natgillin/translations-raw huggingface dataset:
FISH-testen er negativ, hvis der ikke ses stærkt rødt-fluorescerende celler med størrelse og morfologi, der er typisk for R. solanacearum, ved anvendelse af rhodaminfilteret, forudsat at der ses typiske stærkt rødt-fluorescerende celler i de positive kontrolpræparater ved anvendelse af rhodaminfilteret.
The FISH test is negative if bright red fluorescent cells with size and morphology typical of R. solanacearum are not observed using the rhodamine filter, provided that typical bright red fluorescent cells are observed in the positive control preparations when using the rhodamine filter.
ELISA-test
ELISA tests
På grund af sin relativt lave følsomhed er ELISA-testen udelukkende en valgfri test, der kan anvendes som supplement til IF, PCR eller FISH.
ELISA can only be used as an optional test in addition to IF, PCR or FISH due to a relatively low sensitivity of this test.
Når der anvendes DAS ELISA, er berigelse og brug af monoklonale antistoffer obligatorisk (jf. webstedet http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
When DAS ELISA is used enrichment and the use of monoclonal antibodies are compulsory (see web site http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
Berigelse af prøverne, inden ELISA-testen gennemføres, kan være et velegnet middel til at øge testens følsomhed, men der er en risiko for, at den mislykkes som følge af konkurrence fra andre organismer, der er til stede i prøven.
Enrichment of the samples before using ELISA may be useful in order to increase the sensitivity of the test, but it can fail due to competition by other organisms in the sample.
NB: Der skal anvendes en valideret kilde til antistoffer mod R. solanacearum (jf. webstedet http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Det anbefales, at titeren bestemmes for enhver ny antistofbatch.
Note: Use an validated source of antibodies to R. solanacearum (see web site http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main) It is recommended that the titre is determined for each new batch of antibodies.
Titeren defineres som den største fortynding, ved hvilken der opstår optimal reaktion ved test af en suspension af 105-106 celler/ml fra den homologe stamme af R. solanacearum, idet der benyttes passende sekundære antistofkonjugater i overensstemmelse med producentens anbefalinger.
The titre is defined as the highest dilution at which optimum reaction occurs when testing a suspension containing 105 to 106 cells per ml of the homologous strain of R. solanacearum and using appropriate secondary antibody conjugates according to the manufacturer’s recommendations.
Under testen bør antistofferne anvendes som en arbejdsfortynding, der er den samme som eller tæt på titeren for den markedsførte formulering.
During testing, the antibodies should be used at a working dilution close to or at the titre of the commercial formulation.
Antistoffernes titer bestemmes på en suspension af 105-106 celler/ml fra den homologe stamme af R. solanacearum.
Determine the titre of the antibodies on a suspension of 105 to 106 cells per ml of the homologous strain of R. solanacearum.
Medtag et prøveekstrakt, som tidligere er testet negativt for R. solanacearum, og en suspension af en ikke-krydsreagerende bakterie i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) som negative kontroller.
Include a sample extract that previously tested negative for R. solanacearum and a suspension of a non-cross reacting bacterium in phosphate buffered saline (PBS) as negative controls.
Som positiv kontrol anvendes delprøver af prøveekstrakt, som tidligere er testet negativt, blandet med 103-104 celler pr. ml af R. solanacearum, biovar 2 (f.eks. stamme NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; jf. tillæg 2, del A og B).
As positive control use aliquots of sample extract, that previously tested negative, mixed with 103 to 104 cells per ml of R. solanacearum biovar 2 (e.g. strain NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, see Appendix 2 A and B).
Til sammenligning af resultaterne på de enkelte plader anvendes en standardsuspension af 105-106 celler pr. ml. i PBS fra R. solanacearum.
For comparison of results on each plate use a standard suspension of 105 to 106 cells per ml in PBS of R. solanacearum.
Det skal sikres, at positive kontroller på mikrotiterpladen holdes fuldstændig adskilt fra prøver, der er ved at blive analyseret.
Ensure positive controls are well separated on the microtitre plate from the sample(s) under test.
Standardiseret positivt og negativt kontrolmateriale, som kan anvendes til denne test, er angivet i tillæg 3, punkt A.
Standardised positive and negative control materials available for use with this test are listed in Appendix 3 A.
Der er valideret to ELISA-protokoller.
Two ELISA protocols have been validated.
Indirekte ELISA (Robinson-Smith et al., 1995)
Indirect ELISA (Robinson Smith et al., 1995)
Prøveekstraktet anvendes i portioner à 100-200 µl.
Use 100 to 200 µl aliquots of sample extract.
(Opvarmning ved 100 °C i 4 minutter i vandbad eller varmeblok kan i visse tilfælde begrænse de ikke-specifikke resultater.)
(Heating at 100 °C for four minutes in a waterbath or heating block may reduce non-specific results in some cases).
Der tilsættes en lige så stor mængde coatingbuffer af dobbelt styrke (tillæg 4) og vortexes.
Add an equal volume of double strength coating buffer (Appendix 4) and vortex.
100 µl portioner af prøven anbringes på hver af mindst to brønde i mikrotiterpladen (f.eks. Nunc-Polysorp eller lignende), og der inkuberes i 1 time ved 37 °C eller natten over ved 4 °C.
Apply 100 µl aliquots to each of at least two wells of a microtitre plate (e.g. Nunc-Polysorp or equivalent) and incubate for one hour at 37 °C or overnight at 4 °C.
Ekstrakterne hældes ud af brøndene.
Flick out the extracts from the wells.
Brøndene vaskes tre gange med PBS-Tween (tillæg 4). Det sidste hold vaskeopløsning skal henstå i brøndene mindst 5 min.
Wash the wells three times with PBS-Tween (Appendix 4), leaving the last washing solution in the wells for at least five minutes.
Der laves en passende fortynding af antistoffer mod R. solanacearum i blokeringsbuffer (tillæg 4).
Prepare the appropriate dilution of antibodies against-R. solanacearum in blocking buffer (Appendix 4).
Til validerede antistoffer, som fås i handelen, anvendes de anbefalede fortyndinger (normalt dobbelt så koncentreret som titeren).
For validated commercial antibodies, use the recommended dilutions (usually twice as concentrated as the titre).
Der overføres 100 µl til hver brønd og inkuberes i 1 time ved 37 °C.
Add 100 µl to each well and incubate for one hour at 37 °C.
Opløsningen af antistoffer hældes ud af brøndene, og der vaskes som beskrevet i punkt 4.
Flick out the antibody solution from the wells and wash as before (4).
Der laves en passende fortynding af sekundært alkalisk antistof-fosfatasekonjugat i blokeringsbuffer.
Prepare the appropriate dilution of secondary antibody-alkaline phosphatase conjugate in blocking buffer.
Opløsningen af konjugerede antistoffer hældes ud af brøndene, og der vaskes som beskrevet i punkt 4.
Flick out conjugated antibody from wells and wash as before (4).
Der overføres 100 µl alkalisk fosfatasesubstratopløsning (tillæg 4) til hver brønd.
Add 100 µl alkaline phosphatase substrate solution (Appendix 4) to each well.
Der inkuberes i mørke ved stuetemperatur, og absorbansen aflæses ved 405 nm med regelmæssige mellemrum over 90 min.
Incubate in the dark at ambient temperature and read absorbance at 405 nm at regular intervals within 90 minutes.
DASI ELISA
DASI ELISA
Der laves en passende fortynding af polyklonale anti-R. solanacearum-immunglobuliner i coatingbuffer, pH 9,6 (tillæg 4).
Prepare the appropriate dilution of anti-R. solanacearum polyclonal immunoglobulins in coating buffer pH 9.6 (Appendix 4).
Der overføres 200 µl til hver brønd.
Add 200 µl to each well.
Der inkuberes ved 37 °C i 4-5 timer eller ved 4 °C i 16 timer.
Incubate at 37 °C for four to five hours or at 4 °C for 16 hours.
Brøndene vaskes tre gange med PBS-Tween (tillæg 4).
Wash the wells three times with PBS-Tween (Appendix 4).
Der overføres 190 µl prøveekstrakt til mindst 2 brønde.
Add 190 µl of sample extract to at least two wells.
Desuden anbringes positive og negative kontroller i to brønde på hver plade.
Also add positive and negative controls in two wells each per plate.
Der inkuberes i 16 timer ved 4 °C.
Incubate for 16 hr at 4 °C.
Der laves en passende fortynding af specifikke monoklonale antistoffer mod R. solanacearum i PBS (tillæg 4) indeholdende 0,5 % bovint serumalbumin (BSA), og 190 µl overføres til hver brønd.
Prepare an appropriate dilution of R. solanacearum-specific monoclonal antibodies in PBS (Appendix 4) also containing 0,5 % bovine serum albumin (BSA) and add 190 µl to each well.
Der inkuberes ved 37 °C i 2 timer.
Incubate at 37 °C for two hours.
Der laves en passende fortynding af antimuse-immunglobuliner konjugeret med alkalisk fosfatase i PBS.
Prepare an appropriate dilution of anti-mouse immunoglobulins conjugated with alkaline phosphatase in PBS.
Der laves en alkalisk fosfatasesubstratopløsning indeholdende 1 mg p-nitrophenylfosfat pr. ml. substratbuffer (tillæg 4).
Prepare an alkaline phosphatase substrate solution containing 1 mg p-nitrophenyl phosphate per ml of substrate buffer (Appendix 4).
Der inkuberes i mørke ved stuetemperatur, og absorbansen aflæses ved 405 nm med regelmæssige mellemrum over 90 min.
Incubate in the dark at ambient temperature and read absorbance at 40 nm at regular intervals within 90 minutes.
Fortolkning af ELISA-testresultaterne
Interpretation of ELISA test results:
ELISA-testen er negativ, hvis den gennemsnitlige OD-værdi af aflæsningerne af duplikatprøvebrøndene er < 2 x OD af værdien af kontrolbrønden med negativt prøveekstrakt, forudsat at OD for alle de positive kontroller er på over 1,0 (efter 90 minutters inkubation med substratet) og er større end to gange den for de negative prøveekstrakter opnåede OD.
The ELISA test is negative if the average optical density (OD) reading from duplicate sample wells is < 2x OD of that in the negative sample extract control well, providing the OD for the positive controls are all above 1,0 (after 90 minutes incubation with the substrate) and are greater than twice the OD obtained for negative sample extracts.
ELISA-testen er positiv, hvis den gennemsnitlige OD-værdi af aflæsningerne af duplikatprøvebrøndene er > 2 x OD af værdien af kontrolbrønde med negativt prøveekstrakt, forudsat at OD-aflæsningerne for alle de negative kontrolbrønde er mindre end to gange aflæsningerne af de positive kontrolbrønde.
The ELISA test is positive if the average OD readings from duplicate sample wells is > 2x OD in the negative sample extract well provided that OD readings in all negative control wells are < 2x those in the positive control wells.
Negative ELISA-aflæsninger af positive kontrolbrønde er tegn på, at testen ikke er blevet gennemført korrekt, eller at den er blevet hæmmet.
Negative ELISA readings in positive control wells indicate that the test has not been performed correctly or that it has been inhibited.
Positive ELISA-aflæsninger af negative kontrolbrønde er tegn på, at krydskontaminering eller binding af ikke-specifikke antistoffer har fundet sted.
Positive ELISA readings in negative control wells indicate that cross-contamination or non-specific antibody binding has occurred.
NB: Indledende test med denne metode skal muliggøre reproducerbar påvisning af 103-104 kolonidannende celler af R. solanacearum pr. ml tilsat til prøveekstrakter, som tidligere er testet negative (forberedelse: se tillæg 3).
Note: Preliminary testing with this method should permit reproducible detection of 103 to 104 colony-forming units of R. solanacearum per ml added to sample extracts that previously tested negative (preparation see Appendix 3).
Testen er mest følsom, når der anvendes frisklavet prøveekstrakt, og der er optimale vækstbetingelser.
Highest sensitivity of detection can be expected when using freshly prepared sample extract and optimal growth conditions.
Følgende protokol er baseret på Janse (1988):
The following protocol is based upon Janse (1988):
Der benyttes ti testplanter af en modtagelig tomatkultivar (f.eks. Moneymaker eller en anden kultivar med tilsvarende modtagelighed, som prøvningslaboratoriet måtte vælge) i bladstadium 3 til hver prøve.
Use 10 test plants of a susceptible tomato cultivar (e.g. Moneymaker or cultivar with equivalent susceptibility as determined by the testing laboratory) at the third true leaf stage for each sample.
Det har vist sig, at symptomer er mindre udtalte og udvikler sig langsommere i ægplanter.
Symptoms have been show to be less severe and to develop more slowly in eggplant.
Det anbefales derfor at anvende tomatstiklinger.
Where possible, it is therefore recommended to use tomato seedlings.
100 µl prøveekstrakt fordeles mellem testplanterne.
Distribute 100 µl of sample extract between the test plants.
På plantestænglerne podes lige over kimbladene med en sprøjte, der er forsynet med en subkutan nål (ikke mindre end 23 G).
Inoculate the plant stems just above the cotyledons using a syringe fitted with a hypodermic needle (not less than 23G).
Prøven fordeles mellem testplanterne.
Distribute the sample between the test plants.
Idet planten holdes mellem to fingre, anbringes med pipette en dråbe (ca. 5-10 µl) af den suspenderede pellet på stænglen mellem kimbladene og det første blad.
Holding the plant between two fingers, pipette a drop (approximately 5 - 10 µl) of the suspended pellet on the stem between the cotyledons and the first leaf.
Med en steril skalpel skæres et diagonalt snit, der er 1,0 cm langt og så dybt som ca. 2/3 af stænglens tykkelse, idet snittet begyndes fra pelletdråben.
Using a sterile scalpel, make a diagonal slit, about 1.0 cm long and approximately 2/3 of the stem thickness deep, starting the cut from the pellet drop.
Efter samme metode indpodes 5 stiklinger med en vandig suspension af 105-106 celler/ml af en 48-timers kultur af en virulent biovar 2-stamme af R. solanacearum som positiv kontrol og med pelletbuffer (tillæg 4) som negativ kontrol.
Inoculate by the same technique, five seedlings with an aqueous suspension of 105 to 106 cells per ml prepared from a 48 hr culture of a virulent biovar 2 strain of R. solanacearum as a positive control and with pellet buffer (Appendix 4) as negative control.
Positive og negative kontrolplanter holdes adskilt fra de øvrige planter for at undgå krydskontaminering.
Separate positive and negative control plants from the other plants to avoid cross-contamination.
Testplanterne dyrkes under karantæneforhold i op til 4 uger ved 25-30 °C og høj relativ fugtighed, og de vandes i passende omfang, således at såvel overvanding som vandmangel med deraf følgende visnen undgås.
Grow the test plants in quarantine facilities for up to four weeks at 25 to 30 °C and high relative humidity with appropriate watering to prevent waterlogging or wilting through water deficiency.
For at undgå kontaminering inkuberes planter til positiv kontrol og negativ kontrol på tydeligt adskilte bænke i et drivhus eller vækstkammer, eller, hvis pladsen er begrænset, der sikres absolut adskillelse mellem behandlingerne.
To avoid contamination incubate positive control and negative control plants on clearly separated benches in a glasshouse or growth chamber or, in case space is limited, ensure strict separation between treatments.
Det er af afgørende betydning, at drivhuse og vækstkamre holdes fri for alle skadegørende insekter, idet sådanne kan overføre bakterien fra den ene prøve til den anden.
It is essential to keep glasshouses and growth chambers free of all insect pests since they may transmit the bacterium from sample to sample.
Der observeres for symptomer på visnen, epinasti, klorose og/eller nedsat vækst.
Observe for symptoms of wilting, epinasty, chlorosis and/or stunting.
Der isoleres fra inficerede planter (afsnit II, punkt 3) og foretages identifikation af formodede renkulturer af R. solanacearum (afsnit VI, del B).
Isolate from infected plants (Section II.3.) and identify purified cultures of presumptive R. solanacearum (Section VI.B.).
Hvis der ikke er observeret symptomer efter 3 uger, gennemføres en IF-/PCR-test/isolering af en sammensat prøve af stængelstykker på 1 cm fra hver testplante, idet stykkerne skal være taget over podningsstedet.
If no symptoms are observed after three weeks perform IF/PCR/Isolation on a composite sample of 1 cm stem sections of each test plant taken above the inoculation site.
Hvis testen er positiv, foretages fortyndingsudstrygning (afsnit IV, punkt 1).
If the test is positive perform dilution plating (section 4.1).
Der foretages identifikation af eventuelle formodede renkulturer af R. solanacearum (afsnit VI, del B).
Identify any purified cultures of presumptive R. solanacearum (Section VI.B.).
Fortolkning af resultaterne af biotesten
Interpretation of the bioassay test results
Biotesten er negativ, hvis testplanterne ikke er inficeret med R. solanacearum, og forudsat at R. solanacearum er påvist i de positive kontrolplanter.
The bioassay test is negative if test plants are not infected by R. solanacearum, and provided that R. solanacearum is detected in positive controls.
Biotesten er positiv, hvis testplanterne er inficeret med R. solanacearum.
The bioassay test is positive if the test plants are infected by R. solanacearum.
IDENTIFIKATIONSTEST
IDENTIFICATION TESTS
Formodede renkulturer af R. solanacearum-isolater identificeres ved at anvende mindst to af følgende test, der bygger på forskellige biologiske principper.
Identify pure cultures of presumptive R. solanacearum isolates using at least two of the following tests based on different biological principles.
Hvor det er relevant, inddrages kendte referencestammer i hver af de test, der gennemføres (jf. tillæg 3).
Include known reference strains where appropriate for each test performed (see Appendix 3).
Følgende fænotypiske egenskaber, som R. solanacearum enten har eller slet ikke har, bestemmes efter metoderne Lelliott and Stead (1987), Klement et al.
Determine the following phenotypic properties, which are universally present or absent in R. solanacearum, according to the methods of Lelliott and Stead (1987), Klement et al.
Fluorescerende pigmentproduktion
Fluorescent pigment production
Poly-β-hydroxybutyrat-inklusioner
Poly-ß-hydroxybutyrate inclusions
Oxidations/fermenteringstest (O/F)
Oxidation/fermentation (O/F) test
Kovacs oxidasetest
Kovac’s oxidase test
Nitratreduktion
Reduction of nitrate
Udnyttelse af citrat
Utilisation of citrate
Vækst ved 40 °C
Growth at 40 °C
Vækst i 1 % NaCl
Growth in 1 % NaCl
Vækst i 2 % NaCl
Growth in 2 % NaCl
Arginindihydrolase-aktivitet
Arginine dihydrolase activity
Smeltning af gelatine
Gelatine liquefaction
Levanproduktion
Levan production
Der forberedes en suspension af ca. 106 celler pr. ml i IF-buffer (tillæg 4).
Prepare a suspension of approximately 106 cells per ml in IF buffer (Appendix 4).
Der forberedes en tofoldsfortyndingsrække af et passende antiserum (jf. webstedet http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
Prepare a twofold dilution series of an appropriate antiserum (see website http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
IF-metoden benyttes (afsnit VI, del A, punkt 5).
Apply the IF procedure (Section VI.A.5.).
NB: Hvis der kun gennemføres to identifikationstest, skal der ikke anvendes andre serologiske test ud over denne metode.
Note: If performing only 2 identification tests, do not use another serological test in addition to this method.
Der forberedes en suspension af ca. 108 celler pr. ml i 1 x PBS (tillæg 4).
Prepare a suspension of approximately 108 cells per ml in 1X PBS (Appendix 4).
Der gennemføres en passende ELISA-procedure med et specifikt monoklonalt antistof mod R. solanacearum.
Perform an appropriate ELISA procedure with a specific monoclonal antibody to R. solanacearum.
ELISA-testen er positiv, hvis ELISA-aflæsningen af isolatet svarer til mindst halvdelen af aflæsningsværdien for den positive kontrol.
A positive ELISA test is achieved if the ELISA reading obtained from the culture is at least half that obtained for the positive control.
Der forberedes en suspension af ca. 106 celler pr. ml i steriliseret vand af molekylærbiologisk kvalitet.
Prepare a suspension of approximately 106 cells per ml in molecular grade sterile water.
Der anvendes relevante PCR-procedurer for at amplificere R. solanacearum-specifikke amplikoner (f.eks. Seal et al.
Apply appropriate PCR procedures to amplify R. solanacearum-specific amplicons (e.g. Seal et al.
(1993); Pastrik og Maiss (2000); Pastrik et al.
(1993); Pastrik and Maiss (2000); Pastrik et al.
Der opnås en positiv identifikation af R. solanacearum, hvis PCR-amplikonerne har samme størrelse og samme restriktionsfragmentlængde-polymorfisme (RFLP) som den positive kontrolstamme.
A positive identification of R. solanacearum is achieved if the PCR amplicons are the same size and have the same restriction fragment length polymorphisms as for the positive control strain.
FISH-metoden benyttes (afsnit VI, del A, punkt 7), idet der anvendes mindst to R. solanacearum-specifikke oligo-prober (tillæg 7).
Apply the FISH procedure (Section VI.A.7.) with at least 2 R. solanacearum-specific oligo-probes (Appendix 7).
Kulturen dyrkes i 48 timer ved 28 °C på trypticasesojaagar (Oxoid).
Grow the culture on trypticase soy agar (Oxoid) for 48 hours at 28 °C.
Forekomst af karakteristiske fedtsyrer som 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH og 18:1 2OH og ingen forekomst af 16:0 3OH tyder med stor sandsynlighed på forekomst af en Ralstonia-stamme.
The presence of characteristic fatty acids are 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH and 18:1 2OH and absence of 16:0 3OH is highly indicative of a Ralstonia sp.
Det anbefales at anvende en af følgende metoder til bestemmelse af stammer ved hver ny isolering af R. solanacearum.
Strain characterisation using one of the following methods is recommended for each new case of isolation of R. solanacearum.
solanacearum opdeles i biovarer ud fra deres evne til at udnytte og/eller oxidere tre disaccharider og tre hexosealkoholer (Hayward, 1964, og Hayward et al., 1990).
solanacearum is separated into biovars on the basis of the ability to utilise and/or oxidise three disaccharides and three hexose alcohols (Hayward, 1964 and Hayward et al., 1990).
Vækstmedier til biovartesten er beskrevet i tillæg 2.
Growth media for the biovar test is described in Appendix 2.
Testen kan gennemføres på vellykket vis ved at sprøjteinokulere renkulturer af R. solanacearum-isolater i medierne og inkubere ved 28 °C.
The test can be successfully performed by stab inoculating the media with pure cultures of R. solanacearum isolates and incubating at 28 °C.
Hvis medierne fordeles på sterile celledyrkningsplader med 96 brønde (200 µl pr. brønd), kan der observeres et farveskift fra olivengrøn til gul inden for 72 timer, hvilket viser et positivt testresultat.
If the media are dispensed into sterile 96 well cell culture plates (200 µl per well) colour change from olive green to yellow can be observed within 72 hours, indicating a positive test result.
Udnyttelse af:
Utilisation of:
D(+)-cellobiose
D (+) Cellobiose
Supplerende test differentierer biovar 2-underfænotyper
Additional tests differentiate biovar 2 sub-phenotypes
(Findes i hele verden)
(Worldwide distribution)
(Fundet i Chile og Colombia)
(Found in Chile and Colombia)
(Fundet i tropiske egne)
(Found in tropical areas)
Udnyttelse af trehalose
Utilisation of trehalose
Udnyttelse af meso-inositol
Utilisation of meso-inositol
Udnyttelse af D-ribose
Utilisation of D ribose
Pektolytisk aktivitet [101]
Pectolytic activity [101]
Lav
low
Høj
high
Molekylær differentiering af stammer i R. solanacearum-komplekset kan foretages med forskellige teknikker, herunder:
Molecular differentiation of strains in the R. solanacearum complex can be achieved using several techniques, including:
Restriktions-fragment-længde-polymorfisme-analyse (RFLP-analyse) (Cook et al., 1989)
Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis (Cook et al., 1989).
Gentagen sekvens-PCR med REP-, BOX- og ERIC-primere (Louws et al., 1995; Smith et al., 1995).
Repetitive sequence PCR using REP, BOX and ERIC primers (Louws et al., 1995; Smith et al., 1995).