natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Testkemikaliet og kontrolstofferne præpares på dagen for testen.
STD1
For KeratinoSensTM-assayet opløses testkemikalierne i dimethylsulfoxid (DMSO) til den ønskede slutkoncentration (f.eks. 200 mM).
STD2
DMSO-opløsninger kan betragtes som selvsteriliserende, og der er således ikke behov for steril filtrering.
STD3
Testkemikalier, der ikke er opløselige i DMSO, opløses i sterilt vand eller dyrkningsmedium, og opløsningerne steriliseres ved f.eks. filtrering.
STD4
For et testkemikalie, som ikke har nogen defineret molekylvægt, fremstilles der en stamopløsning i en standardkoncentration (40 mg/ml eller 4 % (vægt/volumen)) i KeratinoSensTM-assayet.
STD5
Hvis der benyttes andre opløsningsmidler end DMSO, vand eller dyrkningsmedium, bør der fremlægges en tilstrækkelig videnskabelig begrundelse for dette.
STD6
Baseret på DMSO-stamopløsninger af testkemikaliet foretages der seriefortyndinger med DMSO for at opnå 12 master-koncentrationer af det kemikalie, der skal testes (fra 0,098 til 200 mM i KeratinoSensTM-assayet).
Dilution buffer
For et testkemikalie, der ikke er opløseligt i DMSO, foretages fortyndingerne for at opnå master-koncentrationerne med sterilt vand eller sterilt dyrkningsmedium.
Reference control A, rep 1
Uafhængigt af det anvendte opløsningsmiddel fortyndes skal master-koncentrationerne herefter fortyndes yderligere 25 gange i dyrkningsmedium indeholdende serum og endelig bruges til behandling med en yderligere fortyndingsfaktor på 4 gange, så slutkoncentrationen af testkemikaliet varierer fra 0,98 til 2000 μM i KeratinoSensTM-assayet.
Reference control A, rep 2
Alternative koncentrationer kan bruges, hvis det er begrundet (f.eks. i tilfælde af cytotoksicitet eller dårlig opløselighed).
Reference control A, rep 3
Den negative kontrol (opløsningsmiddelkontrollen), der anvendes i KeratinoSensTM-assayet, er DMSO (CAS-nr.
Co-elution controls
67-68-5, ≥ 99 % renhed), hvortil der præpareres seks brønde pr. plade.
Co-elution control 1 for test chemical 1
Der foretages samme fortynding som beskrevet for master-koncentrationerne i punkt 22, således at slutkoncentrationen i den negative kontrol (opløsningsmiddelkontrollen) er 1 %, der vides ikke at påvirke cellernes levedygtighed, og som svarer til samme DMSO-koncentration som i testkemikaliet og i den positive kontrol.
Co-elution control 2 for test chemical 2
For et testkemikalie, der ikke er opløseligt i DMSO, og hvor fortyndingerne er foretaget i vand, skal DMSO-niveauet for den endelige testopløsning i alle brønde justeres til 1 % som for de øvrige testkemikalier og kontrolstoffer.
Reference controls
Den positive kontrol, der bruges i KeratinoSensTMassayet, er kanelaldehyd (CAS-nr.
Reference control B, rep 1
14371-10-9, ≥ 98 % renhed), hvor der fremstilles en serie på fem master-koncentrationer fra 0,4 til 6,4 mM i DMSO (fra en 6,4 mM stamopløsning), der fortyndes som beskrevet for master-koncentrationer i punkt 22, således at slutkoncentrationen af den positive kontrol går fra 4 til 64 μM.
Reference control B, rep 2
Andre egnede positive kontroller, helst med EC1,5-værdier i mellemområdet, anvendes, hvis der foreligger historiske data, som kan anvendes til at udlede sammenlignelige acceptkriterier for kørsel.
Reference control B, rep 3
Påføring af testkemikalier og kontrolstoffer
First set of replicates
For hvert testkemikalie og positive kontrolstof kræves der et forsøg for at udlede en forudsigelse (positiv eller negativ), der består af mindst to uafhængige gentagelser med hver tre replikater (dvs. n=6).
Reference control C, rep 1
I tilfælde af modstridende resultater for de to uafhængige gentagelser bør der udføres en tredje gentagelse med tre replikater (dvs. n=9).
Cinnamic aldehyde, rep 1
Hver selvstændig gentagelse udføres på en anden dag med en frisk stamopløsning af testkemikalier og uafhængigt høstede celler.
Sample 1, rep 1
Cellerne kan imidlertid komme fra den samme generation.
Sample 2, rep 1
Efter podning som beskrevet i punkt 20 dyrkes cellerne i 24 timer i mikrotiterplader med 96 brønde.
Second set of replicates
Herefter fjernes mediet og erstattes af frisk dyrkningsmedium (150 μl dyrkningsmedium med serum, men uden Geneticin for KeratinoSensTM), hvortil der tilsættes 50 μl af det 25 gange fortyndede testkemikalie og kontrolstofferne.
Reference control C, rep 2
Mindst en brønd pr. plade bør være tom (ingen celler og ingen behandling) for at gøre det muligt at vurdere baggrundsværdierne.
Cinnamic aldehyde, rep 2
De behandlede plader inkuberes derefter i ca. 48 timer ved 37 ± 1 °C under tilstedeværelse af 5 % CO2 i KeratinoSensTM-assayet.
Sample 1, rep 2
Der bør træffes forholdsregler for at undgå, at flygtige testkemikalier fordamper, og for at undgå krydskontaminering med testkemikalier mellem brøndene, f.eks. ved at dække pladerne med en folie inden inkubering med testkemikalierne.
Sample 2, rep 2
Målinger af luciferaseaktivitet
Third set of replicates
Tre faktorer er afgørende for at sikre relevante luminescensaflæsninger:
Reference control C, rep 3
valg af et følsomt luminometer
Cinnamic aldehyde, rep 3
brug af et pladeformat med tilstrækkelig højde til at undgå krydskontaminering med lys og
Sample 1, rep 3
brug af et luciferasesubstrat med tilstrækkelig lysvirkning til at sikre tilstrækkelig følsomhed og lav variabilitet.
Sample 2, rep 3
Inden testen udføres der et kontrolforsøg med opsætningen som beskrevet i tillæg 3 for at sikre, at disse tre punkter er opfyldt.
Reference control B, rep 4
Efter 48 timers eksponering med testkemikaliet og kontrolstofferne i KeratinoSensTM-assayet vaskes cellerne med fosfatbufferet saltopløsning, og den relevante lysisbuffer for luminescensaflæsninger tilsættes hver brønd i 20 min. ved stuetemperatur.
Reference control B, rep 5
Plader med cellelysat placeres derefter i luminometeret til aflæsning, som i KeratinoSensTM-assayet er programmeret til at: i) tilsætte luciferasesubstrat til hver brønd (dvs. 50 μl), ii) vente 1 sekund og iii) integrere luciferaseaktiviteten i 2 sekunder.
Reference control B, rep 6
Hvis man anvender alternative indstillinger, f.eks. som følge af den anvendte luminometermodel, bør dette begrundes.
B.60 In Vitro Skin Sensitisation: ARE-Nrf2 Luciferase Test Method
Desuden kan man benytte et lyssubstrat, forudsat at kvalitetskontrolforsøget i tillæg 3 er lykkedes.
This test method (TM) is equivalent to OECD test guideline (TG) 442D (2015).
Vurdering af cytotoksicitet
A skin sensitiser refers to a substance that will lead to an allergic response following skin contact as defined by the United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (UN GHS) (1) and Regulation (EC) No 1272/2008 of the European Parliament and of the Council on Classification, Labelling and Packaging of Substances and Mixtures (CLP) [18].
For KeratinoSensTM-assayet for cellelevedygtighed udskiftes mediet efter 48 timers eksponering med frisk medium med MTT [ 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid, thiazolylblåt tetrazolium-bromid, CAS-nr.
This test method provides an in vitro procedure (the ARE-Nrf2 luciferase assay) to be used for supporting the discrimination between skin sensitisers and non-sensitisers in accordance with the UN GHS (1) and CLP.
298-93-1), og cellerne inkuberes i 4 timer ved 37 °C under tilstedeværelse af 5 % CO2.
The existing knowledge of the chemical and biological mechanisms associated with skin sensitisation has been summarised in the form of an Adverse Outcome Pathway (AOP) (2), going from the molecular initiating event through the intermediate events up to the adverse health effect, i.e. allergic contact dermatitis in humans or contact hypersensitivity in rodents (2) (3).
Herefter fjernes MTT-mediet, og cellerne lyseres (f.eks. ved tilsætning af 10 % SDS-opløsning til hver brønd) natten over.
The molecular initiating event is the covalent binding of electrophilic substances to nucleophilic centres in skin proteins.
Efter omrystning måles absorptionen ved f.eks. 600 nm med et fotometer.
The second key event in this AOP takes place in the keratinocytes and includes inflammatory responses as well as gene expression associated with specific cell signalling pathways such as the antioxidant/electrophile response element (ARE)-dependent pathways.
Følgende parametre beregnes i KeratinoSensTM-assayet:
The third key event is the activation of dendritic cells, typically assessed by expression of specific cell surface markers, chemokines and cytokines.
den maksimale gennemsnitlige foldinduktion af luciferaseaktivitet (Imax), der er observeret ved en hvilken som helst koncentration af testkemikaliet og den positive kontrol
The fourth key event is T-cell proliferation, which is indirectly assessed in the murine Local Lymph Node Assay (4).
,5-værdien, der repræsenterer den koncentration, hvor en induktion af luciferaseaktiviteten på over tærsklen på 1,5 fold (dvs. 50 % større luciferaseaktivitet) blev opnået
The classical methods based on guinea-pigs, the Magnusson Kligman Guinea Pig Maximisation Test (GMPT) and the Buehler Test (TM B.6 (5)), study both the induction and elicitation phases of skin sensitisation.
og IC30-koncentrationsværdierne for 50 % og 30 % reduktion af cellelevedygtigheden.
A murine test, the Local Lymph Node Assay (LLNA) (TM B.42 (4)) and its two non-radioactive modifications, LLNA: DA (TM B.50 (6)) and LLNA: BrdU-ELISA (TM B.51 (7)), which all assess the induction response exclusively, have also gained acceptance since they provide advantages over the guinea pig tests in terms of both animal welfare and objective measurement of the induction phase of skin sensitisation.
Foldinduktionen af luciferaseaktiviteten beregnes ved hjælp af ligning 1, og den samlede maksimale foldinduktion (Imax) beregnes som et gennemsnit af de enkelte gentagelser.
More recently, mechanistically-based in chemico and in vitro test methods have been considered scientifically valid for the evaluation of the skin sensitisation hazard of chemicals.
Ligning 1:
However, combinations of non-animal methods (in silico, in chemico, in vitro) within Integrated Approaches to Testing and Assessment (IATA) will be needed to be able to fully substitute for the animal tests currently in use given the restricted AOP mechanistic coverage of each of the currently available non-animal test methods (2) (3).
Fold induktion
This test method (ARE-Nrf2 luciferase assay) is proposed to address the second key event as explained in paragraph 2.
hvor
Skin sensitisers have been reported to induce genes that are regulated by the antioxidant response element (ARE) (8) (9).
er luminescensaflæsningen i brønden med testkemikaliet
Small electrophilic substances such as skin sensitisers can act on the sensor protein Keap1 (Kelch-like ECH-associated protein 1), by e.g. covalent modification of its cysteine residue, resulting in its dissociation from the transcription factor Nrf2 (nuclear factor-erythroid 2-related factor 2).
er luminescensaflæsningen i brønden med blindprøven, der ikke indeholder celler og ikke er blevet behandlet
The dissociated Nrf2 can then activate ARE-dependent genes such as those coding for phase II detoxifying enzymes (8) (10) (11).
er den gennemsnitlige luminescensaflæsning i brønde, der indeholder celler og opløsningsmiddelkontrol (negativ kontrol)
Currently, the only in vitro ARE-Nrf2 luciferase assay covered by this test method is the KeratinoSensTM assay for which validation studies have been completed (9) (12) (13) followed by an independent peer review conducted by the European Union Reference Laboratory for Alternatives to Animal Testing (EURL ECVAM) (14).
,5 beregnes ved lineær interpolation i henhold til ligning 2, og den samlede EC1,5 beregnes som det geometriske gennemsnit af de enkelte gentagelser.
The KeratinoSensTM assay was considered scientifically valid to be used as part of an IATA, to support the discrimination between skin sensitisers and non-sensitisers for the purpose of hazard classification and labelling (14).
Ligning 2:
Laboratories willing to implement the test method can obtain the recombinant cell line used in the KeratinoSensTM assay by establishing a licence agreement with the test method developer (15).
er den laveste koncentration i μM med > 1,5 fold induktion
Since activation of the Keap1-Nrf2-ARE pathway addresses only the second key event of the skin sensitisation AOP, information from test methods based on the activation of this pathway is unlikely to be sufficient when used on its own to conclude on the skin sensitisation potential of chemicals.
er den højeste koncentration i μM med < 1,5 fold induktion
Therefore, data generated with the present test method should be considered in the context of integrated approaches, such as IATA, combining them with other complementary information e.g. derived from in vitro assays addressing other key events of the skin sensitisation AOP as well as non-testing methods including read-across from chemical analogues.
er foldinduktionen målt ved den laveste koncentration med > 1,5 fold induktion (gennemsnit af tre replikatbrønde)
Examples on how to use the ARE-Nrf2 luciferase test method in combination with other information are reported in literature (13) (16) (17) (18) (19).
er foldinduktionen målt ved den højeste koncentration med < 1,5 fold induktion (gennemsnit af tre replikatbrønde)
This test method can be used to support the discrimination between skin sensitisers (i.e. UN GHS/CLP Category 1) and non-sensitisers in the context of IATA.
Levedygtigheden beregnes med ligning 3:
This test method cannot be used on its own, neither to sub-categorise skin sensitisers into subcategories 1A and 1B as defined by the UN GHS/CLP nor to predict potency for safety assessment decisions.
Ligning 3:
However, depending on the regulatory framework, a positive result may be used on its own to classify a chemical into UN GHS/CLP category 1.
Levedygtighed
Based on the dataset from the validation study and in-house testing used for the independent peer-review of the test method, the KeratinoSensTM assay proved to be transferable to laboratories experienced in cell culture.
er MTT-absorbansen i brønden med testkemikaliet
The level of reproducibility in predictions that can be expected from the test method is in the order of 85 % within and between laboratories (14).
er MTT-absorbansaflæsningen i brønden med blindprøven, der ikke indeholder celler og ikke er blevet behandlet
The accuracy (77 % - 155/201), sensitivity (78 % - 71/91) and specificity (76 % - 84/110) of the KeratinoSensTM assay for discriminating skin sensitisers (i.e. UN GHS/CLP Cat.
er den gennemsnitlige MTT-absorbansaflæsning i brønde, der indeholder celler og opløsningsmiddelkontrol (negativ kontrol)
1) from non-sensitisers when compared to LLNA results were calculated by considering all of the data submitted to EURL ECVAM for evaluation and peer-review of the test method (14).
og IC30 beregnes ved lineær interpolation i henhold til ligning 4, og den samlede IC50 og IC30 beregnes som det geometriske gennemsnit af de enkelte gentagelser.
These figures are similar to those recently published based on in-house testing of about 145 substances (77 % accuracy, 79 % sensitivity, 72 % specificity) (13).
Ligning 4:
The KeratinoSensTM assay is more likely to under predict chemicals showing a low to moderate skin sensitisation potency (i.e. UN GHS/CLP subcategory 1B) than chemicals showing a high skin sensitisation potency (i.e. UN GHS/CLP subcategory 1A) (13) (14).
X er den procentvise reduktion i den koncentration, der skal beregnes (50 og 30 for IC50 og IC30)
Taken together, this information indicates the usefulness of the KeratinoSensTM assay to contribute to the identification of skin sensitisation hazard.
er den laveste koncentration i μM med > x % reduktion af levedygtigheden
However, the accuracy values given here for the KeratinoSensTM assay as a stand-alone test method are only indicative since the test method should be considered in combination with other sources of information in the context of an IATA and in accordance with the provisions of paragraph 9 above.
er den højeste koncentration i μM med < x % reduktion af levedygtigheden
Furthermore when evaluating non-animal methods for skin sensitisation, it should be kept in mind that the LLNA as well as other animal tests, may not fully reflect the situation in the species of interest i.e. humans.
er den procentvise levedygtighed ved den laveste koncentration med > x % reduktion af levedygtigheden
The term “test chemical” is used in this test method to refer to what is being tested and is not related to the applicability of the ARE-Nrf2 luciferase test method to the testing of substances and/or mixtures.
er den procentvise levedygtighed ved den højeste koncentration med < x % reduktion af levedygtigheden
On the basis of the current data available the KeratinoSensTM assay was shown to be applicable to test chemicals covering a variety of organic functional groups, reaction mechanisms, skin sensitisation potency (as determined with in vivo studies) and physico-chemical properties (9) (12) (13) (14).
For hver koncentration, der udviser > 1,5 foldinduktion af luciferaseaktivitet, beregnes den statistiske signifikans (f.eks. ved hjælp af den tohalede Student's t-test), hvor man sammenligner luminescensværdierne for de tre replikate prøver med luminescensværdierne i brøndene med opløsningsmiddelkontrollen (den negative kontrol) for at afgøre, hvorvidt induktionen af luciferaseaktivitet er statistisk signifikant (p < 0,05).
Mainly mono-constituent substances were tested, although a limited amount of data also exist on the testing of mixtures (20).
Den laveste koncentration med > 1,5 fold induktion af luciferaseaktivitet er den værdi, der bestemmer EC1,5-værdien.
The test method is nevertheless technically applicable to the testing of multi-constituent substances and mixtures.
Det undersøges i hvert enkelt tilfælde, om denne værdi er lavere end IC30-værdien, hvilket indikerer, at der er mindre end 30 % reduktion i cellelevedygtigheden ved den EC1,5-værdi, der fastlægger koncentrationen.
However, before use of this test method on a mixture for generating data for an intended regulatory purpose, it should be considered whether, and if so why, it may provide adequate results for that purpose.
Det anbefales, at data kontrolleres visuelt ved hjælp af grafer.
Moreover, when testing multi-constituent substances or mixtures, consideration should be given to possible interference of cytotoxic constituents with the observed responses.
Hvis der ikke kan konstateres nogen tydelig dosis/respons-kurve, eller dosis/respons-kurven er bifasisk (dvs. grænsen på 1,5 passeres to gange), bør forsøget gentages for at kontrollere, om dette er specifikt for testkemikaliet eller skyldes en eksperimentel artefakt.
The test method is applicable to test chemicals soluble or that form a stable dispersion (i.e. a colloid or suspension in which the test chemical does not settle or separate from the solvent into different phases) either in water or DMSO (including all of the test chemical components in the case of testing a multi-constituent substance or a mixture).
Hvis den bifasiske respons kan reproduceres ved et uafhængigt forsøg, bør den laveste EC1,5-værdi (koncentrationen, hvor grænsen på 1,5 krydses første gang) rapporteres.
Test chemicals that do not fulfil these conditions at the highest final required concentration of 2000 μM (cf. paragraph 22) may still be tested at lower concentrations.
I de sjældne tilfælde, hvor en statistisk ikke-signifikant induktion over 1,5 fold observeres efterfulgt af en højere koncentration med en statistisk signifikant induktion, betragtes resultaterne af denne gentagelse kun som gyldige og positive, hvis den statistisk signifikante induktion over grænsen på 1,5 blev opnået for en ikke-cytotoksisk koncentration.
In such a case, results fulfilling the criteria for positivity described in paragraph 39 could still be used to support the identification of the test chemical as a skin sensitiser, whereas a negative result obtained with concentrations < 1000 μM should be considered as inconclusive (see prediction model in paragraph 39).
Endelig gælder det for testkemikalier, der genererer en 1,5 fold induktion eller mere allerede ved den laveste testkoncentration på 0,98 μM, at EC1,5-værdien på < 0,98 fastsættes baseret på en visuel kontrol af dosis/respons-kurven.
In general substances with a LogP of up to 5 have been successfully tested whereas extremely hydrophobic substances with a LogP above 7 are outside the known applicability of the test method (14).
Følgende acceptkriterier bør være opfyldt ved brug af KeratinoSensTM-assayet.
For substances having a LogP falling between 5 and 7, only limited information is available.
For det første bør den induktion af luciferaseaktivitet, der er opnået med den positive kontrol, kanelaldehyd, være statistisk signifikant over en tærskel på 1,5 (f.eks. ved hjælp af en t-test) i mindst en af de testede koncentrationer (fra 4 til 64 μM).
Negative results should be interpreted with caution as substances with an exclusive reactivity towards lysine-residues can be detected as negative by the test method.
For det andet bør EC1,5-værdien ligge inden for to standardafvigelser af det historiske gennemsnit for testfaciliteten (f.eks. mellem 7 μM og 30 μM baseret på valideringsdatasættet), der bør ajourføres regelmæssigt.
Furthermore, because of the limited metabolic capability of the cell line used (21) and because of the experimental conditions, pro-haptens (i.e. chemicals requiring enzymatic activation for example via P450 enzymes) and pre-haptens (i.e. chemicals activated by auto-oxidation) in particular with a slow oxidation rate may also provide negative results.
Desuden bør den gennemsnitlige induktion i de tre replikater for kanelaldehyd på 64 μM være mellem 2 og 8.
Test chemicals that do not act as a sensitiser but are nevertheless chemical stressors may lead on the other hand to false positive results (14).
Hvis sidstnævnte kriterium ikke er opfyldt, bør dosisresponsen for kanelaldehyden kontrolleres nøje, og disse test må kun accepteres, hvis der er en tydelig dosisrespons med stigende induktion af luciferaseaktivitet ved stigende koncentrationer af den positive kontrol.
Furthermore, highly cytotoxic test chemicals cannot always be reliably assessed.
Endelig bør den gennemsnitlige variationskoefficient for luminescensaflæsningen af DMSO for den negative kontrol (opløsningsmiddelkontrollen) være under 20 % i hver gentagelse bestående af seks brønde testet i tre eksemplarer.
Finally, test chemicals that interfere with the luciferase enzyme can confound the activity of luciferase in cell-based assays causing either apparent inhibition or increased luminescence (22).
Hvis variationen er højere, bør resultaterne kasseres.
For example, phytoestrogen concentrations higher than 1 μM were reported to interfere with the luminescence signals in other luciferase-based reporter gene assays due to over-activation of the luciferase reporter gene (23).
Fortolkning af resultater og forudsigelsesmodel
As a consequence, luciferase expression obtained at high concentrations of phytoestrogens or similar chemicals suspected of producing phytoestrogen-like over-activation of the luciferase reporter gene needs to be examined carefully (23).
En KeratinoSensTM-forudsigelse anses for positiv, hvis følgende fire betingelser alle er opfyldt i to ud af to eller i de samme to ud af tre gentagelser; ellers betragtes KeratinoSensTM-forudsigelsen som negativ (figur 1):
In cases where evidence can be demonstrated on the non-applicability of the test method to other specific categories of test chemicals, the test method should not be used for those specific categories.
Imax er større end (>) 1,5 fold og med statistisk signifikant forskellighed sammenlignet med opløsningsmiddelkontrollen (den negative kontrol) (som blev bestemt med den tohalede uparrede Student's t-test).
In addition to supporting discrimination between skin sensitisers and non-sensitisers, the KeratinoSensTM assay also provides concentration-response information that may potentially contribute to the assessment of sensitising potency when used in integrated approaches such as IATA (19).