natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Vhodná koncentrace cytoB obvykle činí 3 až 6 μg/ml (19).
Therefore the use of those cell lines and types should be justified based on their demonstrated performance in the test, as described in the Acceptability Criteria section.
Při určování nejvyšší koncentrace zkušební chemické látky je nutno se vyhnout koncentracím, které mají schopnost produkovat arteficielní pozitivní odezvy, například koncentracím, jež vyvolávají velmi vysokou cytotoxicitu (viz odstavec 29), vysrážení v kultivačním médiu (viz odstavec 30) a výrazné změny pH nebo osmolality (viz odstavec 9).
Cyto B was reported to potentially impact L5178Y cell growth and therefore is not recommended with this cell line (23).
Měření buněčné proliferace se provádí proto, aby bylo zajištěno, že dostatek ošetřených buněk prodělal během zkoušky mitózu a že se jednotlivé expozice provádějí při vhodných úrovních cytotoxicity (viz odstavec 29).
When primary cells are used, for animal welfare reasons, the use of cells from human origin should be considered where feasible and sampled in accordance with the human ethical principles and regulations.
Cytotoxicita by měla být stanovena v hlavním experimentu s metabolickou aktivací a bez metabolické aktivace za použití vhodné indikace zániku a růstu buněk (viz odstavce 26 a 27).
Human peripheral blood lymphocytes should be obtained from young (approximately 18-35 years of age), non-smoking individuals with no known illness or recent exposures to genotoxic agents (e.g. chemicals, ionising radiation) at levels that would increase the background incidence of micronucleate cells.
Hodnocení cytotoxicity při počáteční předběžné zkoušce může být užitečné a může napomoci lepšímu stanovení koncentrací, jež mají být použity při hlavní zkoušce, avšak předběžná zkouška není povinná.
This would ensure the background incidence of micronucleate cells to be low and consistent.
Ošetření kultur cytoB a měření relativních četností jednojaderných, dvoujaderných a vícejaderných buněk v kultuře představuje přesnou metodu kvantifikace účinku na buněčnou proliferaci a cytotoxického nebo cytostatického působení látky použité k ovlivnění kultury (6) a zajišťuje, že se mikroskopicky hodnotí pouze buňky, které prodělaly buněčné dělení během expozice nebo po ní.
The baseline incidence of micronucleate cells increases with age and this trend is more marked in females than in males (55).
K odhadu cytotoxického a cytostatického působení za expozice porovnáním hodnot u exponovaných a kontrolních kultur se doporučuje použít proliferační index při blokování cytokineze (CBPI) (6) (27) (68) nebo replikační index (RI) získaný z nejméně 500 buněk v každé kultuře (příslušné vzorce viz dodatek 2).
Cell cultures are maintained in an exponential growth phase (cell lines) or stimulated to divide (primary cultures of lymphocytes) to expose the cells at different stages of the cell cycle, since the sensitivity of cell stages to the test chemicals may not be known.
Užitečné informace může poskytnout i hodnocení ostatních ukazatelů cytotoxicity (např. integrity buněk, apoptózy, nekrózy, počítání metafází, buněčný cyklus), avšak tyto ukazatele by neměly být používány namísto CBPI nebo RI.
The primary cells that need to be stimulated with mitogenic agents in order to divide are generally no longer synchronised during exposure to the test chemical (e.g. human lymphocytes after a 48-hour mitogenic stimulation).
Ve studiích bez použití cytoB je nutno prokázat, že buňky v kultuře se rozdělily, takže podstatná část z hodnocených buněk prodělala buněčné dělení během expozice zkoušené chemické látce nebo po ní, jinak mohou vznikat falešně negativní odpovědi.
The use of synchronised cells during treatment with the test chemical is not recommended, but can be acceptable if justified.
K odhadu cytotoxického a cytostatického působení expozice se doporučuje použít měření relativního zdvojnásobení populace (RPD) nebo relativního nárůstu počtu buněk (RICC) (17) (68) (69) (70) (71) (příslušné vzorce viz dodatek 2).
Appropriate culture medium and incubation conditions (culture vessels, humidified atmosphere of 5 % CO2 if appropriate, temperature of 37 °C) should be used for maintaining cultures.
Při prodloužení časů odběru vzorků (např. expozice po dobu odpovídající 1,5–2násobku normální délky buněčného cyklu a odebrání po další době odpovídající 1,5–2násobku normální délky buněčného cyklu, což celkově vede k časům odběru delším než doba odpovídající 3–4násobku normální délky buněčného cyklu, jak je popsáno v oddílech 38 a 39) by při použití měření RPD mohlo vést k podhodnocenému odhadu cytotoxicity (71).
Cell lines should be checked routinely for the stability of the modal chromosome number and the absence of Mycoplasma contamination, and cells should not be used if contaminated or if the modal chromosome number has changed.
Za těchto okolností by mohlo být lepším měřítkem RICC nebo by bylo užitečné provést odhad na základě hodnocení cytotoxicity po době odpovídající 1,5–2násobku normální délky buněčného cyklu.
The normal cell cycle time of cell lines or primary cultures used in the testing laboratory should be established and should be consistent with the published cell characteristics.
Užitečné doplňující informace může poskytnout i hodnocení ostatních ukazatelů cytotoxicity nebo cytostáze (např. integrity buněk, apoptózy, nekrózy, počítání metafází, proliferačního indexu (PI), buněčného cyklu, nukleoplasmatických můstků nebo jaderných pupenů), avšak tyto ukazatele by neměly být používány namísto RPD nebo RICC.
Lymphocytes: whole blood treated with an anti-coagulant (e.g. heparin), or separated lymphocytes, are cultured (e.g. for 48 hours for human lymphocytes) in the presence of a mitogen (e.g. phytohaemagglutinin (PHA) for human lymphocytes) in order to induce cell division prior to exposure to the test chemical and cytoB.
Použití jedné kultury je opodstatněné zejména v případě, že jsou posuzovány více než 3 koncentrace (viz odstavce 44–45).
Exogenous metabolising systems should be used when employing cells with inadequate endogenous metabolic capacity.
Výsledky získané z nezávislých kultur použitých k opakování při dané koncentraci lze pro účely analýzy údajů sloučit.
The most commonly used system that is recommended by default, unless another system is justified is a co-factor-supplemented post-mitochondrial fraction (S9) prepared from the livers of rodents (generally rats) treated with enzyme-inducing agents such as Aroclor 1254 (56) (57) or a combination of phenobarbital and b-naphthoflavone (58) (59) (60).
V případě cytotoxicity by měly zvolené zkušební koncentrace pokrývat rozpětí od koncentrace vyvolávající cytotoxicitu, jak je popsáno v odstavci 29, po koncentrace, při nichž dochází ke střední a nízké cytotoxicitě nebo nedochází k žádné cytotoxicitě.
The latter combination does not conflict with the Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants (61) and has been shown to be as effective as Aroclor 1254 for inducing mixed-function oxidases (58) (59) (60).
Mnohé zkoušené chemické látky vykazují strmé křivky závislosti odezvy na koncentraci, a aby bylo možné získat údaje při nízké a střední cytotoxicitě nebo podrobně studovat závislost odezvy na dávce, může být nezbytné zvolit menší rozdíly mezi jednotlivými koncentracemi a/nebo více než tři koncentrace (pro jednu kulturu nebo repliky), zejména v situacích, kdy jsou nutné opakované experimenty (viz odstavec 60).
The use of products that reduce the mitotic index, especially calcium complexing products (62), should be avoided during treatment.
Je-li maximální koncentrace odvozena od cytotoxicity, měla by být nejvyšší koncentrace zvolena tak, aby se dosáhlo 55 ± 5 % cytotoxicity za použití doporučených parametrů cytotoxicity (tj. snížení RICC a RPD u buněčných linií, není-li použit cytoB, a snížení CBPI nebo RI, je-li použit cytoB, na 45 ± 5 % u souběžné negativní kontroly) (72).
Solid test chemicals should be prepared in appropriate solvents and diluted, if appropriate, prior to treatment of the cells.
Je třeba dbát na to, aby byly interpretovány pouze ty pozitivní výsledky, které jsou vykazovány při vyšší hranici tohoto rozmezí cytotoxicity 55 ± 5 % (71).
Gaseous or volatile test chemicals should be tested by appropriate modifications to the standard protocols, such as treatment in sealed vessels (63) (64) (65).
Dokonce i v případech, kdy k výskytu cytotoxicity dochází při koncentracích vyšších, než je rozpustnost, se doporučuje testovat pouze při jedné koncentraci indukující zákal nebo viditelné sraženiny, neboť sraženina může vést k falešným účinkům.
The solvent should be chosen to optimise the solubility of the test chemicals without adversely impacting the conduct of the assay, i.e. changing cell growth, affecting integrity of the test chemical, reacting with culture vessels, impairing the metabolic activation system.
Není-li pozorována sraženina nebo cytotoxicita omezující hodnocení, měla by největší zkušební koncentrace odpovídat 10 mM, 2 mg/ml nebo 2 μl/ml, podle toho, která z uvedených hodnot je nejnižší (73) (74) (75).
Well established solvents are water or dimethyl sulfoxide (DMSO).
Pokud u zkoušené chemické látky není stanoveno její složení, např. u látek s neznámým nebo proměnlivým složením, komplexních reakčních produktů nebo biologického materiálu (UVCB) (76), přírodního extraktu atd., bude možná muset být při nedostatečné cytotoxicitě nejvyšší koncentrace vyšší (např. 5 mg/ml), aby se zvýšila koncentrace každé ze složek.
Generally organic solvents should not exceed 1 % (v/v).
Je však třeba poznamenat, že u humánních léčivých přípravků se tyto požadavky mohou lišit (93).
If cytoB is dissolved in DMSO, the total amount of organic solvent used for both the test chemical and cytoB should not exceed 1 % (v/v); otherwise, untreated controls should be used to ensure that the percentage of organic solvent has no adverse effect.
V okamžiku každého odběru by měly být použity souběžné negativní kontroly (viz odstavec 21) skládající se ze samotného rozpouštědla v kultivačním médiu a zpracované stejným způsobem jako exponované kultury.
Aqueous solvents (saline or water) should not exceed 10 % (v/v) in the final treatment medium.
K prokázání schopnosti laboratoře stanovit klastogeny a aneugeny za podmínek použitého zkušebního protokolu a účinnosti exogenního systému metabolické aktivace mohou být (případně) nutné souběžné pozitivní kontroly.
If other than well-established solvents are used (e.g. ethanol or acetone), their use should be supported by data indicating their compatibility with the test chemical, the test system and their lack of genetic toxicity at the concentration used.
Příklady pozitivních kontrol jsou uvedeny v tabulce 1 níže.
In the absence of that supporting data, it is important to include untreated controls (see Appendix 1), as well as solvent controls to demonstrate that no deleterious or chromosomal effects (e.g. aneuploidy or clastogenicity) are induced by the chosen solvent.
V současné době nejsou známy žádné aneugenní látky, které by ke svému genotoxickému působení vyžadovaly metabolickou aktivaci (17).
Use of cytoB as a cytokinesis blocker
Jelikož zkoušky genetické toxicity savčích buněk in vitro při krátkodobé expozici prováděné souběžně s metabolickou aktivací a bez metabolické aktivace s použitím stejné doby trvání expozice jsou již dostatečně standardizovány, je možné použití pozitivních kontrol omezit na testování klastogenu vyžadujícího metabolickou aktivaci.
One of the most important considerations in the performance of the MNvit test is ensuring that the cells being scored have completed mitosis during the treatment or the post-treatment incubation period, if one is used.
V tomto případě klastogenní reakce jediné pozitivní kontroly prokáže činnost systému metabolické aktivace i citlivost zkušebního systému.
Micronucleus scoring, therefore, should be limited to cells that have gone through mitosis during or after treatment.
Dlouhodobá expozice (bez S9) by však měla mít svou vlastní pozitivní kontrolu a doba trvání expozice bude odlišná než při zkoušce za použití metabolické aktivace.
CytoB is the agent that has been most widely used to block cytokinesis because it inhibits actin assembly, and thus prevents separation of daughter cells after mitosis, leading to the formation of binucleate cells (6) (66) (67).
Je-li pro jedinou pozitivní kontrolu při krátkodobé expozici s metabolickou aktivací a bez metabolické aktivace zvolen klastogen, měl by být při dlouhodobé expozici bez metabolické aktivace zvolen aneugen.
The effect of the test chemical on cell proliferation kinetics can be measured simultaneously, when cytoB is used.
Pro pozitivní kontroly pro klastogenicitu i pro aneugenicitu by měly být použity metabolicky kompetentní buňky, které nevyžadují S9.
CytoB should be used as a cytokinesis blocker when human lymphocytes are used because cell cycle times will be variable among donors and because not all lymphocytes will respond to PHA stimulation.
Každá pozitivní kontrola by měla být použita při jedné nebo více koncentracích, u nichž se očekává, že poskytnou reprodukovatelný a detekovatelný nárůst oproti pozadí, čímž se prokáže citlivost testovacího systému (tj. aby byl účinek zřetelný, ale aby při odečtu nevyšla ihned najevo identita kódovaného preparátu), a reakce by neměla být narušena cytotoxicitou přesahující limitní hodnoty stanovené ve zkušební metodě.
CytoB is not mandatory for other cell types if it can be established they have undergone division as described in paragraph 27.
Referenční chemické látky doporučené pro posouzení způsobilosti laboratoře a pro výběr pozitivních kontrol
Moreover CytoB is not generally used when samples are evaluated for micronuclei using flow cytometric methods.
Aneugeny
The appropriate concentration of cytoB should be determined by the laboratory for each cell type to achieve the optimal frequency of binucleate cells in the solvent control cultures and should be shown to produce a good yield of binucleate cells for scoring.
kolchicin
The appropriate concentration of cytoB is usually between 3 and 6 μg/ml (19).
vinblastin
When determining the highest test chemical concentration, concentrations that have the capability of producing artifactual positive responses, such as those producing excessive cytotoxicity (see paragraph 29), precipitation in the culture medium (see paragraph 30), or marked changes in pH or osmolality (see paragraph 9), should be avoided.
Harmonogram aplikace
Measurements of cell proliferation are made to assure that sufficient treated cells have undergone mitosis during the test and that the treatments are conducted at appropriate levels of cytotoxicity (see paragraph 29).
Aby se maximalizovala pravděpodobnost detekce aneugenní nebo klastogenní látky působící v určitém stadiu buněčného cyklu, je důležité, aby byl zkoušené chemické látce vystaven dostatečný počet buněk ve všech fázích jejich buněčného cyklu.
Cytotoxicity should be determined in the main experiment with and without metabolic activation using an appropriate indication of cell death and growth (see paragraphs 26 and 27).
Všechny expozice by měly začít a skončit v době exponenciálního růstu buněk a v době odběru vzorků by měl růst buněk pokračovat.
While the evaluation of cytotoxicity in an initial preliminary test may be useful to better define the concentrations to be used in the main experiment, an initial test is not mandatory.
Harmonogram aplikace pro buněčné linie a primární buněčné kultury se proto může poněkud lišit od harmonogramu aplikace u lymfocytů, které k zahájení svého buněčného cyklu potřebují mitogenní stimulaci (17).
Treatment of cultures with cytoB and measurement of the relative frequencies of mononucleate, binucleate, and multi-nucleate cells in the culture provides an accurate method of quantifying the effect on cell proliferation and the cytotoxic or cytostatic activity of a treatment (6), and ensures that only cells that divided during or after treatment are microscopically scored.
U lymfocytů je nejúčinnějším postupem začít s aplikací zkoušené chemické látky 44–48 hodin po stimulaci PHA, kdy se buňky budou dělit asynchronicky (6).
The cytokinesis-block proliferation index (CBPI) (6) (27) (68) or the Replication Index (RI) from at least 500 cells per culture (see Appendix 2 for formulas) are recommended to estimate the cytotoxic and cytostatic activity of a treatment by comparing values in the treated and control cultures.
Publikované údaje (19) ukazují, že většina aneugenních a klastogenních látek bude detekována za použití krátkodobé expozice v trvání 3 až 6 hodin za přítomnosti i nepřítomnosti S9, po níž následuje odstranění zkoušené látky a odběr v době, která odpovídá 1,5–2násobku normální délky buněčného cyklu od zahájení expozice (7).
Assessment of other indicators of cytotoxicity (e.g. cell integrity, apoptosis, necrosis, metaphase counting, cell cycle) could provide useful information, but should not be used in place of CBPI or RI.
buňky by měly být vystaveny zkoušené chemické látce s metabolickou aktivací na dobu 3–6 hodin a měly by být odebrány po takové době od zahájení aplikace, která odpovídá 1,5–2násobku normální délky buněčného cyklu (19),
In studies without cytoB, it is necessary to demonstrate that the cells in culture have divided, so that a substantial proportion of the cells scored have undergone division during or following treatment with the test chemical, otherwise false negative responses may be produced.
buňky by měly být vystaveny nepřetržité expozici bez metabolické aktivace až do odběru v době, která odpovídá 1,5–2násobku normální délky buněčného cyklu.
The measurement of Relative Population Doubling (RPD) or Relative Increase in Cell Count (RICC) is recommended to estimate the cytotoxic and cytostatic activity of a treatment (17) (68) (69) (70) (71) (see Appendix 2 for formulas).
Pokud je známo nebo existuje podezření, že zkoušená chemická látka ovlivňuje délku buněčného cyklu (např. při zkoušení analogů nukleosidů), a to zejména u p53 kompetentních buněk (35) (36) (77), lze intervaly odběru vzorků nebo obnovy kultur prodloužit o další dobu odpovídající až 1,5–2násobku normální délky buněčného cyklu (tj. celkem na 3–4násobek délky buněčného cyklu po zahájení krátkodobé a dlouhodobé expozice).
At extended sampling times (e.g. treatment for 1,5-2 normal cell cycle lengths and harvest after an additional 1,5-2 normal cell cycle lengths, leading to sampling times longer than 3-4 normal cell cycle lengths in total as described in paragraphs 38 and 39), RPD might underestimate cytotoxicity (71).
Tyto možnosti jsou určeny pro situace, které se týkají možných interakcí mezi zkoušenou chemickou látkou a cytoB.
Under these circumstances RICC might be a better measure or the evaluation of cytotoxicity after a 1,5-2 normal cell cycle lengths would be a helpful estimate.
Při použití prodloužených intervalů odběru vzorků (tj. celkově na dobu odpovídající 3–4násobku délky buněčného cyklu kultur) je třeba dbát na to, aby se buňky v této době stále aktivně dělily.
Assessment of other markers for cytotoxicity or cytostasis (e.g. cell integrity, apoptosis, necrosis, metaphase counting, Proliferation index (PI), cell cycle, nucleoplasmic bridges or nuclear buds) could provide useful additional information, but should not be used in place of either the RPD or RICC.
Například u lymfocytů může exponenciální růst v čase 96 hodin od stimulace klesat a buněčné kultury v monovrstvách mohou splývat.
The use of single cultures is particularly relevant when more than 3 concentrations are assessed (see paragraphs 44-45).
Navrhované harmonogramy expozice buněk jsou uvedeny v tabulce 2.
The results obtained from the independent replicate cultures at a given concentration can be pooled for the data analysis.
Tyto obecné harmonogramy expozice lze upravit (což by mělo být odůvodněno) v závislosti na stabilitě a reaktivitě zkoušené chemické látky nebo zvláštních růstových charakteristikách použitých buněk.
Where cytotoxicity occurs, the test concentrations selected should cover a range from that producing cytotoxicity as described in paragraph 29 and including concentrations at which there is moderate and little or no cytotoxicity.
Lymfocyty, primární buňky a buněčné linie ošetřené s cytoB
If the maximum concentration is based on cytotoxicity, the highest concentration should aim to achieve 55 ± 5 % cytotoxicity using the recommended cytotoxicity parameters (i.e. reduction in RICC and RPD for cell lines when cytoB is not used, and reduction in CBPI or RI when cytoB is used to 45± 5 % of the concurrent negative control) (72).
Krátká expozice
Care should be taken in interpreting positive results only found in the higher end of this 55 ± 5 % cytotoxicity range (71).
Expozice po dobu 3–6 hodin za přítomnosti S9;
Even if cytotoxicity occurs above the lowest insoluble concentration, it is advisable to test at only one concentration inducing turbidity or with visible precipitate because artifactual effects may result from the precipitate.
odstranění S9 a expozičního média;
If no precipitate or limiting cytotoxicity is observed, the highest test concentration should correspond to 10 mM, 2 mg/ml or 2 μl/ml, whichever is the lowest (73) (74) (75).
doplnění čerstvého média a cytoB;
When the test chemical is not of defined composition, e.g. a substance of unknown or variable composition, complex reaction products or biological materials (UVCB) (76), environmental extract, etc., the top concentration may need to be higher (e.g. 5 mg/ml) in the absence of sufficient cytotoxicity, to increase the concentration of each of the components.
odběr po uplynutí doby od začátku expozice odpovídající 1,5násobku až 2,0násobku trvání běžných buněčných cyklů.
It should be noted however that these requirements may differ for human pharmaceuticals (93).
Expozice po dobu 3–6 hodin;
Concurrent negative controls (see paragraph 21), consisting of solvent alone in the treatment medium and processed in the same way as the treatment cultures, should be included for every harvest time.
odstranění expozičního média;
Concurrent positive controls are needed to demonstrate the ability of the laboratory to identify clastogens and aneugens under the conditions of the test protocol used and the effectiveness of the exogenous metabolic activation system (when applicable).
Prodloužená expozice
Examples of positive controls are given in Table 1 below.
Expozice po dobu odpovídající 1,5násobku až 2násobku trvání běžných buněčných cyklů za přítomnosti cytoB;
At the present time, no aneugens are known that require metabolic activation for their genotoxic activity (17).
odběr k vyhodnocení na konci doby expozice.
Because in vitro mammalian cell tests for genetic toxicity are sufficiently standardised for the short-term treatments done concurrently with and without metabolic activation using the same treatment duration, the use of positive controls may be confined to a clastogen requiring metabolic activation.
Buněčné linie ošetřené bez cytoB
In this case a single clastogenic positive control response will demonstrate both the activity of the metabolic activation system and the responsiveness of the test system.
(Harmonogramy jsou shodné s harmonogramy uvedenými výše s výjimkou toho, že se nepřidává žádný cytoB.)
However, long term treatment (without S9) should have its own positive control, as the treatment duration will differ from the test using metabolic activation.
Na konci doby expozice v trvání 3–6 hodin se v kulturách v monovrstvách mohou vyskytovat mitotické buňky (které se vyznačují okrouhlým tvarem a odchlipováním od povrchu).
If a clastogen is selected as the single positive control for short-term treatment with and without metabolic activation, an aneugen should be selected for the long-term treatment without metabolic activation.
Pokud v době sklizně existují důkazy podstatného nárůstu počtu mitotických buněk v porovnání s kontrolami, což pravděpodobně ukazuje na zastavení mitózy, pak by buňky měly být odebrány odstředěním a přidány zpět do kultury, aby se zabránilo ztrátě buněk, u nichž probíhá mitóza a tedy může dojít k indukci mikrojader / chromozómových aberací.
Positive controls for both clastogenicity and aneugenicity should be used in metabolically competent cells that do not require S9.