natgillin/translations-raw huggingface dataset:
I mangel af kinetiske data vil det være et egnet kompromis til måling af genotoksicitet at udtage prøver 2-6 timer efter den sidste behandling ved to eller flere behandlinger eller både 2-6 og 16-26 timer efter en enkelt indgift, selv om det er vigtigt at obducere alle dyr på samme tidspunkt efter den sidste (eller eneste) dosis.
Single cells/nuclei embedded in agarose on a slide are lysed with detergent and high salt concentration.
Oplysninger om forekomsten af toksiske virkninger i målorganer (hvis disse findes) kan også bruges til at vælge hensigtsmæssige prøveudtagningstidspunkter.
This lysis step digests the cellular and nuclear membranes and allows the release of coiled DNA loops generally called nucleoids and DNA fragments.
Der bør foretages generelle kliniske observationer vedrørende dyrenes helbred, og de bør registreres mindst en gang om dagen, fortrinsvis på samme tidspunkt(er) hver dag og under hensyntagen til det tidspunkt, hvor de forventede virkninger efter dosering topper (54).
Electrophoresis at high pH results in structures resembling comets, which, by using appropriate fluorescent stains, can be observed by fluorescence microscopy; DNA fragments migrate away from the “head” into the “tail” based on their size, and the intensity of the comet tail relative to the total intensity (head plus tail) reflects the amount of DNA breakage (13) (14) (15).
Alle dyr observeres mindst to gange dagligt for morbiditet og dødelighed.
The in vivo alkaline comet assay is especially relevant to assess genotoxic hazard in that the assay's responses are dependent upon in vivo ADME (absorption, distribution, metabolism and excretion), and also on DNA repair processes.
Ved undersøgelser af længere varighed bør alle dyr vejes mindst en gang om ugen og ved afslutningen af testperioden.
These may vary among species, among tissues and among the types of DNA damage.
Fødeindtaget måles ved hver kostændring og mindst en gang ugentligt.
To fulfil animal welfare requirements, in particular the reduction in animal usage (3Rs — Replacement, Reduction, Refinement-- principles), this assay can also be integrated with other toxicological studies, e.g. repeated dose toxicity studies (10) (16) (17), or the endpoint can be combined with other genotoxicity endpoints such as the in vivo mammalian erythrocyte micronucleus assay (18) (19) (20).
Dyr, der udviser ikkedødelig indikation for for høj toksicitet, bør aflives før testperiodens udløb og anvendes generelt ikke til kometanalyse.
The comet assay is most often performed in rodents, although it has been applied to other mammalian and non-mammalian species.
Opsamling af væv
The use of non-rodent species should be scientifically and ethically justified on a case-by-case basis and it is strongly recommended that the comet assay only be performed on species other than rodents as part of another toxicity study and not as a standalone test.
Eftersom det er muligt at undersøge induktion af DNA-strengbrud (kometer) i næsten alle væv, bør begrundelsen for valg af det indsamlede væv være klart defineret og baseret på begrundelsen for, at man foretager undersøgelsen i kombination med evt. eksisterende ADME-, genotoksicitets-, karcinogenicitet- eller andre toksicitetsdata for det undersøgte testkemikalie.
The selection of route of exposure and tissue(s) to be studied should be determined based on all available/existing knowledge of the test chemicals e.g. intended/expected route of human exposure, metabolism and distribution, potential for site-of-contact effects, structural alerts, other genotoxicity or toxicity data, and the purpose of the study.
Vigtige faktorer, der bør indgå i overvejelserne, er indgivelsesmåde (baseret på sandsynlige humane eksponeringsveje), den forventede vævsdistribution og -absorption, metabolismens rolle og testkemikaliernes mulige handlingsmekanisme.
Thus, where appropriate, the genotoxic potential of the test chemicals can be assayed in the target tissue(s) of carcinogenic and/or other toxic effects.
Leveren er det væv, der undersøges oftest, og for hvilken der findes flest data.
The assay is also considered useful for further investigation of genotoxicity detected by an in vitro system.
I mangel af baggrundsinformation, og hvis der ikke identificeres nogen specifikke vævstyper af interesse, kan det begrundes at foretage udtagning af leverprøver, eftersom den er en primær lokalitet for xenobiotisk metabolisme og ofte er stærkt udsat for såvel moderstof(fer) som metabolit(ter).
It is appropriate to perform an in vivo comet assay in a tissue of interest when it can be reasonably expected that the tissue of interest will be adequately exposed.
I nogle tilfælde kan undersøgelse af det direkte kontaktsted (f.eks. ved oralt indgivne kemikalier proventriculus eller duodenum/jejunum, eller ved indånding af kemikalier lungerne) være særdeles relevant.
The assay has been most extensively validated in somatic tissues of male rats in collaborative studies such as the JaCVAM trial (12) and in Rothfuss et al., 2010 (10).
De supplerende eller alternative vævstyper bør udvælges på grundlag af de konkrete årsager til, at testen gennemføres, men det kan være nyttigt at undersøge flere vævstyper fra de samme dyr, hvis laboratoriet har dokumenteret kompetence med disse vævstyper og med at håndtere flere vævstyper på samme tid.
The liver and stomach were used in the JaCVAM international validation trial.
Også i de følgende afsnit betragtes den tid, der bruges på at i) fjerne hver vævstype efter obduktion, ii) behandle hver vævstype med henblik på celle-/kernesuspensioner og iii) behandle suspensionen og præparere objektglassene, som kritiske variabler (se definitioner, tillæg 1), og den acceptable varighed af hver af disse faser bør fastlægges under definition af metoden og påvisning af kompetencer.
Care should be taken to ensure that such tissues are not exposed to excessively high test chemical concentrations (21).
Dyrene aflives i overensstemmelse med gældende lovgivning om dyrevelfærd og 3R-princippet på de(t) relevante tidspunkt(er) efter sidste behandling med et testkemikalie.
The technique is in principle applicable to any tissue from which analysable single cell/nuclei suspensions can be derived.
De(t) udvalgte væv fjernes og dissekeres, og en del indsamles til kometassayet, samtidig med at en del af vævet opskæres og anbringes i formaldehydopløsning eller et passende fiksativ til mulig histopatologisk analyse (se punkt 55) i henhold til standardmetoderne (12).
Proprietary data from several laboratories demonstrate its successful application to many different tissues, and there are many publications showing the applicability of the technique to organs or tissues other than liver and stomach, e.g. jejunum (22), kidney (23) (24), skin (25) (26), or urinary bladder (27) (28), lungs and bronchoalveolar lavage cells (relevant for studies of inhaled chemicals) (29) (30), and tests have also been performed in multiple organs (31) (32).
Vævet til kometassayet anbringes i hakningsbufferen, skylles tilstrækkeligt med koldt hakningsbuffer for at fjerne resterende blod og opbevares i en iskold hakningsbuffer, indtil det skal bruges.
Whilst there may be an interest in genotoxic effects in germ cells, it should be noted that the standard alkaline comet assay as described in this test method is not considered appropriate to measure DNA strand breaks in mature germ cells.
In situ-perfusion kan også udføres, f.eks. for lever og nyre.
Since high and variable background levels in DNA damage were reported in a literature review on the use of the comet assay for germ cell genotoxicity (33), protocol modifications together with improved standardization and validation studies are deemed necessary before the comet assay on mature germ cells (e.g. sperm) can be included in the test method.
Der findes mange offentliggjorte metoder til celle-/kerneisolation.
In addition, the recommended exposure regimen described in this test method is not optimal and longer exposures or sampling times would be necessary for a meaningful analysis of DNA strand breaks in mature sperm.
Disse omfatter hakning af væv som f.eks. lever og nyre, skrabning af slimhindeoverflader for mave-tarmkanalen, homogenisering og enzymisk fordøjelse.
Genotoxic effects as measured by the comet assay in testicular cells at different stages of differentiation have been described in the literature (34) (35).
Ved JaCVAM-valideringstesten undersøgte man kun isolerede celler, og med henblik på etablering af metoden og for at være i stand til at henvise til JaCVAM-forsøgsdataene med hensyn til dokumentation af kompetence foretrækkes isolerede celler.
However, it should be noted that gonads contain a mixture of somatic and germ cells.
Det er dog blevet påvist, at der ikke var nogen væsentlig forskel i assayresultaterne, uanset om man anvendte isolerede celler eller kerner (8).
For this reason, positive results in whole gonad (testis) are not necessarily reflective of germ cell damage; nevertheless, they indicate that tested chemical(s) and/or its metabolites have reached the gonad.
Forskellige metoder til isolering af celler/kerner (f.eks. homogenisering, hakning, enzymisk fordøjelse og filtrering) gav ligeledes sammenlignelige resultater (55).
Cross-links cannot be reliably detected with the standard experimental conditions of the comet assay.
Derfor kan enten isolerede celler eller isolerede kerner anvendes.
Under certain modified experimental conditions, DNA-DNA and DNA-protein crosslinks, and other base modifications such as oxidized bases might be detected (23) (36) (37) (38) (39).
Et laboratorium bør foretage en grundig vurdering og validering af vævsspecifikke metoder til isolation af enkeltceller/-kerner.
But further work would be needed to adequately characterize the necessary protocol modifications.
Som diskuteret i punkt 40 kan persistensen af nogle af de læsioner, som betyder, at DNA-strengbrud kan registreres med kometassayet, være meget kort (52) (53).
Thus detection of cross linking agents is not the primary purpose of the assay as described here.
Derfor er det, uanset hvilken metode der anvendes til at fremstille suspensioner med en celle/kerne, vigtigt, at vævene behandles så hurtigt som muligt, efter at dyrene er aflivet, og opbevares under forhold, der reducerer fjernelse af læsioner (f.eks. ved at opbevare vævet ved lav temperatur).
The assay is not appropriate, even with modifications, for detecting aneugens.
Cellesuspensioner bør opbevares iskoldt, indtil de er klar til brug, så man kan påvise minimal variation mellem prøverne samt relevante positive og negative kontrolresponser.
Due to the current status of knowledge, several additional limitations (see Appendix 3) are associated with the in vivo comet assay.
PRÆPARERING AF OBJEKTGLAS
It is expected that the test method will be reviewed in the future and if necessary revised in light of experience gained.
Præparering af objektglas bør ske så hurtigt som muligt (helst inden for en time) efter præparering af enkeltcellen/-kernen, men temperaturen og tidsrummet mellem dyrets død og præparering af objektglasset skal kontrolleres nøje og valideres i henhold til laboratoriets bestemmelser.
PRINCIPLE OF THE METHOD
Mængden af cellesuspension, der tilsættes agarose med lavt smeltepunkt (normalt 0,5-1,0 %) for at præparere objektglassene, må ikke sænke den procentvise andel af agarose med lavt smeltepunkt til under 0,45 %.
A detailed description of dosing and sampling is given in paragraphs 36-40.
Den optimale celletæthed bestemmes ved hjælp af billedanalysesystemet, der anvendes til scoring af kometer.
At the selected sampling time(s), the tissues of interest are dissected and single cells/nuclei suspensions are prepared (in situ perfusion may be performed where considered useful e.g. liver) and embedded in soft agar so as to immobilize them on slides.
Lysisbetingelserne er også en kritisk variabel og kan påvirke de strengbrud, der skyldes særlige typer DNA-ændringer (visse DNA-alkyleringer og baseaddukter).
Cells/nuclei are treated with lysis buffer to remove cellular and/or nuclear membrane, and exposed to strong alkali e.g. pH ≥13 to allow DNA unwinding and release of relaxed DNA loops and fragments.
Det anbefales derfor, at lysisbetingelser holdes så konstante som muligt for alle objektglas i et eksperiment.
The nuclear DNA in the agar is then subjected to electrophoresis.
Når objektglassene er præpareret, nedsænkes de i den afkølede lysisopløsning i mindst en time (eller natten over) ved omkring 2-8 °C i dæmpet belysning, f.eks. gult lys (eller lystæt), så de ikke udsættes for hvidt lys, der kan indeholde UV-komponenter.
Normal non-fragmented DNA molecules remain in the position where the nuclear DNA had been in the agar, while any fragmented DNA and relaxed DNA loops would migrate towards the anode.
Efter denne inkubationsperiode skylles objektglassene for at fjerne tilbageværende rengøringsmiddel og salte inden baseudfoldningstrinnet.
After electrophoresis, the DNA is visualized using an appropriate fluorescent stain.
Dette kan gøres med renset vand, neutraliseringsbuffer eller fosfatbuffer.
Preparations should be analysed using a microscope and full or semi-automated image analysis systems.
Elektroforesebuffer kan også anvendes.
The extent of DNA that has migrated during electrophoresis and the migration distance reflects the amount and size of DNA fragments.
Dette vil opretholde det basiske miljø i elektroforesekammeret.
There are several endpoints for the comet assay.
Udfoldning og elektroforese
The DNA content in the tail ( % tail DNA or % tail intensity) has been recommended to assess DNA damage (12) (40) (41) (42).
Objektglassene placeres tilfældigt på platformen i en ubåds-lignende elektroforeseenhed, der indeholder tilstrækkeligt meget elektroforeseopløsning til, at objektglassenes overflade er fuldstændig dækket (dækningens dybde skal også være den samme fra kørsel til kørsel).
After analysis of a sufficient number of nuclei, the data are analysed with appropriate methods to judge the assay results.
I en anden type elektroforeseenheder til kometassays, dvs. enheder med aktiv køling, cirkulation og strømforsyning med høj kapacitet, vil en større dækning med opløsningen føre til en større strømstyrke ved konstant spænding.
It should be noted that altering various aspects of the methodology, including sample preparation, electrophoresis conditions, visual analysis parameters (e.g. stain intensity, microscope bulb light intensity, and use of microscope filters and camera dynamics) and ambient conditions (e.g. background lighting), have been investigated and may affect DNA migration (43) (44) (45) (46).
Objektglassene bør anbringes på en afbalanceret måde i elektroforesebeholderen for at afbøde virkningerne af eventuelle hældninger eller kanter i beholderen og for at minimere variationen fra batch til batch, dvs. at der ved hver elektroforesekørsel bør være det samme antal objektglas fra hvert enkelt dyr i undersøgelsen og prøver fra de forskellige doseringsgrupper samt negative og positive kontroller.
Each laboratory should establish experimental competency in the comet assay by demonstrating the ability to obtain single cell or nuclei suspensions of sufficient quality for each target tissue(s) for each species used.
Objektglassene skal stå i mindst 20 minutter, så DNA'et kan foldes ud, og udsættes derefter for elektroforese under kontrollerede forhold, som vil øge assayets følsomhed og dynamiske område (dvs. føre til acceptable niveauer for den procentvise DNA-intensitet i komethalen for negative og positive kontroller, hvilket maksimerer følsomheden).
The quality of the preparations will be evaluated firstly by the % tail DNA for vehicle treated animals falling within a reproducible low range.
Graden af DNA-migration er lineært forbundet med varigheden af elektroforesen og ligeledes med styrken (V/cm).
Current data suggest that the group mean % tail DNA (based on mean of medians — see paragraph 57 for details of these terms) in the rat liver should be preferably not exceed 6 %, which would be consistent with the values in the JaCVAM validation trial (12) and from other published and proprietary data.
Baseret på JaCVAM-forsøget kan dette være 0,7 V/cm i mindst 20 minutter.
There are not enough data at this time to make recommendations about optimum or acceptable ranges for other tissues.
Varigheden af elektroforesen anses for at være en kritisk variabel, og elektroforesetiden bør fastsættes med henblik på at optimere det dynamiske område.
This does not preclude the use of other tissues if justified.
Længere elektroforesetider (f.eks. 30 eller 40 minutter for at maksimere følsomheden) fører til stærkere positive responser med kendte mutagener.
The test report should provide appropriate review of the performance of the comet assay in these tissues in relation to the published literature or from proprietary data.
Men længere elektroforesetider kan dog også føre til uforholdsmæssig stor vandring i kontrolprøverne.
Firstly, a low range of % tail DNA in controls is desirable to provide sufficient dynamic range to detect a positive effect.
Ved hvert forsøg bør spændingen holdes konstant, og variationen af de øvrige parametre bør ligge inden for et snævert og specificeret område, f.eks. ved JaCVAM-forsøget, hvor der ved 0,7 V/cm frembringes en startstrømstyrke på 300 mA.
Secondly, each laboratory should be able to reproduce expected responses for direct mutagens and pro-mutagens, with different modes of action as suggested in Table 1 (paragraph 29).
Bufferdybden bør tilpasses med henblik på at opnå de nødvendige betingelser og bør opretholdes gennem hele forsøget.
Positive substances may be selected, for example from the JaCVAM validation trial (12) or from other published data (see paragraph 9), if appropriate, with justification, and demonstrating clear positive responses in the tissues of interest.
Strømstyrken ved elektroforeseperiodens start og slutning registreres.
The ability to detect weak effects of known mutagens e.g. EMS at low doses, should also be demonstrated, for example by establishing dose-response relationships with appropriate numbers and spacing of doses.
De optimale betingelser bør derfor fastsættes ved den første demonstration af kompetence i det pågældende laboratorium med hver at de undersøgte vævstyper.
Initial efforts should focus on establishing proficiency with the most commonly used tissues e.g. the rodent liver, where comparison with existing data and expected results may be made (12).
Temperaturen i elektroforeseopløsningen i løbet af udfoldning og elektroforese bør holdes på et lavt niveau, normalt 2-10 °C (10).
Data from other tissues e.g. stomach/duodenum/jejunum, blood etc. could be collected at the same time.
Temperaturen i elektroforeseopløsningen registreres, når udfoldningen begynder, ved starten og ved slutningen af elektroforesen.
The laboratory needs to demonstrate proficiency with each individual tissue in each species they are planning to study, and will need to demonstrate that an acceptable positive response with a known mutagen (e.g. EMS) can be obtained in that tissue.
Efter endt elektroforese nedsænkes/skylles objektglassene i/med neutraliseringsbufferen i mindst 5 minutter.
Vehicle/negative control data should be collected so as to demonstrate reproducibility of negative data responses, and to ensure that the technical aspects of the assay were properly controlled or to suggest the need to re-establish historical control ranges (see paragraph 22).
Geler kan farves og scores “friske” (f.eks. inden for 1-2 dage) eller kan dehydreres med henblik på senere scoring (f.eks. inden for 1-2 uger efter farvning) (56).
It should be noted, that whilst multiple tissues can be collected at necropsy and processed for comet analysis, the laboratory needs to be proficient in harvesting multiple tissues from a single animal, thereby ensuring that any potential DNA lesion is not lost and comet analysis is not compromised.
Betingelserne bør imidlertid valideres under demonstrationen af kompetencer, og historiske oplysninger bør fremskaffes og opbevares separat for hver af disse betingelser.
The length of time from euthanasia to removal of tissues for processing may be critical (see paragraph 44).
I sidstnævnte tilfælde bør objektglassene dehydreres ved nedsænkning i absolut ethanol i mindst 5 minutter, lufttørres og herefter opbevares enten ved stuetemperatur eller i en beholder i køleskab indtil scoringen.
Animal welfare must be considered whilst developing proficiency in this test and therefore tissues from animals used in other tests can be used when developing competence in the various aspects of the test.
Målemetoder
Furthermore, it may not be necessary to conduct a full study during the stages of establishing a new test method in a laboratory and fewer animals or test concentrations can be used when developing the necessary skills.
Kometer bør scores kvantitativt ved hjælp af et automatisk eller halvautomatisk billedanalysesystem.
During the course of the proficiency investigations, the laboratory should build a historical database to establish positive and negative control ranges and distributions for relevant tissues and species.
Objektglassene farves med en passende fluorescerende farve, f.eks. SYBR Gold, Green I, propidiumiodid eller ethidiumbromid, og måles ved en passende forstørrelse (f.eks. 200x) med et mikroskop, der er udstyret med epi-fluorescens og hensigtsmæssige detektorer eller et digitalkamera (f.eks. CCD).
Recommendations on how to build and use the historical data (i.e. criteria for inclusion and exclusion of data in historical data and the acceptability criteria for a given experiment) can be found in the literature (47).
Celler kan inddeles i tre kategorier, som beskrevet i atlasset over kometbilleder (57), nemlig egnede til bedømmelse, ikke egnede til bedømmelse og “pindsvin” (se afsnit 56 for en yderligere diskussion).
Different tissues and different species, as well as different vehicles and routes of administrations, may give different negative control % tail DNA values.
Kun celler, der er egnede til bedømmelse (klart defineret hoved og hale uden interferens med tilstødende celler), bør scores for den procentvise DNA-intensitet i komethalen for at undgå artefakter.
It is therefore important to establish negative control ranges for each tissue and species.
Det er ikke nødvendigt at rapportere hyppigheden af celler, der ikke er egnede til scoring.
Laboratories should use quality control methods, such as control charts (e.g. C-charts or X-bar charts (48)), to identify how variable their data are, and to show that the methodology is ‘under control’ in their laboratory.
Hyppigheden af pindsvin bestemmes på grundlag af den visuelle scoring (eftersom mangel på et klart defineret hoved betyder, at de ikke umiddelbart kan ses ved billedanalyse) i mindst 150 celler pr. prøve (se punkt 56 for yderligere diskussion) og dokumenteres særskilt.
Selection of appropriate positive control substances, dose ranges and experimental conditions (e.g. electrophoresis conditions) may need also to be optimised for the detection of weak effects (see paragraph 17).
Alle objektglas til analyser, herunder fra positive og negative kontroller, bør kodes selvstændigt og scores “blindt”, så bedømmeren ikke er bekendt med eksponeringsbetingelserne.
Common laboratory strains of healthy young adult rodents (6-10 weeks old at start of treatment though slightly older animals are also acceptable) are normally used.
For hver prøve (pr. vævstype pr. dyr) bør mindst 150 celler (ekskl. pindsvin — se punkt 56) analyseres.
The choice of rodent species should be based on (i) species used in other toxicity studies (to be able to correlate data and to allow integrated studies), (ii) species that developed tumours in a carcinogenicity study (when investigating the mechanism of carcinogenesis), or (iii) species with the most relevant metabolism for humans, if known.
Scoring af 150 celler pr. dyr for mindst fem dyr pr. dosis (mindre ved den sideløbende positive kontrol — se punkt 29) sikrer tilstrækkelig statistisk power i henhold til analysen i Smith et al., 2008 (5).
Rats are routinely used in this test.