natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Begrundelsen for at udtage en larve, som ikke er på et stadium svarende til kontrolmedianens udviklingsstadie, anføres.
Then conduct a visual check of the state of the suspension.
Bestemmelse af biologiske endepunkter
If pieces of liver are observed in the suspension, repeat the operations (3) and (4) to prepare satisfactory liver homogenate.
I den 21 dage lange eksponeringsfase foretages måling af primære endepunkter på dag 7 og dag 21, men daglig observation af forsøgsdyrene er dog nødvendig.
Cool the suspended liver homogenate on the ice rack until centrifugation.
Tabel 3 giver et overblik over målingens endepunkter og de tilsvarende observationstidspunkter.
Change the pestle to the new one for each homogenate.
Mere detaljerede oplysninger om tekniske procedurer for måling af slutpunkter og histologiske vurderinger er tilgængelige i OECD's vejledningsdokumenter (9).
Homogenise all livers with homogenate buffer according to the procedure described above.
Observationstidspunkter for primære endepunkter i AMA
Centrifugation of the suspended liver homogenate
Slutpunkter
Confirm the temperature of the refrigerated centrifuge chamber at ≤ 5 °C.
Dagligt
Insert the 1,5 ml microtubes containing the suspended liver homogenate in refrigerated centrifuge (adjust the balance if necessary).
Baglem Længde
However, if the supernatants are adequately separated, centrifugal force and time may be adjusted as needed.
Snude-gat-længde
Following centrifugation, check that the supernatants are adequately separated (surface: lipid, intermediate: supernatant, bottom layer: liver tissue).
Kropsvægt (våd)
If the separation is not adequate, centrifuge the suspension again under the same conditions.
Asynkron udvikling anføres, når de undersøgte væv ikke er misdannede eller abnorme, men det relative tidspunkt for morfogenesen eller udviklingen af forskellige væv forstyrres hos en enkelt haletudse.
Collect the supernatant and dispense it to other two 0,5 ml microtubes in the same manner as described above.
Differentiering og vækst af baglemmer kontrolleres af skjoldbruskkirtelhormoner og er vigtige udviklingsmæssige kendetegn, som allerede benyttes i bestemmelsen af udviklingsstadium.
Collect the rest of the supernatant with the micropipette (if feasible: ≥ 100 μl).
Udviklingen af baglemmer bruges kvalitativt i bestemmelsen af udviklingsstadie, men betragtes her som et kvantitativt endepunkt.
Then dispense the supernatant to the remaining 0,5 ml microtube.
Derfor måles baglemslængde som et endepunkt for at afdække virkninger på thyreoideaaksen (figur 2).
Close the cap of the 0,5 ml microtube and write the volume of the supernatant on the label.
Af konsekvenshensyn måles baglemslængden på det venstre baglem.
Then immediately cool the microtubes on the ice rack.
Baglemslængden evalueres både på forsøgets dag 7 og dag 21.
Change the tip of the micropipette to the new one for each supernatant.
På dag 7 er måling af baglemslængden ligetil, som det fremgår af figur 2.
If a large amount of lipid becomes attached to the tip, change it to the new one immediately to avoid contamination of the liver extract with fat.
Det er dog mere kompliceret at måle baglemslængden på dag 21, da lemmerne krummer.
Dispense all of the centrifuged supernatant to four 0,5 ml microtubes according to the procedure described above.
Derfor måles baglemslængden på dag 21 fra kropsvæggen og ved at følge lemmets midterlinje gennem alle vinkelafvigelser.
After dispensing the supernatant to the 0,5 ml microtubes, place all of them in the tube rack with the identification label, and then freeze them in the freezer immediately.
Ændringer i baglemslængden på dag 7 anses stadig for væsentlige for potentiel aktivitet i skjoldbruskkirtlen, selv om de ikke er synlige på dag 21.
If the VTG concentrations are measured immediately after the pre-treatment, keep one 0,5 ml microtube (containing 30 μl of supernatant) cool in the tube rack and transfer it to the workstation where the ELISA assay is conducted.
Længdemålinger foretages på digitale fotografier ved hjælp software til billedanalyse som beskrevet i OECD's Guidance Document on Amphibian Thyroid Histology (9).
In such case, place the remaining microtubes in the tube racks and freeze them in the freezer.
Kropslængde og vådvægt
After the collection of the supernatant, discard the residue adequately.
Bestemmelser af snude-til-gat-længde (SVL) (figur 2) og vådvægt er inkluderet i testprotokollen for at vurdere testkemikaliernes mulige virkninger på haletudsers vækstrate sammenlignet med kontrolgruppen og er nyttige ved påvisning af generel toksicitet i testkemikaliet.
Storage of the specimen
Da fjernelse af vedhængende vand ved vægtbestemmelsen kan skabe stressende forhold for haletudserne og kan forårsage hudskader, udføres disse målinger på dag 7 for haletudserne i delprøven og for alle de resterende haletudser ved testens afslutning (dag 21).
Store the 0,5 ml microtubes containing the supernatant of the liver homogenate at ≤ – 70 °C until they are used for the ELISA.
Snude-til-gat-længden (SVL) bruges til at vurdere haletudsens vækst som illustreret i figur 2.
Zebrafish, Blood Collection from the Caudal Vein / Artery
Typer af kropslængdemålinger og (B) Målinger af baglemslængder for X. laevis-haletudser (1).
Immediately following anaesthesia, the caudal peduncle is severed transversely, and the blood is removed from the caudal artery/vein with a heparinised microhematocrit capillary tube.
Selv om udviklingsstadium og baglemslængde er vigtige endepunkter til at evaluere eksponeringsrelaterede ændringer i metamorfisk udvikling, kan udviklingsforsinkelse ikke i sig selv betragtes som en diagnostisk indikator for aktivitet, der skader skjoldbruskkirtlen.
Blood volumes range from 5 to 15 μl depending on fish size.
Nogle ændringer kan kun observeres ved rutinemæssig histopatologisk analyse.
An equal volume of aprotinin buffer (6 μgml in PBS) is added to the microcapillary tube, and plasma is separated from the blood via centrifugation (5 minutes at 600 g).
Diagnostiske kriterier omfatter forstørret/formindsket skjoldbruskkirtel, follikelcellehypertrofi, follikelcellehyperplasi og som supplerende kvalitative kriterier:
Plasma is collected in the test tubes and stored at – 20 °C until analyzed for vitellogenin or other proteins of interest.
follikulært lumenområde, kolloid kvalitet og follikelcellehøjde/-form.
Procedure 3B:
Klassificering i alvorsgrader (4 grader) anføres.
Zebrafish, Blood Collection by Cardiac Puncture
Oplysninger om, hvordan prøver udtages og behandles til histologisk analyse, og om udførelse af histologiske analyser af vævsprøver er tilgængelige i »Amphibian Metamorphosis Assay:
To avoid coagulation of blood and degradation of protein the samples are collected within Phosphate-buffered saline (PBS) buffer containing heparin (1000 units/ml) and the protease inhibitor aprotinin (2 TIU/ml).
Part 1 — Technical guidance for morphologic sampling and histological preparation« og »Amphibian Metamorphosis Assay: Part 2 — Approach to reading studies, diagnostic criteria, severity grading and atlas« (9).
As ingredients for the buffer, heparin ammonium salt and lyophilised aprotinin are recommended.
Laboratorier, der udfører assayet for første gang, bør søge råd hos erfarne patologer med henblik på uddannelse, før de foretager en histologisk analyse og vurdering af skjoldbruskkirtlen.
For blood sampling, a syringe (1 ml) with a fixed thin needle (e.g. Braun Omnikan-F) is recommended.
Åbenlyse og væsentlige ændringer i slutpunkter, der viser fremskyndet eller asynkron udvikling, kan betyde, at det ikke er nødvendigt at foretage en histopatologisk analyse af skjoldbruskkirtlerne.
The syringe should be prefilled with buffer (approximately 100 μl) to completely elute the small blood volumes from each fish.
Manglende åbenlyse morfologiske ændringer eller bevis for udviklingsforsinkelse skal underkastes histologiske analyser.
The blood samples are taken by cardiac puncture.
Alle testbeholdere kontrolleres dagligt for døde haletudser, og antallene registreres for hver beholder.
At first the fish should be anesthetized with MS-222 (100 mg/l).
Dato, koncentration og beholdernummer for eventuel observation af dødelighed registreres.
The proper plane of anaesthesia allows the user to distinguish the heartbeat of the zebrafish.
Døde dyr fjernes fra testbeholderen, så snart de observeres.
While puncturing the heart, keep the syringe piston under weak tension.
En dødelighed på over 10 % kan tyde på uhensigtsmæssige testbetingelser eller toksiske virkninger af testkemikaliet.
Collectable blood volumes range between 20 - 40 microliters.
Yderligere observationer
After cardiac puncture, the blood/buffer-mixture should be filled into the test tube.
Tilfælde af abnorm adfærd og meget synlige misdannelser og læsioner registreres.
Plasma is separated from the blood via centrifugation (20 min; 5000 g) and should be stored at – 80 °C until required for analysis.
Dato, koncentration og beholdernummer for eventuelle observationer af abnorm adfærd, grove misdannelser eller læsioner registreres.
Procedure 3C:
Normal adfærd er kendetegnet ved, at haletudserne hænger i vandsøjlen med halen hævet over hovedet, slår regelmæssigt og rytmisk med halefinnen, jævnligt kommer op til overfladen for at ånde og reagerer på stimuli.
SOP:
Abnorm adfærd omfatter f.eks. at flyde på overfladen, ligge på bunden af beholderen, omvendt eller uregelmæssig svømning, manglende overfladeaktivitet og manglende respons på stimuli.
Zebrafish, homogenisation of head & tail
Endvidere skal store forskelle i fødeindtagelse mellem behandlingerne registreres.
The fish are anaesthetised and euthanised in accordance with the test description.
Grove misdannelser og læsioner kan omfatte morfologiske abnormiteter (f.eks. deformiteter på lemmer), hæmoragiske læsioner, bakterie- eller svampeinfektioner for blot at nævne nogle få.
The head and tail are cut of the fish in accordance with Figure 1.
Disse bestemmelser er kvalitative og anses for at svare til kliniske tegn på sygdom/stress og foretages ved sammenligning med kontroldyr.
Important:
Hvis forekomsten eller omfanget er større i eksponerede beholdere end i kontrollerne, betragtes disse som bevis for åbenlys toksicitet.
All dissection instruments, and the cutting board should be rinsed and cleaned properly (e.g. with 96 % ethanol) between handling of each single fish to prevent “vitellogenin pollution” from females or induced males to uninduced males.
Dataindsamling
Cut behind
Alle data indsamles ved hjælp af elektroniske eller manuelle systemer, der er i overensstemmelse med god laboratoriepraksis (GLP).
Cut behind dorsal fin
karakterisering af testkemikaliet:
For Vtg analysis
kemiske oplysninger og data:
For gonad histology
Målinger af testkemikaliet kan være påkrævet for både stamopløsninger og testopløsninger
The weight of the pooled head and tail from each fish is measured to the nearest mg.
opløsningsmiddel (hvis det er andet end vand):
After being weighed, the parts are placed in appropriate tubes (e.g. 1,5 ml eppendorf) and frozen at – 80 °C until homogenisation or directly homogenised on ice with two plastic pistils.
begrundelse for valg af opløsningsmiddel og beskrivelse af opløsningsmidlet (art, anvendt koncentration).
(Other methods can be used if they are performed on ice and the result is a homogenous mass).
Operationelle registreringer:
The tubes should be numbered properly so that the head and tail from the fish can be related to their respective body-section used for gonad histology.
disse består af observationer vedrørende testsystemets funktionsmåde og støttemiljø samt infrastruktur.
When a homogenous mass is achieved, 4 x the tissue weight of ice-cold homogenisation buffer is added.
Typiske registreringer omfatter:
Keep working with the pistils until the mixture is homogeneous.
omgivende temperatur, testtemperatur, lysperiode, status for kritiske komponenter i eksponeringssystemet (f.eks. pumper, cyklustællere, tryk), gennemstrømningshastigheder, vandstand, standflaskeændringer og foderregistrering.
Important note:
Generelle vandkvalitetsparametre omfatter:
New pistils are used for each fish.
pH, DO, ledningsevne, total iod, alkalinitet og hårdhed
The samples are placed on ice until centrifugation at 4 °C at 50000 × g for 30 min.
afvigelser fra forsøgsmetoden:
Use a pipette to dispense portions of 20 μl supernatant into at least two tubes by dipping the tip of the pipette below the fat layer on the surface and carefully sucking up the supernatant without fat- or pellet fractions.
denne information bør omfatte alle oplysninger eller forklarende beskrivelser af afvigelser fra forsøgsmetoden.
The tubes are stored at – 80 °C until use.
biologiske observationer og data:
Homogenisation buffer:(50 mM Tris-HCl pH 7,4; 1 % Protease inhibitor cocktail (Sigma)):
disse omfatter daglige observationer af dødelighed, fødeindtagelse, abnorm svømmeadfærd, sløvhed, tab af balance, misdannelser, læsioner osv. Observationer og data indsamlet med forud fastsatte intervaller omfatter:
12 ml Tris-HCl pH 7,4 + 120 μl Protease inhibitor cocktail.TRIS:
udviklingsstadie, baglemslængde, snude-til-gat-længde og vådvægt
TRIS-ULTRA PURE (ICN) e.g. from Bie & Berntsen, Denmark.Protease inhibitor cocktail:
histologiske data:
From Sigma (for mammalian tissue) Product number P 8340.Note:
disse omfatter forklarende beskrivelser samt gradueret sværhedsgrad og specifikke observationers hyppighed, jf. nærmere oplysninger i vejledningsdokumentet vedrørende histopatologisk undersøgelse
The homogenisation buffer should be used the same day as manufactured.
ad hoc-observationer:
Place on ice during use.
disse observationer bør omfatte forklarende beskrivelser af undersøgelsen, som ikke passer ind i de hidtil beskrevne kategorier.
Vitellogenin fortification samples and inter-assay reference standard
Indberetning af data
On each day that vitellogenin assays are performed, a fortification sample made using an inter-assay reference standard will be analysed.
Tillæg 2 indeholder regneark med daglig dataindsamling, der kan bruges som vejledning for indtastning af rådata og for beregninger af statistikoversigter.
The vitellogenin used to make the inter-assay reference standard will be from a batch different from the one used to prepare calibration standards for the assay being performed.
Endvidere stilles der indberetningsskemaer til rådighed, som passer til indsendelse af resuméer af endepunktsdata.
The fortification sample will be made by adding a known quantity of the inter-assay standard to a sample of control male plasma.
Indberetningsskemaer til histologiske vurderinger kan ses i tillæg 2.
The sample will be fortified to achieve a vitellogenin concentration between 10 and 100 times the expected vitellogenin concentration of control male fish.
Resultatkrav og testens brugbarhed/validitet
The sample of control male plasma that is fortified may be from an individual fish or may be a composite from several fish.
Generelt vil grove afvigelser fra testmetoden resultere i uacceptable data til fortolkning eller indberetning.
A subsample of the unfortified control male plasma will be analysed in at least two duplicate wells.
Derfor er følgende kriterier i tabel 4 blevet udarbejdet som vejledning i at bestemme kvaliteten af den udførte test, kontrolorganernes generelle præstation.
The fortified sample also will be analysed in at least two duplicate wells.
Tabel 4
The mean quantity of vitellogenin in the two unfortified control male plasma samples will be added to the calculated quantity of vitellogenin added to fortification the samples to determine an expected concentration.
Resultatkrav for AMA
The ratio of this expected concentration to the measured concentration will be reported along with the results from each set of assays performed on that day.
Kriterium
Decision flowchart for the statistical analysis
Acceptable grænser
Dunnett test on nested ANOVA
Testkoncentrationer
No Yes
Opretholdt med en variationskoefficient på ≤ 20 % (variabilitet i målt testkoncentration) over den 21 dage lange test
Dunn or Mann-Whitney test on rep means
Dødelighed blandt kontroldyrene
variance stabilising transform
≤ 10 % — dødelighed i et hvilket som helst replikat i kontrollerne må ikke overstige 2 haletudser
>=4 reps per conc
Den 10. og 90. percentil af udviklingsstadiefordelingen må ikke adskille sig med mere end fire stadier
Tamhane-Dunnett test >=4 reps per conc
Opløst ilt
<=3 reps per conc Nested ANOVA not normal No Yes No
≥ 40 % luftmætning [8]
Yes variance stabilising transformation
pH bør fastholdes på 6,5-8,5.
Dunnett test Variances unequal
Forskellene mellem replikater/behandlinger må ikke overstige 0,5.
Variances equal
22 ° ± 1 °C — forskellene mellem replikater/behandlinger må ikke overstige 0,5 °C
Not monotone
Testkoncentrationer uden åbenlys toksicitet
Stept-down Jonckheere or Williams' test
Resultat af replikatet
Step-down trendtest on replicate means
≤ 2 replikater på tværs af forsøget kan være kompromitteret
Monotone
Særlige betingelser for brug af opløsningsmiddel
Tamhane-Dunnett test on nested ANOVA
Hvis der bruges et opløsningsmiddel som bærestof, benyttes der både en kontrolgruppe med opløsningsmiddel og en kontrolgruppe med rent vand, og resultaterne registreres
Dunn test on rep means
Statistisk signifikante forskelle mellem kontrolgrupperne med opløsningsmiddel og med vand behandles specielt.
Dunn or Mann-Whitney test
Se nærmere oplysninger nedenfor
Nested ANOVA normal
Særlige betingelser for system med statisk udskiftning
Rep means normally distributed
Repræsentative kemiske analyser før og efter udskiftning registreres
Step-down Jonckheere test
Ammoniakniveauer måles umiddelbart inden udskiftning
Rep means normal or not homogenous
Alle vandkvalitetsparametre anført i tabel 1 i tillæg 1 måles umiddelbart inden udskiftning
Rep means normal & homogenous
Udskiftningsperioden må ikke overstige 72 timer
Determine whether Dose-Response is monotone
Passende ernæringsplan (50 % af den daglige foderration af kommercielt haletudsefoder)
C.38.
Testningens gyldighed
THE AMPHIBIAN METAMORPHOSIS ASSAY
Følgende krav skal opfyldes, hvis en test skal anses for acceptabel/gyldig:
This test method is equivalent to OECD test guideline (TG) 231 (2009).
Gyldigt forsøg i en test, der bestemmes negativ med hensyn til aktivitet i skjoldbruskkirtlen:
The need to develop and validate an assay capable of detecting chemicals active in the thyroid system of vertebrate species originates from concerns that environmental levels of chemicals may cause adverse effects in both humans and wildlife.
For en given behandling (inklusive kontrolgrupper) må dødeligheden ikke overstige 10 %.
In 1998, the OECD initiated a high-priority activity to revise existing TGs and to develop new TGs for the screening and testing of potential endocrine disrupters.
For et bestemt replikat må dødeligheden ikke overstige tre haletudser, ellers anses replikatet for at være kompromitteret.
One element of the activity was to develop a TG for the screening of chemicals active on the thyroid system of vertebrate species.
Mindst to behandlingsniveauer med alle fire ukompromitterede replikater bør være tilgængelige for analyse.
Both an enhancement of the Repeated dose 28-day oral toxicity study in rodents (Chapter B.7 of this Annex) and the Amphibian Metamorphosis Assay (AMA) were proposed.
Mindst to behandlingsniveauer uden åbenlys toksicitet bør være tilgængelige for analyse.
The enhanced test method B.7 underwent validation and a revised test method has been issued.
Gyldigt forsøg i en test, der bestemmes positiv med hensyn til aktivitet i skjoldbruskkirtlen:
The Amphibian Metamorphosis Assay (AMA) underwent an extensive validation programme which included intra- and inter-laboratory studies demonstrating the relevance and reliability of the assay (1, 2).
Dødelighed hos højst to haletudser/replikat i kontrolgruppen kan forekomme.
Subsequently, the validation of the assay was subject to peer-review by a panel of independent experts (3).
Beslutningsforløb for gennemførelse af AMA
This test method is the outcome of the experience gained during the validation studies for the detection of thyroid active chemicals, and of work conducted elsewhere in OECD member countries.
Beslutningsforløbet blev udviklet for AMA for at yde logisk bistand til gennemførelse og fortolkning af resultaterne af bioassayet (se fremgangsmåde i figur 3).
The Amphibian Metamorphosis Assay (AMA) is a screening assay intended to empirically identify chemicals which may interfere with the normal function of the hypothalamic-pituitary-thyroid (HPT) axis.
Beslutningsforløbet vægter grundlæggende endepunkterne i den avancerede udvikling, asynkrone udvikling og histopatologiske undersøgelse af skjoldbruskkirtlen tungt, mens forsinket udvikling, snude-til-gat-længde og kropsvægt (våd), som er parametre, der potentielt kan påvirkes af generel toksicitet, vejer mindre tungt.
The AMA represents a generalised vertebrate model to the extent that it is based on the conserved structures and functions of the HPT axis.
Avanceret udvikling (bestemt gennem udviklingsstadium, snude-til-gat-længde (SVL) og baglemslængde (HLL)
It is an important assay because amphibian metamorphosis provides a well-studied, thyroid-dependent process which responds to chemicals active within the HPT axis, and it is the only existing assay that detects thyroid activity in an animal undergoing morphological development.
Avanceret udvikling vides kun at forekomme gennem virkninger, som er knyttet til thyreoideahormonet.
The general experimental design entails exposing stage 51 Xenopus laevis tadpoles to a minimum of three different concentrations of a test chemical and a dilution water control for 21 days.
Disse kan være virkninger på perifert væv såsom direkte interaktion med thyreoideahormonreceptoren (som med T4) eller virkninger, der forandrer niveauet af cirkulerende thyreoideahormoner.
There are four replicates of each test treatment.
I begge tilfælde anses det for tilstrækkeligt bevis for, at kemikaliet er thyreoideaaktivt.
Larval density at test initiation is 20 tadpoles per test tank for all treatment groups.
Avanceret udvikling vurderes på en af to måder.
The observational endpoints are hind limb length, snout to vent length (SVL), developmental stage, wet weight, thyroid histology, and daily observations of mortality.
For det første kan det generelle udviklingsstadium vurderes under anvendelse af den standardiserede tilgang, som er beskrevet nærmere hos Nieuwkoop og Faber (8).
Test Species
For det andet kan særlige morfologiske træk kvantificeres såsom baglemslængde på både dag 7 og 21, som associeres positivt med agonistiske virkninger på thyreoideahormonreceptoren.
Xenopus laevis is routinely cultured in laboratories worldwide and is easily obtainable through commercial suppliers.
Hvis der forekommer statistisk signifikante fremskridt i udvikling eller bagbenslængde, viser testen, at kemikaliet er thyreoideaaktivt.
Reproduction can be easily induced in this species throughout the year using human chorionic gonadotropin (hCG) injections and the resultant larvae can be routinely reared to selected developmental stages in large numbers to permit the use of stage-specific test protocols.
Vurderingen af forsøgsdyr for forekomst af fremskyndet udvikling i forhold til kontrolpopulationen baseres på resultater af statistiske analyser udført for følgende fire endepunkter:
It is preferred that larvae used in the assay are derived from in-house adults.
baglemslængde (normaliseret ved SVL) på undersøgelsens dag 7
As an alternative although this is not the preferred procedure, eggs or embryos may be shipped to the laboratory performing the test and allowed to acclimate;
baglemslængde (normaliseret ved SVL) på undersøgelsens dag 21
the shipping of larval stages for use in the test is unacceptable.
udviklingsstadium på undersøgelsens dag 7
Equipment and Supplies
udviklingsstadium på undersøgelsens dag 21
The following equipment and supplies are needed for the conduct of this assay:
Statistiske analyser af baglemslængde udføres på grundlag af målinger af længden af det venstre baglem.
Exposure system (see description below);
Baglemslængden normaliseres ved at beregne forholdet mellem et individs baglemslængde og snude-til-gat-længde.
Glass or stainless steel aquaria (see description below);