natgillin/translations-raw huggingface dataset:
30 sekund při 55 °C
In acute cases, tissue material of up to five fish may be pooled.
45 sekund při 72 °C
Furthermore, non-lethal samples such as blood, gill swabs, gill biopsy, mucus scrape may be used in certain cases (namely very valuable fish may be used in the case of the suspicion of the presence of KHV).
10 minut při 72 °C
DNA extraction
CyHVpol – vnitřní přímý
The commercially available DNA extraction kits that produce high quality DNA suitable for use with the PCR protocols referred to in point I.2 may be used.
Druhé kolo PCR
Agent detection and identification by Polymerase chain reaction (PCR) based methods
2 minuty při 95 °C
I.2.1. qPCR for KHV detection
CyHVpol – vnitřní reverzní
For qPCR detection of KHV, the following qPCR assay shall be used:
Místo tohoto postupu lze použít i jiné varianty PCR, u nichž byla prokázána obdobná účinnost.
Forward primer (KHV-86f): 5′- GACGCCGGAGACCTTGTG -3′;
Sekvenování může provést sama laboratoř nebo externí společnost specializovaná na sekvenování.
Reverse primer (KHV-163r): 5′- CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT -3′;
Analýza výsledků sekvenování se provede srovnáním sekvencí se známými referenčními sekvencemi KHV (jejichž přístupová čísla v databázi Gen Bank jsou: AP008984, DQ657948 a DQ177346).
and probe (KHV-109p): 5′-FAM- CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG -3′.
Získaná čistá konsenzuální sekvence musí referenčním sekvencím odpovídat v rozsahu nejméně 98 %.
Cycling conditions: one cycle of 95 °C at 15 minutes, followed by 40 cycles of 94 °C at 15 seconds and 60 °C for 60 seconds.
PODROBNÉ DIAGNOSTICKÉ METODY A POSTUPY ZA ÚČELEM DOZORU NAD NAKAŽLIVOU CHUDOKREVNOSTÍ LOSOSŮ (ISA) A JEJÍHO POTVRZENÍ
However, other qPCR versions of proven similar efficacy may be used instead.
I.
Conventional PCR for KHV detection
Postupy odběru vzorků pro účely dozoru nad ISA a její kontroly
The assay described in this point targeting the Thymine kinase (TK) gene of KHV shall be used.
Při odběru vzorků a laboratorním vyšetření pro účely programů pro dozor nebo eradikaci podle přílohy I části 3 nebo za účelem potvrzení či vyloučení výskytu ISA v souladu s čl. 57 písm. b) směrnice 2006/88/ES se použijí podrobné metody a postupy stanovené v bodech I.1, I.2 a I.3 této části.
However, other PCR assays with demonstrated similar sensitivities and specificities to the described assay may be used instead.
Pro účely laboratorního vyšetření na přítomnost ISA nesmí být vzorky ryb pokud možno smíseny.
Forward primer (KHV-TKf): 5′-GGGTTACCTGTAC GAG-3′;
Pro účely dozoru nad ISA se však smísení vzorků 2 až 5 ryb považuje za přijatelné řešení.
Reverse primer (KHV-TKr): 5′-CACCCAGTAGATTA TGC-3′.
Vzorky pro analýzu polymerázové řetězové reakce s reverzní transkripcí v reálném čase (RT-PCR) se odeberou ze všech ryb zařazených do vzorku.
Cycling conditions: one cycle of 95 °C for 5 minutes followed by 35 cycles of 95 °C for 30 seconds, 52 °C for 30 seconds, 72 °C for one minute and one cycle of 72 °C for 10 minutes.
Kousek z prvoledviny se rybám odebere pomocí sterilního nástroje a přenese se do mikroodstředivkové zkumavky s 1 ml roztoku pro konzervaci RNK, jehož účinnost byla prokázána.
Product size should be 409 bp.
Do jedné zkumavky s transportním médiem lze umístit tkáně odebrané z maximálně pěti ryb, které pak představují jeden smísený vzorek.
Furthermore, false-positive results may occur because of false primer annealing or contamination.
V jednom vzorku se použije tkáň o hmotnosti 0,5 g.
However, other PCR versions of proven similar efficacy may be used instead.
Pokud jsou ryby k získání vzorku požadované hmotnosti příliš malé, lze odebrat kousky ledviny, srdce, sleziny, jater nebo vrátníkových slepých střev (caeca pylori), v tomto pořadí, tak aby se dosáhlo hmotnosti 0,5 g.
The first detection in an area shall be confirmed by sequencing or sent to a to a national reference laboratory or to the EU reference laboratory for fish diseases referred to in Annex VI to Directive 2006/88/EC, for immediate identification.
Pro účely histologického vyšetření se tkáň odebere pouze z čerstvě usmrcených ryb normální konstituce, které vykazují klinické nebo postmortální příznaky odpovídající přítomnosti ISA.
Detailed diagnostic methods and procedures for the surveillance of KHVD
Ze všech vnějších a vnitřních lézí se odeberou vzorky; v každém případě je třeba u každé jednotlivé ryby odebrat prvoledvinu, srdce, játra, slinivku břišní, střeva, žábry a slezinu pomocí skalpelu a přenést je do 8–10 % (obj./obj.) roztoku slaného a pufrovaného formolu.
When sampling and laboratory examination for the purpose of obtaining or maintaining certain health statuses with regard to KHVD as set out in Section I of Part 2 of Annex I are carried out using the diagnostic methods set out in Sections II or III of Part 2 of that Annex, the detailed diagnostic methods and procedures set out in the following points II.1 and II.2 of this Part shall apply.
K zajištěné spolehlivé konzervace musí být poměr mezi fixativem a tkání přinejmenším 20: 1.
If possible, fish that have been kept for a prolonged time period at the virus permissive temperature range (namely, 2 to 3 weeks at 15 °C to 26 °C) shall be sampled.
Pro účely imunohistochemické analýzy se odeberou vzorky z prvoledviny a srdce.
If possible, samples shall be collected 24 hours but not later than 72 hours after management practices that may reactivate the virus in fish with a carrier status, such as netting or transport, in order to enhance the chance of KHV detection.
Tkáně pro virologické vyšetření na buněčné kultuře se odebírají ze všech ryb zařazených do vzorku.
For the purpose of the surveillance of KHVD, the fish may be sent alive or killed and packed separately in sealed aseptic containers or alternatively frozen organs or organ pieces preserved in 80 % to 100 % alcohol or viral transport medium (to be processed within 48 hours after collection) may be used for testing PCR based methods.
Kousky jater, předledviny nebo prvoledviny, srdce a sleziny se rybám odeberou pomocí sterilního nástroje a přenesou se do plastových zkumavek s 9 ml transportního média.
For the surveillance of KHVD, gill and kidney tissue shall be collected.
Do jedné zkumavky obsahující transportní médium lze odebrat tkáň z maximálně pěti ryb, která pak představuje jeden směsný vzorek.
For the purpose of surveillance of KHVD, pooling shall be avoided where possible.
V jednom vzorku se použije tkáň o hmotnosti 1,0 ± 0,5 g.
If pooling is necessary, tissue material from a maximum of two fish may be pooled.
Do laboratoře lze přepravovat celé ryby, pokud mohou být během přepravy splněny teplotní požadavky popsané v odstavci 3 tohoto bodu.
Larger samples shall be homogenised in mortar and pestle or stomacher, and subsamples retrieved for DNA extraction before clarification.
Celá ryba musí být zabalena do savého papíru a zaslána v plastovém sáčku, přičemž musí být podle uvedeného odstavce chlazena.
Alternatively, subsamples may be collected from each tissue included in the sample and placed in ‘lysis-tubes’.
Ryby mohou být zasílány i živé, avšak pouze pod dohledem národní referenční laboratoře pro nákazy ryb a při zohlednění dalších aspektů spojených s dezinfekcí a biologickou bezpečností při přepravě živých ryb.
Commercially available DNA extraction kits that produce high quality DNA suitable for use with the PCR protocols set out in point II.2 may be used.
Vzorky krve a zkumavky s tkání ryb určenou k virologickému vyšetření nebo analýze RT-PCR se umístí do izolovaných nádob, například polystyrénových přepravek se silnými stěnami, spolu s dostatečným množstvím ledu nebo chladicích bloků, tak aby se při přepravě do laboratoře zajistilo chlazení vzorků.
The acceptable tissue medium ratio shall be 1:9 w/v.
Nesmí přitom dojít k jejich zmrazení a přepravní nádoba musí ještě při převzetí zásilky obsahovat led nebo musí být jeden či více chladicích bloků stále částečně nebo úplně zmrazený.
20 to 25 mg tissue material shall be included in the tests.
Za mimořádných okolností mohou být vzorky RT-PCR a vzorky pro virologické vyšetření zmrazeny a do laboratoře přepravovány při teplotě od – 20 °C níže.
Surveillance of KHVD by PCR based methods
V případě analýzy RT-PCR u tkání konzervovaných přípravkem RNAlater se extrakce RNA v závislosti na teplotě, při které jsou vzorky skladovány, provede v těchto lhůtách:
For the surveillance of KHV, a qPCR shall be used.
vzorky skladované při – 20 °C: neomezeně.
If positive samples appear in an area not previously confirmed positive, the test results shall be confirmed either:
Přepravují-li se tkáně ryb k histologickému vyšetření ve fixativu, musí se převážet v nepropustných zkumavkách umístěných v nádobách odolných vůči nárazu.
by sequencing of a PCR or nested PCR product from the samples.
Je přitom třeba zajistit, aby nedošlo ke zmrazení těchto vzorků.
The obtained clean consensus sequence shall match (by at least 98 %) with these reference sequences.
Na základě souhlasu diagnostické laboratoře mohou být z ryb odebrány a k doplňkovému vyšetření připraveny i jiné tkáně než ty, jež se uvádějí v bodě I.1.
or alternatively, samples may be sent to a national reference laboratory for confirmation.
Podrobné diagnostické metody a postupy za účelem dozoru nad ISA a jejího potvrzení nebo vyloučení podezření na ni
qPCR for KHV detection
Při laboratorním vyšetření za účelem získání nebo zachování určitého nákazového statusu, pokud jde o ISA, podle přílohy I části 3 oddílu I, nebo za účelem potvrzení výskytu ISA nebo vyloučení podezření na ni v souladu s čl. 57 písm. b) směrnice 2006/88/ES pomocí diagnostických metod stanovených v příloze I části 3 oddíle II se použijí podrobné metody a postupy stanovené v následujících bodech II.1 až II.5.
The qPCR described as follows shall be used:
1 Vyšetření vzorků pomocí RT-PCR
Cycling conditions: one cycle of 95 °C at 15 minutes, followed by 50 cycles of 94 °C at 15 seconds and 60 °C for 60 seconds.
Diagnostickou metodou, jež má být použita ke screeningu ISAV, je RT-qPCR.
The results of the qPCR may vary depending on the conditions under which it is performed, namely the thermal protocols might need optimisation, depending on the thermal cycler in use.
Vzhledem k tomu, že výsledky RT-qPCR se mohou v závislosti na podmínkách, za nichž je prováděna, lišit, jsou součástí vyšetření odpovídající pozitivní a negativní kontrolní vzorky a amplikony, tak aby se zabránilo jakýmkoli pochybnostem.
Conventional PCR for confirmation of KHV detection
Extrakce celé RNA
For confirmation of the presence of infection with KHV, the generic nested PCR described in the following Table 2.1 shall be used followed by sequencing of the amplified product.
Celá RNA se extrahuje fenol-chloroformovou metodou nebo afinitními spin kolonami pro RNA podle pokynů výrobce.
Table 2.1
Purifikovaná RNA se resuspenduje v destilované vodě zbavené RNázy (tedy ve vodě ošetřené 0,1 % dietylpyrokarbonátem).
Primers and conditions for the nested PCR assay targeting all cyprinid herpesviruses (CyHV-1, CyHV-2 and CyHV-3)
Odhad koncentrace a čistoty extrahované RNA se provede měřením optické hustoty při 260 nm a při 280 nm.
Primer name
Alternativním přístupem může být zařazení vnitřních kontrol zaměřených na hostitelský genom podle bodu II.1.3.
Sequence
RT-PCR za účelem zjištění ISAV
Cycling conditions
K amplifikaci genomu ISAV lze použít několik metod RT-PCR.
Product size
Může být provedena dvoustupňová polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí v reálném čase (RT-PCR), přičemž stupně reakce RT a PCR probíhají každý v jiné zkumavce.
CyHVpol-forward
Lze však provést také jednostupňovou reakci: obě reakce pak probíhají v jedné zkumavce.
First round PCR
Použije se pokud možno jednostupňová metoda, a to z toho důvodu, že test v jedné zkumavce minimalizuje riziko křížové kontaminace, protože obsah nemusí být přenášen, přičemž tato metoda se považuje za stejně citlivou jako metoda dvoustupňová.
1 cycle:
Použijí se primery a test, jež jsou popsány v tomto bodě, tedy pár primerů ILA1 či ILA2, které se zaměřují na segment 8 a které byly shledány za vhodné ke zjišťování ISAV v ohniscích a u ryb, které jsou přenašeči.
95 °C 2 minutes
Reverzní primer ILA2 neodpovídá izolátům ze Severní Ameriky, a proto se v těchto případech použije alternativní sada primerů.
40 cycles:
Přímý primer (ILA1): 5′-GGCTATCTACCATGAACGAATC-3′;
95 °C for 30 seconds
Reverzní primer (ILA2): 5′-GCCAAGTGTAAGTAGCACTCC-3′.
55 °C for 30 seconds
Podmínky cyklování: 30 minut při 50 °C; 1 cyklus: 15 minut při 94 °C, 40 cyklů: 30 sekund při 94 °C, 30 sekund při 55 °C, 60 sekund při 72 °C; 1 cyklus: 5 minut při 72 °C.
72 °C for 45 seconds
Velikost produktu je 155 bp.
72 °C for 10 minutes
Místo tohoto postupu lze použít i jiné varianty RT-PCR, u nichž byla prokázána obdobná účinnost.
CyHVpol-reverse
RT-qPCR za účelem zjištění ISAV
CyHVpol-internal forward
Použitím kvantitativní polymerázové řetězové reakce s reverzní transkripcí v reálném čase (RT-qPCR) lze zvýšit specifičnost a pravděpodobně i citlivost testu.
Second round PCR
Tato metoda je rychlejší, protože nevyžaduje gelovou elektroforézu, a navíc snižuje riziko křížové kontaminace, protože množství RNA s genomem viru ve zkumavce se vzorkem lze odhadnout.
95 °C 2 minutes,
Nevýhodou testu RT-qPCR je, že často není možné provést sekvenování amplifikovaných produktů.
CyHVpol-internal reverse
Panují-li však pochybnosti o specifičnosti amplifikovaného produktu, musí být k ověření výsledku proveden další specifický test na ISAV.
PCR versions of proven similar efficacy may be used instead.
Použije se test popsaný v tomto bodě, což je test, který se zaměřuje na segment 8.
Sequencing may be performed by the laboratory or at external specialised sequencing companies.
Tento test se použije u izolátů z Evropské unie, Evropského sdružení volného obchodu a Severní Ameriky.
Sequencing results shall be analysed by aligning the sequences to the known reference sequences of KHV (Gen Bank accession numbers AP008984, DQ657948 and DQ177346).
Použije se pokud možno jednostupňová metoda, protože test v jedné zkumavce minimalizuje riziko křížové kontaminace.
The obtained clean consensus sequence must match at least to 98 % with those reference sequences.
Přímý primer: 5′- CTACACAGCAGGATGCAGATGT -3′;
DETAILED DIAGNOSTIC METHODS AND PROCEDURES FOR THE SURVEILLANCE AND CONFIRMATION OF INFECTIOUS SALMON ANEMIA (ISA)
Reverzní primer: 5′- CAGGATGCCGGAAGTCGAT -3′;
I. Sampling procedures for the surveillance and control of ISA
a sonda: 5′-FAM- CATCGTCGCTGCAGTTC – MGBNFQ-3′.
When sampling and laboratory examination are carried out, for the purpose of the surveillance or eradication programmes set out in Part 3 of Annex I or to confirm or rule out the presence of ISA in accordance with Article 57(b) of Directive 2006/88/EC, the detailed methods and procedures set out in points I.1, I.2 and I.3 of this Section shall apply.
Podmínky cyklování: 30 minut při 50 °C; 1 cyklus: 15 minut při 95 °C; 40 cyklů: 15 sekund při 94 °C, 60 sekund při 60 °C; v případě potřeby se tyto podmínky upraví.
For the purpose of laboratory examination for the presence of ISA, fish samples shall not be pooled where possible.
Sekvenování amplifikovaných produktů PCR
However, for the purpose of surveillance for ISA, the pooling of 2 to be 5 fish is accepted.
Přímý primer (ILAs6-3F): 5′-ATGAGGGAGGTAGCATTGCA -3′;
Samples for Reverse Transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis shall be taken from all of the fish sampled.
Reverzní primer (ILAs6-2R): 5′-CATGCTTTCCAACCTGCTAGGA -3′.
A piece of mid-kidney shall be removed from the fish using a sterile instrument and transferred to a microfuge tube containing one ml RNA preservative solution of proven efficacy.
Alternativně lze k sekvenování HPR v segmentu 6 použít tuto metodu:
The weight of tissue in one sample shall be 0,5 g.
Přímý primer: 5′-GAC-CAG-ACA-AGC-TTA-GGT-AAC-ACA-GA-3′,
When the fish are too small to obtain a sample of the required weight, pieces of kidney, heart, spleen, liver or pyloric caeca may be taken, in that order of preference, to make up 0,5 g.
Reverzní primer: 5′-GAT-GGT-GGA-ATT-CTA-CCT-CTA-GAC-TTG-TA-3′;.
Tissue for histological examination shall only be taken from freshly killed fish with a normal constitution, exhibiting clinical signs or post-mortem findings consistent with the presence of ISA.
Velikost produktu: 304 nt v případě HPR0.
Any external or internal lesions shall be sampled and in any case samples of mid-kidney, heart, liver, pancreas, gut, gills and spleen shall be removed from individual fish using a scalpel and transferred to 8 % to 10 % (vol:vol) buffered formol saline.
Lze použít i testy RT-PCR s podobnou citlivostí a specifičností, jakou mají testy popsané v tomto bodě.
The ratio of fixative to tissue shall be at least 20:1 to ensure satisfactory preservation of the tissues.
Před sekvenováním se pomocí gelové elektroforézy provede kontrola čistoty amplifikovaných produktů RT-PCR.
For immunohistochemistry (IHC), samples from mid-kidney and heart shall be taken.
Je-li zjištěn pouze jeden čistý fragment, provede se jeho purifikace přímo z reakce PCR.
Tissues for virological examination on cell culture shall be taken from all of the fish sampled.
Je-li přítomno více amplifikovaných fragmentů, provede se pomocí gelové elektroforézy purifikace fragmentu, který je předmětem zájmu.
Pieces of the liver, anterior or mid-kidney, heart and spleen shall be removed from the fish using a sterile instrument and transferred to plastic tubes containing 9 ml transport medium.
Purifikace fragmentů PCR z roztoků nebo agarózových gelů se provede afinitními spin kolonami pro fragment PCR podle pokynů výrobce.
Tissues from up to five fish may be collected in one tube containing transport solution and represent one pooled sample.
Sekvenování provede pomocí amplifikačních primerů specializovaná externí společnost.
The weight of tissue in one sample shall be 1,0 ± 0,5 g.
Výsledky se analyzují pomocí algoritmu BLAST a sekvence se porovnají s jinými známými sekvencemi v databázi nukleotidů Národního centra USA pro biotechnologické informace (National Centre for Biotechnical Information – NCBI).
Shipment of samples from fish
Sekvenování musí odstranit jakékoli pochybnosti o specifičnosti amplifikovaného produktu RT-PCR.
Whole fish may be transported to the laboratory if the temperature requirements during transportation, as described in paragraph 3 of this point can be fulfilled.
2 Izolace ISAV na buněčné kultuře
Whole fish shall be wrapped in absorbent paper and shipped in a plastic bag, chilled as described in that paragraph.
Příprava vzorků
Live fish may also be shipped, but only under the supervision of the National reference laboratory for fish diseases and taking into account the additional disinfection and biosecurity issues when transporting live fish.
Tkáň se uchovává při teplotě – 80 °C.
Blood samples and tubes containing fish tissues for virological examination or RT-PCR analysis shall be placed in insulated containers, such as thick-walled polystyrene boxes, together with sufficient ice or freeze blocks to ensure chilling of the samples during transportation to the laboratory.
Tkáň lze před vyšetřením zmrazit a rozmrazit pouze jednou.
Freezing shall be avoided and ice must still be present in the transport box at receipt of the shipment or one or more of the ‘freeze blocks’ must still be partly or completely frozen.
Pro účely dozoru a kontroly se vyšetření provede co nejrychleji.
In exceptional circumstances, RT-PCR samples and samples for virological examination may be snap-frozen and transported to the laboratory at – 20 °C or below.
Každý vzorek (směs tkání v transportním médiu) se zcela homogenizuje za pomoci schváleného homogenizátoru, odstřeďuje se při 2000 až 4000 × g po dobu 15 minut za teploty 0 až 6 °C a supernatant se filtruje (filtrem s póry o velikosti 0,45 μm) a inkubuje se stejným objemem přiměřeně zředěné směsi antisér proti domácím sérotypům viru infekční nekrózy pankreatu (IPNV).
For RT-PCR analysis of tissues preserved in Ribonucleic acid(RNA)later, RNA extraction shall be carried out within the following time frames depending on the temperature the samples are stored at:
Při 50 % neutralizačním plakovém testu musí titr antiséra činit minimálně 1: 2000.
samples stored at – 20 °C: indefinitely.
Směs se inkubuje po dobu jedné hodiny při teplotě 15 °C.
If fish tissues are transported in fixative for histological examination, they shall be shipped in leak proof tubes in impact-resistant containers.
Použije se jako očkovací látka (inokulum).
Freezing of those samples shall be avoided.
Ošetření všech inokulí antisérem viru infekční nekrózy pankreatu (v některých částech Evropy je tímto virem kontaminováno 50 % rybích vzorků) slouží k prevenci výskytu cytopatického efektu (CPE) vyvolaného IPNV u naočkovaných buněčných kultur.
Subject to the approval of the diagnostic laboratory, fish tissues other than those referred to in point I.1 may be collected and prepared for supplementary examination.
Toto ošetření lze provést ke zkrácení doby virologických vyšetření, jakož i ke snížení počtu případů, v nichž by se zjištění CPE mohlo považovat za možnou známku ISAV.
Detailed diagnostic methods and procedures for the surveillance and for the confirmation of the presence of or to rule out the suspicion of ISA
Pokud vzorky pocházejí z výrobních jednotek, které se považují za prosté IPNV, lze ošetření očkovací látkou s antisérem na IPNV vynechat.
When laboratory examination for the purpose of obtaining or maintaining a certain health status with regard to ISA as set out in Section I of Part 3 of Annex I, or for the purpose of the confirmation of the presence of or to rule out a suspicion of ISA in accordance with Article 57(b) of Directive 2006/88/EC, are carried out, using the diagnostic methods set out in Section II of Part 3 of Annex I, the detailed methods and procedures set out in the following points II.1 to II.5 shall apply.
Naočkování buněčných kultur
Examination of samples by RT-PCR
Pro prvotní izolaci ISAV se použijí buňky z ledvin lososa obecného (Atlantic salmon kidney – ASK).
The diagnostic method to be used for the screening for ISAV shall be RT-qPCR.
Mohou být použity i jiné buněčné linie, jejichž účinnost a citlivost v souvislosti s izolováním ISAV byly prokázány, přičemž je třeba zohlednit variabilitu kmene a schopnost různých kmenů rozmnožovat se v různých buněčných liniích.
As the results of the RT-qPCR can vary depending on the conditions under which it is performed, adequate positive and negative controls and amplicons shall be included to avoid any doubts.
Pokud se použije nízký počet pasáží, podporují buňky ASK podle všeho izolaci a růst dosud známých izolátů viru.
Total RNA extraction
U buněk ASK může být cytopatický efekt (CPE) výraznější než u jiných vnímavých buněčných linií, např. SHK-1 (Salmon head kidney-1).
Total RNA shall be extracted using the phenol-chloroform method or RNA affinity spin columns, according to the manufacturer's instructions.
Buňky ASK (subkultivační číslo 65 nebo nižší) se kultivují v médiu L-15 s 10 % fetálním bovinním sérem, 2 % (obj./obj.) 200mM L-glutaminu a 0,08 % (obj./obj.) 50mM 2-merkaptoetanolu na destičkách s více jamkami.
Purified RNA shall be re-suspended in distilled RNase-free water (namely water treated with 0,1 % diethyl pyrocarbonate).
Antisérem ošetřená suspenze orgánů se naočkuje do mladých, aktivně rostoucích buněčných kultur tak, aby se dosáhlo konečného zředění tkáňového materiálu v médiu buněčných kultur v poměru 1: 1000.
The concentration and purity of the extracted RNA shall be estimated by measuring the optical density at 260 nm and at 280 nm.
Na každý orgán se do jedné jamky s 2 ml kultivačního média přidá suspenze s 40 μl inokula.
An alternative approach may be to include internal controls targeted against the virus genome as referred to in point II.1.3.
V zájmu minimalizace rizika křížové kontaminace se pro vzorky z různých míst s chovem ryb použijí samostatné destičky s 12 nebo 24 jamkami.
RT-PCR for ISAV detection
Jedna destička se nenaočkuje a poslouží jako negativní kontrolní vzorek.
Several RT-PCR methods may be used for ISAV genome amplification.
Jiná destička se naočkuje referenčním izolátem ISAV a poslouží jako pozitivní kontrolní vzorek, přičemž se použije tento postup.
A two-step RT-PCR may be performed whereby the RT and the PCR reactions steps are run in two separate tubes.