natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Inden laboratorier påbegynder rutinemæssig brug af denne forsøgsmetode, bør de godtgøre deres tekniske kompetence ved korrekt identifikation af øjenætsningsklassificeringen for de otte anbefalede kemikalier i tabel 1.
Importantly, all media/solutions used throughout the FL assay should contain calcium at a concentration between 1,8 mM (200 mg/l) and 1,0 mM (111 mg/l) to ensure tight junction formation and integrity.
Disse kemikalier er udvalgt således, at de repræsenterer det responsområde for lokal øjenirritation/-ætsning, som er baseret på resultater fra in vivo-kaninøjentesten (TG 405, TM B.5(5)) (dvs. stoffer, der befinder sig i UN GHS-kategori 1, 2A, 2B eller uden for klassificering).
Cell passage number range should be controlled to ensure even and reproducible tight junctions formation.
Hvad angår den validerede anvendelighed af FL-assayet (dvs. alene til identifikation af øjenætsende stoffer/stærkt øjenirriterende stoffer), er der imidlertid kun to testudfald i relation til klassificering (ætsende stof/stærkt irriterende stof eller ikke-ætsende stof/ikke-stærkt irriterende stof), hvormed kompetencen kan godtgøres.
Preferably, the cells should be within the passage range 3-30 from thawing because cells within this passage range have similar functionality, which aids assay results to be reproducible.
Andre udvælgelseskriterier er, at kemikalierne er kommercielt tilgængelige, at der foreligger tilgængelige in vivo-referencedata af høj kvalitet, og at der findes data af høj kvalitet for FL-forsøgsmetoden.
Prior to performing the FL test method, the cells are detached from the flask by trypsinisation, centrifuged and an appropriate amount of cells is seeded into the inserts placed in 24-well plates (see Appendix 1).
Derfor blev kompetencekemikalierne udvalgt fra »Fluorescein Leakage Assay Background Review Document as an Alternative Method for Eye Irritation Testing« (8), som blev anvendt til den retrospektive validering af FL-forsøgsmetoden.
Twelve mm diameter inserts with membrane of mixed cellulose esters, a thickness of 80-150 μm and a pore size of 0,45 μm, should be used to seed the cells.
Anbefalede kemikalier til godtgørelse af teknisk kompetence i anvendelsen af FL
In the validation study, Millicell-HA 12 mm inserts were used.
Forkortelser: CASNR = Chemical Abstracts Service Registry Number
The properties of the insert and membrane type are important as these may affect cell growth and chemical binding.
CASNR
Certain types of chemicals may bind to the Millicell-HA insert membrane, which could affect the interpretation of results.
Ætsende stof/stærkt irriterende stof
Proficiency chemicals (see Appendix 3) should be used to demonstrate equivalency if other membranes are used.
Promethazinhydrochlorid
Chemical binding to the insert membrane is more common for cationic chemicals, such as benzalkonium chloride, which are attracted to the charged membrane (7).
Amin/amidin, heterocyklisk organisk svovlforbindelse
Chemical binding to the insert membrane may increase the chemical exposure period, leading to an over-estimation of the toxic potential of the chemical, but can also physically reduce the leakage of fluorescein through the insert by binding of the dye to the cationic chemical bound to the insert membrane, leading to an under-estimation of the toxic potential of the chemical.
Natriumhydroxid (10 %)
This can be readily monitored by exposing the membrane alone to the top concentration of the chemical tested and then adding sodium-fluorescein dye at the normal concentration for the standard time (no cell control).
Natriumlaurylsulfat (15 %)
If binding of the sodium-fluorescein dye occurs, the insert membrane appears yellow after the test material has been washed-off.
Carboxylsyre (salt)
Thus, it is essential to know the binding properties of the test chemical in order to be able to interpret the effect of the chemical on the cells.
arboxy-benzaldehyd
Cell seeding on inserts should produce a confluent monolayer at the time of chemical exposure.
Carboxylsyre, aldehyd
1,6 × 105 cells should be added per insert (400 μl of a cell suspension with a density of 4 × 105 cells / ml).
Kategori 2(A)
Under these conditions, a confluent monolayer is usually obtained after 96 hours in culture.
Ikke-ætsende stof/ikke-stærkt irriterende stof
Inserts should be examined visually prior to seeding, so as to ensure that any damages recorded at the visual control described at paragraph 30 is due to handling.
Ikke-ætsende stof/ikke-stærkt irriterende stof
The MDCK cell cultures should be kept in incubators in a humidified atmosphere, at 5 % ± 1 % CO2 and 37 ± 1 °C.
Kategori 2(B)
The cells should be free of contamination by bacteria, viruses, mycoplasma and fungi.
Baseret på resultater fra in vivo-kaninøjentesten (OECD TG 405, TM B.5) og brug af UN GHS og EU CLP.
Application of the Test and Control Chemicals
Baseret på resultater, der er opnået med FL (INVITTOX protokol nr. 71(6))
A fresh stock solution of test chemical should be prepared for each experimental run and used within 30 minutes of preparation.
B. 62 Alkalisk in vivo-kometassay med pattedyr
Test chemicals should be prepared in calcium-containing (at a concentration of 1,0-1,8 mM), phenol red-free, HBSS to avoid serum protein binding.
Denne forsøgsmetode svarer til OECD's testvejledning (Test Guideline (TG)) 489 (2016).
Solubility of the chemical at 250 mg/ml in HBSS should be assessed prior to testing.
Der er udarbejdet et OECD-dokument med kortfattede oplysninger om test af genetisk toksikologi og en oversigt over de nylige ændringer af denne testvejledning (11).
All chemicals to be tested are prepared in sterile calcium-containing (at a concentration of 1,0-1,8 mM), phenol red-free, HBSS from the stock solution, at five fixed concentrations diluted on a weight per volume basis: 1, 25, 100, 250 mg/ml and a neat or a saturated solution.
Formålet med kometassayet er at identificere kemikalier, der forårsager DNA-skader.
When testing a solid chemical, a very high concentration of 750 mg/ml should be included.
I et basisk miljø (> pH 13) kan kometassayet registrere brud på enkelt- og dobbeltstrenge, der f.eks. skyldes direkte interaktion med DNA, alkali-labile steder eller en række forbigående brud på DNA-strenge som følge af reparation af DNA-overskæring.
This concentration of chemical may have to be applied on the cells using a positive displacement pipette.
Disse brud på strengene kan repareres, hvilket betyder, at der ikke opstår nogen vedvarende virkning, kan være dødelige for cellen eller kan repareres til en mutation, der medfører en permanent, men dog levedygtig forandring.
If the toxicity is found to be between 25 and 100 mg/ml, the following additional concentrations should be tested twice: 1, 25, 50, 75, 100 mg/ml.
De kan også føre til kromosomskader, som ligeledes er forbundet med mange sygdomme hos mennesker, herunder kræft.
The FL20 value should be derived from these concentrations provided the acceptance criteria were met.
Et formelt valideringsforsøg af in vivo-kometassayet for gnavere blev udført i 2006-2012 og blev koordineret af Japanese Center for the Validation of Alternative Methods (JaCVAM) sammen med Det Europæiske Center for Validering af Alternative Metoder (ECVAM), Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) og NTP Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM) (12).
The test chemicals are applied to the confluent cell monolayers after removal of the cell culture medium and washing twice with sterile, warm (37 °C), calcium-containing (at a concentration of 1,0-1,8 mM), phenol red-free, HBSS.
Definitioner af nøgletermer findes i tillæg 1.
At least three replicates should be used for each concentration of the test chemical and for the controls in each run.
Det bemærkes, at mange forskellige platforme kan bruges til dette assay (objektglas, gelpletter, plader med 96 brønde osv.).
After 1 min of exposure at room temperature, the test chemical should be carefully removed by aspiration, the monolayer should be washed twice with sterile, warm (37 °C), calcium-containing (at a concentration of 1,0-1,8 mM), phenol red-free, HBSS, and the fluorescein leakage should be immediately measured.
For nemheds skyld anvendes betegnelsen “objektglas” i hele den resterende del af dette dokument, men det omfatter alle de øvrige platforme.
Concurrent negative (NC) and positive controls (PC) should be used in each run to demonstrate that monolayer integrity (NC) and sensitivity of the cells (PC) are within a defined historical acceptance range.
Kometassayet en metode til måling af brud på DNA-strenge i eukaryote celler.
The suggested PC chemical is Brij 35 (CAS No. 9002-92-0) at 100 mg/ml.
Enkeltceller/-kerner indlejret i agarose på et objektglas lyseres med et rengøringsmiddel og høj saltkoncentration.
This concentration should give approximately 30 % fluorescein leakage (acceptable range 20-40 % fluorescein leakage, i.e. damage to cell layer).
Ved dette lyseringstrin fjernes celle- og kernemembranerne, hvilket giver mulighed for frigivelse af DNA-spiraler, normalt kaldet nukleoider, og DNA-fragmenter.
The suggested NC chemical is calcium-containing (at a concentration of 1,0-1,8 mM), phenol red-free, HBSS (untreated, blank control).
Elektroforese ved høj pH skaber strukturer, der ligner kometer, og som ved hjælp af hensigtsmæssig fluorescerende farvning kan observeres ved fluorescensmikroskopi; DNA-fragmenterne bevæger sig væk fra “hovedet” og ned i “halen” i henhold til deres størrelse, og komethalens intensitet i forhold til den samlede intensitet (hoved plus hale) afspejler omfanget af DNA-brud (13) (14) (15).
A maximum leakage control should also be included in each run to allow for the calculation of FL20 values.
Det basiske in vivo-kometassay er særlig relevant til vurdering af genotoksisk fare, idet assayets respons afhænger af in vivo-ADME (absorption, distribution, metabolisme og ekskretion), og ligeledes af DNA-reparationsprocesserne.
Maximum leakage is determined using a control insert without cells.
Disse kan variere mellem arter, væv og typerne af DNA-skader.
Determination of fluorescein permeability
For at opfylde kravene til dyrevelfærd, navnlig reduktionen i brugen af forsøgsdyr (princippet om de tre R'er — Replacement, Reduction, Refinement), kan dette assay også integreres med andre toksikologiske undersøgelser, f.eks. undersøgelser af toksicitet ved gentagen dosis (10) (16) (17), eller endepunktet kan kombineres med andre genotoksicitetsendepunkter, f.eks. in vivo-assayet for mikrokernetest i erythrocytter hos pattedyr (18) (19) (20).
Immediately after removal of the test and control chemicals, 400 μl of 0,1 mg/ml sodium-fluorescein solution (0,01 % (w/v) in calcium-containing [at a concentration of 1,0-1,8 mM], phenol red-free, HBSS) is added to the inserts (e.g. Millicell-HA).
Kometassayet udføres oftest på gnavere, selv om det også har været anvendt på andre arter af både pattedyr og ikkepattedyr.
The cultures are kept for 30 minutes at room temperature.
Brug af arter, der ikke er gnavere, bør begrundes videnskabeligt og etisk i hvert enkelt tilfælde, og det anbefales på det kraftigste, at kometassayet kun udføres på andre arter end gnavere som et led i en anden toksicitetsundersøgelse og ikke som en selvstændig test.
At the end of the incubation with fluorescein, the inserts are carefully removed from each well.
Udvælgelse af eksponeringsvej og de vævstyper, der skal undersøges, bør fastlægges på grundlag af al foreliggende/eksisterende viden om testkemikalierne, f.eks. tilsigtet/forventet eksponeringsvej for mennesker, metabolisme og fordeling, potentiale for virkninger på kontaktstedet, strukturelle alarmer, andre data for genotoksicitet eller toksicitet samt formålet med forsøget.
Visual check is performed on each filter and any damage which may have occurred during handling is recorded.
Når det er relevant, kan man undersøge kemikaliernes genotoksiske potentiale i målvævet/målvævene med hensyn til kræftfremkaldende og/eller andre toksiske virkninger.
The amount of fluorescein that leaked through the monolayer and the insert is quantified in the solution which remained in the wells after removal of the inserts.
Assayet betragtes også som nyttigt til yderligere undersøgelse af genotoksicitet, der konstateres i et in vitro-system.
Measurements are done in a spectrofluorometer at excitation and emission wavelengths of 485 nm and 530 nm, respectively.
Det er hensigtsmæssigt at udføre et in vivo-kometassay i et væv af interesse, når man med rimelighed kan forvente, at eksponeringen af det pågældende væv vil være tilstrækkelig.
The sensitivity of the spectrofluorometer should be set so that there is the highest numerical difference between the maximum FL (insert with no cells) and the minimum FL (insert with confluent monolayer treated with NC).
Assayet er blevet valideret mest grundigt i somatisk væv fra hanrotter i ringtest, såsom JaCVAM-forsøg (12) og i Rothfuss et al., 2010 (10).
Because of the differences in the used spectrofluorometer, it is suggested that a sensitivity is used which will give fluorescence intensity > 4000 at the maximum fluorescein leakage control.
Lever og mavesæk blev anvendt i den internationale JaCVAM-valideringstest.
The maximum FL value should not be greater than 9999.
Leveren, fordi den er det mest aktive organ ved fordøjelsen af kemikalier og ofte også et målorgan for carcinogenicitet.
The maximum fluorescence leakage intensity should fall within the linear range of the spectrofluorometer used.
Mavesækken, fordi det er normalt er første kontaktsted for kemikalier ved oral eksponering, selv om andre områder i mave-tarmkanalen såsom duodenum og jejunum også bør betragtes som kontaktstedsvæv og kan anses for mere relevante for mennesker end gnaveres kirtelmaver.
Interpretation of results and Prediction model
Det bør sikres, at sådant væv ikke udsættes for uforholdsmæssigt høje koncentrationer af testkemikaliet (21).
The amount of FL is proportional to the chemical-induced damage to the tight junctions.
Proprietære data fra flere laboratorier viser, at den kan anvendes til mange forskellige slags væv med gode resultater, og mange publikationer viser teknikkens anvendelighed til andre organer eller andet væv end lever og mavesæk, f.eks. jejunum (22), nyre (23) (24), hud (25) (26) eller urinblære (27) (28), lunger og udskyllede bronchoalveolære celler (relevant for undersøgelser af inhalerede kemikalier) (29) (30), og der er desuden foretaget test af flere organer (31) (32).
The mean maximum leakage fluorescence intensity = x
Selv om der kan være interesse i genotoksiske virkninger i kimceller, skal det bemærkes, at det basiske standardkometassay som beskrevet i denne forsøgsmetode ikke anses for hensigtsmæssigt til måling af DNA-strengbrud i modne kønsceller.
The mean 0 % leakage fluorescence intensity (NC) = y
Eftersom der blev rapporteret om høje og variable baggrundsniveauer i DNA-skader ved en gennemgang af litteraturen om brug af kometassayet til kimcelle-genotoksicitet (33), anses det for nødvendigt med protokolændringer kombineret med forbedret standardisering og valideringsundersøgelser, før kometassayet på modne kønsceller (f.eks. sæd) kan indgå i forsøgsmetoden.
The mean 100 % leakage is obtained by subtracting the mean 0 % leakage from the mean maximum leakage,
Desuden er den anbefalede eksponering, der beskrives for denne forsøgsmetode, ikke optimal, og der er behov for længere eksponerings- eller prøveudtagningstider for at nå frem til en meningsfuld analyse af DNA-strengbrud i modne sædceller.
i.e. x – y = z
Genotoksiske virkninger, som måles med kometassayet i testikelcellerne på forskellige differentieringsstadier, findes beskrevet i litteraturen (34) (35).
The percentage leakage for each fixed dose is obtained by subtracting the 0 % leakage to the mean fluorescence intensity of the three replicate readings (m), and dividing this value by the 100 % leakage, i.e. %FL = [(m-y) / z] × 100 %, where:
Det skal dog bemærkes, at gonader indeholder en blanding af somatiske celler og kimceller.
m the mean fluorescence intensity of the three replicate measurements for the concentration involved
Derfor afspejler positive resultater i hele gonaden (testis) ikke nødvendigvis kimcelleskader, men de indikerer ikke desto mindre, at de(t) testede kemikalie(r) og/eller dets metabolitter har nået gonaden.
% FL the percent of the fluorescein which leaks through the cell layer
Man kan ikke pålideligt påvise krydsforbindelser med standardforsøgsbetingelserne for kometassayet.
The following equation for the calculation of the chemical concentration causing 20 % FL should be applied:
Ved visse ændrede forsøgsbetingelser kan man muligvis konstatere DNA-DNA- og DNA-protein-krydsforbindelser og andre baseændringer såsom oxiderede baser (23) (36) (37) (38) (39).
FLD = [(A-B) / (C-B)] × (MC – MB) + MB
Der er imidlertid behov for yderligere undersøgelser for at nå frem til en korrekt karakterisering af de nødvendige protokolændringer.
Where:
Dermed er påvisning af krydsforbindelsesfaktorer ikke det primære formål med assayet som beskrevet her.
D % of inhibition
Assayet er ikke egnet til at identificere aneugener, selv ikke efter ændringerne.
A % damage (20 % fluorescein leakage)
På baggrund af det aktuelle videnniveau er der adskillige yderligere begrænsninger (se tillæg 3) forbundet med in vivo-kometassayet.
B % fluorescein leakage < A
Det forventes, at forsøgsmetoden vil blive revideret på et senere tidspunkt og om nødvendigt ændret på baggrund af de indhøstede erfaringer.
C % fluorescein leakage > A
METODENS PRINCIP
Concentration (mg/ml) of C
Punkt 36-40 indeholder en detaljeret beskrivelse af dosering og prøveudtagning.
Concentration (mg/ml) of B
På de(t) valgte prøveudtagningstidspunkt(er) fridissekeres vævet af interesse, og der fremstilles suspensioner af celler/kerner (in situ-perfusion kan udføres, når det anses for nyttigt, f.eks. lever), som indlejres i blød agar for at immobilisere dem på objektglassene.
The cut-off value of FL20 for predicting chemicals as ocular corrosives/severe irritants is given below:
Cellerne/kernerne behandles med lysisbuffer for at fjerne celle- og/eller kernemembranen og udsættes for en stærk base (f.eks. pH ≥ 13) med henblik på at udfolde DNA'et og frigive udrettede DNA-spiraler og -fragmenter.
C&L: classification and labelling.
Kernens DNA i agaret udsættes herefter for elektroforese.
UN GHS C&L
Efter elektroforese undersøges DNA'et visuelt ved hjælp af en hensigtsmæssig fluorescerende farvning.
EPA C&L
Der findes adskillige endepunkter for kometassayet.
In order to identify water soluble chemicals (substances and mixtures) (3) (6) (7) as “inducing serious eye damage” (UN GHS/EU CLP Category 1) or as an “ocular corrosive or severe irritant” (U.S. EPA Category I), the test chemical should induce an FL20 value of ≤ 100 mg/ml.
DNA-indholdet i halen (den procentvise DNA-intensitet i komethalen eller procentvise haleintensitet) anbefales til brug ved vurdering af DNA-skaderne (12) (40) (41) (42).
Acceptance of results
Efter analyse af et tilstrækkeligt antal kerner analyseres dataene med hensigtsmæssige metoder for at vurdere resultaterne af assayet.
The mean maximum fluorescein leakage value (x) should be higher than 4000 (see paragraph 31), the mean 0 % leakage (y) should be equal or lower than 300, and the mean 100 % leakage (z) should fall between 3700 and 6000.
Hvert laboratorium bør dokumentere sin eksperimentelle kompetence vedrørende kometassayet ved at demonstrere sin evne til at opnå enkeltcelle- eller enkeltkernesuspensioner af tilstrækkelig høj kvalitet for alle typer målvæv fra de anvendte arter.
Data
Kvaliteten af præparaterne vil først blive evalueret med den procentvise DNA-intensitet i komethalen for bærestofbehandlede dyr, der falder inden for et reproducerbart lavt interval.
For each run, data from individual replicate wells (e.g. fluorescence intensity values and calculated percentage FL data for each test chemical, including classification) should be reported in tabular form.
De aktuelle data tyder på, at gruppens gennemsnitlige procentvise DNA-intensitet i komethalen (baseret på middelværdien af medianerne — se punkt 57 for at få yderligere oplysninger om disse betegnelser) i rotteleveren helst ikke må overstige 6 %, hvilket vil være i overensstemmelse med værdierne i JaCVAM-valideringsforsøget (12) og i andre offentliggjorte og proprietære data.
In addition, means ± SD of individual replicate measurements in each run should be reported.
Der findes i øjeblikket ikke tilstrækkelige data til at fremsætte anbefalinger om optimale eller acceptable intervaller for andre vævstyper.
Chemical CAS number, if known;
Dette udelukker ikke anvendelsen af andre vævstyper, hvis dette er velbegrundet.
Purity and composition of the substance or mixture (in percentage(s) by weight), to the extent this information is available;
Testrapporten bør indeholde en relevant gennemgang af resultaterne for kometassayet i disse vævstyper i forhold til den offentliggjorte litteratur eller proprietære data.
Physical-chemical properties relevant to the conduct of the study (e.g. physical state, volatility, pH, stability, water solubility, chemical class);
For det første et det ønskeligt med et lavt interval for den procentvise DNA-intensitet i komethalen for at sikre et tilstrækkeligt dynamisk interval til at kunne påvise en positiv effekt.
Treatment of the test/control chemical prior to testing, if applicable (e.g. warming, grinding);
For det andet bør hvert laboratorium være i stand til at reproducere den forventede respons for direkte mutagener og pro-mutagener med forskellig virkemåde som angivet i tabel 1 (punkt 29).
Storage conditions;
Positive stoffer kan vælges, f.eks. fra JaCVAM-valideringsforsøget (12) eller andre offentliggjorte data (se punkt 9), hvis det er relevant, idet disse begrundes, og idet man påviser tydelige positive responser i vævet af interesse.
Justification of the test method and Protocol Used
Evnen til at detektere svage virkninger af kendte mutagener, f.eks. EMS, ved lave doser bør også påvises, f.eks. ved at fastlægge forhold mellem dosis og respons med et passende antal doser og en passende afstand mellem disse.
Should include considerations regarding applicability domain and limitations of the test method;
De første bestræbelser bør være fokuseret på at opbygge færdigheder med de hyppigst anvendte væv, f.eks. gnaverlever, hvor det er muligt at foretage sammenligninger med eksisterende data og forventede resultater (12).
Description of cell system used, including certificate of authenticity and the mycoplasma status of the cell line;
Data for andre vævstyper f.eks. mave/duodenum/jejunum, blod osv. kan indsamles samtidig.
Details of test procedure used;
Laboratoriet bør kunne dokumentere færdigheder med hver enkelt vævstype fra hver af de arter, man planlægger at undersøge, og bør kunne påvise, at det er muligt at opnå en acceptabel positiv respons med en kendt mutagen (f.eks. EMS) i det pågældende væv.
Test chemical concentration(s) used;
Der bør indsamles data fra bærestofkontroller/negative kontroller for at påvise, at den negative datarespons kan reproduceres, og for at sikre, at de tekniske aspekter af assayet er behørigt kontrolleret, eller for at indikere behovet for at genskabe historiske kontrolintervaller (se punkt 22).
Duration of exposure to the test chemical;
Det skal bemærkes, at selv om flere typer væv kan indsamles ved obduktion og forarbejdes til kometanalyse, skal laboratoriet have ekspertise i at høste flere vævstyper fra samme dyr, hvorved man kan sikre, at enhver potentiel DNA-læsion ikke går tabt, og at kometanalysen ikke forstyrres.
Duration of incubation with fluorescein;
Tidsrummet fra aflivning til fjernelse af væv til forarbejdning kan være kritisk (se punkt 44).
Description of evaluation criteria used;
Der skal tages hensyn til dyrevelfærden, mens man udvikler færdighederne i denne test, og derfor kan væv fra dyr, der er anvendt i andre test, bruges til at udvikle kompetence i de forskellige aspekter af testen.
Reference to historical data of the model (e.g. negative and positive controls, benchmark chemicals, if applicable);