natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Blodet overføres til Eppendorf-rør (holdt på is) og centrifugeres (5 min., 7000 g, stuetemperatur).
Plasma is separated from the blood via centrifugation, and stored with protease inhibitors at – 80 °C, until analysed for vitellogenin.
Plasmaet overføres til rene Eppendorf-rør (i alikvoter, hvis plasmavolumenet tillader det) og nedfryses omgående ved – 80 °C, indtil det skal analyseres (Panter et al., 1998).
Alternatively, in medaka the liver will be used, and in zebrafish the head/tail homogenate can be used as tissue-source for vitellogenin determination (Appendix 6).
Fremgangsmåde 2A:
The measurement of VTG should be based upon a validated homologous ELISA method, using homologous VTG standard and homologous antibodies.
Japansk risfisk, udskæring af leveren hos japansk risfisk
It is recommended to use a method capable to detect VTG levels as low as few ng/ml plasma (or ng/mg tissue), which is the background level in unexposed male fish.
Fjernelse af testfisken fra testkammeret
Quality control of vitellogenin analysis will be accomplished through the use of standards, blanks and at least duplicate analyses.
Testfisk fjernes fra testkammeret med et lille fiskenet.
For each ELISA method, a test for matrix effect (effect of sample dilution) should be run to determine the minimum sample dilution factor.
Undgå at tabe testfisken ned i andre testkamre.
Each ELISA plate used for VTG assays should include the following quality control samples:
Testfisk skal principielt fjernes i følgende rækkefølge:
at least 6 calibration standards covering the range of expected vitellogenin concentrations, and at least one non-specific binding assay blank (analysed in duplicate).
kontrol, opløsningsmiddelkontrol (når det er relevant), laveste koncentration, middelkoncentration, højeste koncentration og positiv kontrol.
Absorbance of these blanks should be less than 5 % of the maximum calibration standard absorbance.
Derudover bør alle hanner fjernes fra et testkammer, før de resterende hunner fjernes.
At least two aliquots (well-duplicates) of each sample dilution will be analysed.
Hver testfisks køn identificeres ud fra ydre sekundære kønskarakteristika (f.eks. gatfinnens form).
Well-duplicates that differ by more than 20 % should be re-analysed.
Når testfisken gribes, bruges pincetten til at tage fat på hver side af hovedet, så halen ikke går i stykker.
The ratio of the expected concentration to the measured concentration will be reported along with the results from each set of assays performed on that day.
Tør vandet af testfiskens overflade med filterpapiret (eller papirservietten).
Evaluation of Biomarker Responses by Analysis of Variance (ANOVA)
Foretag derefter et lille tværsnit halvvejs mellem den ventrale nakkeregion og den midterste del af bugen med en dissektionssaks.
To identify potential endocrine activity of a chemical, responses are compared between treatments and control groups using analysis of variance (ANOVA).
Indfør dissektionssaksen i det lille snit, og foretag et snit i abdomen fra et punkt bag gælleklappen til den forreste del af anus langs abdomens midterlinje.
Where a solvent control is used, an appropriate statistical test should be performed between the dilution water and solvent controls for each endpoint.
Dissektionssaksen må ikke føres for dybt ind, da man risikerer at skade leveren og kønskirtlen.
Guidance on how to handle dilution water and solvent control data in the subsequent statistical analysis can be found in OECD, 2006c (27).
Foretag følgende operationer under et stereoskopisk mikroskop.
All biological response data should be analysed and reported separately by sex.
Anbring testfisken med abdomen opad på papirservietten (petriskål af glas eller objektglas er også en mulighed).
If the required assumptions for parametric methods are not met — non-normal distribution (e.g. Shapiro-Wilk's test) or heterogeneous variance (Bartlett's test or Levene's test), consideration should be given to transforming the data to homogenise variances prior to performing the ANOVA, or to carrying out a weighted ANOVA.
Udvid bughulens vægge med en præcisionspincet, og blotlæg de indre organer.
Dunnett's test (parametric) on multiple pair-wise comparisons or a Mann-Whitney with Bonferroni adjustment (non-parametric) may be used for non-monotonous dose-response.
Det er også acceptabelt om nødvendigt at blotlægge de indre organer ved at fjerne den ene side af bughulevæggen.
Other statistical tests may be used (e.g. Jonckheere-Terpstra test or Williams test) if the dose-response is approximately monotone.
Grib galdegangen, og afskær galdeblæren.
Additional information can also be obtained from the OECD Document on Current Approaches to Statistical Analysis of Ecotoxicity Data (27).
Sørg for ikke at ødelægge galdeblæren.
Reporting of test results
Grib spiserøret, og afskær mave-tarm-kanalen fra leveren på samme måde.
Study data should include:
Afskær den bageste del af mave-tarm-kanalen fra anus, og fjern kanalen fra bughulen.
Responsible personnel and their study responsibilities
Fjern fedtmassen og andet væv fra leverens periferi.
Each laboratory should have demonstrated proficiency using a range of representative chemicals
Sørg for ikke at ridse leveren.
Characterisation of test chemical
Grib området ved den hepatiske portal med en præcisionspincet, og fjern leveren fra bughulen.
Physical nature and relevant physicochemical properties
Mål leverens vægt med et 1,5 ml mikrorør som tara med en elektronisk analysevægt.
Solvent:
Registrer værdien på arbejdsarket (aflæsning: 0,1 mg).
Characterization of solvent (nature, concentration used)
Bekræft identifikationsinformationen på mikrorørets etiket.
Justification of choice of solvent (if other than water)
Luk låget på det mikrorør, der indeholder leveren.
Test animals:
Opbevar det på et kølestativ (eller isstativ).
Species and strain
Efter udskæringen af en lever rengøres dissektionsinstrumenterne eller erstattes med rene instrumenter.
Supplier and specific supplier facility
Når leverne er skåret ud af alle fisk i transportbeholderen (dvs. alle hanner eller hunner i et testkammer), anbringes alle leverprøver i et reagensglasstativ med en identifikationsetiket og opbevares i en fryser.
Details of animal acclimation procedure
Når leverne gives til forbehandling kort efter udskæringen, bæres prøverne til den næste arbejdsstation på et kølestativ (eller isstativ).
Body weight of the fish at the start of the exposure (from a sub-sample of the fish stock)
Efter udskæring af leveren kan fiskekadaveret anvendes til måling af sekundære kønskarakteristika.
Test Conditions:
Prøve
Test procedure used (test-type, loading rate, stocking density, etc.);
Opbevar leverprøver udtaget fra testfisken ved ≤ – 70 °C, hvis de ikke bruges til forbehandling kort efter udskæringen.
Method of preparation of stock solutions and flow-rate;
Der foretages et snit lige foran brystfinnerne med en saks.
The nominal test concentrations, weekly measured concentrations of the test solutions and analytical method used, means of the measured values and standard deviations in the test vessels and evidence that the measurements refer to the concentrations of the test chemical in true solution;
Bugvæggene spredes med pincet for at blotlægge leveren og andre indre organer.
Detailed information on feeding (e.g. type of food(s), source, amount given and frequency and analyses for relevant contaminants if available (e.g. PCBs, PAHs and organochlorine pesticides).
Figur 4
Data on mortalities occurring in any of the test concentrations and control;
Figur 5
Data on biological observations of gross morphology, including secondary sex characteristics and vitellogenin;
Indvoldene tages forsigtigt ud med pincet.
Results of the data analyses preferably in tabular and graphical form;
Figur 6
Incidence of any unusual reactions by the fish and any visible effects produced by the test chemical
Figur 7 (hun)
This section contains a few considerations to be taken into account in the interpretation of test results for the various endpoints measured.
Den afsluttede procedure.
It is important to have at least one treatment where there are no signs of toxic effects.
Japansk risfisk (Oryzias latipes), forbehandling af lever med henblik på vitellogeninanalyse
For example, it is possible that production of VTG in females can also be affected by general toxicity and non-endocrine toxic modes of action, e.g. hepatotoxicity.
Hvis leveren f.eks. vejer 4,5 mg, skal der bruges 225 μl homogenatbuffer til leveren.
Examples of the range of values encountered in control and treatment groups are available in the validation reports (1, 2, 3, 4).
Udarbejd en liste over homogenatbuffervolumen for alle levere.
High VTG values in control males could compromise the responsiveness of the assay and its ability to detect weak oestrogen agonists.
Klargøring af leveren til forbehandling
Low VTG values in control females could compromise the responsiveness of the assay and its ability to detect aromatase inhibitors and oestrogen antagonists.
Tag 1,5 ml-mikrorøret, der indeholder leveren, ud af fryseren umiddelbart inden forbehandlingen.
The validation studies were used to build that guidance.
Forbehandling af leveren fra hanner bør foretages før forbehandlingen af leveren fra hunner for at forhindre vitellogeninkontaminering.
If a laboratory has not performed the assay before or substantial changes (e.g. change of fish strain or supplier) have been made it is advisable that a technical proficiency study is conducted.
Forbehandlingen til testgrupperne bør desuden foregå i følgende rækkefølge:
It is recommended that chemicals covering a range of modes of action or impacts on a number of the test endpoints are used.
Antallet af 1,5 ml-mikrorør, som indeholder leverprøver taget fra fryseren, må på et givet tidspunkt ikke overstige det antal, der kan centrifugeres på det pågældende tidspunkt.
In practice, each laboratory is encouraged to build its own historical control data for males and females and to perform a positive control chemical for estrogenic activity (e.g. 17β-estradiol at 100 ng/l, or a known weak agonist) resulting in increased VTG in male fish, a positive control chemical for aromatase inhibition (e.g. fadrozole or prochloraz at 300 μg/l) resulting in decreased VTG in female fish, and a positive control chemical for androgenic activity (e.g. 17β-trenbolone at 5 μg/l) resulting in induction of secondary sex characteristics in female fathead minnow and medaka.
Arranger 1,5 ml-mikrorørene med leverprøverne i samme rækkefølge som prøvenummeret på isstativet (det er ikke nødvendigt at optø leveren).
All these data can be compared to available data from the validation studies (1, 2, 3) to ensure laboratory proficiency.
Udførelse af forbehandlingen
In general, vitellogenin measurements should be considered positive if there is a statistically significant increase in VTG in males (p < 0,05), or a statistically significant decrease in females (p < 0,05) at least at the highest dose tested compared to the control group, and in the absence of signs of general toxicity.
Tilsætning af homogeniseringsbufferen
A positive result is further supported by the demonstration of a biologically plausible relationship between the dose and the response curve.
Se på listen, hvilket homogenatbuffervolumen der skal bruges til en specifik leverprøve, og juster mikropipetten (volumeninterval: 100-1000 μl) til det rette volumen.
As mentioned earlier, the vitellogenin decrease may not entirely be of endocrine origin;
Sæt en ren spids på mikropipetten.
however a positive result should generally be interpreted as evidence of endocrine activity in vivo, and should normally initiate actions for further clarification.
Tag homogenatbufferen fra reagensglasset, og tilsæt bufferen til 1,5 ml-mikrorøret med leveren.
Vitellogenin induction by 17β-estradiol and 17β-ethinylestradiol in male zebrafish (Danio rerio).
Tilsæt homogenatbuffer til alle 1,5 ml-mikrorør med lever i henhold til ovennævnte procedure.
Development of an ELISA for determination of the hepatic vitellogenin in Medaka (Oryzias latipes).
Det er ikke nødvendigt at sætte en ny spids på mikropipetten.
Fish full life-cycle testing for androgen methyltestosterone on medaka (Oryzias latipes).
Hvis spidsen er kontamineret eller mistænkes for at være det, skal den dog udskiftes.
Screening and testing for endocrine disruption in fish-biomarkers as “signposts”, not “traffic lights”, in risk assessment.
Homogenisering af leveren
Effects of waterborne exposure to 17β-estradiol on secondary sex characteristics and gonads of the fathead minnow (Pimephales promelas).
Sæt en ny støder på homogenisatoren med henblik på homogenisering.
Villeneuve and G.T.
Indfør støderen i 1,5 ml-mikrorøret.
Ankley.
Hold homogenisatoren, således at leveren presses mellem støderens overflade og mikrorørets indervæg.
Abbreviations & definitions
Kør homogenisatoren i 10-20 sekunder.
Chemical
Afkøl mikrorøret med knust is under operationen.
A substance or a mixture
Løft støderen op af mikrorøret, og hold den stille i omkring ti sekunder.
Coefficient of variation.
Hvis stykker af lever observeres i suspensionen, gentages trin (3) og (4) for at fremstille et tilfredsstillende leverhomogenat.
Loading rate
Afkøl det opslæmmede leverhomogenat på isstativet indtil centrifugering.
Wet weight of fish per volume of water.
Udskift støderen for hvert homogenat.
Stocking density
Homogeniser alle levere med homogenatbuffer i henhold til ovennævnte procedure.
Number of fish per volume of water.
Centrifugering af det opslæmmede leverhomogenat
VTG (Vitellogenin)
Kontroller, at temperaturen i det afkølede centrifugekammer er på ≤ 5 °C.
Phospholipoglycoprotein precursor to egg yolk protein that normally occurs in sexually active females of all oviparous species.
Indsæt 1,5 ml-mikrorørene med det opslæmmede leverhomogenat i den afkølede centrifuge (juster om nødvendigt balancen).
HPG axis
Centrifuger det opslæmmede leverhomogenat ved 13000 g i 10 min. ved ≤ 5 °C.
Hypothalamic-pituitary-gonadal axis.
Hvis supernatanterne er tilstrækkeligt separeret, kan centrifugalkraften og tiden dog justeres efter behov.
MTC
Efter centrifugeringen kontrolleres det, at supernatanterne er tilstrækkeligt separeret (overflade: fedtstoffer, mellemlag: supernatant, nederste lag: levervæv).
Maximum Tolerated Concentration, representing about 10 % of the LC50.
Hvis separationen ikke er tilstrækkelig, centrifugeres suspensionen igen under samme betingelser.
Experimental conditions for the fish endocrine screening assay
Fjern alle prøver fra den afkølede centrifuge, og arranger dem i samme rækkefølge som prøvenummeret på isstativet.
Recommended species
Sørg for ikke at resuspendere de enkelte separerede lag efter centrifugeringen.
Fathead minnow
Indsamling af supernatanten
(Pimephales promelas)
Anbring fire 0,5 ml-mikrorør til opbevaring af supernatanten i reagensglasstativet.
Medaka (Oryzias latipes)
Indsaml 30 μl af hver supernatant (separeret som det mellemliggende lag) med mikropipetten, og fyld det i et 0,5 ml-mikrorør.
Zebrafish
Sørg for ikke at indsamle fedtstoffet på overfladen eller levervævet i det nederste lag.
Test type
Fyld derefter supernatanten i det sidste mikrorør.
Illumination quality
Luk mikrorørets låg, og angiv supernatantens volumen på etiketten.
Fluorescent bulbs (wide spectrum)
Afkøl derefter straks mikrorørene på isstativet.
Light intensity 10-20 μE/m2/s, 540-1000 lux, or 50-100 ft-c (ambient laboratory levels)
Sæt en ny spids på mikropipetten for hver supernatant.
10-20 μE/m2/s, 540-1000 lux, or 50-100 ft-c (ambient laboratory levels)
Hvis en stor mængde fedtstoffer sætter sig fast i spidsen, skal den straks udskiftes, for at forhindre at leverekstraktet kontamineres med fedtstoffet.
Photoperiod (dawn/dusk transitions are optional, however not considered necessary)
Fordel hele den centrifugerede supernatant i fire 0,5 ml-mikrorør i henhold til ovennævnte procedure.
16 h light, 8 h dark
Når supernatanten er fordelt i mikrorørene, anbringes de alle i reagensglasstativet med identifikationsetiketten og nedfryses straks.
12-16 h light, 12-8 h dark
Hvis VTG-koncentrationerne måles umiddelbart efter forbehandlingen, holdes et af mikrorørene (som indeholder 30 μl supernatant) afkølet i reagensglasstativet og overføres til den arbejdsstation, hvor ELISA-assayet udføres.
< 5 g per l
I givet fald anbringes de resterende mikrorør i reagensglasstativerne og fryses i fryseren.
Test chamber size
Når supernatanten er indsamlet, kasseres remanensen med det samme.
10 l (minimum)
Opbevaring af prøven
2 l (minimum)
Opbevar mikrorørene med supernatanten fra leverhomogenatet ved ≤ -70 °C, indtil de skal bruges til ELISA-assayet.
5 l (minimum)
Fremgangsmåde 3A:
Test solution volume
Zebrafisk, indsamling af blod fra halevenen/-arterien
8 l (minimum)
Umiddelbart efter bedøvelse afskæres haleroden på tværs, og blod indsamles fra halevenen/-arterien med et hepariniseret mikrohæmatokrit-kapillærrør.
l (minimum)
Blodvolumenerne er 5-15 μl afhængigt af fiskens størrelse.
4 l (minimum)
Et tilsvarende volumen aprotininbuffer (6 μgml i PBS) tilsættes til mikrokapillærrøret, og plasma separeres fra blodet ved centrifugering (fem minutter ved 600 g).
Volume exchanges of test solutions
Plasma indsamles i testrørene og opbevares ved -20 °C, indtil de skal analyseres for vitellogenin eller andre proteiner af interesse.
Minimum of 6 daily
Fremgangsmåde 3B:
Minimum of 5 daily
Zebrafisk, indsamling af blod ved hjertepunktur
Age of test organisms See paragraph 20
For at undgå koagulering af blod og nedbrydning af protein indsamles prøverne i phosphatbufret saltvand (PBS), som indeholder heparin (1000 enheder/ml) og proteaseinhibitoren aprotinin (2 TIU/ml).
See paragraph 20
Det anbefales at bruge ammonium-heparinsalt og lyofiliseret aprotinin som bestanddele i bufferen.
See paragraph 20 12.
Det anbefales at bruge en kanyle (1 ml) med en fast tynd nål (f.eks. Braun Omnikan-F) til blodprøveudtagning.
Approximate wet weight of adult fish (g) Females:
Kanylen bør på forhånd være påfyldt buffer (ca. 100 μl) for helt at eluere de små volumener blod fra hver fisk.
1,5 ± 20 %
Blodprøverne udtages ved hjertepunktur.
Males:
Først bedøves fisken med MS-222 (100 mg/l).
2,5 ± 20 %
Ved det rette anæstesiniveau kan brugeren identificere zebrafiskens hjerteslag.
Females:
Under hjertepunktur holdes kanylens stempel under svagt tryk.
0,35 ± 20 %
Der kan indsamles 20-40 mikroliter blod.
0,65 ± 20 %
Efter hjertepunktur fyldes blod/buffer-blandingen i reagensglasset.
0,4 ± 20 %
Plasma separeres fra blodet ved centrifugering (20 min.; 5000 g) og opbevares ved – 80 °C, indtil det skal analyseres.
No. of fish per test vessel
Fremgangsmåde 3C:
6 (2 males and 4 females)
Standardprocedure:
10 (5 males and 5 females)
Fiskene bedøves og aflives i overensstemmelse med testbeskrivelsen.
= 3 (plus appropriate controls)
Hoved og hale skæres af fisken i overensstemmelse med figur 1.
No. vessels per treatment
Vigtigt:
4 minimum
Alle dissektionsinstrumenter og skærebrættet skylles og rengøres grundigt (f.eks. med 96 % ethanol) mellem håndtering af hver enkelt fisk for at forebygge »vitellogeninforurening« fra hunner eller inducerede hanner til ikke-inducerede hanner.
2 minimum
Snit bag
No. of fish per test concentration
Til kønskirtelhistologi
16 adult females and 8 males (4 females and 2 males in each replicate vessel)
Til VTG-analyse
10 adult females and 10 males (5 females and 5 males in each replicate vessel)
Til VTG-analyse
Feeding regime
Den samlede vægt af hoved og hale fra hver fisk måles til nærmeste mg.
Live or frozen adult or nauplii brine shrimp two or three times daily (ad libitum), commercially available food or a combination of the above
Når delene er vejet, anbringes de i passende rør (f.eks. 1,5 ml eppendorf) og fryses ved — 80 °C indtil homogenisering eller homogeniseres direkte på is med to plastpistiller.
Brine shrimp nauplii two or three times daily (ad libitum), commercially available food or a combination of the above
(Der kan bruges andre metoder, hvis de anvendes på is, og resultatet er en homogen masse).
None unless DO concentration falls below 60 % air saturation
Rørene nummereres korrekt, så fiskens hoved og hale kan knyttes til deres respektive kropsparti, der benyttes til histologisk undersøgelse af kønskirtlerne.
Clean surface, well or reconstituted water or dechlorinated tap water
Når der er opnået en homogen masse, tilsættes en mængde iskold homogeniseringsbuffer på 4 gange vævsvægten.
Pre-exposure period
Arbejd til stadighed med pistillerne, indtil blandingen er homogen.
7 days recommended
Vigtigt:
Chemical exposure duration
Der bruges nye pistiller til hver fisk.
Biological endpoints
Prøverne lægges på is indtil centrifugering ved 4 °C ved 50000 × g i 30 min.
survival
Anvend en pipette til at fordele portioner a 20 μl supernatant i mindst to rør ved at dyppe spidsen af pipetten ned under fedtlaget på overfladen og omhyggeligt suge supernatanten op uden dele af hverken fedt eller pellets.
behaviour
Rørene opbevares ved — 80 °C indtil brug.
sex characteristics
Homogeniseringsbuffer:(50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 % proteaseinhibitorblanding (Sigma)):
VTG
12 mM Tris-HCl pH 7,4 + 120 μl proteaseinhibitorblanding.TRIS:
Test acceptability
TRIS-ULTRA PURE (ICN), f.eks. fra Bie & Berntsen, Danmark.Proteaseinhibitorblanding:
Dissolved oxygen > 60 % of saturation;
Fra Sigma (til pattedyrvæv), produktnummer P 8340.Bemærk:
mean temperature of 25 ± 2 °C;
Homogeniseringsbufferen skal anvendes på fremstillingsdagen.
90 % survival of fish in the controls;
Anbringes på is under brug.
measured test concentrations within 20 % of mean measured values per treatment level.
Vitellogeninspikede prøver og referencestandard for assayet
mean temperature of 24 ± 2 °C;
På hver dag, hvor der gennemføres vitellogeninassay, analyseres en spiket prøve, der fremstilles med en referencestandard for assayet.
mean temperature of 26 ± 2 °C;
Det vitellogenin, der bruges til at fremstille referencestandarden for assayet, vil være fra et andet parti end det, der bruges til at fremstille kalibrereringsstandarder for det udførte assay.
Some chemical characteristics of acceptable dilution water
Den spikede prøve fremstilles ved at tilsætte en kendt mængde af standarden for assayet til en prøve af plasma fra hanner i kontrollerne.
< 20 mg/l
Prøven spikes til en vitellogeninkoncentration på 10-100 gange den forventede vitellogeninkoncentration for hanner i kontrollerne.
< 2 mg/l
Den spikede prøve af plasma fra hanner i kontrollerne kan være fra en enkelt fisk eller en kombination af flere fisk.
Total organophosphorus pesticides
En underprøve af ikke-spiket plasma fra hanner i kontrollerne analyseres i mindst to brønde.
Appendix 4A
Den spikede prøve analyseres også i mindst to brønde.
Spawning substrate for zebrafish
Den gennemsnitlige mængde vitellogenin i de to ikke-spikede prøver af plasma fra hanner i kontrollerne lægges til den beregnede mængde vitellogenin, der tilsættes til prøverne for at bestemme en forventet koncentration.
Spawning tray
Forholdet mellem denne forventede koncentration og den målte koncentration registreres i rapporten sammen med resultaterne af hvert sæt assay gennemført på den pågældende dag.
all glass instrument dish, for example 22 × 15 × 5,5 cm (l × w × d), covered with a removable stainless steel wire lattice (mesh width 2 mm).
Beslutningsflowdiagram til statistisk analyse Dunns test på repli-katgennems nit
The lattice should cover the opening of the instrument dish at a level below the brim.
Dunnetts test på indlejret ANOVA
On the lattice, spawning substrate should be fixed.
Variansstabiliserende transformation?
It should provide structure for the fish to move into.
Variansstabiliserende transformation
For example, artificial aquaria plants made of green plastic material are suitable (NB: possible adsorption of the test chemical to the plastic material should be considered).
Step-down trend test på replikatgennemsnit
The transparent eggs are non-adhesive and can easily be counted by using transversal light.
Tamhane-Dunnett-test på indlejret ANOVA
The spawning tray should be removed, the eggs collected and the spawning tray re-introduced in the test vessel, either as late as possible in the evening or very early in the morning.