natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Vzorek se obohatí tak, aby se dosáhlo koncentrace vitelogeninu 10krát až 100krát vyšší než očekávaná koncentrace vitelogeninu u samečků ryb z kontrolní skupiny.
Measurement
Vzorek plazmy samečků z kontrolní skupiny, který se obohacuje, může pocházet z jedné ryby nebo to může být směsný vzorek z několika ryb.
After fixing the fish body in the 10 % neutral buffered formalin for at least 24 hours, pick up the fish carcass from the conical tube and wipe the formalin on the filter paper (or paper towel).
Dílčí vzorek neobohacené plazmy samečků z kontrolní skupiny se bude analyzovat alespoň ve dvou duplikátních jamkách.
Place the fish abdomen side up.
Rovněž obohacený vzorek se bude analyzovat alespoň ve dvou duplikátních jamkách.
Then cut the anal fin using small dissection scissors carefully (it is preferable to cut the anal fin with small amount of pterygiophore).
Za účelem stanovení očekávané koncentrace se střední hodnota množství vitelogeninu z obou neobohacených vzorků plazmy samečků z kontrolní skupiny přičte k vypočtenému množství vitelogeninu přidaného za účelem obohacení vzorků.
Grasp the anterior region of the severed anal fin with tweezers and put it on a glass slide with a several drops of water.
Poměr mezi touto očekávanou koncentrací a naměřenou koncentrací se zaznamená spolu s výsledky všech souborů zkoušek provedených v týž den.
Then cover the anal fin with a cover glass.
Schéma rozhodování pro statistickou analýzu
Be careful not to scratch the papillary processes when grasping the anal fin with tweezers.
Střední hodnoty opakování mají normální rozdělení
Count the number of the joint plate with papillary processes using the counter under a biological microscope (upright microscope or inverted microscope).
Střední hodnoty opakování nemají normální rozdělení Dunnettův test
The papillary processes are recognized when a small formation of processes is visible on the posterior margin of joint plate.
<=3 opak. pro každou konc.
Write the number of joint plate with papillary processes in each fin ray to the worksheet (e.g. first fin ray: 0, second fin ray: 10, third fin ray: 12, etc.) and enter the sum of this number on the Excel spreadsheet by individual fish.
Střední hodnoty opakování testovat Dunnovým testem
If necessary, take a photograph of the anal fin and count the number of joint plate with papillary processes on the photograph.
Dunnův nebo Mannův – Whitneyův test
After the measurement, put the anal fin into the conical tube described in (1) and store it.
Dunnův test Ano Ne
Fig.1.
Není monotónní
Diagram showing sexual difference in shape and size of the anal fin.
Tamhaneův–Dunnettův test >=4 opak. pro každou konc.
A, male;
<=3 opak. pro každou konc.
B, female.
Hierarchická ANOVA není normální
Fig.2.A.
Ne Ano Ne Ano
Processes on joint plates of anal fin-ray.
Tamhaneův- Dunnettův test
J.P., joint plate;
transformace ke stabilizaci rozptylu?
A.S., axial space;
<=3 opak. pro každou konc.
P., process.
Jonckheerův test sestupného trendu
B, Distal extremity of fin-ray.
transformace ke stabilizaci rozptylu?
Actinotrichia (Act.) are on the tip.
Jonckheerův test sestupného trendu
Fig.3.
Vypustit kontrolní skupinu s vodou
Photograph of fish body showing the cut site when the gonad is fixed in the fixing solution other than 10 % neutral buffered formalin.
Střední hodnoty opakování nejsou normální nebo nejsou homogenní
In that case, the remaining body will be cut off between anterior region of anal fin and anal using razor (red bar), and the head side of fish body will be put into the fixing solution for gonad and the tail side of the fish body will be put into the 10 % neutral buffered formalin.
ZKOUŠKA METAMORFÓZY OBOJŽIVELNÍKŮ
Papillary processes normally appear only in adult males and are found on fin rays from the second to the seventh or eighth counting from the posterior end of the anal fin (Fig.1 and 2).
Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení č. 231 (2009).
However, processes rarely appear on the first fin ray from the posterior end of the anal fin.
Potřeba vyvinout a ověřit zkoušku schopnou zjistit chemické látky působící v systému štítné žlázy druhů obratlovců vyplývá z obavy, že úrovně chemických látek v životním prostředí mohou mít nepříznivé účinky na lidi i volně žijící živočichy.
This SOP covers the measurement of processes on the first fin ray (the fin ray number refers to the order from the posterior end of the anal fin in this SOP).
V roce 1998 zahájila OECD činnost s vysokou prioritou, a sice revizi stávajících pokynů pro zkoušení a vývoj nových pokynů pro zkoušení určených ke screeningu a zkouškám potenciálních endokrinních disruptorů.
Recommended procedures for sample collection for vitellogenin analysis
Součástí této činnosti bylo vyvinout Pokyn pro zkoušení určený pro screening chemických látek působících na systém štítné žlázy druhů obratlovců.
Care should be taken to avoid cross-contamination between VTG samples of males and females.
Bylo navrženo rozšíření Studie orální toxicity u hlodavců s opakovaným podáváním dávky v 28denním cyklu (kapitola B.7 této přílohy) a Zkouška metamorfózy obojživelníků (AMA).
Procedure 1A:
Rozšířená zkušební metoda B.7 prošla validací a revidovaná zkušební metoda byla vydána.
Fathead Minnow, Blood Collection from the Caudal Vein/Artery
Zkouška metamorfózy obojživelníků (AMA) prošla rozsáhlým validačním programem, který zahrnoval vnitrolaboratotní i mezilaboratorní studie prokazující vhodnost a spolehlivost této zkoušky (1)(2).
After anaesthetisation, the caudal peduncle is partially severed with a scalpel blade and blood is collected from the caudal vein/artery with a heparinised microhematocrit capillary tube.
Následně byla validace zkoušky podrobena hloubkovému hodnocení, které provedla komise složená z nezávislých odborníků (3).
After the blood has been collected, the plasma is quickly isolated by centrifugation for 3 min at 15000 g (or alternatively for 10 min. at 15000 g at 4 °C).
Tato zkušební metoda je výsledkem zkušeností získaných v průběhu validačních studií se zjišťováním chemických látek ovlivňujících činnost štítné žlázy a práce provedené jinde v členských zemích OECD.
If desired, percent hematocrit can be determined following centrifugation.
Zkouška metamorfózy obojživelníků (AMA) je screeningová zkouška sloužící k empirickému zjištění chemických látek, které mohou narušovat normální funkci osy hypotalamus-hypofýza-štítná žláza (HPT).
The plasma portion is then removed from the microhematocrit tube and stored in a centrifuge tube with 0,13 units of aprotinin (a protease inhibitor) at – 80 °C until determination of vitellogenin can be made.
Zkouška metamorfózy obojživelníků představuje zobecněný model obratlovců do té míry, do jaké je založena na zachovaných strukturách a funkcích osy hypotalamus-hypofýza-štítná žláza (HPT).
Depending on the size of the fathead minnow (which is sex-dependent), collectable plasma volumes generally range from 5 to 60 microlitres per fish (Jensen et al.
Je to důležitá zkouška, protože metamorfóza obojživelníků je dobře popsaný proces závislý na funkci štítné žlázy, který reaguje na chemické látky působící v ose hypotalamus-hypofýza-štítná žláza, a je to jediná stávající zkouška, která zjišťuje činnost štítné žlázy u živočichů procházejících morfologickým vývojem.
2001).
Celkové experimentální uspořádání zahrnuje expozici pulců Xenopus laevis ve stadiu 51 nejméně třem různým koncentracím zkoušené chemické látky a kontrolní experiment s ředicí vodou po dobu 21 dnů.
Procedure 1B:
Každá zkušební expozice má čtyři opakování.
Fathead Minnow, Blood Collection from Heart
Hustota larev na začátku zkoušky je 20 pulců v každé zkušební nádrži pro každou exponovanou skupinu.
Alternatively, blood may also be collected by cardiac puncture using a heparinized syringe (1000 units of heparin per ml).
Sledovanými ukazateli jsou délka zadní končetiny, délka těla od tlamy po kloaku (SVL), stadium vývoje, hmotnost ve vlhkém stavu, histologie štítné žlázy a každodenní pozorování mortality.
The blood is transferred into Eppendorf tubes (held on ice) and then centrifuged (5 min, 7000 g, room temperature).
Zkušební druh
The plasma should be transferred into clean Eppendorf tubes (in aliquots if the volume of plasma makes this feasible) and promptly frozen at – 80 °C, until analyzed (Panter et al., 1998).
Xenopus laevis se běžně kultivuje v laboratořích celého světa a lze jej jednoduše získat prostřednictvím komerčních dodavatelů.
Procedure 2A:
Reprodukci u tohoto druhu lze snadno vyvolat po celý rok dodáním lidského choriového gonadotropinu (hCG) a výsledné larvy lze běžně odchovat do zvolených stadií vývoje ve velkých počtech, což umožňuje používat protokoly o zkoušce specifické pro každé stadium.
Japanese Medaka, Excision of the Liver in Medaka
Upřednostňuje se, aby larvy použité ve zkoušce pocházely od domácích dospělých jedinců.
Removal of the test fish from the test chamber
Jako alternativu, i když se tento postup neupřednostňuje, lze do laboratoře provádějící zkoušku dodat vajíčka nebo embrya a nechat je aklimatizovat;
Test fish should be removed from the test chamber using the small spoon-net.
dodávka vývojových stadií larvy pro použití ve zkoušce je nepřijatelná.
Be careful not to drop the test fish into other test chambers.
Vybavení a potřeby
In principle, the test fish should be removed in the following order:
Pro provedení této zkoušky je potřebné toto vybavení a tyto potřeby:
control, solvent control (where appropriate), lowest concentration, middle concentration, highest concentration and positive control.
systém expozice (viz popis níže);
In addition, all males should be removed from one test chamber before the remaining females are removed.
akvária skleněná nebo z nerezové oceli (viz popis níže);
The sex of each test fish is identified on the basis of external secondary sex characteristics (e.g. the shape of the anal fin).
chovné nádrže;
Place the test fish in a container for transport and carry it to the workstation for excision of the liver.
zařízení řídící teplotu (např. ohřívače nebo chladiče (nastavitelné na 22° ± 1 °C));
Check the labels of the test chamber and the transport container for accuracy and to confirm that the number of fish that have been removed from the test chamber and that the number of fish remaining in the test chamber are consistent with expectation.
teploměr;
If the sex cannot be identified by the fish's external appearance, remove all fish from the test chamber.
binokulární preparační mikroskop;
In this case, the sex should be identified by observing the gonad or secondary sex characteristics under a stereoscopic microscope.
digitální fotoaparát s rozlišením minimálně 4 megapixelů a s mikro funkcí;
Excision of the liver
počítačový software pro digitalizací snímků;
Transfer the test fish from the container for transport to the anaesthetic solution using the small spoon-net.
Petriho miska (např. 100 × 15 mm) nebo průhledná plastová komora srovnatelné velikosti;
After the test fish is anaesthetised, transfer the test fish on the filter paper (or a paper towel) using tweezers (commodity type).
analytické váhy s přesností měření na tři desetinná místa (v mg);
When grasping the test fish, apply the tweezers to the sides of the head to prevent breaking the tail.
oximetr;
Wipe the water on the surface of the test fish on the filter paper (or the paper towel).
pH-metr;
Then make a small transverse incision partway between the ventral neck region and the mid-abdominal region using dissection scissors.
luxmetr (měřič intenzity osvětlení) s přesností měření na jednotky luxů;
Insert the dissection scissors into the small incision, and incise the abdomen from a point caudal to the branchial mantle to the cranial side of the anus along the midline of the abdomen.
různé laboratorní sklo a nástroje;
Be careful not to insert the dissection scissors too deeply so as to avoid damaging the liver and gonad.
nastavitelné pipety (10 až 5000 μl) nebo sada pipet odpovídajících velikostí;
Conduct the following operations under the stereoscopic microscope.
zkoušená chemická látka v množství dostatečném pro provedení zkoušky, pokud možno z jedné šarže;
Place the test fish abdomen side up on the paper towel (glass Petri dish or slide glass are also available).
analytické pomůcky vhodné pro zkoušenou chemickou látku nebo smluvně zajištěné analytické služby.
Extend the walls of the abdominal cavity with precision tweezers and exteriorise the internal organs.
Chemická testovatelnost
It is also acceptable to exteriorise the internal organs by removing one side of the wall of the abdominal cavity if necessary.
Zkouška metamorfózy obojživelníků je založena na protokolu expozice ve vodním prostředí, přičemž zkoušená chemická látka se do zkušebních komor zavádí průtokovým systémem.
Expose the connected portion of the liver and gallbladder using another pair of precision tweezers.
Průtokové metody však představují omezení, pokud jde o typy chemických látek, které lze zkoušet, vyplývající z fyzikálně-chemických vlastností dané chemické látky.
Then grasp the bile duct and cut off the gallbladder.
Před použitím tohoto protokolu by proto měly být získány základní informace o chemické látce, které jsou důležité pro určení testovatelnosti, a mělo by se nahlédnout do Metodického dokumentu OECD ke zkouškám toxicity složitých látek a směsí pro vodní organismy (4).
Be careful not to break the gallbladder.
To, že daná chemická látka může být obtížně testovatelná ve vodním prostředí, naznačují mimo jiné tyto vlastnosti:
Grasp the oesophagus and excise the gastrointestinal tract from the liver in the same way.
vysoký rozdělovací koeficient oktanol/voda (log Kow), vysoká těkavost, citlivost k hydrolýze a citlivost k fotolýze v podmínkách okolního laboratorního osvětlení.
Be careful not to leak the contents of the gastrointestinal tract.
Pro stanovení toho, zda je látka testovatelná, mají význam i další faktory, které by měly být určeny v každém jednotlivém případě.
Excise the caudal gastrointestinal tract from the anus and remove the tract from the abdominal cavity.
Jestliže danou chemickou látku není možné úspěšně zkoušet v průtokovém zkušebním systému, lze použít statický systém s obnovováním média.
Trim the mass of fat and other tissues from the periphery of the liver.
Pokud zkoušené chemické látce nevyhovuje žádný z obou uvedených systémů, obvyklým postupem je, nezkoušet ji podle tohoto protokolu.
Be careful not to scratch the liver.
Systém expozice
Grasp the hepatic portal area using the precision tweezers and remove the liver from the abdominal cavity.
Upřednostňuje se pokud možno průtokový ředicí systém před statickým systémem s obnovováním média.
Place the liver on the slide glass.
Pokud fyzikální a/nebo chemické vlastnosti jakékoli zkoušené chemické látky nejsou vhodné pro použití průtokového ředicího systému, může být použit alternativní systém expozice (např. statický systém s obnovováním média).
Using the precision tweezers, remove any additional fat and extraneous tissue (e.g., abdominal lining), if needed, from the surface of the liver.
Složky systému, které přicházejí do styku s vodou, by měly být vyrobeny ze skla, nerezové oceli a/nebo polytetrafluorethylenu (PTFE).
Measure the liver weight with 1.5 ml microtube as a tare using an electronic analytical balance.
Mohou však být využity i vhodné plasty, pokud nezpochybní studii.
Record the value on the worksheet (read: 0,1 mg).
Jako expoziční nádrže by měla sloužit akvária ze skla nebo nerezové oceli vybavená trubicovými stavoznaky, které pomáhají udržovat přibližný objem nádržky mezi 4,0 a 10,0 l a minimální hloubku vody 10 až 15 cm.
Confirm the identification information on the microtube label.
Systém by měl být schopen podporovat všechny zkušební koncentrace a kontrolní měření, se čtyřmi opakováními při každé expozici.
Close the cap of the microtube containing the liver.
Průtoková rychlost by měla být u všech nádob stejná a neměnná, jednak kvůli zachování biologických podmínek, jednak kvůli expozici chemické látce (např. 25 ml/min).
Store it in a cooling rack (or ice rack).
Expoziční nádrže by k určité pozici v systému expozice měly být přiřazeny náhodně, aby se snížily potenciální poziční vlivy, včetně mírných rozdílů v teplotě, intenzitě osvětlení apod. Mělo by být použito fluoroscenční osvětlení zajišťující fotoperiodu 12 hodin světla:
Following the excision of one liver, clean the dissection instruments or replace them with clean ones.
12 hodin tmy při intenzitě osvětlení mezi 600 a 2000 luxy (lumen/m2) na povrchu vody.
Remove livers from all of the fish in the transport container as described above.
Teplotu vody je třeba udržovat na 22° ± 1 °C, hodnotu pH mezi 6,5 a 8,5 a koncentraci rozpuštěného kyslíku (DO) > 3,5 mg/l (> 40 % nasycení vzduchem) v každé zkušební nádrži.
After the livers have been excised from all of the fish in the transport container (i.e., all males or females in a test chamber), place all liver specimens in a tube rack with a label for identification and store it in a freezer.
Teplota vody, hodnota pH a rozpuštěný kyslík by měly být měřeny minimálně jednou za týden;
When the livers are donated for pre-treatment shortly after the excision, the specimens are carried to the next workstation in a cooling rack (or ice rack).
alespoň v jedné zkušební nádobě by se teplota měla pokud možno měřit průběžně.
Following liver excision, the fish carcass is available for measurement of secondary sex characteristics.
Podmínky, za kterých by tento protokol měl být prováděn, jsou nastíněny v dodatku 1.
Specimen
Pro další informace o nastavení průtokových systémů expozice a/nebo statických systémů s obnovováním média se odkazuje na publikaci Standard Guide for Conducting Acute Toxicity Tests on Test Materials with Fishes, Macroinvertebrates, and Amphibians (5), vydanou Americkou společností pro zkoušení a materiály (ASTM), a obecné toxikologické zkoušky ve vodním prostředí.
Store the liver specimens taken from the test fish at ≤ – 70 °C if they are not used for the pre-treatment shortly after the excision.
Kvalita vody
A cut is made just anterior to pectoral fins with scissors.
Použít lze jakoukoli vodu, která je místně dostupná (např. pramenitou vodu nebo vodu z kohoutku filtrovanou přes aktivní uhlí) a umožňuje normální růst a vývoj pulců X. laevis.
Figure 2
Jelikož kvalita místní vody se může v různých oblastech podstatně lišit, je třeba provést analýzu kvality vody, zejména pokud nejsou dostupné historické údaje o používání této vody pro chov druhu Xenopus.
The midline of abdomen is incised with scissors to a point approximately 2 mm cranial to the anus.
Zvláštní pozornost je třeba věnovat tomu, aby voda neobsahovala měď, chlor a chloraminy, které všechny jsou pro žáby a pulce toxické.
Figure 3
Dále se doporučuje analyzovat vodu na koncentraci fluoridů, chloristanů a chlorečnanů (vedlejší produkty dezinfekce pitné vody) v pozadí, neboť všechny tyto anionty jsou substráty transportního systému jódu ze štítné žlázy a zvýšená úroveň každého z těchto aniontů může zkreslit výsledek studie.
The abdominal walls are spread with forceps for exposure of the liver and other internal organs.
Analýzu je třeba provést před zahájením zkoušení a zkušební voda by obvykle neměla tyto anionty obsahovat.
(Alternatively, the abdominal walls may be pinned laterally).
Koncentrace jódu ve zkušební vodě
Figure 4
K tomu, aby mohla štítná žláza syntetizovat thyroidální hormony, musí mít larvy k dispozici dostatek jodidu podávaného současně vodou i potravou.
The liver is bluntly dissected and excised using forceps.
V současnosti neexistují žádné empiricky podložené pokyny ohledně minimální koncentrace jodidu.
Figure 5
Dostupnost jodidu však může ovlivnit schopnost tyreoidálního systému reagovat na činitele ovlivňující činnost štítné žlázy, a jak známo, moduluje bazální aktivitu štítné žlázy, což je aspekt, který zasluhuje pozornost při interpretaci výsledků provedené histopatologie štítné žlázy.
The intestines are gently retracted using forceps.
Proto je třeba zaznamenávat koncentrace jodidu ve zkušební vodě.
Testis 6
Na základě dostupných údajů validačních studií bylo prokázáno, že se tento protokol dobře osvědčil při koncentraci jodidu (I), která se ve zkušební vodě pohybovala mezi 0,5 a 10 μg/l.
Both ends of the intestines and any mesenteric attachments are severed using scissors.
Optimální hodnota minimální koncentrace jodidu ve zkušební vodě by měla činit 0,5 μg/l.
Testis 7 (female)
Pokud je zkušební voda rekonstituována z deionizované vody, měl by se přidat jód v minimální koncentraci 0,5 μg/l.
The procedure is identical for the female.
Jakékoli další doplnění jódu nebo jeho solí do zkušební vody je třeba uvést ve zprávě.
Testis 8
Chov zvířat
The completed procedure.
Péče o dospělé jedince a množení
Procedure 2 B:
Péče o dospělé jedince a množení se provádí v souladu se standardními pokyny a čtenář se odkazuje na standardní příručku pro provádění zkoušky teratogeneze embryí žab (FETAX) (6), kde získá podrobnější informace.
Japanese Medaka (Oryzias latipes), Liver Pre-treatment for Vitellogenin Analysis
Tyto standardní pokyny poskytují příklad vhodných metod péče a množení, avšak jejich striktní dodržování se nevyžaduje.
Take the bottle of homogenate buffer from the ELISA kit and cool it with crushed ice (temperature of the solution: ≤ 4 °C).
Množení se provádí tak, že se párům (3–5) dospělých samiček a samečků vstřikuje lidský choriogonadotropin (hCG).
If homogenate buffer from EnBio ELISA system is used, thaw the solution at room temperature, and then cool the bottle with crushed ice.
Samičkám ve vzorku se vstříkne přibližně 800–1000 IU a samečkům 600–800 IU hCG rozpuštěných v 0,6–0,9 % solném roztoku.
Calculate the volume of homogenate buffer for the liver on the basis of its weight (add 50 μl of homogenate buffer per mg liver weight for homogenate).
Chovné páry jsou drženy ve velkých nádržích, v klidu a ve statických podmínkách, aby se podpořil amplexus.
For example, if the weight of the liver is 4,5 mg, the volume of homogenate buffer for the liver is 225 μl.
Na dně každé množicí nádrže by mělo být nepravé dno z nerezové oceli nebo plastového pletiva, které umožní propadnutí shluků vajíček na dno nádrže.
Prepare a list of the volume of homogenate buffer for all livers.
Žáby, kterým se vstříkne hCG pozdě odpoledne, obvykle nakladou většinu vajíček do druhého dne dopoledne.
Preparation of the liver for pre-treatment
Po uvolnění a oplodnění dostatečného množství vajíček by dospělí jedinci měli být z množicích nádrží odstraněni.
Take the 1,5 ml microtube containing the liver from the freezer just before the pre-treatment.
Po odstranění dospělých jedinců z množicích nádrží se odeberou vajíčka a zhodnotí se jejich životaschopnost na reprezentativním podsouboru embryí ze všech chovných nádrží.
In addition, the pre-treatment for test groups should be conducted in the following order:
Všechny organismy použité ve studii by měly pocházet z jednoho tření (tj. snůšky by se neměly mísit navzájem).
Arrange the 1,5 ml microtubes containing liver samples in the order of specimen number on the ice rack (no need to thaw the liver).
Embrya se přenesou na velkou plochou pánev nebo mísu a všechna očividně mrtvá nebo nenormální vajíčka (viz definice v (5)) se pipetou nebo kapátkem odstraní.
Operation of the pre-treatment
Zdravá embrya z každé ze tří snůšek se přenesou do tří oddělených líhní.
Addition of the homogenization buffer
Po čtyřech dnech od umístění do líhní se vybere nejlepší snůška na základě životaschopnosti a úspěšného vylíhnutí a larvy se přemístí do vhodného počtu chovných nádrží s teplotou vody 22° ± 1 °C.
Check the list for the volume of the homogenate buffer to be used for a particular sample of liver and adjust the micropipette (volume range: 100-1000 μl) to the appropriate volume.
Kromě toho se některé další larvy přemístí do samostatných nádrží jako rezerva pro případ, že během prvního týdne dojde v chovných nádržích k úhynu.
Attach a clean tip to the micropipette.
Tento postup zachovává jednotnou hustotu organismů, a snižuje tak vývojové rozdíly v rámci kohorty jedné snůšky.
Take the homogenate buffer from the reagent bottle and add the buffer to the 1,5 ml microtube containing the liver.
Všechny chovné nádrže je třeba denně čistit odsátím.
Add the homogenate buffer to all of 1,5 ml microtubes containing the liver according to the procedure described above.