natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Odběr buněk a příprava preparátů
Each positive control should be used at one or more concentrations expected to give reproducible and detectable increases over background in order to demonstrate the sensitivity of the test system (i.e. the effects are clear but do not immediately reveal the identity of the coded slides to the reader), and the response should not be compromised by cytotoxicity exceeding the limits specified in this test method.
Buňky z každé kultury by se měly odebírat a zpracovávat zvlášť.
Reference chemicals recommended for assessing laboratory proficiency and for the selection of positive controls
Příprava buněk může zahrnovat hypotonizaci, ale tento krok není nutný, pokud se dosáhne odpovídajícího rozprostření buněk jiným způsobem.
Aneugens
Při přípravě preparátů lze použít různé postupy za předpokladu, že zajistí získání vysoce kvalitních buněčných preparátů pro vyhodnocení.
Colchicine
Měly by být zachovány buňky s neporušenou buněčnou membránou a neporušenou cytoplazmou, což umožni detekci mikrojader a (při použití metody s blokováním cytokineze) spolehlivou identifikaci dvoujaderných buněk.
Vinblastine
Preparáty lze barvit pomocí různých metod, jako je Giemsa nebo fluorescenčními barvivy se specifickou vazbou na DNA.
Treatment Schedule
Použitím vhodných fluorescenčních barviv (jako je např. akridinová oranž (78) nebo Hoechst 33258 a pyronin-Y (79)) se lze vyhnout některým artefaktům spojeným s použitím barviva bez specifické vazby na DNA.
In order to maximise the probability of detecting an aneugen or clastogen acting at a specific stage in the cell cycle, it is important that sufficient numbers of cells representing all of the various stages of their cell cycles are treated with the test chemical.
Je-li zapotřebí získat mechanistické informace o tvorbě mikrojader, lze k identifikaci jejich obsahu použít protilátky proti kinetochorům, hybridizační metodu FISH využívající pan-centrometrické DNA-sondy nebo značení in situ pomocí primerů se specifickou pan-centrometrickou vazbou spolu s vhodným kontrastním barvením DNA (celé chromozomy se zbarví, zatímco acentrické fragmenty chromozomů nikoli) (16) (17).
All treatments should commence and end while the cells are growing exponentially and the cells should continue to grow up to the time of sampling.
K rozlišení mezi klastogeny a aneugeny lze použít i jiné metody, pokud se ukázaly jako účinné a byly validovány.
The treatment schedule for cell lines and primary cell cultures may, therefore, differ somewhat from that for lymphocytes which require mitogenic stimulation to begin their cell cycle (17).
Například u některých buněčných linií by užitečné informace mohlo poskytnout také měření jader sub-2N jako hypodiploidních jevů pomocí takových postupů, jako je analýza obrazu, laserová skenovací cytometrie nebo průtoková cytometrie (80) (81) (82).
For lymphocytes, the most efficient approach is to start the treatment with the test chemical at 44-48 hours after PHA stimulation, when cells will be dividing asynchronously (6).
Také morfologická pozorování jader by mohla odhalit známky možné aneuploidie.
Published data (19) indicate that most aneugens and clastogens will be detected by a short term treatment period of 3 to 6 hours in the presence and absence of S9, followed by removal of the test chemical and sampling at a time equivalent to about 1,5 - 2,0 normal cell cycle lengths after the beginning of treatment (7).
Rovněž zkouška chromozomových aberací v metafázi, provedená nejlépe se stejným druhem buněk a podle protokolu se srovnatelnou citlivostí, by mohla být užitečná pro stanovení toho, zda jsou mikrojádra důsledkem poškození chromozomů (vzhledem k tomu, že ztráta chromozomů by při zkoušce chromozomových aberací nebyla zjištěna).
However, for thorough evaluation, which would be needed to conclude a negative outcome, all three following experimental conditions should be conducted using a short term treatment with and without metabolic activation and long term treatment without metabolic activation (see paragraphs 56, 57 and 58): Cells should be exposed to the test chemical without metabolic activation for 3-6 hours, and sampled at a time equivalent to about 1,5 - 2,0 normal cell cycle lengths after the beginning of treatment (19),
Všechny preparáty včetně preparátů z kontrol s rozpouštědlem a z neexponovaných (jsou-li použity) a pozitivních kontrol by před mikroskopickou analýzou četnosti výskytu mikrojader měly být označeny samostatným kódem.
Cells should be exposed to the test chemical with metabolic activation for 3-6 hours, and sampled at a time equivalent to about 1,5 - 2,0 normal cell cycle lengths after the beginning of treatment (19),
V případě kultur ošetřených pomocí cytoB by se měla analyzovat četnost výskytu mikrojader nejméně u 2000 dvoujaderných buněk pro každou koncentraci a z každé kontroly (83), které se rovnoměrně rozdělí mezi replikami, jsou-li použity.
Cells should be continuously exposed without metabolic activation until sampling at a time equivalent to about 1,5 - 2,0 normal cell cycle lengths.
V případě použití jediné kultury na každou dávku (viz odstavec 28) by se mělo vyhodnotit nejméně 2000 dvoujaderných buněk na každou kulturu v rámci této jediné kultury (83).
If it is known or suspected that the test chemical affects the cell cycling time (e.g. when testing nucleoside analogues), especially for p53 competent cells (35) (36) (77), sampling or recovery times may be extended by up to a further 1,5 - 2,0 normal cell cycle lengths (i.e. total 3,0 to 4,0 cell cycle lengths after the beginning of short-term and long-term treatments).
Pokud je k dispozici k vyhodnocení pro každou koncentraci podstatně méně než 1000 dvoujaderných buněk z každé kultury (u duplicitních kultur), nebo než 2000 (u jedné kultury) a není-li zjištěn výrazný nárůst výskytu mikrojader, musí se zkouška zopakovat za použití většího počtu buněk nebo při méně cytotoxických koncentracích (podle toho, co z těchto dvou možností připadá v úvahu).
These options address situations where there may be concern regarding possible interactions between the test chemical and cytoB.
Je třeba dbát na to, aby se nezapočítávaly dvoujaderné buňky, které mají nepravidelný tvar nebo jejichž dvě jádra se svou velikostí navzájem značně liší.
When using extended sampling times (i.e. total 3,0 to 4,0 cell cycle lengths culture time), care should be taken to ensure that the cells are still actively dividing.
Dále, dvoujaderné buňky by neměly být zaměňovány za špatně rozprostřené mnoho jaderné buňky.
For example, for lymphocytes exponential growth may be declining at 96 hours following stimulation and monolayer cultures of cells may become confluent.
Buňky obsahující více než dvě hlavní jádra by se neměly analyzovat na přítomnost mikrojader, jelikož základní četnost mikrojader může být v těchto buňkách vyšší (84).
The suggested cell treatment schedules are summarised in Table 2.
Započtení jednojaderných buněk je přijatelné, pokud se prokáže, že zkoušená chemická látka narušuje působení cytoB.
These general treatment schedules may be modified (and should be justified) depending on the stability or reactivity of the test chemical or the particular growth characteristics of the cells being used.
V takových případech by mohla být užitečná opakovaná zkouška bez cytoB.
Cell treatment and harvest times for the MNvit test
Započtení jednojaderných buněk spolu s hodnocením dvoujaderných buněk by mohlo poskytnout užitečné informace (85) (86), ale není povinné.
Lymphocytes, primary cells and cell lines treated with cytoB
Pokud je na každou koncentraci použita jediná kultura (viz odstavec 28), mělo by být hodnoceno nejméně 2000 buněk na kulturu v rámci této jediné kultury.
Treat for 3-6 hours in the presence of S9;
Pokud je k dispozici k vyhodnocení pro každou koncentraci podstatně méně než 1000 buněk z každé kultury (u duplicitních kultur), nebo než 2000 (u jedné kultury) a není-li zjištěn výrazný nárůst výskytu mikrojader, musí se zkouška zopakovat za použití většího počtu buněk nebo při méně cytotoxických koncentracích (podle toho, co z těchto dvou možností připadá v úvahu).
remove the S9 and treatment medium;
Při použití cytoB by se měla určit hodnota CBPI nebo RI k posouzení buněčné proliferace (viz dodatek 2) za použití nejméně 500 buněk z každé kultury.
add fresh medium and cytoB;
Provádí-li se expozice bez přítomnosti cytoB, je nezbytné prokázat, že buňky v kultuře se rozdělily, jak je vysvětleno v odstavcích 24 až 28.
harvest 1,5 - 2,0 normal cell cycle lengths after the beginning of treatment.
Aby bylo možné před zahájením rutinního zkoušení zjistit, zda laboratoř má s danou zkouškou dostatečné zkušenosti, měla by provést sérii experimentů s referenčními pozitivními chemickými látkami, jež působí prostřednictvím různých mechanismů (alespoň s jednou látkou s metabolickou aktivací a jednou bez metabolické aktivace a jednou působící prostřednictvím aneugenního mechanismu, které se vyberou ze seznamu chemických látek uvedeného v tabulce 1), a s různými negativními kontrolami (včetně kontrol s neexponovanými kulturami a kontrol s různými rozpouštědly/vehikuly).
Treat for 3-6 hours;
Tento požadavek neplatí pro laboratoře, které tuto zkušenost mají, tj. které mají k dispozici historickou databázi historických údajů, jak je definována v odstavcích 49 až 52.
remove the treatment medium;
Měl by být zkoumán výběr z chemických látek pro pozitivní kontroly (viz tabulka 1) s krátkou a dlouhou expozicí za nepřítomnosti metabolické aktivace a rovněž s krátkou expozicí za přítomnosti metabolické aktivace, aby byla prokázána způsobilost pro detekci klastogenních a aneugenních chemických látek, stanovení účinnosti systému metabolické aktivace a prokázání vhodnosti postupů hodnocení (mikroskopická vizuální analýza, průtoková cytometrie, laserová skenovací cytometrie nebo analýza obrazu).
Extended treatment
Při prvním získávání údajů o historické distribuci negativních kontrol by měly být výsledky souběžných negativních kontrol v souladu s publikovanými negativními kontrolními údaji, pokud existují.
Treat for 1,5 - 2 normal cell cycle lengths in the presence of cytoB;
S tím, jak je do distribuce kontrol přidáváno více údajů z experimentů, měly by být souběžné negativní kontroly v ideálním případě uvnitř 95 % kontrolních limitů této distribuce (87) (88).
harvest at the end of the treatment period.
Nejprve by měla být vybudována historická databáze negativních kontrol dané laboratoře na základě nejméně 10 experimentů, nejlépe však by měla zahrnovat nejméně 20 experimentů provedených za srovnatelných zkušebních podmínek.
Cell lines treated without cytoB
V laboratořích by měly být uplatňovány metody řízení jakosti, jako např. regulační diagramy (např. takzvané C-charts nebo X-bar charts (88)), z nichž je patrné, jak proměnlivé jsou jejich údaje o pozitivních a negativních kontrolách a že metodika je v dané laboratoři „pod kontrolou“ (83).
(Identical to the treatment schedules outlined above with the exception that no cytoB is added)
Další doporučení, jak získat a používat historické údaje (tj. kritéria pro zařazení údajů do historické databáze a jejich vyřazení a kritéria přijatelnosti pro daný experiment), lze najít v literatuře (87).
For monolayer cultures, mitotic cells (identifiable as being round and detaching from the surface) may be present at the end of the 3-6 hour treatment.
Jakékoli změny zkušebního protokolu by měly být zvažovány z hlediska jejich souladu se stávajícími historickými kontrolními databázemi laboratoře.
If there is evidence for a substantial increase in the number of mitotic cells compared with controls, indicating likely mitotic arrest, then the cells should be collected by centrifugation and added back to the culture, to avoid losing cells that are in mitosis, and at risk for micronuclei/chromosome aberration, at the time of harvest.
Údaje o negativních kontrolách by měly zahrnovat výskyt buněk s mikrojádry z jedné kultury nebo ze souhrnu replikovaných kultur, jak je popsáno v odstavci 28.
Cell harvest and slide preparation
Výsledky souběžných negativních kontrol by v ideálním případě měly spadat do 95 % rozmezí distribuce v historické databázi negativních kontrol laboratoře (87) (88).
Each culture should be harvested and processed separately.
Pokud jsou údaje ze souběžných negativních kontrol mimo 95 % rozmezí může být přijatelné je zahrnout do dosavadní distribuce kontrol, pokud tyto údaje nejsou mimořádně odlehlé a pokud existují důkazy o tom, že testovací systém je „pod kontrolou“ (viz odstavec 50), a důkazy o tom, že nedošlo k technické nebo lidské chybě.
Cell preparation may involve hypotonic treatment, but this step is not necessary if adequate cell spreading is otherwise achieved.
Pokud se používá technika blokování cytokineze, slouží k hodnocení indukce vzniku mikrojader jen četnost dvoujaderných buněk s mikrojádry (nezávisle na počtu mikrojader v každé buňce).
Different techniques can be used in slide preparation provided that high-quality cell preparations for scoring are obtained.
Samostatně lze podat zprávu o počítání počtu buněk s jedním, dvěma nebo více mikrojádry, které by mohlo poskytnout užitečné informace, ale není povinné.
Cells with intact cell membrane and intact cytoplasm should be retained to allow the detection of micronuclei and (in the cytokinesis-block method) reliable identification of binucleate cells.
Souběžně by se mělo provádět měření cytotoxicity a/nebo cytostáze u všech ošetřených kultur a kultur v negativních a pozitivních kontrolách (16).
The slides can be stained using various methods, such as Giemsa or fluorescent DNA specific dyes.
Při použití metody s blokováním cytokineze by se měly vypočítat hodnoty CBPI nebo RI u všech ošetřených a kontrolních kultur jako ukazatele zpoždění buněčného cyklu.
The use of appropriate fluorescent stains (e.g. acridine orange (78) or Hoechst 33258 plus pyronin-Y (79)) can eliminate some of the artifacts associated with using a non-DNA specific stain.
V případě nepřítomnosti cytoB by se měly použít hodnoty RPD nebo RICC (viz dodatek 2).
Anti-kinetochore antibodies, FISH with pancentromeric DNA probes, or primed in situ labelling with pancentromere-specific primers, together with appropriate DNA counterstaining, can be used to identify the contents (whole chromosomes will be stained while acentric chromosome fragments will not) of micronuclei if mechanistic information of their formation is of interest (16) (17).
souběžná negativní kontrola je považována za přijatelnou pro přidání do historické databáze negativních kontrol laboratoře, jak je popsáno v odstavci 50,
Other methods for differentiation between clastogens and aneugens may be used if they have been shown to be effective and validated.
souběžné pozitivní kontroly (viz odstavec 50) by měly vyvolat odpovědi, které jsou slučitelné s odpověďmi uvedenými v historické databázi laboratoře pozitivních kontrol, a měly by vyvolat statisticky významný nárůst v porovnání se souběžnou negativní kontrolou,
For example, for certain cell lines the measurements of sub-2N nuclei as hypodiploid events using techniques such as image analysis, laser scanning cytometry or flow cytometry could also provide useful information (80) (81) (82).
měla by být splněna kritéria buněčné proliferace při kontrole s rozpouštědlem (odstavce 25–27),
Morphological observations of nuclei could also give indications of possible aneuploidy.
byly testovány všechny předepsané experimentální podmínky (viz odstavce 36–40), dokud jedna z nich nevedla k pozitivním výsledkům,
Moreover, a test for metaphase chromosome aberrations, preferably in the same cell type and protocol with comparable sensitivity, could also be a useful way to determine whether micronuclei are due to chromosome breakage (knowing that chromosome loss would not be detected in the chromosome aberration test).
je analyzovatelný adekvátní počet buněk a koncentrací (odstavce 44–46),
All slides, including those of the solvent and the untreated (if used) and positive controls, should be independently coded before the microscopic analysis of micronucleus frequencies.
kritéria pro výběr nejvyšší koncentrace jsou v souladu s kritérii popsanými v odstavcích 24–31.
Appropriate techniques should be used to control any bias or drift when using an automated scoring system, for instance, flow cytometry, laser scanning cytometry or image analysis.
Za předpokladu, že všechna kritéria přijatelnosti byla splněna, lze zkoušenou chemickou látku považovat za jasně pozitivní, pokud v některém ze zkoumaných experimentálních uspořádání (viz odstavce 36–39):
Regardless of the automated platform is used to enumerate micronuclei, CBPI, RI, RPD, or RICC should be assessed concurrently.
alespoň jedna ze zkušebních koncentrací vykazuje statisticky významný nárůst v porovnání se souběžnou negativní kontrolou (89),
In cytoB-treated cultures, micronucleus frequencies should be analysed in at least 2000 binucleate cells per concentration and control (83), equally divided among the replicates, if replicates are used.
při hodnocení pomocí vhodného statistického trend-testu je tento nárůst alespoň za jednoho experimentálního uspořádání závislý na dávce (viz odstavec 28),
In the case of single cultures per dose (see paragraph 28), at least 2000 binucleate cells per culture (83) should be scored in this single culture.
všechny výsledky jsou mimo distribuci dosavadních údajů o negativních kontrolách (např. 95 % rozmezí distribuce dle Poissonova rozdělení; viz odstavec 52).
If substantially fewer than 1000 binucleate cells per culture (for duplicate cultures), or 2000 (for single culture), are available for scoring at each concentration, and if a significant increase in micronuclei is not detected, the test should be repeated using more cells, or at less cytotoxic concentrations, whichever is appropriate.
Jsou-li všechna tato kritéria splněna, má se za to, že zkoušená chemická látka je schopna vyvolávat poškození chromozomů a/nebo zvýšení či snížení jejich počtu v tomto zkušebním systému.
Care should be taken not to score binucleate cells with irregular shapes or where the two nuclei differ greatly in size.
Doporučení ohledně nejvhodnějších statistických metod lze též najít v literatuře (90) (91) (92).
In addition, binucleate cells should not be confused with poorly spread multi-nucleate cells.
Za předpokladu, že byla splněna všechna kritéria přijatelnosti, se zkoušená chemická látka považuje za jasně negativní, pokud za všech zkoumaných zkušebních podmínek (viz odstavce 36–39):
Cells containing more than two main nuclei should not be analysed for micronuclei, as the baseline micronucleus frequency may be higher in these cells (84).
všechny výsledky spadají do rámce distribuce dosavadních údajů o negativních kontrolách (např. 95 % kontrolních limitů dle Poissonova rozdělení; viz odstavec 52).
Scoring of mononucleate cells is acceptable if the test chemical is shown to interfere with cytoB activity.
Pak se má za to, že zkoušená chemická látka není schopna vyvolávat poškození chromozomů a/nebo zvýšení či snížení počtu chromozomů v tomto zkušebním systému.
A repeat test without CytoB might be useful in such cases.
Ověření jasně pozitivní či jasně negativní odpovědi se nepožaduje.
Scoring mononucleate cells in addition to binucleate cells could provide useful information (85) (86), but is not mandatory.
V případě, že odpověď není ani jasně negativní, ani jasně pozitivní, jak je popsáno výše, nebo s cílem napomoci při stanovení biologického významu výsledku by měly být údaje vyhodnoceny na základě odborného posouzení a/nebo dalším šetřením.
In cell lines tested without cytoB treatment, micronuclei should be scored in at least 2000 cells per test concentration and control (83), equally divided among the replicates, if replicates are used.
Užitečné by mohlo být hodnocení dalších buněk (je-li vhodné) nebo provedení opakovaného experimentu, případně za použití upravených zkušebních podmínek (např. rozsah koncentrací, jiné podmínky metabolické aktivace (např. koncentrace S9 nebo původ S9)).
When single cultures per concentration are used (see paragraph 28), at least 2000 cells per culture should be scored in this single culture.
V ojedinělých případech dokonce ani po dalším šetření nebude možné na základě daného souboru údajů dospět k závěru o pozitivitě či negativitě výsledku, a bude proto učiněn závěr, že výsledek je neurčitý.
If substantially fewer than 1000 cells per culture (for duplicate cultures), or 2000 (for single culture), are available for scoring at each concentration, and if a significant increase in micronuclei is not detected, the test should be repeated using more cells, or at less cytotoxic concentrations, whichever is appropriate.
Chemické látky, které vyvolávají vznik mikrojader při zkoušce MNvit, mají tento účinek proto, že vyvolávají poškození chromozomů, ztrátu chromozomů nebo kombinaci obou těchto dějů.
When cytoB is used, a CBPI or an RI should be determined to assess cell proliferation (see Appendix 2) using at least 500 cells per culture.
Při určování, zda je mechanismus vyvolání tvorby mikrojader důsledkem klastogenního a/nebo aneugenního působení, lze uplatnit další analýzy za použití protilátek proti kinetochorům, sond in situ se specifickou vazbou na centromery nebo jiných metod.
When treatments are performed in the absence of cytoB, it is essential to provide evidence that the cells in culture have divided, as discussed in paragraphs 24-28.
reaktivita zkoušených chemických látek s rozpouštědlem/vehikulem nebo médiem pro kultivaci buněk,
In order to establish sufficient experience with the assay prior to using it for routine testing, the laboratory should have performed a series of experiments with reference positive chemicals acting via different mechanisms (at least one with and one without metabolic activation, and one acting via an aneugenic mechanism, and selected from the chemicals listed in Table 1) and various negative controls (including untreated cultures and various solvents/vehicle).
rozpustnost a stabilita zkoušené chemické látky v rozpouštědle, je-li známa,
This is not applicable to laboratories that have experience, i.e. that have an historical data base available as defined in paragraphs 49 to 52.
měření pH, případně osmolality a sraženiny v kultivačním médiu, do něhož byla přidána zkoušená chemická látka.
A selection of positive control chemicals (see Table 1) should be investigated with short and long treatments in the absence of metabolic activation, and also with short treatment in the presence of metabolic activation, in order to demonstrate proficiency to detect clastogenic and aneugenic chemicals, determine the effectiveness of the metabolic activation system and demonstrate the appropriateness of the scoring procedures (microscopic visual analysis, flow cytometry, laser scanning cytometry or image analysis).
zdůvodnění volby rozpouštědla,
When first acquiring data for an historical negative control distribution, concurrent negative controls should be consistent with published negative control data where they exist.
procentuální podíl rozpouštědla v konečném kultivačním médiu.
As more experimental data are added to the control distribution, concurrent negative controls should ideally be within the 95 % control limits of that distribution (87) (88).
druh a zdroj použitých buněk,
The laboratory's historical negative control database, should initially be built with a minimum of 10 experiments but would preferably consist of at least 20 experiments conducted under comparable experimental conditions.
vhodnost použitého druhu buněk,
Laboratories should use quality control methods, such as control charts (e.g. C-charts or X-bar charts (88)), to identify how variable their positive and negative control data are, and to show that the methodology is ‘under control’ in their laboratory (83).
nepřítomnost mykoplasmat v případě buněčných linií,
Further recommendations on how to build and use the historical data (i.e. criteria for inclusion and exclusion of data in historical data and the acceptability criteria for a given experiment) can be found in the literature (87).
u buněčných linií informace o délce buněčného cyklu nebo proliferační index,
Any changes to the experimental protocol should be considered in terms of the consistency of the data with the laboratory's existing historical control databases.