natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Grænsen på 1 % omfatter usikkerheden i forbindelse med reproducerbarhed.
In the case of long series of analyses the use of a cooled sample tray in the automatic injector is desirable
Absorbans (220 nm)
Note: 8.4.2. may be omitted if the % B at initial conditions is known from previous analyses.
Tid (minutter)
The chromatogram of the reference sample [5] should be analogous to Figure.
Outline of collaborative study procedure.«
In this figure the CMPA peak is preceded by two small peaks.
Følgende bilag tilføjes:
It is essential to obtain a similar separation.
BILAG VI
Prior to chromatographic determination of the samples inject 100 μl of the standard sample without rennet whey [0] (5.4.1)
Analysemetoder for smør i privat oplagring
The chromatogram should not show a peak at the retention time of the CMPA peak.
Fedtfri tørstof, (ekskl. salt)
Determine the response factors R by injecting the same volume of filtrate (8.5.1) as used for the samples.
Metoden, der anvendes, skal godkendes af betalingsorganet.
Calculation of the response factor R:
BILAG VII
CMPA peak: R = W/H
Analysemetoder for skummetmælkspulver i privat oplagring
R = the response factor of the CMPA peak
BILAG VIII
H = the height of the CMPA peak
Den i tillægget fastsatte referenceanalysemetode skal benyttes for at sikre, at ost udelukkende fremstillet af fåre-, gede- eller bøffelmælk eller af blandinger af fåre-, gede- og bøffelmælk ikke indeholder komælkskasein.
Calculation of the percentage of rennet whey powder in the sample
Komælkskasein anses for at være til stede, hvis indholdet af komælkskasein i den analyserede prøve er lig med eller overstiger indholdet i referenceprøven med 1 % komælk, jf. tillægget.
W(E) = the percentage (m/m) of rennet whey in the sample (E).
der ikke forekommer falsk positive resultater
If W(E) is greater than 1 % and the difference between the retention time and that of the standard sample [5] is smaller than 0,2 minutes then rennet whey solids are present.
komælkskaseinet er påviseligt med den fornødne følsomhed selv efter lange modningsperioder, som det kan være tilfældet under almindelige handelsforhold.
Not determined.
Hvis et af ovenstående krav ikke er opfyldt, anvendes de metoder, der er fastsat i tillægget.
Linearity
Tillæg
From 0 to 16 % of rennet whey a linear relationship should be obtained with a coefficient of correlation > 0,99.
METODE TIL PÅVISNING AF KOMÆLK OG KOMÆLKSKASEINAT I OST FREMSTILLET AF FÅRE-, GEDE- ELLER BØFFELMÆLK ELLER AF BLANDINGER AF FÅRE-, GEDE- OG BØFFELMÆLK
The 1 % limit includes the uncertainty due to reproducibility.
Påvisning af komælk og komælkskaseinat i ost fremstillet af fåre-, gede- eller bøffelmælk eller af blandinger af fåre-, gede- og bøffelmælk ved isoelektrisk fokusering af γ-kaseiner efter plasminolyse.
Absorbance (220 nm)
ANVENDELSESOMRÅDE
time (Minutes)
Metoden er egnet til følsom og specifik påvisning af rå og varmebehandlet komælk og komælkskaseinat i frisk og modnet ost fremstillet af fåre-, gede- eller bøffelmælk eller af blandinger af fåre-, gede- og bøffelmælk.
International IDF Standard 135B/1991.
Den er ikke egnet til påvisning af, om mælk og ost er forfalsket med varmebehandlede kovalleproteinkoncentrater.
Milk and milk products.
Isolering af kaseiner fra ost og referenceopløsninger
Precision characteristics of analytical methods.
Opløsning af isolerede kaseiner, som derefter underkastes plasminspaltning (EC.3.4.21.7).
Outline of collaborative study procedure.’
Isoelektrisk fokusering af de plasminbehandlede kaseiner i tilstedeværelse af urea og farvning af proteinerne.
the following Annexes are added:
Vurdering af de farvede γ3- og γ2-kaseinmønstre (tegn på komælk) ved sammenligning af mønstret fra prøven med dem, der fremkom i samme gel fra referenceopløsninger med 0 % og 1 % komælk.
ANNEX VI
Medmindre andet er angivet, skal der anvendes kemikalier af analysekvalitet.
Methods of analysis of butter under private storage
Vandet skal være dobbeltdestilleret eller af tilsvarende renhed.
Non Fat Solids (excluding salt)
Bemærkning: Nedenstående detaljer gælder for laboratoriefremstillede polyacrylamidgeler, der indeholder urea, af størrelsen 265 × 125 × 0,25 mm.
Salt
Hvis der bruges gel af en anden størrelse eller type, skal separationsbetingelserne måske justeres.
The method to be applied shall be approved by the paying agency.
Isoelektrisk fokusering
ANNEX VII
Reagenser til fremstilling af polyacrylamider, der indeholder urea
Methods of analysis of skimmed milk powder under private storage
4,85 g acrylamid
ANNEX VIII
0,15 g N, N′-metylen-bis-acrylamid (BIS)
Methods of analysis of cheeses under private storage
15,00 g glycerol (87 % w/w)
The method of analysis laid down in the Appendix shall be used to ensure that cheese made exclusively from ewe's milk, goat's milk or buffalo milk or from a mixture of ewe's milk, goat's milk and buffalo milk does not contain cow's milk casein.
opløses i vand, og der fyldes op til 100 ml. Opbevares i brun flaske i køleskab.
Cow's milk casein is considered to be present if the cow's milk casein content of the analysed sample is equal to or higher than the content of the reference sample containing 1 % cow's milk as laid down in the Appendix.
Bemærkning: En forblandet acrylamid/BIS-opløsning, der fås i handelen, kan anvendes i stedet for de anførte afvejede mængder af neurotoksiske acrylamider.
Methods for detecting cow's milk casein in cheeses referred to in paragraph 1 may be used provided that:
Hvis en sådan opløsning indeholder 30 % w/v acrylamid og 0,8 % w/v BIS, skal der bruges et volumen på 16,2 ml i formuleringen i stedet for de angivne vægte.
the detection limit is maximum 0,5 % and
Stamopløsningens holdbarhed er højst 10 døgn.
there are no false-positive results and
Hvis dens ledningsevne er over 5 μS, afioniseres den ved omrøring med 2 g Amberlite MB-3 i 30 minutter og filtreres derefter gennem en 0,45 μm membran.
cow's milk casein is detectable with the required sensitivity even after long ripening periods, as may occur in usual commercial conditions.
Gelopløsning
If any of the above mentioned requirements is not met, the methods laid down in the Appendix shall be used.
Der laves en gelopløsning ved blanding af additiver og amfolytter (*) med stamopløsningen (4.1.1).
Appendix
9,0 ml stamopløsning
METHOD FOR THE DETECTION OF COW'S MILK AND CASEINATE IN CHEESES FROM EWE'S MILK, GOAT'S MILK OR BUFFALO MILK OR MIXTURES OF EWE'S MILK, GOAT'S MILK AND BUFFALO MILK
24 mg β-alanin
SCOPE
500 μl amfolyt pH 3,5-9,5
Detection of cow's milk and caseinate in cheeses made from ewe's milk, goat's milk, buffalo milk or mixtures of ewe's, goat's and buffalo milk by isoelectric focusing of γ-caseins after plasminolysis.
250 μl amfolyt pH 5-7
FIELD OF APPLICATION
250 μl amfolyt pH 6-8.
The method is suitable for sensitive and specific detection of native and heat-treated cow's milk and caseinate in fresh and ripened cheeses made from ewe's milk, goat's milk, buffalo milk or mixtures of ewe's, goat's and buffalo milk.
Katalysatoropløsninger
Dissolving of the isolated caseins and submitting to plasmin (EC.3.4.21.7) cleavage
N, N, N′N′-tetrametylendiamin (TEMED)
Isoelectric focusing of plasmin-treated caseins in the presence of urea and staining of proteins
800 mg PER opløses i vand, og der fyldes op til 2 ml.
Unless otherwise indicated, analytical grade chemicals shall be used.
Bemærkning: Der skal altid bruges frisklavet PER-opløsning.
Water shall be double-distilled or of equivalent purity.
Kontaktvæske
Note: The following details apply to laboratory prepared polyacrylamide gels containing urea, of dimensions 265 × 125 × 0,25 mm.
Petroleum eller flydende paraffin.
Where other sizes and types of gel are used, the separation conditions may have to be adjusted.
Anodeopløsning
Isoelectric focusing
5,77 g fosforsyre (85 % w/w) opløses i vand og fortyndes til 100 ml med vand.
Reagents for production of the urea containing polyacrylamide gels
Katodeopløsning
Stock gel solution
2,00 natriumhydroxid opløses i vand og fortyndes til 100 ml med vand.
Dissolve:
Forberedelse af prøven
4,85 g acrylamide
Reagenser til proteinisolering
0,15 g N, N′-methylene-bis-acrylamide (BIS)
Fortyndet eddikesyre (25,0 ml iseddike fortyndet til 100 ml ved vand).
48,05 g urea
Dichlormethan
15,00 g glycerol (87 % w/w),
Acetone.
in water and make up to 100 ml and store in a brown glass bottle in the refrigerator.
250 mg dithiothreitol
Note: A commercially available pre-blended acrylamide/BIS solution may be used in preference to the quoted fixed weights of the neurotoxic acrylamides.
opløses i vand, og der fyldes op til 50 ml.
Where such a solution contains 30 % w/v acrylamide and 0,8 % w/v BIS, a volume of 16,2 ml shall be used for the formulation instead of the fixed weights.
Bemærkning: Opbevares i køleskab — holdbarhed 1 uge.
The shelf life of the stock solution is a maximum of 10 days; if its conductivity is more than 5 μS, de-ionize by stirring with 2 g Amberlite MB-3 for 30 minutes, then filter through a 0,45 μm membrane.
Reagenser til plasminspaltning af kaseiner
Gel solution
Ammoniumcarbonatbuffer
Prepare a gel solution by mixing additives and ampholytes (*) with the stock gel solution (see 4.1.1).
En 0,2 mol/l ammoniumhydrogencarbonatopløsning (1,58 g/100 ml vand) med 0,05 mol/l ethylendiamintetra-eddikesyre (EDTA, 1,46 g/100 ml) titreres med en 0,2 mol/l ammoniumcarbonatopløsning (1,92 g/100 ml vand) med 0,05 mol/l EDTA til pH 8.
9,0 ml stock solution
Bovin plasmin (EC.
24 mg β-alanine
3.4.21.7), aktivitet mindst 5 U/ml
500 μl ampholyte pH 3,5-9,5
ε-Aminocapronsyre til enzymhæmning
250 μl ampholyte pH 5-7
2,624 g ε-aminocapronsyre (6-amino-n-heksanonsyre) opløses i 100 ml 40 % (v/v) ethanol.
250 μl ampholyte pH 6-8
Standardopløsninger
Mix the gel solution and de-gas for two to three minutes in an ultrasonic bath or in vacuum.
Godkendte referenceopløsninger af en blanding af løbebehandlet skummet fåre- og gedemælk indeholdende 0 % og 1 % komælk kan fås hos Kommissionen, Instituttet for Referencemålinger og -Materialer, B-2440 Geel, Belgien.
Note: Prepare the gel solution immediately prior to pouring it (see 6.2).
Fremstilling af midlertidige laboratoriestandardopløsninger af løbebehandlet bøffelmæk indeholdende 0 % og 1 % komælk.
Catalyst solutions
Skummetmælken fremstilles ved centrifugering af bøffelmælk eller rå tankkomælk ved 37 °C ved 2500 g i 20 minutter.
N, N, N′ N′ — tetramethylethylenediamine (Temed)
Efter hurtig afkøling af glas og indhold til 6-8 °C fjernes det øverste fedtlag fuldstændigt.
40 % w/v ammonium persulphate (PER):
Til fremstilling af 1 %-standardopløsningen tilsættes 5,00 ml skummet komælk til 495 ml skummet bøffelmælk i et 1 l bæger. pH-værdien justeres til 6,4 ved tilsætning af fortyndet mælkesyre (10 % w/v).
Dissolve 800 mg PER in water and make up to 2 ml.
Temperaturen justeres til 35 °C, og 100 μl kalveløbe tilsættes (løbeaktivitet: 1:10000, ca. 3000 U/ml).
Note: Always use freshly prepared PER solution.
Standardopløsningerne skal opbevares ved – 20 °C.
Cathode solution
Bemærkning: Det kan tilrådes at kontrollere bøffelmælkens renhed ved isoelektrisk fokusering af de plasminbehandlede kaseinater, inden standardopløsningerne fremstilles.
Dissolve 2,00 g sodium hydroxide in water and dilute to 100 ml with water.
Reagenser til proteinfarvning
Sample preparation
Fikservæske
Reagents for protein isolation
150 g trichloreddikesyre opløses i vand, og der fyldes op til 1000 ml.
Dilute acetic acid (25,0 ml of glacial acetic acid made up to 100 ml with water)
Affarvningsopløsning
Dichloromethane
500 ml methanol og 200 ml iseddike fortyndes til 2000 ml med destilleret vand.
Acetone
Bemærkning: Affarvningsopløsningen frisklaves hver dag.
Protein dissolving buffer
Den kan fremstilles ved at blande lige store mængder stamopløsninger af 50 % (v/v) metanol og 20 % iseddike.
Dissolve
Farvningsopløsninger
5,75 g glycerol (87 % w/w)
Farvningsopløsning (stamopløsning 1)
24,03 g urea
3,0 g Coomassie Brilliant Blue G-250 (C.I. 42655) opløses i 1000 ml 90 % (v/v) methanol ved hjælp af en magnetisk omrører (ca. 45 minutter) og filtreres gennem to middelhastigheds-foldefiltre.
250 mg dithiothreitol,
Farvningsopløsning (stamopløsning 2)
in water and make up to 50 ml
5,0 g kobbersulfatpentahydrat opløses i 1000 ml 20 % (v/v) eddikesyre.
Note: Store in a refrigerator, maximum shelf-life one week.
Farvningsopløsning (arbejdsopløsning)
Reagents for plasmin cleavage of caseins
125 ml af hver af stamopløsningerne (4.11.1, 4.11.2) sammenblandes umiddelbart før farvningen.
Ammonium carbonate buffer
Bemærkning: Farvningsopløsningen bør laves samme dag, den skal bruges.
Titrate a 0,2 mol/l ammonium hydrogencarbonate solution (1,58 g/100 ml water) containing 0,05 mol/l ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 1,46 g/100 ml with a 0,2 mol/l ammonium carbonate solution (1,92 g/100 ml water) containing 0,05 mol/l EDTA to pH 8.
APPARATUR
Bovine plasmin (EC.
Glasplader (265 × 125 × 4 mm), gummirulle (bredde 15 cm) og vandret flade
3.4.21.7), activity at least 5 U/ml
Gelbærefolie (265 × 125 mm)
ε-Aminocaproic acid solution for enzyme inhibition
Dækfolie (280 × 125 mm).
Dissolve 2,624 g ε-aminocaproic acid (6 amino-n-hexanoic acid) in 100 ml of 40 % (v/v) ethanol.
Der anbringes en strimmel klæbebånd (280 × 6 × 0,25 mm) på hver langside (jf. figur 1)
Standards
Elektrofokuseringskammer med køleplade (f.eks. 265 × 125 mm) og egnet spændingskilde (≥ 2,5 kV) eller automatisk elektroforeseapparat
Certified reference standards of a mixture of renneted ewe's and goat's skimmed milk containing 0 % and 1 % of cow's milk are available from the Commission's Institute for Reference Materials and Measurements, B-2440 Geel, Belgium
Cirkulationskryostat, termostatstyret ved 12 ± 0,5 °C
Preparation of laboratory interim-standards of buffalo's renneted milk containing 0 % and 1 % of cow's milk
Centrifuge, justerbar til 3000 g
Skimmed milk is prepared by centrifuging of either buffalo or bovine raw bulk milk at 37 °C at 2500 g for 20 minutes.
Elektrodestrimler (længde ≥ 265 mm)
After cooling the tube and contents rapidly to 6 to 8 °C, the upper fat layer is removed completely.
Plastdråbetæller til anode- og katodeopløsninger
For the preparation of the 1 % standard add 5,00 ml of bovine skimmed milk to a 495 ml of buffalo's skimmed milk in a 1 l beaker, adjust the pH to 6,4 by the addition of dilute lactic acid (10 % w/v).
Analyseprøveapplikatorer (10 × 5 mm, viskose- eller lavproteinabsorberingsfilterpapir)
Adjust the temperature to 35 °C and add 100 μl of calf rennet (rennet activity 1: 10000, c.
Farvnings- og affarvningsskåle (f.eks. 280 × 150 mm instrumentbakker) af rustfrit stål eller glas
3000 U/ml), stir for 1 minute and then leave the beaker covered with an aluminium foil at 35 °C for one hour to allow formation of the curd.
Justerbar stanghomogenisator (10 mm diameter), skala 8000-20000 rpm
After the curd has formed, the whole renneted milk is freeze-dried without prior homogenization or draining of the whey.
Filmsvejser
After freeze-drying it is finely ground to produce a homogeneous powder.
25 μl mikropipetter
For the preparation of the 0 % standard, carry out the same procedure using genuine buffalo skimmed milk.
Vakuumkoncentrator eller frysetørrer
The standards shall be stored at – 20 °C.
Termostatstyret vandbad, der kan indstilles til 35 og 40 ± 1 °C, med rysteaggregat
Note: It is advisable to check the purity of the buffalo milk by isoelectric focusing of the plasmin-treated caseins before preparation of the standards.
Densitometerudstyr med aflæsning ved λ = 634 nm.
Reagents for protein staining
Isolering af kaseiner
Fixative
En mængde svarende til 5 g tør ostemasse eller standardopløsninger afvejes i et 100 ml centrifugeglas.
Dissolve 150 g trichloroacetic acid in water and make up to 1000 ml.
Der tilsættes 60 ml destilleret vand og homogeniseres med en stanghomogenisator (8000-10000 rpm). pH-værdien justeres til 4,6 med fortyndet eddikesyre (4.5.1), og der centrifugeres (5 minutter, 3000 g).
Destaining solution
Fedtet og vallen afhældes, restindholdet homogeniseres i 40 ml destilleret vand (pH-værdien justeret til 4,5 med fortyndet eddikesyre (4.5.1)) ved 20000 rpm.
Dilute 500 ml methanol and 200 ml glacial acetic acid to 2000 ml with distilled water.
Der tilsættes 20 ml dichlormethan (4.5.2), homogeniseres igen og centrifugeres (5 minutter, 3000 g).
Note: Prepare the destaining solution fresh every day; it can be prepared by mixing equal volumes of stock solutions of 50 % (v/v) methanol and 20 % (v/v) glacial acetic acid.
Kaseinlaget, der flyder mellem den vandige og den organiske fase (jf. figur 2), fjernes med en spatel, og begge faser afhældes.
Staining solutions
Kaseinet homogeniseres igen i 40 ml destilleret vand (som ovenfor) og 20 ml dichlormethan (4.5.2), og der centrifugeres.
Staining solution (stock solution 1)
Dette gentages, indtil begge ekstraktionsfaser er farveløse (2-3 gange).
Dissolve 3,0 g Coomassie Brilliant Blue G-250 (C.I. 42655) in 1000 ml 90 % (v/v) methanol using a magnetic stirrer (approximately 45 minutes), filter through two medium-speed folded filters.
Proteinresterne homogeniseres med 50 ml acetone (4.5.3) og filtreres gennem et middelhastigheds-foldefilterpapir.
Staining solution (stock solution 2)
Resterne vaskes på filtret med to særskilte portioner acetone på hver 25 ml og henstår til tørring i luft eller en kvælstofstrøm, hvorefter de finknuses i en morter.
Dissolve 5,0 g copper sulphate pentahydrate in 1000 ml 20 % (v/v) acetic acid.
Bemærkning: Tørre kaseinisolater bør opbevares ved – 20 °C.
Staining solution (working solution)
Plasminspaltning af β-kaseiner for at intensivere γ-kaseiner
Mix together 125 ml of each of the stock solutions (4.11.1, 4.11.2) immediately prior to staining.
25 mg isoleret kasein (6.1.1) opslæmmes i 0,5 ml ammoniumcarbonatbuffer (4.7.1) og homogeniseres i 20 minutter, f.eks. ved ultralydsbehandling.
Note: The staining solution should be prepared on the day that it is used.
Der opvarmes til 40 °C og tilsættes 10 μl plasmin (4.7.2), blandes og inkuberes i en time ved 40 °C under stadig omrystning.
EQUIPMENT
Til hæmning af enzymer tilsættes 20 μl ε-aminokapronsyre (4.7.3) og derefter yderligere 200 mg fast urea og 2 mg ditiotreitol.
Glass plates (265 × 125 × 4 mm); rubber roller (width 15 cm); levelling table
Bemærkning: For at få større symmetri i de fokuserede kaseinbånd kan det tilrådes at frysetørre opløsningen efter tilsætningen af ε-aminocapronsyre og derefter opløse resterne i 0,5 ml ureabuffer (4.6).
Gel carrier sheet (265 × 125 mm)
Fremstilling af polyacrylamidgeler, der indeholder urea
Covering sheet (280 × 125 mm).
Gelbærefolien (5.2) rulles med et par dråber vand ud på en glasplade (5.1), og eventuelt overskydende vand fjernes med papirhåndklæde- eller serviet.
Stick on strip of adhesive tape (280 × 6 × 0,25 mm) to each long edge (see Figure 1)
Dækfolien (5.3) udrulles med afstandsstykker (0,25 mm) på en anden glasplade på samme måde.
Electrofocusing chamber with cooling plate (e.g. 265 × 125 mm) and suitable power supply (≥ 2,5 kV) or automatic electrophoresis device
Pladen anbringes plant på en vandret flade.
Circulation cryostat, thermostatically controlled at 12 ± 0,5 °C
Pladen anbringes plant på en vandret flade.
Centrifuge, adjustable to 3000 g
10 μl TEMED (4.1.3.1) tilsættes til den tilberedte, afgassede gelopløsning (4.1.2), og efter omrystning 10 μl PER-opløsning (4.1.3.2).
Electrode strips (≥ 265 mm long)
Opløsningen blandes grundigt og hældes straks derefter jævnt ud på midten af dækfolien.
Plastic dropping bottles for the anode and cathode solutions
Den ene side af gelbærefolien (med bæresiden nedad) anbringes på dækfoliepladen og sænkes langsomt, således at der danner sig en gelfilm mellem folierne, som spreder sig regelmæssigt uden bobledannelse (jf. figur 3).
Sample applicators (10 × 5 mm, viscose or low protein-adsorption filter paper)
Gelbærepladen sænkes forsigtigt helt ned ved hjælp af en tynd spatel, og der lægges endnu tre plader oven på den, der skal tjene som vægte.
Stainless steel or glass staining and destaining dishes (e.g. 280 × 150 mm instrument trays)
Når polymiseringen er fuldstændig (ca. 60 minutter), overføres den polymeriserede gel på gelbærefolien sammen med dækfolien, ved at glaspladerne vippes.
Adjustable rod homogenizer (10 mm shaft diameter), rpm range 8000 to 20000
Bærefoliens bagside rengøres omhyggeligt for at fjerne gelrester og urea.
Film welder
Gelsandwichen svejses til et filmglas og opbevares i køleskab (højst 6 uger).
25 μl micropipettes
Bemærkning: Dækfolien med afstandsstykkerne kan genbruges.
Vacuum concentrator or freeze-dryer
Polyacrylamiden kan skæres i mindre størrelser, hvad der kan anbefales, når der kun er få prøver, eller hvis der anvendes et automatisk elektroforeseapparat (2 geler, størrelse 4,5 × 5 cm).
Thermostatically controlled water bath adjustable to 35 and 40 ± 1 °C with shaker
Isoelektrisk fokusering
Densitometer equipment reading at λ = 634 nm
Køletermostaten indstilles til 12 °C.
Isolation of caseins
Gelbærefoliens bagside aftørres med petroleum, hvorefter et par dråber petroleum (4.2) dryppes på midten af køleblokken.
Weigh the amount equivalent to 5 g dry mass of cheese or the reference standards into a 100 ml centrifuge tube, add 60 ml distilled water and homogenize with a rod homogenizer (8000 to 10000 rpm).
Derpå rulles gelsandwichen (med bæresiden nedad) ud på den, men det skal undgås, at der danner sig bobler.
Adjust to pH 4,6 with dil. acetic acid (4.5.1) and centrifuge (5 minutes, 3000 g).
Eventuel overskydende petroleum tørres af, og dækfolien fjernes.
Decant the fat and whey, homogenize the residue at 20000 rpm in 40 ml distilled water adjusted to pH 4,5 with dil. acetic acid (4.5.1), add 20 ml dichloromethane (4.5.2), homogenize again and centrifuge (5 minutes, 3000 g).
Elektrodestrimlerne gennemvædes med elektrodeopløsningerne (4.3 og 4.4), tilskæres i gelens længde og anbringes de givne steder (elektrodeafstand 9,5 cm).
Remove the casein layer that lies between the aqueous and organic phases (see Figure 2) with a spatula and decant off both phases.
Fokuseringen foretages på nedenstående betingelser:
Rehomogenise the casein in 40 ml distilled water (see above) and 20 ml dichloromethane (4.5.2) and centrifuge.
Gelstørrelse 265 × 125 × 0,25 mm
Repeat this procedure until both extraction phases are colourless (two to three times).
Trin
Homogenize the protein residue with 50 ml acetone (4.5.3) and filter through a medium-speed folded filter paper.
Spænding
Wash the residue on the filter with two separate 25 ml portions of acetone each time and allow to dry in the air or a stream of nitrogen, then pulverize finely in a mortar.
Strøm
Note: Dry casein isolates should be kept at –20 °C.
Effekt
Plasmin cleavage of β-caseins to intensify γ-caseins
Volttimer
Disperse 25 mg of isolated caseins (6.1.1) in 0,5 ml ammonium carbonate buffer (4.7.1) and homogenize for 20 minutes by e.g. using ultrasonic treatment.
Præfokusering
Heat to 40 °C and add 10 μl plasmin (4.7.2), mix and incubate for one hour at 40 °C with continuous shaking.
maksimum
To inhibit the enzyme add 20 μl ε-aminoproic acid solution (4.7.3), then add 200 mg of solid urea and 2 mg of dithiothreitol.
konstant 4
Note: To obtain more symmetry in the focused casein bands it is advisable to freeze-dry the solution after adding the ε-aminocaproic acid and then dissolving the residues in 0,5 ml protein dissolving buffer (4.6).
Prøvefokusering
Preparation of the urea containing polyacrylamide gels
Slutfokusering
With the aid of a few drops of water roll the gel carrier sheet (5.2) onto a glass plate (5.1), removing any extraneous water with paper towel or tissue.
Bemærkning: Hvis gelens tykkelse eller bredde ændres, skal strøm og effekt justeres herefter (f.eks. fordobles elstrøm og effekt, hvis der benyttes en 265 × 125 × 0,5 mm gel).
Roll the cover sheet (5.3) with spacers (0,25 mm) onto another glass plate in the same way.
Eksempel på et spændingsprogram for et automatisk elektroforeseapparat (2 geler på 5,0 × 4,5 cm); elektroder anbringes uden strimler direkte på gelen:
Lay the plate horizontally on a levelling table.
Temperatur
Add 10 μl Temed (4.1.3.1) to the prepared and de-aerated gel solution (4.1.2), stir and add 10 μl PER-solution (4.1.3.2), mix thoroughly and immediately pour out evenly onto the centre of the cover sheet.