natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Pokud se k měření hormonů použijí metody založené na protilátkách, jako jsou enzymové imunoanalýzy s enzymem vázaným na imunosorbent (ELISA) a radio-imunoanalýzy (RIA), měla by být každá chemická látka otestována z hlediska potenciální interference se systémem měření hormonů, který bude použit, a to ještě před zahájením vlastního zkoušení chemických látek (dodatek III validační zprávy (4)), protože některé chemické látky mohou s těmito zkouškami interferovat (17).
If antibody-based assays such as Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISAs) and Radio-Immuno Assays (RIAs) are going to be used to measure hormones, each chemical should be tested for potential interference with the hormone measurement system to be utilised prior to initiation of the actual testing of chemicals (Appendix III to the validation report (4)) because some chemicals can interfere with these tests (17).
Dochází-li k interferenci, která je ≥ 20 % bazální produkce hormonů pro T a/nebo E2, jak stanoví analýza hormonů, měl by u všech ředění zásobního roztoku zkoušené chemické látky proběhnout test interference chemické látky s hormony při zkoušce (např. jak je popsáno v dodatku III validační zprávy (4) oddílu 5.0) s cílem určit prahovou dávku, při níž dochází k významné interferenci (≥ 20 %).
If interference occurs that is ≥ 20 % of basal hormone production for T and/or E2 as determined by hormone analysis, the Chemical Hormone Assay Interference Test (such as described in Appendix III to the validation report (4) section 5.0) should be run on all test chemical stock solution dilutions to identify the threshold dose at which significant (≥ 20 % ) interference occurs.
Pokud je interference menší než 30 %, výsledky lze opravit.
If interference is less than 30 %, results may be corrected for the interference.
Pokud interference přesáhne 30 %, údaje jsou neplatné a údaje pro tyto koncentrace by měly být odstraněny.
If interference exceeds 30 %, the data are invalid and the data at these concentrations should be discarded.
Citlivost metody měření
Limit of Quantification (LOQ)
Mez kvantifikace (LOQ)
Hormone Extraction Efficiency (only when extraction is needed)
Účinnost extrakce hormonů (pouze pokud je extrakce nutná)
The average recovery rates (based on triplicate measures) for the spiked amounts of hormone should not deviate more than 30 % from amount that was added.
Průměrné podíly výtěžnosti (na základě tří měření) u standardního přídavku hormonu by se neměly odchylovat od množství, které bylo přidáno, o více než 30 %.
Chemical Interference (only antibody based systems)
Interference chemické látky (pouze systémy na základě protilátek)
No substantial (≥ 30 % of basal hormone production of the respective hormone) cross-reactivity with any of the hormones produced by the cells should occur [19] [20]
Před zkoušením neznámých chemických látek by laboratoř měla provedením testu způsobilosti prokázat, že je schopna dosáhnout náležitých podmínek pro kultivaci buněk a zkušebních podmínek, které jsou požadovány pro úspěšné provedení zkoušky, a udržet je.
As the performance of an assay is directly linked to the laboratory personnel conducting the assay, these procedures should be partly repeated if a change in laboratory personnel occurs.
Jelikož uskutečnění zkoušky je přímo spojeno s pracovníky laboratoře, kteří budou danou zkoušku provádět, měly by být tyto postupy částečně zopakovány, pokud dojde ke změně laboratorního personálu.
This proficiency test will be conducted under the same conditions listed in paragraphs 38 through 40 by exposing cells to 7 increasing concentrations of strong, moderate and weak inducers and inhibitors as well as a negative chemical (see Table 2).
Tento test způsobilosti bude uskutečněn za podmínek uvedených v odstavcích 38 až 40 tak, že buňky budou vystaveny sedmi rostoucím koncentracím silných, mírných a slabých induktorů a inhibitorů, jakož i negativní chemické látce (viz tabulka 2).
Specifically, chemicals to be tested include the strong inducer forskolin (CAS No 66575-29-9);
Pomocí formátu podle tabulky 6 jsou všechny chemické látky umísťovány do oddělených destiček.
the strong inhibitor prochloraz (CAS No 67747-09-5);
U chemických látek pro test způsobilosti by měla být v každém dnu zkoušení zařazena jedna QC-destička (tabulka 4, odstavce 36–37).
the moderate inducer atrazine (CAS No 1912-24-9);
Chemické látky pro test způsobilosti a expoziční koncentrace
the moderate inhibitor aminoglutethimide (CAS No 125-84-8);
Chemická látka pro test způsobilosti
the weak inducer (E2 production) and weak inhibitor (T production) bisphenol A (CAS No 80-05-7);
Expoziční koncentrace [μM]
and the negative chemical human chorionic gonadotropin (HCG) (CAS No 9002-61-3) as shown in Table 2.
Atrazin
Separate plates are run for all chemicals using the format as shown in Table 6.
Aminoglutethimid
One QC plate (Table 4, paragraphs 36-37) should be included with each daily run for the proficiency chemicals.
Bisfenol A
Proficiency chemicals and exposure concentrations
Při testu způsobilosti laboratoře by expozice buněk H295R chemickým látkám měla proběhnout v 24jamkových destičkách.
Proficiency chemical
U všech dávek zkoušených chemických látek se dávky stanovují v μM.
Test Concentrations [μM]
Pro každou chemickou látku se používají oddělené destičky.
Atrazine
V každém dnu zkoušení se zařadí jedna QC-destička.
Aminoglutethimide
Analýzy životaschopnosti buněk a hormonů by měly být provedeny v souladu s odstavci 42 až 46.
Bisphenol A
Měly by být oznámeny prahová hodnota (nejnižší koncentrace testovaného vzorku, při které jsou pozorovány účinky, LOEC) a rozhodnutí o klasifikaci a měly by být porovnány s hodnotami v tabulce 3.
Exposure of H295R to proficiency chemicals should be conducted in 24 well plates during the laboratory proficiency test.
Údaje jsou považovány za přijatelné, pokud splňují LOEC a klasifikaci v tabulce 3.
Dosing is in μM for all test chemical doses.
Prahové hodnoty (LOEC) a klasifikace výsledku pro chemické látky v testu způsobilosti
Doses should be administered in DMSO at 0,1 % v/v per well.
Číslo CAS
All test concentrations should be tested in triplicate wells (Table 6).
Klasifikace výsledku
Separate plates are run for each chemical.
+ [22] (Inhibice)
One QC plate is included with each daily run.
+ (Inhibice)
Cell viability and hormone analyses should be conducted as provided in paragraphs 42 through 46.
+ (Indukce)
The threshold value (lowest observed effect concentration, LOEC) and classification decision should be reported and compared with the values in Table 3.
nepoužije se
The data are considered acceptable if they meet the LOEC and decision classification in Table 3.
Negativní
Threshold values (LOECs) and decision classifications for Proficiency Chemicals
Destička pro kontrolu kvality (Quality Control Plate), QC-destička
n/a:
QC-destička se používá k ověření chování buněk H295R za standardních podmínek kultivace a k vytvoření dosavadní databáze koncentrací hormonů při kontrolách rozpouštědel, pozitivních a negativních kontrolách a při jiných opatřeních kontroly kvality v průběhu času.
not applicable as no changes should occur after exposure to non-cytotoxic concentrations of negative control.
Chování buněk H295R by mělo být posuzováno pomocí QC-destičky pro každou novou dávku ATCC nebo po prvním použití dříve zmrazené zásoby buněk, pokud test způsobilosti laboratoře (odstavce 32–34) proběhl s touto dávkou buněk.
CAS No
QC-destička zajišťuje kompletní posouzení podmínek zkoušky (např. životaschopnost buněk, kontroly rozpouštědel, negativní a pozitivní kontroly, jakož i rozdíly v rámci zkoušky a mezi zkouškami) při zkoušení chemických látek a měla by být součástí každé zkoušky.
Decision Classification
Test kontroly kvality se provádí v 24jamkové destičce a probíhá stejnými postupy inkubace, dávkování, životaschopnosti buněk/cytotoxicity, extrakce hormonů a analýzy hormonů, které jsou popsány v odstavcích 38 až 46 pro zkoušení chemických látek.
+ [22] (Inhibition)
QC-destička obsahuje slepé pokusy, kontroly rozpouštědla a dvě koncentrace známého induktoru (forskolin, 1, 10 μM) a inhibitoru (prochloraz, 0,1, 1 μM) syntézy E2 a T.
+ (Inhibition)
Kromě toho se ve vybraných jamkách používá jako pozitivní kontrola pro zkoušku životaschopnosti/cytotoxicity MeOH.
+ (Induction)
Podrobný popis rozvržení destičky obsahuje tabulka 4.
n/a
Kritéria, která musí QC-destička splňovat, jsou vyjmenována v tabulce 5.
Negative
Minimální bazální produkce hormonu u T a E2 by měla být splněna jak při kontrole rozpouštědla, tak v jamkách pro slepé pokusy.
Quality Control Plate
Tabulka 4
The quality control (QC) plate is used to verify the performance of the H295R cells under standard culture conditions, and to establish a historical database for hormone concentrations in solvent controls, positive and negative controls, as well as other QC measures over time.
Rozvržení QC-destičky pro zkoušení chování buněk H295R nevystavených expozici a buněk vystavených expozici známých inhibitorů (PRO = prochloraz) a stimulantů (FOR = forskolin) produkce E2 a T.
H295R cell performance should be assessed using a QC plate for each new ATCC batch or after using a previously frozen stock of cells for the first time unless the laboratory proficiency test (paragraphs 32-34) has been run with that batch of cells.
Po ukončení pokusu s expozicí a odstranění média bude do všech jamek s MeOH přidán 70 % roztok metanolu, který poslouží jako pozitivní kontrola cytotoxicity (viz zkouška cytotoxicity v dodatku III validační zprávy (4))
A QC plate provides a complete assessment of the assay conditions (e.g. cell viability, solvent controls, negative and positive controls, as well as intra- and inter-assay variability) when testing chemicals and should be part of each test run.
Slepý pokus [23]
The QC test is conducted in a 24-well plate and follows the same incubation, dosing, cell viability/cytotoxicity, hormone extraction and hormone analysis procedures described in paragraphs 38 through 46 for testing chemicals.
Slepý pokus [23](+ MeOH) [24]
The QC plate contains blanks, solvent controls, and two concentrations of a known inducer (forskolin, 1, 10 μM) and inhibitor (prochloraz, 0,1, 1 μM) of E2 and T synthesis.
(+ MeOH) [24]
In addition, MeOH is used in select wells as a positive control for the viability/cytotoxicity assay.
Tabulka 5
A detailed description of the plate layout is provided in Table 4.
Kritéria výsledků pro QC-destičku
The criteria to be met on the QC plate are listed in Table 5.
Bazální produkce hormonu při kontrole rozpouštědla (SC)
The minimum basal hormone production for T and E2 should be met in both the solvent control and blank wells.
≥ 5násobek LOQ
Table 4 Quality control plate layout for testing performance of unexposed H295R cells and cells exposed to known inhibitors (PRO = prochloraz) and stimulators (FOR = forskolin) of E2 and T production.
≥ 2,5násobek LOQ
After termination of the exposure experiment and removal of medium, a 70 % methanol solution will be added to all MeOH wells to serve as a positive control for cytotoxicity (see cytotoxicity assay in Appendix III to the validation report (4))
Indukce (10 μM forskolinu)
Blank [23]
≥ 1,5násobek SC
Blank [23](+ MeOH) [24]
≥ 7,5násobek SC
(+ MeOH) [24]
Inhibice (1μM prochlorazu)
Table 5
≤ 0,5násobek SC
Performance criteria for the Quality Control Plate
POSTUP EXPOZICE CHEMICKÉ LÁTCE
Basal Production of hormone in the solvent control (SC)
Preinkubované buňky se vyjmou z inkubátoru (odstavec 21) a zkontrolují pod mikroskopem, aby před dávkováním bylo jisté, že jsou v dobrém stavu (přichycení, morfologie).
≥ 5 times the LOQ
Buňky jsou umístěny do biologické bezpečnostní skříně (laminární box) a obohacené médium je odstraněno a nahrazeno novým obohaceným médiem (1 ml/jamku).
≥ 2,5 times the LOQ
Pro tuto zkušební metodu se jako rozpouštědlo upřednostňuje DMSO.
Induction (10 μM forskolin)
Pokud je však důvod pro použití jiných rozpouštědel, mělo by být popsáno vědecké zdůvodnění.
≥ 1,5 times the SC
Buňky jsou vystaveny zkoušené chemické látce přidáním 1 μl vhodného zásobního roztoku v DMSO (viz dodatek II validační zprávy (4)) na 1 ml obohaceného média (objem jamky).
≥ 7,5 times the SC
Výsledkem toho je konečná koncentrace 0,1 % DMSO v jamkách.
Inhibition (1μM prochloraz)
Pro zajištění odpovídající směsi se obecně upřednostňuje, aby byl vhodný zásobní roztok zkoušené chemické látky v DMSO smíchán s obohaceným médiem, aby se dosáhlo požadované konečné koncentrace pro každou dávku a aby směs byla přidána do každé jamky bezprostředně po odstranění starého média.
≤ 0,5 times the SC
Je-li použita tato možnost, měla by koncentrace DMSO (0,1 %) zůstat ve všech jamkách stejná.
CHEMICAL EXPOSURE PROCEDURE
U jamek obsahujících dvě největší koncentrace se vizuálně pomocí stereomikroskopu posoudí, zda se vytvořily sraženiny nebo zákal, což je známka neúplné rozpustnosti zkoušené chemické látky.
The pre-incubated cells are removed from the incubator (paragraph 21) and checked under a microscope to assure that they are in good condition (attachment, morphology) prior to dosing.
Pokud jsou takové podmínky (zákal, tvorba sraženin) pozorovány, jsou přezkoumány i jamky obsahující další nižší koncentrace (a tak dále) a koncentrace, kde se látka zcela nerozpustila, musí být vyloučeny pro účely dalšího hodnocení a analýzy.
The cells are placed in a bio-safety cabinet and the supplemented medium removed and replaced with new supplemented medium (1 ml/well).
Destička se na 48 hodin vrátí do inkubátoru při teplotě 37 oC ve vzduchové atmosféře s 5 % CO2.
DMSO is the preferred solvent for this test method.
Rozvržení destičky se zkoušenou chemickou látkou je uvedeno v tabulce 6.
However, if there are reasons for using other solvents the scientific rationale should be described.
Zásoby 1–7 ukazují umístění rostoucích dávek zkoušené chemické látky.
Cells are exposed to the test chemical by adding 1 μl of the appropriate stock solution in DMSO (see Appendix II to the validation report (4)) per 1 ml supplemented medium (well volume).
Tabulka 6
This results in a final concentration of 0,1 % DMSO in the wells.
Schéma dávkování pro expozici buněk H295R zkoušeným chemickým látkám v 24 jamkové destičce
To assure adequate mixing it is generally preferred that the appropriate stock solution of the test chemical in DMSO is mixed with supplemented medium to yield the desired final concentration for each dose, and the mixture added to each well immediately after removal of old medium.
Zásoba 4
If this option is used, the concentration of DMSO (0,1 %) should remain consistent among all wells.
Zásoba 1
The wells containing the greatest two concentrations are visually assessed for formation of precipitates or cloudiness as an indication of incomplete solubility of the test chemical by using a stereo microscope.
Zásoba 1
If such conditions (cloudiness, formation precipitates) are observed, wells containing the next lesser concentrations are examined as well (and so forth) and concentrations that did not completely go into solution are to be excluded from further evaluation and analysis.
Zásoba 5
The plate is returned to the incubator at 37 °C under a 5 % CO2 in air atmosphere for 48 hours.
Zásoba 2
The test chemical plate layout is shown in Table 6.
Zásoba 6
Stocks 1 -7 show placement of increasing doses of test chemical.
Zásoba 3
Table 6
Zásoba 7
Dosing schematic for the exposure of H295R cells to test chemicals in a 24 well plate
Po 48 hodinách jsou expoziční destičky vyňaty z inkubátoru a každá jamka se zkontroluje pod mikroskopem ohledně stavu buněk (přichycení, morfologie, stupeň konfluence) a známek cytotoxicity.
Stock 4
Médium z každé jamky je rozděleno na dvě stejná množství (každé přibližně 490 μl) a přeneseno do dvou samostatných, řádně označených ampulek (tj. jeden díl poskytuje pro každou jamku náhradní vzorek).
Stock 1
Aby se předešlo vyschnutí buněk, odstraňuje se médium po řadách nebo sloupcích najednou a nahrazuje se médiem pro zkoušku životaschopnosti/cytotoxicity buněk.
Stock1
Pokud je nutné životaschopnost/cytotoxicitu buněk změřit okamžitě, je do každé jamky přidáno 200 μl PBS s Ca2+ a Mg2+.
Stock 5
Média se zmrazí při teplotě – 80 °C až do dalšího zpracování pro analýzu koncentrací hormonů (viz odstavce 44–46).
Stock 2
I když hormony T a E2 uchovávané v médiu při teplotě – 80 °C jsou obecně stálé po dobu nejméně tří měsíců, měla by být v každé laboratoři zdokumentována stálost hormonů během uskladnění.
Stock 6
Okamžitě po odstranění média se pro každou expoziční destičku určí životaschopnost buněk/cytotoxicita.
Stock 3
Určení životaschopnosti buněk
Stock 7
Pro určení potenciálního vlivu zkoušené chemické látky na životaschopnost buněk není metoda testování životaschopnosti buněk/cytotoxicity předepsána, je možno ji zvolit.
After 48 hours the exposure plates are removed from the incubator and every well is checked under the microscope for cell condition (attachment, morphology, degree of confluence) and signs of cytotoxicity.
Zkouška by měla být schopna měřit skutečnou výši procentního podílu životaschopných buněk přítomných v jamce nebo by mělo být prokázáno, že ji lze přímo srovnat se zkouškou Live/Dead® (její lineární funkcí) (viz dodatek III validační zprávy (4)).
The medium from each well is split into two equal amounts (approximately 490 μl each) and transferred to two separate vials appropriately labelled (i.e. one aliquot to provide a spare sample for each well).
Alternativní zkouškou, u které se ukázalo, že funguje stejně dobře, je test MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid] (18).
To prevent cells from drying out, medium is removed a row or column at a time and replaced with the medium for the cell viability/cytotoxicity assay.
Posouzení životaschopnosti buněk využívající výše uvedené metody je relativní měření, které nemusí nutně být lineární závislé na absolutním počtu buněk v jamce.
If cell viability/cytotoxicity is not to be measured immediately, 200 μl PBS with Ca2+ and Mg2+ is added to each well.
Proto by analyzující pracovník měl provést subjektivní paralelní vizuální posouzení každé jamky a je zapotřebí udělat digitální snímky kontrol rozpouštědel a dvou největších necytotoxických koncentrací, které se archivují, aby bylo možno později posoudit skutečnou hustotu buněk, bude-li to zapotřebí.
The media are frozen at – 80 °C until further processing to analyse hormone concentrations (see paragraphs 44-46).
Pokud se na základě vizuální prohlídky nebo podle důkazů ze zkoušky životaschopnosti/cytotoxicity zdá, že počet buněk narostl, je nutné zdánlivý nárůst ověřit.
While T and E2 in medium kept at – 80 °C are generally stable for at least 3 months, hormone stability during storage should be documented within each laboratory.
Je-li nárůst počtu buněk ověřen, mělo by to být uvedeno v závěrečné zprávě.
Immediately after removing the medium, cell viability/cytotoxicity is determined for each exposure plate.
Životaschopnost buněk bude vyjádřena v poměru k průměrné reakci při kontrolách s rozpouštědly, která je považována za 100 % životaschopných buněk, výpočet se provádí podle pravidel metody použité k určení cytototoxicity.
Cell Viability Determination
Pro zkoušku MTT lze použít následující vzorec:
A cell viability/cytotoxicity assay of choice can be used to determine the potential impact of the test chemical on cell viability.
% životaschopných buněk = (reakce v jamce – průměrná reakce v jamkách s aplikovaným MeOH [= 100 % odumřelých]) ÷ (průměrná reakce v jamkách SC – průměrná reakce v jamkách s aplikovaným MeOH [= 100 % odumřelých])
The assay should be able to provide a true measure of the percentage of viable cells present in a well, or it should be demonstrated that it is directly comparable to (a linear function of) the Live/Dead® Assay (see Appendix III to the validation report (4)).
Do závěrečné analýzy údajů by neměly být zařazeny jamky s životaschopností nižší než 80 %, v poměru k průměrné životaschopnosti při kontrolách s rozpouštědly (= 100 % životaschopnost).
An alternative assay that has been shown to work equally well is the MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] test (18).
Inhibice steroidogeneze, vyskytující se při cytotoxicitě kolem 20 %, by měla být pečlivě posouzena, aby bylo zajištěno, že příčinou inhibice není právě cytotoxicita.
The assessment of cell viability using the above methods is a relative measurement that does not necessarily exhibit linear relationships with the absolute number of cells in a well.
Analýza hormonů
Therefore, a subjective parallel visual assessment of each well by the analyst should be conducted, and digital pictures of the SCs and the two greatest non-cytotoxic concentrations are to be taken and archived to enable later assessment of true cell density if this should be required.
Každá laboratoř může pro analýzu T a E2 použít systém měření hormonů podle své volby.
If by visual inspection or as demonstrated by the viability/cytotoxicity assay there appears to be an increase in cell number, the apparent increase needs to be verified.
Zbylé podíly média z každé experimentální skupiny lze použít pro přípravu dalších ředění tak, aby byly k dispozici koncentrace pro lineární část standardní křivky.
If an increase in cell numbers is verified, this should be stated in the test report.
Jak je uvedeno v odstavci 29, každá laboratoř by měla prokázat soulad svého systému měření hormonů (např. ELISA, RIA, LC-MS, LC-MS/MS) s kritérii pro kontrolu kvality tak, že provede analýzu obohaceného média doplněnou o vnitřní kontrolu hormonů před provedením pokusů pro kontrolu kvality nebo zkoušením chemických látek.
Cell viability will be expressed relative to the average response in the SCs, which is considered 100 % viable cells, and is calculated as appropriate for the cell viability/cytotoxicity assay that is used.
Aby bylo zajištěno, že součásti systému zkoušení nebudou rušivě zasahovat do měření hormonů, bude možná zapotřebí hormony před jejich měřením z média extrahovat (viz odstavec 30 s podmínkami, za kterých je nebo není extrakce požadována).
For the MTT assay, the following formula may be used:
Doporučuje se provést extrakci v souladu s postupy uvedenými v dodatku III validační zprávy (4).
% viable cells = (response in well – average response in MeOH treated [= 100 % dead] wells) ÷ (average response in SC wells – average response in MeOH treated [= 100 % dead] wells)
Pokud se k měření produkce hormonů používá komerční zkušební sada (kit), měla by být provedena analýza hormonů v souladu s manuály, které dodal výrobce zkušební sady.
Wells with viability lower than 80 %, relative to the average viability in the SCs (= 100 % viability), should not be included in the final data analysis.
Většina výrobců má jedinečný postup, kterým se mají analýzy hormonů provádět.
Inhibition of steroidogenesis occurring in the presence of almost 20 % cytotoxicity should be carefully evaluated to ensure that cytotoxicity is not the cause for the inhibition.
Roztoky vzorků je třeba upravit, aby očekávané koncentrace hormonů pro kontroly roztoků spadaly do středu lineárního rozmezí standardní křivky konkrétní zkušební sady (dodatek III validační zprávy (4)).
Hormone Analysis
Hodnoty, které leží mimo lineární část standardní křivky, by měly být zamítnuty.
Each laboratory can use a hormone measurement system of its choice for the analysis of T and E2.
Konečné koncentrace hormonů se vypočítají takto:
Spare aliquots of medium from each treatment group may be used to prepare dilutions to bring the concentration within the linear part of the standard curve.
Příklad:
As noted in paragraph 29, each laboratory should demonstrate the conformance of their hormone measurement system (e.g. ELISA, RIA, LC-MS, LC-MS/MS) with the QC criteria by analysing supplemented medium spiked with an internal hormone control prior to conducting QC runs or testing of chemicals.
Extrahováno:
In order to ensure that the components of the test system do not interfere with measurement of hormones, the hormones may need to be extracted from the media prior to their measurement (see paragraph 30 for the conditions under which an extraction is or is not required).
450 μl média
It is recommended to conduct extraction following the procedures in Appendix III to the validation report (4).