natgillin/translations-raw huggingface dataset:
m hmotnost navážky vzorku v g (korigovaná na původní hmotnost, pokud je vzorek vysušen nebo odtučněn)
m sample weight (g) (corrected to original weight if dried or defatted)
V celkový objem hydrolyzátu (5.3.4) v ml nebo celkový objem zředěného extraktu (6.1)
V ml total hydrolysate (5.3.4) or ml calculated total dilution volume of extract (6.1)
Cystin a cystein se v hydrolyzátech oxidovaného vzorku stanovují jako kyselina cysteová, ale vypočítávají se jako cystin (C6H12N2O4S2, MV 240,30 g/mol) s použitím MV 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).
Cystine and cysteine are both determined as cysteic acid in hydrolysates of oxidised sample, but calculated as cystine (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) by using M 120,15 g/mol (= 0,5 x 240,30 g/mol).
Methionin se v hydrolyzátech oxidovaného vzorku stanovuje jako methioninsulfon, ale vypočítává se jako methionin s použitím MV methioninu: 149,21 g/mol.
Methionine is determined as methionine sulphone in hydrolysates of oxidised sample, but calculated as methionine by using M of methionine: 149,21 g/mol.
Přidaný volný methionin se stanovuje po extrakci jako methionin, pro výpočet se použije stejná MV.
Added free methionine is determined after extraction as methionine, for the calculation the same M is used.
Celkový objem zředěného extraktu (F) při stanovení volných aminokyselin (5.2) se vypočítá podle následujícího vzorce:
The total dilution volume of extracts (F) for determination of free amino acids (5.2) is calculated as follows:
V objem výsledného extraktu.
V Volume of final extract
Ověření metody
Evaluation of the method
Tato metoda byla vyzkoušena porovnáním na mezinárodní úrovni v roce 1990 při použití čtyř různých krmiv (krmná směs pro prasata, kombinované krmivo pro brojlery, proteinový koncentrát, premix).
The method has been tested in an intercomparison made at international level in 1990 using four different feed (mixed pig feed, broiler compound, protein concentrate, premixture).
Po vyloučení odlehlých hodnot jsou výsledky středních a standardních odchylek uvedeny v následujících tabulkách:
The results, after elimination of outliers, of mean and standard deviation are given in the tables in this point:
Střední hodnoty v g/kg
Means in g/kg
n počet zúčastněných laboratoří.
n Number of participating laboratories.
Referenční materiál
Reference material
Aminokyselina
Amino Acid
Cyst(e)in
Cyst(e)ine
Krmná směs pro prasata
Mixed Pig Feed
Kombinované krmivo pro brojlery
Broiler Compound
Proteinový koncentrát
Protein Concentrate
Premix
Premixture
Opakovatelnost vyjádřená jako „vnitrolaboratorní standardní odchylka“ je uvedena v následujících tabulkách:
The repeatability expressed as ‘within laboratory standard deviation’ of the abovementioned intercomparison is given in the tables below:
Vnitrolaboratorní standardní odchylka (Sr) v g/kg
Within Laboratory Standard Deviation (Sr) in g/kg
Variační koeficient (%) vnitrolaboratorní standardní odchylky (Sr)
Coefficient of Variation (%) for Within Laboratory Standard Deviation (Sr)
Výsledky pro mezilaboratorní standardní odchylku vyplývající z výše uvedeného srovnání jsou uvedeny v následující tabulce:
The results for between laboratory standard deviation by the abovementioned intercomparison are given in the table below:
Mezilaboratorní standardní odchylka (SR) v g/kg
Between Laboratory Standard Deviation (SR) in g/kg
Variační koeficient (%) mezilaboratorní standardní odchylky (SR)
Coefficient of Variation (%) for Between Laboratory Standard Deviation (SR)
Použití referenčních materiálů
Use of reference materials
Správné použití uvedené metody se ověřuje opakovaným měřením certifikovaných referenčních materiálů, jsou-li k dispozici.
The correct application of the method shall be verified by making replicate measurements of certified reference materials when available.
Doporučuje se kalibrace certifikovanými kalibračními roztoky aminokyselin.
Calibration with certified amino acid calibration solution is recommended.
Vzhledem k rozdílům mezi analyzátory aminokyselin se výsledné koncentrace kalibračních roztoků standardů aminokyselin (viz 3.27.4 a 3.27.5) a hydrolyzátu (viz 5.3.4) považují za určující.
Because of differences between amino acid analysers the final concentrations of the calibration solutions of standard amino acids (see 3.27.4 and 3.27.5) and of the hydrolysate (see 5.3.4) shall be taken as a guideline.
Lineární rozsah přístroje je nutno zkontrolovat pro všechny aminokyseliny.
The range of linear response of the apparatus has to be checked for all amino acids.
Standardní roztok se ředí citrátovým tlumivým roztokem tak, aby se dosáhlo ploch píků uprostřed tohoto rozsahu.
The standard solution is diluted with citrate buffer to give peak areas in the middle of the range.
Pokud je k analýze hydrolyzátů použito zařízení pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii, musí být podmínky zkoušek optimalizovány v souladu s doporučením výrobce.
Where high performance liquid chromatographic equipment is used to analyse the hydrolysates, the experimental conditions must be optimised in accordance with the manufacturer's recommendations.
Při použití této metody u krmiv obsahujících více než 1 % chloridu (koncentráty, minerální krmiva, doplňková krmiva) může dojít k podhodnocení obsahu methioninu, a musí se proto použít speciální postup.
By applying the method to feed containing more than 1 % chloride (concentrate, mineral feeds, supplementary feeds) underestimation of methionine could occur and special treatment has to be done.
STANOVENÍ OBSAHU TRYPTOFANU
DETERMINATION OF TRYPTOPHAN
Tato metoda umožňuje stanovení obsahu celkového a volného tryptofanu v krmivech.
The method makes the determination possible of the total and free tryptophan in feed.
Nerozlišuje mezi D- a L- formou.
It does not distinguish between D- and L- forms.
Pro stanovení celkového tryptofanu se vzorek hydrolyzuje za alkalických podmínek nasyceným roztokem hydroxidu barnatého při 110 oC po dobu 20 hodin.
For the determination of the total tryptophan, the sample is hydrolysed under alkaline conditions with saturated barium hydroxide solution and heated to 110 oC for 20 hours.
Po hydrolýze se přidává vnitřní standard.
After hydrolysis internal standard is added.
Pro stanovení volného tryptofanu se vzorek extrahuje za mírně kyselých podmínek v přítomnosti vnitřního standardu.
For the determination of free tryptophan, the sample is extracted under mild acidic conditions in the presence of internal standard.
Tryptofan a vnitřní standard se stanoví v hydrolyzátu nebo extraktu metodou HPLC s fluorescenční detekcí.
The tryptophan and the internal standard in the hydrolysate or in the extract are determined by HPLC with fluorescence detection.
Dvakrát destilovaná voda nebo voda stejné kvality (vodivost < 10 μS/cm).
Double distilled water or water of equivalent quality must be used (conductivity < 10 μS/cm).
Standardní látka: tryptofan (čistota/obsah ≥ 99 %), vakuově vysušený nad oxidem fosforečným.
Standard substance: tryptophan (purity/content ≥ 99 %) dried under vacuum over phosphorous pentoxide.
Vnitřní standard: α-methyl-tryptofan (čistota/obsah ≥ 99 %), vakuově vysušený nad oxidem fosforečným.
Internal standard substance: α-methyl-tryptophan (purity/content ≥ 99 %), dried under vacuum over phosphorous pentoxide.
Hydroxid barnatý, oktahydrát (Ba(OH)2 . 8 H2O), nesmí být nadměrně vystavován vzduchu, aby nedocházelo ke vzniku BaCO3, který by mohl narušovat stanovení (viz poznámka 9.3).
Barium hydroxide octa-hydrate (care shall be taken not to expose the Ba(OH)2 .8 H2O excessively to air in order to avoid formation of BaCO3, which could disturb the determination) (see observation 9.3).
Kyselina fosforečná, w (w/w) = 85 %.
Ortho-phosphoric acid, w (w/w) = 85 %.
Kyselina chlorovodíková, ρ201,19 g/ml.
Hydrochloric acid, ρ201,19 g/ml.
Methanol, pro HPLC.
Methanol, equivalent to HPLC grade.
40,0 g NaOH (3.5) se rozpustí ve vodě a vodou (3.1) se doplní na 1 litr.
Dissolve 40,0 g NaOH (3.5) in water and make up to 1 litre with water (3.1).
Kyselina chlorovodíková, c = 6 mol/l:
Hydrochloric acid, c = 6 mol/l:
492 ml HCl (3.7) se doplní vodou na 1 litr.
Take 492 ml HCl (3.7) and make up to 1 litre with water.
Kyselina chlorovodíková, c = 1 mol/l:
Hydrochloric acid, c = 1 mol/l:
82 ml HCl (3.7) se doplní vodou na 1 litr.
Take 82 ml HCl (3.7) and make up to 1 litre with water.
Kyselina chlorovodíková, c = 0,1 mol/l:
Hydrochloric acid, c = 0,1 mol/l:
8,2 ml HCl (3.7) se doplní vodou na 1 litr.
Take 8,2 ml HCl (3.7) and make up to 1 litre with water.
Kyselina fosforečná, c = 0,5 mol/l:
Ortho-phosphoric acid, c = 0,5 mol/l:
34 ml kyseliny fosforečné (3.6) se doplní vodou (3.1) na 1 litr.
Take 34 ml ortho-phosphoric acid (3.6) and make up to 1 litre with water (3.1).
Koncentrovaný roztok tryptofanu (3.2), c = 2,50 μmol/ml:
Concentrated solution of tryptophan (3.2), c = 2,50 μmol/ml:
v 500 ml odměrné baňce se rozpustí 0,2553 g tryptofanu (3.2) v kyselině chlorovodíkové (3.13) a doplní se jí po značku.
In a 500 ml volumetric flask dissolve 0,2553 g tryptophan (3.2) in hydrochloric acid (3.13) and make up to the mark with hydrochloric acid (3.13).
Skladuje se při –18 oC nejdéle 4 týdny.
Store at - 18 oC for a maximum of 4 weeks.
Koncentrovaný vnitřní standardní roztok, c = 2,50 μmol/ml:
Concentrated internal standard solution, c = 2,50 μmol/ml:
v 500 ml odměrné baňce se rozpustí 0,2728 g α-methyl-tryptofanu (3.3) v kyselině chlorovodíkové (3.13) a doplní se jí po značku.
In a 500 ml volumetric flask dissolve 0,2728 g α-methyl-tryptophan (3.3) in hydrochloric acid (3.13) and make up to the mark with hydrochloric acid (3.13).
Kalibrační standardní roztok tryptofanu a vnitřního standardu:
Calibration standard solution of tryptophan and internal standard:
Tento roztok se musí připravovat čerstvý před použitím.
This solution must be prepared freshly before use.
Během přípravy musí být roztok chráněn před slunečním světlem.
Protect from direct sunlight during preparation.
Kyselina octová.
Acetic acid
1,1,1-trichloro-2-methyl-2-propanol.
1,1,1-trichloro-2-methyl-2-propanol.
Ethanolamin w (w/w) > 98 %.
Ethanolamine w (w/w) > 98 %.
Roztok 1 g 1,1,1-trichloro-2-methyl-2-propanolu (3.19) ve 100 ml methanolu (3.8).
Solution of 1 g 1,1,1-trichloro-2-methyl-2-propanol (3.19) in 100 ml methanol (3.8).
Doplní se vodou (3.1) na 1000 ml.
Make up to 1000 ml with water (3.1).
HPLC vybavení s fluorometrickým detektorem.
HPLC equipment with a spectrofluorometric detector.
Kolona pro kapalinovou chromatografii, 125 mm × 4 mm, C18, náplň 3 μm, nebo obdobná.
Liquid chromatographic column, 125 mm x 4 mm, C18, 3 μm packing, or equivalent.
pH metr.
pH-meter.
Nádoba polypropylenová s širokým hrdlem a šroubovacím uzávěrem o objemu 125 ml.
Polypropylene flask, capacity 125 ml, with wide neck and screw cap.
Membránový filtr, 0,45 μm.
Membrane filter, 0,45 μm.
Autokláv, 110 (±2) oC, 1,4 (±0,1) bar.
Autoclave, 110 (± 2) oC, 1,4 (±0,1) bar.
Ponorný mixér.
Vortex mixer.
Vzorky s vysokým obsahem tuku se před mletím extrahují petroletherem (3.9).
Samples with high fat content shall be extracted with light petroleum (3.9) prior to grinding.
Stanovení volného tryptofanu (extrakt)
Determination of free tryptophan (extract)
Vhodné množství (1–5 g) upraveného vzorku (5.1) se naváží s přesností na 1 mg do kónické baňky.
Weigh to the nearest 1 mg an appropriate amount (1-5 g) of the prepared sample (5.1), into a conical flask.
Přidá se 100,0 ml roztoku kyseliny chlorovodíkové (3.13) a 5,00 ml koncentrovaného roztoku vnitřního standardu (3.16).
Add 100,0 ml hydrochloric acid, (3.13) and 5,00 ml concentrated internal standard solution (3.16).
Směs se třepe nebo míchá 60 minut na mechanické třepačce nebo magnetickém míchacím zařízení (4.7).
Shake or mix for 60 min. using a mechanical shaker or a magnetic stirrer (4.7).
Sediment se nechá usadit a odpipetuje se 10,0 ml supernatantu do kádinky.
Allow the sediment to settle and pipette 10,0 ml of the supernatant solution into a beaker.
Přidá se tolik methanolu (3.8), aby jeho konečná koncentrace v roztoku byla 10–30 %.
Add sufficient methanol (3.8) to give a concentration of between 10 % and 30 % of methanol in the final volume.
Roztok se převede do odměrné baňky vhodného objemu a zředí se vodou na objem potřebný pro chromatografické stanovení (přibližně stejný objem, jako mají kalibrační standardní roztoky (3.17)).
Transfer to a volumetric flask of appropriate volume and dilute with water to a volume necessary for the chromatography (approx. the same volume as the calibration standard solution (3.17)).
Před nástřikem na kolonu HPLC se přefiltruje několik ml roztoku přes 0,45 μm membránový filtr (4.5).
Filter a few ml of the solution through a 0,45 μm membrane filter (4.5) before injection on the HPLC column.
Standardní roztok a extrakty je nutno chránit před přímým slunečním světlem.
Protect standard solution and extracts against direct sunlight.
Pokud není možné provést zkoušku tentýž den, extrakty lze skladovat při 5 oC nejvýše tři dny.
If it is not possible to analyse the extracts the same day, the extracts may be stored at 5 oC for a maximum of 3 days.
Stanovení celkového tryptofanu (hydrolyzát)
Determination of total tryptophan (hydrolysate)
Do polypropylenové nádoby (4.4) se naváží 0,1–1 g upraveného vzorku (5.1) s přesností na 0,2 mg.
Weigh to the nearest 0,2 mg from 0,1 to 1 g of the prepared sample (5.1) into the polypropylene flask (4.4).
Obsah dusíku v navážce vzorku je asi 10 mg.
The weighed sample portion shall have a nitrogen content of about 10 mg.
Přidá se 8,4 g oktahydrátu hydroxidu barnatého (3.4) a 10 ml vody.
Add 8,4 g barium hydroxide octa-hydrate (3.4) and 10 ml water.
Promíchá se ponorným mixerem (4.8) nebo na magnetickém míchacím zařízení (4.7).
Mix on a vortex mixer (4.8) or magnetic stirrer (4.7).
Magnet s teflonovým povrchem se ponechá ve směsi.
Leave the teflon coated magnet in the mixture.
Stěny nádoby se opláchnou 4 ml vody.
Wash down the walls of the vessel with 4 ml water.
Nádoba se uzavře a víčko se volně dotáhne.
Put on the screw cap and close the flask loosely.
Před otevřením autoklávu se sníží teplota pod 100 oC.
Before opening the autoclave reduce the temperature to just under 100 oC.
Aby se zabránilo krystalizaci Ba(OH)2 . 8 H2O, přidá se k horké směsi 30 ml vody o laboratorní teplotě.
In order to avoid crystallisation of Ba(OH)2 · 8 H2O, add to the warm mixture 30 ml water which is at room temperature.
Mírně se zamíchá nebo protřepe.
Shake or stir gently.
Přidají se 2,00 ml roztoku koncentrovaného vnitřního standardu α-methyl-tryptofanu (3.16).
Add 2,00 ml concentrated internal standard (α-methyl-tryptophan) solution (3.16).
Nádoba se vychladí 15 minut ve vodní lázni s ledem.
Cool the vessels on water/ice bath for 15 minutes.
Dále se přidá 5 ml roztoku kyseliny fosforečné (3.14).
Then, add 5 ml ortho-phosphoric acid (3.14).
Nádoba se ponechá v ledové lázni a za stálého míchání se neutralizuje roztokem kyseliny chlorovodíkové (3.11) a potom se pH upraví roztokem kyseliny chlorovodíkové (3.12) na hodnotu 3,0.
Keep the vessel in the cooling bath and neutralise with HCl (3.11) whilst stirring and adjust the pH to 3,0 using HCl (3.12).
Přidá se tolik methanolu, aby jeho výsledná koncentrace v konečném objemu byla 10–30 %.
Add sufficient methanol to give a concentration of between 10 % and 30 % of methanol in the final volume.
Roztok se převede do odměrné baňky vhodného objemu a zředí se vodou na stanovený objem, který je nutný pro chromatografické stanovení (např. 100 ml).
Transfer to a volumetric flask of appropriate volume and dilute with water to the defined volume necessary for the chromatography (for example 100 ml).
Přídavek methanolu nesmí způsobit tvorbu sraženiny.
The addition of methanol shall not cause precipitation.
Standardní roztok a hydrolyzáty je nutno chránit před přímým slunečním světlem.
Protect standard solution and hydrolysates against direct sunlight.
Pokud není možné provést zkoušku tentýž den, hydrolyzáty lze skladovat při 5 oC nejvýše tři dny.
If it is not possible to analyse the hydrolysates the same day, they may be stored at 5 oC for a maximum of 3 days.
Stanovení HPLC
HPLC determination
Následující podmínky izokratické eluce jsou pouze doporučené; mohou být použity jiné podmínky za předpokladu, že poskytují rovnocenné výsledky (viz poznámky 9.1 a 9.2):
The following conditions for isocratic elution are offered for guidance; other conditions may be used, provided they yield equivalent results (see also observations 9.1 and 9.2):
Kolona pro kapalinovou chromatografii (4.2):
Liquid chromatographic column (4.2):
125 mm × 4 mm, C18, náplň 3 μm, nebo obdobná
125 mm x 4 mm, C18, 3 μm packing or equivalent
Teplota kolony:
Column temperature:
laboratorní teplota
Room temperature
Mobilní fáze (3.22):
Mobile phase (3.22):
Objem se doplní na 1000 ml vodou (3.1).
Make up to 1000 ml with water (3.1)
Průtok:
Flow rate:
1 ml/min
1 ml/min.
Celková doba zkoušky:
Total run time:
asi 34 minut
approx. 34 min.
Detekční vlnová délka:
Detection wavelength:
excitace: 280 nm, emise: 356 nm
excitation: 280 nm, emission: 356 nm.
Objem nástřiku:
Injection volume
Obsah tryptofanu (X) v g na 100 g vzorku se vypočte podle následujícího vzorce:
The amount of tryptophane (X), in g per 100g sample, is calculated as follows:
A plocha píku vnitřního standardu v kalibračním standardním roztoku (3.17)
A peak area of internal standard, calibration standard solution (3.17)
B plocha píku tryptofanu v extraktu (5.2) nebo hydrolyzátu (5.3)
B peak area of tryptophan, extract (5.2) or hydrolysate (5.3)
objem koncentrovaného roztoku tryptofanu (3.15) přidaného do kalibračního roztoku (3.17) v ml (2 ml)
volume in ml (2 ml) of concentrated tryptophan solution (3.15) added to the calibration solution (3.17)
c koncentrace tryptofanu v koncentrovaném roztoku tryptofanu (3.15) přidaném do kalibračního roztoku (3.17) v μmol/ml (= 2,50)
c concentration in μmol/ml (= 2,50) of concentrated tryptophan solution (3.15) added to calibration solution (3.17)
objem koncentrovaného roztoku vnitřního standardu (3.16) přidaný při extrakci (5.2) (= 5,00 ml) nebo do hydrolyzátu (5.3) v ml (= 2,00 ml)
volume in ml of concentrated internal standard solution (3.16) added at the extraction (5.2) (= 5,00 ml) or to the hydrolysate (5.3) (= 2,00 ml)
C plocha píku vnitřního standardu v extraktu (5.2) nebo hydrolyzátu (5.3)
C peak area of internal standard, extract (5.2) or hydrolysate (5.3)
D plocha píku tryptofanu v kalibračním standardním roztoku (3.17)
D peak area of tryptophan, calibration standard solution (3.17)
objem koncentrovaného roztoku vnitřního standardu (3.16) přidaného do kalibračního standardního roztoku (3.17) v ml (= 2,00 ml)
volume in ml (= 2,00 ml) of concentrated internal standard solution (3.16) added to calibration standard solution (3.17)
m hmotnost navážky vzorku v g (korigovaná na původní hmotnost, pokud byl vzorek vysušen a/nebo odtučněn)
m sample weight in g (corrected to original weight if dried and/or defatted)
M molekulární hmotnost tryptofanu (= 204,23 g/mol).
M molar weight of tryptophan (= 204,23 g/mol)
Rozdíl mezi výsledky dvou paralelních stanovení provedených na stejném vzorku nesmí překročit 10 % relat. z hodnoty nejvyššího výsledku.
The difference between the results of two parallel determinations carried out on the same sample must not exceed 10 % relative to the highest result.
Výsledky kruhových testů
Results of a collaborative study
ES uspořádala kruhové testy (4. porovnání) pro tři vzorky, které byly zkoušeny ve 12 laboratořích, aby byl ověřen postup stanovení celkového tryptofanu (hydrolýza). Každý vzorek byl zkoušen pětkrát.
An EC collaborative study (4th intercomparison) was arranged in which three samples were analysed by up to 12 laboratories to certify the method for hydrolysis.
Výsledky jsou uvedeny níže.
Replicate (5) analyses were performed on each sample.
Výsledky jsou shrnuty v níže uvedené tabulce.
The results are given in the following table:
Krmivo pro prasata
Pig feed
Krmivo pro prasata s přidaným L-tryptofanem
Pig feed supplemented with L-tryptophan
Vzorek 3
Sample 3
Koncentrát pro prasata
Feed concentrate for pigs
Průměr (g/kg)
Mean [g/kg]
CVr (%)
CVr [%]
CVR (%)
CVR [%]
L počet laboratoří, které poskytly výsledky
L number of laboratories submitting results
n počet jednotlivých výsledků po vyloučení odlehlých hodnot (určených Cochranovým a Dixonovým testem)
n number of single results retained eliminating outliers (identified by Cochran, Dixon outlier test)
standardní odchylka opakovatelnosti
standard deviation of repeatability
standardní odchylka reprodukovatelnosti
standard deviation of reproducibility
r opakovatelnost
r repeatability
R reprodukovatelnost
R reproducibility
variační koeficient opakovatelnosti v %
coefficient of variation of repeatability, %
variační koeficient reprodukovatelnosti v %.
coefficient of variation of reproducibility, %
Další kruhový test ES (3. porovnání) byl proveden na dvou vzorcích ve 13 laboratořích pro ověření postupu extrakce volného tryptofanu. Každý vzorek byl zkoušen pětkrát.
Another EC collaborative study (3rd intercomparison) was arranged in which two samples were analysed by up to 13 laboratories to certify the method for extraction of free tryptophan.
Vzorek 4
Sample 4
Směs pšenice a sóji
Wheat and soya mixture
Vzorek 5
Sample 5
Směs pšenice a sóji (= vzorek 4) s přidaným tryptofanem (0,457 g/kg)
Wheat and soya mixture (= sample 4) with added tryptophan (0,457g/kg1)
n počet jednotlivých výsledků po vyloučení odlehlých hodnot (určených Cochranovým a Dixonovým testem)
n number of single results retained after eliminating outliers (identified by Cochran, Dixon outlier test)
Další kruhový test ES byla proveden na na čtyřech vzorcích v 7 laboratořích pro ověření hydrolýzy tryptofanu.
Another EC intercomparison study was arranged in which four samples were analysed by up to 7 laboratories with the aim of a tryptophan certification for hydrolysis.
Každý vzorek byl zkoušen pětkrát.
The results are given below.
Krmná směs pro prasata
Mixed pig feed
Nízkotučná rybí moučka
Low fat fish meal
Sójová moučka
Soybean meal
Pro lepší oddělení tryptofanu a α-methyl-tryptofanu jsou doporučeny níže uvedené zvláštní podmínky pro chromatografii.
Following special chromatographic conditions may give better separation between tryptophan and α-methyl-tryptophan.
Po izokratické eluci následuje gradientové čištění kolony:
Isocratic elution followed by gradient column cleaning:
Kolona pro kapalinovou chromatografii:
Liquid chromatographic column:
125 mm × 4 mm, C18, náplň 5 μm, nebo obdobná
125 mm x 4 mm, C18, 5 μm packing or equivalent
Mobilní fáze:
Mobile phase:
A: 0,01 mol/l KH2PO4 a methanol, 95 + 5 (V+V)
0,01 mol/l KH2PO4/méthanol, 95+5 (V+V).
B: methanol
methanol
Gradient:
Gradient program:
asi 33 minut.
approx. 33 min.
Chromatografie se může měnit podle typu HPLC a náplně kolony.
The chromatography will vary according to the type of HPLC and column packing material used.
Zvolený systém musí být schopen oddělit tryptofan a vnitřní standard až na základní „baseline“.
The chosen system must be capable of giving baseline separation between the tryptophan and the internal standard.
Navíc je důležité, aby byly degradační produkty dobře odděleny od tryptofanu a vnitřního standardu.
Moreover it is important that degradation products are well separated from the tryptophan and the internal standard.
Pro kontrolu obsahu nečistot, které by se mohly eluovat ve stejném čase jako vnitřní standard, se provede zkouška hydrolyzátu bez přidaného vnitřního standardu.
Hydrolysates without internal standard shall be run in order to check the base line under the internal standard for impurities.
Je důležité, aby celková doba zkoušky byla dostatečná pro dokonalé vymytí všech degradačních produktů, jinak může docházet v následujících chromatografiích k interferencím.
It is important that the run time is sufficiently long for the elution of all the degradation products, otherwise late eluting peaks may interfere with subsequent chromatographic runs.
Chromatografický systém musí v rozsahu měření poskytovat lineární odezvu.
In the range of operation, the chromatographic system shall give linear response.