natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Média a podmínky kultivace
Care should be taken to avoid conditions that could lead to artifactual positive results, i.e. chromosome damage not caused by direct interaction between the test chemicals and chromosomes; such conditions include changes in pH or osmolality (8) (9) (10), interaction with the medium components (11) (12) or excessive levels of cytotoxicity (13) (14) (15) (16).
Pro udržování kultur by mělo být použito vhodné kultivační médium a inkubační podmínky (kultivační nádoby, případně zvlhčená atmosféra s 5 % CO2, inkubační teplota 37 °C).
This test is used to detect chromosomal aberrations that may result from clastogenic events.
Metabolická aktivace
Cell cultures of human or other mammalian origin are exposed to the test chemical both with and without an exogenous source of metabolic activation unless cells with an adequate metabolizing capability are used (see paragraph 13).
Při použití buněk, které mají nedostatečnou endogenní metabolickou schopnost, by se měly použít exogenní metabolizující systémy.
At appropriate predetermined intervals after the start of exposure of cell cultures to the test chemical, they are treated with a metaphase-arresting chemical (e.g. colcemid or colchicine), harvested, stained and metaphase cells are analysed microscopically for the presence of chromatid-type and chromosome-type aberrations.
Frakce S9 je v konečném testovacím médiu obvykle používána v koncentracích od 1 % do 2 % obj., avšak koncentraci je možné zvýšit do 10 %.
The choice of the cell lines used should be scientifically justified.
V průběhu aplikace by se neměly používat látky, jež snižují mitotický index, zejména látky, které tvoří komplexy s vápníkem (31).
When primary cells are used, for animal welfare reasons, the use of primary cells from human origin should be considered where feasible and sampled in accordance with the human ethical principles and regulations.
Volbu typu a koncentrace systému exogenní metabolické aktivace nebo metabolického induktoru, který se použije, může ovlivnit třída zkoušených chemických látek.
Human peripheral blood lymphocytes should be obtained from young (approximately 18-35 years of age), non-smoking individuals with no known illness or recent exposures to genotoxic agents (e.g. chemicals, ionizing radiations) at levels that would increase the background incidence of chromosomal aberrations.
Příprava zkoušené chemické látky
This would ensure the background incidence of chromosomal aberrations to be low and consistent.
Pevné zkoušené chemické látky by měly být před aplikací na buňky rozpuštěny ve vhodných rozpouštědlech a popřípadě zředěny (viz odstavec 23).
The baseline incidence of chromosomal aberrations increases with age and this trend is more marked in females than in males (17) (18).
Kapalné látky lze přidat přímo do zkušebních systémů a/nebo je lze před použitím k ošetření zkušebních systémů zředit.
If cells from more than one donor are pooled for use, the number of donors should be specified.
Plynné a těkavé zkoušené chemické látky by se měly zkoušet za použití vhodně upravených standardních protokolů, například prostřednictvím ošetření buněk v neprodyšně uzavřených kultivačních nádobách (32) (33) (34).
It is necessary to demonstrate that the cells have divided from the beginning of treatment with the test chemical to cell sampling.
Měly by se používat čerstvě připravené zkoušené látky, pokud údaje o stálosti neprokazují možnost skladování.
Cell cultures are maintained in an exponential cell growth phase (cell lines) or stimulated to divide (primary cultures of lymphocytes), to expose the cells at different stages of the cell cycle, since the sensitivity of cell stages to the test chemicals may not be known.
Rozpouštědla
The primary cells that need to be stimulated with mitogenic agents in order to divide are generally no longer synchronized during exposure to the test chemical (e.g. human lymphocytes after a 48-hour mitogenic stimulation).
Rozpouštědlo by mělo být zvoleno tak, aby optimalizovalo rozpustnost zkoušené chemické látky, aniž by nepříznivě ovlivnilo provádění zkoušky, např. měnilo růst buněk, ovlivňovalo integritu zkoušené chemické látky, reagovalo s kultivačními nádobami, narušovalo systém metabolické aktivace.
The use of synchronized cells during treatment is not recommended, but can be acceptable if justified.
Doporučuje se pokud možno nejprve zvážit použití vodného rozpouštědla (nebo kultivačního média).
Media and culture conditions
Dobře zavedenými rozpouštědly jsou například voda nebo dimethylsulfoxid.
Appropriate culture medium and incubation conditions (culture vessels, humidified atmosphere of 5 % CO2 if appropriate, incubation temperature of 37 °C) should be used for maintaining cultures.
Pokud takové podpůrné údaje neexistují, je důležité zařadit neexponované kontroly (viz dodatek 1) prokazující, že zvolené rozpouštědlo nevyvolává žádné škodlivé nebo klastogenní účinky.
Cell lines should be checked routinely for the stability of the modal chromosome number and the absence of Mycoplasma contamination (7) (19), and cells should not be used if contaminated or if the modal chromosome number has changed.
Měření buněčné proliferace a cytotoxicity a volba expozičních koncentrací
The normal cell cycle time of cell lines or primary cultures used in the testing laboratory should be established and should be consistent with the published cell characteristics (20).
Při stanovení nejvyšší koncentrace zkoušené chemické látky by neměly být použity koncentrace, které jsou schopny vyvolat falešnou pozitivní odpověď, jako např. koncentrace, jež vyvolávají nadměrnou cytotoxicitu (viz odstavec 22), srážení kultivačního média (viz odstavec 23) nebo zřetelné změny pH nebo osmolality (viz odstavec 5).
Preparation of cultures
Pokud zkoušená chemická látka v době jejího přidání způsobuje zřetelnou změnu hodnoty pH média, bylo by možné pH upravit pufrováním konečného expozičního média tak, aby nedošlo k falešným pozitivním výsledkům a aby byly zachovány vhodné kultivační podmínky.
Cell lines: cells are propagated from stock cultures, seeded in culture medium at a density such that the cells in suspensions or in monolayers will continue to grow exponentially until harvest time (e.g. confluence should be avoided for cells growing in monolayers).
Provádí se měření buněčné proliferace, aby bylo zajištěno, že dostatečný počet ošetřených buněk prodělal během zkoušky mitózu a že expozice je prováděna při vhodných úrovních cytotoxicity (viz odstavce 18 a 22).
Lymphocytes: whole blood treated with an anti-coagulant (e.g. heparin) or separated lymphocytes are cultured (e.g. for 48 hours for human lymphocytes) in the presence of a mitogen [e.g. phytohaemagglutinin (PHA) for human lymphocytes] in order to induce cell division prior to exposure to the test chemical.
Cytotoxicita by měla být stanovena v hlavním experimentu s metabolickou aktivací a bez ní za použití vhodných indikátorů buněčné smrti a růstu.
Metabolic activation
Hodnocení cytotoxicity při předběžné zkoušce může být užitečné a může napomoci k lepšímu určení koncentrací, jež mají být použity při hlavní zkoušce, avšak předběžná zkouška není povinná.
Exogenous metabolising systems should be used when employing cells which have inadequate endogenous metabolic capacity.
Pokud se provede, neměla by nahrazovat měření cytotoxicity v hlavním experimentu.
The most commonly used system that is recommended by default, unless otherwise justified, is a co-factor-supplemented post-mitochondrial fraction (S9) prepared from the livers of rodents (generally rats) treated with enzyme-inducing agents such as Aroclor 1254 (21) (22) (23) or a combination of phenobarbital and β-naphthoflavone (24) (25) (26) (27) (28) (29).
Vhodnými metodami pro posouzení cytotoxicity v cytogenetických zkouškách jsou relativní zdvojnásobení populace (RPD) nebo relativní nárůst počtu buněk (RICC) (13) (15) (35) (36) (55) (příslušné vzorce viz dodatek 2).
The latter combination does not conflict with the Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants (30) and has been shown to be as effective as Aroclor 1254 for inducing mixed-function oxidases (24) (25) (26) (28).
V případě dlouhodobé expozice a dobách odběru delších než 1,5násobek normální délky buněčného cyklu po zahájení zkoušky (tj. celkově delších než trojnásobek délky buněčného cyklu) by použití RPD mohlo vést k podhodnocení cytotoxicity (37).
The S9 fraction typically is used at concentrations ranging from 1 to 2 % (v/v) but may be increased to 10 % (v/v) in the final test medium.
Za těchto okolností měření RICC může být lepším ukazatelem nebo v případě použití RPD by hodnocení cytotoxicity po 1,5násobku normální délky buněčného cyklu mohlo být užitečné.
The use of products that reduce the mitotic index, especially calcium complexing products (31) should be avoided during treatment.
Ačkoli doporučenými parametry cytotoxicity jsou pro buněčné linie RICC a RPD a pro primární kulturu lymfocytů MI, mohly by další užitečné informace poskytnout i jiné ukazatele (např. integrita buněk, apoptóza, nekróza, buněčný cyklus).
Solid test chemicals should be prepared in appropriate solvents and diluted, if appropriate, prior to treatment of the cells (see paragraph 23).
Měly by se vyhodnotit nejméně tři zkušební koncentrace (nepočítaje v to kontroly s rozpouštědlem a pozitivní kontroly), které splňují kritéria přijatelnosti (vhodná cytotoxicita, počet buněk atd.).
Liquid test chemicals may be added directly to the test system and/or diluted prior to treatment of the test system.
Bez ohledu na typy buněk (buněčné linie nebo primární kultury lymfocytů) lze pro každou zkušební koncentraci použít repliky nebo jednu exponovanou kulturu.
Gaseous or volatile test chemicals should be tested by appropriate modifications to the standard protocols, such as treatment in sealed culture vessels (32) (33) (34).
Lze doporučit použití duplicitních kultur, avšak jednu kulturu lze rovněž akceptovat za předpokladu, že v této jediné kultuře nebo v duplicitních kulturách je hodnocen stejný celkový počet buněk.
Preparations of the test chemical should be made just prior to treatment unless stability data demonstrate the acceptability of storage.
Použití jedné kultury je opodstatněné zejména v případě, že jsou posuzovány více než 3 koncentrace (viz odstavec 31).
Solvents
Výsledky získané z duplicitních nezávislých kultur při dané koncentraci lze pro účely analýzy údajů sloučit (38).
The solvent should be chosen to optimize the solubility of the test chemicals without adversely impacting the conduct of the assay, e.g. changing cell growth, affecting the integrity of the test chemical, reacting with culture vessels, impairing the metabolic activation system.
U zkoušených látek, jež vykazují malou cytotoxicitu nebo nevykazují žádnou cytotoxicitu, budou obvykle vhodné přibližně dvojnásobné až trojnásobné intervaly koncentrací.
It is recommended that, wherever possible, the use of an aqueous solvent (or culture medium) should be considered first.
V případě cytotoxicity by měly zvolené zkušební koncentrace pokrývat rozpětí od koncentrace vyvolávající cytotoxicitu, jak je popsáno v odstavci 22, po koncentrace, při nichž dochází ke střední a nízké cytotoxicitě nebo nedochází k žádné cytotoxicitě.
Well established solvents are for example water or dimethyl sulfoxide.
Mnohé zkoušené chemické látky vykazují strmé křivky závislosti odezvy na koncentraci, a aby bylo možné získat údaje při nízké a střední cytotoxicitě nebo podrobně studovat závislost účinku na dávce, může být nezbytné zvolit menší rozdíly mezi jednotlivými koncentracemi a/nebo více než tři koncentrace (ať už pro jednu kulturu, nebo replikáty), zejména v případě kdy je požadován opakovaný experiment (viz odstavec 47).
Generally organic solvents should not exceed 1 % (v/v) and aqueous solvents (saline or water) should not exceed 10 % (v/v) in the final treatment medium.
Je-li maximální koncentrace odvozena od cytotoxicity, měla by být nejvyšší koncentrace zvolena tak, aby se dosáhlo 55 ± 5 % cytotoxicity za použití doporučených parametrů cytotoxicity (tj. snížení RICC a RPD u buněčných linií a snížení MI u primárních kultur lymfocytů na 45 ± 5 % u souběžné negativní kontroly).
If not well-established solvents are used (e.g. ethanol or acetone), their use should be supported by data indicating their compatibility with the test chemicals, the test system and their lack of genetic toxicity at the concentration used.
Je třeba dbát na to, aby byly interpretovány pouze ty pozitivní výsledky, které jsou vykazovány při vyšší hranici tohoto rozmezí cytotoxicity 55 ± 5 % (13).
In the absence of that supporting data, it is important to include untreated controls (see Appendix 1) to demonstrate that no deleterious or clastogenic effects are induced by the chosen solvent.
V případě špatně rozpustných zkoušených chemických látek, které nejsou cytotoxické při koncentracích nižších, než je jejich rozpustnost, by nejvyšší analyzovaná koncentrace měla na konci expozice zkoušené chemické látce vyvolat zákal nebo sraženinu viditelnou pouhým okem nebo pomocí inverzního mikroskopu.
Measuring cell proliferation and cytotoxicity and choosing treatment concentrations
Dokonce i v případech, kdy k výskytu cytotoxicity dochází při koncentracích vyšších, než je rozpustnost, se doporučuje testovat pouze při jedné koncentraci vyvolávající zákal nebo viditelné sraženiny, neboť sraženina může vést k falešným účinkům.
When determining the highest test chemical concentration, concentrations that have the capability of producing artifactual positive responses, such as those producing excessive cytotoxicity (see paragraph 22), precipitation in the culture medium (see paragraph 23), or marked changes in pH or osmolality (see paragraph 5), should be avoided.
Při koncentraci, kdy vzniká sraženina, je třeba dbát na to, aby sraženina nemohla ovlivňovat provádění zkoušky (např. barvení nebo hodnocení).
If the test chemical causes a marked change in the pH of the medium at the time of addition, the pH might be adjusted by buffering the final treatment medium so as to avoid artifactual positive results and to maintain appropriate culture conditions.
Užitečné může být stanovit rozpustnost v kultivačním médiu před pokusem.
Measurements of cell proliferation are made to assure that a sufficient number of treated cells have reached mitosis during the test and that the treatments are conducted at appropriate levels of cytotoxicity (see paragraphs 18 and 22).
Není-li pozorována sraženina nebo omezení cytotoxicity, měla by nejvyšší zkušební koncentrace odpovídat 10 mM, 2 mg/ml nebo 2 μl/ml, podle toho, která z uvedených hodnot je nejnižší (39) (40) (41).
Cytotoxicity should be determined with and without metabolic activation in the main experiment using an appropriate indication of cell death and growth.
Pokud u zkoušené chemické látky není stanoveno její složení, např. u látek s neznámým nebo proměnlivým složením, komplexních reakčních produktů nebo biologického materiálu (UVCB) (42), přírodního extraktu atd., může v případě nízké cytotoxicity být horní koncentrace vyšší (např. 5 mg/ml), aby se zvýšila koncentrace každé ze složek.
While the evaluation of cytotoxicity in an initial test may be useful to better define the concentrations to be used in the main experiment, an initial test is not mandatory.
Je však třeba poznamenat, že u humánních léčivých přípravků se tyto požadavky mohou lišit (43).
If performed, it should not replace the measurement of cytotoxicity in the main experiment.
Kontroly
Relative Population Doubling (RPD) or Relative Increase in Cell Count (RICC) are appropriate methods for the assessment of cytotoxicity in cytogenetic tests (13) (15) (35) (36) (55) (see Appendix 2 for formulas).
Pro každý časový interval sběru buněk by měly být použity souběžné negativní kontroly (viz odstavec 15) skládající se ze samotného rozpouštědla v kultivačním médiu a zpracované stejným způsobem jako exponované kultury.
In case of long-term treatment and sampling times after the beginning of treatment longer than 1,5 normal cell cycle lengths (i.e. longer than 3 cell cycle lengths in total), RPD might underestimate cytotoxicity (37).
Souběžné pozitivní kontroly jsou nutné pro prokázání schopnosti laboratoře identifikovat klastogeny za daných experimentálních podmínek a pro prokázání účinnosti exogenního systému metabolické aktivace, všude kde je to možné.
Under these circumstances RICC might be a better measure or the evaluation of cytotoxicity after 1,5 normal cell cycle lengths would be a helpful estimate using RPD.
Příklady pozitivních kontrol jsou uvedeny v tabulce 1 níže.
For lymphocytes in primary cultures, while the mitotic index (MI) is a measure of cytotoxic/cytostatic effects, it is influenced by the time after treatment it is measured, the mitogen used and possible cell cycle disruption.
V odůvodněných případech mohou být k pozitivní kontrole použity jiné chemické látky.
However, the MI is acceptable because other cytotoxicity measurements may be cumbersome and impractical and may not apply to the target population of lymphocytes growing in response to PHA stimulation.
Jelikož zkoušky na buňkách savců in vitro za účelem stanovení genetické toxicity jsou dostatečně standardizované, může se použití pozitivních kontrol omezit na experimenty s kontrolními klastogeny vyžadujícími metabolickou aktivaci.
While RICC and RPD for cell lines and MI for primary culture of lymphocytes are the recommended cytotoxicity parameters, other indicators (e.g. cell integrity, apoptosis, necrosis, cell cycle) could provide useful additional information.
Pokud je provedena souběžně se zkouškou bez aktivace se stejnou dobou trvání expozice, tato jediná odpověď v pozitivní kontrole prokáže činnost metabolického aktivačního systému a citlivost testovacího systému.
At least three test concentrations (not including the solvent and positive controls) that meet the acceptability criteria (appropriate cytotoxicity, number of cells, etc) should be evaluated.
Dlouhodobá expozice (bez S9) by však měla mít svou vlastní pozitivní kontrolu, protože doba trvání expozice bude odlišná než při zkoušce za použití metabolické aktivace.
Whatever the types of cells (cell lines or primary cultures of lymphocytes), either replicate or single treated cultures may be used at each concentration tested.
Každá pozitivní kontrola by měla být použita při jedné nebo více koncentracích, u nichž se očekává, že poskytnou reprodukovatelný a detekovatelný nárůst oproti pozadí, čímž se prokáže citlivost testovacího systému (tj. aby byl účinek zřetelný, ale aby při odečtu nevyšla ihned najevo identita kódovaného preparátu), a reakce by neměla být narušena cytotoxicitou přesahující limitní hodnoty stanovené ve zkušební metodě.
While the use of duplicate cultures is advisable, single cultures are also acceptable provided that the same total number of cells are scored for either single or duplicate cultures.
Referenční chemické látky doporučené pro posouzení způsobilosti laboratoře a pro výběr pozitivních kontrol.
The use of single cultures is particularly relevant when more than 3 concentrations are assessed (see paragraph 31).
Kategorie
The results obtained in the independent replicate cultures at a given concentration can be pooled for the data analysis (38).
Klastogeny působící bez metabolické aktivace
For test chemicals demonstrating little or no cytotoxicity, concentration intervals of approximately 2 to 3 fold will usually be appropriate.
methyl-methansulfonát
Where cytotoxicity occurs, the test concentrations selected should cover a range from that producing cytotoxicity as described in paragraph 22 and including concentrations at which there is moderate and little or no cytotoxicity.
mitomicyn C
Many test chemicals exhibit steep concentration response curves and in order to obtain data at low and moderate cytotoxicity or to study the dose response relationship in detail, it will be necessary to use more closely spaced concentrations and/or more than three concentrations (single cultures or replicates), in particular in situations where a repeat experiment is required (see paragraph 47).
itrochinolin-1-oxid
If the maximum concentration is based on cytotoxicity, the highest concentration should aim to achieve 55 ± 5 % cytotoxicity using the recommended cytotoxicity parameters (i.e. reduction in RICC and RPD for cell lines and reduction in MI for primary cultures of lymphocytes to 45 ± 5 % of the concurrent negative control).
cytosin arabinosid
Care should be taken in interpreting positive results only to be found in the higher end of this 55 ± 5 % cytotoxicity range (13).
Klastogeny vyžadující metabolickou aktivaci
For poorly soluble test chemicals that are not cytotoxic at concentrations lower than the lowest insoluble concentration, the highest concentration analysed should produce turbidity or a precipitate visible by eye or with the aid of an inverted microscope at the end of the treatment with the test chemical.
benzo[a]pyren
Even if cytotoxicity occurs above the lowest insoluble concentration, it is advisable to test at only one concentration producing turbidity or with a visible precipitate because artifactual effects may result from the precipitate.
cyklofosfamid
At the concentration producing a precipitate, care should be taken to assure that the precipitate does not interfere with the conduct of the test (e.g. staining or scoring).
POSTUP
The determination of solubility in the culture medium prior to the experiment may be useful.
Expozice zkoušené chemické látce
If no precipitate or limiting cytotoxicity is observed, the highest test concentration should correspond to 10 mM, 2 mg/ml or 2 μl/ml, whichever is the lowest (39) (40) (41).
Proliferující buňky se vystaví zkoušené chemické látce jak za přítomnosti metabolického aktivačního systému, tak bez něho.
When the test chemical is not of defined composition, e.g. a substance of unknown or variable composition, complex reaction products or biological material (UVCB) (42), environmental extract etc., the top concentration may need to be higher (e.g. 5 mg/ml), in the absence of sufficient cytotoxicity, to increase the concentration of each of the components.
Doba sběru buněk
It should be noted however that these requirements may differ for human pharmaceuticals (43).
Pro důkladné hodnocení, které by bylo zapotřebí pro vyvození závěru o negativním výsledku, by měly být splněny všechny tři následující zkušební podmínky za použití krátkodobé expozice s metabolickou aktivací a bez ní a dlouhodobé expozice bez metabolické aktivace (viz odstavce 43, 44 a 45):
Controls
buňky by měly být vystaveny zkoušené chemické látce bez metabolické aktivace na dobu 3–6 hodin a měly by být odebrány po takové době od zahájení aplikace, která odpovídá 1,5násobku normální délky buněčného cyklu (18),
Concurrent negative controls (see paragraph 15), consisting of solvent alone in the treatment medium and treated in the same way as the treatment cultures, should be included for every harvest time.
buňky by měly být vystaveny zkoušené chemické látce s metabolickou aktivací na dobu 3–6 hodin a měly by být odebrány po takové době od zahájení aplikace, která odpovídá 1,5násobku normální délky buněčného cyklu (18),
Concurrent positive controls are needed to demonstrate the ability of the laboratory to identify clastogens under the conditions of the test protocol used and the effectiveness of the exogenous metabolic activation system, when applicable.
buňky by měly být vystaveny nepřetržité expozicí bez metabolické aktivace až do odběru v době, která odpovídá 1,5násobku normální délky buněčného cyklu.
Examples of positive controls are given in the table 1 below.
Určité chemické látky (např. analogy nukleosidů) lze snáze detekovat při dobách aplikace nebo odběru delších než 1,5násobek délky cyklu (24).
Alternative positive control chemicals can be used, if justified.
V případě, že kterákoli z výše uvedených zkušebních podmínek vede k pozitivní odpovědi, je možné, že nebude nutné zkoumat kterýkoli z ostatních režimů aplikace.
Because in vitro mammalian cell tests for genetic toxicity are sufficiently standardized, the use of positive controls may be confined to a clastogen requiring metabolic activation.