natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Cílem ošetření všech inokul antisérem proti IPNV je zabránit cytopatickému efektu (CPE) vyvolanému IPNV v naočkovaných buněčných kulturách.
Tissues for virological examination on cell culture
Takto lze snížit dobu trvání virologických vyšetření a také počet případů, u kterých by se výskyt CPE musel zvážit jako možný důkaz přítomnosti VHSV nebo IHNV.
Before shipment or transfer to the laboratory, pieces of the organs to be examined shall be removed from the fish with sterile dissection tools and transferred to sterile plastic tubes containing transport medium.
Pokud vzorky pocházejí z výrobních jednotek, které se považují za prosté IPN, lze ošetření inokula antisérem IPNV vynechat.
The quantity of fish material suitable for virological examination on cell culture and by RT-qPCR is dependent on fish size.
Jestliže byly vzorky odebrány do transportního média, postupuje se podle bodů I.4.2 a I.4.3.
Thus, whole alevin (body length < 4 cm), viscera including kidney (4 cm < body length < 6 cm) or, for larger size fish, kidney, spleen, heart and/or encephalon, and ovarian fluid from brood fish at the time of spawning shall be the tissues to be sampled.
Po odstředění se odebere supernatant a extrahuje RNA.
Ovarian or seminal fluid or organ pieces from a maximum of 10 fish may be collected in one sterile tube containing at least 4 ml transport medium and represent one pooled sample.
K analýze tkání ryb konzervovaných v činidle pro stabilizaci RNA je třeba provést další práce, přičemž doba na jejich provedení je dána teplotou, při níž se vzorky skladují, takto:
The virological examination on cell culture shall be started as soon as possible and no later than 48 hours after the collection of the samples.
vzorky skladované při 37 °C: jeden den,
In exceptional cases, the virological examination may be started at the latest within 72 hours after the collection of the material, provided that the material to be examined is protected by a transport medium and that the temperature requirements during transportation can be fulfilled.
vzorky skladované při 25 °C: jeden týden,
Samples for reversed transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR or RT-qPCR) analysis
vzorky skladované při 4 °C: jeden měsíc,
Samples shall be taken from the fish in accordance with the procedure described in point I.1.1 using a sterile instrument and transferred to a sterile plastic tube containing transport medium.
vzorky skladované při – 20 °C: neomezeně.
Tissue from 10 fish may be collected in one tube and shall represent one pooled sample.
Se vzorky smísenými v činidle pro stabilizaci RNA se zachází jako s jedním vzorkem v tomto činidle.
However, in case the amount of inoculum is small, tissue from up to five fish may be used.
Vzorky odebrané do činidel pro stabilizaci RNA se nepoužijí k buněčné kultivaci.
Alternatively, samples may be pooled in RNA stabilization reagents, such as 0,2 g tissue/ml reagent according to the recommendation from the manufacturers, although each fish shall be processed individually and shall not be pooled in the samples because of the small amount of material to be used for extraction.
Jelikož mají relevantní protokoly RT-qPCR podobnou nebo vyšší citlivost než kultivační metody, lze za přijatelné řešení považovat, pokud se v kultivačním médiu pro PCR použije supernatant z homogenizovaného tkáňového materiálu ze směsi orgánů z až 10 ryb.
Whole fish may also be sent to the laboratory.
V tomto případě je však často obtížné odebrat do jedné zkumavky reprezentativní materiál z až 10 ryb, a proto se počet ryb na směsný vzorek sníží na 2 až 5.
However, freezing of the samples shall be avoided.
Virologické vyšetření na buněčné kultuře
The temperature of a sample during transit must never exceed 10 °C and ice must still be present in the transport box at receipt or one or more freeze blocks must still be partly or completely frozen.
Ve vhodném médiu, konkrétně v Eaglově minimálním esenciálním médiu (MEM) nebo v jeho modifikacích, doplněném 10 % fetálním bovinním sérem a antibiotiky ve standardních koncentracích se při teplotě 20 až 30 °C kultivuje buněčná linie potěru slunečnice modroskřelé (BF-2) či buněčná linie gonád pstruha duhového (RTG-2), a buď buňky Epithelioma papulosum cyprini (EPC), nebo jelečka velkohlavého (FHM).
Whole fish may be sent to the laboratory if the temperature requirements referred to in the first paragraph during transportation can be fulfilled.
Buněčné kultury, do kterých se naočkovává tkáňový materiál ryb, musí být mladé, obvykle se pokud možno použijí jeden den staré buněčné linie; za přijatelné řešení lze však považovat i použití buněčných linií starých 4 až 48 hodin.
Live fish may also be shipped.
Při naočkování musí buňky aktivně růst.
Collection of supplementary diagnostic material
Orgánová suspenze ošetřená antibiotiky se naočkuje do buněčných kultur ve dvou stupních ředění: primární ředění a dále tímto roztokem ředěným v poměru 1: 10, čímž se dosáhne konečného ředění tkáňového materiálu v médiu buněčných kultur v poměru 1: 100, respektive 1: 1000, a zabrání se tak homologické interferenci.
When approved by the diagnostic laboratory, other fish tissues may be collected as well and prepared for supplementary examinations.
Naočkovat je třeba alespoň dvě buněčné linie uvedené v bodě I.5.1.
Preparation of samples for cell culture examination and RT-qPCR
Poměr mezi velikostí inokula a objemem kultivačního média činí asi 1: 10.
Freezing in exceptional cases
U každého zředění a každé buněčné linie se použije plocha buněčných kultur o velikosti minimálně 2 cm2, což odpovídá jedné jamce na 24jamkové kultivační destičce.
Where practical difficulties arise, which make it impossible to process the samples within 48 hours after the collection of the fish tissues, it may be acceptable to freeze the tissue specimens in transport medium at – 20 °C or below and to carry out virological examination within 14 days.
Naočkované buněčné kultury se inkubují sedm až deset dnů při teplotě 15 °C.
Records shall be kept with details on the reason for each freezing of fish tissue samples.
Pokud se barva kultivačního média změní z červené na žlutou, což naznačuje překyselení, je třeba upravit hodnotu pH sterilním roztokem hydrogenuhličitanu nebo jinými látkami s obdobným účinkem tak, aby byla zajištěna vnímavost buněk na virovou infekci.
Homogenisation of organs
K přezkoušení vnímavosti buněčných kultur se minimálně každých šest měsíců nebo při podezření na sníženou citlivost provádí titrace hluboce zmrazeným zásobním roztokem VHSV nebo IHNV.
In the laboratory, the fish tissue in the tubes shall be completely homogenised, either by stomacher, blender or mortar and pestle with sterile sand, and subsequently suspended in the original transport medium.
Použije se pokud možno postup popsaný v oddíle III.
If a sample consists of a whole fish less than 4 cm long, it shall be minced with sterile scissors or scalpel after removal of the body behind the gut opening.
U naočkovaných buněčných kultur je třeba pravidelně (minimálně třikrát týdně) při 40–150násobném mikroskopickém zvětšení kontrolovat výskyt cytopatického efektu (CPE).
If a sample consists of a whole fish with body length between 4 cm and 6 cm, the viscera including kidney shall be collected.
V případě, že je pozorován CPE, je třeba okamžitě zahájit postup identifikace viru v souladu s bodem I.6.
If a sample consists of a whole fish more than 6 cm long, the tissue specimens shall be collected as described in point I.1.
Subkultivace
The tissue specimens shall be minced with sterile scissors or scalpel and homogenised as described in the first paragraph of this point and suspended in transport medium.
Pokud se cytopatický efekt po primární sedmi až desetidenní inkubaci nevyskytne, provede se subkultivace na čerstvé buněčné kultury, přičemž je třeba použít podobnou buněčnou plochu jako u primární kultury.
The final ratio between tissue material and transport medium shall be adjusted in the laboratory to 1:10.
Alikvotní množství média (supernatantu) ze všech kultur či jamek, jež tvoří primární kulturu, se v závislosti na buněčné linii sedm až deset dní po naočkování smísí do jednoho směsného vzorku.
Centrifugation of homogenate
Alternativně lze alikvotní množství 10 % média, jež tvoří primární kulturu, naočkovat přímo do jamky s čerstvou buněčnou kulturou (subkultivace z jamky do jamky).
If the sample has been shipped in a transport medium, the treatment of the supernatant with antibiotics may be omitted.
Před naočkováním lze provést preinkubaci roztoků s antisérem IPNV v příslušném roztoku, a to podle popisu v bodě I.4.3.
Where practical difficulties arise, such as incubator breakdown or problems with cell cultures, which make it impossible to inoculate cells within 48 hours after the collection of the fish tissue samples, the supernatant may be frozen at – 80 °C and virological examination may be carried out within 14 days.
Naočkované kultury se následně inkubují sedm až deset dní při teplotě 15 °C a kontrolují podle bodu I.5.4.
If the collected supernatant is stored at – 80 °C within 48 hours after the sampling, it may be reused only once for virological examination.
Pokud se během prvních tří dnů inkubace vyskytne toxický CPE, musí být v této fázi provedena subkultivace; buňky se však poté musí sedm dní inkubovat a opět subkultivovat a znovu sedm dní inkubovat.
Prior to the inoculation of the cells, the supernatant shall be mixed with equal parts of a suitably diluted pool of antisera to the indigenous serotypes of Infectious pancreatic necrosis (IPN) virus and incubated with this for a minimum of one hour at 15 °C or a maximum of 18 hours at 4 °C.
Pokud se toxický CPE vyskytne po třech dnech, buňky se jednou pasážují a inkubují se, tak aby od prvního naočkování uplynulo celkem 14 dní.
The titre of the antiserum shall be at least 1/2000 in a 50 % plaque neutralisation test.
V posledních sedmi dnech inkubace se nesmí vyskytnout žádná známka toxicity.
Treatment of all inocula with antiserum to IPN virus aims at preventing cytopathic effect (CPE) due to IPN virus from developing in inoculated cell cultures.
Pokud se přes ošetření antibiotiky vyskytne bakteriální kontaminace, je třeba před subkultivací provést po dobu 15 až 30 minut za teploty 2 až 5 °C odstředění při 2000 až 4000 × g nebo filtraci supernatantu přes filtr s velikostí pórů 0,45 μm (s membránou s nízkým vázáním proteinů), nebo oba tyto kroky.
This will reduce the duration of the virological examinations as well as the number of cases in which occurrence of CPE would have to be considered potentially indicative of VHSV or IHNV.
Jinak je při subkultivaci postup totožný jako postup u toxického cytopatického efektu popsaný ve čtvrtém odstavci tohoto bodu.
When samples come from production units, which are considered free from IPN, the treatment of inocula with antiserum to IPN virus may be omitted.
Nedojde-li k CPE, lze vyšetření prohlásit za negativní.
Sample preparation for RT-PCR and RT-qPCR based surveillance programmes
Za účelem identifikace izolátu viru se provede nekompetitivní enzymová imunoanalýza ELISA.
If further examination is not to be undertaken directly after centrifugation, the samples shall be immediately frozen at – 20 °C or below.
Na zřeďovací destičce se každý vzorek obsahující 1 % Triton X-100, jakož i pozitivní kontrolní vzorky 4krát zředí pufrovým roztokem (slaným fosfátovým pufrem (PBS)-T-BSA, 1 % BSA), a to v těchto poměrech: neředěn, 1:4, 1:16 a 1:64.
samples stored at 37 °C: 1 day;
Destičky ELISA se opláchnou v pufru PBS obsahujícím 0,05 % Tween-20-(PBS-T), přičemž na opláchnutou destičku ELISA s nanesenou vrstvou se ze zřeďovací destičky přenese 50 μl z každého roztoku.
samples stored at 25 °C: 1 week;
Destičky ELISA se poté 30 minut při teplotě 37 °C inkubují.
samples stored at 4 °C: 1 month;
Následně se opláchnou a inkubují 30 minut při 37 °C se specifickými monoklonálními protilátkami (k identifikaci VHSV se použije MAb IP5B11 a k identifikaci IHNV Hyb 136-3).
samples stored at – 20 °C: indefinitely
Na destičku ELISA se přenese 50 μl králičích protilátek proti myšímu antigenu konjugovaných s křenovou peroxidázou (HRP), ředěných 1:1000 v PBS-T-BSA.
Pooled samples in RNA stabilization reagent shall be treated like single samples in RNA stabilization reagent.
Destičky ELISA se inkubují 20 minut v temnu při pokojové teplotě a reakce se zastaví přidáním 100 μl H2SO4v koncentraci 0,5 M do každé jamky.
If larger samples are pooled, the extraction kits or methods must reflect this pooling.
Absorbance vzorků se kontroluje ve čtečce ELISA při vlnové délce 492 a 620 nm.
Samples collected in RNA stabilization reagents shall not be used for cell cultivation.
Obecně se vzorky s celkovou absorbancí (A) menší než 0,5 u neředěného materiálu považují za negativní, vzorky s hodnotami absorbance mezi 0,5 a 1,0 za podezřelé a vzorky s hodnotami absorbance vyššími než 1,0 za pozitivní.
As the RT-qPCR protocols given are of similar or higher sensitivity than the cell cultivation methods, it may be acceptable to use supernatant from homogenised fish tissue material of pooled organs from up to 10 fish in cell culture medium for PCR.
Místo varianty analýzy ELISA popsané v tomto bodě lze použít i jiné varianty, pokud byla prokázána jejich obdobná účinnost.
However, due to the much smaller inoculum used for PCR compared to cell cultivation, all fish tissues shall be carefully homogenised before collating material for extraction.
Jsou-li IHNV, VHSV nebo oba viry identifikovány infikováním buněk na krycích sklíčkách, použije se tento protokol:
However, in that case it is often difficult to collect representative material from up to 10 fish in one tube, and the number of fish per pool shall therefore be reduced to 2 to 5.
krycí sklíčka se osází buňkami v hustotě zaručující po 24 hodinách kultivace konfluenci mezi 60 % a 90 %.
Virological examination on cell culture
Pro tento účel se pokud možno použijí endoteliální progenitorové buňky (EPC), a to z důvodu jejich silné přilnavosti ke skleněným povrchům, lze však použít i jiné buněčné linie, např. BF-2, RTG-2 nebo FHM.
Cell cultures and media
Vrstva jednodenní buněčné linie se duplicitně naočkuje 150 μl supernatantu buněčné kultury ve dvou různých ředěních (1: 10 a 1: 1000) a při 15 °C se inkubuje 24 hodin;
Bluegill fry cell line -2 (BF-2) or Rainbow trout gonad cell line - 2 (RTG-2) and either Epithelioma papulosum cyprini (EPC) or Fathead minnow (FHM) cells shall be grown at 20 to 30 °C in suitable medium, namely Eagle's Minimum essential medium (MEM) or modifications thereof, with a supplement of 10 % foetal bovine serum and antibiotics in standard concentrations.
následně se kultivační médium odstraní a infikovaná vrstva buněčné linie se fixuje 0,5 ml ledovým vodným roztokem acetonu (80 % obj./obj.).
When the cells are cultivated in closed vials, the medium shall be buffered with bicarbonate.
V této fázi se destičky buď okamžitě zpracují, nebo uskladní při – 20 °C k dalšímu použití;
The pH must be 7,6 ± 0,2.
specifické monoklonální protilátky (k identifikaci VHSV se použije MAb IP5B11 a k identifikaci IHNV Hyb 136-3) se ředí PBST s koncentrací 0,01 M a pH 7,2 v poměru doporučeném dodavatelem těchto protilátek; k fixované buněčné linii se přidá 50 až 100 μl této směsi na jamku a destičky se následně inkubují jednu hodinu při 37 °C ve vlhké komoře;
The cell cultures to be used for inoculation with fish tissue material shall be young, normally 1 day old cell culture monolayers where possible; however, a range between 4 to 48 hours old may be accepted.
krycí sklíčka se třikrát jemně opláchnou pufrem PBS obsahujícím 0,05 % Tween-20 (PBS-T) a po posledním propláchnutí se pufr zcela odstraní.
The cells must be actively growing at inoculation.
Buňky se následně jednu hodinu při 37 °C inkubují s konjugátem fluorescein-izothiokyanátu (FITC) nebo tetrametyl-rhodamin-5-(a-6-)isothiokyanátu (TRITC) a protilátkek proti myšímu imunoglobulinu použitému jako primární protilátka, ředí se podle pokynů dodavatele, opět se oplachují v PBS-T a suší.
Inoculation of cell cultures
Použije se přitom okulár s 10- respektive 12násobným zvětšením a objektivní čočka s 25- respektive 40násobným zvětšením a numerickou aperturou větší než 0,7 respektive 1,3.
At least two cell lines shall be inoculated as referred to in point I.5.1.
Alternativně mohou být použity i jiné techniky IF s prokázanou obdobnou účinností, pokud jde o buněčné kultury, fixaci a protilátky referenční kvality.
The ratio between inoculum size and volume of cell culture medium shall be about 1:10.
Z odebraného supernatantu se odstřeďováním (při 2000 až 4000 × g) nebo membránovou filtrací (s velikostí pórů 0,45 μm) za použití membrány s nízkým vázáním proteinu odstraní buňky a supernatant se zředí v kultivačním médiu v poměru 1:100 a 1:10000.
For each dilution and each cell line, a minimum of about 2 cm2 cell area, corresponding to one well in a 24-well cell culture tray, shall be utilised.
Alikvotní množství minimálně dvou roztoků supernatantu se každé zvlášť smíchá se stejným dílem níže uvedených činidel a inkubuje se po 60 minut při 15 °C:
Cell culture trays shall be used where possible.
se sérem obsahujícím skupinově specifickou protilátku proti viru virové hemoragické septikémie (VHSV) v ředění 1:50 (obj.: obj.);
Incubation of cell cultures
se sérem obsahujícím skupinově specifickou protilátku proti viru infekční nekrózy krvetvorné tkáně (IHNV) v ředění 1:50 (obj.: obj.);
The inoculated cell cultures shall be incubated at 15 °C for seven to 10 days.
se smísenými antiséry proti domácím sérotypům viru infekční nekrózy pankreatu (IPNV) v ředění 1:50 (obj.: obj.);
If the colour of the cell culture medium changes from red to yellow indicating medium acidification, pH adjustment with sterile bicarbonate solution or equivalent substances shall be performed to ensure cell susceptibility to virus infection.
se samotným médium (pozitivní kontrola).
At least every 6 months or if decreased cell susceptibility is suspected, titration of frozen stocks of VHSV and IHNV shall be performed to verify the susceptibility of the cell cultures to infection.
Každou směsí viru a séra supernatantu se naočkují alespoň dvě buněčné kultury (každá 50 μl), které se poté inkubují při 15 °C.
The procedure set out in Section III shall be used, if possible.
Vývoj CPE se kontroluje postupem podle bodu I.5.4.
Microscopy
Kmeny a izoláty VHSV, které při neutralizačních testech nereagují, se identifikují pomocí IF nebo analýzy ELISA.
Inoculated cell cultures shall be inspected regularly, at least three times a week, for the occurrence of CPE at 40 to 150 × magnification.
Alternativně lze provést i jiné neutralizační testy, u nichž byla prokázána obdobná účinnost.
If obvious CPE is observed, virus identification procedures in accordance with point I.6 shall be initiated immediately.
Veškerá práce s RNA se provádí v rukavicích na ledu.
Subcultivation
RNA se extrahuje fenol-chloroformovou metodou nebo afinitními spin kolonami pro RNA podle pokynů výrobce.
If no CPE has developed after the primary incubation for 7 to 10 days, subcultivation shall be performed to fresh cell cultures utilising a cell area similar to that of the primary culture.
Lze použít komerčně dostupné sady pro extrakci RNA, kterými se získá vysoce kvalitní RNA vhodná k použití s protokoly RT-PCR, jež jsou podrobně popsány v bodech níže.
Aliquots of medium (supernatant) from all cultures or wells constituting the primary culture shall be pooled according to cell line 7 to 10 days after inoculation.
RNA se resuspenduje v destilované vodě zbavené RNázy (tedy ve vodě ošetřené 0,1 % dietylpyrokarbonátem) nebo ve vhodném elučním pufru.
The pools shall then be inoculated into homologous cell cultures undiluted and diluted 1:10 (resulting in final dilutions of 1:10 and 1:100, respectively, of the supernatant) as described in point I.5.2.
přímý primer 5′-AGA-GAT-CCC-TAC-ACC-AGA-GAC-3′;
The inoculation may be preceded by pre-incubation of the dilutions with the antiserum to IPN virus at appropriate dilution as described in point I.4.3.
reverzní primer 5′-GGT-GGT-GTT-GTT-TCC-GTG-CAA-3′.
The inoculated cultures shall then be incubated for 7 to 10 days at 15 °C and inspected in accordance with point I.5.4.
Použijí se tyto cykly (jednostupňová reakce RT-PCR): 1 cyklus: 30 minut při 50 °C; 1 cyklus: 2 minut při 95 °C; 30 cyklů: 30 sekund při 95 °C, 30 sekund při 50 °C, 60 sekund při 72 °C; 1 cyklus: 7 minut při 72 °C a s namočením při 4 °C.
If toxic CPE occurs within the first 3 days of incubation, subcultivation shall be performed at that stage, but the cells shall then be incubated for 7 days and sub cultivated again with further 7 days incubation.
Ke zjištění VHSV se použijí tyto primery:
When toxic CPE develops after 3 days, the cells shall be passed once and incubated to achieve the total of 14 days from the primary inoculation.
VN přímý 5′-ATG-GAA-GGA-GGA-ATT-CGT-GAA-GCG-3′;
There must be no evidence of toxicity in the final 7 days of incubation.
VN reverzní 5′-GCG-GTG-AAG-TGC-TGC-AGT-TCC-C-3′.
If bacterial contamination occurs despite treatment with antibiotics, subcultivation shall be preceded by centrifugation at 2000 to 4000 × g for 15 to 30 minutes at 2 to 5 °C, or filtration of the supernatant through a 0,45 μm filter or both (low protein-binding membrane).
Použijí se tyto cykly (jednostupňová reakce RT-PCR): 30 minut při 50 °C, 15 minut při 95 °C; 35 cyklů: 30 sekund při 94 °C, 30 sekund při 55 °C a 60 sekund při 68 °C.
In addition to this, subcultivation shall follow the same procedures as described for toxic CPE in the fourth paragraph of this point.
Následně probíhá 7 minut při 68 °C reakce.
If no CPE occurs, the test may be declared negative.
Množství a specifičnost reakcí RT-PCR se vyhodnotí gelovou elektroforézou v 1,5 % agarózovém gelu s ethidiumbromidem a pozorováním pomocí UV transiluminace.
Virus identification
U IHNV lze pozorovat amplikon PCR o velikosti 693 bp.
If evidence of CPE has been observed in a cell culture, medium (supernatant) shall be collected and examined by one or more of the following techniques: Enzyme-linked immunosorbent essay (ELISA), Immunofluorescence (IF), neutralisation, RT-PCR or RT-qPCR.
U VHSV činí velikost 505 bp.
If these tests have not allowed definitive identification of the virus within 1 week, the supernatant shall be forwarded to the national reference laboratory or to the EU reference laboratory for fish diseases referred to in Annex VI to Directive 2006/88/EC for immediate identification.
Výsledky polymerázové řetězové reakce (PCR) se mohou lišit v závislosti na podmínkách, za kterých se provádí, konkrétně může být v závislosti na používaném termocykleru zapotřebí optimalizovat teplotní protokol.
A double antibody sandwich ELISA shall be performed in order to identify the virus isolate.
Kromě toho může nesprávné žíhání primerů nebo kontaminace laboratoře vést k falešně pozitivním výsledkům.
Microwell plates shall be coated with 50 μl/well (0,9 pg) of proven quality protein-A purified immunoglobulins(Ig) from rabbit antisera against IHNV or VSHV diluted in carbonate buffer (pH 9,6) containing 15 mM sodium azide and incubated from 18 hours to 2 weeks at 4 °C.
Aby se zabránilo jakýmkoliv pochybnostem, použijí se tedy adekvátní pozitivní a negativní kontrolní vzorky a sekvenované amplikony.
On a dilution plate, each sample containing 1 % Triton X-100 and the positive controls shall be diluted with buffer solution (namely, phosphate buffered saline (PBS)-T-BSA, 1 % BSA) in a 4-fold dilution: undiluted, 1:4, 1:16, 1:64.
Při vyšetření supernatantu z buněk BF-2 se sekvenují veškeré fragmenty amplifikované pomocí PCR.
ELISA plates shall then be incubated for 30 minutes at 37 °C.
U VHSV se provede amplifikace pomocí těchto primerů a sondy:
Subsequently plates shall be washed and incubated for 30 minutes at 37 °C with specific monoclonal antibodies (namely for VHSV identification MAb IP5B11 and for IHNV Hyb 136-3, respectively).
Přímý primer: 5′-AAA-CTC-GCA-GGA-TGT-GTG-CGT-CC-3′;
50 μl of horseradish-peroxidase (HRP) conjugated rabbit anti mouse antibodies diluted 1:1000 in PBS-T-BSA shall be transferred to the ELISA plate.
Reverzní primer: 5′-TCT-GCG-ATC-TCA-GTC-AGG-ATG-AA-3′;
Finally, after renewed washing the reactions shall be developed adding 50 μl/well of ortho-phenylenediamine (OPD).