natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Gely lze obarvit a hodnotit v „čerstvém“ stavu (např. během 1 až 2 dnů) nebo je lze dehydratovat pro pozdější hodnocení (např. během 1 až 2 týdnů po obarvení) (56).
Animals should be given daily treatments over a duration of 2 or more days (i.e. two or more treatments at approximately 24 hour intervals), and samples should be collected once at 2-6 h (or at the Tmax) after the last treatment (12).
Tyto podmínky by však měly být při prokázání způsobilosti ověřeny a měly by být získány historické údaje, které se uchovávají zvlášť pro každou z těchto podmínek.
Samples from extended dose regimens (e.g. 28-day daily dosing) are acceptable.
Ve druhém z uvedených případů by preparáty měly být dehydrovány ponořením do absolutního ethanolu alespoň na 5 minut, nechají se usušit na vzduchu a poté se uskladní buď při pokojové teplotě, nebo v nádobě v chladničce, až do hodnocení.
Successful combination of the comet and the erythrocyte micronucleus test has been demonstrated (10) (19).
Metody měření
However careful consideration should be given to the logistics involved in tissue sampling for comet analysis alongside the requirements of tissue sampling for other types of toxicological assessments.
Komety by se měly hodnotit kvantitativně pomocí automatizovaného nebo poloautomatizovaného systému analýzy obrazu.
Harvest 24 hours after the last dose, which is typical of a general toxicity study, is not appropriate in most cases (see paragraph 40 on sampling time).
Preparáty se obarví vhodným fluorescenčním barvivem, např. SYBR Gold, Green 1, propidiumiodidem nebo ethidiumbromidem a změří se při vhodném zvětšení (např. 200x) mikroskopem vybaveným epifluorescencí a vhodnými detektory nebo digitálním fotoaparátem (např. CCD).
The use of other treatment and sampling schedules should be justified (see Appendix 3).
Buňky lze rozdělit do tří kategorií, jak je popsáno v atlasu vyobrazení komet (57), a sice hodnotitelné, nehodnotitelné a tzv. „hedgehogs“ („ježci“, bližší objasnění viz odstavec 56).
For example single treatment with multiple sampling could be used however, it should be noted that more animals will be required for a study with a single administration study because of the need for multiple sampling times, but on occasions this may be preferable, e.g. when the test chemical induces excessive toxicity following repeated administrations.
Aby nedošlo k falešným výsledkům, k získání procentuálního zastoupení DNA v ohonu by měly být hodnoceny pouze hodnotitelné buňky (s jasně vyjádřenou hlavou a ohonem, bez rušivých vlivů sousedních buněk).
Whatever way the test is performed, it is acceptable as long as the test chemical gives a positive response or, for a negative study, as long as direct or indirect evidence supportive of exposure of, or toxicity to, the target tissue(s) has been demonstrated or if the limit dose is achieved (see paragraph 36).
Četnost výskytu nehodnotitelných buněk není nutné uvádět.
Test chemicals also may be administered as a split dose, i.e., two treatments on the same day separated by no more than 2-3 hours, to facilitate administering a large volume.
Četnost výskytu „hedgehogs“ by měla být stanovena na základě vizuálního hodnocení (neboť nepřítomnost jasně vyjádřené hlavy bude znamenat, že je nelze snadno odhalit analýzou obrazu) alespoň 150 buněk v každém vzorku (bližší objasnění viz odstavec 56) a zdokumentována zvlášť.
Under these circumstances, the sampling time should be scheduled based on the time of the last dosing (see paragraph 40).
Všechny preparáty k analýze, včetně preparátů pozitivních a negativních kontrol, by měly být označeny samostatným kódem a hodnoceny „naslepo“ tak, aby hodnotiteli nebyly známy zkušební podmínky.
Dose Levels
Jsou-li použity preparáty, mohlo by to znamenat hodnocení 2 nebo 3 preparátů z každého vzorku, pokud jsou použity skupiny s pěti zvířaty.
If a preliminary range-finding study is performed because there are no suitable data available from other relevant studies to aid in dose selection, it should be performed in the same laboratory, using the same species, strain, sex, and treatment regimen to be used in the main study according to current approaches for conducting dose range-finding studies.
Mělo by být pozorováno několik oblastí preparátu o hustotě zajišťující, že nedojde k překrývání ohonů.
The study should aim to identify the maximum tolerated dose (MTD), defined as the dose inducing slight toxic effects relative to the duration of the study period (for example, clear clinical signs such as abnormal behaviour or reactions, minor body weight depression or target tissue cytotoxicity), but not death or evidence of pain, suffering or distress necessitating euthanasia.
Oblasti na okraji preparátů by se hodnotit neměly.
For a non-toxic test chemical, with an administration period of 14 days or more, the maximum (limit) dose is 1000 mg/kg bodyweight/day.
Zlomy vláken DNA by se v kometovém testu měly měřit podle nezávislých cílových ukazatelů, jako je např. procentuální zastoupení DNA v ohonu, délka ohonu a moment ohonu („tail moment“, definovaný jako součin délky ohonu a procentuálního zastoupení DNA v ohonu).
For administration periods of less than 14 days the maximum (limit) dose is 2000 mg/kg bodyweight/day.
Lze provést všechna tři měření, pokud je použit vhodný softwarový systém pro analýzu obrazu.
For certain types of test chemicals (e.g. human pharmaceuticals) covered by specific regulations these limits may vary.
Pro hodnocení a interpretaci výsledků se však doporučuje použít procentuální zastoupení DNA v ohonu (též známé jako procento intenzity ohonu) (12) (40) (41) (42), které se stanoví jako intenzita fragmentů DNA v ohonu vyjádřená v procentech z celkové intenzity buňky (13).
Chemicals that exhibit saturation of toxicokinetic properties, or induce detoxification processes that may lead to a decrease in exposure after long-term administration, may be exceptions to the dose-setting criteria and should be evaluated on a case-by-case basis.
Poškození tkání a cytotoxicita
For both acute and sub-acute versions of the comet assay, in addition to the maximum dose (MTD, maximum feasible dose, maximum exposure or limit dose) a descending sequence of at least two additional appropriately spaced dose levels (preferably separated by less than √10) should be selected for each sampling time to demonstrate dose-related responses.
Pozitivní nálezy v kometovém testu nemusejí být pouze důsledkem genotoxicity, ale k nárůstům migrace DNA může vést také toxicita cílové tkáně (12) (41).
However, the dose levels used should also preferably cover a range from the maximum to one producing little or no toxicity.
A naopak u známých genotoxinů je často zjištěna nízká nebo střední cytotoxocita (12), z čehož plyne, že pouze kometovým testem není možné rozlišit migraci DNA vyvolanou genotoxicitou od migrace DNA způsobené cytotoxicitou.
When target tissue toxicity is observed at all dose levels tested, further study at non-toxic doses is advisable (see paragraphs 54-55).
Pokud jsou zjištěny nárůsty migrace DNA, doporučuje se nicméně provést vyšetření jednoho nebo více ukazatelů cytotoxicity, což může napomoci při interpretaci těchto nálezů.
Studies intending to more fully investigate the shape of the dose-response curve may require additional dose group(s).
Nárůsty migrace DNA za přítomnosti jasných příznaků cytotoxicity by měly být interpretovány s obezřetností.
Administration of Doses
Byla navržena celá řada měřítek cytotoxicity, přičemž za důležité měřítko toxicity tkání jsou považovány histopatologické změny.
In any case the route should be chosen to ensure adequate exposure of the target tissue(s).
S nárůsty migrace DNA byla spojována taková zjištění jako zánět, infiltrace buněk, apoptotické nebo nekrotické změny, avšak jak prokázal validační experiment JaCVAM (12), není k dispozici žádný konečný seznam histopatologických změn, které jsou vždy spojeny se zvýšenou migrací DNA.
Intraperitoneal injection is generally not recommended since it is not a typical relevant route of human exposure, and should only be used with specific justification (e.g. some positive control substances, for investigative purposes, or for some drugs that are administered by the intraperitoneal route).
„Hedgehogs“ (nebo též „clouds“ či „ghost cells“) jsou buňky, které pod mikroskopem tvoří obraz sestávající z malé nebo chybějící hlavy a z velkých roztroušených ohonů a jsou považovány za těžce poškozené buňky, ačkoli etiologie „hedgehogs“ je nejistá (viz dodatek 3).
The volume should not exceed 1 ml/100 g body weight, except in the case of aqueous solutions where 2 ml/100g body weight may be used.
V důsledku jejich vzhledu jsou měření procentuálního zastoupení DNA v ohonu pomocí obrazové analýzy nespolehlivá, a proto se by buňky „hedgehogs“ měly hodnotit zvlášť.
The use of volumes greater than this (if permitted by animal welfare legislation) should be justified.
Výskyt „hedgehogs“ by měl být zaznamenán a uveden ve zprávě a jakýkoli významný nárůst, o němž se má za to, že je vyvolán zkoušenou chemickou látkou, by měl být pečlivě zkoumán a interpretován.
Wherever possible different dose levels should be achieved by adjusting the concentration of the dosing formulation to ensure a constant volume in relation to body weight at all dose levels.
Při takovém posuzování může pomoci znalost potenciálního mechanismu působení zkoušené chemické látky.
Sampling Time
Experimentální jednotkou je zvíře, a proto by měly být předloženy jak údaje o jednotlivých zvířatech, tak souhrnné výsledky ve formě tabulky.
The sampling time is a critical variable because it is determined by the period needed for the test chemicals to reach maximum concentration in the target tissue and for DNA strand breaks to be induced but before those breaks are removed, repaired or lead to cell death.
Vzhledem k hierarchické povaze údajů se doporučuje určit mediánovou hodnota procentuálního zastoupení DNA v ohonu pro každý preparát a vypočítat střední hodnotu těchto mediánových hodnot pro každé zvíře (12).
The persistence of some of the lesions that lead to the DNA strand breaks detected by the comet assay may be very short, at least for some chemicals tested in vitro (52) (53).
Ze středních hodnot pro jednotlivá zvířata se pak určí skupinová střední hodnota.
Accordingly, if such transient DNA lesions are suspected, measures should be taken to mitigate their loss by ensuring that tissues are sampled sufficiently early, possibly earlier than the default times given below.
Všechny tyto hodnoty by měly být v závěrečné zprávě uvedeny.
The optimum sampling time(s) may be chemical- or route-specific resulting in, for example, rapid tissue exposure with intravenous administration or inhalation exposure.
Možné jsou i jiné přístupy (viz odstavec 53), pokud jsou vědecky a statisticky odůvodněny.
Accordingly, where available, sampling times should be determined from kinetic data (e.g. the time (Tmax) at which the peak plasma or tissue concentration (Cmax) is achieved, or at the steady state for multiple administrations).
Statistickou analýzu lze provést různými způsoby (58) (59) (60) (61).
In the absence of kinetic data a suitable compromise for the measurement of genotoxicity is to sample at 2-6 h after the last treatment for two or more treatments, or at both 2-6 and 16-26 h after a single administration, although care should be taken to necropsy all animals at the same time after the last (or only) dose.
Při výběru statistické metody, která má být použita, by měla být zvážena nutnost transformace (např. log nebo druhá odmocnina) údajů a/nebo přičtení malého čísla (např. 0,001) ke všem (i k nenulovým) hodnotám, aby se zmírnily účinky nulových buněčných hodnot, jak bylo popsáno ve výše uvedených odkazech.
Information on the appearance of toxic effects in target organs (if available) may also be used to select appropriate sampling times.
Podrobnosti k analýze interakcí expozice/pohlaví, jsou-li použita obě pohlaví, a k následné analýze údajů v případě, že jsou zjištěny nebo nejsou zjištěny rozdíly, jsou uvedeny v dodatku 2.
General clinical observations related to the health of the animals should be made and recorded at least once a day preferably at the same time(s) each day and considering the peak period of anticipated effects after dosing (54).
Uvedeny by měly být i údaje o toxicitě a klinické příznaky.
At least twice daily, all animals should be observed for morbidity and mortality.
a. provedená negativní kontrola se považuje za přijatelnou pro přidání do databáze historických negativních kontrol laboratoře, jak je popsáno v odstavci 16;
For longer duration studies, all animals should be weighed at least once a week, and at completion of the test period.
b. provedené pozitivní kontroly (viz odstavec 29) by měly vyvolat odezvy, které jsou slučitelné s odezvami uvedenými v databázi historických pozitivních kontrol a měly by vyvolat statisticky významný nárůst v porovnání se souběžně provedenou negativní kontrolou;
Food consumption should be measured at each change of food and at least weekly.
c. byl analyzován přiměřený počet buněk a dávek (odstavce 52 a 36 až 38);
Animals exhibiting non-lethal indicators of excessive toxicity should be euthanized prior to completion of the test period, and are generally not used for comet analysis.
d. kritéria pro výběr nejvyšší dávky jsou v souladu s kritérii popsanými v odstavci 36.
Tissue Collection
Za předpokladu, že všechna kritéria přijatelnosti byla splněna, lze zkoušenou chemickou látku považovat za jasně pozitivní, pokud:
Since it is possible to study induction of DNA strand breaks (comets) in virtually any tissue, the rationale for selection of tissue(s) to be collected should be clearly defined and based upon the reason for conducting the study together with any existing ADME, genotoxicity, carcinogenicity or other toxicity data for the test chemicals under investigation.
a. alespoň jedna ze zkoušených dávek vykazuje statisticky významný nárůst v porovnání se souběžně provedenou negativní kontrolou;
Important factors for consideration should include the route of administration (based on likely human exposure route(s)), the predicted tissue distribution and absorption, the role of metabolism and the possible mechanism of action of the test chemicals.
c. jakékoli výsledky se nacházejí vně rozložení dosavadních údajů negativních kontrol pro daný druh zvířat, vehikulum, způsob podání, tkáň a počet podání dávek.
The liver has been the tissue most frequently studied and for which there are the most data.
Jsou-li splněna všechna tato kritéria, má se za to, že zkoušená chemická látka je schopna vyvolávat zlomy vláken DNA v tkáních zkoušených v tomto zkušebním systému.
Therefore, in the absence of any background information, and if no specific tissues of interest are identified, sampling the liver would be justified as this is a primary site of xenobiotic metabolism and is often highly exposed to both parent substance(s) and metabolite(s).
Je-li splněno pouze jedno nebo dvě z těchto kritérií, viz odstavec 62.
In some cases, examination of a site of direct contact (for example, for orally-administered chemicals the glandular stomach or duodenum/jejunum, or for inhaled chemicals the lungs) may be most relevant.
Za předpokladu, že všechna kritéria přijatelnosti byla splněna, lze zkoušenou chemickou látku považovat za jasně negativní, pokud:
Additional or alternative tissues should be selected based on the specific reasons for the test is being conducted but it may be useful to examine multiple tissues in the same animals providing the laboratory has demonstrated proficiency with those tissues and competency in handling multiple tissues at the same time.
b. hodnocení pomocí vhodného trend-testu ukáže, že neexistuje nárůst v závislosti na koncentraci;
Preparation of specimens
c. všechny výsledky se nacházejí uvnitř rozložení historických údajů negativních kontrol pro daný druh zvířat, vehikulum, způsob podání, tkáň a počet podání dávek;
For the processes described in the following paragraphs (44-49) it is important that all solutions or stable suspensions should be used within their expiration date, or should be freshly prepared if needed.
d. byly podány přímé či nepřímé důkazy o expozici cílové tkáně (tkání) nebo o toxicitě pro cílovou tkáň (tkáně).
Also in the following paragraphs, the times taken to (i) remove each tissue after necropsy, (ii) process each tissue into cell/nuclei suspensions, and (iii) process the suspension and prepare the slides are all considered critical variables (see Definitions, Appendix 1), and acceptable lengths of time for each of these steps should have been determined during establishment of the method and demonstration of proficiency.
Zkoušená chemická látka je pak považována za látku nevyvolávající poškození vláken DNA v tkáních zkoumaných v tomto zkušebním systému.
Animals will be euthanised, consistent with effective animal welfare legislation and 3Rs principles, at the appropriate time(s) after the last treatment with a test chemical.
V případě, že účinek není jasně negativní ani jasně pozitivní (tj. ne všechna kritéria uvedená v odstavcích 59 nebo 60 jsou splněna) a aby se napomohlo stanovení biologického významu výsledku, měly by být údaje vyhodnoceny na základě odborného posudku a/nebo by měl být provedeno další šetření, pokud je to vědecky odůvodněné.
Selected tissue(s) is removed, dissected, and a portion is collected for the comet assay, whilst at the same time a section from the same part of the tissue should be cut and placed in formaldehyde solution or appropriate fixative for possible histopathology analysis (see paragraph 55) according to standard methods (12).
Užitečné by mohlo být hodnocení dalších buněk (je-li vhodné) nebo provedení opakovaného experimentu, případně za optimalizovaných zkušebních podmínek (např. intervaly koncentrací, jiné způsoby podávání dávek, jiné doby odběru vzorků nebo jiné tkáně).
The tissue for the comet assay is placed into mincing buffer, rinsed sufficiently with cold mincing buffer to remove residual blood, and stored in ice-cold mincing buffer until processed.
V případě, že jsou pozitivní nebo neurčitá zjištění pozorována pouze za přítomnosti zjevných důkazů cytotoxicity, měla by být studie vyhodnocena jako neurčitá z hlediska genotoxicity, pokud neexistuje dostatek informací podporujících jednoznačný závěr.
These include mincing of tissues such as liver and kidney, scraping mucosal surfaces in the case of the gastro-intestinal tract, homogenization and enzymic digestion.
V případě negativního výsledku studie, kdy existují známky toxicity při všech zkoušených dávkách, lze doporučit další studii při netoxických dávkách.
The JaCVAM validation trial only studied isolated cells, and therefore in terms of establishing the method and being able to refer to the JaCVAM trial data for demonstration of proficiency, isolated cells are preferred.
zdroj, číslo šarže, je-li k dispozici,
However, it has been shown that there was no essential difference in the assay result whether isolated cells or nuclei were used (8).
stabilita zkoušené chemické látky, datum použitelnosti nebo datum opětovné analýzy, je-li známo,
Also different methods to isolate cells/nuclei (e.g. homogenizing, mincing, enzymic digestion and mesh filtration) gave comparable results (55).
Rozpouštědlo/vehikulum:
Consequently, either isolated cells or isolated nuclei can be used.
zdůvodnění volby rozpouštědla/vehikula,
A laboratory should thoroughly evaluate and validate tissue-specific methods of single cell/nuclei isolation.
příprava aplikačních forem,
As discussed in paragraph 40, the persistence of some of the lesions that lead to the DNA strand breaks detected by the comet assay may be very short (52) (53).
analytická stanovení aplikační formy (např. stabilita, homogenita, nominální koncentrace).
Therefore, whatever method is used to prepare the single cell/nuclei suspensions, it is important that tissues are processed as soon as possible after the animals have been euthanised and placed in conditions that reduce the removal of lesions (e.g. by maintaining the tissue at low temperature).
použitý druh/kmen a vědecké a etické odůvodnění výběru,
The cell suspensions should be kept ice-cold until ready for use, so that minimal inter-sample variation and appropriate positive and negative control responses can be demonstrated.
původ, podmínky chovu, strava, obohacení atd.,
PREPARATION OF SLIDES
individuální hmotnost zvířat na počátku a na konci zkoušky, včetně rozpětí tělesné hmotnosti, střední hodnoty a směrodatné odchylky pro každou skupinu.
Slide preparation should be done as soon as possible (ideally within one hour) after single cell/nuclei preparation, but the temperature and time between animal death and slide preparation should be tightly controlled and validated under the laboratory's conditions.
údaje ze studie pro zjištění rozsahu dávek (pokud byla provedena),
The volume of the cell suspension added to low melting point agarose (usually 0,5-1,0 %) to make the slides should not reduce the percentage of low melting point agarose to less than 0,45 %.
zdůvodnění způsobu podávání,
The optimum cell density will be determined by the image analysis system used for scoring comets.
zdůvodnění výběru tkáně,
It is therefore recommended that the lysis conditions be kept as constant as possible for all slides within an experiment.
metody ověřování, zda se zkoušená chemická látka dostala k cílové tkáni, nebo ověřování obecné cirkulace, pokud byly získány negativní výsledky,
Once prepared, the slides should be immersed in chilled lysing solution for at least one hour (or overnight) at around 2-8 °C under subdued lighting conditions e.g. yellow light (or light proof) that avoid exposure to white light that may contain UV components.
podrobné údaje o kvalitě krmiva a vody,
After this incubation period, the slides should be rinsed to remove residual detergent and salts prior to the alkali unwinding step.
podrobný popis harmonogramů aplikace a odběru vzorků a odůvodnění výběru konkrétního schématu (např. toxikokinetické údaje, jsou-li k dispozici),
This can be done using purified water, neutralization buffer or phosphate buffer.
metoda tišení bolesti, analgeze,
Electrophoresis buffer can also be used.
postupy izolace a uchovávání tkání,
This would maintain the alkaline conditions in the electrophoresis chamber.
metody přípravy jednobuněčné/jednojaderné suspenze,
Unwinding and electrophoresis
zdroj a čísla šarží všech reakčních činidel (pokud možno),
Slides should be randomly placed onto the platform of a submarine-type electrophoresis unit containing sufficient electrophoresis solution such that the surfaces of the slides are completely covered (the depth of covering should also be consistent from run to run).
metody hodnocení cytotoxicity,
In another type of comet assay electrophoresis units i.e. with active cooling, circulation and high capacity power supply a higher solution covering will result in higher electric current while the voltage is kept constant.
podmínky elektroforézy,
A balanced design should be used to place slides in the electrophoresis tank to mitigate the effects of any trends or edge effect within the tank and to minimize batch-to-batch variability, i.e., in each electrophoresis run, there should be the same number of slides from each animal in the study and samples from the different dosage groups, negative and positive controls, should be included.
použité postupy barvení a
The slides should be left for at least 20 minutes for the DNA to unwind, and then subjected to electrophoresis under controlled conditions that will maximize the sensitivity and dynamic range of the assay (i.e. lead to acceptable levels of % tail DNA for negative and positive controls that maximize sensitivity).
metody hodnocení a měření komet.
The level of DNA migration is linearly associated with the duration of electrophoresis, and also with the potential (V/cm).
všeobecná klinická pozorování každého zvířete, pokud byla prováděna, před zkouškou a v jejím průběhu,
Based on the JaCVAM trial this could be 0,7 V/cm for at least 20 minutes.
důkazy cytotoxicity, pokud byla zkoumána,
The duration of electrophoresis is considered a critical variable and the electrophoresis time should be set to optimize the dynamic range.