natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Protilátka v testovaném séru blokuje reakci mezi antigenem a Mab a v důsledku toho dojde ke zmírnění zbarvení.
Blocking ELISA for the detection of antibodies to African horse sickness virus (AHSV)
Protože je Mab zaměřena proti VP7, poskytuje test vysokou úroveň senzitivity a specificity.
The competitive blocking ELISA is designed to detect specific AHSV antibodies in sera from animals of any equine species, i.e. horses, donkeys, zebra and their crosses, preventing the problem of specificity experienced occasionally using the indirect ELISAs.
Kompetitivní blokující test ELISA je komerčně dostupný.
The principle of the test is the blocking of the reaction between the recombinant VP7 protein absorbed to the ELISA plate and a conjugated AHS-VP7 specific monoclonal antibody (Mab).
Pevná fáze
Antibody in the test sera will block the reaction between the antigen and the Mab resulting in a reduction in colour.
Destičky ELISA se pokryjí 50–100 ng rekombinantu AHSV-4 VP7 rozpuštěného v karbonátovém/bikarbonátovém pufru, pH 9,6.
Because the Mab is directed against the VP7, the assay will give a high level of sensitivity and specificity.
Inkubují se přes noc při teplotě 4 °C.
The competitive blocking ELISA is commercially available.
Destičky se třikrát propláchnou fosfátovým pufrem (PBS) 0,1× obsahujícím 0,135 M NaCl a 0,05 % (obj.) látky Tween 20 (PBST).
Solid Phase
Destičky se jemně poklepou savým materiálem, aby byl odstraněn veškerý zbytkový mycí roztok.
Coat ELISA plates with 50-100 ng of recombinant AHSV-4 VP7 diluted in carbonate/bicarbonate buffer, pH 9,6.
Testované vzorky a kontrolní vzorky
Incubate overnight at 4 °C.
Vzorky séra, které mají být testovány, a pozitivní a negativní kontrolní sérum se rozpustí v poměru 1 ku 5 v roztoku obsahujícím 0,35 M NaCl, 0,05 % (obj.) látky Tween 20 a 0,1 % Kathon, 100 μl na jamku.
Wash the plates three times with phosphate buffered saline (PBS) 0,1× containing 0,135 M NaCl and 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST).
Pro titraci se připraví dvojitá série roztoků testovaných sér (100 μl/jamka) od 1 ku 10 do 1 ku 280 v osmi jamkách, jedno sérum na sloupec destičky.
Gently tap the plates on to absorbent material to remove any residual wash.
Stejný krok se provede i s pozitivním a negativním kontrolním sérem.
Test samples and controls
Inkubuje se 1 hodinu při teplotě 37 °C.
Serum samples to be tested, and positive and negative control sera, are diluted 1 in 5 in diluent containing 0,35 M NaCl, 0,05 % (v/v) Tween 20 and 0,1 % Kathon, 100 μl per well.
Destičky se pětkrát propláchnou solným fosfátovým pufrem (PBS) 0,1× obsahujícím 0,135 M NaCl a 0,05 % (obj.) látky Tween 20 (PBST).
For titration, make a twofold dilution series of the test sera from 1 in 10 to 1 in 280 across 8 wells (100 μl/well), one serum per plate column, and do the same with positive and negative controls.
Do každé jamky se přidá 100 μl roztoku Mab proti VP7 konjugovaného s křenovou peroxidázou.
Incubate for 1 hour at 37 °C.
Tento roztok Mab byl předem naředěn v poměru 1/5000–1/15000 v roztoku stabilizátoru StabiliZyme Select® (SurModics.
Wash the plates five times with phosphate buffered saline (PBS) 0,1× containing 0,135 M NaCl and 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST).
Reference: SZ03) 1 ku 1 v destilované vodě.
Dispense 100 μl/well of horseradish peroxidase-conjugated Mab anti-VP7.
Inkubuje se 30 minut při teplotě 37 °C.
In advance, this Mab has been diluted 1/5000-1/15000 in a 1/1 solution of StabiliZyme Select® Stabilizer (SurModics.
Blokující procento (BP) každého vzorku se určí pomocí následujícího vzorce, kde „Abs“ znamená protilátky:
Add 100 μl/well chromogen/substrate solution, i.e. 1 ml of ABTS (2,2′-Azino-bis-[3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid]) 5 mg/ml + 9 ml of substrate buffer (0,1 M Phosphate-Citrate buffer of pH 4 containing 0,03 % H2O2), and incubate for 10 minutes at room temperature.
Abskontrolní
Colour development is stopped by adding 100 μl/well of 2 % (w/v) SDS (sodium dodecyl sulphate).
Absvzorek
Reading
Vzorky s hodnotou BP vyšší než 50 % by měly být považovány za pozitivní na protilátky proti AHSV.
Read at 405 nm in an ELISA reader.
Vzorky s hodnotou BP nižší než 45 % by měly být považovány za negativní na protilátky proti AHSV.
Determine the blocking percentage (BP) of each sample by applying the following formula, where “Abs” stands for antibodies:
Vzorky s hodnotou BP mezi 45 % a 50 % by měly být považovány za nejisté a testování je třeba provést znovu.
Abscontrol
V případě opakovaného nejistého výsledky by zvířata měla být znovu vyšetřena na základě vzorků odebraných nejdříve dva týdny po odběru vzorku, který se považoval za nejistý.
Abssample
ČÁST B
Samples showing a BP value higher than 50 % should be considered as positive for AHSV antibodies.
Identifikace původce
Samples showing a BP value lower than 45 % should be considered as negative for AHSV antibodies.
Polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí v reálném čase (rRT-PCR)
Samples showing a BP value between 45 % and 50 % should be considered as inconclusive and must be retested.
Testy k identifikaci původce založené na metodách využívajících nukleovou kyselinu musí zjistit referenční kmeny u devíti virových sérotypů AHSV.
If the result is again inconclusive, the animals should be retested on samples taken not earlier than two weeks after the sample which was considered to be inconclusive was taken.
Metoda popsaná v bodě 2.1. vychází z kapitoly 2.5.1. oddílu B bodu 1.2 Příručky pro diagnostické testy a očkovací látky pro suchozemská zvířata, vydání z roku 2016 přijaté Světovým shromážděním delegátů OIE v květnu 2012.
PART B
Každá detekční metoda využívající RT-PCR používaná při testování vzorků krve nebo sleziny v souladu se směrnicí 2009/156/ES musí vykázat stejnou nebo vyšší senzitivitu jako metody popsané v bodě 2.
Identification of the agent
Inaktivovaný vir referenčních kmenů sérotypů 1 až 9 je možné získat v referenční laboratoři Evropské unie nebo referenční laboratoři OIE pro mor koní v Algete ve Španělsku.
Real-time Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction (rRT-PCR)
Extrakce virové RNA
Agent identification tests based on nucleic acid methods must detect reference strains from the nine virus serotypes of the AHSV.
K zajištění dobré reakce je nezbytné ze vzorku AHSV extrahovat vysoce kvalitní RNA.
The method described in point 2.1 is based on point 1.2 of Section B in Chapter 2.5.1 of the Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, Edition 2016 as adopted by the World Assembly of Delegates of the OIE in May 2012.
Extrakci nukleových kyselin z klinických vzorků lze provést různými interními a komerčně dostupnými metodami.
Any RT-PCR detection method used for the testing of samples, either blood or spleen, in the context of Directive 2009/156/EC must perform equal to or exceed the sensitivity of the methodologies described in point 2.
Komerční sady využívají k izolaci RNA různé přístupy.
Inactivated virus of serotypes 1 to 9 reference strains may be obtained from the European Union Reference Laboratory or the OIE Reference Laboratory for African horse sickness, Algete, Spain.
Většina z nich je založena na jednom z následujících postupů:
Extraction of viral RNA
extrakce nukleových kyselin pomocí fenol-chloroformu,
To assure a good reaction it is necessary to extract from the sample an AHSV RNA of high quality.
adsorpce nukleových kyselin do filtračního systému,
The extraction of nucleic acids from clinical samples can be performed by a variety of in-house and commercially available methods.
adsorpce nukleových kyselin do systému magnetických kuliček.
Commercial kits use different approaches for RNA isolation.
Níže je uveden příklad interně provedené extrakce RNA:
Most are based on one of the following procedures:
1 g vzorku tkáně se homogenizuje v 1 ml denaturačního roztoku (4 M guanidium thiokyanát, 25 mM citronan sodný, 0,1 M 2-merkaptoetanol, 0,5 % sarkosyl).
Phenol-chloroform extraction of nucleic acids;
Po odstředění se do supernatantu přidá 1 μg reagentu kvasinkové RNA, 0,1 ml 2 M octanu sodného pH 4, 1 ml fenolu a 0,2 ml směsi chloroformu a isoamylalkoholu (49/1).
Adsorption of nucleic acids to filter system;
Suspenze se prudce protřepe a po dobu 15 minut zchladí na ledu.
Adsorption of nucleic acids to magnetic beads system.
Po odstředění se RNA přítomná ve vodné fázi extrahuje fenolem, precipituje etanolem a resuspenduje ve sterilní vodě.
An example of an in-house RNA extraction is given below:
Postup RT-PCR v reálném čase
1 g of tissue sample is homogenised in 1 ml of denaturing solution (4 M guanidium thiocyanate, 25 mM sodium citrate, 0,1 M 2-mercaptoethanol, 0,5 % sarcosyl).
Skupinově specifická RT-PCR v reálném čase dle Agüero a kol., 2008 [3]
After centrifugation, 1 μg of yeast RNA, 0,1 ml of 2 M sodium acetate pH 4, 1 ml of phenol and 0,2 ml of chloroform/isoamyl alcohol mixture (49/1) are added to the supernatant.
Tato skupinově specifická RT-PCR v reálném čase cílí na VP7 v AHSV a dokáže detekovat všechny známé a aktuálně cirkulující sérotypy a kmeny AHSV.
The suspension is vigorously shaken and cooled on ice for 15 minutes.
Sekvenování primeru a sondy k detekci virů druhu AHSV:
After centrifugation, the RNA present in the aqueous phase is phenol extracted, ethanol precipitated and resuspended in sterile water.
přímý primer 5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′
Real-time RT-PCR Procedure
sonda MGB-TaqMan 5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′
This group-specific real-time RT-PCR targets VP7 of the AHSV and is able to detect all known AHSV serotypes and strains currently circulating.
Koncentrace primeru se naředí na pracovní koncentraci 8 μM (dále jen „pracovní primer 8 μM“) a sonda se naředí na pracovní koncentraci 50 μM (dále jen „pracovní roztok sondy 50 μM“).
It has been employed with very good results by the participating national reference laboratories of the European Union Member States in the proficiency tests annually organised by the European Union Reference Laboratory for the period 2009-2015.
Navrhne se uspořádání testovací destičky a nahraje se do softwaru přístroje k provedení metody PCR v reálném čase.
Moreover, in an international ring trial organised in 2015 in the framework of the OIE reference laboratories network this protocol was ranked very high amongst others.
S využitím plánu uspořádání se přidá 2,5 μl každého pracovního primeru 8 μM do každé jamky, která bude obsahovat vzorky RNA, pozitivní a/nebo negativní kontrolní vzorky (konečná koncentrace primeru bude 1 μM v 20 μl roztoku RT-PCR mix).
Primer and probe sequences for the detection of AHSV species viruses:
Destička se uchovává na ledu.
forward Primer 5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′
2 μl izolované RNA (testované vzorky a pozitivní kontrolní vzorky), nebo 2 μl vody bez ribonukleáz pro negativní kontrolní vzorky se smíchají s přímým a reverzním primerem.
reverse Primer 5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′
Směs se ohřevem na 95 °C po dobu 5 minut denaturuje a následně je rychle zchlazena na ledu po dobu alespoň 5 minut.
MGB-TaqMan probe 5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′
Podle pokynů výrobce se připraví roztok master mix k provedení jednokrokové RT-PCR v reálném čase v objemu dostatečném pro počet testovaných vzorků.
Primer stock concentration is diluted to a working concentration of 8 μM (“primer working stock 8 μM”) whereas probe is diluted to a working concentration of 50 μM (“probe working stock 50 μM”).
0,1 μl pracovního roztoku sondy o 50 μM se přidá do každé jamky obsahující vzorky RNA (konečná koncentrace sondy bude 0,25 μM v každé jamce obsahující vzorky RNA.
A test plate layout should be designed and loaded into the real time PCR machine software.
13 μl roztoku master mix k provedení jednokrokové RT-PCR v reálném čase se rozdělí do každé jamky na destičce PCR obsahující denaturované primery a RNA.
Using the layout as a guide, 2,5 μl of each primer working stock 8 μM is added to each well that will contain RNA samples, positive and/or negative controls (final concentration of the primer will be 1 μM in the 20 μl RT-PCR mix).
Destička se umístí do termocykleru v reálném čase naprogramovaného na reverzní transkripci a detekci amplifikace/fluorescence cDNA.
The plate is held on ice.
Podmínky amplifikace zahrnují první krok reverzní transkripce při 48 °C po 25 minut, následovaný 10 minutami při 95 °C („horký start“) a 40 cykly po 15 sekundách při 95 °C, po 35 sekundách při 55 °C a po 30 sekundách při 72 °C (nebo 40 cyklů při 97 °C po 2 sekundách a při 55 °C po 30 sekundách při použití reakčních činidel a termocykleru určených pro rychlé reakce).
2 μl of isolated RNA (test samples and positive control), or 2 μl of RNAse-free water in negative reaction controls, is mixed with forward and reverse primers.
Údaje o fluorescenci se získají na konci kroku při 55 °C.
This mixture is denatured by heating at 95 °C for 5 minutes, followed by rapid cooling on ice for at least 5 minutes.
Stanovení se nepovažuje za validní, jsou-li výsledkem atypické amplifikační křivky, a musí být provedeno znovu.
An appropriate volume of real time one-step RT-PCR master mix for the number of samples to be tested is prepared following manufacturer's instructions.
Vzorky jsou považovány za pozitivní, pokud je hodnota Ct (číslo cyklu, při němž fluorescence vzniklá při reakci překročí prahovou hodnotu fluorescence) nižší nebo se rovná definované prahové hodnotě Ct (35) během 40 cyklů PCR (Ct ≤ 35).
0,1 μl of probe working stock 50 μM is added to each well containing RNA samples (final concentration of the probe will be 0,25 μM in each well containing RNA samples).
Vzorky jsou považovány za nejisté, pokud je hodnota Ct vyšší než definovaná prahová hodnota Ct (35) během 40 cyklů PCR (Ct ≥ 35).
13 μl of real time one-step RT-PCR master mix is distributed in each well on the PCR plate containing the denatured primers and RNA.
Vzorky jsou považovány za negativní, pokud získaná horizontální křivka amplifikace během 40 cyklů PCR nepřekročí prahovou linii.
The plate is placed in a real time thermal cycler programmed for reverse transcription and cDNA amplification/fluorescence detection.
Skupinově specifická RT-PCR v reálném čase dle Guthrie a kol., 2013 [4]
Amplification conditions consist of a first reverse-transcription step at 48 °C for 25 minutes, followed by 10 minutes at 95 °C (“hot start”) and 40 cycles of 15 seconds at 95 °C, 35 seconds at 55 °C and 30 seconds at 72 °C (or 40 cycles at 97 °C for 2 seconds and 55 °C for 30 seconds if reagents and thermocycler allowing fast reactions are used).
RT-PCR v reálném čase využívající sondy fluorescenčního rezonančního přenosu energie (FRET) k detekci nukleové kyseliny v AHSV.
Fluorescence data are acquired at the end of the 55 °C step.
Popsané stanovení obsahu AHSV RT-PCR bylo navrženo pomocí sekvencí ze širokého spektra v současnosti cirkulujících kmenů AHSV (Quan a kol., 2010 [5]).
The assay is considered not valid if atypical amplification curves are obtained, and must be repeated.
Rovněž zahrnuje chráněnou syntetickou externí kontrolu stanovení obsahu k ověření řádného fungování komponent pro stanovení obsahu.
Samples are considered positives, if the Ct value (cycle number at which the fluorescence generated within a reaction crosses the fluorescence threshold) is lower than or equal to the defined Ct threshold (35) within 40 PCR cycles (Ct ≤ 35).
Soupravy pro jednokrokovou PCR v reálném čase jsou komerčně k dispozici.
Samples are considered inconclusive, if the Ct value is higher than the defined Ct threshold (35) within 40 PCR cycles (Ct > 35).
Níže jsou uvedeny některé základní kroky tak, jak je popsal Guthrie a kol.
Samples are considered negative, if a horizontal amplification curve is obtained which does not cross the threshold line within 40 PCR cycles.
, které lze upravit v závislosti podle místních specifik nebo specifik jednotlivých případů, použitých soupravách a dostupném vybavení.
Group-specific real-time RT-PCR by Guthrie et al., 2013 [4]
přímý primer 5′-AGA-GCT-CTT-GTG-CTA-GCA-GCC-T-3′
Real-time RT-PCR using fluorescence resonance energy transfer (FRET) probes to detect nucleic acid of AHSV.
reverzní primer 5′-GAA-CCG-ACG-CGA-CAC-TAA-TGA-3′
The AHSV RT-PCR assay described was designed using sequences from a wide variety of currently circulating field strains of AHSV (Quan et al., 2010 [5]).
sonda MGB-TaqMan 5′-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3′
It also incorporates a proprietary synthetic external control assay to verify proper functioning of the assay components.
Roztoky primeru a sondy se připraví v 25 × násobné koncentraci při 5 μΜ v případě přímého a reverzního primeru a 3 μΜ v případě sondy.
Kits for the one-step real-time PCR are available commercially.
Navrhne se uspořádání testovací destičky a nahraje se do softwaru přístroje k provedení metody PCR v reálném čase.
Below are some basic steps as described by Guthrie et al.
S využitím plánu uspořádání se přidá 5 μl vzorků RNA, včetně testovacích vzorků a pozitivních i negativních kontrolních vzorků, do příslušných jamek na destičce.
, which can be modified depending upon local/case-specific requirements, kits used and equipment available.
RNA se denaturuje ohřevem na 95 °C po dobu 5 minut a následně se rychle zchladí na ledu po dobu alespoň 3 minut.
forward Primer 5′-AGA-GCT-CTT-GTG-CTA-GCA-GCC-T-3′
Podle pokynů výrobce se připraví roztok master mix k provedení jednokrokové RT-PCR v reálném čase v objemu dostatečném pro počet testovaných vzorků.
reverse Primer 5′-GAA-CCG-ACG-CGA-CAC-TAA-TGA-3′
1 μl 25 × násobného roztoku směsi primeru a sondy (viz bod 2.2.1 výše) se přidá do roztoku master mix k získání konečné koncentrace v každé jamce 200 nM pro každý primer a 120 nM pro sondu.
MGB-TaqMan probe 5′-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3′
20 μl roztoku master mix se rozdělí do každé jamky na destičce PCR obsahující denaturovanou RNA.
Primer and probe mix stock solutions are made up in a 25× concentration at 5 μΜ for the forward and reverse primers and 3 μΜ for the probe.
Destička se umístí do termocykleru v reálném čase naprogramovaného na reverzní transkripci a detekci amplifikace/fluorescence cDNA dle doporučení výrobců.
A test plate layout should be designed and loaded into the real-time PCR machine software.
Podmínky amplifikace zahrnují například první krok reverzní transkripce při 48 °C po 10 minut, následovaný 10 minutami při 95 °C a 40 cykly po 15 sekundách při 95 °C a po 45 sekundách při 60 °C.
Using the layout as a guide, 5 μl of RNA samples, including test samples and positive and negative controls, are added to appropriate wells of the plate following the layout.
Vzorky jsou považovány za pozitivní, pokud normalizovaná fluorescence stanovení obsahu AHSV RT-PCR překročí prahovou hodnotu 0,1 během 36 cyklů PCR ve všech replikacích vzorku.
The RNA is denatured by heating at 95 °C for 5 minutes, followed by rapid cooling on ice for at least 3 minutes.
Vzorky jsou považovány za nejisté, pokud normalizovaná fluorescence stanovení obsahu AHSV RT-PCR překročí prahovou hodnotu 0,1 během 36 až 40 cyklů PCR v kterékoli replikaci vzorku.
An appropriate volume of real-time one-step RT-PCR master mix for the number of samples to be tested is prepared, following the manufacturer's instructions.
Vzorky jsou považovány za negativní, pokud normalizovaná fluorescence stanovení obsahu AHSV RT-PCR nepřekročila prahovou hodnotu 0,1 během 40 cyklů PCR ve všech replikacích vzorku a pokud normalizovaná fluorescence chráněné syntetické externí kontroly stanovení obsahu překročila prahovou hodnotu 0,1 během 33 cyklů PCR.“
1 μl of 25× primer probe mix stock solution (from point 2.2.1 above) is included in the master mix to give a final concentration in each well of 200 nM for each primer and 120 nM of the probe.
CRC Press, Boca Raton, Florida, USA, 646–650.
20 μl of the master mix is distributed in each well on the PCR plate containing the denatured RNA.
Methods, 125 (1), 55–65.
The plate is placed in a real-time thermal cycler programmed for reverse transcription and cDNA amplification/fluorescence detection as suggested by the manufacturers.
2013;189(1):30–5.
Amplification conditions consist of, for example, a first reverse-transcription step at 48 °C for 10 minutes, followed by 10 minutes at 95 °C and 40 cycles of 15 seconds at 95 °C and 45 seconds at 60 °C.
Methods 167, 45–52.
Samples are considered positives, if the normalised fluorescence for the AHSV RT-PCR assay exceeds a 0,1 threshold within 36 PCR cycles in all replicates of a sample.
Většina národních referenčních laboratoří členských států Evropské unie navíc používá metody RT-PCR v reálném čase, včetně diagnostikování moru koní, přičemž testy odborné způsobilosti prováděné v letech 2009 až 2014 prokázaly, že uvedené metody jsou k tomuto účelu vhodné.
Samples are considered inconclusive, if the normalised fluorescence for the AHSV RT-PCR assay exceeds a 0,1 threshold between 36 and 40 PCR cycles in any replicate of a sample.
Ve zprávě se také uvádí, že mimo Unii existuje řada referenčních laboratoří OIE a dalších laboratoří kvalifikovaných k diagnostikování moru koní, které k detekci genomu moru koní zavedly alespoň jednu metodu RT-PCR v reálném čase.
Samples are considered negative, if the normalised fluorescence for the AHSV RT-PCR assay did not exceed a 0,1 threshold within 40 PCR cycles in all replicates of a sample and if the normalised fluorescence for the proprietary synthetic external control assay exceeded a 0,1 threshold within 33 PCR cycles.’
Metoda popsaná v Guthrie a kol.
CRC Press, Boca Raton, Florida, USA, 646-650.
Agüero M., Gomez-Tejedor C., Angeles Cubillo M., Rubio C., Romero E. a Jimenez-Clavero A.
Methods, 125 (1), 55-65.
(2008).
2013;189(1):30-5.
Diagnostic accuracy of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay for detection of African horse sickness virus.
Methods 167, 45-52.
Přidá se 100 μl/jamka roztoku chromogen/substrát, tj.1 ml ABTS (2,2′-azino-bis-[3-ethylbenzothiazolin-6-kyselina sulfonová]), 5 mg/ml + 9 ml substrátového pufru (0,1 M fosfáto-citrátový pufr pH 4 obsahující 0,03 % H2O2, a inkubuje se 10 minut při pokojové teplotě.
In addition, most of the national reference laboratories of the European Union Member States use real-time RT-PCR methods, including for the diagnosis of African horse sickness, which have proven to be fit for purpose in the annual Proficiency Test exercises performed from 2009 to 2014.
Proces barvení se zastaví přidáním 100 μl/jamka 2 % (hmot./obj.) roztoku SDS (natriumdodecylsulfát).
The report also indicates that outside the Union there are a number of OIE reference laboratories and other laboratories with specific African horse sickness expertise that have implemented at least one of the real-time RT-PCR methods for the detection of African horse sickness genome.
Uplatnění této metody přineslo v účastnících se národních referenčních laboratořích členských států Evropské unie při zkouškách odborné způsobilosti každoročně organizovaných referenční laboratoří Evropské unie v období 2009–2015 velmi dobré výsledky.
is the most widely used by laboratories.
V mezinárodním kruhovém testu provedeném v roce 2015 v rámci sítě referenčních laboratoří OIE se tento protokol rovněž umístil na předních místech.
The method described by Guthrie et al.
Maree S. a Paweska J.T.
Agüero M., Gomez-Tejedor C., Angeles Cubillo M., Rubio C., Romero E. and Jimenez-Clavero A. (2008).
Preparation of recombinant African horse sickness virus VP7 antigen via a simple method and validation of a VP7-based indirect ELISA for the detection of group-specific IgG antibodies in horse sera.
Diagnostic accuracy of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay for detection of African horse sickness virus.
Development and optimisation of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay targeting the VP7 and NS2 genes of African horse sickness virus.
Add 100 μl/well chromogen/substrate solution, i.e. 1 ml of ABTS (2,2′-Azino-bis-[3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid]) 5 mg/ml + 9 ml of substrate buffer (0,1 M Phosphate-Citrate buffer of pH 4 containing 0,03 % H2O2), and incubate for 10 minutes at room temperature.
Rozhodnutí Rady (EU) 2016/1841
Council Decision (EU) 2016/1841
ze dne 5. října 2016
of 5 October 2016