natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Třecí rošt se odstraní, odeberou se jikry a třecí rošt se poté opět vsadí do zkušební nádrže, a to co nejpozději večer nebo velmi časně zrána.
Notably, chemicals with certain modes of action may cause abnormal occurrence of secondary sex characteristic in animals of the opposite sex;
Doba do opětovného vsazení by neměla překročit jednu hodinu, protože jinak může pod vlivem třecího podkladu dojít k individuálnímu páření a tření v neobvyklé době.
for example, androgen receptor agonists, such as trenbolone, methyltestosterone and dihydrotestosterone, can cause female fathead minnows to develop pronounced nuptial tubercles or female medaka to develop papillary processes (11, 20, 21).
Pokud situace vyžaduje pozdější vsazení třecího roštu, mělo by se tak stát alespoň 9 hodin po začátku osvětlení.
It also has been reported that oestrogen receptor agonists can decrease nuptial tubercle numbers and size of the dorsal nape pad in adult males (25, 26).
V tuto pozdní denní dobu již tření vyvoláno nebývá.
Such gross morphological observations may provide useful qualitative and quantitative information to inform potential future fish testing requirements.
Dodatek 4B
The number and size of nuptial tubercles in fathead minnow and papillary processes in medaka can be quantified directly or more practically in preserved specimens.
Třecí podklad pro jelečka velkohlavého
Recommended procedures for the evaluation of secondary sex characteristics in fathead minnow and medaka are available from Appendix 5A and Appendix 5B, respectively.
Do jedné zkušební komory se umístí dvě nebo tři kombinované třecí roury a plastové/keramické/skleněné rošty nebo rošty z nerezové oceli (např. šedý žlábek polokruhového tvaru o délce 80 mm uložený na podložce se zvednutými okraji o délce 130 mm) (viz obrázek).
Vitellogenin (VTG)
Bylo prokázáno, že pro třecí podklad jsou vhodné starší roury z PVC nebo keramiky (Thorpe a kol., 2007).
Blood is collected from the caudal artery/vein with a heparinised microhematocrit capillary tubule, or alternatively by cardiac puncture with a syringe.
Roury se doporučuje obrousit, aby se zlepšila přilnavost.
Depending upon the size of the fish, collectable blood volumes generally range from 5 to 60 μl per individual for fathead minnows and 5-15 μl per individual for zebrafish.
Rošt by rovněž měl být odstíněn, aby se rybám zabránilo v přístupu k vypadlým jikrám, pokud u použitého třecího podkladu nebylo prokázáno, že na něm jikry dobře ulpívají.
Plasma is separated from the blood via centrifugation, and stored with protease inhibitors at – 80 °C, until analysed for vitellogenin.
Účelem základny je pojmout veškeré jikry, které neulpěly na povrchu roury a které by tak spadly na dno nádrže (nebo jikry, které jsou kladeny přímo na plochou plastovou základnu).
Alternatively, in medaka the liver will be used, and in zebrafish the head/tail homogenate can be used as tissue-source for vitellogenin determination (Appendix 6).
Všechny třecí podklady by se před použitím měly nejméně 12 hodin proplachovat v ředicí vodě.
The measurement of VTG should be based upon a validated homologous ELISA method, using homologous VTG standard and homologous antibodies.
Dodatek 5A
It is recommended to use a method capable to detect VTG levels as low as few ng/ml plasma (or ng/mg tissue), which is the background level in unexposed male fish.
Posuzování druhotných pohlavních znaků u jelečka velkohlavého za účelem zjištění určitých chemických látek s endokrinním působením
Quality control of vitellogenin analysis will be accomplished through the use of standards, blanks and at least duplicate analyses.
Přehled
For each ELISA method, a test for matrix effect (effect of sample dilution) should be run to determine the minimum sample dilution factor.
Mezi potenciálně důležité charakteristiky tělesného vzhledu dospělých jelečků velkohlavých při zkouškách endokrinních disruptorů patří zbarvení těla (tj. světlé/tmavé), forma zbarvení (tj. přítomnost či nepřítomnost svislých pruhů), tvar těla (tj. tvar hlavy a hrudní oblasti, rozšíření břicha) a druhotné pohlavní znaky specifické pro tento druh (tj. počet a velikost pářicích hrbolků, velikost dorzálního polštářku a kladélka).
Each ELISA plate used for VTG assays should include the following quality control samples:
Pářicí hrbolky se nacházejí na hlavě (dorzální polštářek) reprodukčně aktivních jelečků velkohlavých a obvykle jsou uspořádány symetricky po obou stranách (Jensen a kol., 2001).
at least 6 calibration standards covering the range of expected vitellogenin concentrations, and at least one non-specific binding assay blank (analysed in duplicate).
U samiček v kontrolních skupinách a u nedospělých samečků a samiček nebyl vývoj hrbolků zaznamenán (Jensen a kol., 2001).
Absorbance of these blanks should be less than 5 % of the maximum calibration standard absorbance.
Samečci mohou mít až osm jednotlivých hrbolků kolem očí a mezi nosními dírkami.
At least two aliquots (well-duplicates) of each sample dilution will be analysed.
Nejvíce hrbolků největší velikosti se nachází ve dvou souběžných řadách bezprostředně pod nosními dírkami a nad tlamou.
Well-duplicates that differ by more than 20 % should be re-analysed.
Nejvíce hrbolků má podobu jednotlivých, zaoblených struktur, jejichž výška se přibližně rovná jejich poloměru.
If the nominal concentrations trend away from the calibration regression line (e.g. at lower concentrations), it may be necessary to split the calibration curve into low and high ranges or to use a nonlinear model to adequately fit the absorbance data.
Následuje popis, jak charakterizovat pářicí hrbolky u jelečka velkohlavého, založený na postupech používaných v laboratoři americké Agentury na ochranu životního prostředí (EPA) v Duluthu ve státě Minnesota.
The ratio of the expected concentration to the measured concentration will be reported along with the results from each set of assays performed on that day.
Specifické produkty a/nebo vybavení lze nahradit srovnatelnými materiály, které jsou k dispozici.
Evaluation of Biomarker Responses by Analysis of Variance (ANOVA)
Prohlídka se nejlépe provádí pomocí lupy s osvětlením nebo pomocí preparačního mikroskopu s osvětlením a s objektivem 3X.
To identify potential endocrine activity of a chemical, responses are compared between treatments and control groups using analysis of variance (ANOVA).
Ryby se prohlížejí z dorzálního směru a anteriorní stranou dopředu (hlavou k pozorovateli).
Where a solvent control is used, an appropriate statistical test should be performed between the dilution water and solvent controls for each endpoint.
Ryba se vloží do malé Petriho misky (např. o průměru 100 mm), anteriorní stranou dopředu a ventrální stranou dolů.
Guidance on how to handle dilution water and solvent control data in the subsequent statistical analysis can be found in OECD, 2006c (27).
Hledáček se zaostří tak, aby bylo možné identifikovat hrbolky.
All biological response data should be analysed and reported separately by sex.
Ryba se jemně a pomalu obrací z boku na bok, aby bylo možné identifikovat oblasti s hrbolky.
If the required assumptions for parametric methods are not met — non-normal distribution (e.g. Shapiro-Wilk's test) or heterogeneous variance (Bartlett's test or Levene's test), consideration should be given to transforming the data to homogenise variances prior to performing the ANOVA, or to carrying out a weighted ANOVA.
Hrbolky se spočítají a zaznamená se jejich hodnocení.
Dunnett's test (parametric) on multiple pair-wise comparisons or a Mann-Whitney with Bonferroni adjustment (non-parametric) may be used for non-monotonous dose-response.
Pozorování se opakuje na ventrálním povrchu hlavy tak, že se ryba položí na Petriho misku dorzálně, anteriorní stranou dopředu.
Other statistical tests may be used (e.g. Jonckheere-Terpstra test or Williams test) if the dose-response is approximately monotone.
Pozorování by u každé ryby měla být dokončena do 2 min.
A statistical flowchart is provided in Appendix 8 to help in the decision on the most appropriate statistical test to be used.
Počítání hrbolků a jejich klasifikace
Additional information can also be obtained from the OECD Document on Current Approaches to Statistical Analysis of Ecotoxicity Data (27).
Bylo zjištěno šest specifických oblastí pro posuzování přítomnosti a vývoje hrbolků u dospělých jelečků velkohlavých.
Reporting of test results
Ke zmapování umístění a množství přítomných hrbolků byla vytvořena šablona (viz konec tohoto dodatku).
Study data should include:
U každého organismu se zaznamená počet hrbolků a jejich velikost pak lze kvantitativně seřadit takto:
Testing facility:
0 – nevyskytují se, 1 – přítomné, 2 – zvětšené a 3 – výrazně zvětšené (obrázek 1).
Responsible personnel and their study responsibilities
Stupeň 0 – žádné hrbolky se nevyskytují.
Each laboratory should have demonstrated proficiency using a range of representative chemicals
Stupněm 1 (přítomné) se označí všechny hrbolky s jedním vrcholem, jejichž výška se přibližně rovná jejich poloměru (průměru).
Characterisation of test chemical
Stupeň 2 (zvětšené) se projevuje tkání v hvězdicovitém tvaru, který má obvykle velkou radiální základnu s rýhami nebo brázdami směřujícími od středu.
Physical nature and relevant physicochemical properties
Někdy se hrbolky mohou vyskytovat společně a vytvářet jednolitou strukturu v určité oblasti nebo v několika oblastech najednou (B, C a D, jak jsou popsány níže).
Solvent:
Zbarvení a tvar jsou podobné jako u stupně 2, ale někdy je obtížné je navzájem rozlišit.
Characterization of solvent (nature, concentration used)
Použití tohoto klasifikačního systému zpravidla vede k celkovému hodnocení hrbolků nižšímu než 50 u normálních samečků v kontrolních skupinách, kteří mají 18–20 hrbolků (Jensen a kol., 2001).
Justification of choice of solvent (if other than water)
Skutečný počet hrbolků u některých ryb může být v konkrétní oblasti klasifikace větší, než je počet políček v šabloně (dodatek A).
Test animals:
Nastane-li tento případ, lze vpravo nebo vlevo od daného políčka vepsat další klasifikační čísla.
Species and strain
Šablona proto nemusí vykazovat symetrii.
Supplier and specific supplier facility
Oblasti mapování:
Details of animal acclimation procedure
A hrbolky nacházející se kolem oka.
Body weight of the fish at the start of the exposure (from a sub-sample of the fish stock)
Mapují se od dorzálních po ventrální kolem anteriorního okraje oka.
Test Conditions:
U dospělých samečků v kontrolních skupinách jsou obvykle početné, u samiček v kontrolních skupinách se nevyskytují, zpravidla jsou párové (po jednom u každého oka), u samiček exponovaných androgenům může být pouze jeden.
Test procedure used (test-type, loading rate, stocking density, etc.);
B hrbolky nacházející se mezi nosními dírkami (póry senzorických kanálků).
Method of preparation of stock solutions and flow-rate;
U samečků v kontrolní skupině jsou obvykle párové a vyššího stupně (2 – zvětšené nebo 3 – výrazně zvětšené).
The nominal test concentrations, weekly measured concentrations of the test solutions and analytical method used, means of the measured values and standard deviations in the test vessels and evidence that the measurements refer to the concentrations of the test chemical in true solution;
U samiček v kontrolní skupině se nevyskytují, do určité míry se mohou vyskytnout a vyvinout u samiček exponovaných androgenům.
Dilution water characteristics (including pH, hardness, alkalinity, temperature, dissolved oxygen concentration, residual chlorine levels, total organic carbon, suspended solids and any other measurements made)
C hrbolky nacházející se bezprostředně anteriorně před nosními dírkami, souběžně s tlamou.
Water quality within test vessels:
U zralých samečků v kontrolních skupinách jsou zpravidla zvětšené nebo výrazně zvětšené.
pH, hardness, temperature and dissolved oxygen concentration;
U méně vyvinutých samečků nebo u samiček exponovaných androgenům bývají stupně 1 (přítomné) nebo zvětšené.
Detailed information on feeding (e.g. type of food(s), source, amount given and frequency and analyses for relevant contaminants if available (e.g. PCBs, PAHs and organochlorine pesticides).
D hrbolky nacházející se souběžně s linií tlamy.
Evidence that the controls met the acceptance criteria of the test;
Zpravidla jsou klasifikovány u samečků v kontrolních skupinách.
Data on mortalities occurring in any of the test concentrations and control;
U samiček z kontrolních skupin se nevyskytují, ale bývají přítomné u samiček exponovaných androgenům.
Statistical analytical techniques used, treatment of data and justification of techniques used;
E hrbolky nacházející se na dolní čelisti, poblíž tlamy; obvykle jsou malé a většinou párové.
Data on biological observations of gross morphology, including secondary sex characteristics and vitellogenin;
U samečků v kontrolních skupinách nebo u exponovaných samečků bývají různé, stejně tak u exponovaných samiček.
Results of the data analyses preferably in tabular and graphical form;
F hrbolky nacházející se ventrálně k poloze E.
Incidence of any unusual reactions by the fish and any visible effects produced by the test chemical
Bývají přítomné u samečků v kontrolní skupině a samiček exponovaných androgenům.
This section contains a few considerations to be taken into account in the interpretation of test results for the various endpoints measured.
Číselná klasifikace
In setting the range of test concentrations, care should be taken not to exceed the maximum tolerated concentration to allow a meaningful interpretation of the data.
1 – přítomné
It is important to have at least one treatment where there are no signs of toxic effects.
Datum
Signs of disease and signs of toxic effects should be thoroughly assessed and reported.
2 – zvětšené
For example, it is possible that production of VTG in females can also be affected by general toxicity and non-endocrine toxic modes of action, e.g. hepatotoxicity.
Celkové hodnocení
However, interpretation of effects may be strengthened by other treatment levels that are not confounded by systemic toxicity.
3 – výrazně zvětšené
There are a few aspects to consider for the acceptance of test results.
Dodatek 5B
As a guide, the VTG levels in control groups of males and females should be distinct and separated by about three orders of magnitude in fathead minnow and zebrafish, and about one order of magnitude for medaka.
Posuzování druhotných pohlavních znaků u halančíka japonského za účelem zjištění určitých chemických látek s endokrinním působením
Examples of the range of values encountered in control and treatment groups are available in the validation reports (1, 2, 3, 4).
Následuje popis měření bradavkovitých výběžků, které jsou druhotným pohlavním znakem u halančíka japonského (Oryzias latipes).
High VTG values in control males could compromise the responsiveness of the assay and its ability to detect weak oestrogen agonists.
Po vyříznutí jater (dodatek 6) se mrtvé tělo vloží do kónické zkumavky, která obsahuje asi 10 ml 10 % neutrálního pufrovaného formalínu (hlavou nahoru, ocasem dolů).
Low VTG values in control females could compromise the responsiveness of the assay and its ability to detect aromatase inhibitors and oestrogen antagonists.
Fixuje-li se gonáda v jiném roztoku než v 10 % neutrálním pufrovaném formalínu, provede se příčný řez skalpelem přes celé mrtvé tělo mezi anteriorní oblastí řitní ploutve a řitním otvorem, přičemž je nutno dbát na to, aby nedošlo k poškození vývodu pohlavních žláz a samotné gonády (obrázek 3).
The validation studies were used to build that guidance.
Kraniální část rybího těla se vloží do fixačního roztoku, aby se zachovala gonáda, a ocasní část rybího těla do 10 % neutrálního pufrovaného formalínu, jak bylo popsáno výše.
If a laboratory has not performed the assay before or substantial changes (e.g. change of fish strain or supplier) have been made it is advisable that a technical proficiency study is conducted.
Po uložení rybího těla do 10 % neutrálního pufrovaného formalínu se anteriorní oblast řitní ploutve uchopí pinzetou a stiskne se asi na 30 vteřin tak, aby řitní ploutev zůstala otevřená.
It is recommended that chemicals covering a range of modes of action or impacts on a number of the test endpoints are used.
Při uchopení řitní ploutve pinzetou se opatrně uchopí několik ploutevních paprsků v anteriorní oblasti tak, aby se nepoškrábaly bradavkovité výběžky.
In practice, each laboratory is encouraged to build its own historical control data for males and females and to perform a positive control chemical for estrogenic activity (e.g. 17β-estradiol at 100 ng/l, or a known weak agonist) resulting in increased VTG in male fish, a positive control chemical for aromatase inhibition (e.g. fadrozole or prochloraz at 300 μg/l) resulting in decreased VTG in female fish, and a positive control chemical for androgenic activity (e.g. 17β-trenbolone at 5 μg/l) resulting in induction of secondary sex characteristics in female fathead minnow and medaka.
Poté, co řitní ploutev zůstala asi po 30 vteřin otevřená, se rybí tělo uloží do 10 % neutrálního pufrovaného formalínu při pokojové teplotě až do změření bradavkovitých výběžků (měření se provádí po fixaci trvající alespoň 24 hodin).
All these data can be compared to available data from the validation studies (1, 2, 3) to ensure laboratory proficiency.
Měření
In general, vitellogenin measurements should be considered positive if there is a statistically significant increase in VTG in males (p < 0,05), or a statistically significant decrease in females (p < 0,05) at least at the highest dose tested compared to the control group, and in the absence of signs of general toxicity.
Po fixaci rybího těla v 10 % neutrálním pufrovaném formalínu po dobu alespoň 24 hodin se mrtvé tělo ryby vyjme z kónické zkumavky a formalín se otře do filtračního papíru (nebo papírového ubrousku).
A positive result is further supported by the demonstration of a biologically plausible relationship between the dose and the response curve.
Ryba se položí břichem nahoru.
As mentioned earlier, the vitellogenin decrease may not entirely be of endocrine origin;
Poté se malými preparačními nůžkami opatrně odstřihne řitní ploutev (upřednostňuje se řitní ploutev odstřihnout s malým množstvím interneurálních trnů (pterygioforů).
however a positive result should generally be interpreted as evidence of endocrine activity in vivo, and should normally initiate actions for further clarification.
Anteriorní oblast oddělené řitní ploutve se uchopí pinzetou a položí na skleněné podložní sklíčko spolu s několika kapkami vody.
Vitellogenin induction by 17β-estradiol and 17β-ethinylestradiol in male zebrafish (Danio rerio).
Poté se řitní ploutev překryje krycím sklíčkem.
Development of an ELISA for determination of the hepatic vitellogenin in Medaka (Oryzias latipes).
Je třeba dát pozor, aby se při uchopení řitní ploutve pinzetou nepoškrábaly bradavkovité výběžky.
Fish full life-cycle testing for androgen methyltestosterone on medaka (Oryzias latipes).
Pod biologickým mikroskopem (vzpřímený mikroskop nebo inverzní mikroskop) se pomocí počítadla stanoví počet článků s bradavkovitými výběžky.
Screening and testing for endocrine disruption in fish-biomarkers as “signposts”, not “traffic lights”, in risk assessment.
Bradavkovité výběžky se započítají, pokud je na posteriorním okraji článku viditelná malá formace výběžků.
Effects of waterborne exposure to 17β-estradiol on secondary sex characteristics and gonads of the fathead minnow (Pimephales promelas).
Počet článků s bradavkovitými výběžky na každé řitní ploutvi se zaznamená v pracovním listu (např. první ploutevní paprsek: 0, druhý ploutevní paprsek: 10, třetí ploutevní paprsek: 12 atd.) a součet těchto čísel u jednotlivých ryb se zanese do excelové tabulky.
Villeneuve and G.T.
V případě potřeby se řitní ploutev vyfotografuje a počet článků s bradavkovitými výběžky se spočítá na fotografii.
Ankley.
Po ukončení měření se řitní ploutev vloží do kónické zkumavky popsané v bodě 1) a uskladní se.
Abbreviations & definitions
Obrázek 1.
Chemical
Obrázek 2.
A substance or a mixture
A – výběžky na článcích paprsků řitní ploutve.
Coefficient of variation.
Obrázek 3.
Loading rate
Fotografie rybího těla, na které je znázorněno místo řezu při fixaci gonád ve fixačním roztoku, nejedná-li se o 10 % neutrální pufrovaný formalín.
Wet weight of fish per volume of water.
V takovém případě se zbývající část těla pomocí břitvy odřízne mezi anteriorní oblastí řitní ploutve a řitním otvorem (červená čára), hlavová část rybího těla se uloží do fixačního roztoku pro gonády a ocasní část se uloží do 10 % neutrálního pufrovaného formalínu.
Stocking density
Bradavkovité výběžky se obvykle objevují pouze u dospělých samečků a nacházejí se na paprscích ploutví, a to od druhého do sedmého nebo osmého paprsku od posteriorního konce řitní ploutve (obrázek 1 a 2).
Number of fish per volume of water.
Na prvním ploutevním paprsku od posteriorního konce řitní ploutve se výběžky vyskytují jen zřídka.
VTG (Vitellogenin)
Uvedené standardní operační postupy zahrnují měření výběžků na prvním ploutevním paprsku (pořadové číslo ploutevního paprsku v tomto standardním operačním postupu označuje pořadí od posteriorního konce řitní ploutve).
Phospholipoglycoprotein precursor to egg yolk protein that normally occurs in sexually active females of all oviparous species.
Doporučené postupy pro odběr vzorků za účelem analýzy vitelogeninu
HPG axis
Je třeba dbát na to, aby nedošlo ke vzájemné kontaminaci mezi vzorky VTG samečků a samiček.
Hypothalamic-pituitary-gonadal axis.
Postup 1A:
MTC
Jeleček velkohlavý, odběr krve z ocasní žíly/tepny
Maximum Tolerated Concentration, representing about 10 % of the LC50.
Po anestetizaci se skalpelem částečně oddělí ocasní stopka a heparinizovanou mikrohematokritovou kapilárou se odebere krev z ocasní žíly/tepny.
Experimental conditions for the fish endocrine screening assay
Po odebrání krve se rychle izoluje plazma, a to odstředěním po dobu 3 minut při zrychlení 15000 g (nebo alternativně po dobu 10 minut při zrychlení 15000 g a při teplotě 4 °C).
Recommended species
Je-li to požadováno, lze po odstředění stanovit procento hematokritu.
Fathead minnow
Část plazmy se poté přenese z mikrohematokritové kapiláry a uloží se do odstředivkové zkumavky s 0,13 jednotkami aprotininu (inhibitor proteázy) při teplotě – 80 °C do doby, než bude možné provést stanovení vitelogeninu.
(Pimephales promelas)
Podle velikosti jelečka velkohlavého (závisející na pohlaví) se objem plazmy, kterou lze odebrat, zpravidla nachází v rozmezí od 5 do 60 mikrolitrů z každé ryby (Jensen a kol., 2001).
Medaka (Oryzias latipes)
Postup 1B:
Zebrafish
Jeleček velkohlavý, odběr krve ze srdce
Test type
Alternativně lze krev odebrat také srdeční punkcí pomocí heparinizované injekční stříkačky (1000 jednotek heparinu na ml).
Flow-through
Krev se přenese do Eppendorfových zkumavek (uložených na ledu) a poté odstředí (po dobu 5 minut při zrychlení 7000 g a pokojové teplotě).
Water temperature
Plazma se přenese do čistých Eppendorfových zkumavek (v poměrných částech, pokud je to s ohledem na objem plazmy proveditelné), urychleně se zmrazí při teplotě – 80 °C a takto se ponechá až do analýzy (Panter a kol., 1998).
Illumination quality
Postup 2A:
Fluorescent bulbs (wide spectrum)
Halančík japonský, vyříznutí jater
Light intensity 10-20 μE/m2/s, 540-1000 lux, or 50-100 ft-c (ambient laboratory levels)
Vyjmutí testované ryby ze zkušební komory
10-20 μE/m2/s, 540-1000 lux, or 50-100 ft-c (ambient laboratory levels)
Testovaná ryba se pomocí malého čeřenu vyjme ze zkušební komory.
Photoperiod (dawn/dusk transitions are optional, however not considered necessary)
Je třeba dát pozor a neupustit testovanou rybu do jiné zkušební komory.
16 h light, 8 h dark
V zásadě by se testované ryby měly vyjímat v tomto pořadí:
12-16 h light, 12-8 h dark
kontrolní skupina, kontrola s rozpouštědlem (existuje-li), skupina s nejnižší koncentrací, skupina se střední koncentrací, skupina s nejvyšší koncentrací a pozitivní kontrola.
< 5 g per l
Všichni samečkové se ze zkušební komory vyjmou dříve než zbývající samičky.
Test chamber size
Pohlaví každé testované ryby se zjistí na základě vnějších druhotných pohlavních znaků (např. tvaru řitní ploutve).
10 l (minimum)