natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Po vylíhnutí by koljušky již neměly být methylenové modři vystaveny, systém by proto ode dne 6 zkoušky neměl methylenovou modř již obsahovat.
Is solvent used?
Jikry se denně kontrolují a veškeré uhynulé nebo neoplodněné jikry se jako takové zaznamenají.
Appendix 9
Jikry by až do vylíhnutí nikdy neměly opustit vodu, a to ani na sebekratší dobu.
Guidance for tissue sampling for genetic sex determination and for genetic sex determination by PCR-method
Hankův pufrovaný solný roztok (HBSS):HBSS je potřebný pro zachování spermatu v době, kdy se připravuje k oplodnění.
Tissue sampling, preparation and storage before determination of genetic sex by PCR-method in medaka (Prepared by the Laboratory for Aquatic Organisms of Bayer CropScience AG)
C.42 BIOLOGICKÁ ROZLOŽITELNOST V MOŘSKÉ VODĚ
With fine scissors the anal or the dorsal fin will be cut off in each individual fish and placed into a tube filled with 100 μl of extraction-buffer 1 (details on buffer preparation see below).
VŠEOBECNÝ ÚVOD
The scissors will be cleaned after each single fish in a beaker filled up with distilled H2O and dried with a paper tissue.
Tato zkušební metoda je rovnocenná Pokynu OECD pro zkoušení č. 306 (1992).
Now the fin-tissues will be homogenised by a micro tube teflon pistil for the lysis of cells.
Když byly vyvíjeny původní zkušební metody, nebylo známo, do jaké míry lze výsledky screeningových zkoušek týkajících se snadné biologické rozložitelnosti za použití sladké vody, splaškových vod nebo aktivovaného odpadu jako inokula uplatnit na mořské prostředí.
For each tube a new pistil will be used to prevent any contaminations.
K této otázce byly uváděny různé výsledky (např. (1)).
The pistils will be placed overnight in 0,5 M NaOH, rinse for 5 minutes in distilled H2O and stored in ethanol or sterile after autoclave until use.
Mnohé průmyslové odpadní vody, obsahující řadu chemických látek, se dostanou do moře buď přímým vypuštěním, nebo prostřednictvím výtoků a ústí řek, v nichž je doba zdržení krátká v porovnání s obdobím potřebným pro úplné biologické rozložení mnoha chemických látek, které jsou zde přítomny.
It is also possible to store the fin tissue without any extraction-buffer 1 on dry-ice and then at – 80 °C refrigerator to prevent any degeneration of the DNA.
Vzhledem k rostoucímu povědomí o tom, že je třeba chránit mořské prostředí proti rostoucí zátěži, již chemické látky způsobují, a odhadnout pravděpodobnou koncentraci chemických látek v moři, byly vyvinuty zkušební metody pro zkoušky biologické rozložitelnosti v mořské vodě.
But the extraction runs better, if you extract the DNA at the same time (handling see above; samples should be thawed on ice after storaging at – 80 °C before the buffer will be filled in the tubes).
Metody zde popsané využívají přírodní mořské vody jako vodní fáze i jako zdroje mikroorganismů.
After homogenizing all tubes will be placed in a water bath and boiled for 15 minutes at 100 °C.
Ve snaze splnit požadavky metod pro snadnou biologickou rozložitelnost ve sladké vodě bylo zkoumáno použití vysoce filtrované a odstředěné mořské vody a rovněž užití mořských sedimentů jako inokula.
Then 100 μl of the extraction buffer 2 (details on buffer preparation see below) will be pipetted into each tube.
Tato šetření nebyla úspěšná.
The samples will be stored at room temperature for 15 minutes and in the meantime they will be sometimes gently shaken by hand.
Zkušebním médiem je proto přírodní mořská voda upravená tak, aby se odstranily hrubé částice.
Afterwards all tubes will be placed in the water bath again and boiled for another 15 minutes at 100 °C.
Aby bylo možné posoudit konečnou biologickou rozložitelnost metodou třepací lahve, musí se použít poměrně vysoké koncentrace zkoušené látky vzhledem k nízké citlivosti analytické metody rozpuštěného organického uhlíku (DOC).
Until further analysis the tubes will be frozen at – 20 °C.
To na druhé straně vyžaduje, aby byly do mořské vody přidány minerální živiny (N a P), jejichž nízké koncentrace by jinak odstraňování DOC omezily.
Buffer preparation
Tyto živiny je z důvodu koncentrace přidané zkoušené látky nezbytné přidat také při použití metody uzavřených lahviček.
PCR-buffer 1:
Tyto metody tudíž nejsou zkouškami snadné biologické rozložitelnosti, jelikož se nepřidává žádné inokulum kromě mikroorganismů, které jsou v mořské vodě již přítomny.
500 mg N-Lauroylsarcosine (e.g. Merck KGaA, Darmstadt, GE)
Tyto zkoušky rovněž nesimulují mořské prostředí, protože se přidávají živiny a koncentrace zkoušených látek je mnohem vyšší, než v jaké by byly přítomny v moři.
ad 100 ml dest.
Z těchto důvodů se tyto metody navrhují v rámci nového pododdílu ‚Biologická rozložitelnost v mořské vodě‘.
→ autoclave
UPLATNĚNÍ
PCR-buffer 2:
Výsledky zkoušek aplikované s ohledem na způsob použití a likvidace příslušné látky, u níž se ukáže, že se dostává do moře, dávají první představu o biologické rozložitelnosti v mořské vodě.
20 g Chelex (e.g. Biorad, Munich, GE)
Je-li výsledek pozitivní (odstranění DOC > 70 %; teoretická spotřeba kyslíku (TSK) > 60 %), lze učinit závěr, že existuje potenciál pro biologickou rozložitelnost v mořském prostředí.
To swell in 100 ml dest.
Ani negativní výsledek takový potenciál nevylučuje, naznačuje však, že je nezbytné další studium, např. s použitím co nejnižší koncentrace zkoušené látky.
Determination of genetic sex (by PCR-method) in medaka (Prepared by the Laboratory for Aquatic Organisms of Bayer CropScience AG and Universität Würzburg Biozentrum)
V každém případě platí, že požaduje-li se stanovení míry nebo stupně biologického rozkladu v mořské vodě v té či oné lokalitě v konkrétnějších hodnotách, budou zřejmě muset být použity jiné, složitější a propracovanější, a tudíž i nákladnější metody.
The prepared and frozen tubes (described in the above section) will be thawed on ice.
Například by bylo možné provést simulační zkoušku s koncentrací zkoušené látky, která se více přibližuje pravděpodobné koncentraci v životním prostředí.
After that, they will be centrifuged using an Eppendorf centrifuge (30 sec at max. speed, at room temperature).
Bylo by rovněž možné použít neobohacenou, neupravenou mořskou vodu ze zájmové lokality a na primární biologický rozklad by mohla navázat specifická chemická analýza.
For the PCR, the clear supernatant separated from the precipitate will be used.
Pro úplnou biologickou rozložitelnost by byly zapotřebí látky značené 14C, aby bylo možné měřit míry vymizení rozpustného organického 14C a produkce 14CO2 v koncentracích reálných v životním prostředí.
It has absolutely to be avoided that any traces of Chelex (localized in the precipitate) are transferred to the PCR reaction, because this will interfere with the “Taq”-polymerase activity.
VOLBA METOD
The supernatant will be used directly or can be stored frozen (at – 20 °C) and rethawed again in several cycles without negative impact on the DNA for later analyses.
Výběr metody, která má být použita, závisí na řadě faktorů;
Preparation of the “Reaction Mix” (25 μl per sample):
jako pomůcka při výběru poslouží následující tabulka.
Volume
Látky s rozpustností ve vodě nižší, než je ekvivalent přibližně 5 mg C/l, není možné zkoušet metodou třepací lahve, avšak špatně rozpustné látky v zásadě lze testovat metodou uzavřených lahviček.
Final Concentration
Tabulka
Template DNA
Výhody a nevýhody zkoušky s třepací lahví a zkoušky v uzavřených lahvičkách
0,5μl-2μl
METODA
buffer with MgCl2
VÝHODY
2,5μl
NEVÝHODY
Nucleotides (each of dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
TŘEPACÍ LAHEV
Forward Primer (10μM) (see below 3-5)
jednoduchá aparatura s výjimkou analyzátoru C
0,5μl
doba trvání 60 d není problémem
Reverse Primer (10μM) (see below 3-5)
žádný vliv nitrifikace
Water (PCR grade)
lze přizpůsobit pro těkavé látky
up to 25μl
vyžaduje analyzátor C
Taq E- Polymerase
používá se 5–40 mg DOC/l, může být inhibující
0,3μl
stanovení DOC je obtížné při nízkých koncentracích v mořské vodě (vliv chloridů)
buffer with MgCl2:
DOC v mořské vodě je někdy vysoký
Tris/HCl (pH8,8 at 25 °C), 160mM (NH4)2SO4, 25mM MgCl2, 0,1 %Tween 20
UZAVŘENÉ LAHVIČKY
For each PCR (see below 3-5) the special primer as a new combination of “Reaction-Mix” and the adequate needed amount of template DNA for each sample (see above) is needed.
jednoduchá aparatura
The respective volumes will be transferred into new tubes using pipettes.
jednoduché konečné stanovení
After that all tubes will be closed, stirred (ca.
užívá se nízkých koncentrací zkušebních látek (2 mg/l), tudíž menší pravděpodobnost inhibice
10 sec) and centrifuged (10 sec, at room temperature).
lze snadno přizpůsobit pro těkavé látky
Now the respective PCR-programmes can be started.
může být obtížné zachovat vzduchotěsnost lahviček
Additionally a positive control (exemplary DNA sample with known activity and clear results) and a negative control (1 μl dest.
růst bakterií na stěnách může vést k nesprávným hodnotám
H2O) will be used in each PCR-programme.
hodnoty příjmu O2 v slepých zkouškách mohou být vysoké, zejména po 28 dnech;
Preparation of the agarose gel (1 %) — During running PCR-programmes:
to lze vyřešit odstátím mořské vody
Solve 3 g agarose in 300 ml 1 × TAE-buffer (1 % agarose gel)
možný vliv příjmu O2 v důsledku nitrifikace
This solution should be boiled using an microwave (ca.
METODA TŘEPACÍ LAHVE
2-3 min)
Tato metoda je variantou modifikované screeningové zkoušky OECD, která je popsána v kapitole C.4–B této přílohy (2), prováděnou v mořské vodě.
Transfer the hot solution into a special casting box, which lies on ice
Byla dokončena jako výsledek mezilaboratorní porovnávací zkoušky, kterou pro Evropskou komisi (EK) zorganizoval dánský Institut pro kvalitu vody (3).
After ca.
Zlepší-li se meze citlivosti analýz organického uhlíku, může být výhodné použití nižších koncentrací zkoušené látky, zejména v případě inhibujících látek.
Actin-PCR-programme:
V případech, kdy je cílem studie simulovat situace v životním prostředí, mohou být prováděny i zkoušky mimo toto obvyklé teplotní rozmezí.
Special primer:
Doporučené maximální trvání zkoušky je přibližně 60 dnů.
“Mact1(upper/forward)” → TTC AAC AGC CCT GCC ATG TA
Musí být stanoven obsah organického uhlíku v látce, její těkavost musí být taková, aby v průběhu zkoušky nedocházelo k významným ztrátám, a její rozpustnost ve vodě by měla být větší než ekvivalent 25–40 mg C/l.
Cycle (35-times):
Pro volbu vhodných zkušebních koncentrací mohou být užitečné informace o toxicitě zkoušené látky pro bakterie, například o toxicitě naměřené při krátkodobých testech rychlosti dýchání (4); tyto informace mohou být důležité pro správnou interpretaci nízkých hodnot biologického rozkladu.
Annealing
Takové informace však nemusí být vždy dostatečné pro interpretaci výsledků získaných ve zkoušce biologické rozložitelnosti a vhodnější je postup popsaný v odstavci 18.
→ 45 sec at 56 °C
Za tímto účelem lze použit látky jako např. benzoan sodný, octan sodný nebo anilin.
→ 1 min at 68 °C
U anilinu se tL pohybovala od 0 do 10 dnů a t50 od 1 do 10 dnů.
The samples with intact DNA will be used in this PCR-programme to detect the X- and Y-Genes.
REPRODUKOVATELNOST A CITLIVOST METODY
Male DNA should show one double-band and female DNA should show one single band (after staining and gel-electrophoresis).
Reprodukovatelnost této metody byla stanovena mezilaboratorní porovnávací zkouškou (3).
For this programme-run one positive control for males (XY-sample) and one for females (XX-sample) should be included.
Koncentrace DOC v pozadí by neměla být větší než přibližně 20 % celkové koncentrace DOC po přidání zkoušené látky.
“PG 17,6” (lower/reverse) → GAT CGT CCC TCC ACA GAG AAG AGA
Je-li tato metoda použita pouze při specifické chemické analýze (při které se měří primární rozklad), musí experimentátor s uvedením doplňujících informací zdokumentovat, zda lze očekávat úplnou rozložitelnost.
→ 45 sec at 55 °C
Běžné laboratorní vybavení a dále:
Y-Gene-PCR-programme as “control” for X- and Y-Gene-PCR-programme:
a. třepačka upravená pro umístění Erlenmeyerových baněk o objemu 0,5–2 litrů, buď s automatickou regulací teploty, nebo používaná v prostoru s konstantní teplotou 15–20 °C udržovanou s tolerancí ± 2 °C;
This PCR-programme verifies the results of the “X- and Y-Gene-PCR-programme”.
b.
The “male-samples” should show one band and the “female-samples” shouldn't show any band (after staining and gel-electrophoresis).
Erlenmeyerovy baňky o objemu 0,5–2 litrů s úzkým hrdlem;
“DMTYa (upper/forward)” → GGC CGG GTC CCC GGG TG
c. membránový filtrační přístroj nebo odstředivka;
“DMTYd (lower/reverse)” → TTT GGG TGA ACT CAC ATG G
d. membránové filtry, velikost pórů 0,2–0,45 μm;
Staining of the PCR-samples:
e. analyzátor uhlíku;
Staining solution:
f. vybavení pro specifickou analýzu (volitelné).
50 % Glycerol
Mořská voda
0,25 % Bromphenolblue
Do důkladně vyčištěného zásobníku se odebere vzorek mořské vody a dopraví se do laboratoře, pokud možno během jednoho nebo dvou dnů po odběru.
0,25 % Xylenecyanol
Během dopravy nesmí dojít k tomu, aby teplota vzorku byla výrazně vyšší než teplota, která bude použita při zkoušce.
Pipette 1 μl of the staining solution into each single tube
Přesně se identifikuje lokalita odběru vzorků a popíše se její stav znečištění a živin.
Start of the Gel-Electrophoresis:
Zejména u pobřežních vod se v této charakteristice uvede také počet kolonií heterotrofních mikroorganismů a stanovení koncentrací rozpuštěných dusičnanů, amoniaku a fosfátů.
The prepared 1 % agarose gel will be transferred into a gel-electrophoresis-chamber filled with 1 × TAE-Buffer
O samotném vzorku mořské vody se uvedou tyto informace:
10 - 15 μl of each stained PCR-sample will be pipetted into an agarose gel slot
datum odběru,
Also 5 - 15 μl of the 1kb-“Ladder”(Invitrogen) will be pipetted into a separate slot
hloubka odběru,
Start the electrophoresis by 200 V
vzhled vzorku – zakalený atd.,
Stop after 30-45 min
teplota v době odběru,
Determination of the bands:
salinita,
Clean the agarose gel in distilled H2O
zpoždění mezi odběrem a použitím ve zkoušce.
Now transfer the agarose gel into Ethidium bromide for 15 - 30 min
Zjistí-li se, že obsah DOC ve vzorku mořské vody je příliš vysoký (odstavec 8), doporučuje se nechat mořskou vodu přibližně jeden týden před použitím odstát.
After that, a picture of the agarose gel should be taken in an UV-light-box
To se děje za umístění v aerobních podmínkách při zkušební teplotě, v temnu nebo v rozptýleném světle.
Finally the samples are analysed in comparison to the positive control-band (or bands) and the ladder
Je-li to nezbytné, aerobní podmínky se udržují jemným provzdušňováním.
Appendix 10
Během odstátí se sníží obsah snadno rozložitelného organického materiálu.
Guidance on tissue sampling for genetic sex determination by PCR method in the three-spined stickleback
Při mezilaboratorní porovnávací zkoušce (3) nebyl zjištěn žádný rozdíl mezi potenciálem rozkladu vzorků odstáté mořské vody a nově odebrané mořské vody.
Tissue sampling and DNA extraction
Před použitím se mořská voda upraví tak, aby se odstranily hrubé částice, např. filtrací přes nylonový filtr nebo přes hrubý papírový filtr (nikoli membránový nebo GF/C filtr), případně sedimentací a dekantací.
DNA can be extracted using a variety of commercially available reagents and both manual and automated extraction systems.
Užitý postup musí být zaznamenán.
The protocol used at the Cefas Weymouth laboratory is outlined below, and the alternative approaches have been added where appropriate.
Případná předúprava se provede po odstátí.
With fine scissors, a small piece of tissue (10-20 mg) from the dorsolateral area (after removing the head and tail for VTG analysis), is removed from each individual fish.
Zásobní roztoky pro minerální živné médium
The tissue is added into a tube and either placed directly in liquid nitrogen (for storage at – 80 °C) or filled with 70 % ethanol (for transport and subsequent storage at 4 °C).
Za použití reakčních činidel čistoty p.a. se připraví tyto zásobní roztoky:
The scissors are cleaned after each single fish in 70 % ethanol then in distilled water and dried with tissue paper.
dihydrogenfosforečnan draselný, KH2PO4
The ethanol (if present) is removed by aspiration and the tissue is digested overnight with proteinase K in 400 μl of ATL buffer (Qiagen).
Hydrogenfosforečnan didraselný, K2HPO4
An aliquot (200 μl) of the digest is transferred to a 96-well S-block (Qiagen) and the DNA extracted in a 96-well format using the Qiagen Universal BioRobot and the QIamp Investigator BioRobot kit.
Dihydrát hydrogenfosforečnanu sodného, Na2HPO4 · 2H2O
The DNA is eluted in a 50 μl of DNase and RNase free water.
Chlorid amonný, NH4Cl
If using hard tissues to extract DNA (such as a spine or a pectoral fin) it may be necessary to homogenise the sample in the lysis buffer using a FastPrep® tissue lyser or equivalent tissue disruption system.
Rozpustí se a doplní na 1 litr destilovanou vodou.
Alternatively,
Chlorid vápenatý, CaCl2
the tissue is digested overnight with proteinase K in 400 μl of G2 lysis buffer (Qiagen) and DNA is extracted from 200 μl of the digest using either the EZ-1 DNA easy tissue kit and the EZ-1 biorobot or the DNA easy tissue mini kit.
Heptahydrát síranu hořečnatého, MgSO4 · 7H2O
The DNA is eluted in a 50 μl volume.
Hexahydrát chloridu železitého, FeCl3 · 6H2O
The tissues are processed using the DNAzol reagent.
Srážení v roztoku d) lze předejít přidáním jedné kapky koncentrované kyseliny chlorovodíkové nebo 0,4 g disodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA) na 1 litr.
Briefly, tissue samples are lysed in 1ml of DNAzol for 10 minutes in a 1,5 ml micro centrifuge tube and then centrifuged at 13000 rpm for 5 minutes to remove any particulate matter.
Vytvoří-li se v zásobním roztoku sraženina, nahradí se nově připraveným roztokem.
The lysed sample is then transfered to a new 1,5 ml micro centrifuge tube containing 500 μl of 100 % molecular grade ethanol and then centrifuged at 13000 rpm for 10 minutes to precipitate the DNA.
Příprava zkušebního média
The ethanol is removed and replaced with 400 μl of 70 % molecular grade ethanol, centrifuged at 13000 rpm for 5 minutes and the DNA pellet is dissolved in 50 μl molecular DNase and RNase free water.
Na litr předupravené mořské vody se přidá 1 ml každého z výše uvedených zásobních roztoků.
Again, when using the hard tissues (pectoral fin) it may be necessary to homogenise the sample in the lysis buffer using a FastPrep® tissue lyser or equivalent tissue disruption system prior to extracting the DNA.
Kromě mikroorganismů, které jsou v mořské vodě již přítomny, se žádné specifické inokulum nepřidává.
The DNA is stored at – 20 °C until required.
Určete (volitelně) počet heterotrofních organismů tvořících kolonie ve zkušebním médiu s mořskou vodou (a pokud možno také v původních vzorcích mořské vody), např. určením počtů na misce pomocí mořského agaru.
gloves must be worn during the procedures.
To je zvlášť žádoucí u vzorků z pobřežních nebo znečištěných lokalit.
Polymerase chain reaction (PCR) analysis
Zkontroluje se aktivita heterotrofních mikroorganismů v mořské vodě provedením testu s referenční látkou.
Amplifications were performed using 2,5 μl of the DNA extract in a 50 μl reaction volume using the Idh locus primers (as described by Peichel et al., 2004.
Příprava baněk
Current Biology 1:1416-1424):
Zajistěte, aby veškeré sklo bylo před použitím absolutně čisté, ne nutně sterilní (např. pomocí alkoholového roztoku kyseliny chlorovodíkové), opláchnuté a vysušené, aby nedošlo ke kontaminaci zbytky dřívějších zkoušek.
Forward primer
Baňky se před prvním použitím musí také vyčistit.
Reverse primer
Zkoušené látky se hodnotí ve dvou stejných baňkách současně, spolu s jednou baňkou pro zkoušku s referenční látkou.
There are numerous suppliers of suitable PCR reagents.
Provede se slepá zkouška ve dvou opakováních bez zkoušené a bez referenční látky s cílem stanovit analytické údaje slepých zkoušek.
The method outlined below is that currently used at the Cefas Weymouth laboratory.
Zkoušené látky se rozpustí ve zkušebním médiu – mohou být snadno přidány prostřednictvím koncentrovaného zásobního roztoku – aby se dosáhlo žádoucích výchozích koncentrací, obvykle 5–40 mg DOC/l.
Preparation of the “Reaction Mix” (50 μl per sample):
Referenční látka se testuje obvykle při výchozí koncentraci odpovídající 20 mg DOC/l.
A mastermix is prepared as follows.
Jsou-li použity zásobní roztoky zkoušené a/nebo referenční látky, zajistí se, aby se u média s mořskou vodou výrazně nezměnila salinita.
This can be prepared in advance and stored frozen at – 20 °C until required.
Pokud lze předpokládat toxické účinky nebo je nelze vyloučit, lze doporučit zařazení zkoušky na inhibici, ve dvou opakováních, do zkušebního uspořádání.
Make sufficient mastermix for a negative control (molecular biology grade water only).
Zkoušená a referenční látka se přidají do téže nádoby, přičemž koncentrace referenční látky je obvykle stejná jako při kontrolní zkoušce (tj. 20 mg DOC/l), aby se umožnilo srovnání.
Volume (stock conc.)/ sample
Přiměřené množství zkušebních roztoků se nalije do Erlenmeyerových baněk (vhodné množství je přibližně do poloviny objemu baňky) a každá baňka se poté opatří volným uzávěrem (např. hliníkovou fólii), který umožní výměnu plynů mezi baňkou a okolním ovzduším.
® Reaction Buffer
(Zátky z vaty nejsou vhodné, provádí-li se analýza DOC).
Nucleotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Nádoby se umístí do třepačky a protřepávají nepřetržitě mírným tempem (např. 100 rpm) po celou dobu zkoušky.
0,5 μl (25 mM each)
Teplota je řízena (v rozmezí 15–20 °C, s tolerancí ± 2 °C) a nádoby se chrání před světlem, aby se zamezilo růstu řas.
250 μM each
Je nutno zajistit, aby vzduch neobsahoval toxické materiály.
Forward Primer
Fyzikálně-chemická kontrolní zkouška (volitelná)
0,5μl (0,1 nmol/μl)
Existuje-li podezření na abiotický rozklad nebo jiné ztrátové mechanismy, jako je hydrolýza (problém, který vzniká pouze při specifické analýze), těkání nebo adsorpce, lze doporučit provedení fyzikálně-chemického kontrolního experimentu.
Reverse Primer
Ten lze provést tak, že do nádob se zkoušenou látkou se přidá chlorid rtuťnatý (HgCl2) [10] (v koncentraci 50–100 mg/l) k zastavení mikrobiální aktivity.
2,0μM
Významné snížení DOC nebo koncentrace konkrétní látky při fyzikálně-chemické zkoušce nasvědčuje mechanismům abiotického odstraňování.
Molecular biology grade water
(Je-li užito chloridu rtuťnatého, je třeba při analýze DOC věnovat pozornost tomu, aby nedošlo k interferencím nebo otravě katalyzátoru.)
GoTaq polymerase
Počet nasazených baněk
Dispense 47,5 μl to a labelled 0,5 ml thin walled PCR tube.
V typické zkoušce se použijí tyto baňky:
Add 2,5 μl of the purified DNA to the appropriately labelled tube.
Baňka 1 a 2 obsahující zkoušenou látku (zkušební suspenze);
Repeat for all samples and the negative control.
Baňka 3 a 4 obsahující pouze mořskou vodu (slepá zkouška);
Over lay with 2 drops of mineral oil.
Baňka 5 obsahující referenční látku (kontrolní zkouška postupu);
Alternatively, use a thermal cycler with a heated lid.
Baňka 6 obsahující zkoušenou a referenční látku (kontrola toxicity) – volitelná;
Close the lids.
Baňka 7 obsahující zkoušenou látku a sterilizační činidlo (abiotická sterilní kontrola) – volitelná.
Samples were denatured in a Peltier PTC-225 thermal cycler at 94 ± 2 °C for 5 minutes followed by 39 cycles of 94 ± 2 °C for 1 minute, 55 ± 2 °C for 1 minute, 72 ± 2 °C for 1 minute, and a final extension of 72 ± 2 °C for 10 minutes.
Analýza DOC
Preparation of the agarose gel (2 %):
V průběhu zkoušky se ve vhodných intervalech odeberou vzorky pro analýzu DOC (dodatek 1).
Traditionally the PCR products are resolved on a 20 % agarose gel containing ethidium bromide.
Vzorky je třeba vždy odebrat na počátku zkoušky (den 0) a v den 60.
Capillary based electrophoresis systems can also be used.
Pro popis průběhu rozkladu v čase se požaduje minimálně pět vzorků.
Weigh 2 g agarose in 100 ml 1 × TAE-buffer
Pro odběr vzorků nelze stanovit žádný časový harmonogram, protože rychlost biologického rozkladu se v jednotlivých případech liší.
Heat in a microwave (ca.
Stanovení DOC se provede ve dvou opakováních na každém vzorku.
2-3 min) to dissolve the agarose.