natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Η γλυκερίνη είναι δυνατόν να αφαιρεθεί από το δείγμα με την προσθήκη 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος ιζήματος (προσάρτημα 4), εκ νέου φυγοκέντριση για 15 λεπτά σε 7000 g και επανασχηματισμό αιωρήματος σε ίσο όγκο ρυθμιστικού διαλύματος ιζήματος.
Glycerol can be removed from the sample by addition of 1 ml pellet buffer (Appendix 4), re-centrifugation for 15 minutes at 7000 g and resuspension in an equal volume of pellet buffer.
Συχνά αυτό δεν είναι αναγκαίο, ιδιαίτερα εάν τα δείγματα αντικειμενοφόρου έχουν προσηλωθεί στις αντικειμενοφόρους με διέλευση από φλόγα (βλέπε 2.2).
This is often not necessary, especially if slides samples are fixed to the slides by flaming (see 2.2).
Παρασκευάζονται ξεχωριστά ως θετικοί μάρτυρες αντικειμενοφόροι από ομόλογο στέλεχος ή άλλο στέλεχος αναφοράς του C. m. subsp. sepedonicus, που είναι αιώρημα σε εκχύλισμα πατάτας, όπως περιγράφεται στο προσάρτημα 2, και προαιρετικά σε ρυθμιστικό διάλυμα.
Prepare separate positive control slides of the homologous strain or any other reference strain of C. m. subsp. sepedonicus, suspended in potato extract, as specified in Appendix 2, and optionally in buffer.
Ως παρόμοιοι μάρτυρες πρέπει να χρησιμοποιούνται, όποτε είναι δυνατόν, στην ίδια αντικειμενοφόρο, φυσικώς μολυσμένοι ιστοί (που διατηρούνται με λυοφιλίωση ή κατάψυξη στους –16 έως –24 °C).
Naturally infected tissue (maintained by lyophilization or freezing at –16 to –24 °C) should be used where possible as a similar control on the same slide.
Ως αρνητικοί μάρτυρες, χρησιμοποιούνται κατάλληλες ποσότητες εκχυλίσματος δείγματος που προηγουμένως είχε δοκιμαστεί και ήταν αρνητικό.
As negative controls, use aliquots of sample extract which previously tested negative.
Χρησιμοποιούνται πολυφατνιακές αντικειμενοφόροι πλάκες μικροσκοπίου με 10 κατά προτίμηση φατνία διαμέτρου τουλάχιστον 6 mm.
Use multiwell microscope slides with preferably 10 windows of at least 6 mm diameter.
Η δοκιμή του υλικού των μαρτύρων γίνεται με τον ίδιο τρόπο όπως αυτή του ή των δειγμάτων.
Test control material in an identical manner as the sample(s).
Οι αντικειμενοφόροι πλάκες δοκιμής προετοιμάζονται με μία από τις ακόλουθες διαδικασίες:
Prepare the test slides by one of the following procedures:
Για ιζήματα με μικρή σχετικά ποσότητα ιζήματος αμύλου:
For pellets with relatively little starch sediment:
Στο πρώτο φατνίο, φέρεται μετρημένος με σιφώνιο συγκεκριμένος όγκος (15 µl είναι αρκετός για φατνία με διάμετρο 6 mm - ο όγκος κλιμακώνεται προς τα άνω για μεγαλύτερα φατνία) αραίωσης 1/100 του αιωρήματος του ιζήματος πατάτας.
Pipette a measured standard volume (15 µl is appropriate for 6 mm window diameter-scale up volume for larger windows) of a 1/100 dilution of the resuspended potato pellet onto the first window.
Στη συνέχεια, φέρεται με σιφώνιο όμοιος όγκος μη αραιωμένου ιζήματος (1/1) στα υπόλοιπα φατνία διαδοχικά.
Subsequently pipette a similar volume of undiluted pellet (1/1) onto the remaining windows on the row.
Η δεύτερη σειρά μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείγμα εις διπλούν ή ως δεύτερο δείγμα όπως φαίνεται στην εικόνα 1.
The second row can be used as duplicate or for a second sample as presented in Figure 1.
Για άλλα ιζήματα:
For other pellets:
Παρασκευάζονται δεκαδικές αραιώσεις (1/10 και 1/100) του αιωρήματος του ιζήματος σε ρυθμιστικό διάλυμα ιζήματος.
Prepare decimal dilutions (1/10 and 1/100) of the resuspended pellet in pellet buffer.
Σε μία σειρά φατνίων, φέρεται μετρημένος με σιφώνιο συγκεκριμένος όγκος (15 µl είναι αρκετός για φατνία με διάμετρο 6 mm – ο όγκος κλιμακώνεται προς τα άνω για μεγαλύτερα φατνία) του αιωρήματος του ιζήματος και κάθε αραίωση.
Pipette a measured standard volume (15 µl is appropriate for 6 mm window diameter-scale up volume for larger windows) of the resuspended pellet and each dilution on a row of windows.
Η δεύτερη σειρά μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως επανάληψη του πρώτου δείγματος ή για ένα δεύτερο δείγμα όπως φαίνεται στην εικόνα 2.
The second row can be used as duplicate or for a second sample as presented in Figure 2.
Τα σταγονίδια στεγνώνονται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος ή με θέρμανση σε θερμοκρασίες 40 έως 45 °C.
Dry the droplets at ambient temperatures or by warming at temperature of 40 to 45 °C.
Τα βακτηριακά κύτταρα προσηλώνονται στην αντικειμενοφόρο με θέρμανση (15 λεπτά στους 60 °C), με φλόγα, με 95 % αιθανόλη ή σύμφωνα με τις συγκεκριμένες οδηγίες των προμηθευτών των αντισωμάτων.
Fix the bacterial cells to the slide either by heating (15 minutes at 60 °C), flaming, with 95 % ethanol or according to specific instructions from the suppliers of the antibodies.
Εάν είναι απαραίτητο, οι προσηλωμένες αντικειμενοφόροι είναι δυνατόν να φυλαχθούν στη συνέχεια στην κατάψυξη σε αφυδατωμένο δοχείο για όσο το δυνατόν μικρότερο χρονικό διάστημα (το μέγιστο για 3 μήνες) προτού υποβληθούν σε περαιτέρω δοκιμές.
If necessary, fixed slides may then be stored frozen in a desiccated box for as little time as necessary (up to a maximum of 3 months) prior to further testing.
Διαδικασία IF
IF procedure:
Σύμφωνα με την προετοιμασία της αντικειμενοφόρου δοκιμής στο σημείο 4.1.i):
According to test slide preparation in 4.1(i):
Παρασκευάζεται μία σειρά αραιώσεων του αντισώματος στο διπλάσιο σε ρυθμιστικό διάλυμα για IF.
Prepare a set of twofold dilutions of the antibody in IF buffer.
Το πρώτο φατνίο πρέπει να έχει 1/2 του τίτλου (T/2), τα υπόλοιπα 1/4 του τίτλου (T/4), 1/2 του τίτλου (T/2), τον τίτλο (T) και το διπλάσιο του τίτλου (2T).
The first well should have 1/2 of the titre (T/2), the others 1/4 of the titre (T/4), 1/2 of the titre (T/2), the titre (T) and twice the titre (2T).
Σύμφωνα με την ετοιμασία της αντικειμενοφόρου προς δοκιμή στο σημείο 4.1.ii):
According to test slide preparation in 4.1(ii):
Παρασκευάζεται η αραίωση εργασίας (WD) του αντισώματος σε ρυθμιστικό διάλυμα για IF.
Prepare the working dilution (WD) of the antibody in IF buffer.
Η αραίωση εργασίας επηρεάζει την εξειδίκευση.
The working dilution affects the specificity.
Προετοιμασία της αντικειμενοφόρου πλάκας δοκιμής σύμφωνα με τα σημεία 4.1.i) και 4.3.i)
Preparation of the test slide according to 4.1(i) and 4.3(i)
Αραιώσεις του αναδιαλυμένου ιζήματος
Dilutions of resuspended pellet
Αραίωση του αναδιαλυμένου ιζήματος
Dilution of resuspended pellet
(T = τίτλος)
(T = titre)
Αραιώσεις του αντιορρού/αντισώματος στο διπλάσιο
Twofold dilutions of antiserum/antibody
Δείγμα 1
Sample 1
Επανάληψη του δείγματος 1 ή δείγμα 2
Duplicate of sample 1 or sample 2
Προετοιμασία της αντικειμενοφόρου πλάκας δοκιμής σύμφωνα με τα σημεία 4.1.ii) και 4.3.ii)
Preparation of the test slide according to 4.1(ii) and 4.3(ii)
Αραίωση εργασίας του αντιορρού/αντισώματος
Working dilution of antiserum/antibody
κενό
empty
Δεκαδική αραίωση του αναδιαλυμένου ιζήματος
Decimal dilution of resuspended pellet
Οι αντικειμενοφόροι πλάκες διευθετούνται πάνω σε ένυγρο χαρτί.
Arrange the slides on moist paper.
Κάθε φατνίο δοκιμής καλύπτεται πλήρως με την ή τις αραιώσεις του αντισώματος.
Cover each test window completely with the antibody dilution(s).
Ο όγκος του αντισώματος που εφαρμόζεται σε κάθε φατνίο πρέπει να είναι τουλάχιστον ίσος με τον όγκο του εφαρμοσθέντος εκχυλίσματος.
The volume of antibody applied on each window must be at least the volume of extract applied.
Η ακόλουθη διαδικασία πρέπει να εφαρμόζεται στην περίπτωση που δεν υπάρχουν συγκεκριμένες οδηγίες από τους προμηθευτές των αντισωμάτων:
The following procedure should be carried out in the absence of specific instructions from the suppliers of the antibodies:
Οι αντικειμενοφόροι επωάζονται σε ένυγρο χαρτί κάτω από ένα κάλυμμα για 30 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος (18-25 °C).
Incubate the slides on moist paper under a cover for 30 minutes at ambient temperature (18 to 25 °C).
Τα σταγονίδια απομακρύνονται με ένα ελαφρό τίναγμα από την αντικειμενοφόρο και ακολουθεί προσεκτικό ξέπλυμα με ρυθμιστικό διάλυμα IF.
Shake the droplets off each slide and rinse carefully with IF buffer.
Πλένονται με βύθισμα για 5 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα IF-Tween (προσάρτημα 3) και στη συνέχεια για 5 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα IF.
Wash by submerging for 5 minutes in IF buffer-Tween (Appendix 3) and subsequently for 5 minutes in IF buffer.
Πρέπει να αποφεύγεται η δημιουργία αερολυμάτων ή η μεταφορά σταγονιδίων που θα μπορούσαν να έχουν ως αποτέλεσμα την επιμόλυνση.
Avoid causing aerosols or droplet transfer that could result in cross-contamination.
Η περίσσεια νερού αφαιρείται προσεκτικά χρησιμοποιώντας με απαλές κινήσεις ένα στυπόχαρτο.
Carefully remove excess moisture by blotting gently.
Τα φατνία δοκιμής καλύπτονται με την αραίωση του συμπλόκου FITC που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό του τίτλου.
Cover the test windows with the dilution of FITC conjugate used to determine the titre.
Ο όγκος του χρησιμοποιούμενου στα φατνία συμπλόκου πρέπει να είναι ίδιος με τον όγκο του εφαρμοσθέντος αντισώματος.
The volume of conjugate applied on the windows must be identical to the volume of antibody applied.
Τα σταγονίδια του συμπλόκου απομακρύνονται με ελαφρό τίναγμα από την αντικειμενοφόρο.
Shake the droplets of conjugate off the slide.
Οι αντικειμενοφόροι ξεπλένονται και πλένονται όπως προηγουμένως (4.3.3).
Rinse and wash as before (4.3.3).
Η περίσσεια υγρασίας αφαιρείται προσεκτικά.
Carefully remove excess moisture.
Σε κάθε φατνίο φέρονται με σιφώνιο 5-10 µl 0,1 Μ φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος γλυκερίνης (προσάρτημα 3) ή εμπορικού αντιξεθωριαστικού υλικού έγκλεισης και τα φατνία καλύπτονται με μία καλυπτρίδα.
Pipette 5 to 10 µl of 0,1M phosphate-buffered glycerol (Appendix 3) or a commercially antifading mountant on each window and apply a coverslip.
Ανάγνωση της δοκιμής IF
Reading the IF test:
Οι αντικειμενοφόροι πλάκες δοκιμής εξετάζονται σε μικροσκόπιο επιφθορισμού με φίλτρα κατάλληλα για τη διέγερση του FITC, με έλαιο – ή υδατοκαταδυτικό φακό σε μεγέθυνση 500-1000x.
Examine test slides on an epifluorescence microscope with filters suitable for excitation of FITC, under oil or water immersion at a magnification of 500 to 1000.
Τα φατνία εξετάζονται κατά δύο κάθετες διαμέτρους και κατά την περίμετρό τους.
Scan windows across two diameters at right angles and around the perimeter.
Όσον αφορά τα δείγματα που δεν δείχνουν καθόλου κύτταρα ή δείχνουν μικρό αριθμό κυττάρων, πρέπει να παρατηρηθούν τουλάχιστον 40 πεδία μικροσκοπίου.
For samples showing no or low number of cells observe at least 40 microscope fields.
Πρώτα ελέγχεται η αντικειμενοφόρος του θετικού μάρτυρα.
Check the positive control slide first.
Τα κύτταρα πρέπει να είναι πλήρως χρωσμένα με λαμπρό φθορισμό στον προσδιορισμένο τίτλο αντισώματος ή την αραίωση εργασίας.
Cells must be bright fluorescent and completely stained at the determined antibody titre or working dilution.
Σε περίπτωση παρέκκλισης της χρώσης, η δοκιμή IF (ενότητα 4) επαναλαμβάνεται.
The IF test (section 4) must be repeated if the staining is aberrant.
Εξετάζεται εάν υπάρχουν λαμπρώς φθορίζοντα κύτταρα με τη χαρακτηριστική μορφολογία του C. m. subsp. sepedonicus στα φατνία δοκιμής των αντικειμενοφόρων δοκιμής (βλέπε ιστοχώρο http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
Observe for bright fluorescing cells with characteristic morphology of C. m. subsp. sepedonicus in the test windows of the test slides (see web site http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
Η ένταση του φθορισμού πρέπει να είναι ισοδύναμη ή καλύτερη από εκείνη του θετικού μάρτυρα με ίδια αραίωση αντισώματος.
The fluorescence intensity must be equivalent or better to the positive control strain at the same antibody dilution.
Κύτταρα με ατελή χρώση ή με ασθενή φθορισμό δεν πρέπει να λαμβάνονται υπόψη.
Cells with incomplete staining or with weak fluorescence must be disregarded.
Εάν υπάρχει υπόνοια μόλυνσης, η δοκιμή πρέπει να επαναληφθεί.
If any contamination is suspected the test must be repeated.
Αυτό μπορεί να ισχύει εάν όλες οι αντικειμενοφόροι μιας παρτίδας δείχνουν θετικά κύτταρα λόγω μόλυνσης του ρυθμιστικού διαλύματος ή εάν βρεθούν θετικά κύτταρα (εκτός των φατνίων της αντικειμενοφόρου) στην επικάλυψη της αντικειμενοφόρου.
This may be the case when all slides in a batch show positive cells due to the contamination of buffer or if positive cells are found (outside of the slide windows) on the slide coating.
Υπάρχουν διάφορα προβλήματα σύμφυτα με την εξειδίκευση της δοκιμής ανοσοφθορισμού.
There are several problems inherent to the specificity of the immunofluorescence test.
Τα ιζήματα των κώνων από τα σημεία πρόσφυσης του στολονίου και των τμημάτων του στελέχους περιέχουν συχνά πληθυσμούς φθοριζόντων κυττάρων μη τυπικής μορφολογίας καθώς και μη ειδικώς αντιδρώντα σαπροφυτικά βακτήρια όμοιου μεγέθους και μορφολογίας με το C. m. ssp. sepedonicus.
Background populations of fluorescing cells with atypical morphology and cross reacting saprophytic bacteria with size and morphology similar to C. m. sepedonicus are likely to occur in potato heel end core and stem segment pellets.
Λαμβάνονται υπόψη μόνον τα φθορίζοντα κύτταρα τυπικού μεγέθους και μορφολογίας στον τίτλο ή την αραίωση εργασίας των αντισωμάτων όπως στο σημείο 4.3.
Consider only fluorescing cells with typical size and morphology at the titre or working dilution of the antibodies as in 4.3.
Ερμηνεία των αποτελεσμάτων IF:
Interpretation of the IF reading:
Εάν σε ένα δείγμα εντοπίζονται λαμπρώς φθορίζοντα κύτταρα με χαρακτηριστική μορφολογία, εκτιμάται ο μέσος αριθμός τυπικών κυττάρων ανά πεδίο μικροσκοπίου και υπολογίζεται ο αριθμός των τυπικών κυττάρων ανά ml του αναδιαλυμένου ιζήματος (προσάρτημα 4).
If bright fluorescing cells with characteristic morphology are found, estimate the average number of typical cells per microscope field and calculate the number of typical cells per ml of resuspended pellet (Appendix 4).
Η ανάγνωση IF είναι θετική για δείγματα με τουλάχιστον 5 × 103 τυπικά κύτταρα ανά ml του αναδιαλυμένου ιζήματος.
The IF reading is positive for samples with at least 5 × 103 typical cells per ml of resuspended pellet.
Το δείγμα θεωρείται ενδεχομένως μολυσμένο και απαιτείται η διενέργεια περαιτέρω δοκιμών.
The sample is considered potentially contaminated. and further testing is required.
Η ανάγνωση IF είναι αρνητική για δείγματα με λιγότερα από 5 × 103 κύτταρα ανά ml αναδιαλυμένου ιζήματος και το δείγμα θεωρείται αρνητικό.
The IF reading is negative for samples with less than 5 × 103 cells per ml resuspended pellet and the sample is considered negative.
Δεν απαιτείται η διεξαγωγή περαιτέρω δοκιμών.
Further testing is not required.
ΔΟΚΙΜΗ FISH
FISH TEST
Όταν η δοκιμή FISH χρησιμοποιείται ως αρχική δοκιμή διαλογής και τα αποτελέσματα είναι θετικά, πρέπει να πραγματοποιηθεί η δοκιμή IF ως δεύτερη υποχρεωτική δοκιμή διαλογής.
When the FISH test is used as the first screening test and found to be positive, the IF test must be performed as a second compulsory screening test.
Όταν η δοκιμή FISH χρησιμοποιείται ως δεύτερη δοκιμή διαλογής και έχει θετικά αποτελέσματα, απαιτείται διεξαγωγή περαιτέρω δοκιμών σύμφωνα με το διάγραμμα ροής για την ολοκλήρωση της διάγνωσης.
When the FISH test is used as the second screening test and found to be positive, further testing according to the flow scheme is required to complete the diagnosis.
Χρησιμοποιούνται επικυρωμένοι ολιγοανιχνευτές ειδικοί για το C. m. subsp. sepedonicus (προσάρτημα 7).
Use validated C. m. subsp. sepedonicus-specific oligo-probes (Appendix 7).
Οι προκαταρκτικές δοκιμές με τη μέθοδο αυτή θα πρέπει να επιτρέπουν την αναπαραγώγιμη ανίχνευση τουλάχιστον 103-104 κυττάρων του C. m. subsp. sepedonicus ανά ml που προστίθενται σε εκχυλίσματα δειγμάτων που προηγουμένως ήταν αρνητικά στη δοκιμή.
Preliminary testing with this method should permit reproducible detection of at least 103 to 104 cells of C. m. subsp. sepedonicus per ml added to sample extracts which previously tested negative.
Η ακόλουθη διαδικασία είναι προτιμότερο να πραγματοποιείται σε εκχύλισμα δείγματος που έχει μόλις παρασκευασθεί αλλά είναι επίσης δυνατόν να πραγματοποιηθεί με επιτυχία σε εκχύλισμα δείγματος που έχει αποθηκευθεί με γλυκερίνη στους –16 έως –24 °C ή τους –68 έως –86 °C.
The following procedure should preferably be performed on freshly prepared sample extract but can also be successfully performed on sample extract that has been stored under glycerol at –16 to –24 °C or –68 to –86 °C.
Ως αρνητικοί μάρτυρες, χρησιμοποιούνται κατάλληλες ποσότητες εκχυλίσματος δείγματος που προηγουμένως ήταν αρνητικό στις δοκιμές για το C. m. subsp. sepedonicus.
As negative controls, use aliquots of sample extract that previously tested negative for C. m. subsp. sepedonicus.
Ως θετικοί μάρτυρες, παρασκευάζονται αιωρήματα που περιέχουν 105 έως 106 κύτταρα ανά ml του C. m. subsp. sepedonicus (π.χ. στέλεχος NCPPB 4053 ή PD 406) σε 0,01M ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PB) από καλλιέργεια 3-5 ημερών (για την παρασκευή βλέπε προσάρτημα 2).
As positive controls prepare suspensions containing 105 to 106 cells per ml of C. m. subsp. sepedonicus (e.g. strain NCPPB 4053, or PD 406) in 0,01M phosphate buffer (PB) from a three to five day culture (preparation see Appendix 2).
Παρασκευάζονται ξεχωριστά ως θετικοί μάρτυρες αντικειμενοφόροι πλάκες από ομόλογο στέλεχος ή άλλο στέλεχος αναφοράς του C. m. subsp. sepedonicus, που έχει γίνει αιώρημα σε εκχύλισμα πατάτας, όπως περιγράφεται στο προσάρτημα 2.
Prepare separate positive control slides of the homologous strain or any other reference strain of C. m. subsp. sepedonicus, suspended in potato extract, as specified in Appendix 2.
Η χρήση ολιγοανιχνευτή ευβακτηρίων σημασμένου με FITC παρέχει μάρτυρα για τη διαδικασία υβριδισμού, καθώς χρωματίζει όλα τα ευβακτήρια που βρίσκονται στο δείγμα.
The use of the FITC-labelled eubacterial oligo-probe offers a control for the hybridisation process, since it will stain all eubacteria that are present in the sample.
Προσήλωση του εκχυλίσματος πατάτας
Potato extract fixation
Παρασκευάζεται το προσηλωτικό διάλυμα (βλέπε προσάρτημα 7).
Prepare fixative solution (see Appendix 7).
Φέρονται με σιφώνιο 100 µl κάθε εκχυλίσματος δείγματος σε σωλήνα Eppendorf και φυγοκεντρούνται για 8 λεπτά σε 7000 g.
Pipette 100 µl of each sample extract into an Eppendorf tube and centrifuge for eight min at 7000 g.
Αφαιρείται το υπερκείμενο υγρό και το ίζημα διαλύεται σε 500 µl προσηλωτικού υγρού που έχει παρασκευασθεί λιγότερο από 24 ώρες πριν.
Remove the supernatant and dissolve the pellet in 500 µl of fixative prepared < 24 hours previously.
Ανακατεύουμε με στροβιλισμό (vortex) και επωάζουμε για μία νύκτα στους 4 °C.
Vortex and incubate overnight at 4 °C.
Εναλλακτικό προσηλωτικό υγρό είναι διάλυμα 96 % αιθανόλης.
An alternative fixative is 96 % ethanol.
Για τη χρησιμοποίησή του το ίζημα, από το βήμα 5.1.2 διαλύεται σε 50 µl 0,01 M ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (ΡΒ) και 50 µl 96 % αιθανόλης.
To use this dissolve the pellet from step 5.1.2 in 50 µl 0,01M PB and 50 µl 96 % ethanol.
Ανακατεύουμε με στροβιλισμό (vortex) και επωάζουμε στους 4 °C για 30-60 λεπτά.
Vortex mix and incubate at 4 °C for 30 to 60 minutes.
Φυγοκεντρείται για 8 λεπτά σε 7000 g, αφαιρείται το υπερκείμενο υγρό και το ίζημα αναδιαλύεται σε 75 µl 0,01 M ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (ΡΒ) (βλέπε προσάρτημα 3).
Centrifuge for 8 min. at 7000 g, remove the supernatant and resuspend the pellet in 75 µl 0,01M PB (see Appendix 3).
Το εναπομείναν διάλυμα δείγματος (49 µl) μπορεί να αποθηκευθεί στους –20 °C μετά την προσθήκη 1 όγκου 96 % αιθανόλης.
The remaining sample solution (49 µl) can be stored at –20 °C after addition of 1 volume of 96 % ethanol.
Στην περίπτωση που η δοκιμή FISH πρέπει να επαναληφθεί, αφαιρείται η αιθανόλη με φυγοκέντριση και προστίθεται ίσος όγκος 0,01 M ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών [αναμειγνύουμε με στροβιλισμό (vortex)].
In case the FISH assay requires repeating, remove the ethanol by centrifugation and add an equal volume of 0,01M PB (mix by vortexing).
Σχέδιο αντικειμενοφόρου FISH
Layout for FISH slide
Τυφλό πείραμα
Blank
Δείγμα 2
Sample 2
φατνίο 1
window 1
φατνίο 2
window 2
φατνίο 3
window 3
φατνίο 4
window 4
φατνίο 5
window 5
φατνίο 6
window 6
φατνίο 7
window 7
φατνίο 8
window 8
φατνίο 9
window 9
φατνίο 10
window 10
Καλυπτρίδα 1
Coverslip 1
Καλυπτρίδα 2
Coverslip 2
Οι αντικειμενοφόροι στεγνώνουν στον αέρα (ή σε στεγνωτήρα αντικειμενοφόρου στους 37 °C) και προσηλώνονται με διέλευση από φλόγα.
Air-dry the slides (or on slide dryer at 37 °C) and fix them by flaming.
Στο στάδιο αυτό η διαδικασία είναι δυνατόν να διακοπεί και να συνεχισθεί ο υβριδισμός την επόμενη ημέρα.
At this stage the procedure may be interrupted and the hybridisation continued the following day.
Οι αντικειμενοφόροι πρέπει να αποθηκεύονται απαλλαγμένες από σκόνη και στεγνές σε θερμοκρασία δωματίου.
Slides should be stored dust-free and dry at room temperature.
Προϋβριδισμός και υβριδισμός
Pre-hybridisation and hybridisation
Παρασκευάζεται διάλυμα λυσοζύμης που περιέχει 10 mg λυσοζύμης (Sigma L-6876) σε 10 ml ρυθμιστικού διαλύματος (100 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 8,0).
Prepare a lysozyme solution containing 10 mg lysozyme (Sigma L–6876) in 10 ml buffer (100 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH8.0).
Το διάλυμα αυτό μπορεί να αποθηκευθεί αλλά επιτρέπεται να καταψυχθεί και να αποψυχθεί μόνον μία φορά.
This solution can be stored but it should only be freeze-thawed once.
Το φατνίο κάθε δείγματος καλύπτεται με περίπου 50 µl διαλύματος λυσοζύμης και επωάζεται για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου.
Cover each sample well with approximately 50 µl of lysozyme solution and incubate for 10 minutes at room temperature.
Στη συνέχεια οι αντικειμενοφόροι βυθίζονται σε απιονισμένο νερό, μία μόνον φορά και στεγνώνονται με διηθητικό χαρτί.
Then dip the slides in demineralised water, once only and dry with filter paper.
Εναλλακτικά, αντί λυσοζύμης προστίθενται σε κάθε φατνίο 50 µl διαλύματος 40-400 µg ml-1 πρωτεάσης K σε ρυθμιστικό διάλυμα (20 mM Tris-HCl, 2 mM CaCl2, pH 7,4) και επωάζουμε σε 37 °C για 30 λεπτά.
Alternatively, instead of lysozyme add 50 µl of 40 to 400µg ml–1 proteinase K in buffer (20 mM Tris-HCl, 2 mM CaCl2, pH 7,4) to each well and incubate at 37 °C for 30 minutes.
Τα κύτταρα αφυδατώνονται σε διαβαθμισμένη σειρά αιθανόλης των 50 %, 80 % και 96 % για ένα λεπτό σε κάθε μία.
Dehydrate the cells in a graded ethanol series of 50 %, 80 % and 96 % for one minute each.
Οι αντικειμενοφόροι στεγνώνονται στον αέρα σε υποδοχέα αντικειμενοφόρων.
Air dry the slides in a slide-holder.
Παρασκευάζεται ένας υγρός θάλαμος επώασης με κάλυψη του πυθμένα ενός αεροστεγούς δοχείου με απορροφητικό ή διηθητικό χαρτί που έχει εμβαπτισθεί σε 1x μείγμα υβριδισμού (hybmix) (προσάρτημα 7).
Prepare a moist incubation chamber by covering the bottom of an air-tight box with tissue or filter paper soaked in 1x hybmix (Appendix 7).
Το δοχείο προεπωάζεται στον κλίβανο υβριδισμού στους 55 °C για τουλάχιστον 10 λεπτά.
Pre-incubate the box in the hybridisation oven at 55 °C for at least 10 minutes.
Παρασκευάζεται το διάλυμα υβριδισμού (προσάρτημα 7) θεωρώντας 45 µl ανά αντικειμενοφόρο πλάκα και προεπωάζεται για 5 λεπτά στους 55 °C.
Prepare the hybridisation solution (Appendix 7) allowing 45 µl per slide, and preincubate for five minutes at 55 °C.
Οι αντικειμενοφόροι πλάκες τοποθετούνται σε θερμή πλάκα θερμοκρασίας 45 °C και εφαρμόζονται 10 µl διαλύματος υβριδισμού σε καθένα από τα 4 φατνία στην(-ις) αντικειμενοφόρο(-ους).
Place slides on a hot plate at 45 °C and apply 10 µl of hybridization solution to each of the four wells on the slide(s).
Εφαρμόζονται 2 καλυπτρίδες (24 × 24 mm) σε κάθε αντικειμενοφόρο πλάκα χωρίς να εγκλωβιστεί αέρας.
Apply two coverslips (24 × 24 mm) to each slide without trapping air.
Οι αντικειμενοφόροι πλάκες τοποθετούνται στον προθερμασμένο υγρό θάλαμο και ο υβριδισμός πραγματοποιείται όλη τη νύκτα στον κλίβανο σε θερμοκρασία 55 °C στο σκοτάδι.
Place the slides in the pre-warmed moist chamber and hybridise overnight in the oven at 55 °C in the dark.
Παρασκευάζονται 3 ποτήρια ζέσεως που περιέχουν αντίστοιχα 1 l υπέρ καθαρό νερό (UPW), 1 l από 1x hybmix (334 ml 3x hybmix και 666 ml UPW) και 1 l από 1/2x hybmix (167 ml 3x hybmix και 833 ml UPW).
Prepare three beakers containing 1 l of Ultra pure water (UPW), 1 l of 1x hybmix (334 ml 3x hybmix and 666 ml UPW) and 1 l of 1/2x hybmix (167 ml 3x hybmix and 833 ml UPW).
Έκαστο προεπωάζεται σε υδατόλουτρο σε θερμοκρασία 55 °C.
Pre-incubate each in a waterbath at 55 °C.