natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Den form, som nukleoider får efter at været udsat for et elektroforetisk felt, på grund af ligheden med kometer: hovedet er kernen, og halen udgøres af DNA'et, der migrerer ud af kernen i det elektriske felt.
The liver has been the tissue most frequently studied and for which there are the most data.
En kritisk variabel/parameter
Therefore, in the absence of any background information, and if no specific tissues of interest are identified, sampling the liver would be justified as this is a primary site of xenobiotic metabolism and is often highly exposed to both parent substance(s) and metabolite(s).
En protokolvariabel, hvor en lille ændring kan få stor indvirkning på assayets konklusion.
In some cases, examination of a site of direct contact (for example, for orally-administered chemicals the glandular stomach or duodenum/jejunum, or for inhaled chemicals the lungs) may be most relevant.
Kritiske variabler kan være vævsspecifikke.
Additional or alternative tissues should be selected based on the specific reasons for the test is being conducted but it may be useful to examine multiple tissues in the same animals providing the laboratory has demonstrated proficiency with those tissues and competency in handling multiple tissues at the same time.
Kritiske variabler bør ikke ændres, især ikke under en test, uden at der er taget hensyn til, hvordan ændringen vil ændre en assayresponsen, f.eks. som angivet af størrelsen og variationen i positive og negative kontroller.
Preparation of specimens
Testrapporten bør indeholde en opgørelse over ændringer af kritiske variabler, der er foretaget under testen eller sammenholdt med standardprotokollen for laboratoriet, samt en begrundelse for hver ændring.
For the processes described in the following paragraphs (44-49) it is important that all solutions or stable suspensions should be used within their expiration date, or should be freshly prepared if needed.
Halens intensitet eller den procentvise DNA-intensitet
Also in the following paragraphs, the times taken to (i) remove each tissue after necropsy, (ii) process each tissue into cell/nuclei suspensions, and (iii) process the suspension and prepare the slides are all considered critical variables (see Definitions, Appendix 1), and acceptable lengths of time for each of these steps should have been determined during establishment of the method and demonstration of proficiency.
Dette svarer til komethalens intensitet i forhold til den samlede intensitet (hoved plus hale).
Animals will be euthanised, consistent with effective animal welfare legislation and 3Rs principles, at the appropriate time(s) after the last treatment with a test chemical.
Det afspejler mængden af DNA-brud, udtrykt som procentdel.
Selected tissue(s) is removed, dissected, and a portion is collected for the comet assay, whilst at the same time a section from the same part of the tissue should be cut and placed in formaldehyde solution or appropriate fixative for possible histopathology analysis (see paragraph 55) according to standard methods (12).
FAKTORMODEL TIL IDENTIFIKATION AF KØNSBETINGEDE FORSKELLE I IN VIVO-KOMETASSAYET
The tissue for the comet assay is placed into mincing buffer, rinsed sufficiently with cold mincing buffer to remove residual blood, and stored in ice-cold mincing buffer until processed.
I denne model testes mindst 5 hanner og 5 hunner på hvert koncentrationsniveau, hvilket betyder, at der med denne model anvendes mindst 40 dyr (20 hanner og 20 hunner, plus relevante positive kontroller).
In situ perfusion may also be performed, e.g. for liver, kidney.
Analysen opdeler variationen i datasættet i variationen mellem kønnene, mellem koncentrationerne og i relation til interaktionen mellem kønnene og koncentrationerne.
Many published methods exist for cell/nuclei isolation.
Fuldstændige oplysninger om den underliggende metode fås i mange statistiske standardlærebøger (jf. referencer) og i hjælpefunktionerne i de statistiske pakker.
These include mincing of tissues such as liver and kidney, scraping mucosal surfaces in the case of the gastro-intestinal tract, homogenization and enzymic digestion.
BEGRÆNSNINGER I ASSAYET
The JaCVAM validation trial only studied isolated cells, and therefore in terms of establishing the method and being able to refer to the JaCVAM trial data for demonstration of proficiency, isolated cells are preferred.
På grund af det aktuelle videnniveau er der adskillige begrænsninger forbundet med in vivo-kometassayet.
However, it has been shown that there was no essential difference in the assay result whether isolated cells or nuclei were used (8).
Det forventes, at disse begrænsninger vil blive mindre eller mere snævert defineret, da der er gjort flere erfaringer med at anvende assayet til besvarelse af sikkerhedsspørgsmål i lovgivningssammenhæng.
Also different methods to isolate cells/nuclei (e.g. homogenizing, mincing, enzymic digestion and mesh filtration) gave comparable results (55).
Nogle former for DNA-skader kan være kortvarige, dvs. at de muligvis repareres for hurtigt til, at de kan observeres i 24 timer eller mere efter sidste dosis.
Consequently, either isolated cells or isolated nuclei can be used.
Der findes ikke nogen påviselig liste over typer af kortvarige skader, heller ikke over de kemikalier, som kan forårsage denne type skader, og det vides heller ikke, over hvilket tidsrum denne type skader kan påvises.
A laboratory should thoroughly evaluate and validate tissue-specific methods of single cell/nuclei isolation.
Den/de optimale prøveudtagningstidspunkt/-er kan også være kemikalie- eller rutespecifikke, og prøveudtagningstidspunkter bør bestemmes ud fra kinetiske data (f.eks. det tidspunkt, Tmax, hvor den maksimale plasma- eller vævskoncentration opnås), når sådanne data foreligger.
As discussed in paragraph 40, the persistence of some of the lesions that lead to the DNA strand breaks detected by the comet assay may be very short (52) (53).
I de fleste af de valideringsundersøgelser, der underbygger denne forsøgsmetode, blev der foretaget obduktion to eller tre timer efter indgivelse af den sidste dosis.
Therefore, whatever method is used to prepare the single cell/nuclei suspensions, it is important that tissues are processed as soon as possible after the animals have been euthanised and placed in conditions that reduce the removal of lesions (e.g. by maintaining the tissue at low temperature).
I de fleste undersøgelser i litteraturen indgives den sidste dosis mellem 2 og 6 timer før aflivning.
The cell suspensions should be kept ice-cold until ready for use, so that minimal inter-sample variation and appropriate positive and negative control responses can be demonstrated.
Derfor er disse erfaringer brugt som grundlag for anbefalingen i forsøgsmetoden, nemlig at den sidste dosis, hvis der ikke foreligger data, bør indgives på et angivet tidspunkt mellem 2 og 6 timer før obduktion.
PREPARATION OF SLIDES
Der findes ingen kendte data for undersøgelse af testens følsomhed over for påvisning af kortvarige DNA-skader efter indgivelse i foder eller drikkevand sammenlignet med indgivelse med sonde.
Slide preparation should be done as soon as possible (ideally within one hour) after single cell/nuclei preparation, but the temperature and time between animal death and slide preparation should be tightly controlled and validated under the laboratory's conditions.
DNA-skader er konstateret efter indgivelse i foder og drikkevand, men der er relativt få rapporteringer heraf sammenlignet med den langt større erfaring med indgivelse med sonde og intraperitonal indgivelse.
The volume of the cell suspension added to low melting point agarose (usually 0,5-1,0 %) to make the slides should not reduce the percentage of low melting point agarose to less than 0,45 %.
Assayets følsomhed kan således mindskes for kemikalier, som fremkalder kortvarige skader, når de indgives i foder eller drikkevand.
The optimum cell density will be determined by the image analysis system used for scoring comets.
Der er ikke foretaget laboratorieundersøgelser af andet væv end lever og mave, og der er derfor ingen anbefaling til, hvordan der opnås en følsom og reproducerbar respons i andet væv end lever, såsom forventede positive og negative kontrolintervaller.
Lysis
For lever er der heller ikke opnået enighed om at fastsætte en nedre grænse for den negative kontrolværdi.
Lysis conditions are also a critical variable and may interfere with the strand breaks resulting from specific types of DNA modifications (certain DNA alkylations and base adducts).
Selv om det fremgår af flere publikationer, at cytotoksicitet har en forvirrende effekt in vitro, findes der meget få data vedrørende cytotoksicitet in vivo, og det er derfor ikke muligt at anbefale en bestemt måling af cytotoksicitet.
It is therefore recommended that the lysis conditions be kept as constant as possible for all slides within an experiment.
Histopatologiske forandringer såsom inflammation, celleinfiltration og apoptotiske eller nekrotiske forandringer er blevet associeret med øget DNA-migration, men som påvist i JaCVAM-valideringstesten (OECD, 2014) resulterer disse ændringer ikke altid i positive kometresultater, og der findes derfor ikke en endelig liste over histopatologiske forandringer, som altid er forbundet med øget DNA-migration.
Once prepared, the slides should be immersed in chilled lysing solution for at least one hour (or overnight) at around 2-8 °C under subdued lighting conditions e.g. yellow light (or light proof) that avoid exposure to white light that may contain UV components.
Pindsvin (eller skyer, spøgelsesceller) er tidligere blevet foreslået som en indikator for cytotoksicitet, men ætiologien for disse pindsvin er usikker.
After this incubation period, the slides should be rinsed to remove residual detergent and salts prior to the alkali unwinding step.
Nogle data tyder på, at de kan være forårsaget af kemikalierelateret cytotoksicitet, mekanisk/enzym-induceret skade, der er opstået under fremstillingen af prøven (Guerard et al.2014), og/eller en mere ekstrem virkning af testkemikaliets genotoksicitet.
This can be done using purified water, neutralization buffer or phosphate buffer.
Andre data synes at vise, at de skyldes omfattende DNA-skader, som måske kan repareres (Lorenzo et al., 2013).
Electrophoresis buffer can also be used.
Væv eller cellekerner er med held blevet frosset ned med henblik på senere analyse.
This would maintain the alkaline conditions in the electrophoresis chamber.
Dette resulterer normalt i en målelig virkning på responsen på bærestoffet og den positive kontrol (Recio et al., 2010, Recio et al., 2012, Jensen et al., 2013).
Unwinding and electrophoresis
Hvis der anvendes nedfrysning, bør laboratoriet dokumentere kompetence med hensyn til nedfrysningsmetoder samt bekræfte acceptable lave intervaller i den procentvise DNA-intensitet i halen i målvæv fra dyr behandlet med bærestof, og at der stadig kan påvises positive responser.
Slides should be randomly placed onto the platform of a submarine-type electrophoresis unit containing sufficient electrophoresis solution such that the surfaces of the slides are completely covered (the depth of covering should also be consistent from run to run).
Litteraturen indeholder eksempler på forskellige metoder til nedfrysning af væv.
In another type of comet assay electrophoresis units i.e. with active cooling, circulation and high capacity power supply a higher solution covering will result in higher electric current while the voltage is kept constant.
På nuværende tidspunkt er der ikke enighed om, hvordan væv bedst nedfryses og optøes, og hvordan det vurderes, om en potentielt ændret respons kan påvirke testens følsomhed.
A balanced design should be used to place slides in the electrophoresis tank to mitigate the effects of any trends or edge effect within the tank and to minimize batch-to-batch variability, i.e., in each electrophoresis run, there should be the same number of slides from each animal in the study and samples from the different dosage groups, negative and positive controls, should be included.
Nyere arbejde viser, at listen over kritiske variabler forventes at blive stedse kortere og parametrene for kritiske variabler mere præcist defineret (Guerard et al., 2014).
The slides should be left for at least 20 minutes for the DNA to unwind, and then subjected to electrophoresis under controlled conditions that will maximize the sensitivity and dynamic range of the assay (i.e. lead to acceptable levels of % tail DNA for negative and positive controls that maximize sensitivity).
I del C affattes kapitel C.13 således:
The level of DNA migration is linearly associated with the duration of electrophoresis, and also with the potential (V/cm).
Bioakkumulering i fisk: Eksponering i vand eller føde
Based on the JaCVAM trial this could be 0,7 V/cm for at least 20 minutes.
Denne forsøgsmetode svarer til OECD's testvejledning (Test Guideline (TG)) 305 (2012).
The duration of electrophoresis is considered a critical variable and the electrophoresis time should be set to optimize the dynamic range.
Det overordnede mål med denne revision af forsøgsmetoden er dobbelt.
Longer electrophoresis times (e.g. 30 or 40 minutes to maximize sensitivity) usually lead to stronger positive responses with known mutagens.
For det første er det hensigten at medtage en test af bioakkumulering i føde [20], der kan anvendes til at bestemme bioakkumuleringspotentialet for stoffer med meget lav vandopløselighed.
However longer electrophoresis times may also lead to excessive migration in control samples.
For det andet er formålet at skabe en forsøgsmetode, hvori der af dyrevelfærdshensyn benyttes færre fisk, når det er muligt, og som er mere omkostningseffektiv.
In each experiment the voltage should be kept constant, and the variability in the other parameters should be within a narrow and specified range, for example in the JaCVAM trial 0,7 V/cm delivered a starting current of 300 mA.
I årene siden vedtagelsen af den konsoliderede forsøgsmetode C.13 (1) er mange stoffer blevet testet, og der er opnået stor erfaring hos både laboratorier og myndigheder.
The depth of buffer should be adjusted to achieve the required conditions and maintained throughout the experiment.
Dette har ført til den overbevisning, at testen kan gøres mindre kompleks, hvis bestemte kriterier er opfyldt (jf. punkt 88), og at en trinvis fremgangsmåde er mulig.
The current at the start and end of the electrophoresis period should be recorded.
Erfaringerne viser også, at biologiske faktorer såsom vækst og fiskenes fedtindhold kan have stor indflydelse på resultaterne og måske skal tages i betragtning.
The optimum conditions should therefore be determined during the initial demonstration of proficiency in the laboratory concerned with each tissue studied.
Dertil kommer, at man har erkendt, at test af stoffer, der er meget tungtopløselige i vand, måske ikke er teknisk gennemførlige.
The temperature of the electrophoresis solution through unwinding and electrophoresis should be maintained at a low temperature, usually 2-10 °C (10).
For stoffer med meget lav vandopløselighed i vandmiljøet kan eksponering i vand være af begrænset betydning sammenlignet med eksponering i føde.
The temperature of the electrophoresis solution at the start of unwinding, the start of electrophoresis, and the end of electrophoresis should be recorded.
Dette har ført til udviklingen af en forsøgsmetode, hvor fisk eksponeres for stoffer i foderet (jf. punkt 7-14 og 97 ff).
After completion of electrophoresis, the slides should be immersed/rinsed in the neutralization buffer for at least 5 minutes.
En validering (ringtest) af eksponering i føde blev foretaget i 2010 (51).
Gels can be stained and scored “fresh” (e.g. within 1-2 days) or can be dehydrated for later scoring (e.g. within 1-2 weeks after staining) (56).
De vigtigste ændringer omfatter:
However, the conditions should be validated during the demonstration of proficiency and historical data should be obtained and retained separately for each of these conditions.
Test af kun en testkoncentration kan anses for at være tilstrækkelig, når det er sandsynligt, at biokoncentreringsfaktoren (BCF) er uafhængig af testkoncentrationen.
In case of the latter, slides should be dehydrated by immersion into absolute ethanol for at least 5 minutes, allowed to air dry, and then stored, either at room temperature or in a container in a refrigerator until scored.
Et begrænset testdesign for eksponering i vand med et reduceret antal prøveudtagningspunkter er muligt, hvis bestemte kriterier er opfyldt.
Methods of Measurement
Fiskens fedtindhold bør måles, så BCF kan udtrykkes på grundlag af et fedtindhold på 5 %.
Comets should be scored quantitatively using an automated or semi-automated image-analysis system.
Større fokus på skøn over kinetisk BCF (når det er muligt) samt skøn over BCF ved ligevægt.
The slides will be stained with an appropriate fluorescent stain e.g. SYBR Gold, Green I, propidium iodide or ethidium bromide and measured at a suitable magnification (e.g. 200x) on a microscope equipped with epi-fluorescence and appropriate detectors or a digital (e.g. CCD) camera.
For visse stofgrupper foreslås en test med eksponering i foder, når dette anses for at være mere hensigtsmæssigt end en test med eksponering i vand.
Cells may be classified into three categories as described in the atlas of comet images (57), namely scorable, non-scorable and “hedgehog” (see paragraph 56 for further discussion).
Fiskenes vægt bør måles, således at BCFk kan korrigeres for vækstfortynding.
Only scorable cells (clearly defined head and tail with no interference with neighbouring cells) should be scored for % tail DNA to avoid artefacts.
Før bioakkumuleringen testes, bør følgende oplysninger om prøvestoffet være kendt:
There is no need to report the frequency of non-scorable cells.
Analyseteknikkens følsomhed med hensyn til at måle koncentrationer i væv, vand eller foder af både teststof og eventuelle metabolitter (jf. punkt 65).
The frequency of hedgehogs should be determined based on the visual scoring (since the absence of a clearly-defined head will mean they are not readily detected by image analysis) of at least 150 cells per sample (see paragraph 56 for further discussion) and separately documented.
Opløselighed i vand [TM A.6 (2)]; dette bør bestemmes i overensstemmelse med en metode, som er egnet til det (skønnede) opløselighedsinterval for at opnå en pålidelig værdi.
All slides for analysis, including those of positive and negative controls, should be independently coded and scored “blinded” so the scorer is unaware of the treatment condition.
For hydrofobe stoffer vil dette normalt være elueringsmetoden med kolonner.
For each sample (per tissue per animal), at least 150 cells (excluding hedgehogs — see paragraph 56) should be analysed.
n-octanol/vand-fordelingskoefficient KOW [21] [TM A.8 (4), A.24 (5), A.23 (6)], eller andre relevante oplysninger om fordelingsadfærd (f.eks. sorption til lipider, KOC); dette bør bestemmes ved hjælp af en metode, der gør det muligt med det (skønnede) interval for KOW at opnå en pålidelig værdi.
Scoring 150 cells per animal in at least 5 animals per dose (less in the concurrent positive control — see paragraph 29) provides adequate statistical power according to the analysis of Smith et al., 2008 (5).
For hydrofobe stoffer vil dette normalt være slow-stirring-metoden [TM A.23 (6)].
If slides are used, this could be from 2 or 3 slides scored per sample when five animals per group are used.
Stoffets stabilitet i vand (hydrolyse [TM C.7 (7)].
Several areas of the slide should be observed at a density that ensures there is no overlapping of tails.
Stoffets stabilitet i foder (især ved undersøgelser af eksponering i føde).
Scoring at the edge of slides should be avoided.
Oplysninger om fototransformation af relevans for irradiationsbetingelserne i testen (8).
DNA strand breaks in the comet assay can be measured by independent endpoints such as % tail DNA, tail length and tail moment.
Overfladespænding (dvs. for stoffer, hvor log KOW ikke kan bestemmes) [TM A.5 (9)]
All three measurements can be made if the appropriate image software analyser system is used.
Damptryk [TM A.4 (10)].
However, the % tail DNA (also known as % tail intensity) is recommended for the evaluation and interpretation of results (12) (40) (41) (42), and is determined by the DNA fragment intensity in the tail expressed as a percentage of the cell's total intensity (13).
Oplysninger om biotisk eller abiotisk nedbrydning i vand, herunder (men ikke begrænset til) let bionedbrydelighed [TM C.4, del II til VII (11), C.29 (12)], hvor det er relevant
Tissue damage and cytotoxicity
Oplysninger om metabolitter: struktur, log KOW, dannelse og nedbrydelighed, hvis det er relevant.
Positive findings in the comet assay may not be solely due to genotoxicity, target tissue toxicity may also result in increases in DNA migration (12) (41).
Syrestyrkekonstant (pKa) for stoffer, der kan ionisere.
Conversely, low or moderate cytotoxicity is often seen with known genotoxins (12), showing that it is not possible to distinguish DNA migration induced by genotoxicity versus that induced by cytotoxicity in the comet assay alone.
Om nødvendigt bør testvandets pH tilpasses for at sikre, at stoffet er ikke-ioniseret i testen, hvis dette er foreneligt med fiskearten.
However, where increases in DNA migration are observed, it is recommended that an examination of one or more indicators of cytotoxicity is performed as this can aid in interpretation of the findings.
Uafhængigt af den valgte eksponeringsmetode eller prøveudtagningsplan beskriver denne forsøgsmetode en fremgangsmåde til at karakterisere stoffers bioakkumuleringspotentiale i fisk.
Increases in DNA migration in the presence of clear evidence of cytotoxicity should be interpreted with caution.
Skønt gennemstrømningstestsystemer er langt at foretrække, er semistatiske systemer tilladt, forudsat at validitetskriterierne (jf. punkt 24 og 113) er opfyldt.
Many measures of cytotoxicty have been proposed and of these histopathological changes are considered a relevant measure of tissue toxicity.
Ved eksponering i foder er gennemstrømningssystemet ikke nødvendigt for at bevare koncentrationer af teststoffet i vand, men vil bidrage til at bevare passende koncentrationer af opløst ilt, sikre rent vand og fjerne indflydelse fra f.eks. udskillelsesprodukter.
Observations such as inflammation, cell infiltration, apoptotic or necrotic changes have been associated with increases in DNA migration, however, as demonstrated by the JaCVAM validation trial (12) no definitive list of histopathological changes that are always associated with increased DNA migration is available.
Uafhængigt af den valgte forsøgsmetode er denne forsøgsmetode så detaljeret beskrevet, at den kan udføres, samtidig med at der er tilstrækkelig frihed til at tilpasse tilrettelægningen af forsøgene til forholdene i forskellige laboratorier og til teststoffernes forskellige egenskaber.
Changes in clinical chemistry measures (e.g. AST, ALT), can also provide useful information on tissue damage and additional indicators such as caspase activation, TUNEL stain, Annexin V stain, etc. may also be considered.
Testen med eksponering i vand anvendes mest hensigtsmæssigt på stabile organiske stoffer med log KOW-værdier på mellem 1,5 og 6,0 (13), men kan også anvendes på stærkt hydrofobe stoffer (log KOW > 6,0), hvis der kan påvises en stabil og fuldt opløst koncentration af teststoffet i vand.
However, there are limited published data where the latter have been used for in vivo studies and some may be less reliable than others.
Hvis der ikke kan påvises en stabil koncentration af teststoffet i vand, er en undersøgelse af eksponering i vand ikke hensigtsmæssig, og der vil derfor være behov for at anvende en metode, hvor fiskene eksponeres for teststoffet i foderet (selv om fortolkning og anvendelse af resultaterne af undersøgelsen af eksponering i foder kan afhænge af lovrammerne).
Hedgehogs (or clouds, ghost cells) are cells that exhibit a microscopic image consisting of a small or non-existent head, and large diffuse tails and are considered to be heavily damaged cells, although the etiology of the hedgehogs is uncertain (see Appendix 3).