natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Hvis der i perioden fra dag 14 til dag 18 ikke konstateres CPE, skal der foretages en hæmadsorptionstest eller en RT-PCR.
Sequencing shall be performed using amplification primers at external specialised sequencing companies.
Hvis der inden for de første syv inkubationsdage optræder cytotoksicitet, skal der på dette tidspunkt foretages subkultivering, og cellerne inkuberes i 14-18 dage og subkultiveres igen med yderligere inkubation i 14-18 dage.
The results shall be analysed with the search tool BLAST and the sequences shall be compared with other known sequences in the US National Centre for Biotechnical Information (NCBI) nucleotide database.
Hvis der optræder cytotoksicitet efter den syvende dag, skal der foretages subkultivering én gang, og cellerne inkuberes, indtil den samlede inkubationsperiode fra primærpodningen er på 28-36 dage.
Sequencing must eliminate any doubt on the specificity of an amplified RT-PCR product.
Hvis der optræder bakteriekontamination i primærkulturen, skal testen foretages på ny under anvendelse af det ved – 80 °C opbevarede vævshomogenat.
ISAV isolation on cell cultures
Inden podningen centrifugeres vævshomogenatet ved 4000 × g i 15-30 minutter ved 0-6 °C, og supernatanten filtreres gennem et 0,22 μm filter.
Preparation of samples
Hvis bakteriekontaminationen optræder under subkultiveringen, filtreres supernatanten gennem et 0,22 μm filter, podes på friske celler og inkuberes i yderligere 14-18 dage.
The tissue may be kept at – 80 °C.
Virusidentifikationstest
The tissue shall only be frozen and thawed once before examination.
Hvis der på noget tidspunkt konstateres tegn på CPE, eller hvis en hæmadsorptionstest er positiv, skal der foretages virusidentifikation.
For surveillance and control purposes, the examination shall be undertaken as fast as possible.
De metoder, der vælges til identifikation af ISAV, skal være RT-PCR i overensstemmelse med punkt II.1 og immunfluorescens (IF) i overensstemmelse med punkt II.2.6.
Each sample (tissue pool in transport solution) shall be completely homogenised using a validated homogeniser, centrifuged at 2000 to 4000 × g for 15 minutes at 0 to 6 °C, and the supernatant shall be filtered (0,45 μm) and incubated with an equal volume of a suitably diluted pool of antisera to the indigenous serotypes of IPNV.
Hvis det formodes, at andre virus kan være til stede, skal der foretages supplerende virusidentifikationstest.
The titre of the antiserum must be at least 1:2000 in a 50 % plaque neutralisation test.
Hvis sådanne test ikke i løbet af en uge har ført til en definitiv identifikation af virusset, skal supernatanten sendes til et af følgende laboratorier med henblik på øjeblikkelig identifikation:
The mixture shall be incubated for one hour at 15 °C.
Hæmadsorption
To reduce the duration of the virological examinations as well as the number of cases in which occurrence of CPE would have to be considered potentially indicative of ISAV, such treatment may be carried out.
Da replikation af ISAV i cellekulturer ikke altid resulterer i CPE, skal hver brønd underkastes en RT-PCR-test eller en hæmadsorptionstest i overensstemmelse med nærværende punkt eller en IF-test i overensstemmelse med punkt II.2.6.
When samples come from production units which are considered free from IPN, the treatment of inocula with antiserum to IPN virus may be omitted.
Celledyrkningsmediet fjernes fra hver brønd, også fra dem til positiv og negativ kontrol, og anbringes i sterile mærkede rør.
Inoculation on cell cultures
500 μl af en 0,2 % (v/v) opløsning af vaskede røde blodlegemer fra kanin eller hest eller en 0,05 % (v/v) opløsning af vaskede røde blodlegemer fra regnbueørred eller atlantisk laks tilsættes i hver brønd og inkuberes ved rumtemperatur i 45 minutter.
Atlantic salmon kidney (ASK) cells shall be used for primary ISAV isolation.
Derefter fjernes de røde blodlegemer, og hver brønd vaskes to gange med L-15-medium.
Other cell lines of proven efficacy and sensitivity in isolating ISAV may be used, taking into consideration strain variability and the ability of different strains to replicate in different cell lines.
Hver brønd undersøges ved hjælp af et mikroskop.
The ASK cells seem to support isolation and growth of the hitherto known virus isolates, as long as a low passage level is used.
Forekomst af ansamlinger af røde blodlegemer på overfladen af ASK-celler tages som tegn på en formodet infektion med en orthomyxovirus.
A more distinct cytopathic effect (CPE) may appear in ASK cells than in other susceptible cell lines like SHK-1 (Salmon head kidney-1).
Hvis en hæmadsorptionstest er positiv, skal der straks foretages en virusidentifikationstest i overensstemmelse med punkt II.2.4.
ASK (pass 65 or lower) cells shall be grown in L-15 medium containing 10 % foetal bovine serum, 2 % (vol:vol) 200 mM L-glutamine, and 0,08 % (vol:vol) 50 mM 2-mercaptoethanol in multi-well plates.
Immunfluorescens (IF)
Antiserum-treated organ suspension shall be inoculated into young actively growing cell cultures to give a final dilution of tissue material to culture medium of 1:1000.
ASK-celler (passage 65 eller derunder) dyrkes i L-15-medium indeholdende 10 % føtalt kvægserum, 2 % (v/v) 200 mM L-glutamin og 0,08 % (v/v) 50 mM 2-mercaptoethanol i multibrøndplader med mere end 50 % sammenflydning.
For each organ, suspension 40 μl of inoculum shall be added to one well containing 2 ml of culture medium.
Andre cellelinjer eller vækstmedium af dokumenteret effektivitet kan også anvendes.
To minimise the risk of cross-contamination, separate 12- or 24-well plates shall be used for samples from different fish farm sites.
225 μl supernatant af den kultur, der formodes inficeret med virus, tilsættes til hver af to brønde og omrøres, hvorefter 225 μl overføres til to yderligere brønde (en fortynding på 1:5).
One plate shall be left uninoculated to serve as a negative control.
To yderligere brønde lades upodede, så de kan fungere som kontroller.
A separate plate shall be inoculated with a reference isolate of ISAV as a positive control, as follows.
Prøver fra de enkelte akvakulturbrug skal behandles på separate plader, og det samme gælder viruskontrollen.
One hundred μl of a stock preparation of ISAV (minimum titre 107 Tissue culture infective dose at the 50 % end point (TCID50 ml– 1)) shall be inoculated into the first well and mixed.
Der etableres en viruskontrol ved hjælp af et referenceisolat af ISAV.
A volume of this material shall be transferred from the first well to the second well to make a 1:10 dilution and mixed.
Pladerne inkuberes ved 14 ± 2 °C og undersøges mikroskopisk i op til syv dage.
This shall be repeated across the plate to make six 10-fold dilutions.
Hvis tidlig CPE konstateres, eller hvis der ikke i løbet af syv dage konstateres CPE, er næste skridt fiksering.
Stock ISAV may be stored at – 80 °C for at least 2 years but once thawed must be used within 3 days.
Brøndene vaskes med phosphat-bufferet saltopløsning (PBS) og fikseres ved inkubation med 80 % acetone i 20 minutter ved rumtemperatur.
Care shall be taken to prevent cross-contamination of test plates with positive control material.
Pladerne lufttørres og farves med det samme eller efter højst 24 timers opbevaring ved 0-6 °C.
To avoid that risk, positive controls shall be set up and handled separately from test plates.
Replikationsbrønde farves med en blanding af monoklonale antistoffer (MAb) 3H6F8 og 1OC9F5 mod ISAV eller et andet MAb af dokumenteret effektivitet og specificitet, opløst i PBS, og inkuberes ved 37 ± 4 °C i 30 minutter.
A sensitivity test every 6 months of ASK cells towards ISAV isolates may replace the use of including a positive control at each inoculation.
MAb fjernes, og pladerne vaskes tre gange med 0,05 % Tween 20 i PBS.
Samples shall be incubated at 15 ± 2 °C for up to 15 days.
Et anti-muse-IgG-FITC-konjugat opløst i PBS tilsættes til hver brønd og inkuberes ved 37 ± 4 °C i 30 minutter.
Using a microscope, cell cultures shall be examined for CPE twice, between 5 to 7 and 12 to 14 days following inoculation.
Opløsningerne af forskellige batcher af MAb og FITC-konjugat optimeres i hvert laboratorium.
If any pool shows CPE, virus identification procedures shall be initiated immediately in accordance with point II.2.4.
Antistoffet fjernes, og pladerne vaskes tre gange med 0,05 % Tween 20 i PBS.
If no CPE is observed by day 14, an Indirect fluorescent antibody test (IFAT), haemadsorption or RT-PCR shall be performed.
Brøndene undersøges straks ved hjælp af et inverteret mikroskop forberedt til fluorescensmikroskopi med et filter egnet til excitering af FITC.
Subcultivation shall be carried out between days 13 to 15.
En test betragtes som positiv, hvis der iagttages fluorescerende celler.
Culture supernatant shall be added to wells containing fresh actively growing cells in appropriate dilution (1/10) in multi-well plates and incubated at 14 ± 2 °C for up to 18 days.
For at en test er gyldig, skal de positive kontroller give positivt resultat og de negative kontroller give negativt resultat.
Using a microscope, cell cultures shall be examined for CPE twice, between days five to seven and days 14 to 18 following inoculation.
Undersøgelse af andet væv
If no CPE is observed by days 14 to 18, a haemadsorption or an RT-PCR test shall be performed.
Den i punkt II.2.6 omhandlede metode kan anvendes for andet fiskevæv såsom lever, milt og hjerte, forudsat at en rimelig mængde endoteliale celler, leukocytter eller lymfocytter kan anbringes på objektglasset.
If cytotoxicity occurs within the first 7 days of incubation, subcultivation shall be performed at that stage, and the cells shall be incubated for 14 to 18 days and sub cultivated again with a further period of 14 to 18 days incubation.
Farvningsmetoden er den samme for alt væv, idet det dog for nogle former for væv kan være at foretrække at undgå farvning med propidiumjodid og i stedet anvende fasebelysning ved identifikationen af de celletyper, der forekommer i aftrykket.
If cytotoxicity occurs after 7 days, subcultivation shall be performed once and the cells shall be incubated to achieve the total period of 28 to 36 days incubation from the primary inoculation.
Histologi
If bacterial contamination occurs in the primary culture, the test shall be set up again using the tissue homogenate stored at – 80 °C.
De i paraffin indstøbte snit skæres i 5 μm tynde skiver og farves med hæmatoxylin og eosin.
Prior to inoculation, the tissue homogenate shall be centrifuged at 4000 × g for 15 to 30 minutes at 0 to 6 °C and the supernatant shall be filtered at 0,22 μm.
De histologiske ændringer i klinisk syg atlantisk laks varierer, men de kan omfatte følgende:
If bacterial contamination occurs during the subcultivation step the supernatant shall be filtered at 0,22 μm, inoculated onto fresh cells and incubated for a further 14 to 18 days.
talrige erytrocytter i den centrale venøse sinus og gællernes lamellære kapillærer, hvor der også kan dannes tromber af erytrocytter
Virus identification tests
multifokale til sammenflydende petekkier eller nekrose af hepatocytter eller begge dele i nogen afstand fra de større blodkar i leveren; multifokal akkumulering af erytrocytter i dilaterede sinusoider i leveren
If evidence of CPE is observed at any stage, or if a haemadsorption test is positive, virus identification shall be carried out.
akkumulering af erytrocytter i blodkarrene i tarmens lamina propria, eventuelt resulterende i blødninger i lamina propria
The methods of choice for the identification of ISAV shall be RT-PCR in accordance with point II.1 and Immunofluorescence (IF) in accordance with point II.2.6.
miltens stroma udspilet på grund af akkumulering af erytrocytter
If it is considered that other viruses may be present, supplementary virus identification tests shall be carried out.
let multifokal til meget udbredt interstitiel blødning med tubulær nekrose i de blødende områder og akkumulering af erytrocytter i glomeruli i nyren
If those tests have not resulted in a definitive identification of the virus within 1 week, the supernatant shall be forwarded for immediate identification to:
erytrofagocytose i milten og sekundære blødninger i lever og nyre.
the World Organisation for Animal Health (OIE) reference laboratory for ISA, or;
Immunhistokemi (IHC)
a national reference laboratory or the EU reference laboratory for fish diseases as referred to in Annex VI to Directive 2006/88/EC.
Polyklonale antistoffer mod ISAV-nukleoprotein anvendes på paraffinsnit fra formalinfikseret væv.
Haemadsorption
De organer, som skal undersøges, er mellemnyre og hjerte (overgangsområde inklusive alle tre kamre og klapper).
As replication of ISAV in cell cultures does not always result in a CPE, every well shall be subject to an RT-PCR test or a haemadsorption test in accordance with this point, or an IF test in accordance with point II.2.6.
Mistanke som følge af patologiske tegn skal verificeres med en positiv IHC.
Cell culture medium shall be removed from each well, including those of positive and negative controls, and placed in labelled sterile tubes.
Histologiske snit skal præpareres i overensstemmelse med standardmetoder.
500 μl of a 0,2 % (vol:vol) suspension of washed rabbit or horse red blood cells, or a 0,05 % (vol:vol) suspension of washed rainbow trout or Atlantic salmon red blood cells, shall be added to each well and incubated at room temperature for 45 minutes.
Præparation af vævssnit
The red blood cells shall be removed and each well shall be washed twice with L-15 medium.
Væv fikseres i neutral phosphat-bufferet 10 % formalin i mindst 1 dag, dehydreres i ethanol i stigende koncentrationer, klares i xylen og indstøbes i paraffin i henhold til standardprotokollerne.
Each well shall be examined using a microscope.
Ca. 5 μm tykke snit (for IHC anbragt på poly-L-lysin-belagte objektglas) opvarmes ved 56-58 °C (højst 60 °C) i 20 minutter, voksen fjernes i xylen, snittene rehydreres i ethanol i faldende koncentrationer og farves med hæmatoxylin og eosin med henblik på patomorfologi og IHC i overensstemmelse med nr. 2).
The presence of clusters of red blood cells attaching to the surface of ASK cells shall be indicative of presumptive infection with an orthomyxovirus.
Farvningsmetode for IHC
If a haemadsorption test is positive, a virus identification test shall be performed immediately in accordance with point II.2.4.
Alle inkubationer foretages ved rumtemperatur på et vippebord, medmindre andet er fastsat i denne afgørelse:
Immunofluorescence (IF)
Udtræk af antigen foretages ved at koge snittene i 0,1 M citratbuffer (pH 6,0) i 2 × 6 minutter efterfulgt af blokering med 5 % fedtfri tørmælk og 2 % gedeserum i 50 mM TBS (TBS; Tris/HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,6) i 20 minutter.
ASK (pass 65 or lower) shall be grown in a L-15 medium containing 10 % foetal bovine serum, 2 % (vol:vol) 200 mM L-glutamine, and 0,08 % (vol:vol) 50 mM 2-mercaptoethanol in multi-well plates and used at greater than 50 % confluence.
Derefter inkuberes snittene natten over med primært antistof (monospecifikt kaninantistof mod ISAV-nukleoprotein) opløst i TBS med 1 % fedtfri tørmælk efterfulgt af tre skylninger med TBS med 0,1 % Tween 20.
Other cell lines or growth medium of proven efficacy may also be used.
Til påvisning af bundne antistoffer skal snittene inkuberes med antistoffer mod kanin-IgG, der er konjugeret med alkalisk phosphatase, i 60 minutter.
225 μl of putative virus-infected culture supernatant shall be added to each of two wells, mixed and 225 μl transferred to two further wells, namely a 1:5 dilution.
Efter en sidste vaskning tilsættes Fast Red (1 mg ml– 1) og naphthol-AS-MX-phosphat (0,2 mg ml– 1) med 1 mM levamisol i 0,1 M TBS (pH 8,2); lad det udvikle sig i 20 minutter.
Two additional wells shall be left uninoculated to act as controls.
Derefter vaskes snittene i ledningsvand inden kontrastfarvning med Harris-hæmatoxylin og monteres i vandigt monteringsmedium.
Samples from each fish farm site shall be handled on separate plates, as shall the virus control.
ISAV-positive og ISAV-negative vævssnit skal indgå som kontroller ved hver udførelse.
A virus control shall be established using a reference isolate of ISAV.
Fortolkning af resultaterne af IHC
Plates shall be incubated at 14 ± 2 °C and examined microscopically for up to 7 days.
Resultaterne af IHC-testen fortolkes som anført i litra a) og b):
When early CPE is observed, or if no CPE is observed within 7 days, the next step shall be fixation.
Kontrolsnittene anses for positive, når det konstateres, at kontrolsnittene har en klart synlig rød (rødlig) cytoplasmatisk og intranukleær farvning af endotelcellerne i endokardiets blodkar.
Wells shall be washed with Phosphate buffered saline (PBS) and fixed by incubation with 80 % acetone for 20 minutes at room temperature.
Et prøvesnit anses kun for positivt, hvis der forekommer en sådan klar intranukleær rødfarvning af endotelcellerne.
Plates shall be air-dried and stained immediately or stored at 0 to 6 °C for no more than 24 hours prior to staining.
Kontrolsnit anses for negative, hvis de ikke har nogen markante farvereaktioner.
Replicate wells shall be stained with a mix of monoclonal antibodies (MAb) 3H6F8 and 1OC9F5 against ISAV, or other MAb of proven efficacy and specificity, diluted in PBS and incubated at 37 ± 4 °C for 30 minutes.
Da den intranukleære placering er specifik for orthomyxovirussets nukleoprotein i en fase af virusreplikationen, mens samtidig cytoplasmisk farvning ofte er dominerende, skal cytoplasmiske og andre farvningsmønstre uden intranukleær placering anses for ikkespecifikke eller inkonklusive.
MAb shall be removed and plates washed three times with 0,05 % Tween 20 in PBS.
De stærkeste positive farvningsreaktioner opnås normalt i endotelceller fra hjerte og nyre.
Anti-mouse IgG Fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugate diluted in PBS shall be added to each well and incubated at 37 ± 4 °C for 30 minutes.
Ved meget omfattende hæmoragiske læsioner kan endotel-farvningsreaktionerne være svage eller fraværende, muligvis på grund af lysis af inficerede endotelceller.
The dilutions of different batches of MAb and FITC conjugate shall be optimised in each laboratory.
DETALJEREDE DIAGNOSEMETODER OG -PROCEDURER FOR OVERVÅGNING OG BEKRÆFTELSE AF INFEKTION MED MARTEILIA REFRINGENS
Antibody shall be removed and plates shall be washed three times with 0,05 % Tween 20 in PBS.
I. Detaljerede diagnosemetoder og -procedurer for diagnose af infektion med Marteilia refringens
Wells shall be examined immediately using an inverted microscope set up for fluorescence microscopy with a suitable filter for excitation of FITC.
Hvis der foretages prøveudtagning og laboratorieundersøgelse med henblik på at opnå eller opretholde en sundhedsstatus med hensyn til infektion med Marteilia refringens, jf. bilag I, del 4, afsnit I, eller for at bekræfte eller udelukke forekomst af denne listeopførte sygdom i overensstemmelse med artikel 57, litra b), i direktiv 2006/88/EF ved hjælp af diagnosemetoderne i bilag I, del 4, afsnit II, anvendes de detaljerede diagnosemetoder og -procedurer i punkt I.1, I.2 og I.3.
A test shall be considered positive if fluorescent cells are observed.
Prøveudtagningsprocedure
For a test to be valid, the positive controls shall score positive and the negative controls shall score negative.
Bløddyr med åbne skaller eller nyligt døde bløddyr skal prioriteres ved prøveudtagningen for at øge chancerne for at finde inficerede dyr.
Examination of other tissues
De indsamlede østers eller muslinger opbevares ved 4 °C eller på køleis i højst 24 timer, hvis der er bløddyr med åbne skaller, og højst 72 timer, hvis dette ikke er tilfældet; de skal opbevares i en plastpose med en etiket med oplysninger om østernes eller muslingernes art og oprindelse.
The technique referred to in point II.2.6 may be applied to other fish tissues such as liver, spleen and heart providing a reasonable quantity of endothelial cells, leucocytes or lymphocytes can be deposited on the slide.
Bløddyr med åbne skaller eller nyligt døde bløddyr skal opbevares adskilt fra andre bløddyr.
The staining procedure shall remain the same for each tissue, although for some tissues it may be preferable to omit the propidium iodide staining and rely on the phase illumination to identify the cell types present in the imprint.
Et 3-5 mm tykt vævssnit, der omfatter væv fra hjerte og gæller, skal anvendes til diagnosticering af Marteilia refringens ved hjælp af histologi.
Histology
Et stykke af fordøjelseskirtlen skal anvendes til visse test, bl.a. aftryk og polymerasekædereaktion (PCR).
Paraffin-embedded sections shall be cut at 5 μm and stained using haematoxylin and eosin.
Mikroskopiske teknikker
Histological changes in clinically diseased Atlantic salmon are variable, but may include the following:
Cytologi (aftrykscytologi)
numerous erythrocytes in the central venous sinus and lamellar capillaries of the gills, where erythrocyte thrombi also may be formed;
Efter tørring af væv fra fordøjelseskirtlen på absorberende papir skal der tages en række aftryk på et objektglas.
multifocal to confluent petechiae or hepatocyte necrosis or both at some distance from larger vessels in the liver; multifocal accumulation of erythrocytes in dilated hepatic sinusoids;
Objektglassene skal lufttørres, fikseres i methanol eller i absolut ethanol og farves med et kommercielt tilgængeligt kit til farvning af blod, f.eks. Diff-Quick®/Hemacolor®, i henhold til fabrikantens anvisninger.
accumulation of erythrocytes in blood vessels of the intestinal lamina propria and eventually haemorrhage into the lamina propria;
Efter skylning i ledningsvand og tørring skal objektglassene monteres med dækglas ved hjælp af en egnet syntetisk harpiks.
spleen stroma distended by erythrocyte accumulation;
Dækglassene observeres først ved 200 × forstørrelse og derefter i immersionsolie ved 1000 × forstørrelse.
slight multifocal to extensive diffuse interstitial haemorrhage with tubular necrosis in the haemorrhagic areas, erythrocyte accumulation in the glomeruli in the kidney;
Et positivt resultat er iagttagelse af celler i størrelser på op til 30-40 μm.
erythrophagocytosis in the spleen and secondary haemorrhages in liver and kidney.
Cytoplasmaet farves basofilt, mens cellekernen farves eosinofil.
Immunohistochemistry (IHC)
Der observeres lyse haloer rundt om store stærkt farvede (lysbrydende) granula og celler intracellulært i større celler.
Polyclonal antibody against ISAV nucleoprotein shall be used on paraffin sections from formalin-fixed tissue.
Teknikken er ikke artsspecifik for parasitter.
The organs to be examined shall be mid-kidney and heart (transitional area including all three chambers and valves).
Vævssnit, som omfatter gæller, fordøjelseskirtel, kappe og gonade, fikseres i mindst 24 timer i Davidsons fikseringsmiddel efterfulgt af normal behandling for histologi med paraffin og farvning, f.eks. med hæmatoxylin og eosin.
Suspected cases due to pathological signs shall be verified with a positive IHC.
Der foretages observationer ved stadig kraftigere forstørrelse op til 1000 ×.
Histological sections shall be prepared in accordance with standard methods.
Et positivt resultat er iagttagelse af celler i størrelser på 4-40 μm.
Preparation of tissue sections
De tidlige stadier består af multinukleære celler, som er sfæriske til aflange.
The tissues shall be fixed in neutral phosphate-buffered 10 % formalin for at least 1 day, dehydrated in a graded ethanol series, cleared in xylene and embedded in paraffin, according to standard protocols.
Disse findes først og fremmest i epitel fra spiserør og mave og undertiden fra læbeflige.
Approximately 5 μm thick sections (for IHC placed on poly-L-lysine-coated slides) shall be heated at 56 °C to 58 °C (maximum 60 °C) for 20 minutes, dewaxed in xylene, rehydrated through a graded ethanol series, and stained with haematoxylin and eosin for pathomorphology and IHC in accordance with point (2).
Sporedannelse omfatter celledelinger inden i celler og foregår i fordøjelseskirtlens tubuli og ducti.
Staining procedure for IHC
Lysbrydende granula forekommer i forbindelse med sporedannelsen, men observeres ikke i de tidlige stadier.
All incubations shall be carried out at room temperature on a rocking platform, unless otherwise provided for in this decision: