natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Derfor kan FL-forsøgsmetoden anvendes til at bestemme kemikaliers evne til at fremkalde øjenirritation/ætsning i henhold til den sekventielle teststrategi i TM B.5 (5).
Interpretation of results and prediction model
Et kemikalie, der ikke forudses som værende øjenætsende eller stærkt øjenirriterende med FL-forsøgsmetoden, vil imidlertid skulle testes med en eller flere supplerende forsøgsmetoder (in vitro og/eller in vivo), som er i stand til præcist at identificere i) kemikalier, der in vitro er falsk negative øjenætsende stoffer/stærkt øjenirriterende stoffer i FL-testen (UN GHS-kategori 1, EU CLP kategori 1, U.S. EPA-kategori I), ii) kemikalier, der ikke er klassificeret som øjenætsende/øjenirriterende (UN GHS uden for kategori, EU CLP uden for kategori, U.S. EPA-kategori IV) og/eller iii) kemikalier, der er moderat/mildt øjenirriterende (UN GHS-kategori 2A og 2B, EU CLP kategori 2, U.S. EPA-kategori II og III).
A KeratinoSensTM prediction is considered positive if the following 4 conditions are all met in 2 of 2 or in the same 2 of 3 repetitions, otherwise the KeratinoSensTM prediction is considered negative (Figure 1):
Formålet med denne forsøgsmetode er at beskrive de procedurer, som anvendes til at vurdere et testkemikalies potentielle øjenætsende eller stærkt øjenirriterende virkning som målt ved dets evne til at inducere skade på et impermeabelt, konfluerende epitelmonolag.
the Imax is higher than (>) 1,5 fold and statistically significantly different as compared to the solvent (negative) control (as determined by a two-tailed, unpaired Student's t-test);
Integriteten af transepitelpermeabilitet er en vigtig funktion ved et epitel som det, der findes i conjunctiva og cornea.
the cellular viability is higher than (>) 70 % at the lowest concentration with induction of luciferase activity above 1,5 fold (i.e. at the EC1,5 determining concentration);
Øget permeabilitet af cornea-epitelet in vivo har vist sig at korrelere med inflammationsniveauet og observerede overfladeskader, efterhånden som øjenirritationen udvikler sig.
there is an apparent overall dose-response for luciferase induction (or a biphasic response as mentioned under paragraph 33).
Ved FL-forsøgsmetoden måles toksiske virkninger efter en kort eksponeringstid for testkemikaliet i form af en stigning i permeabiliteten af natriumfluorescein gennem epitelmonolaget af Madin-Darby-hundenyreceller (MDCK) dyrket på permeable indsatser.
If in a given repetition, all of the three first conditions are met but a clear dose-response for the luciferase induction cannot be observed, then the result of that repetition should be considered inconclusive and further testing may be required (Figure 1).
Størrelsen af den opståede fluoresceinudsivning er proportional med den kemikalieinducerede beskadigelse af tight junctions, desmosomer og cellemembraner og kan anvendes til at vurdere et testkemikalies potentielle øjenætsende toksicitet.
In addition, a negative result obtained with concentrations < 1000 μM (or < 200 μg/ml for test chemicals with no defined MW) should also be considered as inconclusive (see paragraph 11).
Tillæg 1 indeholder et diagram over MDCK-celler dyrket på en indsatsmembran til FL-forsøgsmetoden.
Figure 1
Definitioner findes i tillæg 2.
Prediction model used in the KeratinoSensTM assay.
Denne forsøgsmetode er baseret på INVITTOX-protokol nr. 71 (6), som er blevet evalueret i en international valideringsundersøgelse foretaget af Det Europæiske Center for Validering af Alternative Metoder (ECVAM) i samarbejde med US Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) og Japanese Center for the Validation of Alternative Methods (JaCVAM).
A KeratinoSensTM prediction should be considered in the framework of an IATA and in accordance with the provision of paragraphs 9 and 11
FL-forsøgsmetoden anbefales ikke til identifikation af kemikalier, der skal klassificeres som let/moderat øjenirriterende stoffer, eller til kemikalier, der ikke skal klassificeres som øjenirriterende (stoffer og blandinger) (dvs. GHS-kategori 2A/ 2B, uden for kategori, EU CLP-kategori 2, uden for kategori, US EPA-kategori II/III/IV), som fremgår af valideringsundersøgelsen (3) (7).
In rare cases, test chemicals which induce the luciferase activity very close to the cytotoxic levels can be positive in some repetitions at non-cytotoxic levels (i.e. EC1,5 determining concentration below (<) the IC30), and in other repetitions only at cytotoxic levels (i.e. EC1,5 determining concentration above (>) the IC30).
Forsøgsmetoden kan kun anvendes til vandopløselige kemikalier (stoffer og blandinger).
Such test chemicals shall be retested with more narrow dose-response analysis using a lower dilution factor (e.g. 1,33 or √2 (= 1,41) fold dilution between wells), to determine if induction has occurred at cytotoxic levels or not (9).
Det stærkt øjenirriterende potentiale ved kemikalier, som er vandopløselige, og/eller hvis toksiske virkning ikke påvirkes af fortynding, forudsiges generelt nøjagtigt med FL-forsøgsmetoden (7).
Physical appearance, water solubility, DMSO solubility, molecular weight, and additional relevant physicochemical properties, to the extent available;
For at et kemikalie kan kategoriseres som vandopløseligt under forsøgsbetingelser, skal det være opløseligt i en steril calciumholdig (med en koncentration på 1,0-1,8 mM) phenolrødt-fri Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) i en koncentration på ≥ 250 mg/ml (en dosis over grænseværdien på 100 mg/ml).
Physical appearance, water solubility, DMSO solubility and additional relevant physicochemical properties, to the extent available;
Men hvis testkemikaliet er opløseligt under koncentrationen 100 mg/ml, men allerede inducerer en FL-induktion på 20 % ved denne koncentration (dvs. FL20 < 100 mg/ml), kan det stadig klassificeres som GHS-kategori 1 eller EPA-kategori I.
Physical appearance, water solubility, DMSO solubility, molecular weight, and additional relevant physicochemical properties, to the extent available and where applicable;
De konstaterede begrænsninger ved denne forsøgsmetode udelukker stærke syrer og baser, cellefiksativer og meget flygtige kemikalier fra anvendelsesområdet.
Negative (vehicle) control
Disse kemikalier har mekanismer, som ikke måles med FL-forsøgsmetoden, f.eks. kraftig koagulering, forsæbning eller specifikke reaktionsegenskaber.
Chemical identification, such as IUPAC or CAS name(s), CAS number(s), and/or other identifiers;
Andre identificerede begrænsninger for denne metode er baseret på resultaterne for forudsigelsesevnen for farvede og viskøse testkemikalier (7).
Physical appearance, molecular weight, and additional relevant physicochemical properties in the case other negative controls / vehicles than those mentioned in this test method are used and to the extent available;
Det anføres, at begge typer kemikalier er vanskelige at fjerne fra monolaget efter kortvarig eksponering, og at forsøgsmetodens forudsigelsesevne kan forbedres, hvis der anvendes et stort antal vaskninger.
Justification for choice of solvent for each test chemical.
Faste kemikalier i suspension i væsker er tilbøjelige til at udfældes, og slutkoncentrationen i cellerne kan være vanskelig at fastslå.
Test method conditions
Når kemikalier i disse kemiske og fysiske stofgrupper udelukkes fra databasen, forbedres FL's nøjagtighed på tværs af EU-, EPA- og GHS-klassificeringssystemerne væsentligt (7).
Description of test method used;
Som følge af formålet med denne forsøgsmetode (dvs. alene identifikation af øjenætsende stoffer/stærkt øjenirriterende stoffer) er falsk negativ-raterne (jf. punkt 13) ikke kritiske, eftersom sådanne kemikalier efterfølgende vil blive testet med andre tilstrækkeligt validerede in vitro-test eller i kaniner, alt efter de forskriftsmæssige krav, med anvendelse af en sekventiel teststrategi med en “weight of evidence”-tilgang (5) (jf. også punkt 3 og 4).
Cell line used, its storage conditions and source (e.g. the facility from which they were obtained);
Andre identificerede begrænsninger ved FL-forsøgsmetoden skyldes andelen af falsk negative og falsk positive resultater.
Passage number and level of confluence of cells used for testing;
Når andelen af falsk positive resultater blev anvendt som første trin i en top-down-metode til at identificere vandopløselige øjenætsende stoffer/stærkt øjenirriterende stoffer og blandinger (UN GHS-kategori 1, EU CLP-kategori 1, U.S. EPA-kategori I), varierede den ved FL-forsøgsmetoden fra 7 % (7/103, UN GHS og EU CLP) til 9 % (9/99, U.S. EPA), og andelen af falsk negative resultater varierede fra 54 % (15/28, U.S. EPA) til 56 % (27/48, UN GHS og EU CLP) sammenlignet med in vivo-resultater.
Cell counting method used for seeding prior to testing and measures taken to ensure homogeneous cell number distribution (cf. paragraph 20);
Kemikaliegrupper, der udviser falsk positive og/eller falsk negative resultater i FL-forsøgsmetoden, defineres ikke her.
Luminometer used (e.g. model), including instrument settings, luciferase substrate used, and demonstration of appropriate luminescence measurements based on the control test described in Appendix 3;
Visse tekniske begrænsninger er specifikke for MDCK-cellekulturen.
The procedure used to demonstrate proficiency of the laboratory in performing the test method (e.g. by testing of proficiency substances) or to demonstrate reproducible performance of the test method over time.
De tight junctions, der blokerer natriumfluorescein-farvestoffets passage gennem monolaget, ødelægges stadig mere med et stigende antal cellegenerationer.
Test procedure
Ufuldstændig dannelse af tight junctions resulterer i øget FL i den ikke-behandlede kontrol.
Number of repetitions and replicates used;
Det er derfor vigtigt med en defineret tilladt maksimal udsivning i de ubehandlede kontroller (se punkt 38: 0 % udsivning).
Test chemical concentrations, application procedure and exposure time used (if different than the one recommended)
Som det er tilfældet med alle in vitro-assays, er det muligt, at cellerne forandres over tid, og derfor er det afgørende, at generationernes nummerserier for assays angives.
Tabulation of Imax, EC1,5 and viability values (i.e. IC50, IC30) obtained for the test chemical and for the positive control for each repetition as well as the mean values (Imax: average; EC1,5 and viability values: geometric mean) and SD calculated using data from all individual repetitions and an indication of the rating of the test chemical according to the prediction model;
Det nuværende anvendelsesområde kan udvides i nogle tilfælde, men først efter analyse af et udvidet datasæt for de undersøgte testkemikalier, helst opnået gennem test (3).
Coefficient of variation obtained with the luminescence readings for the negative control for each experiment;
Denne forsøgsmetode vil blive opdateret efter behov, i takt med at nye oplysninger og data behandles.
A graph depicting dose-response curves for induction of luciferase activity and viability;
Ethvert laboratorium bør, når det begynder at bruge dette assay, benytte kompetencekemikalierne i tillæg 3.
Description of any other relevant observations, if applicable.
Laboratorier kan benytte disse kemikalier til at godtgøre deres tekniske kompetence vedrørende brug af FL-forsøgsmetoden, inden de påbegynder fremsendelse af FL-assaydata med henblik på forskriftsmæssig fareklassificering.
Discussion of the results obtained with the KeratinoSensTM assay;
FL-forsøgsmetoden er et in vitro-assay baseret på cytotoksicitet og cellefunktion, der udføres på et sammenflydende monolag af rørformede MDCK CB997-epitelceller, der er dyrket på semipermeable indsatser, og som modellerer den ikke-formerende tilstand af cornea-epitelet in vivo.
Consideration of the test method results within the context of an IATA, if other relevant information is available.
MDCK-cellelinjen er veletableret og danner tight junctions og desmosomer svarende til dem, der findes på den apikale side af conjunctiva- og cornea-epitel.
Available at: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html.
Tab af trans-epitel-uigennemtrængelighed på grund af beskadigede tight junctions og desmosomer er en af de tidlige begivenheder ved kemikalieinduceret øjenirritation.
OECD, Paris.
Testkemikaliet påføres det sammenflydende lag af celler, der dyrkes på den apikale side af indsatsen.
Chapter B.42 of this Annex: Skin sensitization: Local Lymph Node assay.
En kortvarig eksponering på 1 minut anvendes rutinemæssigt til at afspejle det normale tidsrum for menneskers eksponering.
Chapter B.50 of this Annex: Skin sensitization: Local Lymph Node assay: DA.
En fordel ved den korte eksponeringstid er, at vandbaserede stoffer og blandinger kan testes i ren form, såfremt de let kan fjernes efter eksponeringsperioden.
Chapter B.51 of this Annex: Skin sensitization: Local Lymph Node assay: BrdU-ELISA.
Dette giver mulighed for mere direkte sammenligninger af resultaterne med de kemiske virkninger hos mennesker.
Recommendation on the KeratinoSensTM assay for skin sensitisation testing, 42 pp.
Herefter fjernes testkemikaliet, og det ikketoksiske, stærkt fluorescerende natriumfluorescein-farvestof påføres den apikale side af monolaget i 30 minutter.
Available at: http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/our_labs/eurl-ecvam/eurl-ecvam-recommendations/recommendation-keratinosens-skin-sensitisation.
Skaden, som testkemikaliet forårsager på tight junctions, bestemmes af mængden af fluorescein, der siver gennem cellelaget inden for en nærmere afgrænset periode.
DB-ALM (INVITTOX) (2013) Protocol 155: KeratinoSensTM., 17 pp.
Mængden af natriumfluorescein-farvestoffet, der passerer gennem monolaget og indsatsmembranen i en bestemt mængde af opløsningen i brønden (som natriumfluorescein-farvestoffet siver ud i) bestemmes ved spektroflourometrisk måling af fluoresceinkoncentrationen i brønden.
Available: http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/beta/index.cfm/methodsAndProtocols/index
Størrelsen af fluorescein-udsivningen (FL) beregnes i forhold til fluorescensintensitets- (FI) aflæsningerne fra to kontroller: en blindprøve og en kontrol for den maksimale udsivning.
OECD Guidelines for Chemical Testing No. 457.
Den procentvise udsivning og dermed omfanget af skaden på tight junctions angives i forbindelse med disse kontroller for hver af de fastlagte koncentrationer af testkemikaliet.
The term is often used interchangeably with “concordance”, to mean the proportion of correct outcomes of a test method (29).
Derefter beregnes FL20 (dvs. den koncentration, der forårsager 20 % FL i forhold til den værdi, der registreres for det ubehandlede, sammenflydende enkeltlag og indsatser uden celler).
Antioxidant response element (also called EpRE, electrophile response element), is a response element found in the upstream promoter region of many cytoprotective and phase II genes.
Værdien FL20 (mg/ml) bruges i forudsigelsesmodellen til identifikation af øjenætsende stoffer og stærkt øjenirriterende stoffer (se punkt 35).
When activated by Nfr2, it mediates the transcriptional induction of these genes.
Restitutionen er en vigtig del af et testkemikalies toksicitetsprofil, som også vurderes ved hjælp af in vivo-testen af øjenirritation.
Interpolated concentration for a 1,5 fold luciferase induction.
Foreløbige analyser viste, at restitutionsdata (op til 72 timer efter kemikalieeksponeringen) vil kunne vanskeliggøre forudsigelsesevnen for INVITTOX Protocol 71, men der er behov for yderligere evaluering, og det vil være hensigtsmæssigt med flere data, helst opnået ved yderligere test (6).
Concentration effecting a reduction of cellular viability by 30 %.
Præparering af cellemonolaget
Concentration effecting a reduction of cellular viability by 50 %.
Monolaget af MDCK CB997-celler præpareres med sub-konfluente celler dyrket i celledyrkningskolber i DMEM/næringsstofblandingen F12 (1x-koncentrat med L-glutamin, 15 mM HEPES, calcium (i en koncentration på 1,0-1,8 mM) og 10 % varme-inaktiverede FCS/FBS).
Maximal induction factor of luciferase activity compared to the solvent (negative) control measured at any test chemical concentration.
Det er vigtigt, at alle medier/opløsninger, der anvendes i hele FL-assayet, indeholder calcium i en koncentration på mellem 1,8 mM (200 mg/l) og 1,0 mM (111 mg/l) for at sikre dannelse af tight junctions og disses integritet.
Kelch-like ECH-associated protein 1, is a sensor protein that can regulate the Nrf2 activity.
Intervallet af cellegenerationer bør kontrolleres for at sikre ensartet og reproducerbar dannelse af tight junctions.
Under un-induced conditions the Keap1 sensor protein targets the Nrf2 transcription factor for ubiquitinylation and proteolytic degradation in the proteasome.
Cellerne skal helst ligge inden for generationsintervallet 3-30 efter optøning, fordi celler i dette generationsinterval har en ensartet funktionalitet, hvilket gør det nemmere at reproducere analyseresultaterne.
Covalent modification of the reactive cysteine residues of Keap 1 by small molecules can lead to dissociation of Nrf2 from Keap1 (8) (10) (11).
Før FL-forsøgsmetoden anvendes, adskilles celler fra kolben ved trypsinering og centrifugeres, hvorefter en passende mængde celler podes på indsatser, der er anbragt i plader med 24 brønde (se tillæg 1).
Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2, is a transcription factor involved in the antioxidant response pathway.
12 mm indsatser med en membran af blandede celluloseestere, en tykkelse på 80-150 μm og en porestørrelse på 0,45 μm anvendes til udsåning af cellerne.
When Nrf2 is not ubiquitinylated, it builds up in the cytoplasm and translocates into the nucleus, where it combines to the ARE in the upstream promoter region of many cytoprotective genes, initiating their transcription (8) (10) (11).
I valideringsundersøgelsen benyttede man Millicell-HA 12 mm-indsatser.
Relevance incorporates consideration of the accuracy (concordance) of a test method (29).
Indsatsens egenskaber og membrantypen er vigtige, da disse kan påvirke cellevæksten og kemikaliebindingen.
It is assessed by calculating intra- and inter-laboratory reproducibility and intra-laboratory repeatability (29).
Visse typer af kemikalier kan binde sig til Millicell-HA-indsatsmembranen, hvilket kan få indflydelse på fortolkningen af resultaterne.
The agreement among results obtained from testing the same chemical using the same test protocol (see reliability) (29).
Kompetencekemikalier (se tillæg 3) bør anvendes til at påvise ækvivalensen, hvis der anvendes andre membraner.
The proportion of all positive / active chemicals that are correctly classified by the test method.
Kemikaliebinding til indsatsmembranen er mere almindelig for kationiske kemikalier som benzalkoniumchlorid, der tiltrækkes af den ladede membran (7).
It is a measure of accuracy for a test method that produces categorical results, and is an important consideration in assessing the relevance of a test method (29).
Kemisk binding til indsatsmembranen kan øge den kemiske eksponeringsperiode og føre til en overvurdering af kemikaliets toksiske potentiale, men kan også fysisk reducere udsivningen af fluorescein gennem indsatsen ved at binde farvestoffet til det kationiske kemikalie, der er bundet til indsatsmembranen, hvilket vil føre til en undervurdering af kemikaliets toksiske potentiale.
A replicate containing all components of a test system except of the test chemical, but including the solvent that is used.
Dette kan let kontrolleres ved kun at eksponere membranen for den højeste koncentration af det testede kemikalie og herefter tilføje farvestoffet natriumfluorescein i den normale koncentration i standardtidsrummet (ingen cellekontrol).
It is used to establish the baseline response for the samples treated with the test chemical dissolved in the same solvent.
Hvis der indtræder binding af natriumfluorescein-farvestoffet, får indsatsmembranen en gul farve, når testmaterialet er vasket af.
The proportion of all negative / inactive chemicals that are correctly classified by the test method.
Det er derfor vigtigt kende testkemikaliets bindingsegenskaber for at kunne fortolke kemikaliets indvirkning på cellerne.
It is a measure of accuracy for a test method that produces categorical results and is an important consideration in assessing the relevance of a test method (29).
Cellepodning på indsatserne skal frembringe et sammenflydende monolag på tidspunktet for den kemiske eksponering.
A test method is never valid in an absolute sense, but only in relation to a defined purpose (29).
1,6 × 105 celler tilføjes pr. indsats (400 μl af en cellesuspension med en densitet på 4 × 105 celler/ml).
In Vitro Skin Sensitisation: ARE-Nrf2 Luciferase Test Method
Under disse omstændigheder opnås et sammenflydende monolag normalt efter 96 timers dyrkning.
Prior to routine use of this test method, laboratories should demonstrate technical proficiency by correctly obtaining the expected KeratinoSens™ prediction for the 10 Proficiency Substances recommended in Table 1 and by obtaining the EC1,5 and IC50 values that fall within the respective reference range for at least 8 out of the 10 proficiency substances.
Indsatserne bør undersøges visuelt før podning for at sikre, at eventuelle skader, der konstateres ved den visuelle kontrol, som beskrives i punkt 30, skyldes håndtering.
These Proficiency Substances were selected to represent the range of responses for skin sensitisation hazards.
MDCK-cellekulturer bør opbevares i inkubatorer i en fugtig atmosfære ved 5 % ± 1 % CO2 og 37 ± 1 °C.
Other selection criteria were commercial availability, availability of high quality in vivo reference, and availability of high quality in vitro data from the KeratinoSens™ assay.
Cellerne skal være fri for kontamination med bakterier, virus, mykoplasma og svampe.
Recommended substances for demonstrating technical proficiency with the KeratinoSens™ assay
Påføring af test- og kontrolkemikalier
Proficiency Substances
Der fremstilles en ny stamopløsning af testkemikaliet til hvert forsøg, og den bør anvendes inden for 30 minutter efter fremstillingen.
In Vivo Prediction [1]
Testkemikalierne præpareres i en calciumholdig (med en koncentration på 1,0-1,8 mM), phenolrødt-fri HBSS for at undgå proteinbinding i serummet.
KeratinoSens™ Prediction [2]
Kemikaliets opløselighed ved 250 mg/ml i HBSS vurderes inden testen.
,5 (μM) Reference Range [3]
Hvis kemikaliet danner en stabil suspension eller emulsion (dvs. bevarer ensartetheden og ikke bundfældes eller skilles i mere end en fase) i løbet af 30 minutter ved denne koncentration, kan HBSS stadig bruges som opløsningsmiddel.
(μM ) Reference Range [3]
Brugen af let mineralolie som opløsningsmiddel i de tilfælde, hvor det viser sig, at kemikaliet er uopløseligt i HBSS, bør ske med forsigtighed, da der ikke foreligger tilstrækkelige data til at udlede konklusioner vedrørende FL-assayets ydeevne under sådanne forhold.
Non-sensitiser
Ved test af et fast kemikalie medtages der en meget høj koncentration på 750 mg/ml.
Lactic acid
Denne koncentration af kemikaliet skal muligvis påføres cellerne med en pipette med positiv fortrængning.
Cinnamyl alcohol
Hvis det konstateres, at toksiciteten ligger mellem 25 og 100 mg/ml, bør følgende yderligere koncentrationer testes to gange: 1, 25, 50, 75, 100 mg/ml.
Sensitiser (weak)
værdien udledes af disse koncentrationer, hvis acceptkriterierne er opfyldt.
25 - 175
Testkemikalierne tilsættes de sammenflydende cellemonolag efter fjernelse af dyrkningsmediet og to gange vask med sterilt, varmt (37 °C) calciumholdig (med en koncentration på 1,0-1,8 mM) phenolrødt-fri HBSS.
Ethylene glycol dimethacrylate
Forinden er filtrene kontrolleret visuelt for alle eksisterende skader, der fejlagtigt kunne tilskrives potentiel uforenelighed med testkemikalierne.
5 - 125
Der anvendes mindst tre replikater for hver koncentration af testkemikaliet og til kontrollerne i hver kørsel.
ercaptobenzothiazole
Efter 1 minuts eksponering ved stuetemperatur fjernes testkemikaliet forsigtigt ved opsugning, monolaget vaskes to gange med steril, varm (37 °C) calciumholdigt (med en koncentration på 1,0-1,8 mM) phenolrødt-fri HBSS, og fluoresceinudsivningen måles med det samme.
Sensitiser (moderate)