natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Η παρουσία του R. solanacearum σε στελέχη μαραμένων φυτών πατάτας, τομάτας ή άλλων ξενιστών μπορεί να εκτιμηθεί με την ακόλουθη απλή προκαταρκτική δοκιμή: κόβουμε το στέλεχος πάνω ακριβώς από το έδαφος.
The presence of R. solanacearum in stems of wilting potato, tomato or other host plants can be indicated by the following simple presumptive test: Cut the stem just above the soil level.
Αναρτάται η κομμένη επιφάνεια μέσα σε σωλήνα με καθαρό νερό.
Suspend the cut surface in a tube of clean water.
Παρατηρούμε εάν σε λίγα λεπτά παρουσιαστεί η χαρακτηριστική αυθόρμητη ροή βακτηριακού γλοιώδους εκκρίματος με τη μορφή κλωστών από τις κομμένες αγγειώδεις δέσμες.
Observe for characteristic spontaneous streaming of threads of bacterial slime from the cut vascular bundles after a few minutes.
Παρασκευάζουμε επίχρισμα της βακτηριακής εξίδρωσης από τους μολυσμένους ιστούς ή από 48ωρη καλλιέργεια σε υλικό YPGA ή SPA (προσάρτημα 2) σε αντικειμενοφόρο πλάκα μικροσκοπίου.
Prepare a smear of bacterial ooze from infected tissue or from a 48-hour culture on YPGA or SPA medium (Appendix 2) on a microscope slide.
Παρασκευάζουμε επίσης επιχρίσματα θετικού μάρτυρα από στέλεχος του R. solanacearum βιοποικιλίας 2 και, αν θεωρηθεί χρήσιμο, ένα επίχρισμα αρνητικού μάρτυρα ενός είδους γνωστού ως αρνητικού στην παραγωγή PHB.
Prepare positive control smears of a biovar 2 strain of R. solanacearum and, if considered useful, a negative control smear of a known PHB negative sp.
Αφήνουμε να ξηρανθούν και περνούμε την κατώτερη επιφάνεια κάθε αντικειμενοφόρου γρήγορα πάνω από φλόγα για να προσηλωθούν τα επιχρίσματα.
Allow to air dry and pass the lower surface of each slide rapidly above a flame to fix the smears.
Ακολουθεί χρώση του παρασκευάσματος με Nile Blue ή Sudan Black και εξετάζονται στο μικροσκόπιο ως εξής:
Stain preparation with either Nile Blue or Sudan Black and observe microscopically as described below:
Δοκιμή Nile Blue
Nile blue test:
Κάθε αντικειμενοφόρος καλύπτεται πλήρως με 1 % υδατικό διάλυμα Nile Blue A και επωάζεται για 10 λεπτά στους 55 °C.
Flood each slide with 1 % aquous solution of Nile Blue A and incubate for 10 minutes at 55 °C.
Αποστραγγίζουμε το διάλυμα χρώσεως.
Drain off the staining solution.
Πλένουμε την πλάκα για λίγο προσεκτικά με ρέον νερό της βρύσης.
Wash briefly in gently running tap water.
Απομακρύνουμε την περίσσεια του νερού με απορροφητικό χαρτί.
Remove excess water with tissue paper.
Περιλούζουμε το επίχρισμα με 8 % υδατικό διάλυμα οξικού οξέος και το αφήνουμε για επώαση επί 1 λεπτό σε θερμοκρασία εργαστηρίου.
Flood the smear with 8 % aqueous acetic acid and incubate for one minute at ambient temperature.
Ξαναρίχνουμε μία σταγόνα νερό και τοποθετούμε μία καλυπτρίδα.
Re-moisten with a drop of water and apply a coverslip.
στ) Εξετάζουμε το χρωσμένο επίχρισμα με μικροσκόπιο επιφθορισμού στα 450 nm με ελαιοκαταδυτικό φακό σε μεγέθυνση 600-1000 χρησιμοποιώντας ένα έλαιο- ή υδατοκαταδυτικό αντικειμενικό φακό.
Examine the stained smear with an epifluorescence microscope at 450 nm under oil immersion at a magnification of 600 to 1000 using an oil- or water-immersion objective.
Παρατηρούμε για την παρουσία κοκκίων PHB με λαμπρό πορτοκαλί φθορισμό.
Observe for bright orange fluorescence of PHB granules.
Επίσης παρατηρούμε με κανονικό διερχόμενο φως για, να εξασφαλιστεί ότι τα κοκκία είναι ενδοκυτταρικά και ότι η μορφολογία των κυττάρων είναι η τυπική του R. solanacearum.
Also observe under transmitted normal light to ensure that the granules are intracellular and that cell morphology is typical of R. solanacearum.
Δοκιμή Sudan Black
Sudan Black test:
Κάθε αντικειμενοφόρος καλύπτεται πλήρως με 0,3 % διάλυμα Sudan Black B σε 70 % αιθανόλη και επωάζεται για 10 λεπτά σε θερμοκρασία εργαστηρίου.
Flood each slide with 0,3 % Sudan Black B solution in 70 % ethanol and incubate for 10 minutes at ambient temperature.
Αποστραγγίζουμε το διάλυμα χρώσεως, πλένουμε την πλάκα για λίγο προσεκτικά με ρέον νερό της βρύσης και απομακρύνουμε την περίσσεια του νερού με απορροφητικό χαρτί.
Drain off the staining solution and wash briefly in tap water, removing excess water with tissue paper.
Οι αντικειμενοφόροι βυθίζονται για σύντομο χρονικό διάστημα σε ξυλόλη και στεγνώνουμε με απορροφητικό χαρτί.
Dip the slides briefly in xylol and blot dry on tissue paper.
Προσοχή: Η ξυλόλη είναι επιβλαβής, γι’ αυτό πρέπει να λαμβάνουμε τις απαραίτητες προφυλάξεις ασφαλείας και να εργαζόμαστε σε απαγωγό εστία.
Caution: Xylol is harmful, take necessary safety precautions and work in a fume cupboard.
Περιλούζουμε τις αντικειμενοφόρους με 0,5 % (β/ο) υδατικό διάλυμα σαφρανίνης και το αφήνουμε για 10 δευτερόλεπτα σε θερμοκρασία εργαστηρίου.
Flood the slides with 0,5 % (w/v) aqueous safranin and leave for 10 seconds at ambient temperature.
Προσοχή: Η σαφρανίνη είναι επιβλαβής, γι’ αυτό πρέπει να λαμβάνουμε τις απαραίτητες προφυλάξεις ασφαλείας και να εργαζόμαστε σε απαγωγό εστία.
Caution: Safranin is harmful, take necessary safety precautions and work in a fume cupboard.
Ξεπλένουμε ήπια με ρέον νερό της βρύσης, στεγνώνουμε με απορροφητικό χαρτί και τοποθετούμε μία καλυπτρίδα.
Wash in gently running tap water, blot dry on tissue paper and apply a coverslip.
στ) Εξετάζουμε τα χρωσμένα επιχρίσματα σε φωτομικροσκόπιο χρησιμοποιώντας διερχόμενο φως με ελαιοκαταδυτικό φακό και με κλίμακα μεγέθυνσης 1000 χρησιμοποιώντας ένα ελαιοκαταδυτικό αντικειμενικό.
Examine stained smears with a light microscope using transmitted light under oil immersion at a magnification of 1000 using an oil-immersion objective.
Παρατηρούμε για κοκκία PHB που έχουν χρωσθεί μπλε-μαύρα μέσα σε κύτταρα του R. solanacearum με χρωσμένα ροζ κυτταρικά τοιχώματα.
Observe for blue-black staining of PHB granules in cells of R. solanacearum with pink-stained cell walls.
Η συγκόλληση των κυττάρων του R. solanacearum σε βακτηριακή εξίδρωση ή εκχυλίσματα ιστών που παρουσιάζουν συμπτώματα παρατηρείται καλύτερα με τη χρήση επικυρωμένων αντισωμάτων (βλ. παράρτημα 3) επισημασμένων με τους κατάλληλους χρωματικούς δείκτες, όπως κόκκινα κύτταρα Staphylococcus aureus ή χρωσμένα σωματίδια latex.
Agglutination of R. solanacearum cells in bacterial ooze or symptomatic tissue extracts is best observed using validated antibodies (see Appendix 3) labelled with appropriate coloured markers such as red Staphylococcus aureus cells or coloured latex particles.
Εάν χρησιμοποιείται συσκευασία που διατίθεται στο εμπόριο (βλ. προσάρτημα 3), ακολουθούμε τις οδηγίες του κατασκευαστή.
If using a commercially available kit (see Appendix 3), follow the manufacturers instructions.
Σε διαφορετική περίπτωση, ακολουθείται η εξής διαδικασία:
Otherwise perform the following procedure:
Αναμειγνύουμε σταγόνες ενός αιωρήματος επισημασμένου αντισώματος και βακτηριακής εξίδρωσης (περίπου 5 µl το καθένα) σε φατνία πολυφατνιακών αντικειμενοφόρων δοκιμής.
Mix drops of a suspension of labelled antibody and bacterial ooze (approximately 5 µl each) on windows of multiwell test slides.
Παρασκευάζουμε θετικούς και αρνητικούς μάρτυρες χρησιμοποιώντας αιωρήματα του R. solanacearum βιοποικιλίας 2 και ετερόλογου στελέχους.
Prepare positive and negative controls using suspensions of R. solanacearum biovar 2 and a heterologous strain.
Παρατηρούμε εάν υπάρχει συγκόλληση σε θετικά δείγματα ύστερα από ελαφρά ανάμειξη για 15 δευτερόλεπτα.
Observe for agglutination in positive samples after gentle mixing for 15 seconds.
Σημείωση: Προτού χρησιμοποιήσετε για πρώτη φορά τη μέθοδο αυτή, πρέπει να πραγματοποιήσετε προκαταρκτικές δοκιμές έτσι ώστε να εξασφαλισθεί η αναπαραγώγιμη ανίχνευση 103 έως 104 μονάδων που σχηματίζουν αποικίες του R. solanacearum ανά ml που προστίθεται σε εκχυλίσματα από δείγματα που προηγουμένως έδειξαν αρνητικά αποτελέσματα. Χρησιμοποιείστε ένα κατάλληλο επικυρωμένο εκλεκτικό θρεπτικό υπόστρωμα όπως το SMSA (όπως τροποποιήθηκε από τον Elphinstone et al., 1996·
Note: Before using this method for the first time, perform preliminary tests to ensure reproducible detection of 103 to 104 colony-forming units of R. solanacearum per ml added to extracts from samples which previously tested negative.
βλ. προσάρτημα 2). Χρειάζεται επίσης προσοχή ώστε το R. solanacearum να διαφοροποιείται από τυχόν άλλα βακτήρια που μπορεί να αναπτύξουν αποικίες στο θρεπτικό υπόστρωμα.
Use an appropriately validated selective medium such as SMSA (as modified by Elphinstone et al., 1996; see Appendix 2).
Στις περιπτώσεις που υπάρχουν υπόνοιες για φαινόμενα ανταγωνισμού, το δείγμα πρέπει να επανεξετάζεται με διαφορετική δοκιμή.
Where effects of competition or antagonism are suspected, the sample should be re-tested using a different test.
Είναι δυνατόν να αναμένεται η ύψιστη ευαισθησία ανίχνευσης με τη μέθοδο αυτή όταν χρησιμοποιούνται εκχυλίσματα δειγμάτων που έχουν μόλις παρασκευασθεί.
Highest sensitivity of detection by this method can be expected when using freshly prepared sample extracts.
Ωστόσο, η μέθοδος εφαρμόζεται επίσης για εκχυλίσματα που έχουν αποθηκευθεί σε γλυκερίνη στους –68 έως –86 °C.
However, the method is also applicable for use with extracts which have been stored under glycerol at –68 to –86 °C.
Ως θετικοί μάρτυρες, παρασκευάζονται δεκαδικές αραιώσεις από αιώρημα 106 cfu ανά ml παθογόνου στελέχους του R. solanacearum βιοποικιλίας 2 (π.χ. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857).
As positive controls, prepare decimal dilutions from a suspension of 106 cfu per ml of a virulent biovar 2 strain of R. solanacearum (e.g. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857).
Για την αποφυγή ενδεχόμενης μόλυνσης, παρασκευάζονται θετικοί μάρτυρες πλήρως διαχωρισμένοι από τα δείγματα προς δοκιμή.
To avoid any possibility of contamination, prepare positive controls totally separately from samples to be tested.
Το υλικό των μαρτύρων δοκιμάζεται με τρόπο ταυτόσημο με εκείνο του ή των δειγμάτων.
Test control material in an identical manner as the sample(s).
Πραγματοποιείται η κατάλληλη τεχνική αραιώσεων επί στερεού υποστρώματος με στόχο να εξασφαλισθεί ότι αραιώνονται οποιοιδήποτε πληθυσμοί σαπροφύτων που σχηματίζουν αποικίες.
Perform an appropriate dilution plating technique aiming to ensure that any background saprophytic colony-forming populations are diluted out.
Απλώνονται 50-100 µl ανά τρυβλίο εκχυλίσματος δείγματος και κάθε αραίωση.
Spread 50 - 100 µl per plate of sample extract and each dilution.
Τα τρυβλία επωάζονται στους 28 °C.
Incubate plates at 28 °C.
Γίνεται ανάγνωση των τρυβλίων μετά από 48 ώρες και στη συνέχεια κάθε μέρα για 6 ημέρες.
Read plates after 48 hours and daily thereafter up to six days.
Σημείωση: Ορισμένες φορές στο εν λόγω θρεπτικό υπόστρωμα σχηματίζονται μη τυπικές αποικίες του R. solanacearum.
Note: Atypical colonies of R. solanacearum sometimes form on this medium.
Οι αποικίες αυτές ενδέχεται να είναι μικρές, στρογγυλές, εντελώς κόκκινες στο χρώμα και μη ρευστώδεις ή μόνον μερικώς ρευστώδεις και, για το λόγο αυτό, είναι δύσκολο να τις ξεχωρίσει κανείς από σαπροφυτικά βακτήρια που σχηματίζουν αποικίες.
These may be small, round, entirely red in colour and non-fluidal or only partially fluidal and therefore difficult to distinguish from saprophytic colony-forming bacteria.
Καθαρίζονται οι πιθανές αποικίες του R. solanacearum ύστερα από γραμμωτή εξάπλωση ή εξάπλωση διαδοχικών αραιώσεων σε τρυβλία σε γενικής χρήσης θρεπτικό υλικό για την επίτευξη απομονωμένων αποικιών (βλ. προσάρτημα 2).
Purify presumptive R. solanacearum colonies after streaking or dilution plating onto a general nutrient medium to obtain isolated colonies (see Appendix 2).
Οι καλλιέργειες αποθηκεύονται για βραχέα διαστήματα σε αποστειρωμένο νερό (pH 6-8, χωρίς χλώριο) σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι ή για μακρά διαστήματα σε κατάλληλο κρυοπροστατευτικό υλικό στους –68 έως –86 °C ή λυοφιλιωμένες.
Store cultures short-term in sterile water (pH 6 to 8, chlorine free) at room temperature in the dark, or long term in a suitable cryoprotectant medium at –68 to –86 °C or lyophilised.
Ταυτοποιούνται οι πιθανές καλλιέργειες (βλ. ενότητα VI.B.) και πραγματοποιείται δοκιμή παθογένειας (βλ. ενότητα VI.
Identify presumptive cultures (see Section VI.B.) and perform a pathogenicity test (see Section VI.
Ερμηνεία των αποτελεσμάτων της δοκιμής εκλεκτικής απομόνωσης επί στερεού θρεπτικού υποστρώματος
Interpretation of selective plating test results
Η δοκιμή αυτή είναι αρνητική εάν δεν παρατηρηθούν βακτηριακές αποικίες μετά από έξι ημέρες ή δεν εντοπισθούν πιθανές τυπικές αποικίες του R. solanacearum, υπό την προϋπόθεση ότι δεν υπάρχουν υπόνοιες για παρεμπόδιση λόγω ανταγωνισμού από άλλα βακτήρια και ότι στους θετικούς μάρτυρες έχουν βρεθεί τυπικές αποικίες R. solanacearum.
The selective plating test is negative if no bacterial colonies are observed after six days or if no presumptive colonies typical of R. solanacearum are found, provided that no inhibition is suspected due to competition or antagonism by other bacteria and that typical R. solanacearum colonies are found in the positive controls.
Η δοκιμή είναι θετική εάν απομονωθούν πιθανές αποικίες του R. solanacearum.
The selective plating test is positive if presumptive R. solanacearum colonies are isolated.
Χρησιμοποιούμε ένα επικυρωμένο υπόστρωμα εμπλουτισμού όπως ο τροποποιημένος ζωμός Wilbrink (βλ. προσάρτημα 2).
Use a validated enrichment medium such as modified Wilbrink broth (see Appendix 2).
Η διαδικασία αυτή μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την εκλεκτική αύξηση των πληθυσμών του R. solanacearum σε εκχυλίσματα δειγμάτων και για την ενίσχυση της ευαισθησίας ανίχνευσης.
This procedure can be used to selectively increase R. solanacearum populations in sample extracts and increase sensitivity of detection.
Η εν λόγω διαδικασία, αραιώνει επίσης αποτελεσματικά παρεμποδιστές της αντίδρασης PCR (1:100).
The procedure also effectively dilutes inhibitors of the PCR reaction (1:100).
Θα πρέπει, ωστόσο, να σημειωθεί ότι ο εμπλουτισμός του R. solanacearum μπορεί να αποτύχει λόγω ανταγωνισμού από σαπροφυτικούς οργανισμούς οι οποία επίσης εμπλουτίζονται ταυτόχρονα.
It should be noted, however, that enrichment of R. solanacearum can fail due to competition or antagonism by saprophytic organisms which are often simultaneously enriched.
Για το λόγο αυτό, η απομόνωση του R. solanacearum από εμπλουτισμένες καλλιέργειες ζωμού ενδέχεται να είναι δύσκολη.
For this reason, isolation of R.solanacearum from enriched broth cultures may be difficult.
Επιπροσθέτως, καθώς μπορεί να αυξηθούν οι πληθυσμοί ορολογικά σχετιζομένων βακτηρίων, συνιστάται η χρήση εξειδικευμένων μονοκλωνικών αντισωμάτων αντί πολυκλωνικών αντισωμάτων όσον αφορά τις περιπτώσεις που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί η δοκιμή ELISA.
In addition, since populations of serologically related saprophytes can be increased, the use of specific monoclonal antibodies rather than polyclonal antibodies is recommended where the ELISA test is to be used.
Όσον αφορά την PCR εμπλουτισμού, μεταφέρουμε 100 µl εκχυλίσματος δείγματος σε 10 ml ζωμού εμπλουτισμού (προσάρτημα 2) που έχει προηγουμένως τοποθετηθεί σε επιμέρους ίσες ποσότητες σε σωλήνες ή φιάλες απαλλαγμένες από DNA.
For enrichment-PCR, transfer 100 µl of sample extract into 10 ml of enrichment broth (Appendix 2) previously aliquoted into DNA-free tubes or flasks.
Για την ELISA εμπλουτισμού, είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν μεγαλύτερες αναλογίες εκχυλίσματος δείγματος σε σχέση με το ζωμό (π.χ. 100 µl σε 1,0 ml ζωμού εμπλουτισμού).
For enrichment-ELISA, higher proportions of sample extract to broth can be used (e.g. 100 µl in 1,0 ml of enrichment broth).
Επωάζουμε για 72 ώρες στους 27 έως 30 °C σε ανακινούμενη ή στατική καλλιέργεια διατηρώντας το καπάκι προσαρμοσμένο χαλαρά έτσι ώστε να είναι δυνατός ο αερισμός.
Incubate for 72 hours at 27 to 30 °C in shaking culture or static culture with caps loosely- fitted to permit aeration.
Αναμειγνύουμε καλά πριν από τη διεξαγωγή των δοκιμών ELISA ή PCR.
Mix well before using in ELISA or PCR tests.
Επεξεργαζόμαστε τον εμπλουτισμένο ζωμό με τον ίδιο τρόπο όπως το (τα) δείγμα(-τα) στις ανωτέρω δοκιμές.
Treat enriched broth in an identical manner as the sample(s) in the above tests.
Σημείωση: Εάν αναμένουμε παρεμπόδιση του εμπλουτισμού του R. solanacearum λόγω των υψηλών πληθυσμών ορισμένων ανταγωνιστικών σαπροφυτικών βακτηρίων, είναι δυνατόν να παραχθούν καλύτερα αποτελέσματα εάν εμπλουτισθούν τα εκχυλίσματα δείγματος πριν από οιαδήποτε φυγοκέντριση ή άλλες ενέργειες συγκέντρωσης.
Note: If inhibition of enrichment of R. solanacearum is anticipated, due to high populations of certain competing saprophytic bacteria, enrichment of sample extracts before any centrifugation or other concentration steps may give better results.
Δοκιμή IF
IF Test
Όταν η δοκιμή IF χρησιμοποιείται ως αρχική δοκιμή διαλογής και η ανάγνωση IF είναι θετική, πρέπει να πραγματοποιηθεί η δοκιμή απομόνωσης, PCR ή FISH ως δεύτερη δοκιμή διαλογής.
When the IF test is used as the principal screening test and the IF reading is positive, the Isolation, PCR or FISH test must be performed as a second screening test.
Σημείωση: Χρησιμοποιούμε επικυρωμένη πηγή αντισωμάτων του R. solanacearum (βλ. Ιστοχώρο http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
Note: Use a validated source of antibodies to R. solanacearum (see web site http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
Ως τίτλος ορίζεται η μεγαλύτερη αραίωση στην οποία λαμβάνει χώρα η βέλτιστη αντίδραση όταν υποβάλλεται σε δοκιμή αιώρημα που περιέχει 105 έως 106 κύτταρα ανά ml του ομόλογου στελέχους του R. solanacearum και χρησιμοποιείται κατάλληλο σύμπλοκο ισοθειοκυανικής φθορεϊσίνης (FITC) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή.
The titre is defined as the highest dilution at which optimum reaction occurs when testing a suspension containing 105 to 106 cells per ml of the homologous strain of R. solanacearum and using an appropriate fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugate according to the manufacturer’s recommendations.
Οι επικυρωμένοι πολυκλωνικοί αντιορροί πρέπει να έχουν τίτλο IF τουλάχιστον 1:2000.
Validated polyclonal antisera all had an IF titre of at least 1:2000.
Κατά τη διάρκεια της δοκιμής, τα αντισώματα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε αραίωση(-εις) εργασίας (WD) στον τίτλο ή κοντά στον τίτλο.
During testing, the antibodies should be used at a working dilution(s) close to or at the titre.
Η γλυκερίνη είναι δυνατόν να αφαιρεθεί από το δείγμα με την προσθήκη 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος ιζήματος (προσάρτημα 4), εκ νέου φυγοκέντριση για 15 λεπτά σε 7000 g και επανασχηματισμό αιωρήματος σε ίσο όγκο ρυθμιστικού διαλύματος ιζήματος.
Glycerol can be removed from the sample by addition of 1 ml pellet buffer (Appendix 4), re-centrifugation for 15 minutes at 7000 g and re-suspension in an equal volume of pellet buffer.
Συχνά αυτό δεν είναι αναγκαίο, ιδιαίτερα εάν τα δείγματα αντικειμενοφόρου έχουν προσηλωθεί στις αντικειμενοφόρους με διέλευση από φλόγα.
This is often not necessary, especially if samples are fixed to the slides by flaming.
Παρασκευάζονται ξεχωριστά ως θετικοί μάρτυρες αντικειμενοφόροι από ομόλογο στέλεχος ή άλλο στέλεχος αναφοράς του R. solanacearum, που είναι αιώρημα σε εκχύλισμα πατάτας, όπως περιγράφεται στο προσάρτημα 3 Β, και προαιρετικά σε ρυθμιστικό διάλυμα.
Prepare separate positive control slides of the homologous strain or any other reference strain of R. solanacearum, suspended in potato extract, as specified in Appendix 3 B, and optionally in buffer.
Ως παρόμοιοι μάρτυρες πρέπει να χρησιμοποιούνται, όποτε είναι δυνατόν, στην ίδια αντικειμενοφόρο, φυσικώς μολυσμένοι ιστοί (που διατηρούνται με λυοφιλίωση ή κατάψυξη στους –16 έως –24 °C).
Naturally infected tissue (maintained by lyophilisation or freezing at –16 to –24 °C) should be used where possible as a similar control on the same slide.
Ως αρνητικοί μάρτυρες είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν κατάλληλες ποσότητες εκχυλίσματος δείγματος που προηγουμένως είχε δοκιμαστεί και ήταν αρνητικό όσον αφορά το R. solanacearum.
As negative controls, aliquots of sample extract which previously tested negative for R. solanacearum can be used.
Στο προσάρτημα 3 παρατίθενται τυποποιημένα υλικά θετικών και αρνητικών μαρτύρων που διατίθενται προς χρήση στο πλαίσιο της εν λόγω δοκιμής.
Standardised positive and negative control materials available for use with this test are listed in Appendix 3.
Στο πρώτο φατνίο, φέρεται μετρημένος με σιφώνιο συγκεκριμένος όγκος (15 µl είναι αρκετός για φατνία με διάμετρο 6 mm - ο όγκος κλιμακώνεται προς τα άνω για μεγαλύτερα φατνία) αραίωσης 1/100 του αιωρήματος του ιζήματος πατάτας.
Pipette a measured standard volume (15 µl is appropriate for 6 mm window diameter – scale up volume for larger windows) of a 1/100 dilution of the resuspended potato pellet onto the first window.
Παρασκευάζονται δεκαδικές αραιώσεις (1/10 και 1/100) του αιωρήματος του ιζήματος σε ρυθμιστικό διάλυμα ιζήματος.
Prepare decimal dilutions (1/10, 1/100) of the resuspended pellet in pellet buffer.
Σε μία σειρά φατνίων, φέρεται μετρημένος με σιφώνιο συγκεκριμένος όγκος (15 µl είναι αρκετός για φατνία με διάμετρο 6 mm - ο όγκος κλιμακώνεται προς τα άνω για μεγαλύτερα φατνία) του αιωρήματος του ιζήματος και κάθε αραίωση.
Pipette a measured standard volume (15 µl is appropriate for 6 mm window diameter – scale up volume for larger windows) of the resuspended pellet and each dilution on a row of windows.
Τα σταγονίδια στεγνώνονται σε θερμοκρασία εργαστηρίου ή με θέρμανση σε θερμοκρασίες 40 έως 45 °C.
Dry the droplets at ambient temperature or by warming to temperatures of 40 to 45 °C.
Εάν είναι απαραίτητο, οι προσηλωμένες αντικειμενοφόροι είναι δυνατόν να φυλαχθούν στη συνέχεια στην κατάψυξη σε αφυδατωμένο δοχείο για όσο το δυνατόν μικρότερο χρονικό διάστημα (το μέγιστο για 3 μήνες) προτού υποβληθούν σε περαιτέρω δοκιμές.
If necessary, fixed slides may then be stored frozen in a desiccated box for as little time as necessary (up to a maximum of three months) prior to further testing.
Διαδικασία IF
IF procedure
Σύμφωνα με την προετοιμασία της αντικειμενοφόρου δοκιμής στο σημείο 5.1.i): Παρασκευάζεται μία σειρά αραιώσεων στο διπλάσιο.
According to test slide preparation in 5.1(i):
Το πρώτο φατνίο πρέπει να έχει 1/2 του τίτλου (T/2), τα υπόλοιπα 1/4 του τίτλου (T/4), 1/2 του τίτλου (T/2), τον τίτλο (T) και το διπλάσιο του τίτλου (2T).
Prepare a set of twofold dilutions The first well should have 1/2 of the titre (T/2), the others 1/4 of the titre (T/4), 1/2 of the titre (T/2), the titre (T) and twice the titre (2T).
Σύμφωνα με την ετοιμασία της αντικειμενοφόρου προς δοκιμή στο σημείο 5.1.ii):
According to test slide preparation in 5.1(ii):
Προετοιμασία της αντικειμενοφόρου δοκιμής σύμφωνα με τα σημεία 5.1.i) και 5.3.i)
Preparation of the test slide according to 5.1(i) and 5.3(i)
Οι αντικειμενοφόροι πλάκες διευθετούνται πάνω σε ένυγρο απορροφητικό χαρτί.
Arrange the slides on moist tissue paper.
Κάθε φατνίο δοκιμής καλύπτεται πλήρως με την ή τις αραιώσεις αντισώματος.
Cover each test window completely with the antibody dilution(s).
Οι αντικειμενοφόροι επωάζονται σε ένυγρο χαρτί κάτω από ένα κάλυμμα για 30 λεπτά σε θερμοκρασία εργαστηρίου (18-25 °C).
Incubate the slides on moist paper under a cover for 30 minutes at ambient temperature (18 to 25 °C).
Πλένονται με βύθισμα για 5 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα IF-Tween (προσάρτημα 4) και στη συνέχεια σε ρυθμιστικό διάλυμα IF.
Wash by submerging for five minutes in IF buffer-Tween (Appendix 4) and subsequently in IF buffer.
Οι αντικειμενοφόροι ξεπλένονται και πλένονται όπως προηγουμένως (5.3.3).
Rinse and wash as before (5.3.3).
Σε κάθε φατνίο φέρονται με σιφώνιο 5-10 µl 0,1 Μ φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος γλυκερίνης (προσάρτημα 4) ή εμπορικού αντιξεθωριαστικού υλικού έγκλεισης και τα φατνία καλύπτονται με μία καλυπτρίδα.
Pipette 5 - 10 µl of 0,1M phosphate-buffered glycerol (Appendix 4) or a commercially antifading mountant on each window and apply a coverslip.
Οι αντικειμενοφόροι πλάκες δοκιμής εξετάζονται σε μικροσκόπιο επιφθορισμού με φίλτρα κατάλληλα για τη διέγερση του FITC, με ελαιο- ή υδατοκαταδυτικό φακό σε μεγέθυνση 500-1000 x.
Examine test slides on an epifluorescence microscope with filters suitable for excitation of FITC, under oil or water immersion at a magnification of 500-1000.
Τα φατνία εξετάζονται κατά δύο κάθετες διαμέτρους και στην περίμετρό τους.
Scan windows across two diameters at right angles and around the perimeter.