natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Buňky NCI-H295R lze komerčně získat z American Type Culture Collections (ATCC) po podpisu smlouvy o prodeji materiálu (Material Transfer Agreement, MTA) [14].
Introduction
Úvod
Due to changes in the E2 producing capacity of the cells with increasing age/passages (2), cells should be cultured following a specific protocol before they are used and the number of passages since the cells were defrosted as well as the passage number at which the cells were frozen and placed in liquid nitrogen storage should be noted.
Z důvodu změn schopnosti buněk produkovat E2 se zvyšujícím se stářím/počtem pasáží (2) by kultivace buněk měla před jejich použitím probíhat v souladu s konkrétním pracovním postupem a měl by být zaznamenán počet pasáží od rozmrazení buněk i číslo/pořadí pasáže, v níž byly buňky zmraženy a umístěny do kapalného dusíku.
The first number indicates the actual cell passage number and the second number describes the passage number at which the cells were frozen and placed in storage.
První číslo uvádí skutečný počet buněčných pasáží a druhé číslo popisuje číslo pasáže, v níž byly buňky zmraženy a uloženy.
For example, cells that were frozen after passage five and defrosted and then were split three times (4 passages counting the freshly thawed cells as passage 1) after they were cultured again would be labelled passage 4.5.
Například buňky, které byly zmraženy po pasáži pět a rozmraženy a poté byly třikrát rozděleny (čtyři pasáže počítající čerstvě rozmražené buňky se počítají jako pasáž 1) by poté, co byly opět kultivovány, byly označeny jako pasáž 4,5.
An example of a numbering scheme is illustrated in Appendix I to the validation report (4).
Příklad schématu číslování je uveden v dodatku I validační zprávy (4).
Stock medium is used as the base for the supplemented and freezing mediums.
Jako základ pro obohacené médium a mrazicí médium se použije zásobní médium.
Supplemented medium is a necessary component for culturing cells.
Obohacené médium je nezbytnou součástí kultivace buněk.
Freezing medium is specifically designed to allow for impact-free freezing of cells for long-term storage.
Mrazicí médium je speciálně navrženo tak, aby umožnilo ničím nedotčené zmrazení buněk pro dlouhodobé skladování.
Prior to use, Nu-serum (or a comparable serum of equal properties that has been demonstrated to produce data that meets the test performance and Quality Control (QC) requirements), which is a constituent of supplemented media, should be analysed for background T and E2 concentrations.
Před použitím by z hlediska základních koncentrací T a E2 měla proběhnout analýza Nu-séra (nebo srovnatelného séra se stejnými vlastnostmi, kde bylo prokázáno, že splňuje požadavky na provedení zkoušky a kontrolu kvality), které je součástí obohaceného média.
The preparation of these solutions is described in Appendix II to the validation report (4).
Příprava těchto roztoků je popsána v dodatku II validační zprávy (4).
After initiation of an H295R cell culture from an original ATCC batch, cells should be grown for five passages (i.e.the cells are split 4 times).
Po zahájení kultivace buněk H295R z původní dodávky z ATCC by buňky měly růst po pět pasáží (tj. buňky jsou rozděleny čtyřikrát).
Passage five cells are then frozen in liquid nitrogen for storage.
Buňky pasáže 5 jsou poté zmraženy v kapalném dusíku a uskladněny.
Prior to freezing the cells, a sample of the previous passage four cells is run in a QC plate (See paragraph 36 and 37) to verify whether the basal production of hormones and the response to positive control chemicals meet the assay quality control criteria as defined in Table 5.
Před zmrazením buněk je na destičce pro kontrolu kvality (QC-destičce) odebrán vzorek buněk předchozí pasáže 4 (viz odstavec 36 a 37), aby se ověřilo, zda bazální produkce hormonů a reakce pozitivní kontrolní látky splňují kritéria kontroly kvality zkoušky definovaná v tabulce 5.
H295R cells need to be cultured, frozen and stored in liquid nitrogen to make sure that there are always cells of the appropriate passage/age available for culture and use.
Buňky H295R musí být kultivovány, zmraženy a uchovávány v kapalném dusíku, aby bylo zajištěno, že pro účely kultivace a použití budou vždy k dispozici buňky příslušné pasáže/stáří.
The maximum number of passages after taking a new [15] or frozen [16] batch of cells into culture that is acceptable for use in the H295R assay should not exceed 10.
Aby to bylo přijatelné pro zkoušku H295R, tak pasáží po odebrání nové [15] nebo zmrazené [16] dodávky buněk do kultury by nemělo být více než deset.
For example, acceptable passages for cultures of cells from a batch frozen at passage 5 would be 4.5 through 10.5.
Například přijatelné pasáže pro kultury buněk z dávky zmrazené v pasáži 5 by byly 4,5 až 10,5.
For cells started from these frozen batches, the procedure described in paragraph 19 should be followed.
U buněk kultivovaných z těchto zmrazených dávek by měl být dodržen postup popsaný v odstavci 19.
These cells should be cultured for at least four (4) additional passages (passage 4.5) prior to their use in testing.Starting Cells from the Frozen Stock
Tyto buňky by se měly před použitím kultivovat alespoň čtyři (4) další pasáže (pasáž 4,5).Aktivace buněk ze zmrazené zásoby
The procedure for starting the cells from frozen stock is to be used when a new batch of cells is removed from liquid nitrogen storage for the purpose of culture and testing.
Postup pro aktivaci buněk ze zmrazené zásoby se uplatňuje tehdy, když se z uskladnění v kapalném dusíku vyjme pro účely kultivace a zkoušení nová dávka buněk.
Details for this procedure are set forth in Appendix III to the validation report (4).
Podrobnosti o tomto postupu jsou stanoveny v dodatku III validační zprávy (4).
Cells are removed from liquid nitrogen storage, thawed rapidly, placed in supplemented medium in a centrifuge tube, centrifuged at room temperature, re-suspended in supplemented medium, and transferred to a culture flask.
Buňky jsou vyjmuty ze skladovacích nádob s kapalným dusíkem, rychle jsou rozmraženy, umístěny do obohaceného média v centrifugační zkumavce, odstředěny při pokojové teplotě, opětovně suspendovány v obohaceném médiu a přeneseny do kultivační baňky.
The medium should be changed the following day.
Médium by mělo být následující den vyměněno.
The H295R cells are cultivated in an incubator at 37 °C with 5 % CO2 in air atmosphere and the medium is renewed 2-3 times per week.
Buňky H295R se kultivují v inkubátoru při teplotě 37 °C s 5 % CO2 ve vzduchové atmosféře a médium se obnovuje 2–3krát týdně.
When the cells are approximately 85-90 % confluent, they should be split.
Jakmile buňky dosáhnou konfluence přibližně 85–90 %, měly by být rozděleny.
Splitting of the cells is necessary to ensure the health and growth of the cells and to maintain cells for performing bioassays.
Rozdělení buněk je nezbytné pro zajištění zdraví a růstu buněk a pro zachování buněk pro účely provádění biologických zkoušek.
The cells are rinsed three times with phosphate-buffered saline (PBS, without Ca2+ Mg2+.) and freed from the culture flask by the addition of an appropriate detachment enzyme, e.g. trypsin, in PBS (without Ca2+ Mg2+).
Buňky jsou třikrát opláchnuty ve fyziologickém roztoku ve fosfátovém pufru (PBS, bez Ca2+ Mg2+.) a vyňaty z kultivační baňky přidáním vhodného odlučovacího enzymu, např. trypsinu, do PBS (bez Ca2+ Mg2+).
Immediately after the cells detach from the culture flask, the enzyme action should be stopped with the addition of supplemented medium at a ratio of 3× the volume used for the enzyme treatment.
Bezprostředně po vynětí buněk z kultivační baňky by působení enzymu mělo být zastaveno přidáním obohaceného média v poměru trojnásobku objemu použitého pro aplikaci enzymu.
Cells are placed into a centrifuge tube, centrifuged at room temperature, the supernatant is removed and the pellet of cells is re-suspended in supplemented medium.
Buňky jsou umístěny do centrifugační zkumavky, odstředěny při pokojové teplotě, je odstraněn supernatant a sediment buněk se resuspenduje v obohaceném médiu.
The appropriate amount of cell solution is placed in the new culture flask.
Příslušné množství buněčné suspenze se umístí do nové kultivační baňky.
The amount of cell solution should be adjusted so that the cells are confluent within 5-7 days.
Toto množství buněčné suspenze by se mělo upravit tak, aby buňky dosáhly do 5–7 dnů konfluence.
The recommended sub-cultivation ratio is 1:3 to 1:4.
Doporučený subkultivační poměr je 1:3 až 1:4.
The plate should be carefully labelled.
Destička by měla být pečlivě označena.
The cells are now ready to be used in the assay and excess cells should be frozen in liquid nitrogen as described in paragraph 20.
Buňky jsou nyní připraveny k použití při zkoušce a přebytečné buňky by měly být podle odstavce 20 zmraženy v kapalném dusíku.
Freezing H295R Cells (preparing cells for liquid nitrogen storage)
Zmrazení buněk H295R (příprava buněk na skladování v kapalném dusíku)
To prepare H295R cells for freezing, the procedure described above for splitting cells should be followed until the step for re-suspending the pellet of cells in the bottom of the centrifuge tube.
Pro přípravu buněk H295R na zmrazení je zapotřebí dodržet postup popsaný výše u dělení buněk až do kroku resuspenze sedimentu buněk na dně odstředivkové zkumavky.
Here, the pellet of cells is re-suspended in freezing medium.
Zde je sediment buněk resuspendován v mrazicím médiu.
The solution is transferred to a cryogenic vial, labelled appropriately, and frozen at – 80 °C for 24 hours after which the cryogenic vial is transferred to liquid nitrogen for storage.
Roztok je přenesen do řádně označené kryogenní ampulky a zmražen při teplotě – 80 °C na 24 hodin, po jejichž uplynutí je kryogenní ampulka přemístěna do kapalného dusíku k uskladnění.
Plating and Pre-incubation of Cells for Testing
Umístění buněk na destičky a preinkubace před zkoušením
The number of 24-well plates, prepared as outlined in paragraph 19, that will be needed depends on the number of chemicals to be tested and the confluency of the cells in the culture dishes.
Počet 24jamkových destiček připravených podle odstavce 19, které budou zapotřebí, závisí na počtu zkoušených chemických látek a konfluenci buněk v kultivačních miskách.
As a general rule, one culture flask (75 cm2) of 80-90 % confluent cells will supply sufficient cells for one to 1,5 (24-well) plates at a target density of 200000 to 300000 cells per ml of medium resulting in approximately 50-60 % confluency in the wells at 24 hours (Figure 2).
Zpravidla jedna kultivační baňka (75 cm2) buněk s 80–90 % konfluencí zajistí dostatečné množství buněk pro 1–1,5 (24jamkové) destičky při cílové hustotě 200000 až 300000 buněk na 1 ml média s výslednou přibližnou 50–60 % konfluencí v jamkách během 24 hodin (obrázek 2).
This is typically the optimal cell density for hormone production in the assay.
To je obvykle optimální hustota buněk pro produkci hormonu při zkoušce.
At higher densities, T as well as E2 production patterns are altered.
Při vyšších hustotách se vzorce produkce T i E2 mění.
Before conducting the assay the first time, it is recommended that different seeding densities between 200000 and 300000 cells per ml be tested, and the density resulting in 50-60 % confluency in the well at 24 hours be selected for further experiments.
Před prvním provedením zkoušky se doporučuje vyzkoušet různé hustoty nasazení mezi 200000 a 300000 buňkami na 1 ml a pro další pokusy vybrat hustotu, která během 24 hodin přinese 50–60 % konfluenci v jamce.
Photomicrograph of H295R cells at a seeding density of 50 % in a 24 well culture plate at 24 hours taken at the edge (A) and centre (B) of a well
Mikrosnímek buněk H295R při 50 % hustotě nasazení v 24jamkové kultivační destičce po 24 hodinách pořízený na okraji (A) a ve středu (B) jamky
Necropsy P animals
Pitva zvířat rodičovské generace P
Pre-mating
Před pářením
Post-mating
Po páření
2 weeks
2 týdny
6 weeks
6 týdnů
Pregnancy
Březost
Lactation
Laktace
In-utero development
Nitroděložní vývoj
Pre-weaning
Před odstavením
Post-weaning
Po odstavení
Parental generation
Rodičovská generace
Cohort
Kohorta
Designation
Pojmenování
Animals/cohort
Počet zvířata/kohortu
Approximate age at necropsy (weeks)
Přibližné stáří při pitvě (v týdnech)
Target is 20 litters per group
Cílem je 20 vrhů na skupinu
Surplus
Přebytek
Reproductive
Reprodukční
Neurotoxicity
Neurotoxicita
Immunotoxicity
Imunotoxicita
Spares
Náhrady
20 M + 20 F
20 samců + 20 samic
10 M + 10 F @
10 samců + 10 samic @
14 or 20-25 if triggered
@ Pokud možno jeden na vrh a celkově je třeba reprezentovat všech 20 vrhů, pokud je to možné
The medium is pipetted off the culture flask, and the cells are rinsed 3 times with sterile PBS (without Ca2+Mg2+).
Médium je rozpipetováno z kultivační baňky a buňky jsou třikrát propláchnuty sterilním PBS (bez Ca2+Mg2+).
An enzyme solution (in PBS) is added to detach the cells from the culture flask.
Je přidán roztok enzymu (v PBS) pro oddělení buněk od kultivační baňky.
Following an appropriate time for detachment of the cells, the enzyme action should be stopped with the addition of supplemented medium at a ratio of 3 × the volume used for the enzyme treatment.
Po uplynutí náležité doby pro oddělení buněk by působení enzymu mělo být zastaveno přidáním obohaceného média v poměru trojnásobku objemu použitého pro aplikaci enzymu.
Cells are placed into a centrifuge tube, centrifuged at room temperature, the supernatant is removed, and the pellet of cells is re-suspended in supplemented medium.
Buňky jsou umístěny do centrigugační zkumavky, odstředěny při pokojové teplotě, odstraní se supernatant a sediment buněk se resuspenduje v obohaceném médiu.
The cell density is calculated using e.g. a haemocytometer or cell counter.
Hustota buněk se vypočítá např. pomocí hemocytometru nebo počítače buněk.
The cell solution should be diluted to the desired plating density and thoroughly mixed to assure homogenous cell density.
Buněčná suspenze by měla být zředěna na požadovanou hustotu pro destičku a důkladně rozmíchána, aby byla zajištěna homogenní hustota buněk.
The cells should be plated with 1 ml of the cell solution/well and the plates and wells labelled.
Buňky by měly být umístěny na destičky s 1 ml buněčné suspenze na jamku a destičky a jamky by měly být označeny.
The seeded plates are incubated at 37 °C under 5 % CO2 in air atmosphere for 24 hours to allow the cells to attach to the wells.
Destičky s nasazenými buňkami se inkubují při teplotě 37 °C ve vzduchové atmosféře s 5 % CO2 na dobu 24 hodin, aby se buňky mohly přichytit k jamkám.
QUALITY CONTROL REQUIREMENTS
POŽADAVKY KONTROLY KVALITY
It is critical that exact volumes of solutions and samples are delivered into the wells during dosing because these volumes determine the concentrations used in the calculations of assay results.
Je velmi důležité, aby během dávkování byl do jamek umístěn přesný objem roztoků a vzorků, protože tento objem určuje koncentrace používané při počítání výsledků zkoušky.
Prior to the initiation of cell culture and any subsequent testing, each laboratory should demonstrate the sensitivity of its hormone measurement system (paragraphs 29-31).
Před zahájením kultivace buněk a jakýmkoli následným zkoušením by každá laboratoř měla doložit citlivost svého systému měření hormonů (odstavce 29–31).
If antibody-based hormone measurement assays are to be used, the chemicals to be tested should be analysed for their potential to interfere with the measurement system used to quantify T and E2 as outlined in paragraph 32 prior to initiating testing.
Používají-li se zkoušky měření hormonu na základě protilátek, musí být před zahájením zkoušení provedena analýza zkoušených chemických látek, aby se zjistilo, zda mají potenciál působit rušivě na systém měření používaný ke kvantifikaci T a E2 podle odstavce 32.
DMSO is the recommended solvent for the assay.
Doporučovaným rozpouštědlem pro zkoušku je DMSO.
If an alternative solvent is utilised, the following should be determined:
Pokud se používá alternativní rozpouštědlo, je zapotřebí stanovit toto:
The solubility of the test chemical, forskolin and prochloraz in the solvent;
cytotoxicitu jako funkci koncentrace rozpouštědla.
The cytotoxicity as a function of the concentration of solvent.
Doporučuje se, aby maximální přípustná koncentrace rozpouštědla nepřekročila desetinásobek zředění nejmenší cytotoxické koncentrace rozpouštědla.
It is recommended that the maximum allowable solvent concentration should not exceed a 10 × dilution of the least cytotoxic concentration of the solvent.
Před prvním provedením zkoušky by laboratoř měla provést kvalifikační pokus prokazující, že laboratoř je schopna udržet a dosáhnout vhodných kultivačních a experimentálních podmínek, které jsou požadovány pro zkoušení chemické látky podle odstavců 33–35.
Prior to conducting testing for the first time, the laboratory should conduct a qualifying experiment demonstrating that the laboratory is capable of maintaining and achieving appropriate cell culture and experimental conditions required for chemical testing as described in paragraphs 33-35.
Na začátku zkoušení při použití nové dávky buněk by před použitím nové dávky buněk ke zkoušení měl být proveden kontrolní experiment (destička pro kontrolu kvality – QC plate) ke zhodnocení vlastností buněk podle odstavců 36 a 37.
When initiating testing using a new batch, a control plate should be run before using a new batch of cells to evaluate the performance of the cells as described in paragraphs 36 and 37.
Fungování systému měření hormonů
Performance of the Hormone Measurement System
Citlivost metody, přesnost, preciznost a křížová reaktivita s matricí vzorků
Method sensitivity, accuracy, precision and cross-reactivity with sample matrix
Každá laboratoř může k analýze produkce T a E2 buňkami H259R používat systém měření hormonů dle své volby, pokud splňuje kritéria provedení zkoušky, včetně meze kvantifikace (LOQ).
Each laboratory may use a hormone measurement system of its choice for the analysis of the production of T and E2 by H295R cells so long as it meets performance criteria, including the Limit of Quantification (LOQ).
Nominálně to je 100 pg/ml pro T a 10 pg/ml pro E2, které vycházejí z bazálních hladin hormonů pozorovaných ve validačních studiích.
Nominally these are 100 pg/ml for T and 10 pg/ml for E2, which are based on the basal hormone levels observed in the validation studies.
Avšak v závislosti na bazálních hladinách hormonů dosažených v provádějící laboratoři mohou být vhodné vyšší nebo nižší hladiny.
However, greater or lower levels may be appropriate depending upon the basal hormone levels achieved in the performing laboratory.
Před zahájením pokusů s destičkou pro kontrolu kvality a pokusů v rámci zkoušky by laboratoř měla prokázat, že při uplatněné zkoušce hormonů lze změřit koncentrace hormonů v obohaceném médiu s dostatečnou přesností a precizností, aby mohla být při analýze obohaceného média doplněné o interní kontrolu hormonů splněna kritéria kontroly kvality specifikovaná v tabulkách 1 a 5.
Prior to initiation of QC plate and test runs, the laboratory should demonstrate that the hormone assay to be used can measure hormone concentrations in supplemented medium with sufficient accuracy and precision to meet the QC criteria specified in Tables 1 and 5 by analysing supplemented medium spiked with an internal hormone control.
Obohacené médium by mělo být doplněno nejméně o tři koncentrace každého hormonu (např. 100, 500 a 2500 pg/ml hormonu T; 10, 50 a 250 pg/ml hormonu E2; nebo pro nejnižší obohacené koncentrace T a E2 lze použít nejnižší možné koncentrace na základě limitů zjištění vybraného systému měření hormonů) a analyzováno.
Supplemented medium should be spiked with at least three concentrations of each hormone (e.g. 100, 500 and 2500 pg/ml of T; 10, 50 and 250 pg/ml of E2; or the lowest possible concentrations based upon the detection limits of the chosen hormone measurement system can be used for the lowest spike concentrations for T and E2) and analysed.
Naměřené koncentrace hormonů u neextrahovaných vzorků by měly spadat do rozmezí 30 % nominálních koncentrací a rozdíl mezi opakovanými měřeními téhož vzorku by neměl překročit 25 % (viz rovněž tabulka 8, kde jsou uvedena další kritéria kontroly kvality).
Measured hormone concentrations of non-extracted samples should be within 30 % of nominal concentrations, and variation between replicate measurements of the same sample should not exceed 25 % (see also Table 8 for additional QC criteria).
Pokud jsou tato kritéria kontroly kvality splněna, předpokládá se, že vybraná metoda měření hormonů je dostatečně přesná, precizní a nedochází při ní ke křížové reakci se složkami média (matrice vzorků), tak, že by se očekával významný vliv na výsledek zkoušky.
If these QC criteria are fulfilled it is assumed that the selected hormone measurement assay is sufficiently accurate, precise and does not cross-react with components in the medium (sample matrix) such that a significant influence on the outcome of the assay would be expected.
V tomto případě není vyžadována extrakce vzorků před měřením hormonů.
In this case, no extraction of samples prior to measurement of hormones is required.
V případě, že kritéria kontroly kvality v tabulkách 1 a 8 nejsou splněna, může se objevit významný účinek matrice a měl by být proveden pokus s extrahovaným obohaceným médiem.
In the case that the QC criteria in Tables 1 and 8 are not fulfilled, a significant matrix effect may be occurring, and an experiment with extracted spiked medium should be conducted.
Příklad postupu extrakce je popsán v dodatku II validační zprávy (4).
An example of an extraction procedure is described in Appendix II to the validation report (4).
Měření koncentrací hormonů v extrahovaných vzorcích by měla být provedena trojmo.
Measurements of the hormone concentrations in the extracted samples should be made in triplicate.
Pokud lze dokázat, že po extrakci nenarušují složky média metodu zjišťování hormonů podle kritérií kontroly kvality, měly by být všechny další pokusy uskutečněny pomocí extrahovaných vzorků.
If it can be shown that after extraction the components of the medium do not interfere with the hormone detection method as defined by the QC criteria, all further experiments should be conducted using extracted samples.
Pokud kritéria kontroly kvality nelze po extrakci splnit, použitý systém měření hormonů není pro účely zkoušky steroidogeneze H295R vhodný a měla by se použít alternativní metoda zjišťování hormonů.Standardní křivka
If the QC criteria cannot be met after extraction, the utilised hormone measurement system is not suitable for the purpose of the H295R Steroidogenesis Assay, and an alternative hormone detection method should be used.Standard curve
Koncentrace hormonů v kontrolních vzorcích rozpouštědla by měly být v rozmezí lineární části standardní křivky.
The hormone concentrations of the solvent controls (SC) should be within the linear portion of the standard curve.
V ideálním případě by se hodnoty kontrolních vzorků rozpouštědla měly pohybovat kolem středu lineární části, aby bylo zajištěno, že bude možné změřit indukci a inhibici syntézy hormonů.
Preferably, the SC values should fall close to the centre of the linear portion to ensure that induction and inhibition of hormone synthesis can be measured.
Podle toho je třeba vybrat zředění média (nebo extrakty), které budou měřeny.
Dilutions of medium (or extracts) to be measured are to be selected accordingly.
Lineární vztah se stanoví vhodným statistickým přístupem.
The linear relationship is to be determined by a suitable statistical approach.
Zkouška interference chemické látky
Chemical interference test