natgillin/translations-raw huggingface dataset:
K některým testům, například otiskům či polymerázové řetězové reakci (PCR), se použije část slinivkojaterní žlázy.
Two additional wells shall be left uninoculated to act as controls.
Po osušení tkání slinivkojaterní žlázy na savém papíře se pořídí několik otisků na podložná sklíčka.
Samples from each fish farm site shall be handled on separate plates, as shall the virus control.
Sklíčka se usuší na vzduchu, fixují se v metanolu nebo v absolutním etanolu a obarví se pomocí komerčně dostupné sady pro barvení krve (například Diff-Quik®/Hemacolor®), a to podle pokynů výrobce.
A virus control shall be established using a reference isolate of ISAV.
Po opláchnutí v kohoutkové vodě a usušení se za použití syntetické pryskyřice překryjí krycími sklíčky.
Plates shall be incubated at 14 ± 2 °C and examined microscopically for up to 7 days.
Sklíčka se pozorují nejprve při 200násobném zvětšení a poté pod imerzní tekutinou při 1000násobném zvětšení.
When early CPE is observed, or if no CPE is observed within 7 days, the next step shall be fixation.
Za pozitivní výsledek se považuje, pokud jsou pozorovány buňky o velikosti 30 až 40 μm.
Wells shall be washed with Phosphate buffered saline (PBS) and fixed by incubation with 80 % acetone for 20 minutes at room temperature.
Zabarvení cytoplazmy je bazofilní, zatímco jádra eosinofilní.
Plates shall be air-dried and stained immediately or stored at 0 to 6 °C for no more than 24 hours prior to staining.
Kolem velkých, výrazně obarvených (světlolomných) granul lze pozorovat světlé kruhy a ve větších buňkách také buňky uvnitř buněk.
Replicate wells shall be stained with a mix of monoclonal antibodies (MAb) 3H6F8 and 1OC9F5 against ISAV, or other MAb of proven efficacy and specificity, diluted in PBS and incubated at 37 ± 4 °C for 30 minutes.
Tato technika není specifická pro parazitní druhy.
MAb shall be removed and plates washed three times with 0,05 % Tween 20 in PBS.
Řezy tkání, které zahrnují žábry, slinivkojaterní žlázu, plášť a gonády, se po dobu minimálně 24 hodin fixují v Davidsonově fixačním roztoku a poté následuje běžné zpracování na parafínový histologický preparát a barvení, například hematoxylinem a eosinem.
Anti-mouse IgG Fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugate diluted in PBS shall be added to each well and incubated at 37 ± 4 °C for 30 minutes.
Při pozorování se zvětšení postupně zvyšuje až na 1000násobek.
The dilutions of different batches of MAb and FITC conjugate shall be optimised in each laboratory.
Za pozitivní výsledek se považuje, pokud jsou pozorovány buňky o velikosti 4 až 40 μm.
Antibody shall be removed and plates shall be washed three times with 0,05 % Tween 20 in PBS.
V počátečních fázích lze pozorovat vícejaderné, sférické až protáhlé buňky.
Wells shall be examined immediately using an inverted microscope set up for fluorescence microscopy with a suitable filter for excitation of FITC.
Nacházejí se především v epitelové tkáni jícnu a žaludku a někdy i labiálních palp.
A test shall be considered positive if fluorescent cells are observed.
Při sporulaci, která probíhá v tubulech a kanálcích slinivkojaterní žlázy, dochází k dělení buněk uvnitř buněk.
For a test to be valid, the positive controls shall score positive and the negative controls shall score negative.
V jejím průběhu se objevují světlolomná granula, která v počátečních fázích pozorována nejsou.
Examination of other tissues
V závěrečných fázích infekce jsou pozorována sporangia nacházející se volně v lumen trávícího traktu.
The technique referred to in point II.2.6 may be applied to other fish tissues such as liver, spleen and heart providing a reasonable quantity of endothelial cells, leucocytes or lymphocytes can be deposited on the slide.
Granula mohou mít sytě oranžovou až sytě rudou barvu.
The staining procedure shall remain the same for each tissue, although for some tissues it may be preferable to omit the propidium iodide staining and rely on the phase illumination to identify the cell types present in the imprint.
Lze použít komerčně dostupné sady pro extrakci DNA, kterými se získá vysoce kvalitní DNA vhodná k použití s protokoly PCR popsanými v bodě I.3.2.
Histology
Bylo vypracováno a zveřejněno několik protokolů PCR.
Paraffin-embedded sections shall be cut at 5 μm and stained using haematoxylin and eosin.
Použijí se primery PCR, které se zaměřují na vnitřní přepisovaný mezerník (oblast ITS (ITS1)), protože jsou schopny amplifikovat pouze M. refringens.
Histological changes in clinically diseased Atlantic salmon are variable, but may include the following:
PCR se provede v objemu 50 μl směsi.
numerous erythrocytes in the central venous sinus and lamellar capillaries of the gills, where erythrocyte thrombi also may be formed;
Směsi na PCR musí obsahovat pufr (500 mM KCl, 100 mM Tris/HCl [pH 9,0 při teplotě 25 °C] a 1 % Triton® X-100), 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM směsi dNTP, 1 μM přímých a reverzních primerů, 0,02 jednotky μl– 1 Taq DNA polymerázy a 10 až 100 ng extrahované DNA.
multifocal to confluent petechiae or hepatocyte necrosis or both at some distance from larger vessels in the liver; multifocal accumulation of erythrocytes in dilated hepatic sinusoids;
Po denaturaci DNA po dobu 5 minut při teplotě 94 °C se 30 cyklů provede takto: denaturace při teplotě 94 °C po dobu 1 minuty, žíhání po dobu 1 minuty při teplotě 55 °C a elongace při teplotě 72 °C po dobu 1 minuty na 1 kbp.
accumulation of erythrocytes in blood vessels of the intestinal lamina propria and eventually haemorrhage into the lamina propria;
Následně se provede závěrečná elongace po dobu 10 minut při teplotě 72 °C.
spleen stroma distended by erythrocyte accumulation;
Za účelem zjištění M. refringens se provede PCR s primery, které se zaměřují na oblast ITS1 (5′-CCG-CAC-ACG-TTC-TTC-ACT-CC-3′ a 5′-CTC-GCG-AGT-TTC-GAC-AGA-CG-3′).
slight multifocal to extensive diffuse interstitial haemorrhage with tubular necrosis in the haemorrhagic areas, erythrocyte accumulation in the glomeruli in the kidney;
Pozitivní kontrolní vzorky tvoří genomická DNA z vysoce infikované hostitelské či plazmatické DNA obsahující cílovou oblast.
erythrophagocytosis in the spleen and secondary haemorrhages in liver and kidney.
Negativní kontrolní vzorky tvoří genomická DNA z neinfikované hostitelské DNA a reakční činidla PCR bez cílové DNA.
Immunohistochemistry (IHC)
Za pozitivní výsledek se považuje pozitivní amplifikace PCR s očekávanou velikostí (412 bp), přičemž všechny negativní kontrolní vzorky musí být negativní a všechny pozitivní kontrolní vzorky pozitivní.
Polyclonal antibody against ISAV nucleoprotein shall be used on paraffin sections from formalin-fixed tissue.
Bylo vypracováno a zveřejněno několik protokolů (ISH).
The organs to be examined shall be mid-kidney and heart (transitional area including all three chambers and valves).
Použije se sonda, která se zaměřuje na malou podjednotku (SSU) genového komplexu rRNA, protože byla histologicky ověřena.
Suspected cases due to pathological signs shall be verified with a positive IHC.
Řezy tkání, které zahrnují žábry a slinivkojaterní žlázu, se po dobu minimálně 24 hodin fixují v Davidsonově fixačním roztoku a poté následuje běžné zpracování na parafínový histologický preparát.
Histological sections shall be prepared in accordance with standard methods.
Připraví se řezy o síle 5 μm a položí na sklíčka potažená aminoalkylsilanem, jež se přes noc zapečou v troubě při 40 °C.
Preparation of tissue sections
Řezy se poté odparafínují ponořením do xylenu na dobu 10 minut.
The tissues shall be fixed in neutral phosphate-buffered 10 % formalin for at least 1 day, dehydrated in a graded ethanol series, cleared in xylene and embedded in paraffin, according to standard protocols.
Tento krok se jednou opakuje, poté se rozpouštědlo odstraní dvěma po sobě následujícími lázněmi v absolutním etanolu, z nichž každá trvá 10 minut.
Approximately 5 μm thick sections (for IHC placed on poly-L-lysine-coated slides) shall be heated at 56 °C to 58 °C (maximum 60 °C) for 20 minutes, dewaxed in xylene, rehydrated through a graded ethanol series, and stained with haematoxylin and eosin for pathomorphology and IHC in accordance with point (2).
Řezy se poté dehydratují ponořením do stupňované etanolové řady.
Staining procedure for IHC
Následně se po dobu 30 minut při teplotě 37 °C ošetřují proteinázou K (100 μg/ml) v TE pufru (Tris [50 mM], EDTA [10 mM]).
All incubations shall be carried out at room temperature on a rocking platform, unless otherwise provided for in this decision:
Sklíčka se dehydrují ponořením do stupňované etanolové řady a pak se usuší na vzduchu.
antigen retrieval shall be done by boiling sections in 0,1 M citrate buffer pH 6,0 for 2 × 6 minutes followed by blocking with 5 % non-fat dry milk and 2 % goat serum in 50 mM TBS (TBS; Tris/HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,6) for 20 minutes;
Řezy se inkubují s 100 μl hybridizačního pufru (4 × SSC [solný roztok citrátu sodného], 50 % formamid, 1 × Denhardtův roztok, 250 μg/ml kvasinkové tRNA, 10 % dextran sulfát) obsahujícího 10 ng (1 μl reaktantů PCR připravených podle postupu popsaného v bodě I.3.2 za použití primerů CCG-GTG-CCA-GGT-ATA-TCT-CG a TTC-GGG-TGG-TCT-TGA-AAG-GC) sondy značené digoxigeninem.
sections shall then be incubated overnight with primary antibody (monospecific rabbit antibody against ISAV nucleoprotein) diluted in TBS with 1 % non-fat dry milk, followed by three washes in TBS with 0,1 % Tween 20;
Řezy se přikryjí plastickými krycími sklíčky in situ a umístí se do ohřívacího bloku s teplotou 95 °C na dobu 5 minut.
for detection of bound antibodies, sections shall be incubated with Alkaline phosphatase-conjugated antibodies to rabbit IgG for 60 minutes.
Sklíčka se pak chladí na ledu po dobu 1 minuty, poté se přes noc provede hybridizace při teplotě 42 °C ve vlhké komoře.
Following a final wash, Fast Red (1 mg ml– 1) and Naphthol AS-MX phosphate (0,2 mg ml– 1) with 1 mM Levamisole in 0,1 M TBS (pH 8,2) shall be added to develop for 20 minutes.
Řezy se dvakrát opláchnou v solném roztoku citrátu sodného (2 × SSC) po dobu 5 minut při pokojové teplotě a jednou v solném roztoku citrátu sodného (0,4 × SSC) po dobu 10 minut při teplotě 42 °C.
Sections shall then be washed in tap water before counterstaining with Harris haematoxylin and mounted in aqueous mounting medium.
Sklíčka se poté opláchnou sterilní destilovanou vodou (dH2O).
Interpretation of the result of IHC
Řezy se kontrastně obarví Bismarckovou hnědou žlutí, opláchnou se sterilní destilovanou vodou a za použití montovacího média rozpustného ve vodě se přikryjí krycími sklíčky.
The interpretation of the result of the IHC test shall be as set out in points (a) and (b):
Pozitivní a negativní kontrolní vzorky tvoří řezy ze známých infikovaných respektive neinfikovaných hostitelů.
control sections shall be considered as positive, when it is observed that the control sections have clearly visible red-coloured (reddish) cytoplasmic and intranuclear staining of endothelia cells in blood vessels of endocardium.
Při pozitivním výsledku jsou buňky M. refringens v rámci známých cílových tkání označeny fialově-černou barvou, přičemž všechny negativní kontrolní vzorky musí být negativní a všechny pozitivní kontrolní vzorky pozitivní.
A test sample section shall only be regarded as positive if such clear, intranuclear red staining of endothelial cells is found;
Sekvenování
control sections shall be considered as negative if they don't have any significant colour reaction.
Podrobné diagnostické metody a postupy za účelem dozoru nad infekcí marteiliózou (Marteilia refringens) a jejího potvrzení
Endothelial staining reactions within very extensive haemorrhagic lesions may be slight or absent, possibly because of lysis of infected endothelial cells.
Pro účely programů pro dozor a za účelem potvrzení infekce marteiliózou (Marteilia refringens) nebo vyloučení podezření na tuto nákazu uvedenou na seznamu v souladu s požadavky stanovenými v příloze I části 4 oddíle II musí diagnostické metody a příslušné postupy, které se použijí, odpovídat následujícím pokynům stanoveným v tabulce 4.1 níže:
DETAILED DIAGNOSTIC METHODS AND PROCEDURES FOR THE SURVEILLANCE AND CONFIRMATION OF INFECTION WITH MARTEILIA REFRINGENS
Tabulka 4.1
I. Detailed diagnostic methods and procedures for the diagnosis of infection with Marteilia refringens
Pokyny k použití diagnostických metod pro účely programů pro dozor a potvrzení nebo vyloučení výskytu infekce Marteilia refringens
When sampling and laboratory examination are carried out for the purpose of obtaining or maintaining a health status with regard to infection with Marteilia refringens as set out in Section I of Part 4 of Annex I or to confirm or rule out the presence of that listed disease in accordance with Article 57(b) of Directive 2006/88/EC, using the diagnostic methods set out in Section II of Part 4 of Annex I, the detailed diagnostic methods and procedures set out in points I.1, I.2 and I.3 of this Part shall apply.
Metoda
Sampling procedure
Cílený dozor
Gaping or freshly dead individual molluscs shall be sampled by priority, to increase the chances of finding infected animals.
Předběžná diagnóza
Once sampled, oysters or mussels shall be maintained at 4 °C or on refrigerated ice for no more than 24 hours if samples include gaping molluscs and no more than 72 hours if not, in a plastic bag including a label with details related to the nature and the origin of the oysters or mussels.
Potvrzení diagnózy
Gaping or freshly dead molluscs shall be maintained separately from other molluscs.
Otisky slinivkojaterní žlázy
A 3 to 5 mm thick section of tissues including gills and heart tissue shall be used for the diagnostic of Marteilia refringens by histology.
X (jako možnost)
A piece of digestive gland shall be used for some tests, including imprints and polymerase chain reaction (PCR).
Histopatologie
Microscopic techniques
Hybridizace in situ
Cytology (imprint cytology)
X (vždy)
After drying digestive gland tissues on absorbent paper, several imprints shall be made on a glass slide.
PODROBNÉ DIAGNOSTICKÉ METODY A POSTUPY ZA ÚČELEM DOZORU NAD INFEKCEMI BONAMIÓZOU (BONAMIA OSTREAE) A JEJICH POTVRZENÍ
Slides shall be air-dried, fixed in methanol or in absolute ethanol and stained using a commercially available blood-staining kit such as Diff-Quik®/Hemacolor®, in accordance with the manufacturer's instructions.
I.
After rinsing in tap water and drying, the slides shall be mounted with a cover-slip using an appropriate synthetic resin.
Diagnostické postupy u infekce bonamiózou (Bonamia ostreae)
The slides shall be observed first at × 200 magnification and then under oil immersion at × 1000 magnification.
Při odběru vzorků a laboratorním vyšetření za účelem získání nebo zachování určitého nákazového statusu, pokud jde o Bonamia ostreae, podle přílohy I části 5 oddílu I nebo za účelem potvrzení výskytu nebo vyloučení této nákazy uvedené na seznamu v souladu s čl. 57 písm. b) směrnice 2006/88/ES pomocí diagnostických metod stanovených v příloze I části 5 oddíle II se použijí podrobné diagnostické metody a postupy stanovené v bodech I.1, I.2 a I.3 níže.
A positive result shall be the observation of cells ranging in size up to between 30 to 40 μm.
Po odebrání se vzorky ústřic uchovávají při teplotě 4 °C nebo na chlazeném ledu v plastovém sáčku se štítkem, na němž jsou uvedeny údaje o vlastnostech a původu, a to po dobu maximálně 24 hodin v případě, že obsahují rozevřené měkkýše, a po dobu maximálně 72 hodin v případě, že je neobsahují.
Pale halos around large, strongly stained (refringent) granules and, in larger cells, cell within cell arrangements are observed.
Po usušení žaber nebo srdečních tkání na savém papíře se pořídí několik otisků na podložná sklíčka.
Sections of tissue that include gills, digestive gland, mantle, and gonad shall be fixed for at least 24 hours in Davidson's fixative followed by normal processing for paraffin histology and staining, for example with haematoxylin and eosin.
Sklíčka se usuší na vzduchu, fixují se v metanolu nebo v absolutním etanolu a obarví se pomocí komerčně dostupné sady pro barvení krve (například Diff- Quik®/Hemacolor®.), a to podle pokynů výrobce.
Observations shall be made at increasing magnifications up to × 1000.
Sklíčka se pozorují nejprve při 200násobném zvětšení a poté pod imerzní tekutinou při 1000násobném zvětšení.
A positive result shall be the observation of cells ranging in size from 4 up to 40 μm.
Za pozitivní výsledek se považuje přítomnost malých kulovitých nebo vejčitých organismů (širokých 2 až 5 μm) v hemocytech.
Early stages consist of multinucleate, spheric to elongated cells.
Extracelulárně by se však mohli objevit také paraziti.
These are mainly found in the epithelium of oesophagus and stomach and sometimes of labial palps.
Tyto organismy mají bazofilní cytoplazmu a eosinofilní jádro (barvy se mohou lišit podle použitého barvení), a vzhledem k tomu, že jsou rozetřeny po sklíčku, mohou se na otiscích zdát širší než při histologickém zkoumání.
Sporulation involves divisions of cells within cells and takes place in the digestive gland tubules and ducts.
Lze pozorovat i vícejaderné buňky.
Refringent granules appear in the course of sporulation, but are not observed in early stages.
Řezy tkání, které zahrnují žábry a slinivkojaterní žlázu, se po dobu minimálně 24 hodin fixují v Davidsonově fixačním roztoku a poté následuje běžné zpracování na parafínový histologický preparát a barvení, například hematoxylinem a eosinem.
In late phases of infection, sporangia are observed free in the lumen of the digestive tract.
Za pozitivní výsledek se považuje přítomnost parazitů v podobě velice malých buněk o šířce 2 až 5 μm v hemocytech nebo volně v pojivové tkáni nebo sinusech epitelu žaber, střeva a pláště, často ve spojení s intenzivní zánětlivou reakcí.
The granules can range from deep orange to deep red.
Aby se zamezilo jakýmkoliv pochybnostem, je k pozitivní diagnóze třeba v hemocytech parazita pozorovat.
Molecular techniques
Lze použít dva protokoly PCR, které se zaměřují na malou podjednotku (SSU) rDNA:
Polymerase chain reaction (PCR)
Směsi PCR obsahují pufr (500 mM KCl, 100 mM Tris/HCl [pH 9,0 při 25 °C] a 1 % Triton® X-100), 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM směsi dNTP, 1 μM přímých a reverzních primerů, 0,02 jednotky/μl Taq DNA polymerázy a 0,2 ng/μl šablony DNA při celkovém objemu 50 μl.
Several PCR protocols have been developed and published.
Vzorky se denaturují v termocykleru po dobu pěti minut při 94 °C a následně se podrobí 30 cyklům (1 minuta při 94 °C, 1 minuta při 55 °C, 1 minuta při 72 °C) a na závěr se po dobu 10 minut při 72 °C provede konečná extenze.
PCR primers that target the internal transcribed spacer (ITS1) region shall be used as they are able to amplify only M. refringens.
Za pozitivní výsledek se považuje pozitivní amplifikace PCR s očekávanou velikostí (300 bp), přičemž všechny negativní kontrolní vzorky musí být negativní a všechny pozitivní kontrolní vzorky pozitivní;
PCR shall be carried out in a 50 μl volume.
druhým protokolem PCR je test PCR v reálném čase s pomocí barviva SYBR® Green.
PCR mixtures shall contain buffer (500 mM KCl, 100 mM Tris/HCl [pH 9,0 at 25 °C] and 1 % Triton® X-100), 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP mix, 1 μM forward and reverse primers, 0,02 units μl– 1 Taq DNA polymerase, and 10 to100 ng of extracted DNA.
Umožňuje specificky zjistit B. ostreae (jak je popsáno níže) a lze jej kombinovat s testem PCR v reálném čase pomocí barviva SYBR® Green ke specifickému zjištění B. exitiosa (Ramilo et al.
After denaturation of DNA at 94 °C for five minutes, 30 cycles shall be run as follows: denaturation at 94 °C for one minute, annealing at 55 °C for one minute, and elongation at 72 °C for one minute per kilo-base pair.
2013).
A final elongation step of 10 minutes at 72 °C shall be performed.
Primery BOSTRE-F (5′- TTACGTCCCTGCCCTTTGTA-3′) a BOSTRE-R (5′- TCGCGGTTGAATTTTATCGT-3′) amplifikují produkt o velikosti 208 bp.
For the detection of M. refringens, PCR shall be performed with primers that target the ITS1 region (5′-CCG-CAC-ACG-TTC-TTC-ACT-CC-3′ and 5′-CTC-GCG-AGT-TTC-GAC-AGA-CG-3′).
Směsi PCR obsahují směs SYBR® Green Master (1×), 0,3 μM přímých a reverzních primerů a 200 ng extrahované DNA.
Positive controls shall consist of genomic DNA from a highly infected host or plasmidic DNA including the target region.
Vzorky se po dobu 10 minut při 95 °C denaturují v systému umožňujícím detekci v reálném čase, následně se podrobí 35 cyklům (30 sekund při 95 °C, 45 sekund při 55 °C a 1 minuta při 72 °C).
Negative controls shall consist of genomic DNA from non-infected hosts and PCR reactives without target DNA.
Provede se analýza křivky teploty tání, a to s přírůstky teploty ve výši 0,5 °C/s a počátkem na 55 °C a koncem na 95 °C, přičemž se zaznamená fluorescence při každé změně teploty.
A positive result shall be positive PCR amplification at the expected size (412 bp), with all negative controls being negative and all positive controls being positive.
Pozitivní kontrolní vzorky tvoří genomická DNA z vysoce infikované hostitelské či plazmatické DNA obsahující cílovou oblast.
In-situ hybridisation (ISH)
Negativní kontrolní vzorky tvoří genomická DNA z neinfikované hostitelské DNA a reakční činidla PCR bez cílové DNA.
Several ISH protocols have been developed and published.
Za pozitivní výsledek se považuje pozitivní amplifikace PCR s jedinečným horním bodem tání (78,25 ± 0,25 °C za podmínek zveřejněných ve studii Ramilo et al.
Probe that targets the SSU of the rRNA gene complex shall be used because it has been validated against histology.
2013), přičemž všechny negativní kontrolní vzorky musí být negativní a všechny pozitivní kontrolní vzorky pozitivní.
Sections of tissue that include gills, digestive gland, shall be fixed for at least 24 hours in Davidson's fixative followed by normal processing for paraffin histology.
Použije se sonda, která se zaměřuje na malou podjednotku (SSU) genového komplexu rDNA, přestože bylo prokázáno, že křížově reaguje s některými dalšími členy skupiny Haplosporidia.
Sections of 5 μm shall be cut and placed on aminoalkylsilane-coated slides, which shall then be baked overnight in an oven at 40 °C.
Řezy tkání, které zahrnují žábry a slinivkojaterní žlázu, se po dobu minimálně 24 hodin fixují v Davidsonově fixačním roztoku a poté následuje běžné zpracování na parafínový histologický preparát.
The sections shall be dewaxed by immersing in xylene for 10 minutes.
Řezy se inkubují s 100 μl hybridizačního pufru (4 × SSC [solný roztok citrátu sodného], 50 % formamid, 1 × Denhardtův roztok, 250 μg/ml kvasinkové tRNA, 10 % dextran sulfát) obsahujícího 20 ng (2 μl reakce PCR připravené podle postupu popsaného v bodě I.3.2 za použití primerů Bo a Boas) sondy značené digoxigeninem.
This step shall be repeated once and then the solvent shall be eliminated by immersion in two successive absolute ethanol baths for 10 minutes each.
Řezy se dvakrát opláchnou v solném roztoku citrátu sodného (2 × SSC) po dobu 5 minut při pokojové teplotě a jednou v solném roztoku citrátu sodného (0,4 × SSC) po dobu 10 minut při teplotě 42 °C.
The sections shall then be dehydrated by immersion in a graded ethanol series.
Při pozitivním výsledku jsou v hemocytech označeni paraziti, přičemž všechny negativní kontrolní vzorky musí být negativní a všechny pozitivní kontrolní vzorky musí být pozitivní.
The sections shall be treated with proteinase K (100 μg ml– 1) in TE buffer (Tris [50 mM], EDTA [10 mM]), at 37 °C for 30 minutes.
Cílovými oblastmi jsou malá podjednotka (SSU) rDNA a ITS1.
Slides shall be dehydrated by immersion in a graded ethanol series and then air dried.
Postupy za účelem dozoru nad infekcí Bonamia ostreae a jejího potvrzení
Sections shall be incubated with 100 μl of hybridisation buffer (4 × SSC [standard saline citrate], 50 % formamide, 1 × Denhardt's solution, 250 μg ml– 1 yeast tRNA, 10 % dextran sulphate) containing 10 ng (1 μl of the PCR reactants prepared as described in point I.3.2 using primers CCG-GTG-CCA-GGT-ATA-TCT-CG and TTC-GGG-TGG-TCT-TGA-AAG-GC) of the digoxigenin-labelled probe.