natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Pro každou chemickou látku se použije vhodná referenční kontrola k výpočtu procentuálního úbytku peptidů vyvolaného touto chemickou látkou (viz odstavec 26).
For this purpose a new prediction model based on a gravimetric approach will need to be developed.
Do série provedení by rovněž měla být pro každou zkoušenou chemickou látku, která se analyzuje, zařazena kontrola koeluce sestávající pouze ze zkoušené chemické látky, s cílem detekovat případnou koeluci zkoušené chemické látky s lysinovými nebo cysteinovými peptidy.
In cases where evidence can be demonstrated on the non-applicability of the test method to other specific categories of chemicals, the test method should not be used for those specific categories of chemicals.
Inkubace zkoušené chemické látky s roztoky cysteinových a lysinových peptidů
This test method is an in chemico method that does not encompass a metabolic system.
Roztoky cysteinových a lysinových peptidů by se měly inkubovat ve skleněných zkumavkách s automatickým dávkovačem se zkoušenou chemickou látkou v poměru 1:10 pro cysteinové a 1:50 pro lysinové peptidy.
Chemicals that require enzymatic bioactivation to exert their skin sensitisation potential (i.e. pro-haptens) cannot be detected by the test method.
Je-li ihned po přidání roztoku zkoušené chemické látky do roztoku peptidů zpozorována sraženina v důsledku nízké rozpustnosti zkoušené chemické látky ve vodě, nelze si v tomto případě být jistý, jaké množství zkoušené chemické látky zůstalo v roztoku a bude moci reagovat s peptidy.
Chemicals that become sensitisers after abiotic transformation (i.e. pre-haptens) are reported to be in some cases correctly detected by the test method (18).
Proto by v takovém případě pozitivní výsledek mohl být i přesto použit, ale negativní výsledek je nejistý a měl by být interpretován s velkou opatrností (viz též ustanovení odstavce 11 o zkoušení chemických látek, které nejsou rozpustné až do koncentrace 100 mM).
In the light of the above, negative results obtained with the test method should be interpreted in the context of the stated limitations and in the connection with other information sources within the framework of an IATA.
Před provedením analýzy HPLS by reakční roztok měl být ponechán v temnu při teplotě 25 ± 2,5 °C po dobu 24 ± 2 hodin.
Test chemicals that do not covalently bind to the peptide but promote its oxidation (i.e. cysteine dimerisation) could lead to a potential over estimation of peptide depletion, resulting in possible false positive predictions and/or assignement to a higher reactivity class (see paragraphs 29 and 30).
Každá zkoušená chemická látka by se měla analyzovat třikrát s každým z obou druhů peptidů.
As described, the DPRA supports the discrimination between skin sensitisers and non-sensitisers.
Před analýzou HPLC se musí vzorky vizuálně zkontrolovat.
However, it may also potentially contribute to the assessment of sensitising potency (11) when used in integrated approaches such as IATA.
Je-li zjištěna sraženina nebo fázová separace, lze vzorky odstředit při nízké rychlosti (100–400xg), aby se sraženina z preventivních důvodů vytlačila ke dnu zkumavky, neboť velké množství sraženiny může ucpat trubice nebo kolony HPLC.
However further work, preferably based on human data, is required to determine how DPRA results may possibly inform potency assessment.
Je-li sraženina nebo fázová separace zjištěna po inkubační době, může v případě negativního výsledku dojít k podhodnocenému odhadu a závěr o nedostatečné reaktivitě nelze učinit s dostatečnou jistotou.
The DPRA is an in chemico method which quantifies the remaining concentration of cysteine- or lysine-containing peptide following 24 hours incubation with the test chemical at 25 ± 2,5 °C.
Příprava kalibrační křivky standardů pro HPLC
The synthetic peptides contain phenylalanine to aid in the detection.
Kalibrační křivka standardů by měla být stanovena pro cysteinové i pro lysinové peptidy.
Relative peptide concentration is measured by high-performance liquid chromatography (HPLC) with gradient elution and UV detection at 220 nm.
Standardy peptidů by měly být připraveny ve 20 % nebo 25 % pufračním roztoku acetonitrilu za použití fosfátového pufru (pH 7,5) pro cysteinové peptidy a pufru octanu sodného (pH 10,2) pro lysinové peptidy.
Cysteine- and lysine peptide percent depletion values are then calculated and used in a prediction model (see paragraph 29) which allows assigning the test chemical to one of four reactivity classes used to support the discrimination between sensitisers and non-sensitisers.
S použitím standardu sériového ředění pro zásobní roztok s peptidy (0,667 mM) by se mělo připravit 6 kalibračních roztoků pokrývajících rozsah od 0,534 do 0,0167 mM.
Prior to routine use of the method described in this test method, laboratories should demonstrate technical proficiency, using the ten proficiency substances listed in Appendix 2.
Do kalibrační křivky standardů by měla být rovněž zanesena slepá zkouška s ředicím pufrem.
This test method is based on the DPRA DB-ALM protocol no 154 (20) which represents the protocol used for the EURL ECVAM-coordinated validation study.
Vhodné kalibrační křivky by měly mít r2 > 0,99.
It is recommended that this protocol is used when implementing and using the method in the laboratory.
Příprava a analýza HPLC
The following is a description of the main components and procedures for the DPRA.
Před provedením analýzy by se měla ověřit vhodnost systému HPLC.
If an alternative HPLC set-up is used, its equivalence to the validated set-up described in the DB-ALM protocol should be demonstrated (e.g. by testing the proficiency substances in Appendix 2).
Úbytek peptidů se sleduje pomocí HPLC s připojeným UV detektorem (fotodiodový detektor nebo absorpční detektor s fixní vlnovou délkou se signálem 220 nm).
Preparation of the cysteine or lysine-containing peptides
Do systému HPLC se nainstaluje vhodná kolona.
Stock solutions of cysteine (Ac-RFAACAA-COOH) and lysine (Ac-RFAAKAA-COOH) containing synthetic peptides of purity higher than 85 % and preferably in the range of 90-95 %, should be freshly prepared just before their incubation with the test chemical.
Nastavení HPLC popsané ve validační studii používá přednostně kolonu Zorbax SB-C-18 o rozměrech 2,1 mm × 100 mm × 3,5 micronu.
The final concentration of the cysteine peptide should be 0,667 mM in pH 7,5 phosphate buffer whereas the final concentration of the lysine peptide should be 0,667 mM in pH 10,2 ammonium acetate buffer.
S touto kolonou HPLC na reverzní fázi by se celý systém měl nechat před provedením analýzy nejméně po dobu 2 hodin ustálit při teplotě 30 °C s 50 % fází A (0,1 % obj. roztok kyseliny trifluoroctové ve vodě) a 50 % fází B (0,085 % obj. roztok kyseliny trifluoroctové v acetonitrilu).
The HPLC run sequence should be set up in order to keep the HPLC analysis time less than 30 hours.
Analýza HPLC by se měla provádět za průtoku 0,35 ml/min a s lineárním gradientem od 10 % do 25 % acetonitrilu za 10 minut, s následným prudkým zvýšením na 90 % acetonitrilu za účelem odstranění jiných materiálů.
For the HPLC set up used in the validation study and described in this test method, up to 26 analysis samples (which include the test chemical, the positive control and the appropriate number of solvent controls based on the number of individual solvents used in the test, each tested in triplicate), can be accommodated in a single HPLC run.
Injekcí by měly být nastříknuty stejné objemy každého standardu, vzorku a kontroly.
All of the replicates analysed in the same run should use the identical cysteine and lysine peptide stock solutions.
Kolona by se mezi injekcemi měla znovu nechat ustálit za původních podmínek po dobu 7 minut.
It is recommended to prove individual peptide batches for proper solubility prior to their use.
Použije-li se jiná kolona HPLC na reverzní fázi, bude možná nutné upravit výše popsané nastavení parametrů, aby se zajistila přiměřená eluce a integrace cysteinových a lysinových peptidů, včetně vstřikovaného objemu, který se může lišit (obvykle v rozmezí od 3 do 10 μl) podle použitého systému.
Preparation of the test chemical
Důležité je, že při použití jiného nastavení HPLC by měla být prokázána jeho rovnocennost s validovaným nastavením, které je popsáno výše (např. testováním vhodných látek uvedených v dodatku 2).
Solubility of the test chemical in an appropriate solvent should be assessed before performing the assay following the solubilisation procedure described in the DPRA DB-ALM protocol (20).
Absorbance se měří při 220 nm.
An appropriate solvent will dissolve the test chemical completely.
Je-li použit fotodiodový detektor, měla by se rovněž zaznamenávat absorbance při 258 nm.
Since in the DPRA the test chemical is incubated in large excess with either the cysteine or the lysine peptides, visual inspection of the forming of a clear solution is considered sufficient to ascertain that the test chemical (and all of its components in the case of testing a multi-constituent substance or a mixture) is dissolved.
Je třeba poznamenat, že některé dodávky acetonitrilu by mohly mít negativní dopad na stabilitu peptidů, a toto se musí posoudit při použití nové šarže acetonitrilu.
Suitable solvents are acetonitrile, water, 1:1 mixture water:acetonitrile, isopropanol, acetone or 1:1 mixture acetone:acetonitrile.
Jako ukazatel koeluce lze použít poměr plochy píků při 220 nm k ploše píků při 258 nm.
Other solvents can be used as long as they do not impact on the stability of the peptide as monitored with reference controls C (i.e. samples constituted by the peptide alone dissolved in the appropriate solvent; see Appendix 3).
Poměr v rozmezí 90 % < střední hodnota [13] poměru plochy u kontrolních vzorků < 100 % u každého vzorku by znamenal přesvědčivou známku toho, že ke koeluci nedošlo.
As a last option if the test chemical is not soluble in any of these solvents attempts should be made to solubilise it in 300 μL of DMSO and dilute the resulting solution with 2700 μL of acetonitrile and if the test chemical is not soluble in this mixture attempts should be made to solubilise the same amount of test chemical in 1500 μL of DMSO and dilute the resulting solution with 1500 μL of acetonitrile.
Mohou se vyskytnout zkoušené chemické látky, které by mohly podporovat oxidaci cysteinových peptidů.
The test chemical should be pre-weighed into glass vials and dissolved immediately before testing in an appropriate solvent to prepare a 100 mM solution.
Pík dimerizovaného cysteinového peptidu je možné sledovat vizuálně.
For mixtures and multi-constituent substances of known composition, a single purity should be determined by the sum of the proportion of its constituents (excluding water), and a single apparent molecular weight should be determined by considering the individual molecular weights of each component in the mixture (excluding water) and their individual proportions.
Pokud se zdá, že došlo k dimerizaci, mělo by to být zaznamenáno, neboť může dojít k příliš vysokému odhadu procentuálního úbytku peptidů, což vede k falešným pozitivním předpovědím a/nebo k zařazení do vyšší třídy reaktivity (viz odstavce 29 a 30)
The resulting purity and apparent molecular weight should then be used to calculate the weight of test chemical necessary to prepare a 100 mM solution.
Analýzu cysteinových a lysinových peptidů pomocí metody HPLC lze provádět souběžně (jsou-li k dispozici dva systémy HPLC), nebo v různých dnech.
For polymers for which a predominant molecular weight cannot be determined, the molecular weight of the monomer (or the apparent molecular weight of the various monomers constituting the polymer) may be considered to prepare a 100 mM solution.
Provádí-li se analýza v různých dnech, pak by se všechny roztoky zkušebních chemických látek měly čerstvě připravit pro obě analýzy v každý příslušný den.
However, when testing mixtures, multi-constituent substances or polymers of known composition, it should be considered to also test the neat chemical.
Analýza by měla být načasována tak, aby se zajistilo, že vstříknutí prvního vzorku začne po uplynutí 22 až 26 hodin od okamžiku, kdy byla zkoušená chemická látka smíchána s roztokem peptidu.
For liquids, the neat chemical should be tested as such without any prior dilution by incubating it at 1:10 and 1:50 molar ratio with the cysteine and lysine peptides, respectively.
Při nastavení HPLC, které bylo použito ve validační studii a je popsáno v této zkušební metodě, lze v jedné sérii provedení HPLC zpracovat až 26 analytických vzorků (viz též odstavec 17).
For solids, the test chemical should be dissolved to its maximum soluble concentration in the same solvent used to prepare the apparent 100 mM solution.
Příklad série provedení analýzy HPLC je uveden v dodatku 3.
It should then be tested as such without any further dilution by incubating it at 1:10 and 1:50 ratio with the cysteine and lysine peptides, respectively.
Vyhodnocení údajů
Concordant results (reactive or non-reactive) between the apparent 100 mM solution and the neat chemical should allow for a firm conclusion on the result.
Koncentrace cysteinových nebo lysinových peptidů se stanoví v každém vzorku fotometricky při 220 nm změřením plochy píku (plocha pod křivkou) vhodných píků a výpočtem koncentrace peptidů pomocí lineární kalibrační křivky odvozené od standardů.
Preparation of the positive control, reference controls and coelution controls
Procentuální úbytek peptidů se stanoví v každém vzorku změřením plochy píku, která se vydělí střední hodnotou plochy píku příslušných referenčních kontrol C (viz dodatek 3) podle níže uvedeného vzorce.
Cinnamic aldehyde (CAS 104-55-2; ≥ 95 % food-grade purity) should be used as positive control (PC) at a concentration of 100 mM in acetonitrile.
Procentuální úbytek peptidů
Other suitable positive controls preferentially providing mid-range depletion values may be used if historical data are available to derive comparable run acceptance criteria.
Plocha píku peptidů v každé replice
In addition, reference controls (i.e. samples containing only the peptide dissolved in the appropriate solvent) should also be included in the HPLC run sequence and these are used to verify the HPLC system suitability prior to the analysis (reference controls A), the stability of the reference controls over time (reference controls B) and to verify that the solvent used to dissolve the test chemical does not impact the percent peptide depletion (reference controls C) (see Appendix 3).
Střed.hodnota plochy píku v ref.kontrolách C
The appropriate reference control for each chemical is used to calculate the percent peptide depletion for that chemical (see paragraph 26).
Kritéria přijatelnosti
In addition a co-elution control constituted by the test chemical alone for each of the test chemicals analysed should be included in the run sequence to detect possible co-elution of the test chemical with either the lysine or the cysteine peptide.
Aby se provedení mohlo považovat za platné, měla by být splněna tato kritéria:
Incubation of the test chemical with the cysteine and lysine peptide solutions
kalibrační křivka standardů by měla mít r2 > 0,99;
Cysteine and lysine peptide solutions should be incubated in glass autosampler vials with the test chemical at 1:10 and 1:50 ratio respectively.
střední hodnota procentuálního úbytku peptidů ze tří replik pozitivní kontroly v cinnamaldehydu by měla být mezi 60,8 % a 100 % u cysteinového peptidu a mezi 40,2 % and 69,0 % u lysinového peptidu a maximální směrodatná odchylka (SD) replik pozitivní kontroly by měla být < 14,9 % pro procentuální úbytek cysteinových peptidů a < 11,6 % pro procentuální úbytek lysinových peptidů; a
If a precipitate is observed immediately upon addition of the test chemical solution to the peptide solution, due to low aqueous solubility of the test chemical, in this case one cannot be sure how much test chemical remained in the solution to react with the peptide.
střední hodnota koncentrace peptidů z referenčních kontrol A by měla být 0,50 ± 0,05 mM a varianční koeficient (CV) píkových ploch peptidů u devíti referenčních kontrol B a C v acetonitrilu by měl být < 15,0 %.
Therefore, in such a case, a positive result could still be used, but a negative result is uncertain and should be interpreted with due care (see also provisions in paragraph 11 for the testing of chemicals not soluble up to a concentration of 100 mM).
Není-li jedno nebo více těchto kritérií splněno, mělo by se provedení opakovat.
The reaction solution should be left in the dark at 25 ± 2,5 °C for 24 ± 2 hours before running the HPLC analysis.
Aby se výsledky zkoušení zkoušené chemické látky mohly považovat za platné, měla by být splněna tato kritéria:
Each test chemical should be analysed in triplicate for both peptides.
maximální směrodatná odchylka u replik se zkoušenou chemickou látkou by měla být < 14,9 % u procentuálního úbytku cysteinu a < 11,6 % u procentuálního úbytku lysinu;
Samples have to be visually inspected prior to HPLC analysis.
střední hodnota koncentrace peptidů ze tří referenčních kontrol C ve vhodném rozpouštědle by měla být 0,50 ± 0,05 mM.
If a precipitate or phase separation is observed, samples may be centrifuged at low speed (100-400 xg) to force precipitate to the bottom of the vial as a precaution since large amounts of precipitate may clog the HPLC tubing or columns.
Nejsou-li tato kritéria splněna, měly by se údaje zamítnout a provedení s touto konkrétní zkoušenou chemickou látkou by se mělo opakovat.
If a precipitation or phase separation is observed after the incubation period, peptide depletion may be underestimated and a conclusion on the lack of reactivity cannot be drawn with sufficient confidence in case of a negative result.
Predikční model
Preparation of the HPLC standard calibration curve
Pro každou zkoušenou chemickou látku se vypočítá střední hodnota procentuálního úbytku cysteinu a procentuálního úbytku lysinu.
A standard calibration curve should be generated for both the cysteine and the lysine peptides.
Záporný úbytek se při výpočtu střední hodnoty považuje za „0“.
Peptide standards should be prepared in a solution of 20 % or 25 % acetonitrile:buffer using phosphate buffer (pH 7,5) for the cysteine peptide and ammonium acetate buffer (pH 10,2) for the lysine peptide.
S použitím predikčního modelu cystein 1:10 / lysin 1:50, jak je uvedeno v tabulce 1, by rozlišení mezi látkami senzibilizujícímu kůži a látkami nesenzibilizujícími kůži v rámci přístupu IATA mělo umožnit použití prahové hodnoty průměrného úbytku peptidů ve výši 6,38 %.
Using serial dilution standards of the peptide stock solution (0,667 mM), 6 calibration solutions should be prepared to cover the range from 0,534 to 0,0167 mM.
Uplatnění tohoto predikčního modelu pro zařazení zkoušené chemické látky do příslušné třídy reaktivity (tj. nízká, střední a vysoká reaktivita) se snad může osvědčit jako užitečný zdroj informací pro posouzení potence v rámci přístupu IATA.
A blank of the dilution buffer should also be included in the standard calibration curve.
Predikční model cystein 1:10 / lysin 1:50 [14]
Suitable calibration curves should have an r2 > 0,99.
Střední hodnota procentuálního úbytku cysteinu a lysinu
HPLC preparation and analysis
Třída reaktivity
The suitability of the HPLC system should be verified before conducting the analysis.
Předpověď DPRA [15]
Peptide depletion is monitored by HPLC coupled with an UV detector (photodiode array detector or fixed wavelength absorbance detector with 220 nm signal).
0 % ≤ střední hodnota procentuálního úbytku ≤ 6,38 %
The appropriate column is installed in the HPLC system.
Žádná nebo minimální reaktivita
The HPLC set-up described in the validated protocol uses a Zorbax SB-C-18 2,1 mm × 100 mm × 3,5 micron as preferred column.
Negativní
With this reversed-phase HPLC column, the entire system should be equilibrated at 30 °C with 50 % phase A (0,1 % (v/v) trifluoroacetic acid in water) and 50 % phase B (0,085 % (v/v) trifluoroacetic acid in acetonitrile) for at least 2 hours before running.
6,38 % < střední hodnota procentuálního úbytku ≤ 22,62 %
The HPLC analysis should be performed using a flow rate of 0,35 ml/min and a linear gradient from 10 % to 25 % acetonitrile over 10 minutes, followed by a rapid increase to 90 % acetonitrile to remove other materials.
Nízká reaktivita
Equal volumes of each standard, sample and control should be injected.
Pozitivní
The column should be re-equilibrated under initial conditions for 7 minutes between injections.
22,62 % < střední hodnota procentuálního úbytku ≤ 42,47 %
If a different reversed-phase HPLC column is used, the set-up parameters described above may need to be adjusted to guarantee an appropriate elution and integration of the cysteine and lysine peptides, including the injection volume, which may vary according to the system used (typically in the range from 3-10 μl).
Střední reaktivita
Importantly, if an alternative HPLC set-up is used, its equivalence to the validated set-up described above should be demonstrated (e.g. by testing the proficiency substances in Appendix 2).
42,47 % < střední hodnota procentuálního úbytku ≤ 100 %
Absorbance is monitored at 220 nm.
Vysoká reaktivita
If a photodiode array detector is used, absorbance at 258 nm should also be recorded.
Mohly by se vyskytnout případy, kdy zkoušená chemická látka (látka nebo jedna nebo několik složek vícesložkové látky nebo směsi) při 220 nm značně absorbuje a má stejný retenční čas jako peptid (koeluce).
It should be noted that some supplies of acetonitrile could have a negative impact on peptide stability and this has to be assessed when a new batch of acetonitrile is used.
Koeluci lze vyřešit mírnou úpravou nastavení HPLC, aby se více oddělil eluční čas zkoušené chemické látky a eluční čas peptidu.
The ratio of the 220 peak area and the 258 peak area can be used as an indicator of co-elution.
Při použití jiného nastavení HPLC ve snaze vyřešit koeluci by měla být prokázána jeho rovnocennost s validovaným nastavením (např. testováním vhodných látek uvedených v dodatku 2).
For each sample a ratio in the range of 90 % < mean [13] area ratio of control samples < 100 % would give a good indication that co-elution has not occurred.
Dojde-li ke koeluci, pík peptidu nelze integrovat a výpočet procentuálního úbytku peptidu není možný.
There may be test chemicals which could promote the oxidation of the cysteine peptide.
Jestliže dojde ke koeluci takových zkoušených chemických látek s cysteinovými i lysinovými peptidy, měla by být analýza označena za „neprůkaznou“.
The peak of the dimerised cysteine peptide may be visually monitored.
V případech, kdy dojde ke koeluci pouze s lysinovým peptidem, lze použít predikční model cystein 1:10 uvedený v tabulce
If dimerisation appears to have occurred, this should be noted as percent peptide depletion may be over-estimated leading to false positive predictions and/or assignment to a higher reactivity class (see paragraphs 29 and 30).
Predikční model cystein 1:10 [16]
HPLC analysis for the cysteine and lysine peptides can be performed concurrently (if two HPLC systems are available) or on separate days.
Procentuální úbytek cysteinu (Cys)
If analysis is conducted on separate days then all test chemical solutions should be freshly prepared for both assays on each day.
Třída reaktivity
The analysis should be timed to assure that the injection of the first sample starts 22 to 26 hours after the test chemical was mixed with the peptide solution.
Předpověď DPRA [17]
For the HPLC set up used in the validation study and described in this test method, up to 26 analysis samples can be accommodated in a single HPLC run (see also paragraph 17).
0 % ≤ procentuální úbytek Cys ≤ 13,89 %
An example of HPLC analysis sequence is provided in Appendix 3.
13,89 % < procentuální úbytek Cys ≤ 23,09 %
Data evaluation
23,09 % < procentuální úbytek Cys ≤ 98,24 %
The concentration of cysteine or lysine peptide is photometrically determined at 220 nm in each sample by measuring the peak area (area under the curve, AUC) of the appropriate peaks and by calculating the concentration of peptide using the linear calibration curve derived from the standards.