natgillin/translations-raw huggingface dataset:
PCR-versioner med dokumenteret tilsvarende effektivitet kan også anvendes.
Commercially available DNA extraction kits that produce high quality DNA suitable for use with the PCR protocols set out in point II.2 may be used.
Sekventering kan foretages af laboratoriet eller hos eksterne specialiserede sekventeringsvirksomheder.
The acceptable tissue medium ratio shall be 1:9 w/v.
Sekventeringsresultaterne skal analyseres ved at sammenligne sekvenserne med kendte referencesekvenser af KHV (GenBank, stammesamlingsnummer AP008984, DQ657948 og DQ177346).
20 to 25 mg tissue material shall be included in the tests.
Der skal mindst være 98 % match mellem den opnåede rene konsensussekvens og disse referencesekvenser
Surveillance of KHVD by PCR based methods
DETALJEREDE DIAGNOSEMETODER OG -PROCEDURER FOR OVERVÅGNING OG BEKRÆFTELSE AF INFEKTIØS LAKSEANÆMI (ISA)
For the surveillance of KHV, a qPCR shall be used.
I. Prøveudtagningsprocedurer for overvågning og bekæmpelse af ISA
If positive samples appear in an area not previously confirmed positive, the test results shall be confirmed either:
Hvis der foretages prøveudtagning og laboratorieundersøgelse med henblik på overvågnings- eller udryddelsesprogrammerne i bilag I, del 3, eller for at bekræfte eller udelukke forekomst af ISA i overensstemmelse med artikel 57, litra b), i direktiv 2006/88/EF, anvendes de detaljerede metoder og procedurer i punkt I.1, I.2 og I.3.
by sequencing of a PCR or nested PCR product from the samples.
Fiskeprøver til laboratorieundersøgelser for forekomst af ISA må, hvis muligt, ikke samles.
The obtained clean consensus sequence shall match (by at least 98 %) with these reference sequences.
I forbindelse med overvågning af ISA må 2-5 fisk dog gerne samles i en prøve.
or alternatively, samples may be sent to a national reference laboratory for confirmation.
Prøver til revers transkriptase-polymerasekædereaktion (RT-PCR) skal udtages af alle de af prøven omfattede fisk.
qPCR for KHV detection
Et stykke af mellemnyren fjernes fra fisken med et sterilt instrument og overføres til et mikrocentrifugeglas med 1 ml RNA-konserveringsvæske af dokumenteret effektivitet.
The qPCR described as follows shall be used:
Vægten af vævet i en prøve skal være 0,5 g. Hvis fisken er for lille til, at der kan opnås en prøve af den krævede vægt, kan der tages stykker af nyre, hjerte, milt, lever eller blindtarm i nævnte rækkefølge, indtil der opnås 0,5 g.
The results of the qPCR may vary depending on the conditions under which it is performed, namely the thermal protocols might need optimisation, depending on the thermal cycler in use.
Prøver til histologisk undersøgelse må kun udtages fra nyligt aflivede fisk med normal konstitution, der udviser kliniske tegn eller tegn ved obduktion, som tyder på forekomst af ISA.
Conventional PCR for confirmation of KHV detection
Alle ydre eller indre læsioner skal medtages i prøven, og der skal under alle omstændigheder udtages prøver af mellemnyre, hjerte, lever, bugspytkirtel, tarm, gæller og milt, som fjernes fra de enkelte fisk ved hjælp af en skalpel og overføres til en 8-10 % (v/v) bufferet formaldehyd/saltopløsning.
For confirmation of the presence of infection with KHV, the generic nested PCR described in the following Table 2.1 shall be used followed by sequencing of the amplified product.
Forholdet mellem fikseringsvæske og væv skal mindst være 20:1 for at sikre en tilfredsstillende konservering af vævet.
Table 2.1
Til immunhistokemi (IHC) skal der udtages prøver fra mellemnyre og hjerte.
Primers and conditions for the nested PCR assay targeting all cyprinid herpesviruses (CyHV-1, CyHV-2 and CyHV-3)
Til virologisk undersøgelse i cellekultur udtages der væv af alle de af prøven omfattede fisk.
Primer name
Stykker af lever, for- eller mellemnyre, hjerte og milt fjernes fra fisken med et sterilt instrument og overføres til plastrør med 9 ml transportmedium.
Sequence
Væv fra op til fem fisk kan samles i et rør med transportopløsning og udgøre en samleprøve.
Cycling conditions
Hele fisk kan transporteres til laboratoriet, hvis de i tredje afsnit i dette punkt beskrevne krav til transporttemperaturen kan overholdes.
First round PCR
Hele fisk skal indpakkes i absorberende papir og sendes i en plastpose, der køles som beskrevet i nævnte afsnit.
1 cycle:
Blodprøver og rør med fiskevæv til virologisk undersøgelse eller RT-PCR-analyse placeres i isolerede beholdere, f.eks. tykvæggede polystyren-kasser, sammen med tilstrækkeligt med is eller fryseblokke, så det sikres, at prøverne opbevares køligt under transporten til laboratoriet.
40 cycles:
Frysning skal undgås, og ved modtagelsen skal der stadig være is i transportbeholderen, eller en eller flere af fryseblokkene skal stadig være helt eller delvis frosset.
95 °C for 30 seconds
Under ekstraordinære omstændigheder kan RT-PCR-prøver og prøver til virologisk undersøgelse lynfryses og transporteres til laboratoriet ved – 20 °C eller derunder.
55 °C for 30 seconds
Til RT-PCR-analyse af væv konserveret i ribonukleinsyre(RNA)later skal RNA-ekstraktion foretages inden for følgende tidsfrister afhængigt af den temperatur, som prøverne opbevares ved:
72 °C for 45 seconds
prøver opbevaret ved – 20 °C: tidsubegrænset.
72 °C for 10 minutes
Hvis fiskevæv transporteres i fikseringsvæske til histologisk undersøgelse, skal det forsendes i lækagesikre rør i stødsikre beholdere.
CyHVpol-reverse
Nedfrysning af disse prøver skal undgås.
CyHVpol-internal forward
Under forudsætning af det diagnostiske laboratoriums godkendelse kan andet fiskevæv end det i punkt I.1 omhandlede indsamles og præpareres til supplerende undersøgelser.
Second round PCR
Detaljerede diagnosemetoder og -procedurer for overvågning af og for at bekræfte forekomst af eller for at udelukke mistanke om ISA
95 °C 2 minutes,
Hvis der foretages laboratorieundersøgelser for at opnå eller opretholde en bestemt sundhedsstatus med hensyn til ISA, jf. bilag I, del 3, afsnit I, eller for at bekræfte forekomst af eller udelukke mistanke om ISA i overensstemmelse med artikel 57, litra b), i direktiv 2006/88/EF ved hjælp af diagnosemetoderne i bilag I, del 3, afsnit II, anvendes de detaljerede diagnosemetoder og -procedurer i punkt II.1-II.5 nedenfor.
CyHVpol-internal reverse
Undersøgelse af prøver ved hjælp af RT-PCR
PCR versions of proven similar efficacy may be used instead.
Den diagnosemetode, der skal anvendes til screening for ISAV, skal være RT-qPCR.
Sequencing may be performed by the laboratory or at external specialised sequencing companies.
Da resultaterne af RT-qPCR kan variere afhængigt af de betingelser, den foretages under, skal der anvendes passende negative og positive kontroller samt amplikon for at undgå enhver tvivl.
Sequencing results shall be analysed by aligning the sequences to the known reference sequences of KHV (Gen Bank accession numbers AP008984, DQ657948 and DQ177346).
Total RNA-ekstraktion
The obtained clean consensus sequence must match at least to 98 % with those reference sequences.
RNA ekstraheres efter phenolchloroformmetoden eller med kolonner til oprensning af RNA i henhold til fabrikantens anvisninger.
DETAILED DIAGNOSTIC METHODS AND PROCEDURES FOR THE SURVEILLANCE AND CONFIRMATION OF INFECTIOUS SALMON ANEMIA (ISA)
RNA skal genopslæmmes i destilleret RNAse-frit vand (dvs. vand, der er behandlet med 0,1 % diethylpyrocarbonat).
I. Sampling procedures for the surveillance and control of ISA
Det ekstraherede DNA's koncentration og renhed skal bestemmes ved at måle den optiske densitet ved 260 nm og ved 280 nm.
When sampling and laboratory examination are carried out, for the purpose of the surveillance or eradication programmes set out in Part 3 of Annex I or to confirm or rule out the presence of ISA in accordance with Article 57(b) of Directive 2006/88/EC, the detailed methods and procedures set out in points I.1, I.2 and I.3 of this Section shall apply.
En alternativ fremgangsmåde kan være at inkludere interne kontroller, der er målrettet virusgenomet, jf. punkt II.1.3.
For the purpose of laboratory examination for the presence of ISA, fish samples shall not be pooled where possible.
RT-PCR til ISAV-påvisning
However, for the purpose of surveillance for ISA, the pooling of 2 to be 5 fish is accepted.
Der kan anvendes flere RT-PCR-metoder til ISAV-genomamplificering.
Samples for Reverse Transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis shall be taken from all of the fish sampled.
Der kan foretages en totrins-RT-PCR, hvor RT- og PCR-reaktionstrinnene køres i to separate rør.
A piece of mid-kidney shall be removed from the fish using a sterile instrument and transferred to a microfuge tube containing one ml RNA preservative solution of proven efficacy.
Der kan dog også foretages en ettrins-reaktion, hvor de to reaktioner køres i ét rør.
Tissue from up to five fish may be collected in one tube of transport solution and shall represent one pooled sample.
Hvor det er muligt, skal ettrins-metoden anvendes, da risikoen for krydskontaminering mindskes, idet indholdet ikke skal overføres, og denne metode anses for at være lige så sensitiv som totrins-metoden.
The weight of tissue in one sample shall be 0,5 g.
Der skal anvendes de primere og analyser, der er beskrevet i dette punkt, dvs. primerparret ILA1 eller ILA2, der er målrettet segment 8, og som er fundet egnet til påvisning af ISAV ved udbrud og hos fisk, der er bærere.
When the fish are too small to obtain a sample of the required weight, pieces of kidney, heart, spleen, liver or pyloric caeca may be taken, in that order of preference, to make up 0,5 g.
Den reverse primer ILA2 matcher ikke isolater fra Nordamerika, og der skal i sådanne tilfælde anvendes et alternativt primersæt.
Tissue for histological examination shall only be taken from freshly killed fish with a normal constitution, exhibiting clinical signs or post-mortem findings consistent with the presence of ISA.
Forward primer (ILA1): 5′-GGCTATCTACCATGAACGAATC-3′
Any external or internal lesions shall be sampled and in any case samples of mid-kidney, heart, liver, pancreas, gut, gills and spleen shall be removed from individual fish using a scalpel and transferred to 8 % to 10 % (vol:vol) buffered formol saline.
Cyklusbetingelser: 1 cyklus ved 50 °C i 30 minutter, 1 cyklus ved 94 °C i 15 minutter, 40 cyklusser ved 94 °C i 30 sekunder, 55 °C i 30 sekunder og 72 °C i 60 sekunder; 1 cyklus ved 72 °C i 5 minutter.
The ratio of fixative to tissue shall be at least 20:1 to ensure satisfactory preservation of the tissues.
Produktstørrelse: 155 bp.
For immunohistochemistry (IHC), samples from mid-kidney and heart shall be taken.
Andre RT-PCR-versioner med dokumenteret tilsvarende effektivitet kan dog også anvendes.
Tissues for virological examination on cell culture shall be taken from all of the fish sampled.
RT-qPCR til ISAV-påvisning
Pieces of the liver, anterior or mid-kidney, heart and spleen shall be removed from the fish using a sterile instrument and transferred to plastic tubes containing 9 ml transport medium.
Anvendelsen af RT-qPCR kan øge specificiteten og muligvis også sensitiviteten.
Tissues from up to five fish may be collected in one tube containing transport solution and represent one pooled sample.
Metoden kan udføres hurtigere, da der ikke kræves gelelektroforese, og den mindsker risikoen for krydskontaminering, da det er muligt at estimere mængden af viralt genomisk RNA i prøverøret.
The weight of tissue in one sample shall be 1,0 ± 0,5 g.
En ulempe ved RT-qPCR-analyse er, at det ofte ikke er muligt at sekventere de amplificerede produkter.
Shipment of samples from fish
Hersker der imidlertid tvivl om det amplificerede produkts specificitet, skal der køres en anden ISAV-specifik analyse for at verificere resultatet.
Whole fish may be transported to the laboratory if the temperature requirements during transportation, as described in paragraph 3 of this point can be fulfilled.
Den i dette punkt beskrevne analyse, som er en analyse, der er målrettet segment 8, skal anvendes.
Whole fish shall be wrapped in absorbent paper and shipped in a plastic bag, chilled as described in that paragraph.
Denne analyse skal omfatte isolater fra Den Europæiske Union, Den Europæiske Frihandelssammenslutning og Nordamerika.
Live fish may also be shipped, but only under the supervision of the National reference laboratory for fish diseases and taking into account the additional disinfection and biosecurity issues when transporting live fish.
Hvor det er muligt, skal ettrins-metoden anvendes, da metoden med ét rør mindsker risikoen for krydskontaminering.
Blood samples and tubes containing fish tissues for virological examination or RT-PCR analysis shall be placed in insulated containers, such as thick-walled polystyrene boxes, together with sufficient ice or freeze blocks to ensure chilling of the samples during transportation to the laboratory.
Forward primer: 5′- CTACACAGCAGGATGCAGATGT -3′
Freezing shall be avoided and ice must still be present in the transport box at receipt of the shipment or one or more of the ‘freeze blocks’ must still be partly or completely frozen.
Reverse primer: 5′- CAGGATGCCGGAAGTCGAT -3′
In exceptional circumstances, RT-PCR samples and samples for virological examination may be snap-frozen and transported to the laboratory at – 20 °C or below.
og probe: 5′-FAM- CATCGTCGCTGCAGTTC — MGBNFQ-3′.
For RT-PCR analysis of tissues preserved in Ribonucleic acid(RNA)later, RNA extraction shall be carried out within the following time frames depending on the temperature the samples are stored at:
Cyklusbetingelser: 1 cyklus ved 50 °C i 30 minutter, 1 cyklus ved 95 °C i 15 minutter, 40 cyklusser ved 94 °C i 15 sekunder, 60 °C i 60 sekunder; justeres om nødvendigt.
samples stored at – 20 °C: indefinitely.
Sekventering af amplificerede PCR-produkter
If fish tissues are transported in fixative for histological examination, they shall be shipped in leak proof tubes in impact-resistant containers.
Forward primer (ILAs6-3F): 5′-ATGAGGGAGGTAGCATTGCA -3′
Freezing of those samples shall be avoided.
Cyklusbetingelser (ettrins-RT-PCR): 1 cyklus ved 50 °C i 30 minutter, 1 cyklus ved 94 °C i 15 minutter, 40 cyklusser ved 94 °C i 30 sekunder, 55 °C i 30 sekunder og 72 °C i 60 sekunder, 1 cyklus ved 72° i 5 minutter; justeres om nødvendigt.
Subject to the approval of the diagnostic laboratory, fish tissues other than those referred to in point I.1 may be collected and prepared for supplementary examination.
Alternativt kan følgende metode til sekventering af HPR i segment 6 anvendes:
Detailed diagnostic methods and procedures for the surveillance and for the confirmation of the presence of or to rule out the suspicion of ISA
Forward primer: 5′-GAC-CAG-ACA-AGC-TTA-GGT-AAC-ACA-GA-3′
When laboratory examination for the purpose of obtaining or maintaining a certain health status with regard to ISA as set out in Section I of Part 3 of Annex I, or for the purpose of the confirmation of the presence of or to rule out a suspicion of ISA in accordance with Article 57(b) of Directive 2006/88/EC, are carried out, using the diagnostic methods set out in Section II of Part 3 of Annex I, the detailed methods and procedures set out in the following points II.1 to II.5 shall apply.
Reverse primer: 5′-GAT-GGT-GGA-ATT-CTA-CCT-CTA-GAC-TTG-TA-3′
Examination of samples by RT-PCR
Produktstørrelse: 304 nt hvis HPR0.
The diagnostic method to be used for the screening for ISAV shall be RT-qPCR.
RT-PCR-analyser med samme sensitivitet og specificitet som den analyse, der er beskrevet i dette punkt, kan også anvendes.
As the results of the RT-qPCR can vary depending on the conditions under which it is performed, adequate positive and negative controls and amplicons shall be included to avoid any doubts.
Det amplificerede RT-PCR-produkts renhed skal kontrolleres ved gelelektroforese inden sekventering.
Total RNA extraction
Hvis der kun forekommer ét rent fragment, skal det renses direkte fra PCR-reaktionen.
Total RNA shall be extracted using the phenol-chloroform method or RNA affinity spin columns, according to the manufacturer's instructions.
PCR-fragmenterne skal renses for opløsninger eller agarosegeler ved hjælp af kolonner til oprensning af PCR-fragmenter i henhold til fabrikantens anvisninger.
The concentration and purity of the extracted RNA shall be estimated by measuring the optical density at 260 nm and at 280 nm.
Sekventering skal foretages med amplificeringsprimere hos eksterne specialiserede sekventeringsvirksomheder.
An alternative approach may be to include internal controls targeted against the virus genome as referred to in point II.1.3.
Sekventeringsresultaterne skal analyseres ved hjælp af søgeværktøjet BLAST, og sekvenserne skal sammenlignes med andre kendte sekvenser i nucleotiddatabasen i det amerikanske »National Centre for Biotechnical Information« (NCBI).
RT-PCR for ISAV detection
Sekventering skal fjerne al tvivl om et amplificeret RT-PCR-produkts specificitet.
Several RT-PCR methods may be used for ISAV genome amplification.
ISAV-isolation i cellekulturer
A two-step RT-PCR may be performed whereby the RT and the PCR reactions steps are run in two separate tubes.
Præparation af prøver
However, a one-step reaction, where the two reactions are run in one tube, may also be performed.
Vævet kan opbevares ved – 80 °C.
The one-step method shall be used where possible, as the one tube assay minimises the risk of cross-contamination as no transfer of content have to be made and it is regarded to be as sensitive as the two-step method.
Vævet må kun fryses og optøs én gang, inden det undersøges.
The primers and assay described in this point, namely the ILA1 or ILA2 primer pair that target segment 8 and which have been found suitable for detection of ISAV in outbreaks and in carrier fish, shall be used.
I forbindelse med overvågning og kontrol skal undersøgelsen foretages så hurtigt som muligt.
The ILA2 reverse primer does not match isolates from North America and an alternative primer set shall be used in those cases.
Hver prøve (samlet vævsprøve i transportvæske) skal homogeniseres fuldstændigt ved hjælp af en valideret homogenisator, centrifugeres ved 2000 til 4000 × g i 15 minutter ved 0-6 °C, og supernatanten skal filtreres (0,45 μm) og inkuberes med en tilsvarende mængde passende fortyndet blanding af antiserum mod de indigene serotyper af IPNV.
Forward primer (ILA1): 5′-GGCTATCTACCATGAACGAATC-3′;
Antiserumtiteren skal være mindst 1:2000 i en 50 % pladeneutraliseringsprøve.
Reverse primer (ILA2): 5′-GCCAAGTGTAAGTAGCACTCC-3′.
Blandingen inkuberes i 1 time ved 15 °C.
Cycling conditions: one cycle of 50 °C for 30 minutes, 1 cycle of 94 °C for 15 minutes, 40 cycles of 94 °C for 30 seconds, 55 °C for 30 seconds, 72 °C for 60 seconds; one cycle of 72 °C for 5 min.
Derved opnås inokulummet.
Product size 155 bp.
Formålet med at behandle alle inokula med antiserum mod IPN-virus (et virus, som i nogle dele af Europa forekommer i 50 % af alle fiskeprøver) er at hindre, at der udvikles cytopatisk effekt (CPE) som følge af IPN-virus i podede cellekulturer.
However, other RT-PCR versions of proven similar efficacy may be used instead.
En sådan behandling kan gennemføres for at nedsætte de virologiske undersøgelsers varighed og antallet af tilfælde, hvor forekomst af CPE ellers måtte opfattes som en potentiel indikation af ISAV.
RT-qPCR for ISAV detection
Når prøverne kommer fra produktionsenheder, der anses for at være frie for IPN, kan behandling af inokula med antiserum mod IPN-virus undlades.
The use of RT-qPCR may increase specificity and probably also sensitivity.
Atlantic salmon kidney-celler (ASK-celler) skal anvendes til primær ISAV-isolation.
A drawback of the RT-qPCR assay is that it is often not possible to sequence amplified products.
Andre cellelinjer af dokumenteret effektivitet og sensitivitet ved isolation af ISAV kan anvendes under hensyntagen til stammevariabilitet og de forskellige stammers evne til replikation i forskellige cellelinjer.
However, if there is doubt on the specificity of the amplified product, another ISAV specific assay must be run to verify the result.
ASK-cellerne synes at støtte isolation og vækst af de hidtil kendte virusisolater, så længe der anvendes et lavt passageniveau.
The assay described in this point, which is an assay that target segment 8, shall be used.
Der kan forekomme en tydeligere cytopatisk effekt i ASK-celler end i andre modtagelige cellelinjer som f.eks. SHK-1 (Salmon Head Kidney-1).
This assay shall cover isolates from the European Union, the European Free Trade Association and North America.
ASK-celler (passage 65 eller derunder) skal dyrkes i et L-15-medium indeholdende 10 % føtalt kvægserum, 2 % (v/v) 200 mM L-glutamin og 0,08 % (v/v) 50 mM 2-mercaptoethanol i multibrøndplader.
The one-step method shall be used where possible, because the one tube assay minimises the risk of cross-contamination.
Antiserumbehandlet organopslæmning podes på unge aktivt voksende cellekulturer, så der fremkommer en slutopløsning af vævsmateriale i dyrkningssubstrat på 1:1000.
Forward primer: 5′- CTACACAGCAGGATGCAGATGT -3′;
For hvert organ tilsættes en opslæmning af 40 μl podemateriale til én brønd med 2 ml dyrkningsmedium.
Reverse primer: 5′- CAGGATGCCGGAAGTCGAT -3′;
En plade lades upodet, så den kan bruges som negativ kontrol.
and probe: 5′-FAM- CATCGTCGCTGCAGTTC – MGBNFQ-3′.
En separat plade til positiv kontrol podes med et referenceisolat af ISAV på følgende måde: 100 μl af et stampræparat af ISAV (minimumstiter 107 50 % Tissue Culture Infective Dose (TCID50 ml– 1)) podes i den første brønd og omrøres.
Cycling conditions: one cycle of 50 °C for 30 minutes, one cycle of 95 °C for 15 minutes, 40 cycles of 94 °C for 15 seconds, 60 °C for 60 seconds; it shall be adjusted if necessary.
En mængde af dette materiale overføres fra den første brønd til den anden brønd, så der opnås en fortynding på 1:10, og omrøres.
Sequencing of amplified PCR products
Dette gentages hen over pladen, så der opnås seks ti-fold-fortyndinger.
Forward primer (ILAs6-3F): 5′-ATGAGGGAGGTAGCATTGCA -3′;
ISAV-stampræparatet kan opbevares ved – 80 °C i mindst to år, men når det er optøet, skal det anvendes i løbet af tre dage.
Reverse primer (ILAs6-2R): 5′-CATGCTTTCCAACCTGCTAGGA -3′.
Det skal forhindres, at prøvepladerne krydskontamineres med positivt kontrolmateriale.
Cycling conditions (One-step RT-PCR): one cycle of 50 °C for 30 minutes, one cycle of 94 °C for 15 minutes, 40 cycles of 94 °C for 30 seconds, 55 °C for 30 seconds, 72 °C for 60 seconds, one cycle of 72 °C for 5 minutes; it shall be adjusted if necessary.
For at undgå denne risiko skal positive kontroller opstilles og behandles adskilt fra prøvepladerne.
Alternatively, the following method for sequencing HPR in segment 6 may be used:
Hvis ASK-cellerne gennemgår en sensitivitetstest mod ISAV-isolater hver sjette måned, kan dette erstatte anvendelsen af en positiv kontrol ved hver podning.
Forward primer: 5′-GAC-CAG-ACA-AGC-TTA-GGT-AAC-ACA-GA-3′;
Prøverne inkuberes ved 15 ± 2 °C i op til 15 dage.
Reverse primer: 5′-GAT-GGT-GGA-ATT-CTA-CCT-CTA-GAC-TTG-TA-3′;
Cellekulturerne skal ved hjælp af et mikroskop undersøges for CPE to gange, nemlig 5-7 dage og 12-14 dage efter podningen.
Product size: 304 nt if HPR0.
Hvis der i en samleprøve konstateres CPE, skal der straks foretages virusidentifikation i overensstemmelse med punkt II.2.4.
RT-PCR assays with similar sensitivities and specificities to the assays described in this point may also be used.
Hvis der den 14. dag ikke er konstateret CPE, skal der foretages en IFAT, en hæmadsorptionstest eller en RT-PCR.
The purity of the amplified RT-PCR product shall be checked by gel electrophoresis before sequencing.
Subkultivering foretages fra dag 13-15.
If only one pure fragment appears, it shall be purified directly from the PCR reaction.
Cellekulturens supernatant tilsættes til brønde indeholdende friske aktivt voksende celler i passende opløsning (1/10) i multibrøndplader og inkuberes ved 14 ± 2 °C i op til 18 dage.
If multiple amplified fragments are present, the fragment of interest shall be purified by gel electrophoresis.
Cellekulturerne skal ved hjælp af et mikroskop undersøges for CPE to gange, nemlig 5-7 dage og 14-18 dage efter podningen.
The purification of PCR fragments from solutions or agarose gels shall be made using PCR fragment affinity spin columns, according to the manufacturer's instructions.