natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Laboratoře, jež chtějí tuto zkušební metodu provádět, mohou získat rekombinantní buněčnou linii použitou ve zkoušce KeratinoSensTM po uzavření licenční dohody se subjektem, který tuto zkušební metodu vyvinul.
However, combinations of non-animal methods (in silico, in chemico, in vitro) within Integrated Approaches to Testing and Assessment (IATA) will be needed to be able to fully substitute for the animal tests currently in use given the restricted AOP mechanistic coverage of each of the currently available non-animal test methods (2) (3).
V následujících odstavcích je uveden popis hlavních složek a postupů zkušební metody se stanovením luciferázy ARE-Nrf2.
This test method (ARE-Nrf2 luciferase assay) is proposed to address the second key event as explained in paragraph 2.
Příprava kultur keratinocytů
Skin sensitisers have been reported to induce genes that are regulated by the antioxidant response element (ARE) (8) (9).
Měla by být použita transgenní buněčná linie, která má stabilní inzerci reporterového genu luciferázy řízeného elementem ARE (např. buněčná linie KeratinoSens™).
Small electrophilic substances such as skin sensitisers can act on the sensor protein Keap1 (Kelch-like ECH-associated protein 1), by e.g. covalent modification of its cysteine residue, resulting in its dissociation from the transcription factor Nrf2 (nuclear factor-erythroid 2-related factor 2).
Buňky se po obdržení pomnoží (např. 2 až 4 pasáže) a skladují se zmrazené jako homogenní kmen.
The dissociated Nrf2 can then activate ARE-dependent genes such as those coding for phase II detoxifying enzymes (8) (10) (11).
Buňky z tohoto původního kmene se mohou pomnožit až do maximálního počtu pasáží (tj. 25 v případě KeratinoSensTM) a použijí se pro rutinní zkoušení s použitím vhodného udržovacího média (v případě KeratinoSensTM se jedná o DMEM (Dulbeccova modifikace Eagleova média, obsahující sérum a geneticin).
Currently, the only in vitro ARE-Nrf2 luciferase assay covered by this test method is the KeratinoSensTM assay for which validation studies have been completed (9) (12) (13) followed by an independent peer review conducted by the European Union Reference Laboratory for Alternatives to Animal Testing (EURL ECVAM) (14).
Buňky by pro zkoušení měly být z 80 % až 90 % konfluentní a je třeba dbát na to, aby nikdy nevyrostly do úplné konfluence.
The KeratinoSensTM assay was considered scientifically valid to be used as part of an IATA, to support the discrimination between skin sensitisers and non-sensitisers for the purpose of hazard classification and labelling (14).
Jeden den před zkoušením se buňky odeberou a rozdělí na destičky o 96 jamkách (10000 buněk na každou jamku v případě KeratinoSensTM).
Laboratories willing to implement the test method can obtain the recombinant cell line used in the KeratinoSensTM assay by establishing a licence agreement with the test method developer (15).
Je třeba se vyvarovat sedimentace buněk během nasazování, aby se zajistila distribuce homogenního počtu buněk do jamek.
Since activation of the Keap1-Nrf2-ARE pathway addresses only the second key event of the skin sensitisation AOP, information from test methods based on the activation of this pathway is unlikely to be sufficient when used on its own to conclude on the skin sensitisation potential of chemicals.
Pokud by se tak nestalo, může z tohoto kroku vzejít vysoká variabilita mezi jednotlivými jamkami.
Therefore, data generated with the present test method should be considered in the context of integrated approaches, such as IATA, combining them with other complementary information e.g. derived from in vitro assays addressing other key events of the skin sensitisation AOP as well as non-testing methods including read-across from chemical analogues.
V každém opakování se použijí tři repliky pro měření aktivity luciferázy a jedna souběžná replika se použije pro zkoušku životaschopnosti buněk.
Examples on how to use the ARE-Nrf2 luciferase test method in combination with other information are reported in literature (13) (16) (17) (18) (19).
Příprava zkoušené chemické látky a kontrolních látek
This test method can be used to support the discrimination between skin sensitisers (i.e. UN GHS/CLP Category 1) and non-sensitisers in the context of IATA.
Zkoušená chemická látka a kontrolní látky se připraví v den zkoušení.
This test method cannot be used on its own, neither to sub-categorise skin sensitisers into subcategories 1A and 1B as defined by the UN GHS/CLP nor to predict potency for safety assessment decisions.
Při zkoušce KeratinoSensTM se zkoušené chemické látky rozpustí v dimethylsulfoxidu (DMSO) na žádoucí konečnou koncentraci (např. 200 mM).
However, depending on the regulatory framework, a positive result may be used on its own to classify a chemical into UN GHS/CLP category 1.
Roztoky v DMSO lze považovat za samosterilizující, takže sterilní filtrace není nutná.
Based on the dataset from the validation study and in-house testing used for the independent peer-review of the test method, the KeratinoSensTM assay proved to be transferable to laboratories experienced in cell culture.
Chemická látka, která není rozpustná v DMSO, se rozpustí v sterilní vodě nebo v kultivačním médiu a roztoky se sterilizují např. filtrací.
The level of reproducibility in predictions that can be expected from the test method is in the order of 85 % within and between laboratories (14).
V případě zkoušené chemické látky, která nemá definovanou molekulovou hmotnost (MW) se připraví zásobní roztok v standardní koncentraci (40 mg/ml nebo 4 % (m/V)) používané ve zkoušce KeratinoSensTM.
The accuracy (77 % - 155/201), sensitivity (78 % - 71/91) and specificity (76 % - 84/110) of the KeratinoSensTM assay for discriminating skin sensitisers (i.e. UN GHS/CLP Cat.
V případě použití jiných rozpouštědel než DMSO, vody nebo kultivačního média by mělo být uvedeno dostatečné vědecké zdůvodnění.
1) from non-sensitisers when compared to LLNA results were calculated by considering all of the data submitted to EURL ECVAM for evaluation and peer-review of the test method (14).
Na základě zásobních roztoků zkoušené chemické látky v DMSO se provádí sériové ředění pomocí DMSO k získání 12 základních koncentrací chemické látky, která má být zkoušena (od 0,098 do 200 mM ve zkoušce KeratinoSensTM).
These figures are similar to those recently published based on in-house testing of about 145 substances (77 % accuracy, 79 % sensitivity, 72 % specificity) (13).
U chemických látek nerozpustných v DMSO se k získání základních koncentrací provádí ředění sterilní vodou nebo sterilním kultivačním médiem.
The KeratinoSensTM assay is more likely to under predict chemicals showing a low to moderate skin sensitisation potency (i.e. UN GHS/CLP subcategory 1B) than chemicals showing a high skin sensitisation potency (i.e. UN GHS/CLP subcategory 1A) (13) (14).
Nezávisle na použitém rozpouštědle se poté základní koncentrace dále naředí v poměru 1:25 v kultivačním médiu obsahujícím sérum, a nakonec se použije k expozici buněk po dalším zředění ředicím faktorem 4, takže konečné koncentrace zkoušené chemické látky při zkoušce KeratinoSensTM jsou v rozsahu od 0,98 do 2000 μM.
Taken together, this information indicates the usefulness of the KeratinoSensTM assay to contribute to the identification of skin sensitisation hazard.
V odůvodněných případech lze použít jiné koncentrace (např. v případě cytotoxicity nebo špatné rozpustnosti).
However, the accuracy values given here for the KeratinoSensTM assay as a stand-alone test method are only indicative since the test method should be considered in combination with other sources of information in the context of an IATA and in accordance with the provisions of paragraph 9 above.
Pro negativní kontrolu (s rozpouštědlem) se ve zkoušce KeratinoSensTM používá DMSO (č. CAS 67-68-5, v ≥ 99 % čistotě), pro tuto kontrolu se připraví šest jamek na každé destičce.
Furthermore when evaluating non-animal methods for skin sensitisation, it should be kept in mind that the LLNA as well as other animal tests, may not fully reflect the situation in the species of interest i.e. humans.
Provede se stejné zředění, jak je popsáno u základních koncentrací v odstavci 22, takže konečná koncentrace negativní kontroly (s rozpouštědlem) je 1 %, což neovlivní životaschopnost buněk a odpovídá to stejné koncentraci DMSO, která je použita u zkoušené chemické látky a v pozitivní kontrole.
The term “test chemical” is used in this test method to refer to what is being tested and is not related to the applicability of the ARE-Nrf2 luciferase test method to the testing of substances and/or mixtures.
U zkoušené chemické látky nerozpustné v DMSO, u které se ředění prováděla ve vodě, musí být úroveň DMSO ve všech jamkách konečného zkušebního roztoku upravena na 1 %, tj. na stejnou úroveň, která byla použita u ostatních zkoušených chemických látek a u kontrolních látek.
On the basis of the current data available the KeratinoSensTM assay was shown to be applicable to test chemicals covering a variety of organic functional groups, reaction mechanisms, skin sensitisation potency (as determined with in vivo studies) and physico-chemical properties (9) (12) (13) (14).
Pozitivní kontrolou, která se používá v případě zkoušky KeratinoSensTM je cinnamaldehyd (č. CAS 14371-10-9, o čistotě ≥ 98 %), pro který se připraví řada základních koncentrací v rozsahu od 0,4 do 6,4 mM v DMSO (ze zásobního roztoku 6,4 mM) a rozpustí se tak, jak je uvedeno u základních koncentrací v odstavci 22, takže konečná koncentrace pozitivní kontroly je v rozsahu 4 až 64 μM.
Mainly mono-constituent substances were tested, although a limited amount of data also exist on the testing of mixtures (20).
Lze použít jiné vhodné pozitivní kontroly, nejlépe poskytující hodnoty EC1,5 ve střední části rozsahu, pokud jsou k dispozici historické údaje k odvození srovnatelných kritérií přijatelnosti provedení.
The test method is nevertheless technically applicable to the testing of multi-constituent substances and mixtures.
Aplikace zkoušené chemické látky a kontrolních látek
However, before use of this test method on a mixture for generating data for an intended regulatory purpose, it should be considered whether, and if so why, it may provide adequate results for that purpose.
U každé zkoušené chemické látky a pozitivní kontrolní látky je pro předpověď účinku (pozitivní nebo negativní) postačující jeden experiment, který sestává nejméně ze dvou nezávislých opakování, každé s třemi replikami (tj. n = 6).
Moreover, when testing multi-constituent substances or mixtures, consideration should be given to possible interference of cytotoxic constituents with the observed responses.
V případě neshodných výsledků mezi dvěma nezávislými opakováními by se mělo provést třetí opakování se třemi replikami (tj. n=9).
The test method is applicable to test chemicals soluble or that form a stable dispersion (i.e. a colloid or suspension in which the test chemical does not settle or separate from the solvent into different phases) either in water or DMSO (including all of the test chemical components in the case of testing a multi-constituent substance or a mixture).
Každé nezávislé opakování se provádí v různý den s čerstvým zásobním roztokem zkoušených chemických látek a s nezávisle sklizenými buňkami.
Test chemicals that do not fulfil these conditions at the highest final required concentration of 2000 μM (cf. paragraph 22) may still be tested at lower concentrations.
Buňky však mohou pocházet ze stejné pasáže.
In such a case, results fulfilling the criteria for positivity described in paragraph 39 could still be used to support the identification of the test chemical as a skin sensitiser, whereas a negative result obtained with concentrations < 1000 μM should be considered as inconclusive (see prediction model in paragraph 39).
Po nasazení buněk, jak je popsáno v odstavci 20, se buňky kultivují 24 hodin na mikrotitračních destičkách s 96 jamkami.
In general substances with a LogP of up to 5 have been successfully tested whereas extremely hydrophobic substances with a LogP above 7 are outside the known applicability of the test method (14).
Exponované destičky se poté ve zkoušce KeratinoSensTM inkubují asi 48 hodin při teplotě 37 ± 1 °C za přítomnosti 5 % CO2.
For substances having a LogP falling between 5 and 7, only limited information is available.
Mělo by se dbát na to, aby nedošlo k vypařování těkavých zkoušených chemických látek a ke vzájemné kontaminaci zkoušenou chemickou látkou mezi jamkami, např. tak, že se destičky před inkubací se zkoušenými chemickými látkami přikryjí fólií.
Negative results should be interpreted with caution as substances with an exclusive reactivity towards lysine-residues can be detected as negative by the test method.
Měření aktivity luciferázy
Furthermore, because of the limited metabolic capability of the cell line used (21) and because of the experimental conditions, pro-haptens (i.e. chemicals requiring enzymatic activation for example via P450 enzymes) and pre-haptens (i.e. chemicals activated by auto-oxidation) in particular with a slow oxidation rate may also provide negative results.
K zajištění odpovídajících údajů o luminiscenci jsou kriticky důležité tři faktory:
Test chemicals that do not act as a sensitiser but are nevertheless chemical stressors may lead on the other hand to false positive results (14).
volba citlivého luminometru,
Furthermore, highly cytotoxic test chemicals cannot always be reliably assessed.
použití destiček o dostatečné výšce, aby se nedošlo k vzájemné světelné kontaminaci, a
Finally, test chemicals that interfere with the luciferase enzyme can confound the activity of luciferase in cell-based assays causing either apparent inhibition or increased luminescence (22).
použití substrátu pro luciferázu s dostatečným světelným výstupem, což zajistí dostatečnou citlivost a nízkou variabilitu.
For example, phytoestrogen concentrations higher than 1 μM were reported to interfere with the luminescence signals in other luciferase-based reporter gene assays due to over-activation of the luciferase reporter gene (23).
Před vlastním zkoušením by měl být proveden kontrolní experiment, jak je popsáno v dodatku 3, aby se zajistilo, že tyto tři body budou splněny.
As a consequence, luciferase expression obtained at high concentrations of phytoestrogens or similar chemicals suspected of producing phytoestrogen-like over-activation of the luciferase reporter gene needs to be examined carefully (23).
Po 48hodinové době expozice zkoušené chemické látce a kontrolním látkám ve zkoušce KeratinoSensTM se buňky opláchnou fosfátovým pufrem a do každé jamky se přidá na 20 minut za pokojové teploty příslušný lýzový pufr pro získání údajů o luminiscenci.
In cases where evidence can be demonstrated on the non-applicability of the test method to other specific categories of test chemicals, the test method should not be used for those specific categories.
Destičky s buněčným lyzátem se poté vloží do luminometru pro získání údajů, což je ve zkoušce KeratinoSensTM naprogramováno tak, že se i) přidá substrát pro luciferázu do každé jamky (tj. 50 μl), ii) počká 1 sekundu a iii) integruje aktivita luciferázy po 2 sekundy.
In addition to supporting discrimination between skin sensitisers and non-sensitisers, the KeratinoSensTM assay also provides concentration-response information that may potentially contribute to the assessment of sensitising potency when used in integrated approaches such as IATA (19).
V případě, že se použije jiné nastavení, např. v závislosti na použitém modelu luminometru, mělo by to být odůvodněno.
However, further work preferably based on reliable human data is required to determine how KeratinoSensTM assay results can contribute to potency assessment (24) and to sub-categorisation of sensitisers according to UN GHS/CLP.
Je možné rovněž použít luminiscenční substrát za předpokladu, že byl úspěšně splněn pokus na kontrolu kvality uvedený v dodatku 3.
The ARE-Nrf2 luciferase test method makes use of an immortalised adherent cell line derived from HaCaT human keratinocytes stably transfected with a selectable plasmid.
Posouzení cytotoxicity
The cell line contains the luciferase gene under the transcriptional control of a constitutive promoter fused with an ARE element from a gene that is known to be up-regulated by contact sensitisers (25) (26).
Při zkoušce životaschopnosti buněk KeratinoSensTM se médium po 48hodinové expoziční době nahradí čerstvým médiem obsahujícím MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium-bromid, thiazolylová modř č. CAS 298-93-1) a buňky se inkubují 4 hodiny při teplotě 37 °C za přítomnosti 5 % CO2.
The luciferase signal reflects the activation by sensitisers of endogenous Nrf2 dependent genes, and the dependence of the luciferase signal in the recombinant cell line on Nrf2 has been demonstrated (27).
Médium s MTT se poté odstraní a buňky se přes noc lýzují (např. přidáním 10 % roztoku SDS do každé jamky).
This allows quantitative measurement (by luminescence detection) of luciferase gene induction, using well established light producing luciferase substrates, as an indicator of the activity of the Nrf2 transcription factor in cells following exposure to electrophilic substances.
Po protřepání se změří absorpce při 600 nm pomocí fotometru.
Test chemicals are considered positive in the KeratinoSens™ assay if they induce a statistically significant induction of the luciferase activity above a given threshold (i.e. > 1,5 fold or 50 % increase), below a defined concentration which does not significantly affect cell viability (i.e. below 1000 μM and at a concentration at which the cellular viability is above 70 % (9) (12)).
Ve zkoušce KeratinoSensTM se vypočítávají tyto parametry:
For this purpose, the maximal fold induction of the luciferase activity over solvent (negative) control (Imax) is determined.
hodnoty koncentrací IC50 a IC30, při nichž došlo k 50 % a 30 % snížení životnosti buněk,
Prior to routine use of the ARE-Nrf2 luciferase assay that adheres to this test method, laboratories should demonstrate technical proficiency, using the ten Proficiency Substances listed in Appendix 2.
násobek indukce aktivity luciferázy se vypočítá pomocí rovnice 1 a celkový maximální násobek indukce (Imax) se vypočítá jako průměr jednotlivých opakování.
Performance standards (PS) (28) are available to facilitate the validation of new or modified in vitro ARE-Nrf2 luciferase test methods similar to the KeratinoSens™ assay and allow for timely amendment of this test method for their inclusion.
Rovnice 1:
Mutual Acceptance of Data (MAD) according to the OECD agreement will only be guaranteed for test methods validated according to the PS, if these test methods have been reviewed and included in the corresponding test guideline by OECD.
Násobek indukce
Currently, the only method covered by this test method is the scientifically valid KeratinoSensTM assay (9) (12) (13) (14).
kde
The Standard Operating Procedures (SOP) for the KeratinoSensTM assay is available and should be employed when implementing and using the test method in the laboratory (15).
je naměřená hodnota luminiscence v jamce se zkoušenou chemickou látkou,
Laboratories willing to implement the test method can obtain the recombinant cell line used in the KeratinoSensTM assay by establishing a licence agreement with the test method developer.
je naměřená hodnota luminiscence v jamce slepého pokusu, jež neobsahuje žádné buňky a nebyla nijak ošetřena,
The following paragraphs provide with a description of the main components and procedures of the ARE-Nrf2 luciferase test method.
je průměrná naměřená hodnota luminiscence v jamkách obsahujících buňky a (negativní) kontrolu s rozpouštědlem.
Preparation of the keratinocyte cultures
,5 se vypočítá lineární interpolací podle rovnice2 a celková hodnota EC1,5 se vypočítá jako geometrický průměr z jednotlivých opakování.
A transgenic cell line having a stable insertion of the luciferase reporter gene under the control of the ARE-element should be used (e.g. the KeratinoSens™ cell line).
Rovnice 2:
Upon receipt, cells are propagated (e.g. 2 to 4 passages) and stored frozen as a homogeneous stock.
je nejnižší koncentrace v μM s větší než 1,5násobnou indukcí,
Cells from this original stock can be propagated up to a maximum passage number (i.e. 25 in the case of KeratinoSensTM) and are employed for routine testing using the appropriate maintenance medium (in the case of KeratinoSensTM this represents DMEM containing serum and Geneticin).
je nejvyšší koncentrace v μM s menší než 1,5násobnou indukcí,
For testing, cells should be 80-90 % confluent, and care should be taken to ensure that cells are never grown to full confluence.
je násobek indukce naměřený při nejnižší koncentraci s větší než 1,5násobnou indukcí (střední hodnota tří jamek s replicitními vzorky),
One day prior to testing cells are harvested, and distributed into 96-well plates (10000 cells/well in the case of KeratinoSensTM).
je násobek indukce při nejvyšší koncentraci s menší než 1,5násobnou indukcí (střední hodnota tří jamek s replicitními vzorky).
Attention should be paid to avoid sedimentation of the cells during seeding to ensure homogeneous cell number distribution across wells.
Životaschopnost se vypočítá podle rovnice 3:
If this is not the case, this step may give raise to high well-to-well variability.
Rovnice 3:
For each repetition, three replicates are used for the luciferase activity measurements, and one parallel replicate used for the cell viability assay.
Životaschopnost
Preparation of the test chemical and control substances
je naměřená hodnota absorbance MTT v jamce se zkoušenou chemickou látkou,
The test chemical and control substances are prepared on the day of testing.
je naměřená hodnota absorbance MTT v jamce slepého pokusu, jež neobsahuje žádné buňky a nebyla nijak ošetřena,
For the KeratinoSensTM assay, test chemicals are dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) to the final desired concentration (e.g. 200 mM).
je průměrná naměřená hodnota absorbance MTT v jamkách obsahujících buňky a (negativní) kontrolu s rozpouštědlem,
The DMSO solutions can be considered self-sterilising, so that no sterile filtration is needed.
a IC30 se vypočítají lineární interpolací podle rovnice 4 a celkové hodnoty IC50 a IC30 se vypočítají jako geometrický průměr z jednotlivých opakování.
Test chemical not soluble in DMSO is dissolved in sterile water or culture medium, and the solutions sterilised by e.g. filtration.
Rovnice 4:
For a test chemical which has no defined molecular weight (MW), a stock solution is prepared to a default concentration (40 mg/mL or 4 % (w/v)) in the KeratinoSensTM assay.
X je % snížení při koncentraci, jež má být vypočtena (50 pro IC50 a 30 pro IC30),
In case solvents other than DMSO, water or the culture medium are used, sufficient scientific rationale should be provided.
je % životaschopnosti při nejvyšší koncentraci s menším než x % snížením životaschopnosti.
Alternative concentrations may be used upon justification (e.g. in case of cytotoxicity or poor solubility).
Nejnižší koncentrace s větší než 1,5násobnou indukcí aktivity luciferázy je hodnotou určující hodnotu EC1,5.
It undergoes the same dilution as described for the master concentrations in paragraph 22, so that the final negative (solvent) control concentration is 1 %, known not to affect cell viability and corresponding to the same concentration of DMSO found in the tested chemical and in the positive control.
Doporučuje se tyto údaje zkontrolovat vizuálně s použitím grafů.
The positive control used in the case of the KeratinoSensTM assay is cinnamic aldehyde (CAS No. 14371-10-9, ≥ 98 % purity), for which a series of 5 master concentrations ranging from 0,4 to 6,4 mM are prepared in DMSO (from a 6,4 mM stock solution) and diluted as described for the master concentrations in paragraph 22, so that the final concentration of the positive control range from 4 to 64 μM.
V případě, že dvoufázová odezva je reprodukovatelná v nezávislém experimentu, měla by být zaznamenána nižší hodnota EC1,5 (koncentrace, kdy je prahová hodnota 1,5 protnuta poprvé).
Application of the test chemical and control substances