natgillin/translations-raw huggingface dataset:
5-10 µl af 0,1 M fosfatbufferet glycerol (tillæg 4) eller et tilsvarende indlejringsmiddel, der modvirker falmning, og som kan fås i handelen, afpipetteres på hvert vindue, og der sættes dækglas på.
Pipette 5 - 10 µl of 0,1M phosphate-buffered glycerol (Appendix 4) or a commercially antifading mountant on each window and apply a coverslip.
Aflæsning af IF-testen
Reading the IF test:
Testglassene undersøges i et epifluorescensmikroskop og et filter, som er egnet til arbejdet med FITC, i immersionsolie eller -vand ved 500-1000 ganges forstørrelse.
Examine test slides on an epifluorescence microscope with filters suitable for excitation of FITC, under oil or water immersion at a magnification of 500-1000.
IF-testen (afsnit VI, del A, punkt 5) gentages, hvis farvningen er unormal.
The IF test (Section VI.A.5.) must be repeated if the staining is aberrant.
Dernæst observeres, om der er stærkt fluorescerende celler med den for R. solanacearum karakteristiske morfologi i testvinduerne på glassene (jf. webstedet http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
Observe for bright fluorescing cells with characteristic morphology of R. solanacearum in the test windows of the test slides (see website http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
Fluorescensens intensitet skal svare til den positive kontrolstammes ved samme antistoffortynding.
The fluorescence intensity must be equivalent to the positive control strain at the same antibody dilution.
Dette kan være tilfældet, hvis alle objektglas i en batch har positive celler som følge af kontaminering af buffer, eller hvis der konstateres positive celler (uden for vinduerne på objektglasset) på glassets belægning.
This may be the case when all slides in a batch show positive cells due to the contamination of buffer or if positive cells are found (outside of the slide windows) on the slide coating.
Baggrundsflora af fluorescerende celler med atypisk morfologi og krydsreagerende blødrådsbakterier, som i størrelse og morfologi ligner R. solanacearum, vil sandsynligvis forekomme i pellets af navleende og stængelstykker fra kartofler.
Background populations of fluorescing cells with atypical morphology and cross reacting saprophytic bacteria with size and morphology similar to R. solanacearum are likely to occur in potato heel end core and stem segment pellets.
Kun fluorescerende celler med typisk størrelse og morfologi ved den antistoftiter eller arbejdsfortynding, der er beskrevet i punkt 5.3, tages i betragtning.
Consider only fluorescing cells with typical size and morphology at the titre or working dilution of the antibodies as in 5.3.
Fortolkning af IF-resultatet
Interpretation of the IF reading:
Hvis der findes stærkt fluorescerende celler med karakteristisk morfologi, anslås det gennemsnitlige antal typiske celler pr. mikroskopfelt, og antal typiske celler pr. ml resuspenderet pellet beregnes (tillæg 5).
If bright fluorescing cells with characteristic morphology are found, estimate the average number of typical cells per microscope field and calculate the number of typical cells per ml of resuspended pellet (Appendix 5).
Prøven betragtes som potentielt kontamineret, og der skal gennemføres supplerende test.
The sample is considered potentially contaminated and further testing is required.
IF-resultatet er negativt for prøver med under 5 × 103 celler pr. ml resuspenderet pellet, og prøven anses for negativ.
The IF reading is negative for samples with less than 5 × 103 cells per ml of resuspended pellet and the sample is considered negative.
PCR-test
PCR tests
Når PCR-testen anvendes som den primære screeningtest, og resultatet er positivt, skal isolering eller IF-testen gennemføres som anden obligatoriske screeningtest.
When the PCR test is used as the principal screening test and found to be positive, isolation or IF must be performed as a second compulsory screening test.
Når PCR anvendes som anden screeningtest, og resultatet er positivt, skal der gennemføres yderligere test i henhold til flowdiagrammet for at fuldende diagnosen.
When PCR is used as the second screening test and found to be positive, further testing according to the flow scheme is required to complete the diagnosis.
NB: Indledende test med denne metode skulle muliggøre reproducerbar påvisning af 103-104 celler af R. solanacearum pr. ml tilsat til prøveekstrakter, som tidligere er testet negative.
Note: Preliminary testing with this method should permit reproducible detection of 103 to 104 cells of R. solanacearum per ml added to sample extracts which previously tested negative.
Der skal anvendes validerede PCR-reagenser og protokoller (jf. tillæg 6).
Use validated PCR reagents and protocols (see Appendix 6).
Negative kontroller (ved dna-ekstraktion og i PCR-testprocedurer) bør altid håndteres som den sidste prøve i proceduren, så det tydeligt ses, hvis der er sket overførsel af dna fra andre prøver.
Negative controls (for DNA extraction and PCR procedures) should always be handled as final samples in the procedure, to make evident whether any carry over of DNA has occurred.
prøveekstrakt, som tidligere er testet negativt for R. solanacearum
Sample extract that previously tested negative for R. solanacearum,
bufferkontroller, der anvendes til ekstrahering af bakterien og dna'et fra prøven
Buffer controls used for extracting the bacterium and the DNA from the sample,
Delprøver af resuspenderede pellets, til hvilke der er tilsat R. solanacearum (forberedelse: se tillæg 3, del B).
Aliquots of resuspended pellets to which R. solanacearum has been added (preparation see Appendix 3 B).
En suspension i vand af 106 celler pr. ml af R. solanacearum fra et virulent isolat (f.eks. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; jf. tillæg 3, del B).
A suspension of 106 cells per ml of R. solanacearum in water from a virulent isolate (e.g. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; see Appendix 3 B).
Om muligt anvendes desuden dna ekstraheret fra positive kontrolprøver ved PCR-testen.
If possible use also DNA extracted from positive control samples in the PCR test.
Det kan derfor i visse tilfælde anbefales at forberede ekstrakter fra vaskede kartofler, hvis der skal anvendes PCR-protokoller.
It could therefore, in certain cases, be advisible to prepare extracts from washed potatoes if PCR protocols are to be used.
Standardiseret positivt og negativt kontrolmateriale, som kan anvendes til denne test, er angivet i tillæg 3.
Standardized positive and negative control material available for use with this test are listed in Appendix 3).
Der anvendes positive og negative kontrolprøver som beskrevet ovenfor (jf. tillæg 3).
Use positive and negative control samples as described above (see Appendix 3).
Følgende metode er blevet optimeret med henblik på anvendelse med de validerede PCR-metoder, der er beskrevet i tillæg 6.
The following method has been optimised for use with the validated PCR methods shown in Appendix 6.
Der tilsættes 100 µl prøveekstrakt, og det placeres i en varmeblok eller et vandbad ved 95 °C i 10 min.
Add 100 µl sample extract and place in a heating block or water bath at 95 °C for 10 min.
Røret anbringes i isbad i 5 min.
Put tube on ice for 5 min.
Der tilsættes 80 µl lysozymstamopløsning (50 mg lysozym pr. ml i 10 mM Tris HCl, pH 8,0), og der inkuberes ved 37 °C i 30 min.
Add 80 µl Lysozyme stock solution (50 mg Lysozyme per ml in 10 mM Tris HCl, pH 8,0) and incubate at 37 °C for 30 min.
Der tilsættes 220 µl Easy DNA®-opløsning A (Invitrogen), der vortexes grundigt, og der inkuberes ved 65 °C i 30 min.
Add 220 µl of Easy DNA® solution A (Invitrogen), mix well by vortexing and incubate at 65 °C for 30 min.
Der centrifugeres ved 15000 g i 20 min. ved 4 °C for at adskille faser og danne interfasen.
Centrifuge at 15000 g for 20 min at 4 °C to separate phases and form the interphase.
Der tilsættes 1 ml 100 % ethanol (–20 °C), der vortexes kort, og der inkuberes i isbad i 10 min.
Add 1 ml of 100 % ethanol (–20 °C) vortex briefly and incubate on ice for 10 min.
Der centrifugeres ved 15000 g i 20 min. ved 4 °C, og ethanolen fjernes fra pellet.
Centrifuge at 15000 g for 20 min at 4 °C and remove ethanol from pellet.
Der centrifugeres ved 15000 g i 10 min. ved 4 °C, pellet beholdes, og ethanolen fjernes.
Centrifuge at 15000 g for 10 min at 4 °C, save the pellet and remove ethanol.
Pellet lufttørres eller tørres i en DNA Speed Vac.
Allow the pellet to dry in air or in a DNA speed vac.
Der kan anvendes andre dna-ekstraktionsmetoder, f.eks. Qiagen DNeasy Plant Kit, forudsat at det er dokumenteret, at de er lige så effektive til at oprense dna fra kontrolprøver med 103-104 patogene celler pr. ml.
Other DNA extraction methods, e.g. Qiagen DNeasy Plant Kit, could be applied providing that they are proven to be equally as effective in purifying DNA from control samples containing 103 to 104 pathogen cells per ml.
Test- og kontrolskabeloner til PCR forberedes i overensstemmelse med de validerede protokoller (afsnit VI, del A, punkt 6).
Prepare test and control templates for PCR according to the validated protocols (Section VI.A.6.).
Det relevante PCR-mastermix forberedes i et kontamineringsfrit miljø i overensstemmelse med de publicerede protokoller (tillæg 6).
Prepare the appropriate PCR reaction mix in a contamination-free environment according to the published protocols (Appendix 6).
Hvor det er muligt, anbefales det at anvende en multiplex-PCR-protokol, som også omfatter en intern PCR-kontrol.
Where possible, it is recommended to use a multiplex PCR protocol that also incorporates an internal PCR control.
Der tilsættes 2-5 µl dna-ekstrakt pr. 25 µl PCR-reaktion i sterile PCR-rør i overensstemmelse med PCR-protokollerne (jf. tillæg 6).
Add 2-5 µl of DNA extract per 25 µl PCR reaction in sterile PCR tubes according to the PCR protocols, (see Appendix 6).
Rørene anbringes i det samme PCR-apparat som det, der blev anvendt til den indledende test, og det korrekt optimerede PCR-protokol gennemføres (tillæg 6).
Place tubes in the same thermal cycler which was used in preliminary testing and run the appropriately optimised PCR programme (Appendix 6).
PCR-amplikoner kan adskilles ved agarosegelelektroforese.
Resolve PCR amplicons by agarose gel electrophoresis.
Ved testen anvendes mindst 12 µl amplificeret dna-mastermix fra hver prøve blandet med 3 µl loadingbuffer (tillæg 6) i 2,0 % (w/v) agarosegel i tris-acetat-EDTA-buffer (TAE-buffer) (tillæg 6) ved 5-8 V pr. cm.
Run at least 12 µl of amplified DNA reaction mixture from each sample mixed with 3 µl loading buffer (Appendix 6) in 2,0 % (w/v) agarose gels in tris-acetate-EDTA (TAE) buffer (Appendix 6) at 5 to 8 V per cm.
Dna-båndene visualiseres ved farvning i ethidiumbromid (0,5 mg pr. l) i 30-60 min., idet der træffes de fornødne forholdsregler ved håndteringen af dette mutagen.
Reveal DNA bands by staining in ethidium bromide (0,5 mg per L) for 30 to 60 minutes taking appropriate precautions for handling this mutagen.
Den farvede gel undersøges ved UV-gennemlysning (λ = 302 nm) for amplificerede PCR-produkter af den forventede størrelse (tillæg 6); resultatet skal dokumenteres.
Observe stained gel under short wave UV transillumination (λ = 302 nm) for amplified PCR products of the expected size (Appendix 6) and document.
Ved alle nye fund/tilfælde verificeres PCR-amplikonens ægthed ved restriktionsenzymanalyse af en prøve af det resterende amplificerede dna ved at inkubere ved optimal temperatur i et optimalt tidsrum med passende enzym og buffer (se tillæg 6).
For all new findings/cases verify authenticity of the PCR amplicon by performing restriction enzyme analysis on a sample of the remaining amplified DNA by incubating at the optimum temperature and time with an appropriate enzyme and buffer (see Appendix 6).
De nedbrudte fragmenter adskilles som før ved agarosegelelektroforese, og det karakteristiske restriktionsfragment-mønster undersøges ved UV-gennemlysning efter farvning med ethidiumbromid og sammenlignes med den nedbrudte og den ikke-nedbrudte positive kontrol.
Resolve the digested fragments by agarose gel electrophoresis as before and observe characteristic restriction fragment pattern under UV transillumination after ethidium bromide staining and compare with the undigested and digested positive control.
Fortolkning af PCR-testresultatet
Interpretation of the PCR test result:
PCR-testen er negativ, hvis det R. solanacearum-specifikke PCR-amplikon af den forventede størrelse ikke påvises i den pågældende prøve, men påvises i alle positive kontrolprøver (ved multiplex-PCR med plantespecifikke interne kontrolprimere skal endnu et PCR-produkt af den forventede størrelse amplificeres med den pågældende prøve).
The PCR test is negative if the R. solanacearum-specific PCR amplicon of expected size is not detected for the sample in question but is detected for all positive control samples (in case of multiplex PCR with plant specific internal control primers: a second PCR-product of expected size must be amplified with the sample in question).
PCR-testen er positiv, hvis det R. solanacearum-specifikke PCR-amplikon af den forventede størrelse og med (evt.) det forventede restriktionsmønster påvises, forudsat at det ikke er blevet amplificeret fra nogen af de negative kontrolprøver.
The PCR test is positive if the R. solanacearum-specific PCR amplicon of expected size and restriction pattern (when required) is detected, providing that it is not amplified from any of the negative control samples.
Pålidelig bekræftelse af et positivt resultat kan endvidere fås ved at gentage testen med et nyt sæt PCR-primere (tillæg 6).
Reliable confirmation of a positive result can also be obtained by repeating the test with a second set of PCR primers (Appendix 6).
NB: Der er mistanke om PCR-inhibition, hvis det forventede amplikon fremkommer fra den positive kontrolprøve, der indeholder R. solanacearum i vand, men der fås negative resultater fra positive kontrolprøver med R. solanacearum i kartoffelekstrakt.
Note: Inhibition of the PCR may be suspected if the expected amplicon is obtained from the positive control sample containing R. solanacearum in water but negative results are obtained from positive controls with R. solanacearum in potato extract.
I multiplex-PCR-protokoller med interne PCR-kontroller er det tegn på inhibition af reaktionen, hvis ingen af de to amplikoner fremkommer.
In multiplex PCR protocols with internal PCR controls, inhibition of the reaction is indicated when neither of the two amplicons are obtained.
Når FISH-testen anvendes som den første screeningtest, og resultatet er positivt, skal isolering eller IF-testen gennemføres som anden obligatoriske screeningtest.
When the FISH test is used as the first screening test and found to be positive, Isolation or the IF test must be performed as a second compulsory screening test.
Når FISH-testen anvendes som anden screeningtest, og resultatet er positivt, skal der gennemføres yderligere test i henhold til flowdiagrammet for at komplettere diagnosen.
When the FISH test is used as the second screening test and found to be positive, further testing according to the flow scheme is required to complete the diagnosis.
NB: Der skal anvendes validerede R. solanacearum-specifikke oligo-prober (jf. tillæg 7).
Note: Use validated R. solanacearum-specific oligo-probes (see Appendix 7).
Indledende test med denne metode skulle muliggøre reproducerbar påvisning af mindst 103-104 celler af R. solanacearum pr. ml tilsat til prøveekstrakter, som tidligere er testet negative.
Preliminary testing with this method should permit reproducible detection of at least 103 to 104 cells of R. solanacearum per ml added to sample extracts which previously tested negative.
Følgende procedure bør gennemføres på frisklavet prøveekstrakt, men kan også udmærket gennemføres på prøveekstrakt, der er opbevaret i glycerol ved –16 til –24 °C eller –68 til –86 °C.
The following procedure should preferably be performed on freshly prepared sample extract but can also be successfully performed on sample extract that has been stored under glycerol at –16 to –24 or –68 to –86 °C.
Som negative kontroller anvendes delprøver af prøveekstrakt, som tidligere er testet negativt for R. solanacearum.
As negative controls, use aliquots of sample extract that previously tested negative for R. solanacearum.
Til anvendelse som positive kontroller forberedes suspensioner med 105-106 celler pr. ml af R. solanacearum, biovar 2 (f.eks. stamme NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; jf. tillæg 3), i 0,01 M fosfatbuffer fra en 3-5 dage gammel dyrkning.
As positive controls prepare suspensions containing 105 to 106 cells per ml of R. solanacearum biovar 2 (e.g. strain NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, see Appendix 3) in 0,01M phosphate buffer (PB) from a 3 to 5 day culture).
Fiksering af kartoffelekstrakt
Potato extract fixation
Følgende protokol er baseret på Wullings et al.
The following protocol is based upon Wullings et al.
Der afpipetteres 100 µl af hvert prøveekstrakt i et eppendorfrør, og der centrifugeres i 7 min. ved 7000 g.
Pipette 100 µl of each sample extract into an Eppendorf tube and centrifuge for 7 minutes at 7000 g.
Supernatanten fjernes, og pellet opløses i 200 µl fikseringsopløsning, der er forberedt mindre end 24 timer før.
Remove the supernatant and dissolve the pellet in 200 µl of fixative prepared < 24 hours previously.
Der vortexes og inkuberes i 1 time i køleskab.
Vortex and incubate for one hour in the refrigerator.
Der centrifugeres i 7 min. ved 7000 g, supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i 75 µl 0,01 M fosfatbuffer (se tillæg 7).
Centrifuge for 7 minutes at 7000 g, remove the supernatant and resuspend the pellet in 75 µl 0,01M PB (see Appendix 7).
Den resterende prøveopløsning (49 µl) kan opbevares ved –20 °C efter tilsætning af 1 del 96 % ethanol.
The remaining sample solution (49 µl) can be stored at –20 °C after addition of one volume of 96 % ethanol.
Hvis der er behov for at gentage FISH-assayet, fjernes ethanolen ved centrifugering, og der tilsættes samme mængde 0,01 M fosfatbuffer (der vortexes).
In case the FISH assay requires repeating, remove the ethanol by centrifugation and add an equal volume of 0,01 PB (mix by vortexing).
På dette trin kan proceduren afbrydes, og hybridiseringen fortsættes næste dag.
At this stage the procedure may be interrupted and the hybridisation continued the following day.
Hybridisering
Hybridisation
Kassen præinkuberes i hybridiseringsovnen ved 45 °C i mindst 10 min.
Pre-incubate the box in the hybridisation oven at 45 °C for at least 10 minutes.
Der tilsættes 10 μl hybridiseringsopløsning (tillæg 7) til 8 vinduer (vindue 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 og 10; jf. fig. 7.1) på hvert glas, idet de to vinduer i midten (3 og 8) skal være tomme.
Apply 10 μl of hybridisation solution (Appendix 7) to eight windows (windows 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 and 10; see Fig 7.1) of each slide leaving the two centre windows (3 and 8) empty.
Der sættes dækglas (24 × 24 mm) på det første og de sidste fire vinduer uden luftlommer.
Apply coverslips (24 × 24 mm) to the first and last four windows without trapping air.
Objektglassene anbringes i det foropvarmede fugtkammer og hybridiseres i 5 timer i ovnen ved 45 °C i mørke.
Place the slides in the pre-warmed moist chamber and hybridise for five hours in the oven at 45 °C in the dark.
Der forberedes 3 bægerglas med 1 l Milli Q-vand (af molekylærbiologisk kvalitet), 1 l 1x hybmix (334 ml 3x hybmix og 666 ml Milli Q-vand) og 1 l 1/8x hybmix (42 ml 3x hybmix og 958 ml Milli Q-vand).
Prepare three beakers containing 1 l of Milli Q (molecular grade) water, 1 l of 1x hybmix (334 ml 3x hybmix and 666 ml Milli Q water) and 1 l of 1/8x hybmix (42 ml 3x hybmix and 958 ml Milli Q water).
De præinkuberes alle i vandbad ved 45 °C.
Pre-incubate each in a waterbath at 45 °C.
Overskydende probe bortvaskes ved inkubation i 15 min. i bægerglasset med 1x hybmix ved 45 °C.
Wash away excess probe by incubation for 15 minutes in the beaker with 1x hybmix at 45 °C.
Glasholderen overføres til 1/8 hybmix vaskeopløsning, og der inkuberes i yderligere 15 min.
Transfer the slide holder to 1/8 hybmix washing solution and incubate for a further 15 minutes.
Glassene neddyppes kort i Milli Q-vand og placeres på filtrerpapir.
Dip the slides briefly in Milli Q water and place them on filter paper.
Overskydende fugt fjernes ved at dække overfladen forsigtigt med filtrerpapir.
Remove excess moisture by covering the surface gently with filter paper.
5-10 μl indlejringsopløsning, der modvirker falmning (f.eks. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA, eller tilsvarende) afpipetteres på hvert vindue, og der anbringes et stort dækglas (24 × 60 mm) over hele objektglasset.
Pipette 5 to 10 μl of anti-fading mountant solution (e.g. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA or equivalent) on each window and apply a large coverslip (24 × 60 mm) over the whole slide.
Objektglassene undersøges straks under et epifluorescensmikroskop i immersionsolie ved 630 eller 1000 ganges forstørrelse.
Observe the slides immediately with a microscope fitted for epifluorescence microscopy at 630 or 1000 × magnification under immersion oil.
Ved anvendelse af et filter for tetramethylrhodamin-5-isothiocyanat fremtræder Cy3-farvede celler af R. solanacearum fluorescerende røde. Cellemorfologien sammenlignes med de positive kontroller.
Using a filter for tetramethylrhodamine-5-isothiocyanate, Cy3-stained cells of R. solanacearum appear fluorescent red.
Cellerne skal være stærkt fluorescerende og fuldstændig farvede.
Compare cell morphology with that of the positive controls.
FISH-testen (afsnit VI, del A, punkt 7) gentages, hvis farvningen er unormal.
Cells must be bright fluorescent and completely stained The FISH test (Section VI.A.7.) must be repeated if the staining is aberrant.
Dernæst observeres, om der er stærkt fluorescerende celler med den karakteristiske morfologi for R. solanacearum i testvinduerne på glassene (jf. webstedet http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
Observe for bright fluorescing cells with characteristic morphology of R. solanacearum in the test windows of the test slides (see web site http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
Dette kan være tilfældet, hvis alle objektglas i en batch har positive celler som følge af kontaminering af buffer, eller hvis der konstateres positive celler (uden for vinduerne på objektglasset) på glassets belægning.
This may be the case when all slides in a batch show positive cells due to the contamination of buffer or if positive cells are found (outside of the slide windows) on the the slide coating.
Baggrundsflora af fluorescerende celler med atypisk morfologi og krydsreagerende blødrådsakterier, som i størrelse og morfologi ligner R. solanacearum, kan forekomme — om end mindre hyppigt end i IF-testen — i pellets af navleende og stængelstykker fra kartofler.
Background populations of fluorescing cells with atypical morphology and cross reacting saprophytic bacteria with size and morphology similar to R. solanacearum may occur, although much less frequent as in the IF test, in potato heel end core and stem segment pellets.
Kun fluorescerende celler med typisk størrelse og morfologi tages i betragtning.
Consider only fluorescing cells with typical size and morphology.
Fortolkning af FISH-testresultatet
Interpretation of the FISH test result:
FISH-testresultaterne er gyldige, hvis der i alle positive kontroller og i ingen af de negative kontroller ses stærkt grønt-fluorescerende celler med størrelse og morfologi, der er typisk for R. solanacearum, ved anvendelse af FITC-filteret, og stærkt rødt-fluorescerende celler ved anvendelse af rhodaminfilteret.
Valid FISH test results are obtained if bright green fluorescent cells of size and morphology typical of R. solanacearum are observed using the FITC filter and bright red fluorescent cells using the rhodamine filter in all positive controls and not in any of the negative controls.