natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Απομακρύνονται οι καλυπτρίδες από τις αντικειμενοφόρους πλάκες και οι αντικειμενοφόροι πλάκες τοποθετούνται στον υποδοχέα αντικειμενοφόρων.
Remove the coverslips from the slides and place the slides in a slide holder.
Ξεπλένεται η περίσσεια ανιχνευτού με επώαση για 15 λεπτά στο ποτήρι ζέσεως με 1x hybmix στους 55 °C.
Wash away excess probe by incubation for 15 mins. in the beaker with 1x hybmix at 55 °C.
Ο υποδοχέας αντικειμενοφόρων πλακών μεταφέρεται σε διάλυμα πλυσίματος 1/2 hybmix και επωάζουμε για 15 λεπτά ακόμη.
Transfer the slide holder to 1/2 hybmix washing solution and incubate for a further 15 mins.
Οι αντικειμενοφόροι πλάκες βυθίζονται για σύντομο χρονικό διάστημα σε UPW και τοποθετούνται σε διηθητικό χαρτί.
Dip the slides briefly in UPW and place them on filter paper.
Η περίσσεια υγρασίας απομακρύνεται καλύπτοντας την επιφάνεια απαλά με διηθητικό χαρτί.
Remove excess moisture by covering the surface gently with filter paper.
Προστίθενται με σιφώνιο 5-10 μl αντιξεθωριαστικού διαλύματος έγκλεισης (e.g. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA ή ισοδύναμα) σε κάθε φατνίο και εφαρμόζεται μεγάλη καλυπτρίδα (24 × 60 mm) σε ολόκληρη την αντικειμενοφόρο πλάκα.
Pipette 5 to 10 μl of anti-fading mountant solution (e.g. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA or equivalent) on each window and apply a large coverslip (24 × 60 mm) over the whole slide.
Ανάγνωση της δοκιμής FISH
Reading the FISH test
Εξετάζονται οι αντικειμενοφόροι πλάκες αμέσως με μικροσκόπιο προσαρμοσμένο για μικροσκοπία επιφθορισμού σε μεγένθυση 630 ή 1000x με έλαιο κατάδυσης.
Observe the slides immediately with a microscope fitted for epifluorescence microscopy at 630 or 1000x magnification under immersions oil.
Με φίλτρο κατάλληλο για ισοθειοκυανική φθορεϊσίνη (FITC), τα ευβακτηριακά κύτταρα (συμπεριλαμβανομένων των περισσοτέρων αρνητικών κατά Gram κυττάρων) στο δείγμα είναι χρωσμένα πράσινα φθορίζοντα.
With a filter suitable for fluorescein isothiocyanate (FITC) eubacterial cells (including most gram negative cells) in the sample are stained fluorescent green.
Εάν χρησιμοποιηθεί φίλτρο 5-ισοθειοκυανικής τετραμεθυλοροδαμίνης, τα κύτταρα του C. m. subsp. sepedonicus που έχουν χρωσθεί με Cy3 εμφανίζονται φθορίζοντα κόκκινα. Συγκρίνεται η μορφολογία των κυττάρων με αυτή των θετικών μαρτύρων.
Using a filter for tetramethylrhodamine-5-isothiocyanate, Cy3-stained cells of C. m. subsp. sepedonicus appear fluorescent red.
Τα κύτταρα πρέπει να είναι πλήρως χρωσμένα με λαμπρό φθορισμό.
Compare cell morphology with that of the positive controls.
Η δοκιμή FISH (ενότητα 9.4) πρέπει να επαναληφθεί αν η χρώση παρεκκλίνει.
Cells must be bright fluorescent and completely stained The FISH test (section 9.4) must be repeated if the staining is aberrant.
Η ένταση του φθορισμού πρέπει να είναι ισοδύναμη ή καλύτερη από αυτήν της χρώσης των θετικών μαρτύρων.
The fluorescence intensity must be equivalent or better than that of the positive control strain.
Υπάρχουν διάφορα προβλήματα σύμφυτα με την εξειδίκευση της δοκιμής FISH.
There are several problems inherent to the specificity of the FISH test.
Τα ιζήματα των κώνων από τα σημεία πρόσφυσης του στολονίου και των τμημάτων των στελεχών ενδέχεται να περιέχουν αν και λιγότερο συχνά απ’ότι στη δοκιμή IF πληθυσμούς φθοριζόντων κυττάρων μη τυπικής μορφολογίας καθώς και μη ειδικώς αντιδρώντα σαπροφυτικά βακτήρια όμοιου μεγέθους και μορφολογίας με το C. m. sepedonicus.
Background populations of fluorescing cells with atypical morphology and cross reacting saprophytic bacteria with size and morphology similar to C. m. subsp. sepedonicus may occur, although much less frequent than in the IF test, in potato heel end core and stem segment pellets.
Λαμβάνονται υπόψη μόνον τα φθορίζοντα κύτταρα με τυπικό μέγεθος και μορφολογία, βλέπε 5.3.2.
Consider only fluorescing cells with typical size and morphology, see in 5.3.2.
Ερμηνεία των αποτελεσμάτων των δοκιμών FISH
Interpretation of the FISH test result:
Έγκυρα αποτελέσματα από τη δοκιμή FISH παρέχονται όταν, χρησιμοποιώντας φίλτρο FITC, παρατηρούνται κύτταρα που είναι χρωσμένα με λαμπρό φθορίζον πράσινο χρώμα και διαθέτουν το τυπικό μέγεθος και μορφολογία του C. m. subsp. sepedonicus και όταν, χρησιμοποιώντας φίλτρο ροδαμίνης, παρατηρούνται κύτταρα χρωσμένα με λαμπρό φθορίζον κόκκινο χρώμα σε όλους τους θετικούς μάρτυρες και σε κανέναν αρνητικό μάρτυρα.
Valid FISH test results are obtained if bright green fluorescent cells of size and morphology typical of C. m. subsp. sepedonicus are observed using the FITC filter and if bright red fluorescent cells using the rhodamine filter in all positive controls and not in any of the negative controls.
Τα δείγματα με τουλάχιστον 5 × 103 τυπικά κύτταρα ανά ml αναδιαλυμένου ιζήματος θεωρούνται ενδεχομένως μολυσμένα.
Samples with at least 5 × 103 typical cells per ml of resuspended pellet are considered potentially contaminated.
Απαιτείται η διεξαγωγή περαιτέρω δοκιμών.
Further testing is required.
Τα δείγματα με λιγότερα από 5 × 103 τυπικά κύτταρα ανά ml αναδιαλυμένου ιζήματος θεωρούνται αρνητικά.
Samples with less than 5 × 103 typical cells per ml of resuspended pellet are considered negative.
Η δοκιμή FISH είναι αρνητική εάν κύτταρα χρωσμένα με λαμπρό φθορίζον κόκκινο χρώμα, τυπικό μέγεθος και μορφολογία του C. m. subsp. sepedonicus, δεν παρατηρούνται με φίλτρο ροδαμίνης, υπό την προϋπόθεση ότι τυπικά κύτταρα χρωσμένα με λαμπρό φθορίζον κόκκινο χρώμα παρατηρούνται στα παρασκευάσματα θετικών μαρτύρων όταν χρησιμοποιείται φίλτρο ροδαμίνης.
The FISH test is negative if bright red fluorescent cells with size and morphology typical of C. m. subsp. sepedonicus are not observed using the rhodamine filter, provided that typical bright red fluorescent cells are observed in the positive control preparations when using the rhodamine filter.
Όταν η δοκιμή PCR χρησιμοποιείται ως αρχική δοκιμή διαλογής και έχει θετικά αποτελέσματα, πρέπει να πραγματοποιηθεί η δοκιμή IF ως δεύτερη υποχρεωτική δοκιμή διαλογής.
When the PCR test is used as the principal screening test and found to be positive, the IF test must be performed as a second compulsory screening test.
Όταν η δοκιμή PCR χρησιμοποιείται ως δεύτερη δοκιμή διαλογής και έχει θετικά αποτελέσματα, απαιτείται διεξαγωγή περαιτέρω δοκιμών σύμφωνα με το διάγραμμα ροής για την ολοκλήρωση της διάγνωσης.
When the PCR test is used as the second screening test and found to be positive, further testing according to the flow scheme is required to complete the diagnosis.
Η πλήρης αξιοποίηση της μεθόδου αυτής ως αρχικής δοκιμής διαλογής συνιστάται μόνον όταν έχει αποκτηθεί εξειδικευμένη εμπειρία
Full exploitation of this method as principal screening test is only recommended when specialised expertise has been acquired.
Οι προκαταρκτικές δοκιμές με τη μέθοδο αυτή πρέπει να επιτρέπουν την αναπαραγώγιμη ανίχνευση τουλάχιστον 103 έως 104 κυττάρων του C. m. subsp. sepedonicus ανά ml που προστίθεται σε εκχυλίσματα δειγμάτων που προηγούμενως έδειξαν αρνητικά αποτελέσματα.
Preliminary testing with this method should permit reproducible detection of 103 to 104 cells of C. m. subsp. sepedonicus per ml added to sample extracts which previously tested negative.
Μπορεί να χρειασθούν πειράματα αριστοποίησης για την επίτευξη των μέγιστων επιπέδων ευαισθησίας και εξειδίκευσης σε όλα τα εργαστήρια.
Optimisation experiments may be required to achieve maximum levels of sensitivity and specificity in all laboratories.
Χρησιμοποιούνται επικυρωμένα αντιδραστήρια και πρωτόκολλα PCR.
Use validated PCR reagents and protocols.
Επιλέγεται κατά προτίμηση μέθοδος με εσωτερικό μάρτυρα.
Preferably select a method with an internal control.
Λαμβάνονται οι κατάλληλες προφυλάξεις ώστε να αποφευχθεί η μόλυνση του δείγματος με DNA στόχο.
Use appropriate precautions to avoid contamination of sample with target DNA.
Η δοκιμή PCR θα πρέπει να πραγματοποιείται από πεπειραμένους τεχνικούς, σε καθιερωμένα εργαστήρια μοριακής βιολογίας, έτσι ώστε να ελαχιστοποιηθεί η πιθανότητα μόλυνσης με DNA στόχο.
The PCR test should be performed by experienced technicians, in dedicated molecular biology laboratories, in order to minimise the possibility of contamination with target DNA.
Οι αρνητικοί μάρτυρες πρέπει πάντοτε (εξαγωγή DNA και PCR) να χειρίζονται ως τελικό δείγμα στη διαδικασία, έτσι ώστε να καθίσταται φανερή ενδεχόμενη μεταφορά DNA.
Negative controls (for DNA extraction and PCR procedures) should always be handled as final samples in the procedure, to make evident whether any carry over of DNA has occurred.
Στη δοκιμή PCR πρέπει να περιλαμβάνονται οι ακόλουθοι αρνητικοί μάρτυρες:
The following negative controls should be included in the PCR test:
εκχύλισμα δείγματος που προηγουμένως ήταν αρνητικό στη δοκιμή για το C. m. subsp. sepedonicus,
sample extract that previously tested negative for C. m. subsp. Sepedonicus,
μάρτυρες ρυθμιστικών διαλυμάτων που χρησιμοποιούνται για την εξαγωγή του βακτηρίου και του DNA από το δείγμα,
buffer controls used for extracting the bacterium and the DNA from the sample,
μείγμα αντίδρασης PCR.
PCR-reaction mix.
Πρέπει να περιλαμβάνονται οι ακόλουθοι θετικοί μάρτυρες:
The following positive controls should be included:
κατάλληλες ποσότητες αναδιαλυμένων ιζημάτων στις οποίες έχει προστεθεί το C. m. subsp. sepedonicus (για την παρασκευή βλέπε προσάρτημα 2),
aliquots of resuspended pellets to which C. m. subsp. sepedonicus has been added (preparation see Appendix 2),
αιώρημα 106 κυττάρων ανά ml νερού παθογόνου απομόνωσης του C. m. subsp. sepedonicus (π.χ. NCPPB 2140 ή NCPPB 4053),
a suspension of 106 cells per ml of C. m. subsp. sepedonicus in water from a virulent isolate (e.g. NCPPB 2140 or NCPPB 4053),
εάν είναι δυνατόν, χρησιμοποιείται επίσης DNA από δείγματα θετικών μαρτύρων κατά τη διενέργεια της δοκιμής PCR.
if possible also use DNA extracted from positive control samples in the PCR test.
Για την αποφυγή πιθανής μόλυνσης παρασκευάζονται θετικοί μάρτυρες σε ξεχωριστό περιβάλλον από τα δείγματα προς δοκιμή.
To avoid potential contamination prepare positive controls in a separate environment from samples to be tested.
Τα εκχυλίσματα δείγματος πρέπει να έχουν απαλλαγεί στο μέγιστο δυνατό βαθμό από χώματα.
Sample extracts should be as free as possible from soil.
Για το λόγο αυτό, συστήνεται σε ορισμένες περιπτώσεις να προετοιμάζονται οι εξαγωγές από πλυμένες πατάτες εάν πρόκειται να χρησιμοποιηθούν πρωτόκολλα PCR.
It could therefore in certain cases advisible to prepare extractions from washed potatoes if PCR protocols are to be used.
Μέθοδοι καθαρισμού DNA
DNA purification methods
Χρησιμοποιούνται δείγματα θετικών και αρνητικών μαρτύρων όπως περιγράφηκε παραπάνω.
Use positive and negative control samples as described above.
Η παρασκευή του υλικού των μαρτύρων γίνεται με τον ίδιο τρόπο όπως εκείνη του ή των δειγμάτων.
Prepare control material in an identical manner as the sample(s).
Υπάρχουν διάφορες διαθέσιμες μέθοδοι για τον καθαρισμό του DNA στόχου από σύνθετα υποστρώματα δειγμάτων, απομακρύνοντας κατ’ αυτόν τον τρόπο τους παρεμποδιστές της PCR και άλλων ενζυματικών αντιδράσεων και συγκεντρώνοντας το DNA στόχο στο εκχύλισμα δείγματος.
A variety of methods are available for purification of target DNA from complex sample substrates, thus removing inhibitors of PCR and other enzymatic reactions and concentrating target DNA in the sample extract.
Η ακόλουθη μέθοδος έχει βελτιστοποιηθεί με σκοπό τη χρήση με την επικυρωμένη μέθοδο PCR που περιγράφεται στο προσάρτημα 6.
The following method has been optimised for use with the validated PCR method shown in Appendix 6.
Μέθοδος Pastrik (2000):
6.1.(a) Method according to Pastrik (2000)
Προστίθενται με σιφώνιο 220 µl ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) σε σωλήνα Eppendorf 1,5 ml.
Pipette 220 µl of lysis buffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) into a 1,5 ml Eppendorf tube.
Προστίθενται 100 µl εκχυλίσματος δείγματος και τοποθετούνται σε θερμικό μπλοκ ή υδατόλουτρο σε θερμοκρασία 95 °C για 10 λεπτά.
Add 100 µl sample extract and place in a heating block or waterbath at 95 °C for 10 minutes.
Ο σωλήνας τοποθετείται σε πάγο για 5 λεπτά.
Put tube on ice for five minutes.
Προστίθενται 80 µl πυκνού διαλύματος λυσοζύμης (50 mg λυσοζύμη ανά ml σε 10 mM Tris HCl, pH 8,0) και επωάζονται στους 37 °C για 30 λεπτά.
Add 80 µl Lysozyme stock solution (50 mg lysozyme per ml in 10 mM Tris HCl, pH 8,0) and incubate at 37 °C for 30 minutes.
Προστίθενται 220 µl διαλύματος Α Easy DNA® (Invitrogen), αναμειγνύονται καλά σε συσκευή vortex και επωάζονται στους 65 °C για 30 λεπτά.
Add 220 µl of Easy DNA® solution A (Invitrogen), mix well by vortexing and incubate at 65 °C for 30 minutes.
Προστίθενται 100 µl διαλύματος Β Easy DNA® (Invitrogen), αναμειγνύονται με ένταση σε συσκευή vortex έως ότου το ίζημα να ρέει ελεύθερα στο σωλήνα και το δείγμα να είναι ομοιόμορφα ιξώδες.
Add 100 µl of Easy DNA® solution B (Invitrogen), vortex vigorously until the precipitate runs freely in the tube and the sample is uniformly viscous.
Προστίθενται 500 µl χλωροφόρμιου και αναμειγνύουμε με στροβιλισμό (vortex) έως ότου μειωθεί το ιξώδες και το μείγμα είναι ομοιογενές.
Add 500 µl of chloroform and vortex until the viscosity decreases and the mixture is homogeneous.
Ακολουθεί φυγοκέντριση σε 15000 g για 20 λεπτά σε θερμοκρασία 4 °C για το διαχωρισμό των φάσεων και τη δημιουργία της ενδιάμεσης φάσης.
Centrifuge at 15000 g for 20 minutes at 4 °C to separate phases and form the interphase.
Η άνω φάση μεταφέρεται σε νέο σωλήνα Eppendorf.
Transfer the upper phase into a fresh Eppendorf tube.
Προστίθεται 1 ml από 100 % αιθανόλη (–20 °C), αναμειγνύεται με στροβιλισμό (vortex) για σύντομο χρονικό διάστημα και επωάζεται σε πάγο για 10 λεπτά.
Add 1 ml of 100 % ethanol (–20 °C) vortex briefly and incubate on ice for 10 minutes.
Φυγοκεντρείται σε 15000 g για 20 λεπτά στους 4 °C και απομακρύνεται η αιθανόλη από το ίζημα.
Centrifuge at 15000 g for 20 minutes at 4 °C and remove ethanol from pellet.
Προστίθενται 500 µl 80 % αιθανόλης (–20 °C) και αναμειγνύουμε αναποδογυρίζοντας το σωλήνα.
Add 500 µl 80 % ethanol (–20 °C) and mix by inverting the tube.
Ακολουθεί φυγοκέντριση σε 15000 g για 10 λεπτά στους 4 °C διατηρείται το ίζημα και απομακρύνεται η αιθανόλη.
Centrifuge at 15000 g for 10 minutes at 4 °C, save the pellet and remove ethanol.
Αφήνουμε το ίζημα να στεγνώσει στον αέρα ή σε DNA Speed Vac.
Allow the pellet to dry in air or in a DNA speed vac.
Το ίζημα αναδιαλύεται σε 100 µl αποστειρωμένου UPW και αφήνεται σε θερμοκρασία δωματίου για τουλάχιστον 20 λεπτά.
Resuspend the pellet in 100 µl sterile UPW and leave at room temperature for at least 20 minutes.
Αποθηκεύεται στους –20 °C έως ότου χρειασθεί να χρησιμοποιηθεί για την PCR.
Store at –20 °C until required for PCR.
Καθιζάνεται με φυγοκέντριση οιοδήποτε λευκό ίζημα και χρησιμοποιούνται 5 µl του υπερκείμενου υγρού που περιέχει DNA για την PCR.
Spin down any white precipitate by centrifugation and use 5 µl of the supernatant containing DNA for the PCR.
Τα προς δοκιμή πρότυπα και εκείνα των μαρτύρων παρασκευάζονται για την PCR σύμφωνα με το επικυρωμένο πρωτόκολλο (προσάρτημα 6).
Prepare test and control templates for PCR according to the validated protocol (Appendix 6).
Παρασκευάζεται μια δεκαδική αραίωση εκχυλίσματος DNA δείγματος (1:10 σε UPW).
Prepare one decimal dilution of sample DNA extract (1:10 in UPW).
Παρασκευάζεται το κατάλληλο μείγμα αντίδρασης PCR σε περιβάλλον απαλλαγμένο από μολύνσεις σύμφωνα με το δημοσιευμένο πρωτόκολλο (προσάρτημα 6).
Prepare the appropriate PCR reaction mix in a contamination-free environment according to the published protocol (Appendix 6).
Το επικυρωμένο πρωτόκολλο PCR είναι μια πολλαπλή αντίδραση που ενσωματώνει επίσης έναν εσωτερικό μάρτυρα PCR.
The validated PCR protocol is a multiplex reaction that also incorporates an internal PCR control.
Προσθέτουμε 5 µl εκχυλίσματος DNA ανά 25 µl αντίδρασης PCR σε αποστειρωμένους σωλήνες PCR.
Add 5 µl of DNA extract per 25 µl PCR reaction in sterile PCR tubes.
Ενσωματώνεται δείγμα αρνητικού μάρτυρα που περιέχει μόνον μείγμα αντίδρασης PCR και προστίθεται η ίδια πηγή UPW που χρησιμοποιήθηκε στο μείγμα PCR αντί για δείγμα.
Incorporate a negative control sample containing only PCR reaction mix and add the same source of UPW as used in the PCR mix in place of sample.
Οι σωλήνες τοποθετούνται στον ίδιο θερμικό κυκλοποιητή που χρησιμοποιήθηκε στην προκαταρκτική δοκιμή και αρχίζει το καταλλήλως βελτιστοποιημένο πρόγραμμα PCR (προσάρτημα 6).
Place tubes in the same thermal cycler which was used in preliminary testing and run the appropriately optimised PCR programme (Appendix 6).
Ανάλυση του προϊόντος PCR
Analysis of the PCR product
Τα αμπλικόνια της PCR αναλύονται με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης.
Resolve PCR amplicons by agarose gel electrophoresis.
Τοποθετούνται για μετακίνηση τουλάχιστον 12 µl μείγματος αντίδρασης ενισχυμένου DNA από κάθε δείγμα αναμεμειγμένα με 3 µl ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης (προσάρτημα 6) σε 2,0 % (β/ο) πηκτές αγαρόζης σε ρυθμιστικό διάλυμα τρις-Οξικού-EDTA (TAE) (προσάρτημα 6) σε 5-8 V ανά cm.
Run at least 12 µl of amplified DNA reaction mixture from each sample mixed with 3 µl loading buffer (Appendix 6) in 2,0 % (w/v) agarose gels in tris-acetate-EDTA (TAE) buffer (Appendix 6) at 5 to 8 V per cm.
Χρησιμοποιείται ένας κατάλληλος δείκτης μοριακών βαρών (MW) DNA, π.χ. 100 bp ladder.
Use an appropriate DNA marker, e.g. 100 bp ladder.
Οι ζώνες DNA αποκαλύπτονται διά χρώσεως σε βρωμιούχο αιθίδιο (0,5 mg ανά L) για 30-45 λεπτά λαμβάνοντας τις απαραίτητες προφυλάξεις κατά το χειρισμό αυτού του μεταλλαξιογόνου.
Reveal DNA bands by staining in ethidium bromide (0,5 mg per L) for 30 to 45 min taking appropriate precautions for handling this mutagen.
Η χρωσμένη πηκτή εξετάζεται υπό υπεριώδη ακτινοβολία μικρού μήκους κύματος (π.χ. λ = 302 nm) για ενισχυμένα προϊόντα PCR του αναμενόμενου μεγέθους (προσάρτημα 6) και σημειώνονται τα αποτελέσματα.
Observe stained gel under short wave UV transillumination (e.g. λ = 302 nm) for amplified PCR products of the expected size (Appendix 6) and document.
Για όλα τα νέα ευρήματα/περιπτώσεις, επιβεβαιώνεται η αυθεντικότητα του αμπλικονίου PCR με την πραγματοποίηση ανάλυσης με ένζυμο περιορισμού σε δείγμα του εναπομείναντος ενισχυμένου DNA με επώαση στη βέλτιστη θερμοκρασία και χρόνο με το κατάλληλο ένζυμο και ρυθμιστικό διάλυμα (βλέπε προσάρτημα 6).
For all new findings/cases verify authenticity of the PCR amplicon by performing restriction enzyme analysis on a sample of the remaining amplified DNA by incubating at the optimum temperature and time with an appropriate enzyme and buffer (see Appendix 6).
Τα τμήματα που υπέστησαν πέψη αναλύονται με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης όπως προηγουμένως και παρατηρείται υπό υπεριώδη ακτινοβολία το χαρακτηριστικό πρότυπο του θραύσματος περιορισμού μετά τη χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο και συγκρίνεται με το θετικό μάρτυρα που δεν υπέστη πέψη και το θετικό μάρτυρα που υπέστη πέψη.
Resolve the digested fragments by agarose gel electrophoresis as before and observe characteristic restriction fragment pattern under UV transillumination after ethidium bromide staining and compare with the undigested and digested positive control.
Ερμηνεία των αποτελεσμάτων των δοκιμών PCR:
Interpretation of the PCR test result:
Η δοκιμή PCR είναι αρνητική εάν το αναμενόμενου μεγέθους, ειδικό για το C. m. subsp. sepedonicus αμπλικόνιο PCR δεν ανιχνευθεί για το εν λόγω δείγμα αλλά ανιχνευθεί για όλα τα δείγματα θετικών μαρτύρων (στην περίπτωση πολλαπλής PCR με εκκινητές εσωτερικών μαρτύρων ειδικούς για φυτά: πρέπει να ενισχυθεί ένα δεύτερο, αναμενόμενου μεγέθους, προϊόν PCR με το εν λόγω δείγμα).
The PCR test is negative if the C. m. subsp. sepedonicus-specific PCR amplicon of expected size is not detected for the sample in question but is detected for all positive control samples (in case of multiplex PCR with plant specific internal control primers: a second PCR-product of expected size must be amplified with the sample in question).
Η δοκιμή PCR είναι θετική εάν ανιχνευθεί το ειδικό για το C. m. subsp. sepedonicus αμπλικόνιο της PCR στο αναμενόμενο μέγεθος και πρότυπο περιορισμού (όταν αυτό απαιτείται), εφόσον δεν έχει ενισχυθεί από οιοδήποτε εκ των δειγμάτων αρνητικών μαρτύρων.
The PCR test is positive if the C. m. subsp. sepedonicus-specific PCR amplicon of expected size and restriction pattern (when required) is detected, providing that it is not amplified from any of the negative control samples.
Η αξιόπιστη επιβεβαίωση τυχόν θετικού αποτελέσματος είναι δυνατόν να επιτευχθεί επίσης με την επανάληψη της δοκιμής με δεύτερο σετ εκκινητών PCR (ενότητα 9.3).
Reliable confirmation of a positive result can also be obtained by repeating the test with a second set of PCR primers (section 9.3).
Ενδέχεται να υπάρξουν υπόνοιες για παρεμπόδιση της PCR εάν το αναμενόμενο αμπλικόνιο αποκτηθεί από δείγμα θετικού μάρτυρα που περιέχει C. m. subsp. sepedonicus σε ύδωρ αλλά προκύψουν αρνητικά αποτελέσματα από τους θετικούς μάρτυρες με C. m. subsp. sepedonicus σε εκχύλισμα πατάτας.
Inhibition of the PCR may be suspected if the expected amplicon is obtained from the positive control sample containing C. m. subsp. sepedonicus in water but negative results are obtained from positive controls with C. m. subsp. sepedonicus in potato extract.
Στα πρωτόκολλα πολλαπλής PCR με εσωτερικούς ελέγχους PCR, υπάρχει ένδειξη για παρεμπόδιση της αντίδρασης εάν δεν προκύψει κανένα από τα δύο αμπλικόνια.
In multiplex PCR protocols with internal PCR controls, inhibition of the reaction is indicated when neither of the two amplicons are obtained.
Υπάρχει υπόνοια για επιμόλυνση εάν το αναμενόμενο αμπλικόνιο προκύψει από έναν ή περισσότερους αρνητικούς μάρτυρες.
Contamination may be suspected if the expected amplicon is obtained from one or more of the negative controls.
ΒΙΟΔΟΚΙΜΗ
BIOASSAY TEST
Οι προκαταρκτικές δοκιμές με τη μέθοδο αυτή θα πρέπει να καθιστούν δυνατή την αναπαραγώγιμη ανίχνευση 103 έως 104 μονάδων του C. m. subsp. sepedonicus που σχηματίζουν αποικίες ανά ml που προστίθεται σε εκχυλίσματα δειγμάτων που προηγουμένως ήταν αρνητικά στις δοκιμές (για την παρασκευή βλέπε προσάρτημα 2).
Preliminary testing with this method should permit reproducible detection of 103 to 104 colony-forming units of C. m. subsp. sepedonicus per ml added to sample extracts that previously tested negative (preparation see Appendix 2).
Η ύψιστη ευαισθησία της ανίχνευσης μπορεί να αναμένεται όταν χρησιμοποιείται εκχύλισμα δείγματος που έχει μόλις παρασκευασθεί και υπάρχουν οι βέλτιστες συνθήκες ανάπτυξης.
Highest sensitivity of detection can be expected when using freshly prepared sample extract and optimal growth conditions.
Ωστόσο, η μέθοδος μπορεί να εφαρμοσθεί επιτυχώς σε εκχυλίσματα που έχουν αποθηκευθεί σε γλυκερίνη στους –68 έως –86 °C.
However, the method can be successfully applied to extracts that have been stored under glycerol at –68 to –86 °C.
Ορισμένες ποικιλίες φυτών μελιτζάνας αποτελούν εξαιρετικό υπόστρωμα εκλεκτικού εμπλουτισμού για την ανάπτυξη του C. m. subsp. sepedonicus ακόμη και ελλείψει συμπτωμάτων και αποτελούν εξαιρετική δοκιμή επιβεβαίωσης στον ξενιστή.
Some varieties of eggplant provide an excellent selective enrichment medium for the growth of C. m. subsp. sepedonicus even in the absence of symptoms and also provide an excellent confirmatory host test.
Οι συνθήκες ανάπτυξης πρέπει να είναι βέλτιστες έτσι ώστε να είναι μειωμένος ο κίνδυνος λανθασμένων αρνητικών αποτελεσμάτων της δοκιμής.
Growth conditions should be optimal to reduce the risk of false negative test results.
Για τον τρόπο καλλιέργειας, βλέπε προσάρτημα 8.
For cultural details, see Appendix 8.
Διανέμεται το σύνολο της εναπομείνασας κατάλληλης ποσότητας δοκιμής στο αναδιαλυμένο ίζημα της ενότητας 3.1.6 ή 3.2.5 μεταξύ φυτών μελιτζάνας με μία από τις μεθόδους που δίδονται παρακάτω (7.3 ή 7.4).
Distribute the whole of the remaining test aliquot of the resuspended pellet from section 3.1.6 or 3.2.5 between eggplants by one of the methods given below (7.3 or 7.4).
Χρησιμοποιούνται μόνον τα φυτά στο στάδιο του 2-3 πραγματικού φύλλου έως την πλήρη ανάπτυξη του τρίτου πραγματικού φύλλου.
Use only plants at leaf stage two to three up to full expansion of the third true leaf.