or IF must be performed as a second compulsory screening test.
Όταν η δοκιμή PCR χρησιμοποιείται ως δεύτερη δοκιμή διαλογής και έχει θετικά αποτελέσματα, απαιτείται διεξαγωγή περαιτέρω δοκιμών σύμφωνα με το διάγραμμα ροής για την ολοκλήρωση της διάγνωσης.
When PCR is used as the second screening test and found to be positive, further testing according to the flow scheme is required to complete the diagnosis.
Η πλήρης αξιοποίηση της μεθόδου αυτής ως αρχικής δοκιμής διαλογής συνιστάται μόνον όταν έχει αποκτηθεί εξειδικευμένη εμπειρία..
Full exploitation of this method as principal screening test is only recommended when specialised expertise has been acquired.
Σημείωση: Οι προκαταρκτικές δοκιμές με τη μέθοδο αυτή πρέπει να επιτρέπουν την αναπαραγώγιμη ανίχνευση τουλάχιστον 103 έως 104 κυττάρων του R. solanacearum ανά ml που προστίθεται σε εκχυλίσματα δειγμάτων που προηγούμενως έδειξαν αρνητικά αποτελέσματα.
Note: Preliminary testing with this method should permit reproducible detection of 103 to 104 cells of R. solanacearum per ml added to sample extracts which previously tested negative.
Χρησιμοποιούνται επικυρωμένα αντιδραστήρια και πρωτόκολλα PCR (βλ. προσάρτημα 6).
Use validated PCR reagents and protocols (see Appendix 6).
εκχύλισμα δείγματος που προηγουμένως ήταν αρνητικό στη δοκιμή για το R. solanacearum,
Sample extract that previously tested negative for R. solanacearum,
μάρτυρες ρυθμιστικών διαλυμάτων που χρησιμοποιούνται για την εξαγωγή του βακτηρίου και του DNA από το δείγμα,
Buffer controls used for extracting the bacterium and the DNA from the sample,
κατάλληλες ποσότητες αναδιαλυμένων ιζημάτων στις οποίες έχει προστεθεί το R. solanacearum (για την παρασκευή βλ. προσάρτημα 3 Β),
Aliquots of resuspended pellets to which R. solanacearum has been added (preparation see Appendix 3 B).
αιώρημα 106 κυττάρων ανά ml νερού παθογόνου απομόνωσης του R. solanacearum (π.χ. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857· βλ. προσάρτημα 3 Β),
A suspension of 106 cells per ml of R. solanacearum in water from a virulent isolate (e.g. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; see Appendix 3 B).
εάν είναι δυνατόν, χρησιμοποιείται επίσης DNA από δείγματα θετικών μαρτύρων κατά τη διενέργεια της PCR.
If possible use also DNA extracted from positive control samples in the PCR test.
Για το λόγο αυτό, συστήνεται σε ορισμένες περιπτώσεις να προετοιμάζονται οι εξαγωγές από πλυμένες πατάτες εάν πρόκειται να χρησιμοποιηθούν πρωτόκολλα PCR.
It could therefore, in certain cases, be advisible to prepare extracts from washed potatoes if PCR protocols are to be used.
Στο προσάρτημα 3 παρατίθενται τυποποιημένα υλικά θετικών και αρνητικών μαρτύρων που διατίθενται προς χρήση στο πλαίσιο της εν λόγω δοκιμής.
Standardized positive and negative control material available for use with this test are listed in Appendix 3).
Χρησιμοποιούνται δείγματα θετικών και αρνητικών μαρτύρων όπως περιγράφηκε παραπάνω (βλ. προσάρτημα 3).
Use positive and negative control samples as described above (see Appendix 3).
Η ακόλουθη μέθοδος έχει βελτιστοποιηθεί με σκοπό τη χρήση με τις επικυρωμένες μεθόδους PCR που περιγράφονται στο προσάρτημα 6.
The following method has been optimised for use with the validated PCR methods shown in Appendix 6.
Προστίθενται με σιφώνιο 220 µl ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 1 mM EDTA [pH 8.0]) σε σωλήνα Eppendorf 1,5 ml.
Pipette 220 µl of lysis buffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) into a 1,5 ml Eppendorf tube.
Προστίθενται 100 µl εκχυλίσματος δείγματος και τοποθετούνται σε θερμικό μπλοκ ή υδατόλουτρο σε θερμοκρασία 95 °C για 10 λεπτά.
Add 100 µl sample extract and place in a heating block or water bath at 95 °C for 10 min.
Ο σωλήνας τοποθετείται σε πάγο για 5 λεπτά.
Put tube on ice for 5 min.
Προστίθενται 80 µl πυκνού διαλύματος λυσοζύμης (50 mg λυσοζύμη ανά ml σε 10 mM Tris HCl, pH 8.0) και επωάζονται στους 37 °C για 30 λεπτά.
Add 80 µl Lysozyme stock solution (50 mg Lysozyme per ml in 10 mM Tris HCl, pH 8,0) and incubate at 37 °C for 30 min.
Προστίθενται 220 µl διαλύματος Α Easy DNA® (Invitrogen), αναμειγνύονται καλά σε συσκευή vortex και επωάζονται στους 65 °C για 30 λεπτά.
Add 220 µl of Easy DNA® solution A (Invitrogen), mix well by vortexing and incubate at 65 °C for 30 min.
Προστίθενται 500 µl χλωροφορμίου και αναμειγνύουμε με στροβιλισμό (vortex) έως ότου μειωθεί το ιξώδες και το μείγμα είναι ομοιογενές.
Add 500 µl of chloroform and vortex until the viscosity decreases and the mixture is homogeneous.
Ακολουθεί φυγοκέντριση σε 15000 g για 20 λεπτά σε θερμοκρασία 4 °C για το διαχωρισμό των φάσεων και τη δημιουργία της ενδιάμεσης φάσης.
Centrifuge at 15000 g for 20 min at 4 °C to separate phases and form the interphase.
Προστίθεται 1 ml από 100 % αιθανόλη (–20 °C), αναμειγνύεται με στροβιλισμό (vortex) για σύντομο χρονικό διάστημα και επωάζεται σε πάγο για 10 λεπτά.
Add 1 ml of 100 % ethanol (–20 °C) vortex briefly and incubate on ice for 10 min.
Φυγοκεντρείται σε 15000 g για 20 λεπτά στους 4 °C και απομακρύνεται η αιθανόλη από το ίζημα.
Centrifuge at 15000 g for 20 min at 4 °C and remove ethanol from pellet.
Ακολουθεί φυγοκέντριση σε 15000 g για 10 λεπτά στους 4 °C, διατηρείται το ίζημα και απομακρύνεται η αιθανόλη.
Centrifuge at 15000 g for 10 min at 4 °C, save the pellet and remove ethanol.
Είναι δυνατόν να εφαρμοσθούν άλλες μέθοδοι εξαγωγής DNA (π.χ. Qiagen DNeasy Plant Kit) υπό την προϋπόθεση ότι έχει αποδειχθεί πως είναι εξίσου αποτελεσματικές για τον καθαρισμό DNA από δείγματα μαρτύρων που περιέχουν 103 έως 104 κύτταρα παθογόνου ανά ml.
Other DNA extraction methods, e.g. Qiagen DNeasy Plant Kit, could be applied providing that they are proven to be equally as effective in purifying DNA from control samples containing 103 to 104 pathogen cells per ml.
Τα προς δοκιμή πρότυπα και εκείνα των μαρτύρων παρασκευάζονται για την PCR σύμφωνα με τα επικυρωμένα πρωτόκολλα (ενότητα VI.A.6.).
Prepare test and control templates for PCR according to the validated protocols (Section VI.A.6.).
Παρασκευάζεται μία δεκαδική αραίωση εκχυλίσματος DNA δείγματος (1:10 σε UPW).
Prepare one decimal dilution of sample DNA extract (1:10 in UPW).
Παρασκευάζεται το κατάλληλο μείγμα αντίδρασης PCR σε περιβάλλον απαλλαγμένο από μολύνσεις σύμφωνα με τα δημοσιευμένα πρωτόκολλα (προσάρτημα 6).
Prepare the appropriate PCR reaction mix in a contamination-free environment according to the published protocols (Appendix 6).
Στις περιπτώσεις που κάτι τέτοιο είναι δυνατόν, συνιστάται η χρήση πρωτοκόλλου πολλαπλής PCR που περιλαμβάνει επίσης εσωτερικό μάρτυρα PCR.
Where possible, it is recommended to use a multiplex PCR protocol that also incorporates an internal PCR control.
Προσθέτουμε 2-5 µl εκχυλίσματος DNA ανά 25 µl αντίδρασης PCR σε αποστειρωμένους σωλήνες PCR σύμφωνα με τα πρωτόκολλα PCR (βλ. προσάρτημα 6).
Add 2-5 µl of DNA extract per 25 µl PCR reaction in sterile PCR tubes according to the PCR protocols, (see Appendix 6).
Τοποθετούνται για μετακίνηση τουλάχιστον 12 µl ενισχυμένου σε DNA μείγματος αντίδρασης από κάθε δείγμα αναμεμειγμένα με 3 µl ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης (προσάρτημα 6) σε 2,0 % (β/ο) πηκτές αγαρόζης σε ρυθμιστικό διάλυμα tris-acetate-EDTA (TAE) (προσάρτημα 6) σε 5-8 V ανά cm.
Run at least 12 µl of amplified DNA reaction mixture from each sample mixed with 3 µl loading buffer (Appendix 6) in 2,0 % (w/v) agarose gels in tris-acetate-EDTA (TAE) buffer (Appendix 6) at 5 to 8 V per cm.
Οι ζώνες DNA αποκαλύπτονται διά χρώσεως σε βρωμιούχο αιθίδιο (0,5 mg ανά L) για 30-60 λεπτά λαμβάνοντας τις απαραίτητες προφυλάξεις κατά το χειρισμό αυτού του μεταλλαξιογόνου.
Reveal DNA bands by staining in ethidium bromide (0,5 mg per L) for 30 to 60 minutes taking appropriate precautions for handling this mutagen.
Η χρωσμένη πηκτή εξετάζεται υπό υπεριώδη ακτινοβολία μικρού μήκους κύματος (π.χ. λ = 302 nm) για ενισχυμένα προϊόντα PCR του αναμενόμενου μεγέθους (προσάρτημα 6) και σημειώνονται τα αποτελέσματα.
Observe stained gel under short wave UV transillumination (λ = 302 nm) for amplified PCR products of the expected size (Appendix 6) and document.
Για όλα τα νέα ευρήματα/περιπτώσεις, επιβεβαιώνεται η αυθεντικότητα του αμπλικονίου PCR με την πραγματοποίηση ανάλυσης με ένζυμο περιορισμού σε δείγμα του εναπομείναντος ενισχυμένου DNA με επώαση στη βέλτιστη θερμοκρασία και χρόνο με το κατάλληλο ένζυμο και ρυθμιστικό διάλυμα (βλ. προσάρτημα 6).
For all new findings/cases verify authenticity of the PCR amplicon by performing restriction enzyme analysis on a sample of the remaining amplified DNA by incubating at the optimum temperature and time with an appropriate enzyme and buffer (see Appendix 6).
Ερμηνεία των αποτελεσμάτων της δοκιμής PCR:
Interpretation of the PCR test result:
Η δοκιμή PCR είναι αρνητική εάν το αναμενόμενου μεγέθους, ειδικό για το R. solanacearum αμπλικόνιο PCR δεν ανιχνευθεί για το εν λόγω δείγμα αλλά ανιχνευθεί για όλα τα δείγματα θετικών μαρτύρων (στην περίπτωση πολλαπλής PCR με εκκινητές εσωτερικών μαρτύρων ειδικούς για φυτά: πρέπει να ενισχυθεί ένα δεύτερο, αναμενόμενου μεγέθους, προϊόν PCR με το εν λόγω δείγμα).
The PCR test is negative if the R. solanacearum-specific PCR amplicon of expected size is not detected for the sample in question but is detected for all positive control samples (in case of multiplex PCR with plant specific internal control primers: a second PCR-product of expected size must be amplified with the sample in question).
Η δοκιμή PCR είναι θετική εάν ανιχνευθεί το ειδικό για το R. solanacearum αμπλικόνιο της PCR στο αναμενόμενο μέγεθος και πρότυπο περιορισμού (όταν αυτό απαιτείται), εφόσον δεν έχει ενισχυθεί από οιοδήποτε εκ των δειγμάτων αρνητικών μαρτύρων.
The PCR test is positive if the R. solanacearum-specific PCR amplicon of expected size and restriction pattern (when required) is detected, providing that it is not amplified from any of the negative control samples.
Η αξιόπιστη επιβεβαίωση τυχόν θετικού αποτελέσματος είναι δυνατόν να επιτευχθεί επίσης με την επανάληψη της δοκιμής με δεύτερο σετ εκκινητών PCR (προσάρτημα 6).
Reliable confirmation of a positive result can also be obtained by repeating the test with a second set of PCR primers (Appendix 6).
Σημείωση: Ενδέχεται να υπάρξουν υπόνοιες για παρεμπόδιση της PCR εάν το αναμενόμενο αμπλικόνιο αποκτηθεί από δείγμα θετικού μάρτυρα που περιέχει R. solanacearum σε ύδωρ αλλά προκύψουν αρνητικά αποτελέσματα από τους θετικούς μάρτυρες με R. solanacearum σε εκχύλισμα πατάτας.
Note: Inhibition of the PCR may be suspected if the expected amplicon is obtained from the positive control sample containing R. solanacearum in water but negative results are obtained from positive controls with R. solanacearum in potato extract.
Στα πρωτόκολλα πολλαπλής PCR με εσωτερικούς μάρτυρες PCR, υπάρχει ένδειξη για παρεμπόδιση της αντίδρασης εάν δεν προκύψει κανένα από τα δύο αμπλικόνια.
In multiplex PCR protocols with internal PCR controls, inhibition of the reaction is indicated when neither of the two amplicons are obtained.
Όταν η δοκιμή FISH χρησιμοποιείται ως αρχική δοκιμή διαλογής και τα αποτελέσματα είναι θετικά, πρέπει να πραγματοποιηθεί η δοκιμή απομόνωσης ή IF ως δεύτερη υποχρεωτική δοκιμή διαλογής.
When the FISH test is used as the first screening test and found to be positive, Isolation or the IF test must be performed as a second compulsory screening test.
Σημείωση: Χρησιμοποιούνται επικυρωμένοι ολιγοανιχνευτές ειδικοί για το R. solanacearum (βλ. προσάρτημα 7).
Note: Use validated R. solanacearum-specific oligo-probes (see Appendix 7).
Οι προκαταρκτικές δοκιμές με τη μέθοδο αυτή θα πρέπει να επιτρέπουν την αναπαραγώγιμη ανίχνευση τουλάχιστον 103-104 κυττάρων R. solanacearum ανά ml που προστίθενται σε εκχυλίσματα δειγμάτων που προηγούμενως ήταν αρνητικά στη δοκιμή.
Preliminary testing with this method should permit reproducible detection of at least 103 to 104 cells of R. solanacearum per ml added to sample extracts which previously tested negative.
Η ακόλουθη διαδικασία είναι προτιμότερο να πραγματοποιείται σε εκχύλισμα δείγματος που έχει μόλις παρασκευασθεί αλλά είναι επίσης δυνατόν να πραγματοποιηθεί με επιτυχία σε εκχύλισμα δείγματος που έχει αποθηκευθεί με γλυκερίνη στους –16 έως –24 °C ή τους –68 έως –86 °C.
The following procedure should preferably be performed on freshly prepared sample extract but can also be successfully performed on sample extract that has been stored under glycerol at –16 to –24 or –68 to –86 °C.
Ως αρνητικοί μάρτυρες, χρησιμοποιούνται κατάλληλες ποσότητες εκχυλίσματος δείγματος που προηγουμένως ήταν αρνητικό στις δοκιμές όσον αφορά το R. solanacearum.
As negative controls, use aliquots of sample extract that previously tested negative for R. solanacearum.
Ως θετικοί μάρτυρες, παρασκευάζονται αιωρήματα που περιέχουν 105 έως 106 κύτταρα ανά ml του R. solanacearum βιοποικιλία 2 (π.χ. στέλεχος NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, βλ. προσάρτημα 3) σε 0,01M ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PB) από καλλιέργεια 3-5 ημερών.
As positive controls prepare suspensions containing 105 to 106 cells per ml of R. solanacearum biovar 2 (e.g. strain NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, see Appendix 3) in 0,01M phosphate buffer (PB) from a 3 to 5 day culture).
Παρασκευάζεται το προσηλωτικό διάλυμα (βλ. προσάρτημα 7).
Prepare fixative solution (see Appendix 7).
Φέρονται με σιφώνιο 100 µl κάθε εκχυλίσματος δείγματος σε σωλήνα Eppendorf και φυγοκεντρούνται για 7 λεπτά σε 7000 g.
Pipette 100 µl of each sample extract into an Eppendorf tube and centrifuge for 7 minutes at 7000 g.
Αφαιρείται το υπερκείμενο υγρό και το ίζημα διαλύεται σε 200 µl προσηλωτικού υγρού που έχει παρασκευασθεί λιγότερο από 24 ώρες πριν.
Remove the supernatant and dissolve the pellet in 200 µl of fixative prepared < 24 hours previously.
Αναταράσσουμε με στροβιλισμό (vortex) και επωάζουμε για 1 ώρα στο ψυγείο.
Vortex and incubate for one hour in the refrigerator.
Φυγοκεντρείται για 7 λεπτά σε 7000 g, αφαιρείται το υπερκείμενο υγρό και το ίζημα αναδιαλύεται σε 75 µl 0,01 M ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (PB) (βλέπε προσάρτημα 7).
Centrifuge for 7 minutes at 7000 g, remove the supernatant and resuspend the pellet in 75 µl 0,01M PB (see Appendix 7).
Το εναπομείναν διάλυμα δείγματος (49 µl) μπορεί να αποθηκευθεί στους –20 °C μετά την προσθήκη 1 όγκου 96 % αιθανόλης.
The remaining sample solution (49 µl) can be stored at –20 °C after addition of one volume of 96 % ethanol.
Στην περίπτωση που η δοκιμή FISH πρέπει να επαναληφθεί, αφαιρείται η αιθανόλη με φυγοκέντριση και προστίθεται ίσος όγκος 0,01 ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (αναμειγνύουμε με στροβιλισμό (vortex).
In case the FISH assay requires repeating, remove the ethanol by centrifugation and add an equal volume of 0,01 PB (mix by vortexing).
Στο στάδιο αυτό, η διαδικασία είναι δυνατόν να διακοπεί και να συνεχισθεί ο υβριδισμός την επόμενη ημέρα.
At this stage the procedure may be interrupted and the hybridisation continued the following day.
Υβριδισμός
Hybridisation
Τα κύτταρα αφυδατώνονται σε διαβαθμισμένη σειρά αιθανόλης των 50 %, 80 % και 96 % για ένα λεπτό σε καθεμία.
Dehydrate the cells in a graded ethanol series of 50 %, 80 % and 96 % for one minute each.
Το δοχείο προεπωάζεται στον κλίβανο υβριδισμού στους 45 °C για τουλάχιστον 10 λεπτά.
Pre-incubate the box in the hybridisation oven at 45 °C for at least 10 minutes.
Εφαρμόζουμε 10 μl διαλύματος υβριδισμού (προσάρτημα 7) σε 8 φατνία (φατνία 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 και 10· βλ. εικόνα 7.1) κάθε αντικειμενοφόρου αφήνοντας τα δύο φατνία στο κέντρο (3 και 8) κενά.
Apply 10 μl of hybridisation solution (Appendix 7) to eight windows (windows 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 and 10; see Fig 7.1) of each slide leaving the two centre windows (3 and 8) empty.
Εφαρμόζουμε καλυπτρίδες (24 x 24 mm) στο πρώτο και τα 4 τελευταία φατνία χωρίς να εγκλωβιστεί αέρας.
Apply coverslips (24 × 24 mm) to the first and last four windows without trapping air.
Οι αντικειμενοφόροι τοποθετούνται σε προθερμασμένο υγρό θάλαμο και ο υβριδισμός πραγματοποιείται για 5 ώρες στον κλίβανο σε θερμοκρασία 45 °C στο σκοτάδι.
Place the slides in the pre-warmed moist chamber and hybridise for five hours in the oven at 45 °C in the dark.
Παρασκευάζονται 3 ποτήρια ζέσεως που περιέχουν αντίστοιχα 1 l νερό Milli Q (νερό μοριακού βαθμού καθαρότητας), 1 l από 1x hybmix (334 ml 3x hybmix και 666 ml νερό Milli Q) και 1 l από 1/8x hybmix (42 ml 3x hybmix και 958 ml νερό Milli Q).
Prepare three beakers containing 1 l of Milli Q (molecular grade) water, 1 l of 1x hybmix (334 ml 3x hybmix and 666 ml Milli Q water) and 1 l of 1/8x hybmix (42 ml 3x hybmix and 958 ml Milli Q water).
Έκαστο προεπωάζεται σε υδατόλουτρο σε θερμοκρασία 45 °C.
Pre-incubate each in a waterbath at 45 °C.
Απομακρύνονται οι καλυπτρίδες από τις αντικειμενοφόρους πλάκες και οι αντικειμενοφόροι τοποθετούνται στον υποδοχέα αντικειμενοφόρων.
Remove the coverslips from the slides and place the slides in a slide holder.
Ξεπλένεται η περίσσεια ανιχνευτού με επώαση για 15 λεπτά σε ποτήρι ζέσεως με 1x hybmix στους 45 °C.
Wash away excess probe by incubation for 15 minutes in the beaker with 1x hybmix at 45 °C.
Ο υποδοχέας αντικειμενοφόρων πλακών μεταφέρεται σε διάλυμα πλυσίματος 1/8 hybmix και επωάζουμε για 15 λεπτά ακόμη.
Transfer the slide holder to 1/8 hybmix washing solution and incubate for a further 15 minutes.
Οι αντικειμενοφόροι πλάκες βυθίζονται για σύντομο χρονικό διάστημα σε νερό Milli Q και τοποθετούνται σε διηθητικό χαρτί.
Dip the slides briefly in Milli Q water and place them on filter paper.
Προστίθενται με σιφώνιο 5-10 μl αντιξεθωριαστικού διαλύματος έγκλεισης (e.g. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA ή ισοδύναμα) σε κάθε φατνίο και εφαρμόζεται μεγάλη καλυπτρίδα (24 x 60 mm) σε ολόκληρη την αντικειμενοφόρο πλάκα.
Pipette 5 to 10 μl of anti-fading mountant solution (e.g. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA or equivalent) on each window and apply a large coverslip (24 × 60 mm) over the whole slide.
Εξετάζονται οι αντικειμενοφόροι πλάκες αμέσως με μικροσκόπιο προσαρμοσμένο για μικροσκοπία επιφθορισμού σε μεγέθυνση 630 ή 1000x με έλαιο κατάδυσης.
Observe the slides immediately with a microscope fitted for epifluorescence microscopy at 630 or 1000 × magnification under immersion oil.
Εάν χρησιμοποιηθεί φίλτρο 5-ισοθειοκυανικής τετραμεθυλοροδαμίνης, τα κύτταρα του R. solanacearum που έχουν χρωσθεί με Cy3 εμφανίζονται φθορίζοντα κόκκινα. Συγκρίνεται η μορφολογία των κυττάρων με αυτή των θετικών μαρτύρων.
Using a filter for tetramethylrhodamine-5-isothiocyanate, Cy3-stained cells of R. solanacearum appear fluorescent red.
Η δοκιμή FISH (ενότητα VI.A.7.) πρέπει να επαναληφθεί αν η χρώση παρεκκλίνει.
Cells must be bright fluorescent and completely stained The FISH test (Section VI.A.7.) must be repeated if the staining is aberrant.
Εξετάζεται εάν υπάρχουν λαμπρώς φθορίζοντα κύτταρα με τη χαρακτηριστική μορφολογία του R. solanacearum στα φατνία δοκιμής των αντικειμενοφόρων δοκιμής (βλ. ιστοχώρο http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
Observe for bright fluorescing cells with characteristic morphology of R. solanacearum in the test windows of the test slides (see web site http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
Αυτό μπορεί να ισχύει εάν όλες οι αντικειμενοφόροι μιας παρτίδας δείχνουν θετικά κύτταρα λόγω μόλυνσης του ρυθμιστικού διαλύματος ή εάν βρεθούν θετικά κύτταρα (εκτός των φατνίων της αντικειμενοφόρου) στην επικάλυψη της αντικειμενοφόρου.
This may be the case when all slides in a batch show positive cells due to the contamination of buffer or if positive cells are found (outside of the slide windows) on the the slide coating.
Τα ιζήματα των κώνων από τα σημεία πρόσφυσης του στολονίου και των τμημάτων των στελεχών ενδέχεται να περιέχουν, αν και πολύ λιγότερο συχνά από τη δοκιμή IF, πληθυσμούς φθοριζόντων κυττάρων μη τυπικής μορφολογίας καθώς και μη ειδικώς αντιδρώντα σαπροφυτικά βακτήρια όμοιου μεγέθους και μορφολογίας με το R. solanacearum.
Background populations of fluorescing cells with atypical morphology and cross reacting saprophytic bacteria with size and morphology similar to R. solanacearum may occur, although much less frequent as in the IF test, in potato heel end core and stem segment pellets.
Λαμβάνονται υπόψη μόνον τα φθορίζοντα κύτταρα με τυπικό μέγεθος και μορφολογία.
Consider only fluorescing cells with typical size and morphology.
Ερμηνεία των αποτελεσμάτων της δοκιμής FISH:
Interpretation of the FISH test result: