natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Nasazením buněk do vložek by měla vzniknout konfluentní monovrstva v době expozice chemické látce.
The Top-Down approach (4) is designed to be used when, based on existing information, a chemical is expected to have high irritancy potential.
Do každé vložky by mělo být vloženo 1,6 × 105 buněk (400 μl buněčné suspenze o hustotě 4 × 105 buněk/ml).
Based on the prediction model detailed in paragraph 35, the FL test method can identify chemicals within a limited applicability domain as ocular corrosives/severe irritants (UN GHS Category 1; EU CLP Category 1; U.S. EPA Category I) without any further testing.
Za těchto podmínek se po 96 hodinách obvykle vytvoří konfluentní jednovrstvá kultura.
The same is assumed for mixtures although mixtures were not used in the validation.
Před aplikací látek by se vložky měly vizuálně zkontrolovat a zaznamenat viditelná poškození, aby se zajistilo, která poškození zaznamenaná při vizuální kontrole, která je popsána v odstavci 30, byla způsobena manipulací.
Therefore, the FL test method may be used to determine the eye irritancy/corrosivity of chemicals, following the sequential testing strategy of TM B.5 (5).
Buněčné kultury MDCK by měly být udržovány v inkubátorech ve zvlhčeném ovzduší, při 5 % ± 1 % CO2 a teplotě 37 ± 1 °C.
However, a chemical that is not predicted as ocular corrosive or severe irritant with the FL test method would need to be tested in one or more additional test methods (in vitro and/or in vivo) that are capable of accurately identifying i) chemicals that are in vitro false negative ocular corrosives/severe irritants in the FL (UN GHS Category 1; EU CLP Category 1; U.S. EPA Category I); ii) chemicals that are not classified for eye corrosion/irritation (UN GHS No Category; EU CLP No Category; U.S. EPA Category IV); and/or iii) chemicals that are moderate/mild eye irritants (UN GHS Categories 2A and 2B; EU CLP Category 2; U.S. EPA Categories II and III).
Buňky by neměly být kontaminovány bakteriemi, viry, mykoplasmaty ani houbovými mikroorganismy.
The purpose of this test method is to describe the procedures used to evaluate the potential ocular corrosivity or severe irritancy of a test chemical as measured by its ability to induce damage to an impermeable confluent epithelial monolayer.
Aplikace zkoušených a kontrolních chemických látek
The integrity of trans-epithelial permeability is a major function of an epithelium such as that found in the conjunctiva and the cornea.
Pro každé provedení pokusu by měl být připraven čerstvý zásobní roztok zkoušené chemické látky a použit do 30 minut od přípravy.
Trans-epithelial permeability is controlled by various tight junctions.
Zkoušená chemická látka by se měla připravit v roztoku HBSS s obsahem vápníku (v koncentraci 1,0 až 1,8 mM), bez fenolové červeně, aby se zabránilo vazbě na proteiny v séru.
Increasing the permeability of the corneal epithelium in vivo has been shown to correlate with the level of inflammation and surface damage observed as eye irritation develops.
Před zkoušením by se měla posoudit rozpustnost chemické látky v roztoku HBSS při koncentraci 250 mg/ml.
In the FL test method, toxic effects after a short exposure time to the test chemical are measured by an increase in permeability of sodium fluorescein through the epithelial monolayer of Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells cultured on permeable inserts.
Jestliže chemická látka při této koncentraci vytváří stabilní suspenzi nebo emulzi (tj. zachovává jednotnost a neusazuje se ani se nedělí na více než jednu fázi) po dobu 30 minut, může být HBSS přesto použito jako rozpouštědlo.
The amount of fluorescein leakage that occurs is proportional to the chemical-induced damage to the tight junctions, desmosomal junctions and cell membranes, and can be used to estimate the ocular toxicity potential of a test chemical.
Pokud se však zjistí, že chemická látka je za této koncentrace v HBSS nerozpustná, mělo by se zvážit použití jiných zkušebních metod než FL.
Appendix 1 provides a diagram of MDCK cells grown on an insert membrane for the FL test method.
Použití lehkého minerálního oleje jako rozpouštědla v případech, kdy se zjistí, že chemická látka není v HBSS rozpustná, by mělo být zvažováno s obezřetností, neboť není k dispozici dostatek údajů umožňujících učinit závěr o funkčnosti zkoušky FL za takových podmínek.
Definitions are provided in Appendix 2.
Všechny chemické látky, které mají být zkoušeny, se připraví v roztoku HBSS s obsahem vápníku (v koncentraci 1,0 až 1,8 mM), bez fenolové červeně, pocházejícím ze zásobního roztoku, v pěti pevně stanovených koncentracích zředěných na bázi hmotnosti na jednotku objemu: 1, 25, 100, 250 mg/ml a čistý nebo nasycený roztok.
This test method is based on the INVITTOX protocol No. 71 (6) that has been evaluated in an international validation study by the European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM), in collaboration with the US Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the Japanese Center for the Validation of Alternative Methods (JaCVAM).
Při zkoušení pevné chemické látky by měla být zařazena velmi vysoká koncentrace 750 mg/ml.
The FL test method is not recommended for the identification of chemicals which should be classified as mild/moderate irritants or of chemicals which should not be classified for ocular irritation (substances and mixtures) (i.e. GHS Cat.
Chemickou látku v této koncentraci možná bude nutné na buňky aplikovat pomocí objemové pipety.
2A/2B, no category; EU CLP Cat.
Pokud se zjistí toxicita při koncentraci mezi 25 a 100 mg/ml, měly by se následující koncentrace zkoušet dvakrát: 1, 25, 50, 75, 100 mg/ml.
2, no category; US EPA Cat.
Hodnota FL20 by se měla odvodit z těchto koncentrací, za předpokladu, že byla splněna kritéria přijatelnosti zkoušky.
II/III/IV), as demonstrated by the validation study (3) (7).
Zkoušené chemické látky se aplikují na konfluentní buněčné monovrstvy po odstranění média pro kultivaci buněk a po dvojím opláchnutí sterilním, teplým (37 °C) roztokem HBSS s obsahem vápníku (v koncentraci 1,0 až 1,8 mM), bez fenolové červeně.
The test method is only applicable to water soluble chemicals (substances and mixtures).
Předtím byly vizuálně zkontrolovány filtry, zda nevykazují dříve vzniklá poškození, která by mohla být chybně přičtena potenciální neslučitelnosti se zkoušenými chemickými látkami.
The ocular severe irritation potential of chemicals that are water soluble and/or where the toxic effect is not affected by dilution is generally predicted accurately using the FL test method (7).
Měly by být použity nejméně tři repliky pro každou koncentraci zkoušené chemické látky a pro kontroly v každém provedení zkoušky.
To categorise a chemical as water soluble, under experimental conditions, it should be soluble in sterile calcium-containing (at a concentration of 1,0-1,8 mM), phenol red-free, Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) at a concentration ≥ 250 mg/ml (one dose above the cut-off of 100 mg/ml).
Po expozici o délce 1 minuty za pokojové teploty by měla být zkoušená chemická látka pečlivě odstraněna odsátím, monovrstva by se měla dvakrát opláchnout sterilním teplým (37 °C) roztokem HBSS s obsahem vápníku (v koncentraci 1,0 až 1,8 mM), bez fenolové červeně, a ihned by se měl změřit průnik fluoresceinu.
However, if the test chemical is soluble below the concentration 100 mg/ml, but already induces a FL induction of 20 % at that concentration (meaning FL20 < 100 mg/ml), it can still be classified as GHS Cat.
Souběžné negativní a pozitivní kontroly je nutné používat pro každé provedení zkoušky, aby se prokázalo, že integrita monovrstev (v negativní kontrole) a citlivost buněk (v pozitivní kontrole) je v rámci definovaného dosavadního rozpětí přijatelnosti.
1 or EPA Cat.
Doporučenou chemickou látkou pro pozitivní kontrolu je Brij 35 (č. CAS 9002-92-0) v koncentraci 100 mg/ml.
I.
Tato koncentrace by měla vykázat přibližně 30 % průnik fluoresceinu (přijatelné rozpětí je 20 až 40 % průnik fluoresceinu, tj. poškození vrstvy buněk).
The identified limitations for this test method exclude strong acids and bases, cell fixatives and highly volatile chemicals from the applicability domain.
Maximální průnik se stanoví pomocí kontrolní vložky bez buněk.
These chemicals have mechanisms that are not measured by the FL test method, e.g. extensive coagulation, saponification or specific reactive chemistries.
Stanovení propustnosti fluoresceinu
Other identified limitations for this method are based upon the results for the predictive capacity for coloured and viscous test chemical (7).
Ihned po odstranění zkoušené a kontrolní chemické látky se do vložek (např. typu Milicell-HA) přidá 400μl roztoku fluoresceinu sodného o koncentraci 0,1 mg/ml (0,01 % (m/V) v HBSS s obsahem vápníku (v koncentraci 1,0 až 1,8 mM], bez fenolové červeně).
It is suggested that both types of chemicals are difficult to remove from the monolayer following the short exposure period and that predictivity of the test method could be improved if a higher number of washing steps was used.
Kultury se udržují 30 minut při pokojové teplotě.
Solid chemicals suspended in liquid have the propensity to precipitate out and the final concentration to cells can be difficult to determine.
Na konci inkubace s fluoresceinem se z každé jamky opatrně vyjmou vložky.
When chemicals within these chemical and physical classes are excluded from the database, the accuracy of FL across the EU, EPA, and GHS classification systems is substantially improved (7).
Provede se vizuální kontrola každého filtru a zaznamená se každé poškození, ke kterému mohlo dojít při manipulaci.
Based on the purpose of this test method (i.e. to identify ocular corrosives/severe irritants only), false negative rates (see Paragraph 13) are not critical since such chemicals would be subsequently tested with other adequately validated in vitro tests or in rabbits, depending on regulatory requirements, using a sequential testing strategy in a weight of evidence approach (5) (see also paragraphs 3 and 4).
V roztoku, který zbyl v jamkách po odstranění vložek, se vyčíslí množství fluoresceinu, který pronikl přes monovrstvu a podložku.
Other identified limitations of the FL test method are based on false negative and false positive rates.
Měření se provádějí spektrofluorimetrem při excitační vlnové délce 485 mm a emisní vlnové délce 530 mm.
When used as an initial step within a Top-Down approach to identify water soluble ocular corrosive/severe irritant substances and mixtures (UN GHS Category 1; EU CLP Category 1; U.S. EPA Category I), the false positive rate for the FL test method ranged from 7 % (7/103; UN GHS and EU CLP) to 9 % (9/99; U.S. EPA) and the false negative rate ranged from 54 % (15/28; U.S. EPA) to 56 % (27/48; UN GHS and EU CLP) when compared to in vivo results.
Citlivost spektrofluorimetru by měla být nastavena tak, aby byl co nejvyšší numerický rozdíl mezi maximálním FL (vložka bez buněk) a minimálním FL (vložka s konfluentní monovrstvou ošetřená negativní kontrolní látkou).
Chemical groups showing false positive and/or false negative results in the FL test method are not defined here.
Kvůli rozdílnosti použitého spektrofluorimetru se doporučuje použít takovou citlivost, která poskytne intenzitu fluorescence > 4000 v kontrole s maximálním průnikem fluoresceinu.
Certain technical limitations are specific to the MDCK cell culture.
Maximální hodnota FL by neměla být větší než 9999.
The tight junctions that block the passage of the sodium-fluorescein dye through the monolayer are increasingly compromised with increasing cell passage number.
Maximální intenzita průniku fluorosceinu by se měla nacházet v lineárním rozpětí použitého spektrofluorimetru.
Incomplete formation of the tight junctions results in increased FL in the non-treated control.
Interpretace výsledků a predikční model
Therefore, a defined permissible maximal leakage in the non-treated controls is important (see paragraph 38: 0 % leakage).
Velikost průniku fluoresceinu je úměrná poškození těsných spojů vyvolanému chemickou látkou.
As with all in vitro assays there is the potential for the cells to become transformed over time, thus it is vital that passage number ranges for the assays are stated.
Procentuální hodnota průniku fluoresceinu pro každou zkoušenou koncentraci chemické látky se vypočítá z hodnot FL získaných pro zkoušenou chemickou látku ve srovnání s hodnotami FL získanými z negativní kontroly (údaje naměřené z konfluentní monovrstvy ošetřené negativní kontrolní látkou) a z kontroly s maximálním únikem (údaje naměřené z množství fluoresceinu, který pronikl přes vložku bez buněk).
The current applicability domain might be increased in some cases, but only after analysing an expanded data set of studied test chemicals, preferably acquired through testing (3).
Střední hodnota intenzity fluorescence při maximálním průniku = x
This test method will be updated accordingly as new information and data are considered.
Střední hodnota intenzity fluorescence při 0 % průniku (v negativní kontrole) = y
For any laboratory initially establishing this assay, the proficiency chemicals provided in Appendix 3 should be used.
Střední hodnota 100 % průniku se získá odečtením střední hodnoty 0 % průniku od střední hodnoty maximálního průniku,
Laboratories can use these chemicals to demonstrate their technical competence in performing the FL test method prior to submitting FL assay data for regulatory hazard classification purposes.
tj. x – y = z
The FL test method is a cytotoxicity and cell-function based in vitro assay that is performed on a confluent monolayer of MDCK CB997 tubular epithelial cells that are grown on semi-permeable inserts and model the non-proliferating state of the in vivo corneal epithelium.
Procentuální hodnota průniku pro každou pevně stanovenou dávku se získá odečtením 0 % průniku od střední hodnoty intenzity fluorescence získané měřeními tří replik (m) a vydělením této hodnoty 100 % průnikem tj. % FL = [(m-y) / z] × 100 %, kde:
The MDCK cell line is well established and forms tight junctions and desmosomal junctions similar to those found on the apical side of conjunctival and corneal epithelia.
m střední hodnota intenzity fluorescence z měření tří replik pro danou koncentraci
Tight and desmosomal junctions in vivo prevent solutes and foreign materials penetrating the corneal epithelium.
% FL procento fluoresceinu, který proniká skrz vrstvu buněk
Loss of trans-epithelial impermeability, due to damaged tight junctions and desmosomal junctions, is one of the early events in chemical-induced ocular irritation.
Pro výpočet koncentrace chemické látky vyvolávající 20 % FL se použije tato rovnice:
The test chemical is applied to the confluent layer of cells grown on the apical side of the insert.
kde:
A short 1 min exposure is routinely used to reflect the normal clearance rate in human exposures.
D % inhibice
An advantage of the short exposure period is that water-based substances and mixtures can be tested neat, if they can be easily removed after the exposure period.
A % poškození (20 % únik fluoresceinu)
This allows more direct comparisons of the results with the chemical effects in humans.
B % průnik fluoresceinu < A
The test chemical is then removed and the non-toxic, highly fluorescent sodium-fluorescein dye is added to the apical side of the monolayer for 30 minutes.
C % průnik fluoresceinu > A
The damage caused by the test chemical to the tight junctions is determined by the amount of fluorescein which leaks through the cell layer within a defined period of time.
koncentrace C (v mg/ml)
The amount of sodium-fluorescein dye that passes through the monolayer and the insert membrane into a set volume of solution present in the well (to which the sodium-fluorescein dye leaks in) is determined by measuring spectrofluorometrically the fluorescein concentration in the well.
Klasifikace a označování
Then the FL20 (i.e. concentration that causes 20 % FL relative to the value recorded for the untreated confluent monolayer and inserts without cells), is calculated.
Kategorie I
The FL20 (mg/ml) value is used in the prediction model for identification of ocular corrosives and severe irritants (see paragraph 35).
Zkušební metoda FL se doporučuje pouze ke zjišťování ve vodě rozpustných látek s leptavými a silně dráždivými účinky na oči (kategorie 1 GHS OSN, kategorie 1 CLP EU, kategorie I EPA USA) (viz odstavce 1 a 10).
Recovery is an important part of a test chemical's toxicity profile that is also assessed by the in vivo ocular irritation test.
Aby bylo možné identifikovat chemické látky (látky a směsi) rozpustné ve vodě (3) (6) (7) jako „látky vyvolávající závažné poškození očí“ (kategorie 1 GHS OSN / CLP EU) nebo jako „látky s leptavými nebo silně dráždivými účinky na oči“ (kategorie 1 EPA USA), měla by chemická látka indukovat hodnotu FL20 ≤ 100 mg/ml.
Preliminary analyses indicated that recovery data (up to 72 h following the chemical exposure) could potentially increase the predictive capacity of INVITTOX Protocol 71 but further evaluation is needed and would benefit from additional data, preferably acquired by further testing (6).
Přijatelnost výsledků
Preparation of the cellular monolayer
Střední hodnota při maximálním průniku fluorosceinu (x) by měla být vyšší než 4000 (viz odstavec 31), střední hodnota při 0 % průniku (y) by měla být rovna nebo menší než 300 a střední hodnota při 100 % průniku (z) by se měla nacházet mezi 3700 a 6000.
The monolayer of MDCK CB997 cells is prepared using sub-confluent cells growing in cell culture flasks in DMEM/Nutrient Mix F12 (1x concentrate with L-glutamine, 15 mM HEPES, calcium (at a concentration of 1,0-1,8 mM) and 10 % heat-inactivated FCS/FBS).
Zkouška se považuje za přijatelnou, pokud pozitivní kontrola vyvolala 20 % až 40 % poškození vrstvy buněk (vyjádřeno v % průniku fluoresceinu).
Importantly, all media/solutions used throughout the FL assay should contain calcium at a concentration between 1,8 mM (200 mg/l) and 1,0 mM (111 mg/l) to ensure tight junction formation and integrity.
Údaje
Cell passage number range should be controlled to ensure even and reproducible tight junctions formation.
U každého provedení se uvedou ve formě tabulky údaje o jednotlivých replicitních jamkách (např. hodnoty intenzity fluorescence a vypočtené procentuální údaje o průniku fluoresceinu pro každou zkoušenou chemickou látku včetně její klasifikace).
Preferably, the cells should be within the passage range 3-30 from thawing because cells within this passage range have similar functionality, which aids assay results to be reproducible.
Dále by měly být uvedeny střední hodnoty ± směrodatné odchylky u jednotlivých měření replik při každém provedení zkoušky.
Prior to performing the FL test method, the cells are detached from the flask by trypsinisation, centrifuged and an appropriate amount of cells is seeded into the inserts placed in 24-well plates (see Appendix 1).
číslo CAS chemické látky, je-li známo,
Twelve mm diameter inserts with membrane of mixed cellulose esters, a thickness of 80-150 μm and a pore size of 0,45 μm, should be used to seed the cells.
čistota a složení látky nebo směsi (v hmotnostních procentech), jsou-li tyto informace dostupné,
In the validation study, Millicell-HA 12 mm inserts were used.
fyzikálně-chemické vlastnosti důležité pro provádění studie (např. skupenství, těkavost, pH, stabilita, rozpustnost ve vodě, třída chemických látek),
The properties of the insert and membrane type are important as these may affect cell growth and chemical binding.
případné ošetření zkoušených/kontrolních chemických látek před zkouškou (např. zahřívání, mletí),
Certain types of chemicals may bind to the Millicell-HA insert membrane, which could affect the interpretation of results.
podmínky skladování.
Proficiency chemicals (see Appendix 3) should be used to demonstrate equivalency if other membranes are used.
Zdůvodnění použité zkušební metody a protokolu
Chemical binding to the insert membrane is more common for cationic chemicals, such as benzalkonium chloride, which are attracted to the charged membrane (7).
Mělo by obsahovat úvahy týkající se oblasti použitelnosti a omezení zkušební metody.
Chemical binding to the insert membrane may increase the chemical exposure period, leading to an over-estimation of the toxic potential of the chemical, but can also physically reduce the leakage of fluorescein through the insert by binding of the dye to the cationic chemical bound to the insert membrane, leading to an under-estimation of the toxic potential of the chemical.
popis použitého buněčného systému, včetně osvědčení o pravosti a o stavu mykoplazmatu v buněčné linii,
This can be readily monitored by exposing the membrane alone to the top concentration of the chemical tested and then adding sodium-fluorescein dye at the normal concentration for the standard time (no cell control).
podrobnosti o použitém zkušebním postupu,
If binding of the sodium-fluorescein dye occurs, the insert membrane appears yellow after the test material has been washed-off.
použitá (použité) koncentrace zkoušené chemické látky,
Thus, it is essential to know the binding properties of the test chemical in order to be able to interpret the effect of the chemical on the cells.
délka inkubace s fluoresceinem,
1,6 × 105 cells should be added per insert (400 μl of a cell suspension with a density of 4 × 105 cells / ml).
popis použitých hodnotících kritérií,
Under these conditions, a confluent monolayer is usually obtained after 96 hours in culture.
odkaz na dosavadní údaje modelu (např. o negativních a pozitivních kontrolách, o případných referenčních chemických látkách),
Inserts should be examined visually prior to seeding, so as to ensure that any damages recorded at the visual control described at paragraph 30 is due to handling.
informace o prokázané odborné způsobilosti laboratoře.
The MDCK cell cultures should be kept in incubators in a humidified atmosphere, at 5 % ± 1 % CO2 and 37 ± 1 °C.
V tabulce se uvedou údaje o každé zkoušené chemické látce a o kontrolách pro každé provedení zkoušky a pro každé měření replik (včetně jednotlivých výsledků, středních hodnot a směrodatných odchylek),
The cells should be free of contamination by bacteria, viruses, mycoplasma and fungi.
odvozená (odvozené) klasifikace s odkazem na predikční model a/nebo na použitá kritéria rozhodování,
Application of the Test and Control Chemicals
Měla by zahrnovat úvahy týkající se nepřesvědčivého výsledku zkoušky (odstavec 35: FL20 > 100 mg/ml) a dalšího zkoušení.
A fresh stock solution of test chemical should be prepared for each experimental run and used within 30 minutes of preparation.
Závěry
Test chemicals should be prepared in calcium-containing (at a concentration of 1,0-1,8 mM), phenol red-free, HBSS to avoid serum protein binding.
Dostupné na: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev03/03files_e.html]
Solubility of the chemical at 250 mg/ml in HBSS should be assessed prior to testing.
SCHÉMA BUNĚK MDCK KULTIVOVANÝCH NA MEMBRÁNĚ VLOŽKY PRO ZKUŠEBNÍ METODU FL
All chemicals to be tested are prepared in sterile calcium-containing (at a concentration of 1,0-1,8 mM), phenol red-free, HBSS from the stock solution, at five fixed concentrations diluted on a weight per volume basis: 1, 25, 100, 250 mg/ml and a neat or a saturated solution.
Konfluentní vrstva buněk MDCK se kultivuje na polopropustné membráně vložky.
When testing a solid chemical, a very high concentration of 750 mg/ml should be included.
Vložky jsou umístěny do jamek destiček s 24 jamkami.
This concentration of chemical may have to be applied on the cells using a positive displacement pipette.
Schéma převzato z: Wilkinson, P.J.
If the toxicity is found to be between 25 and 100 mg/ml, the following additional concentrations should be tested twice: 1, 25, 50, 75, 100 mg/ml.
Kategorie I EPA
The FL20 value should be derived from these concentrations provided the acceptance criteria were met.
Chemické látky, jež vyvolávají poleptání (nevratné poškození oční tkáně) nebo zasažení rohovky či dráždění přetrvávající déle než 21 dní (2).
The test chemicals are applied to the confluent cell monolayers after removal of the cell culture medium and washing twice with sterile, warm (37 °C), calcium-containing (at a concentration of 1,0-1,8 mM), phenol red-free, HBSS.