natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Et testsystem uden sediment har lav analytisk kompleksitet (kun i vandfasen), og resultaterne kan analyseres parallelt og/eller sammenlignes med de resultater, der opnås i Lemna sp.-tests (3).
Lift up the pestle from the 1,5 ml microtube and leave it at rest for about 10 seconds.
Derudover betyder de krævede sterile forhold, at virkningerne af mikroorganismer og alger (kemikalieoptagelse/nedbrydning mv.) så vidt muligt kan begrænses.
Then conduct a visual check of the state of the suspension.
Denne test erstatter ikke andre akvatiske toksicitetstest, men bør derimod supplere dem, så der kan foretages en mere fuldstændig fare- og risikovurdering af vandplanter.
If pieces of liver are observed in the suspension, repeat the operations (3) and (4) to prepare satisfactory liver homogenate.
Forsøgsmetoden er blevet valideret ved en ringtest (4).
Cool the suspended liver homogenate on the ice rack until centrifugation.
Der gives en nærmere beskrivelse af testen med udskiftning af testopløsningen (semistatisk test) og uden udskiftning (statisk).
Change the pestle to the new one for each homogenate.
Afhængigt af målsætningen for testen og myndighedernes krav anbefales det at bruge den semistatiske metode, f.eks. til stoffer, der hurtigt forlader opløsningen ved fordampning, adsorption, fotonedbrydning, hydrolyse, udfældning eller bionedbrydning.
Homogenise all livers with homogenate buffer according to the procedure described above.
Nærmere anvisninger er givet i (5).
Centrifugation of the suspended liver homogenate
Denne metode gælder for stoffer, som forsøgsmetoden er valideret for (se nærmere oplysninger i ringtestrapporten (4)), eller formuleringer eller kendte blandinger.
Confirm the temperature of the refrigerated centrifuge chamber at ≤ 5 °C.
Hvis en blanding testes, bør dens indhold så vidt muligt identificeres og kvantificeres.
Insert the 1,5 ml microtubes containing the suspended liver homogenate in refrigerated centrifuge (adjust the balance if necessary).
Forsøgsmetoden for sedimentfri Myriophyllum spicatum supplerer toksicitetstesten for vandsedimentet Myriophyllum spicatum (6).
Centrifuge the suspended liver homogenate at 13000 g for 10 min at ≤ 5 °C.
Før brug af forsøgsmetoden til lovmæssig test af en blanding bør det overvejes, om den vil give resultater, som er egnede til formålet, og i givet fald hvorfor.
However, if the supernatants are adequately separated, centrifugal force and time may be adjusted as needed.
Plantekulturer af Myriophyllum spicatum (kun i modificeret Andrews-medie, se tillæg 2), som dyrkes kontinuerligt, må dyrkes som monokulturer i forskellige koncentrationer af testkemikaliet over en periode på 14 dage i et sedimentfrit testsystem.
Following centrifugation, check that the supernatants are adequately separated (surface: lipid, intermediate: supernatant, bottom layer: liver tissue).
Testens formål er at kvantificere kemikalierelaterede virkninger på den vegetative vækst i dette tidsrum, baseret på vurdering af udvalgte målevariable.
If the separation is not adequate, centrifuge the suspension again under the same conditions.
Målevariablene er væksten i skuddene i længden, af sidegrene og rødder samt udvikling af frisk- og tørvægt og forøgelse af grenkranse.
Remove all specimens from the refrigerated centrifuge and arrange them in the order of specimen number on the ice rack.
Desuden tages der hensyn til særlige kvalitative ændringer i testorganismer såsom vansiring eller chlorose og nekrose, som kan ses ved gulnede eller hvide og brune farver.
Be careful not to resuspend each separated layer after the centrifugation.
De kemikalierelaterede virkninger kvantificeres ved, at væksten i testopløsningerne sammenholdes med væksten i kontrollerne, hvorudfra man bestemmer den koncentration, som frembringer en bestemt hæmning på x % af væksthastigheden, og som betegnes ECx; “x” kan være en vilkårlig værdi afhængigt af lovkravene, f.eks. EC10, EC20, EC50.
Collection of the supernatant
Det bør bemærkes, at estimater af EC10- og EC20-værdier kun er pålidelige og relevante i test, hvor variationskoefficienterne i kontrolplanterne falder til under det anslåede effektniveau, dvs. variationskoefficienterne bør være < 20 % for at give et robust skøn af EC20.
Place four 0,5 ml microtubes for storage of the supernatant into the tube rack.
Både den gennemsnitlige specifikke væksthastighed (anslået ud fra vurderinger af længden af hovedskuddene og tre yderligere målevariable) og udbytte (anslået ud fra den øgede længde af hovedskuddene og tre yderligere målevariable) af ubehandlede og behandlede planter bør bestemmes.
Collect 30 μl of each supernatant (separated as the intermediate layer) with the micropipette and dispense it to one 0,5 ml microtube.
Den specifikke væksthastighed (r) og udbyttet (y) anvendes efterfølgende til at bestemme henholdsvis ErCx (f.eks. ErC10, ErC20, ErC50) og EyCx (f.eks. EyC10, EyC20, EyC50).
Be careful not to collect the lipid on the surface or the liver tissue in the bottom layer.
Derudover kan den laveste koncentration med observeret effekt (LOEC) og nuleffektkoncentrationen (NOEC) bestemmes statistisk.
Collect the supernatant and dispense it to other two 0,5 ml microtubes in the same manner as described above.
Der bør foreligge en tilstrækkeligt følsom analysemetode til kvantitativ bestemmelse af testkemikaliet i testmediet.
Collect the rest of the supernatant with the micropipette (if feasible: ≥ 100 μl).
Af oplysninger om testkemikaliet, der kan være nyttige ved fastsættelse af testbetingelserne, kan nævnes strukturformel, renhed og urenheder, vandopløselighed, stabilitet i vand, lysstabilitet, syrestyrkekonstant (pKa) fordelingskoefficient octanol/vand (Kow), damptryk og bionedbrydelighed.
Then dispense the supernatant to the remaining 0,5 ml microtube.
Vandopløseligheden og damptrykket kan bruges til at beregne Henrys konstant, som angiver, om der kan forventes væsentligt tab af testkemikalie i løbet af testperioden.
Close the cap of the 0,5 ml microtube and write the volume of the supernatant on the label.
Kontrollen af testmediets pH-værdi er særlig vigtig, f.eks. ved test af metaller eller stoffer, som er hydrolytisk ustabile.
Then immediately cool the microtubes on the ice rack.
I OECD's vejledning (5) findes der yderligere vejledning i test af kemikalier, hvis fysisk-kemiske egenskaber vanskeliggør testen.
Change the tip of the micropipette to the new one for each supernatant.
For at testen skal være gyldig, skal fordoblingstiden for længden af hovedskuddene være mindre end 14 dage.
If a large amount of lipid becomes attached to the tip, change it to the new one immediately to avoid contamination of the liver extract with fat.
Med de medier og testbetingelser, der er beskrevet i denne forsøgsmetode, kan dette kriterium opfyldes ved at gennemføre testen under statiske eller semistatiske betingelser.
Dispense all of the centrifuged supernatant to four 0,5 ml microtubes according to the procedure described above.
Den gennemsnitlige variationskoefficient for udbytte baseret på målinger af vægten af friske skud (dvs. fra testen påbegyndes, til den afsluttes) og de supplerende målevariable (jf. punkt 37) i kontrolkulturerne må ikke overstige 35 % mellem replikaterne.
After dispensing the supernatant to the 0,5 ml microtubes, place all of them in the tube rack with the identification label, and then freeze them in the freezer immediately.
Mere end 50 % af replikaterne af kontrolgruppen holdes sterile i eksponeringsperioden på 14 dage, hvilket betyder, at de er synligt fri for forurening med andre organismer såsom alger, svampe og bakterier (klar opløsning).
If the VTG concentrations are measured immediately after the pre-treatment, keep one 0,5 ml microtube (containing 30 μl of supernatant) cool in the tube rack and transfer it to the workstation where the ELISA assay is conducted.
Bemærk: Vejledning i vurdering af sterilitet i ringtestraport (4).
In such case, place the remaining microtubes in the tube racks and freeze them in the freezer.
REFERENCEKEMIKALIE
After the collection of the supernatant, discard the residue adequately.
Referencekemikalie(r), f.eks. 3,5-dichlorphenol anvendt i ringtest (4), kan testes som en metode til at kontrollere forsøgsmetoden; på grundlag af ringtestdata ligger de gennemsnitlige EC50-værdier for 3,5-DCP for de forskellige responsvariable (jf. punkt 37-41 i denne forsøgsmetode) mellem 3,2 mg/l og 6,9 mg/l (se ringtestrapporten for oplysninger om konfidensinterval for disse værdier).
Storage of the specimen
Det tilrådes, at test af et referencekemikalie finder sted mindst to gange årligt eller, hvis testfrekvensen er lavere, sideløbende med toksicitetsbestemmelsen af et testkemikalie.
Store the 0,5 ml microtubes containing the supernatant of the liver homogenate at ≤ – 70 °C until they are used for the ELISA.
Alt udstyr, der kommer i berøring med testmedierne, bør være udført helt i glas eller andet kemisk inaktivt materiale.
Procedure 3A:
Glasapparatur, der anvendes til dyrkning og test, bør være renset for kemiske kontaminanter, der kan udvaskes i testmediet, og bør være sterilt.
Zebrafish, Blood Collection from the Caudal Vein / Artery
Testbeholderne bør være lange nok til, at skuddet i kontrolbeholderne kan vokse i vandfasen uden dog at nå op til overfladen af testmediet ved testens afslutning.
Immediately following anaesthesia, the caudal peduncle is severed transversely, and the blood is removed from the caudal artery/vein with a heparinised microhematocrit capillary tube.
Det anbefales at anvende tykvæggede reagensglas af borsilikat uden kant med en indvendig diameter på ca. 20 mm, en længde på ca. 250 mm og aluminiumslukkekapsler.
Blood volumes range from 5 to 15 microliters depending on fish size.
Da det modificerede Andrews-medium indeholder saccharose (der stimulerer væksten af svampe og bakterier), skal testopløsningerne fremstilles under sterile forhold.
An equal volume of aprotinin buffer (6 micrograms/ml in PBS) is added to the microcapillary tube, and plasma is separated from the blood via centrifugation (5 minutes at 600 g).
Alle væsker samt udstyr steriliseres inden brug.
Plasma is collected in the test tubes and stored at – 20 °C until analysed for VTG or other proteins of interest.
Sterilisering sker via behandling med opvarmet luft (210 °C) i fire timer eller autoklavering i 20 minutter ved 121 °C.
Procedure 3B:
Desuden skal alle flasker, fade, skåle mv. og andet udstyr underkastes flammebehandling ved en steril arbejdsbænk umiddelbart før brug.
Zebrafish, Blood Collection by Cardiac Puncture
Kulturerne og testbeholderne bør ikke opbevares sammen.
To avoid coagulation of blood and degradation of protein the samples are collected within Phosphate-buffered saline (PBS) buffer containing heparin (1000 units/ml) and the protease inhibitor aprotinin (2 TIU/ml).
Dette opnås bedst ved, at klimakamre, inkubatorer eller lokaler er separate.
As ingredients for the buffer, heparin, ammonium-salt and lyophilised aprotinin are recommended.
Belysning og temperatur bør kunne reguleres og holdes på et konstant niveau.
For blood sampling, a syringe (1ml) with a fixed thin needle (e.g. Braun Omnikan-F) is recommended.
Testorganisme
The syringe should be prefilled with buffer (approximately 100 microliter) to completely elute the small blood volumes from each fish.
Myriophyllum spicatum — en tokimbladet undervandsplante — er en art i tusindbladsfamilien.
The blood samples are taken by cardiac puncture.
Mellem juni og august stikker diskrete rosa-hvide blomster op over vandoverfladen.
At first the fish should be anesthetized with MS-222 (100 mg/l).
Planternes rødder er et system af robuste jordstængler og findes på hele den nordlige halvkugle i eutrofisk, men ikke forurenet og mere kalkholdigt stille vand med mudret underlag.
The proper plane of anaesthesia allows the user to distinguish the heartbeat of the zebrafish.
Myriophyllum spicatum foretrækker ferskvand, men findes også i brakvand.
While puncturing the heart, keep the syringe piston under weak tension.
Til en sedimentfri toksicitetstest skal der anvendes sterile planter.
Collectable blood volumes range between 20 - 40 microliters.
Hvis testlaboratoriet ikke har regelmæssige kulturer af Myriophyllum spicatum, kan der indhentes sterilt plantemateriale fra et andet laboratorium, eller der kan hentes (ikke-sterilt) plantemateriale i felten eller fra en kommerciel leverandør; hvis planterne indhentes i felten, bør der foretages en taksonomisk verifikation af arten.
After cardiac puncture, the blood/buffer-mixture should be filled into the test tube.
Er planterne indsamlet i felten eller leveret af en kommerciel leverandør, bør de steriliseres (1) og opbevares i mindst otte uger i kultur i samme medium, som benyttes til test, før de anvendes.
Plasma is separated from the blood via centrifugation (20 min; 5000 g) and should be stored at – 80°C until required for analysis.
Indsamlingssteder for startkulturer i felten skal være fri for åbenbare forureningskilder.
Procedure 3C:
Der bør udvises stor forsigtighed for at sikre, at der indsamles de korrekte arter af Myriophyllum spicatum i felten, især i områder, hvor den kan hybridiseres med andre Myriophyllum-arter.
SOP: Zebrafish, homogenisation of head & tail
Hvis de leveres fra et andet laboratorium, skal de opbevares på tilsvarende måde i mindst tre uger.
The fish are anaesthetised and euthanised in accordance with the test description.
Kilden til plantematerialet og den testede art bør altid rapporteres.
The head and tail are cut of the fish in accordance with Figure 1.
De testede planters kvalitet og ensartethed har stor indflydelse på testresultatet, hvorfor de bør udvælges nøje.
Important: All dissection instruments, and the cutting board should be rinsed and cleaned properly (e.g. with 96 % ethanol) between handling of each single fish to prevent “vitellogenin pollution” from females or induced males to uninduced males.
Der bør anvendes unge, hurtigtvoksende planter uden synlige forandringer eller misfarvning (chlorose).
For gonad histology
Nærmere oplysninger om klargøring af testorganismen findes i tillæg 4.
Cut behind
Dyrkning
Cut behind dorsal fin
For at undgå at skulle vedligeholde kulturerne så ofte (f.eks. når Myriophyllum-test ikke påtænkes anvendt i en periode), kan kulturerne opbevares ved reduceret belysning og temperatur (50 μE m– 2 s– 1, 20 ± 2 °C).
For Vtg analysis
En nærmere beskrivelse af dyrkningen er givet i tillæg 3.
The weight of the pooled head and tail from each fish is measured to the nearest mg.
Mindst 14 til 21 dage før test overføres et tilstrækkeligt antal testorganismer aseptisk til frisk, sterilt medium og dyrkes i 14 til 21 dage under testbetingelserne som en prækultur.
After being weighed, the parts are placed in appropriate tubes (e.g. 1,5 ml eppendorf) and frozen at – 80 °C until homogenisation or directly homogenised on ice with two plastic pistils.
Oplysninger om fremstilling af en prækultur findes i tillæg 4.
(Other methods can be used if they are performed on ice and the result is a homogenous mass).
Der anbefales kun et næringsmedium til Myriophyllum spicatum i et sedimentfrit testsystem som beskrevet i tillæg 2.
Important: The tubes should be numbered properly so that the head and tail from the fish can be related to their respective body-section used for gonad histology.
Det anbefales at modificere Andrews-medium til dyrkning af og test med Myriophyllum spicatum som beskrevet i (1).
When a homogenous mass is achieved, 4 x the tissue weight of ice-cold homogenisation buffer [1] is added.
Fra fem særskilt udarbejdede stamopløsninger tilsat 3 % saccharose fremstilles det modificerede Andrews-medium.
Keep working with the pistils until the mixture is homogeneous.
Oplysninger om fremstilling af et medum findes i tillæg 2.
Important note: New pistils are used for each fish.
Der skal anvendes et 10-fold koncentreret, modificeret Andrews-medium til at opnå testopløsninger (ved fortynding hvor det er relevant).
The samples are placed on ice until centrifugation at 4 °C at 50000 g for 30 min.
Sammensætningen af dette medium er givet i tillæg 2.
Use a pipette to dispense portions of 20 μl supernatant into at least two tubes by dipping the tip of the pipette below the fat layer on the surface and carefully sucking up the supernatant without fat- or pellet fractions.
Testopløsninger fremstilles sædvanligvis ved fortynding af en stamopløsning.
The tubes are stored at – 80 °C until use.
Stamopløsningerne af testkemikaliet fremstilles normalt ved opløsning af kemikaliet i demineraliseret (dvs. destilleret eller deioniseret) vand.
Homogenisation buffer:(50 mM Tris-HCl pH 7,4; 1 % Protease inhibitor cocktail (Sigma)): 12 ml Tris-HCl pH 7,4 + 120 μl Protease inhibitor cocktail.TRIS: TRIS-ULTRA PURE (ICN) e.g. from Bie & Berntsen, Denmark.Protease inhibitor cocktail: From Sigma (for mammalian tissue) Product number P 8340.NOTE: The homogenisation buffer should be used the same day as manufactured.
Tilsætning af næringsstoffer opnås ved at anvende 10-fold koncentreret, modificeret Andrews-medium.
Place on ice during use.
Stamopløsningerne af testkemikaliet kan steriliseres ved autoklavering ved 121 °C i 20 minutter eller ved sterilfiltrering, forudsat at steriliseringsteknikken ikke denaturerer testkemikaliet.
VITELLOGENIN FORTIFICATION SAMPLES AND INTER-ASSAY REFERENCE STANDARD
Testopløsninger kan også fremstilles i sterilt demineraliseret vand eller medium under sterile forhold.
On each day that VTG assays are performed, a fortification sample made using an inter-assay reference standard will be analysed.
Der bør tages højde for varmestabilitet og adsorption på forskellige overflader ved udvælgelsen af sterilisationsproceduren for testkemikaliets stamopløsninger.
The VTG used to make the inter-assay reference standard will be from a batch different from the one used to prepare calibration standards for the assay being performed.
Derfor anbefales det, at stamopløsningerne fremstilles under sterile forhold, dvs. ved hjælp af sterilt materiale, der kan opløse testkemikaliet under sterile forhold (f.eks. flammesterilisation, laminar strømningskappe mv.) i sterilt vand.
The fortification sample will be made by adding a known quantity of the inter-assay standard to a sample of control male plasma.
Denne teknik til fremstilling af sterile stamopløsninger gælder både stoffer og blandinger.
The sample will be fortified to achieve a VTG concentration between 10 and 100 times the expected vitellogenin concentration of control male fish.
Den højeste testede koncentration af testkemikaliet bør sædvanligvis ikke være større end kemikaliets vandopløselighed under testbetingelserne.
The sample of control male plasma that is fortified may be from an individual fish or may be a composite from several fish.
For testkemikalier med lav vandopløselighed kan det være nødvendigt at fremstille en koncentreret stamopløsning eller -dispersion af kemikaliet ved hjælp af et organisk opløsnings- eller dispergeringsmiddel for at lette tilsætning af nøjagtige mængder testkemikalie til testmediet og medvirke til, at det dispergeres eller opløses.
A subsample of the unfortified control male plasma will be analysed in at least two duplicate wells.
Brug af sådanne midler bør så vidt muligt søges undgået.
The fortified sample also will be analysed in at least two duplicate wells.
Brug af sådanne hjælpeopløsnings- og dispergeringsmidler bør ikke medføre fytotoksisk virkning.
The mean quantity of vitellogenin in the two unfortified control male plasma samples will be added to the calculated quantity of VTG added to fortification the samples to determine an expected concentration.
Som eksempler på almindeligt anvendte opløsningsmidler, der er uden fytotoksisk virkning i koncentrationer på op til 100 μl/l, kan nævnes acetone og dimethylformamid.
The ratio of this expected concentration to the measured concentration will be reported along with the results from each set of assays performed on that day.
Hvis der anvendes et opløsnings- eller dispergeringsmiddel, bør dets slutkoncentration rapporteres og holdes så lav som mulig (≤ 100 μl/l), og der bør være samme koncentration af opløsnings- eller dispergeringsmiddel i alle behandlings- og kontrolgrupper.
DECISION FLOWCHART FOR THE STATISTICAL ANALYSIS
Nærmere anvisninger kan findes i (5).
Rep means normally distributed
Test- og kontrolgrupper
Stept-down Jonckheere or Williams' test
Det vil lette valget af passende testkemikaliekoncentrationer, hvis man på forhånd kender til testkemikaliets toksicitet for Myriophyllum spicatum, f.eks. fra en test til bestemmelse af dosisinterval.
Normalising transform?
I den endelige toksicitetstest bør der normalt være fem (som i Lemna-væksthæmningstesten, kapitel C.26 i dette bilag) til syv testkoncentrationer arrangeret i en geometrisk serie; de bør vælges således, at NOEC og EC50 ligger i intervallet mellem den højeste og laveste koncentration (jf. nedenfor).
variance stabilising transform?
Kvotienten mellem testkoncentrationerne bør helst ikke være over 3,2, men kan dog være større, når koncentration/respons-kurven er flad.
Tamhane-Dunnett test on nested ANOVA
Det bør begrundes, såfremt der anvendes færre end fem koncentrationer.
Dunnett test on nested ANOVA No
Der bør anvendes mindst fem replikater for hver testkoncentration.
Yes Yes
Ved fastsættelse af området for testkoncentrationerne (i den indledende test og/eller i den endelige toksicitetstest) bør følgende tages i betragtning:
No >=4 reps per conc
Ved bestemmelse af en ECx-værdi bør denne ligge i det område, testkoncentrationerne dækker, for at den skal blive bestemt med et tilstrækkeligt konfidensniveau.
<=3 reps per conc
Ved beregning af en EC50-værdi bør den højeste testkoncentration således være større end EC50-værdien.
Dunn or Mann-Whitney test on rep means
Ligger EC50-værdien uden for testkoncentrationernes område, bliver de tilhørende konfidensintervaller store, så det kan blive umuligt at foretage en pålidelig vurdering af modellens statistiske fit.
Dunn test on rep means Dunn or Mann-Whitney test
Hvis målet er at bestemme en LOEC/NOEC-værdi, bør den laveste testkoncentration være så lav, at væksten ikke er væsentligt lavere end i kontrolprøven.
Dunn test <=3 reps per conc
Desuden bør den højeste testkoncentration være så høj, at væksten er væsentligt mindre end i kontrolprøven.
>=4 reps per conc Tamhane-Dunnett test
Er det ikke tilfældet, må testen gentages med et andet koncentrationsområde (medmindre den højeste koncentration svarer til opløselighedsgrænsen eller til den maksimalt krævede grænsekoncentration, f.eks. 100 mg/l).
Nested ANOVA normal
Hver test bør omfatte kontroller med samme næringsmedium, testorganisme (der vælges et så homogent plantemateriale som muligt, friske sidegrene fra prækulturer, forkortet til 2,5 cm fra roden), miljøforhold og procedurer som testbeholderne, men uden testkemikaliet.
Nested ANOVA not normal
Hvis der anvendes et opløsnings- eller dispergeringsmiddel, bør der indgå en ekstra kontrolbehandling med samme koncentration af opløsnings-/dispergeringsmiddel som i testbeholderne med testkemikalie.
variance stabilising transformation
Der bør være mindst 10 replikate kontrolbeholdere (og beholdere med opløsningsmiddel, hvis det er relevant).
Variances unequal Dunnett test
Hvis der ikke kræves bestemmelse af NOEC, kan testens design ændres, så der er flere forskellige koncentrationer og færre replikater for hver koncentration.
Variances equal
Der bør dog være mindst 10 replikater af kontrolprøverne.
Step-down Jonckheere test
Eksponering
Rep means normal or not homogenous
Friske sidegrene fra prækultur afkortet til 2,5 cm fra roden fordeles tilfældigt i testbeholderne under aseptiske forhold; hver testbeholder bør indeholde en 2,5 cm lang sidegren, der bør have et apikalt meristem i den ene ende.
Rep means normal & homogenous
Det valgte plantemateriale bør være af samme kvalitet i hver testbeholder.
Step-down trendtest on replicate means
Testbeholdernes placering i inkubatoren skal være randomiseret for at minimere indflydelsen af rumlige forskelle i lysintensitet eller temperatur.
Not monotone
Desuden skal testen enten have blokdesign, eller også skal testbeholderne omplaceres tilfældigt ved hver observation (eller hyppigere).
Monotone