natgillin/translations-raw huggingface dataset:
b.
Chapter C.37 of this Annex (38) provides relevant photographs of male secondary sex characteristics and androgenised females.
V Bouinově fixačním roztoku zůstanou tkáně po 24 h, poté se přenesou do 70 % ethanolu.
It is important that the strongest valid statistical test determine the endpoint.
Zpracování tkání
The replicate is the experimental unit but intra-replicate variability should be included in the statistical testing.
Dehydratace tkáně pro dostatečné proniknutí parafínu.
A decision flow-chart is available in Appendix 8 to help with the most appropriate statistical test to use based on the characteristic of the data obtained from the test.
Impregnace tkáně parafínem, aby zůstala zachována integrita tkání, a vytvoření pevného povrchu pro mikrotomii.
Statistical significance level is 0,05 for all endpoints included.
Tkáňové kazety označené etiketou se vyjmou z formalínového/ethylenového uložení a vloží se do koše (košů) ke zpracování.
Proportions of sex and genetic sex
Koš se vloží do tkáňového procesoru.
The proportions of sex should be analysed for significant effect (NOEC/LOEC approach) of exposure by Jonckheere-Terpstra (Trend test) if a monotone dose-response exists.
Zvolí se plán zpracování.
If non-monotonicity is found then a pair wise test should be applied:
Poté, co tkáňový procesor dokončí cyklus zpracování, koš (koše) je možné přenést do zalévacího přístroje.
Use Dunnett's test if normality and homogenous variance can be obtained.
Zalití
Use Tamhane-Dunnett if heterogeneous variance is present.
Cíl:
Otherwise use exact Mann-Whitney test with Bonferroni-Holm adjustment.
Řádná orientace vzorku ve ztuhlém parafínu pro mikrotomii.
A flow chart describing the statistics of the proportions of sex is placed in Appendix 8.
Koš (koše) s kazetami se vyjme (vyjmou) z procesoru a ponoří se do přední komory termální konzoly zalévacího přístroje naplněné parafínem nebo se kazety přenesou do samostatného ohřívače parafínu.
The proportions of sex should be presented in tables as concentration proportions ± SD of males, females, intersex and undifferentiated.
První kazeta, která má být zalita, se vyjme z přední komory termální konzole nebo z ohřívače parafínu.
Statistical significance should be highlighted.
Víčko kazety se sejme a odstraní se a zkontroluje se etiketa na kazetě, zda odpovídá záznamům o zvířeti, aby se případné nesrovnalosti vyřešily ještě před zalitím.
Examples are presented in the FSDT Phase 2 validation report (42).
Vybere se zalévací forma vhodné velikosti.
Genetic sex should be reported as percentage of phenotypic sex reversal of males, females, intersex and undifferentiated.
Formy se podrží pod výtokovým otvorem dávkovací konzoly a naplní se roztaveným parafínem.
VTG concentrations
Z kazety se vyjme vzorek a vloží se do roztaveného parafínu ve formě.
VTG concentrations should be analysed for significant effect (NOEC/LOEC approach) of exposure.
To se opakuje se 4–8 vzorky na každou formu s parafínem.
The Dunnett test is preferable to the t-test with Bonferroni correction.
Poloha jednotlivých ryb se vyznačí tak, že se ryba č. 1 uloží v úhlu 180 stupňů vůči rybám č. 2–4/8.
Where a Bonferroni correction is used, the Bonferroni-Holm correction is preferable.
Přidá se další parafín, aby byl vzorek zakryt.
Allowance should be made for log-transformation of VTG to achieve normality and variance homogeneity.
Forma s dnem kazety se vloží na chladicí desku kryokonzole.
Next, if the concentration-response is consistent with monotonicity, then the JonckheereTerpstra test is preferable to any of the above.
Po ztuhnutí parafínu se blok (tj. ztuhlý parafín s tkáněmi a dnem kazety) vyjme z formy.
If t-tests or Dunnett's test is used, there is no need for a ANOVA significance F-test in order to proceed.
Mikrotomie
For details see the flow chart in Appendix 8.
Provedení a uložení histologických řezů za účelem zbarvení.
Results should be reported in tables as concentration means ± SD for males, females, intersex and undifferentiated separately.
Počáteční fáze mikrotomie, která se nazývá ‚odkrytí‘, se provádí takto:
Statistical significance for phenotypic females and phenotypic males should be highlighted.
Parafínový blok se vloží do svorky mikrotomu.
Test chemical actual concentrations
Svorka se posune otáčením kolečka mikrotomu a z parafínového povrchu bloku se odřezávají silné plátky, dokud nůž nedosáhne uložených tkání.
The actual chamber concentrations of the test chemical should be analysed in frequencies described in paragraph 34.
Tloušťka řezů na mikrotomu se nastaví mezi 3–5 mikrony.
Results should be reported in tables as mean concentration ± SD on replicate basis as well as on concentration basis with information on number of samples and with outliers from the mean treatment concentration ± 20 % highlighted.
Svorka se posune a z bloku se několika řezy odstraní jakékoli artefakty, jež vznikly na odříznutém povrchu tkání během hrubých řezů.
Examples can be found in the FSDT Phase 2 validation report (42).
Blok je možné vyjmout ze svorky a položit jej lícem dolů na led, aby tkáň nabobtnala.
The test results should be interpreted with caution where measured test chemical concentrations in test solutions occur at levels near the detection limit of the analytical method.
Další fází mikrotomie je provedení konečných řezů a umístění tkáně na podložní sklíčka.
Relevant physical-chemical properties;
Tyto postupy se provádějí takto:
chemical identification data including purity and analytical method for quantification of the test chemical.
Pokud byl blok položen na led, z ledu se sejme a znovu se vloží do svorky mikrotomu.
Test procedure used (e.g. flow-through semi-static/renewal);
Svorka se posunuje otáčením kolečka mikrotomu, přičemž tloušťka řezu je nastavena na 3–5 mikronů.
test design including test concentrations, method of preparation of stock solutions (in an Annex), frequency of renewal (the solubilising agent and its concentration should be given, when used);
Z bloku se odřezávají řezy, dokud se nezíská ‚páska‘ obsahující alespoň jeden přijatelný řez včetně gonád.
The nominal test concentrations, the means of the measured values and their standard deviations in the test chambers and the method by which these were attained (the analytical method used should be presented in an Annex);Evidence that the measurements refer to the concentrations of the test chemical in true solution;
(V případě potřeby je možné blok během provádění řezů ze svorky vyjmout, položit na led, aby tkáň nabobtnala, a vrátit do svorky.)
Water quality within test chambers:
Řezy se umístí na hladinu vody ve vodní lázni.
Detailed information on feeding (e.g. type of food(s), source, amount given and frequency and analyses for contaminants (e.g. PCBs, PAHs and organochlorine pesticides) if relevant.
Usiluje se o získání alespoň jednoho řezu, který nebude zvrásněný a pod nímž nebudou zachyceny žádné vzduchové bublinky.
Evidence that controls met the validity criteria:
Podložním sklíčkem mikroskopu se podloží nejlepší řez, který se pomocí sklíčka vyjme z vody.
data on hatching rate should be presented in tables as percentage per replicate and per concentration.
Tento postup se označuje jako ‚umístění‘ řezu na podložní sklíčko.
Outliers from the acceptance criteria (in controls) should be highlighted.
Pro soubor ryb se připraví tři řezy.
Survival should be presented as percentage per replicate and per concentration.
Druhý a třetí řez se provedou v intervalech 50 mikronů od prvního řezu.
Outliers from the validity criteria (in controls) should be highlighted;
Pokud ryba s gonádami nebyla uložena do stejné úrovně provádění řezů, je třeba provést více řezů, aby se zajistilo, že z každé ryby bude získáno alespoň šest řezů obsahujících gonády.
Clear indication of the results obtained on the different endpoints observed:
Tužkou pro označování sklíček se na sklíčko zaznamená číslo bloku, z něhož byl řez pořízen.
embryo survival and hatching success;
Sklíčko se umístí na barvicí stojan.
external abnormalities;
Blok se vyjme ze svorky a uloží se lícem dolů k uskladnění.
length and weight;
Barvení vzorků, překrytí krycím sklíčkem a označování
VTG measurements (ng/g homogenate, ng/ml plasma or ng/mg liver);
Obarvení řezů pro histopatologické vyšetření.
gonadal histology, sex ratio, genetic sex data;
Trvalé zapečetění zbarvených tkání.
incidence of any unusual reactions by the fish and any visible effects produced by the test chemical.
Trvalá identifikace zbarvených vzorků způsobem, který umožní jejich plnou vysledovatelnost.
The results should be presented as mean values ± standard deviation (SD) or standard error (SE).
Barvení
Statistics should be reported as a minimum as NOEC and LOEC and confidence intervals.
a.
The statistical flow chart (Appendix 8) should be followed.
Vzorky se přes noc před barvením vysuší na vzduchu.
Sumpter, 1996, “Inhibition of testicular growth in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) exposed to estrogenic alkylphenolic chemicals”, Environmental Toxicology and Chemistry 15, pp. 194-202.
b.
Sumpter, J.P. and S. Jobling, 1995, “Vitellogenesis As A Biomarker for Estrogenic Contamination of the Aquatic Environment”, Environmental Health Perspectives 103, pp. 173-178.
Řezy se obarví hematoxylinem-eosinem.
Hutchinson, S. Maddix, and H. Trip (1999), “An in vivo testing system for endocrine disruptors in fish early life stages using induction of vitellogenin”, Environmental Toxicology and Chemistry 18, pp. 337-347.
Překrytí krycím sklíčkem
Pedersen, and P. Bjerregaard (2001a), “Development of an ELISA for vitellogenin in whole body homogenate of zebrafish (Danio rerio)”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 130, pp. 119-131.
a.
Andersen, L., P. Bjerregaard, and B. Korsgaard (2003), “Vitellogenin induction and brain aromatase activity in adult male and female zebrafish exposed to endocrine disrupters”, Fish Physiology and Biochemistry 28, pp. 319-321.
Krycí sklíčka lze nasazovat ručně nebo automaticky.
Petersen (2003), “Gonad development and vitellogenin production in zebrafish (Danio rerio) exposed to ethinylestradiol and methyltestosterone”, Aquatic Toxicology 65, pp. 397-411.
b.
Tyler (2002), “Utility of a juvenile fathead minnow screening assay for detecting (anti-)estrogenic substances”, Environmental Toxicology and Chemistry 21, pp. 319-326.
Vzorek se ponoří do xylenu nebo do přípravku TissueClear a přebytek xylenu nebo TissueClear se ze vzorku jemně sklepne.
Wang (2007), “Toxicity of the aromatase inhibitor letrozole to Japanese medaka (Oryzias latipes) eggs, larvae and breeding adults”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 145, pp. 533-541.
c.
LeBlanc, and C.V.Sullivan (1999), “Fathead minnow (Pimephales promelas) vitellogenin: purification, characterization and quantitative immunoassay for the detection of estrogenic compounds”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 123, pp. 113-125.
U konce vzorku opačného, než je zmrazený konec, nebo na krycí sklíčko se nanese přibližně 0,1 ml barvicího média.
Porcher (2002), “Development and validation of an enzyme-linked immunosorbent assay to measure vitellogenin in the zebrafish (Danio rerio)”, Environmental Toxicology and Chemistry 21, pp. 1699-1708.
d.
Hatano, H. Mizukami, M. Yamashita, R. Sakakibara, and E. Tamiya (2002), “Development and application of a monoclonal antibody-based sandwich ELISA for quantification of Japanese medaka (Oryzias latipes) vitellogenin”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 132, pp. 161-169.
Krycí sklíčko se nakloní v mírném úhlu a položí na vzorek.
Bengtsson (2004), “The juvenile three-spined stickleback (Gasterosteus aculeatus L.) as a model organism for endocrine disruption — II — kidney hypertrophy, vitellogenin and spiggin induction”, Aquatic Toxicology 70, pp. 311-326.
Označování
Tatarazako, N., M. Koshio, H. Hori, M. Morita, and T. Iguchi (2004), “Validation of an enzyme-linked immunosorbent assay method for vitellogenin in the medaka”, Journal of Health Science 50, pp. 301-308.
a.
Eidem, J.K., H. Kleivdal, K. Kroll, N. Denslow, R. van Aerle, C. Tyler, G. Panter, T. Hutchinson, and A. Goksoyr (2006), “Development and validation of a direct homologous quantitative sandwich ELISA for fathead minnow (Pimephales promelas) vitellogenin.
i.
Ankley (2006), “Evaluation of a commercial kit for measuring vitellogenin in the fathead minnow (Pimephales promelas)”, Ecotoxicology and Environmental Safety 64, pp. 101-105.
Č. vzorku / č. podkladového sklíčka
Comparison of vitellogenin in plasma and whole body homogenate from zebrafish (Danio rerio) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)”, Nordic Council of Ministers, TemaNord 2001:597, pp. 48-51.
Chemickou látku / expoziční skupinu
Porcher, and A. Goksoyr (2004), “Development of quantitative vitellogenin-ELISAs for fish test species used in endocrine disruptor screening”, Analytical and Bioanalytical Chemistry 378, pp. 621-633.
Schéma – statistické metody pro analýzu vitelogeninu
Orn, S., S. Yamani, and L. Norrgren (2006), “Comparison of vitellogenin induction, sex ratio, and gonad morphology between zebrafish and Japanese medaka after exposure to 17 alpha-ethinylestradiol and 17 beta-trenbolone”, Archives of Environmental Contamination and Toxicology 51, pp. 237-243.
>=4 opak. pro každou konc.
Scholz, S. and N. Kluver (2009), “Effects of Endocrine Disrupters on Sexual, Gonadal Development in Fish, Sexual Development 3”, pp. 136-151.
>=4 opak. pro každou konc.
Fenske, M., G. Maack, C. Schafers, and H. Segner (2005), “An environmentally relevant concentration of estrogen induces arrest of male gonad development in zebrafish, Danio rerio”, Environmental Toxicology and Chemistry 24, pp. 1088-1098.
Střední hodnoty opakování testovat Dunnovým testem
Nagahama (2004), “Two DM domain genes, DMY and DMRT1, involved in testicular differentiation and development in the medaka, Oryzias latipes”, Developmental Dynamics 231, pp. 518-526.
Výsledky hierarchické ANOVA testovat Tamhaneovým–Dunnettovým testem
Shinomiya, A., H. Otake, K. Togashi, S. Hamaguchi, and M. Sakaizumi (2004), “Field survey of sex-reversals in the medaka, Oryzias latipes: genotypic sexing of wild populations”, Zoological Science 21, pp. 613-619.
Stejný rozptyl Ne
Flick (2007), “Collapse of a fish population after exposure to a synthetic estrogen”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, pp. 8897-8901.
Hierarchická ANOVA je normální
Tyler (2006), “Development of chronic tests for endocrine active chemicals — Part 1.
Jonckheerův nebo Williamsův test sestupného trendu
An extended fish early-life stage test for oestrogenic active chemicals in the fathead minnow (Pimephales promelas)”, Aquatic Toxicology 77, pp. 279-290.
Střední hodnoty opakování jsou normální a homogenní
Petersen, P. Jackson, K. Hylland, L. Norrgren, and P. Bjerregaard (2006), “Detection of endocrine disrupters: Evaluation of a Fish Sexual Development Test (FSDT)”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 144, pp. 57-66.
Ano Ano
Andersen, L., K. Kinnberg, H. Holbech, B. Korsgaard, and P. Bjerregaard (2004), “Evaluation of a 40 day assay for testing endocrine disrupters: Effects of an anti-estrogen and an aromatase inhibitor on sex ratio and vitellogenin concentrations in juvenile zebrafish (Danio rerio)”, Fish Physiology and Biochemistry 30, pp. 257-266.
Dunnův nebo Mannův-Whitneyův test Normalising transform?
Morthorst, J.E., H. Holbech, and P. Bjerregaard (2010), “Trenbolone causes irreversible masculinization of zebrafish at environmentally relevant concentrations”, Aquatic Toxicology 98, pp. 336-343.
Monotónní Určit, zda je odezva na dávku monotónní
Metcalf (2003), “Effects of the antiandrogens, vinclozolin and cyproterone acetate on gonadal development in the Japanese medaka (Oryzias latipes)”, Aquatic Toxicology 63, pp. 391-403.
Dunnův test >=4 opak. pro každou konc.
Tyler (2004), “Successful detection of (anti-) androgenic and aromatase inhibitors in pre-spawning adult fathead minnows (Pimephales promelas) using easily measured endpoints of sexual development”, Aquatic Toxicology 70, pp. 11-21.
Smísit kontrolní skupiny, ponechat podskupiny
Petersen, and P. Bjerregaard (2007), “Effects of the fungicide prochloraz on the sexual development of zebrafish (Danio rerio)”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 145, pp. 165-170.
Porovnat kontrolní skupiny pomocí Wilcoxonova testu nebo t-testu.
Chapter C.14 of this Annex, Fish Juvenile Growth Test.
Liší se kontrolní skupiny?
Chapter C.4 of this Annex, Ready Biodegradability.
Kontrolní měření s rozpouštědlem i bez rozpouštědla
Chapter C.37 of this Annex, 21-Day Fish Assay:
Schéma – statistické metody pro analýzu poměru pohlaví
A Short Term Screening for Oestrogenic and Androgenic Activity, and Aromatase Inhibition.
Použít Jonckheerův–Terpstrův test (+) ke stanovení NOEC
Schäfers, C., Teigeler, M., Wenzel, A., Maack, G., Fenske, M., Segner, H (2007), “Concentration- and time-dependent effects of the synthetic estrogen, 17 alpha-ethinylestradiol, on reproductive capabilities of the zebrafish, Danio rerio” Journal of Toxicology and Environmental Health-Part A, 70, 9-10 pp 768-779.
Dunnův nebo Mannův–Whitneyův U-test s Bonferroniho–Holmovou korekcí ke stanovení NOEC
Abbreviations and definitions
Při homogenním rozptylu (*), použít Dunnettův test, jinak Tamhaneův–Dunnettův (T3) test ke stanovení NOEC
Apical endpoint
Mají údaje normální rozdělení?
Causing effect at population level
Odpovídají údaje monotónní odezvě na dávku?
Air saturation value
(‡) Nebo jiný schválený výběr kontrolních skupin
Biomarker
Po transformaci druhou odmocninou funkce arcsin
Causing effect at individual level
(+) Při méně než 5 experimentálních jednotkách pro každou expozici by měl být použit exaktní Jonckheerův–Terpstrův test nebo Mannův–Whitneyův test, jsou-li dostupné
A substance or a mixture.
Smísit kontrolní skupiny
Days post hatch
Vypustit kontrolní skupinu s vodou (‡)
Y-specific DM-domain gene required for male development in the medaka fish
Porovnat kontrolní skupiny pomocí t-testu.
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
Je použito rozpouštědlo?
Fish weight
Dodatek 9
Fish wet weight (blotted dry)
Návod k odběru vzorků pro určení genetického pohlaví a pro určení genetického pohlaví metodou PCR
FSDT
Odběr, příprava a uskladnění vzorků před určením genetického pohlaví u halančíka japonského metodou PCR (připraveno Laboratoří pro vodní organismy společnosti Bayer CropScience AG)
Fish Sexual Development Test
Z každé jednotlivé ryby se jemnými nůžkami odstřihne řitní ploutev nebo hřbetní ploutev a umístí se do zkumavky obsahující 100 μl extrakčního pufru 1 (podrobnosti o přípravě pufru viz níže).
Hypothalamic-pituitary-gonadal axis
Po každé jednotlivé rybě se nůžky očistí v kádince s destilovanou H2O a osuší se papírovým ubrouskem.
Intersex fish
Nyní se ploutvové tkáně v mikrozkumavce homogenizují teflonovou tyčinkou pro lýzu buněk.
Fish with more than one oocyte in testis per 6 sections analysed or spermatogenetic cells in ovaries (yes/no)
Pro každou zkumavku se použije nová tyčinka, aby se zabránilo jakékoli kontaminaci.
Wet weight of fish per volume of water
Tyčinky se přes noc vloží do roztoku 0,5 M NaOH, po dobu 5 minut oplachují destilovanou H2O a skladují v etanolu nebo sterilizátoru po ošetření v autoklávu až do použití.
Mode of action
Je také možné ploutvové tkáně skladovat bez extrakčního pufru 1 na suchém ledu a poté v mrazničce při teplotě – 80 °C, aby se zabránilo jakékoli degeneraci DNA.
Reverse Transcriptase Polymerase Chain-Reaction
Extrakce však probíhá lépe, pokud se současně extrahuje DNA (manipulace viz výše; před přidáním pufru do zkumavky by vzorky po skladování při teplotě – 80 °C měly být rozmrazeny na ledu).
Undifferentiated fish
Po homogenizaci se všechny zkumavky vloží do vodní lázně a nechají po 15 minut vařit při teplotě 100 °C.
Fish with gonads exhibiting no discernible germ cells.
Poté se do každé zkumavky pipetou vloží 100 μl extrakčního pufru 2 (podrobnosti o přípravě pufru viz níže).
Vitellogenin
Vzorky se ponechají 15 minut při pokojové teplotě za občasného jemného protřepání v ruce.
Experimental conditions for the FSDT (freshwater species)
Poté se všechny zkumavky znovu vloží do vodní lázně a nechají dalších 15 minut vařit při teplotě 100 °C.
Japanese medaka (Oryzias latipes)
Až do další analýzy jsou zkumavky zmrazeny při teplotě – 20 °C.
Zebrafish (Danio rerio)
Příprava pufru
Three-spined Stickleback (Gasterostreus aculeatus)
Pufr PCR 1:
Flow-through or semi-static
500 mg N-Lauroylsarcosin (např. Merck KGaA, Darmstadt, Německo)
Fluorescent bulbs (wide spectrum
→ autokláv
Light intensity
Pufr PCR 2:
10-20 μE/m2/s, 540-1080 lux, or 50-100 ft-c (ambient laboratory levels)
20 g Chelex (např. Biorad, München, Německo)
12-16 h light, 8-12 h dark
Určení genetického pohlaví (metodou PCR) u halančíka japonského (připraveno Laboratoří pro vodní organismy společnosti Bayer CropScience AG a Biocentrem Univerzity ve Würzburgu)
Minimum chamber size
Připravené a zmrazené zkumavky (jak je popsáno v předchozím oddíle) se rozmrazí na ledu.
Individual chambers should contain a minimum of 7 l water volume
Poté se odstředí odstředivkou Eppendorf (30 sekund při maximální rychlosti, při pokojové teplotě).
Age of test organisms at start of exposure
Pro PCR se použije čistý supernatant oddělený od sraženiny.
Newly fertilised eggs (Early blastula stage)
Je naprosto nezbytné zabránit tomu, aby se do reakce PCR dostaly jakékoli stopy Chelexu (nacházející se ve sraženině), protože by interferoval s působením tzv. Taq-polymerázy.
Newly fertilised eggs
Supernatant se použije přímo nebo ho lze zmrazit (na teplotu – 20 °C) a znovu rozmrazit v několika cyklech bez negativního dopadu na DNA pro pozdější analýzy.
No. of eggs per treatment
Příprava ‚reakční směsi‘ (25 μl na každý vzorek):
Minimum 120
Objem
Minimum 3 (plus appropriate controls)
Konečná koncentrace
No. replicates per treatment
Templátová DNA
Minimum 4 (unless square root allocation to controls)
0,5 μl–2 μl
Live Artemia, frozen adult brine shrimp, flake food, etc.
pufr PCR s MgCl2
It is recommended to feed twice daily
2,5 μl
Special fry food, live Artemia, frozen adult brine shrimp, flake food, etc.
Nukleotidy (každý z dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
It is recommended to feed twice daily
Přímý primer (10 μM) (viz níže 3–5)
None unless DO concentration falls below 60 % saturation
0,5 μl
None unless DO concentration falls below 70 % saturation
Reverzní primer (10 μM) (viz níže 3-5)
Clean surface, well or reconstituted water
Voda (PCR grade)
Test chemical exposure duration
do 25 μl
Hatching success, Survival Gross- morphology, VTG gonadal histology, Genetic sex, Sex ratio
Taq-E-polymeráza
Hatching success, Survival Gross- morphology, VTG gonadal histology, Sex ratio
0,3 μl
Test acceptability criteria for pooled replicates of controls
pufr PCR s MgCl2:
Hatching success > 80 %
670 mM Tris/HCl (pH 8,8 při 25 °C), 160 mM (NH4)2SO4, 25 mM MgCl2, 0,1 % Tween 20
Post hatch survival ≥ 70 %
Pro každou reakci PCR (viz níže 3–5) je potřeba zvláštní primer jako nová kombinace ‚reakční směsi‘ a příslušného potřebného množství templátové DNA pro každý vzorek (viz výše).
growth (Fish wet weight, blotted dry) > 150 mg
Příslušné objemy se pipetami přenesou do nových zkumavek.
growth (Fish wet weight, blotted dry) > 75 mg
Poté se všechny zkumavky uzavřou, míchají (asi 10 sekund) a odstředí (10 sekund, při pokojové teplotě).
growth (Fish wet weight, blotted dry) > 120 mg
Poté lze zahájit příslušné programy PCR.
Length (standard length) > 20mm
V každém programu se kromě toho použije jedna pozitivní kontrola (modelový vzorek DNA se známou aktivitou a jasnými výsledky) a jedna negativní kontrola (1 μl dest.
Length (standard length) > 14 mm
H2O).
Length (standard length) > 20 mm
Příprava agarózového gelu (1 %) – během probíhajících programů PCR
Sex ratio (% males or females) 30 %-70 %
Rozpusťte 3 g agarózy v 300 ml 1 × pufru TAE (1 % agarózový gel).
Chemical characteristics of an acceptable dilution water
Tento roztok by se měl povařit v mikrovlnné troubě (asi 2–3 min).
CONCENTRATION
Horký roztok přeneste do speciální odlévací schránky, která je položena na ledu.
Particular matter
Přibližně po 20 minutách je agarózový gel připraven k použití.
From test method C.14/Guidance on test concentrations