natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Agarózový gel skladujte v 1 × pufru TAE až do konce programů PCR.
Column (Number of concentrations between 100 and 10, or between 10 and 1) [1]
Program PCR s aktinem
A series of three (or more) successive concentrations may be chosen from a column.
Cílem tohoto programu PCR je prokázat, že DNA ve vzorku není poškozena.
Mid-points between concentrations in column (x) are found in column (2x + 1).
Speciální primer:
The values listed can represent concentrations expressed as percentage per volume or weight (mg/l or μg/l).
‚Mact1(horní/přímý)‘ → TTC AAC AGC CCT GCC ATG TA
Values can be multiplied or divided by any power of 10 as appropriate.
‚Mact2(dolní/reverzní)‘ → GCA GCT CAT AGC TCT TCT CCA GGG AG
Column 1 might be used if there was considerable uncertainty on the toxicity level.
Program:
Guidance for homogenisation of head & tail from juvenile zebrafish, fathead minnow, three spined stickleback and Japanese medaka
Cyklus (35krát):
The purpose of this section is to describe the procedures that occur prior to the quantification of the VTG concentration.
Denaturace
Other procedures that result in comparable VTG quantification can be used.
→ 45 s při 95 °C
It is an option to determine the VTG concentration in blood plasma or liver instead of head/tail homogenate.
Nasedání
The head and tail are cut of the fish in accordance with the test description.
→ 45 s při 56 °C
All dissection instruments, and the cutting board should be rinsed and cleaned properly (e.g. with 96 % ethanol) between handling of each single fish to prevent “VTG pollution” from females or induced males to un-induced males.
Prodloužení
When a homogenous mass is achieved an amount of 4-10 time the tissue weight of ice-cold homogenisation buffer is added (note the dilution).
→ 1 min při 68 °C
The samples are placed on ice until centrifugation at 4 °C at 50000 g for 30 min.
15 min při 68 °C
Use a pipette to dispense portions of 20 to 50 μl (note the amount) supernatant into at least two tubes by dipping the tip of the pipette below the fat layer on the surface and carefully sucking up the supernatant without fat- or pellet fractions.
Program PCR k zjištění genů X a Y
Place on ice during use
Při tomto programu se vzorky s nepoškozenou DNA použijí k zjištění genů X a Y.
Homogenisation buffer:50 mM Tris-HCl pH 7,4;
Samčí DNA by se měla projevit jedním dvojitým proužkem a samičí DNA jedním jednoduchým proužkem (po obarvení a gelové elektroforéze).
1 % Protease inhibitor cocktail (Sigma):
Pro tento program by měla být zařazena jedna pozitivní kontrola pro samčí vzorek (vzorek XY) a jedna pro samičí vzorek (vzorek XX).
12 ml Tris-HCl pH 7,4 + 120 μl Protease inhibitor cocktail (or equivalent protease inhibitor cocktails).TRIS:
‚PG 17.5‘ (horní/přímý) → CCG GGT GCC CAA GTG CTC CCG CTG
TRIS-ULTRA PURE (ICN)Protease inhibitor cocktail:
‚PG 17.6‘ (dolní/reverzní) → GAT CGT CCC TCC ACA GAG AAG AGA
From Sigma (for mammalian tissue) Product number P 8340.
Cyklus (40krát):
Guidance for quantification of head & tail homogenate vitellogenin in zebrafish (Danio rerio) (modified from Holbech et al., 2001). other procedures using homologous antibodies and standards can be used
→ 45 s při 55 °C
Microtiter plates (certified Maxisorp F96, Nunc, Roskilde Denmark) previously coated with 5 μg/ml anti zebrafish lipovitellin-IgG are thawed and washed 3 times with washing buffer (*).
→ 1 min 30 s při 68 °C
Purified zebrafish vitellogenin standard [1] is serially diluted to 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10 and 20 ng/ml in dilution buffer (**) and samples are diluted at least 200 times (to prevent matrix effect) in dilution buffer and applied to the plates.
Program PCR k zjištění genů Y jako ‚kontrola‘ pro program PCR k zjištění genů X a Y:
An assay control is applied in duplicate.
Tento program PCR ověřuje výsledky ‚programu PCR k zjištění genů X a Y‘.
150 μl are applied to each well.
‚Samčí vzorky‘ by měly vykázat jeden proužek a ‚samičí vzorky‘ by neměly vykázat žádný proužek (po obarvení a gelové elektroforéze).
Standards are applied in duplicate and samples in triplicate.
‚DMTYa (horní/přímý)‘ → GGC CGG GTC CCC GGG TG
Incubate over night at 4 °C on a shaker.
‚DMTYd (dolní/reverzní)‘ → TTT GGG TGA ACT CAC ATG G
The plates are washed 5 times with washing buffer (*)
Barvení vzorků PCR:
HRP coupled to a dextran chain (e.g. AMDEX A/S, Denmark) and conjugated antibodies are diluted in washing buffer;
Barvicí roztok:
Actual dilution differs by batch and age.
0,25 % bromfenolová modř
150 μl are applied to each well and the plates are incubated for 1 hour at room temperature on a shaker.
0,25 % xylen kyanol
The plates are washed 5 times with washing buffer (*) and the bottom of the plates is carefully cleaned with ethanol.
Pomocí pipety se do každé jednotlivé zkumavky přidá 1 μl barvicího roztoku.
150 μl TMB plus (***) are applied to each well.
Zahájení gelové elektroforézy:
Protect the plate against light with tinfoil, and watch the colour development on a shaker.
Připravený 1 % agarózový gel se přenese do komory pro gelovou elektroforézu naplněné 1 × pufrem TAE.
When the standard curve is fully developed the enzyme activity is stopped by adding 150 μl 0,2 M H2SO4 to each well.
10–15 μl každého obarveného vzorku PCR se pipetou umístí do jamky v agarózovém gelu.
The absorbance is measured at 450 nm (e.g. on a Molecular Devices Thermomax plate reader).
Do samostatné jamky se pipetou nanese také 5–15 μl velikostního markeru – 1kb žebříku (Invitrogen).
Data are analysed on the associated software (e.g. Softmax).
Zahájí se elektroforéza při 200 V.
Washing buffer:
Po 30–45 min se proces ukončí.
PBS-stock (****)
Určení pruhů:
Adjust pH to 7,3 and fill to 5 l with millipore H2O.
Agarózový gel se omyje v destilované H2O.
Store at 4 °C.
Následně se agarózový gel na 15–30 min umístí do ethidiumbromidu.
Dilution buffer:
Poté by měl být pořízen snímek agarózového gelu v UV transiluminátoru.
PBS-Stock (****)
Nakonec se vzorky analyzují porovnáním s pruhem (nebo pruhy) pozitivní kontroly a s markerem (žebříkem).
Adjust pH to 7,3 and fill to 1 l with millipore H2O.
Dodatek 10
TMB plus is a “ready-to-use” substrate produced by KemEnTec (Denmark).
Návod k odběru tkáňových vzorků pro určení genetického pohlaví u koljušky tříostné metodou PCR
It is sensitive to light.
Odběr tkáňových vzorků a extrakce DNA
PBS stock
DNA lze extrahovat pomocí různých komerčně dostupných činidel a ručních i automatizovaných extrakčních systémů.
HPO4 · 2H2O
Níže je ve stručnosti popsán protokol používaný v laboratoři CEFAS, Weymouth, popřípadě s doplněnými alternativními postupy.
Adjust pH to 6,8 and fill with millipore H2O to 2 l.
Z každé jednotlivé ryby se jemnými nůžkami odstřihne malý kousek tkáně (10–20 mg) z dorzálně laterální oblasti (po odstranění hlavy a ocasu pro analýzu VTG).
Store at room temperature.
Tkáň se vloží do zkumavky a ta se buď umístí přímo do kapalného dusíku (pro skladování při teplotě – 80 °C), nebo se naplní 70 % ethanolem (pro přepravu a následné skladování při teplotě 4 °C).
Battelle AP4.6.04 (1,18 mg/ml (AAA)), purified according to:
Nůžky se po každé jednotlivé rybě očistí v 70 % ethanolu a poté v destilované vodě a osuší se hedvábným papírem.
Guidance for the preparation of tissue sections for sex determination and staging of gonads
Ethanol (je-li přítomen) se odstraní odsátím a tkáň se nechá přes noc vyluhovat s proteinázou K ve 400 μl pufru ATL (Qiagen).
The purpose of this section is to describe the procedures that occur prior to the evaluation of histological sections.
Poměrný podíl (200 μl) výluhu se přemístí do S-bloku s 96 jamkami (Qiagen) a DNA se extrahuje v 96jamkovém formátu za pomoci biorobota Qiagen Universal BioRobot a soupravy QIamp Investigator BioRobot kit.
Other procedures that result in similar sex determination and gonadal staging can be used.
DNA se eluuje v 50 μl vody prosté DNázy a RNázy.
With a few exceptions, these procedures are similar for Japanese medaka (JMD) and zebrafish (ZF).
Použijí-li se pro extrakci DNA tvrdé tkáně (jako je hřbetní nebo prsní ploutev), může být nezbytné homogenizovat vzorek v lýzovém pufru za pomoci homogenizátoru FastPrep® nebo rovnocenného systému pro narušení tkání.
Euthanasia, Necropsy, and Tissue Fixation
Alternativní postup:
Objectives:
Tkáň se nechá přes noc vyluhovat s proteinázou K ve 400 μl lýzového pufru G2 (Qiagen) a DNA se extrahuje z 200 μl výluhu za pomoci buď soupravy EZ-1 DNA easy tissue kit a biorobota EZ-1, nebo soupravy DNA easy tissue mini kit.
Provide for the humane sacrifice of fish.
DNA se eluuje v objemu 50 μl.
Obtain necessary body weights and measurements.
Tkáně se zpracují pomocí činidla DNAzol.
Evaluate secondary sex characteristics.
Vzorky tkání se krátce (10 minut) lýzují v 1 ml DNAzolu v mikrocentrifugační zkumavce o objemu 1,5 ml a poté se odstředí 5 minut při 13000 ot/min, aby se odstranily veškeré pevné částice.
Dissect tissues for VTG analysis.
Lýzovaný vzorek se poté přemístí do nové mikrocentrifugační zkumavky o objemu 1,5 ml, která obsahuje 500 μl 100 % ethanolu molekulární kvality, a 10 minut se odstředí při 13000 ot/min, aby se vysrážela DNA.
Fixation of the gonads.
Opět, použijí-li se tvrdé tkáně (prsní ploutev), může být nezbytné před extrakcí DNA homogenizovat vzorek v lýzovém pufru za pomoci homogenizátoru FastPrep® nebo rovnocenného systému pro narušení tkání.
Fish should be sacrificed immediately prior to necropsy.
DNA se skladuje až do použití při teplotě – 20 °C.
Therefore, unless multiple prosectors are available, multiple fish should not be sacrificed simultaneously.
při těchto postupech se musí používat rukavice.
Using the small dip net, a fish is removed from the experimental chamber and transported to the necropsy area in the transport container.
Byly provedeny amplifikace pomocí 2,5 μl extraktu DNA v 50 μl objemu do reakce za použití primerů Idh locus (popsaných v publikaci Peichel et al., 2004.
The fish is removed from the solution when there is cessation of respiration and the fish is unresponsive to external stimuli.
Current Biology 1:1416–1424):
The fish is wet weighed.
Přímý primer
For preparation of tissues for VTG analysis, the fish can be placed on a corkboard on the stage of a dissecting microscope.
Reverzní primer
For zebrafish the head is cut right behind the pectoral fin and tail is cut right behind the dorsal fin.
Existuje řada dodavatelů vhodných činidel pro PCR.
For Japanese medaka the abdomen is opened via a carefully made incision that extends along the ventral midline from the pectoral girdle to a point just cranial to the anus.
Níže uvedená metoda se v současnosti používá v Centru pro životní prostředí, rybolov a akvakulturu (CEFAS), v laboratořích ve Weymouthu.
Using the small forceps and small scissors, the liver is carefully removed.
Příprava ‚reakční směsi‘ (50 μl na každý vzorek):
Specimen for VTG analysis are placed in eppendorf tubes and immediately frozen in liquid nitrogen.
Pracovní roztok (‚mastermix‘) se připraví následujícím způsobem.
The carcass including the gonads is placed into a pre-labelled plastic tissue cassette, which is transferred into Davidson's or Bouin's fixative.
Lze jej připravit předem a uskladnit zmrazený při teplotě – 20 °C až do použití.
The volume of fixative should be at least 10 times the approximated volume of the tissues.
Mastermixu se připraví dostatečné množství i pro negativní kontrolu (použije se pouze voda jakosti pro molekulární biologii).
The fixative container is gently agitated for five seconds to dislodge air bubbles from the cassette.
Objem (koncentrace zásobního roztoku) na vzorek
All tissues remain in Davidson's fixative overnight, followed by transfer to individual containers of 10 % neutral buffered formalin the next day.
reakční pufr GoTaq®
Containers with cassettes are gently agitated for 5 seconds to ensure adequate penetration of formalin into cassettes.
Nukleotidy (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Tissues remain in Bouins fixative for 24 h, followed by transfer to 70 % ethanol.
0,5 μl (25 mM každý)
Tissue Processing
250 μM každý
Dehydrate tissue for adequate penetration of paraffin.
Přímý primer
Impregnate the tissue with paraffin to maintain tissue integrity and create a firm surface for microtomy.
0,5 μl (0,1 nmol/μl)
Labelled tissue cassettes are removed from formalin/ethanol storage and the cassettes are placed in the processing basket(s).
Reverzní primer
The processing basket is loaded in the tissue processor.
2,0 μM
The processing schedule is selected.
Voda jakosti pro molekulární biologii
After the tissue processor has completed the processing cycle, the basket(s) may be transferred to the embedded station.
GoTaq polymeráza
Embedding
47,5 μl se odpipetuje do tenkostěnné zkumavky pro PCR o objemu 0,5 ml, označené etiketou.
Objective:
Do vhodně označené zkumavky se přidá 2,5 μl purifikované DNA.
Properly orient the specimen in solidified paraffin for microtomy.
Opakuje se pro všechny vzorky a pro negativní kontrolu.
The basket(s) of cassettes is/are removed from the processor and immersed in the paraffin-filled front chamber of the embedding station thermal console or the cassettes are moved to a separate paraffin heater.
Pokryje se 2 kapkami minerálního oleje.
The first cassette to be embedded is removed from the front chamber of the thermal console or the paraffin heater.
Alternativně lze použít termocykler s nahřátým víčkem.
The cassette lid is removed and discarded, and the cassette label is checked against the animal records to resolve potential discrepancies prior to embedding.
Uzavře se víčky.
An appropriately sized embedding mould is selected.
Vzorky se 5 minut denaturují v termocykleru Peltier PTC-225 při teplotě 94 ± 2 °C a následuje 39 cyklů 1 minuta při teplotě 94 ± 2 °C, 1 minuta při teplotě 55 ± 2 °C, 1 minuta při teplotě 72 ± 2 °C a konečná extenze 10 minut při teplotě 72 ± 2 °C.
The mould is held under the spout of the dispensing console and filled with molten paraffin.
Příprava agarózového gelu (2 %):
The specimen is removed from the cassette and placed in the molten paraffin in the mould.
Produkty PCR se tradičně zpracovávají v 20 % agarózovém gelu, který obsahuje ethidiumbromid.
This is repeated with 4-8 specimens for each paraffin mould.
Lze rovněž použít systémy kapilární elektroforézy.
The position of individual fish is marked by putting fish no 1 in 180 degrees to fish 2-4/8.
Odváží se 2 g agarózy ve 100 ml 1 × pufru TAE
Additional paraffin is added to cover the specimen.
Ohřeje se v mikrovlnné troubě (asi 2–3 min), aby se agaróza rozpustila.
The mould with the cassette base is placed on the cooling plate of the cryo console.
Přidají se 2 kapky ethidiumbromidu v konečné koncentraci 0,5 μg/ml.
After the paraffin has solidified, the block (i.e., the hardened paraffin containing the tissues and the cassette base) is removed from the mould.
Horký roztok se přenese do zařízení na odlévání gelů.
Microtomy
Gel se nechá ztuhnout.
Cut and mount histological sections for staining.
Gelová elektroforéza:
The initial phase of microtomy termed “facing” is conducted as follows:
Agarózový gel se přemístí do elektroforézního zařízení a ponoří se do 1 × pufru TAE.
The paraffin block is placed in the chuck of the microtome.
20 μl z každého vzorku se naloží do samostatných jamek a do náhradní jamky se přidá marker molekulové hmotnosti (100 bp DNA ladder, Promega).
The chuck is advanced by rotating the microtome wheel and thick sections are cut from the paraffin surface of the block until the knife reaches the embedded tissues.
Elektroforéza se provádí 30–45 minut při 120 V.
The section thickness on the microtome is set between 3 - 5 microns.
Vizualizace produktů amplifikace
The chuck is advanced and multiple sections are cut from the block to remove any artefacts created on the cut surface of the tissue during rough trimming.
Pokud byl do agarózového gelu přidán ethidiumbromid, jak bylo popsáno výše, produkty DNA se vizualizují pod zdrojem UV záření.
The block can be removed from the chuck and placed facedown on ice to soak the tissue.
Alternativně se agarózový gel obarví ponořením do zředěného roztoku ethidiumbromidu (0,5 μg na ml vody) po dobu 30 minut před vizualizací.
The next phase of microtomy is final sectioning and mounting of tissue sections on slides.
Dodatek 11
These procedures are conducted as follows:
Postup umělého oplodnění u koljušky tříostné
If the block has been placed on ice, the block is removed from the ice and replaced in the chuck of the microtome.
Účelem tohoto oddílu je popsat postup, jak získat oplodněné jikry koljušky tříostné se zřetelem k jejich použití ve zkoušce FSDT.
With the section thickness on the microtome set to 3 - 5 microns, the chuck is advanced by rotating the microtome wheel.
Postupy
Sections are cut from the block until a “ribbon” containing at least one acceptable section including the gonads has been produced.
Získání spermatu od samečků
(As necessary during sectioning, the block may be removed from the chuck, placed on ice to soak the tissue, and replaced in the chuck.)
Dobře vybarvený sameček z požadované populace se usmrtí.
The sections are floated flat on the surface of the water in the water bath.
Z obou boků ryby se vyříznou varlata.
An attempt is made to obtain at least one section that contains no wrinkles and has no air bubbles trapped beneath it.
Varlata jsou obvykle silně pigmentované struktury tyčinkovitého tvaru, které jsou snadno rozeznatelné v laterální střední linii těla.
A microscope slide is immersed beneath the best section, which is lifted out of the water using the slide.
Použije se některá z následujících metod:
This process is referred to as “mounting” the section on the slide.
Jemnými nůžkami se vede řez od kloaky v délce 1–1,5 cm jedním střihem přibližně pod úhlem 45 stupňů.
Three sections are prepared for a set of fish.
Skalpelem se provede malý řez na boku ryby poněkud posteriorně za pánví a přímo ventrálně od laterálních destiček.
The second and third sections are taken at 50 micron intervals following the first section.
Varlata se jemnou pinzetou vyjmou a umístí se do Petriho misky.
If the fish are not embedded with their gonads in the same sectioning level, more sections are to be made to ensure that at least six sections including the gonads are obtained from each fish.
Každé varle se pokryje 100 μl čerstvě připraveného Hankova konečného roztoku.
With a slide-marking pen, the block number from which the slide was produced is recorded on the slide.
Varlata se břitvou nebo skalpelem nakrájejí na malé kostičky.
The slide is placed in a staining rack.
Tím se uvolní sperma, které dodá Hankovu roztoku mléčný vzhled.
The block is removed from the chuck and placed facedown for storage.
Tekutina obsahující sperma se přidá do zkumavky, přičemž se dbá na to, aby při přenosu pipetou neobsahovala žádné kousky tkáně varlat.
Staining, Cover slipping, and Slide Labelling
Do zkumavky se přidá 800 μl of Hankova konečného roztoku a dobře se promíchá.
Stain the sections for histopathological examination
V případě potřeby lze samečka uchovávat fixací ve 100 % ethanolu nebo v jiném požadovaném fixativu.
Permanently seal mounted and stained tissues.
To je zvlášť důležité, pokud se při studii určuje parentální původ potomků.
Permanently identify stained sections in a manner that allows complete traceability.
Většinu požadovaných zásobních roztoků lze připravit předem, avšak zásobní roztok 5 a následně konečný roztok by měly být čerstvě připraveny v den použití.
Staining
Zásobní roztok 1
Slides are air-dried overnight before staining.
Zásobní roztok 2
Cover slipping
HPO4 (bezvodý)
Cover slips can be applied manually or automatically.
Zásobní roztok 3
A slide is dipped in xylene or TissueClear, and the excess xylene/TissueClear is gently knocked off the slide.
Zásobní roztok 4
Approximately 0,1 ml of mounting medium is applied near the end of the slide opposite to the frosted end or on the cover slip.
MgSO4 · 7H2O
The cover slip is tilted at a shallow angle as it is applied to the slide.
Zásobní roztok 5 (čerstvě připravený)
Labelling
Je-li některá z výše uvedených solí již k dispozici, avšak s odlišným obsahem vody (např. 2H2O, a nikoli bezvodá), lze ji přesto použít, ale nejprve je třeba upravit její hmotnost na základě molekulové hmotnosti).
Each slide label should contain the following information.
Pro získání Hankova konečného roztoku se zkombinují v tomto pořadí:
Laboratory name
zásobní roztok 1
Specimen No./Slide No.
zásobní roztok 2
Chemical/Treatment group
zásobní roztok 3
Statistical Flow Chart for vitellogenin analysis
zásobní roztok 4
Dunnett test
zásobní roztok 5
variances stabilising transform?
Před použitím se dobře promíchá.
Variances unequal Variances equal No Yes
Oplodnění
Yes Step-down trend test on replicate means
Z požadované populace se vyberou velké, gravidní samičky;
<=3 reps per conc
samičky jsou připraveny k tření teprve tehdy, když jsou vidět jikry vyčnívající z kloaky.
Normalising transform?
Připravené samičky zaujímají typickou polohu ‚hlavou nahoru‘.
Nested ANOVA not normal
Prstem se jemně přejede po boku ryby směrem k ocasu, aby se napomohlo vytlačení vaku s jikrami do nové Petriho misky.
Nested ANOVA normal Monotone
Totéž se opakuje na druhém boku a ryba se vrátí do nádrže.
Drop water control
Jikry lze pomocí jemného štětečku rozptýlit (vytvořit monovrstvu).
Dunn test
Je důležité dbát na to, aby spermatu bylo vystaveno co nejvíce jiker, takže je užitečné, aby pokrývaly co největší plochu.
Step-down Jonckheere or Williams' test
Jikry se udržují vlhké tím, že se obalí navlhčeným hedvábným papírem (je důležité, aby se jikry přímo nedotýkaly vody, neboť to může způsobit předčasně ztuhnutí chorionu a zabránit oplodnění).
Rep means not normal or not homogenous
Počet jiker, které může každá samička produkovat, se velmi liší, ale v průměru by se z jedné gravidní samičky mělo snadno získat přibližně 150 jiker.
Rep means not normally distributed
25 μl spermatu ve směsi s Hankovým roztokem se štětečkem rovnoměrně nanese na celý povrch jiker.
Combine controls, retains subgroups
Po začátku oplodnění jikry rychle (během minuty) ztuhnou a změní barvu.
Compare controls using Wilcoxon or T-test.
Je-li odhadovaný počet jiker větší než 150, postup se opakuje.
Do controls differ?
Obdobně pokud jikry během minuty neztuhnou, přidá se o něco více spermatu.
Both solvent and non-solvent control are present
Přidání většího množství spermatu nemusí nutně zvýšit míru oplodnění.
Statistical Flow Chart for sex ratio analysis
Jikry a roztok se spermatem by měly být ponechány pro ‚interakci‘ nejméně 15 minut a do 1,5 hodiny po oplodnění by oplodněné jikry měly být umístěny do expozičních akvárií.
Apply step-down Jonckheere-Terpstra test (+) to determine NOEC
Postup se opakuje s další samičkou, dokud se neodebere požadovaný počet jiker.
Dunn or Mann-Whitney U-test w/Bonferroni-Holm adjustment to determine NOEC
Několik jiker z poslední sady se dá stranou a zafixují se v 10 % kyselině octové.
Use Dunnett test if homogenous variances (*), Tamhane-Dunnett (T3) test otherwise, to determine NOEC
Počítání jiker a jejich distribuce do zkušebních akvárií
Are data normally distributed?
Jikry by měly být rovnoměrně distribuovány mezi všechny úrovně expozice, aby nedošlo ke genetickému zkreslení.
Are data consistent with monotone dose-response?
Každá sada oplodněných jiker by pomocí tupého nástroje (tj. entomologickou pinzetou se širokým břitem nebo pomocí očkovací kličky) měla být rozdělena do stejně velikých skupin (tolika, kolik je úrovní expozice).
(‡) Or other agreed control selection
Mají-li být čtyři opakování pro každou expozici, každé s 20 jikrami, pak se do každého expozičního akvária musí distribuovat 80 jiker.
After arcsin square-root transform
Pokud není jisté, že bude dosaženo 100 % míry oplodnění, může být užitečné přidat 20 % navíc (tj. 96 jiker na každou úroveň expozice).
(+) With fewer than 5 experimental units per treatment exact J-T or M-W test should be used if available
Vně sítě chráněné otcem jsou jikry koljušky velmi náchylné k plísňovým infekcím.
Combine controls
V této souvislosti je velice důležité, aby byly všechny jikry během prvních 5 dnů zkoušky ošetřeny methylenovou modří.
Drop water control (‡)
Zásobní roztok methylenové modři se připraví s koncentrací 1 mg/ml a přidá se do expozičních akvárií, aby se získala maximální konečná koncentrace 2,125 mg/l.
Compare controls using t-Test.