natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Pro každou chemickou látku se buňky nasadí stejným způsobem do dvou oddělených 96jamkových destiček, které jsou poté souběžně podrobeny celému postupu zkoušky za stejných podmínek kromě doby, kdy je jedna z destiček ozářena (+ Irr) a druhá je udržována v temnu (– Irr).
For each test chemical cells are seeded identically in two separate 96-well plates, which are then taken concurrently through the entire test procedure under identical culture conditions except for the time period where one of the plates is irradiated (+Irr) and the other one is kept in the dark (-Irr).
Příprava zkoušené látky
Preparation of test substance
Zkoušené látky musí být čerstvě připraveny vždy bezprostředně před použitím, pokud údaje neprokáží jejich stabilitu při skladování.
Test substances must be prepared fresh, immediately prior to use unless data demonstrate their stability in storage.
Doporučuje se veškeré chemické kroky a počáteční úpravy buněk provádět při světelných podmínkách vylučujících fotoaktivaci nebo degradaci zkoušené látky před ozářením.
It is recommended that all chemical handling and the initial treatment of cells be performed under light conditions that would avoid photoactivation or degradation of the test substance prior to irradiation.
Zkoušené chemické látky se rozpustí ve fyziologickém roztoku, např. v Earlově fyziologickém roztoku (EBSS), nebo v jiných fyziologicky vyvážených pufrovaných roztocích, které nesmí obsahovat proteinové složky a složky absorbující světlo (např. pH indikátory a vitaminy), aby nerušily při ozařování.
Test chemicals shall be dissolved in buffered salt solutions, e.g. Earle's Balanced Salt Solution (EBSS), or other physiologically balanced buffer solutions, which must be free from protein components, light absorbing components (e.g. pH-indicator colours and vitamins) to avoid interference during irradiation.
Protože během ozařování jsou buňky drženy přibližně 50 minut mimo inkubátor s CO2, je nutno dbát na vyloučení alkalizace.
Since during irradiation cells are kept for about 50 minutes outside of the CO2 incubator, care has to be taken to avoid alkalisation.
Je-li použit slabý pufr jako např. EBSS, lze toho dosáhnout inkubováním buněk v prostředí se 7,5 % CO2.
If weak buffers like EBSS are used this can be achieved by incubating the cells at 7,5 % CO2.
Jsou-li buňky inkubovány pouze při 5 % CO2, je nutno použít silnější pufr.
If the cells are incubated at 5 % CO2 only, a stronger buffer should be selected.
Zkoušené chemické látky s omezenou rozpustností ve vodě by měly být rozpuštěny ve vhodném rozpouštědle.
Test chemicals of limited solubility in water should be dissolved in an appropriate solvent.
Použije-li se rozpouštědlo, musí být přítomné v konstantní koncentraci ve všech kulturách, tj. v negativní (rozpouštědlové) kontrole i ve všech koncentracích zkoušené chemické látky, a nesmí být při této koncentraci cytotoxické.
If a solvent is used it must be present at a constant volume in all cultures, i.e. in the negative (solvent) controls as well as in all concentrations of the test chemical, and be noncytotoxic at that concentration.
Koncentrace zkoušené chemické látky musí být voleny tak, aby bylo vyloučeno srážení nebo zakalení roztoku.
Test chemical concentrations should be selected so as to avoid precipitate or cloudy solutions.
Doporučenými rozpouštědly jsou dimethylsulfoxid (DMSO) a ethanol (EtOH).
Dimethylsulphoxide (DMSO) and ethanol (ETOH) are the recommended solvents.
Vhodná mohou být i jiná málo cytotoxická rozpouštědla.
Other solvents of low cytotoxicity may be appropriate.
Před použitím by měly být pro všechna rozpouštědla posouzeny jejich specifické vlastnosti, např. reakce se zkoušenou chemickou látku, potlačení fototoxických účinků, záchyt radikálů a/nebo chemická stabilita v rozpouštědle.
Prior to use, all solvents should be assessed for specific properties, e.g. reaction with the test chemical, quenching of the phototoxic effect, radical scavenging properties and/or chemical stability in the solvent.
Rozpouštění může být usnadněno mícháním a/nebo ultrazvukem a/nebo zahřátím na vhodnou teplotu, pokud tím není dotčena stabilita zkoušené chemické látky.
Vortex mixing and/or sonication and/or warming to appropriate temperatures may be used to aid solubilisation unless this would affect the stability of the test chemical.
Podmínky ozařování
Irradiation conditions
Volba vhodného zdroje světla a filtrů je kritickým faktorem zkoušení fototoxicity.
The choice of an appropriate light source and filters is a crucial factor in phototoxicity testing.
Záření v pásmu UVA a ve viditelném pásmu je obvykle spojováno s fototoxickými reakcemi in vivo (3, 12), zatímco záření v pásmu UVB je méně relevantní a je vysoce cytotoxické; cytotoxicita vzrůstá mezi 313 nm a 280 nm tisíckrát (13).
Light of the UVA and visible regions is usually associated with phototoxic reactions in vivo (3)(12), whereas generally UVB is of less relevance but is highly cytotoxic; the cytotoxicity increases 1000-fold as the wavelength goes from 313 to 280 nm (13).
Kritéria pro volbu vhodného světelného zdroje musí zahrnovat požadavek, aby zdroj světla vyzařoval světlo o vlnových délkách, které zkoušená chemická látka absorbuje (absorpční spektrum), a aby dávka světelného záření (dosažitelná po přijatelnou dobu expozice) byla dostatečná pro detekci známých fotocytotoxických chemických látek.
Criteria for the choice of an appropriate light source must include the requirement that the light source emits wavelengths absorbed by the test chemical (absorption spectrum) and that the dose of light (achievable in a reasonable exposure time) should be sufficient for the detection of known photocytotoxic chemicals.
Použité vlnové délky a dávky by dále neměly nadměrně poškozovat zkušební systém, např. emisí tepla (infračervená oblast).
Furthermore, the wavelengths and doses employed should not be unduly deleterious to the test system, e.g. the emission of heat (infrared region).
Simulace slunečního světla solárními simulátory se považuje za optimální zdroj umělého světla.
Simulation of sunlight with solar simulators is considered the optimal artificial light source.
Distribuce zářivého výkonu filtrovaného solárního simulátoru by měla být blízká dennímu venkovnímu světlu uvedenému v literatuře (14).
The irradiation power distribution of the filtered solar simulator should be close to that of outdoor daylight given in (14).
V solárních simulátorech se používá jak xenonová výbojka, tak vysokotlaká rtuťová halogenová výbojka (15).
Both, Xenon arcs and (doped) mercury-metal halide arcs are used as solar simulators (15).
Druhá z nich má tu výhodu, že emituje méně tepla a je levnější, avšak sluneční světlo napodobuje méně dokonale než výbojka xenonová.
The latter has the advantage of emitting less heat and being cheaper, but the match to sunlight is less perfect compared to that of xenon arcs.
Poněvadž všechny solární simulátory vyzařují významné množství UVB záření, měly by být vhodně filtrovány, aby byly vysoce cytotoxické vlnové délky UVB zeslabeny.
Because all solar simulators emit significant quantities of UVB they should be suitably filtered to attenuate the highly cytotoxic UVB wavelengths.
Protože plastové materiály pro buněčné kultury obsahují UV stabilizátory, spektrum by mělo být měřeno po průchodu stejným typem víčka 96jamkové destičky, jaké se použije v daném stanovení.
Because cell culture plastic materials contain UV stabilisers the spectrum should be measured through the same type of 96-well plate lid as will be used in the assay.
Nehledě na opatření přijatá k potlačení částí spektra filtrováním nebo na nevyhnutelné filtrační vlivy zařízení, spektrum zaznamenané za těmito filtry by se nemělo lišit od normalizovaného denního světla ve vnějším prostředí (14).
Irrespective of measures taken to attenuate parts of the spectrum by filtering or by unavoidable filter effects of the equipment the spectrum recorded below these filters should not deviate from standardised outdoor daylight (14).
Příklad spektrální distribuce filtrovaného záření solárního simulátoru použitého ve validační studii zkoušky fototoxicity 3T3 NRU in vitro je uveden v literatuře (8, 16).
An example of the spectral irradiance distribution of the filtered solar simulator used in the validation study of the in vitro 3T3 NRU phototoxicity test is given in (8)(16).
Viz též dodatek 2 obrázek 1.
See also Appendix 2 Figure 1.
Dozimetrie
Dosimetry
Intenzita světla (intenzita ozáření) se musí pravidelně před každou zkouškou fototoxicity kontrolovat za použití vhodného širokopásmového UV-metru.
The intensity of light (irradiance) should be regularly checked before each phototoxicity test using a suitable broadband UV-meter.
Intenzita by měla být měřena po průchodu stejným typem víčka 96jamkové destičky, jaké se použije v daném stanovení.
The intensity should be measured through the same type of 96-well plate lid as will be used in the assay.
UV-metr musí být pro daný zdroj kalibrován.
The UV-meter must have been calibrated to the source.
Funkčnost UV-metru by měla být kontrolována a za tímto účelem se doporučuje použít druhý referenční UV-metr stejného typu, stejným způsobem kalibrovaný.
The performance of the UV-meter should be checked, and for this purpose the use of a second, reference UV-meter of the same type and identical calibration is recommended.
V ideálním případě by měl být v delších časových odstupech použit k měření spektrální intenzity záření filtrovaného zdroje světla a ke kontrole kalibrace širokopásmového UV-metru spektroradiometr.
Ideally, at greater intervals, a spectroradiometer should be used to measure the spectral irradiance of the filtered light source and to check the calibration of the broadband UV-meter.
Dávka 5 J/cm2 (změřená v pásmu UVA) byla shledána jako necytotoxická pro buňky Balb/c 3T3 a dostatečně silná k excitaci chemických látek pro vyvolání fototoxických reakcí (6, 17), např. pro dosažení 5 J/cm2 po dobu 50 minut byla intenzita ozáření nastavena na 1,7 mW/cm2.
A dose of 5 J/cm2 (as measured in the UVA range) was determined to be non-cytotoxic to Balb/c 3T3 cells and sufficiently potent to excite chemicals to elicit phototoxic reactions, (6) (17) e.g. to achieve 5 J/cm2 within a time period of 50 min, irradiance was adjusted to 1,7 mW/cm2.
Viz dodatek 2 obrázek 2.
See Appendix 2 Figure 2.
Jestliže je použita jiná buněčná linie nebo jiný světelný zdroj, musí být dávka ozáření případně kalibrována, aby mohl být režim dávkování volen tak, aby nepoškozoval buňky a byl dostatečný k excitaci standardních fototoxinů.
If another cell line or a different light source are used, the irradiation dose may have to be calibrated so that a dose regimen can be selected that is not deleterious to the cells but sufficient to excite standard phototoxins.
Doba světelné expozice se vypočte tímto způsobem:
The time of light exposure is calculated in the following way:
t(min)=dávka ozáření (J / cm
t(min)=irradiation dose (J/cm
intenzita ozáření (mW / cm
irradiance (mW/cm
(1 J = 1 Ws)
(1 J = 1 Wsec)
Koncentrace zkoušené látky
Test substance concentrations
Rozmezí koncentrací chemických látek zkoušených se světlem (+ Irr) a bez světla (– Irr) by měly být náležitě stanoveny v experimentech pro zjištění rozmezí.
The ranges of concentrations of a chemical tested in the presence (+Irr) and in the absence (-Irr) of light should be adequately determined in dose range-finding experiments.
Může být užitečné zjistit rozpustnost na počátku a po 60 minutách (nebo po době odpovídající době expozice), neboť rozpustnost se může měnit s časem nebo v průběhu expozice. pH buněčných kultur s přídavkem zkoušených látek by měla být v rozmezí 6,5–7,8, aby byla vyloučena toxicita způsobená nevhodnými kultivačními podmínkami nebo vysoce kyselými či zásaditými chemickými látkami.
It may be useful to assess solubility initially and at 60 min (or whatever treatment time is to be used), as solubility can change during time or during the course of exposure. To avoid toxicity induced by improper culture conditions or by highly acidic or alkaline chemicals, the pH of the cell cultures with added test chemical should be in the range 6,5 - 7,8.
Nejvyšší koncentrace zkoušené chemické látky by se měla nacházet v mezích fyziologických zkušebních podmínek, např. by měl být vyloučen osmotický stres či stres z pH.
The highest concentration of the test substance should be within physiological test conditions, e.g. osmotic and pH stress should be avoided.
V závislosti na zkoušené chemické látce může být nutné brát v úvahu další fyzikálně-chemické vlastnosti jako faktory omezující nejvyšší zkušební koncentraci.
Depending on the test chemical, it may be necessary to consider other physico-chemical properties as factors limiting the highest test concentration.
U relativně nerozpustných látek, které nejsou toxické až do koncentrace nasycení, by měla být testována nejvyšší dosažitelná koncentrace.
For relatively insoluble substances that are not toxic at concentrations up to the saturation point the highest achievable concentration should be tested.
Obecně by mělo být vyloučeno srážení zkoušené látky při jakýchkoli zkušebních koncentracích.
In general, precipitation of the test chemical at any of the test concentrations should be avoided.
Maximální koncentrace zkoušené látky by neměla překročit 1000 μg/ml; osmolarita by neměla překročit 10 mM.
The maximum concentration of a test substance should not exceed 1000 μg/mL; osmolarity should not exceed 10 mmolar.
Měla by být použita geometrická řada ředění 8 koncentrací zkoušené látky s konstantním faktorem ředění (viz druhý odstavec bodu 2.1).
A geometric dilution series of eight test substance concentrations with a constant dilution factor should be used (See Section 2.1, second paragraph).
Pokud existují údaje (z experimentů pro zjištění rozmezí koncentrací) o tom, že zkoušená chemická látka není cytotoxická až do mezní koncentrace určené pro experiment v temnu (– Irr), ale je vysoce cytotoxická po ozáření (+ Irr), rozmezí koncentrací, které má být zvoleno pro experimenty s ozářením (+ Irr), se může lišit od rozmezí zvoleného pro experimenty v temnu (– Irr), má-li být splněn požadavek uspokojivé kvality údajů.
If there is information (from a range finding experiment) that the test chemical is not cytotoxic up to the limit concentration in the dark experiment (-Irr), but is highly cytotoxic when irradiated (+Irr), the concentration ranges to be selected for the (+Irr) experiment may differ from those selected for the (-Irr) experiment to fulfill the requirement of adequate data quality.
Citlivost buněk na záření, zjištění dosavadních údajů:
Radiation sensitivity of the cells, establishing of historical data:
Citlivost buněk na zdroj světla by měla být pravidelně kontrolována (přibližně každá pátá pasáž) posouzením jejich životaschopnosti po expozici rostoucími dávkami ozáření.
Cells should be checked regularly (about every fifth passage) for sensitivity to the light source by assessing their viability following exposure to increasing doses of irradiation.
Při tomto posouzení by mělo být použito několik dávek ozáření, včetně úrovní podstatně vyšších, než jsou úrovně při zkoušce fototoxicity 3T3 NRU.
Several doses of irradiation, including levels substantially greater than those used for the 3T3 NRU Phototoxicity test should be used in this assessment.
Tyto dávky se nejsnáze kvantifikují měřením UV složek světelného zdroje.
These doses are easiest quantitated by measurements of UV parts of the light source.
Buňky se nasadí při intenzitě použité ke zkoušce fototoxicity 3T3 NRU in vitro a příští den se ozáří.
Cells are seeded at the density used in the in vitro 3T3 NRU phototoxicity test and irradiated the next day.
Životaschopnost buněk se poté stanoví o den později využitím příjmu neutrální červeně.
Cell viability is then determined one day later using Neutral Red uptake.
Mělo by být prokázáno, že výsledná nejvyšší necytotoxická dávka (např. dávka ve validační studii 5 J/cm2 (UVA)) byla dostatečná ke korektní klasifikaci referenčních chemických látek (tabulka 1).
It should be demonstrated that the resulting highest non-cytotoxic dose (e.g. in the validation study: 5 J/cm2 [UVA]) was sufficient to classify the reference chemicals (Table 1) correctly.
Citlivost na záření, kontrola současné zkoušky:
Radiation sensitivity, check of current test:
Zkouška splňuje kritéria jakosti, pokud ozářené negativní/rozpouštědlové kontroly vykazují životaschopnost více než 80 % v porovnání s neozářenými negativními/rozpouštědlovými kontrolami.
The test meets the quality criteria if the irradiated negative/solvent controls show a viability of more than 80 % when compared with non-irradiated negative/solvent.
Životaschopnost rozpouštědlové kontroly
Viability of solvent controls:
Absolutní absorbance (A540 NRU) neutrální červeně extrahované z rozpouštědlových kontrol naznačí, zda 1 × 104 buněk nasazených na jednu jamku zachovalo při růstu během dvou dnů zkoušky obvyklou dobu zdvojnásobení (doubling time).
The absolute optical density (OD540 NRU) of the Neutral Red extracted from the solvent controls indicates whether the 1×104 cells seeded per well have grown with a normal doubling time during the two days of the assay.
Zkouška splňuje kritérium přijatelnosti, jestliže střední hodnota A540 NRU neexponovaných kontrol je ≥ 0,4 (tj. přibližně dvacetinásobek absorbance rozpouštědlového pozadí).
A test meets the acceptance criteria if the mean OD540 NRU of the untreated controls is ≥ 0,4 (i.e. approximately 20 times the background solvent absorbance).
Pozitivní kontrola
Positive control:
Při každé zkoušce fototoxicity 3T3 NRU in vitro musí být souběžně zkoušena známá fototoxická chemická látka.
A known phototoxic chemical shall be tested concurrently with each in vitro 3T3 NRU phototoxicity test.
Doporučen je chlorpromazin (CPZ).
Chlorpromazine (CPZ) is recommended.
Pro CPZ zkoušený podle standardního postupu při zkoušce fototoxicity 3T3 NRU in vitro byla definována tato kritéria přijatelnosti zkoušky: CPZ ozářený (+ Irr): IC50 = 0,1 až 2,0 μg/ml, pro CPZ neozářený (– Irr): IC50 = 7,0 až 90,0 μg/ml.
For CPZ tested with the standard protocol in the in vitro 3T3 NRU phototoxicity test, the following test acceptance criteria were defined: CPZ irradiated (+Irr): IC50 = 0,1 to 2,0 μg/ml, CPZ non-irradiated (-Irr): IC50 = 7,0 to 90,0 μg/mL.
Fotoiritační faktor (PIF) by měl být > 6.
The Photo Irritation Factor (PIF), should be > 6.
Měla by být sledována předcházející funkčnost této pozitivní kontroly.
The historical performance of the positive control should be monitored.
Namísto chlorpromazinu mohou být použity jako souběžné pozitivní kontroly jiné fototoxické chemické látky vhodné z hlediska typu nebo rozpustnosti hodnocené chemické látky.
Other phototoxic chemicals, suitable for the chemical class or solubility characteristics of the chemical being evaluated, may be used as the concurrent positive controls in place of chlorpromazine.
Zkušební postup (6, 7, 8, 16, 17)
Test procedure (6)(7)(8)(16)(17):
Třetí den
day:
Do obvodových jamek 96jamkové mikrotitrační destičky pro tkáňové kultury se odpipetuje po 100 μl kultivačního média (slepý pokus).
Dispense 100 μL culture medium into the peripheral wells of a 96-well tissue culture microtiter plate (= blanks).
Do zbývajících jamek se dávkuje po 100 μl buněčné suspenze s 1 × 105 buněk/ml v kultivačním médiu (= 1 × 104 buněk na jamku).
In the remaining wells, dispense 100 μL of a cell suspension of 1×105 cells/mL in culture medium (= 1×104 cells/well).
Pro každou řadu koncentrací jednotlivých zkoušených chemických látek a pro rozpouštědlovou a pro pozitivní kontrolu se připraví dvě destičky.
Two plates should be prepared for each series of individual test substance concentrations, and for the solvent and positive controls.
Buňky se inkubují 24 hodin (viz bod 1.4.1.2), dokud nedosáhnou semikonfluentní monovrstvy.
Incubate cells for 24 h (See Section 1.4.1.2) until they form a half confluent monolayer.
Tato inkubační doba umožní regeneraci buněk, jejich přichycení a exponenciální růst.
This incubation period allows for cell recovery, adherence, and exponential growth.
Po inkubaci se kultivační médium z buněk dekantuje a důkladně promyje 150 μl pufrovaného roztoku použitého k inkubaci.
After incubation, decant culture medium from the cells and wash carefully with 150 μL of the buffered solution used for incubation.
Přidá se 100 μl pufru obsahujícího vhodnou koncentraci zkoušené chemické látky, nebo pouze rozpouštědlo (rozpouštědlová kontrola).
Add 100 μL of the buffer containing the appropriate concentration of test chemical or solvent (solvent control).
Aplikuje se 8 různých koncentrací zkoušené chemické látky.
Apply eight different concentrations of the test chemical.
Buňky se zkoušenou chemickou látkou se inkubují v temnu po dobu 60 minut (viz bod 1.4.1.2 a druhý odstavec bodu 1.4.1.4).
Incubate cells with the test substance in the dark for 60 minutes (See Section 1.4.1.2 and 1.4.1.4 second paragraph).
Jedna ze dvou destiček připravených pro každou z řady koncentrací zkoušené chemické látky a kontroly se zvolí, obvykle náhodně, pro stanovení cytotoxicity (– Irr) (tj. kontrolní destička) a jedna (tj. expoziční destička) pro stanovení fotocytotoxicity (+ Irr).
From the two plates prepared for each series of test substance concentrations and the controls, one is selected, generally at random, for the determination of cytotoxicity (-Irr) (i.e., the control plate), and one (the treatment plate) for the determination of photocytotoxicity (+Irr).
K provedení části zkoušky s ozářením (+ Irr) se buňky při pokojové teplotě po dobu 50 minut ozařují přes víčko 96jamkové destičky nejvyšší dávkou záření, která je necytotoxická (viz též dodatek 2).
To perform the +Irr exposure, irradiate the cells at room temperature for 50 minutes through the lid of the 96-well plate with the highest dose of radiation that is non-cytotoxic (see also Appendix 2).
Neozářené destičky (– Irr) se ponechají 50 minut (= doba expozice světlem) v temnu při pokojové teplotě.
Keep non-irradiated plates (-Irr) at room temperature in a dark box for 50 min (= light exposure time).
Zkušební roztok se odstraní a každá jamka se promyje dvakrát 150 μl pufrovaného roztoku použitého k inkubaci, ale neobsahujícího zkoušený materiál.
Decant test solution and carefully wash twice with 150 μL of the buffered solution used for incubation, but not containing the test material.
Pufrovaný roztok se poté nahradí kultivačním médiem a inkubuje se (viz bod 1.4.1.2) přes noc (18–22 hodin).
Replace the buffer with culture medium and incubate (See Section 1.4.1.2.) overnight (18-22 h).
Mikroskopické hodnocení
Microscopic evaluation
Buňky se prohlédnou pod mikroskopem s fázovým kontrastem vzhledem k jejich růstu, morfologii a neporušenosti monovrstvy.
Cells should be examined for growth, morphology, and integrity of the monolayer using a phase contrast microscope.
Zaznamenají se změny morfologie buněk a účinky na růst buněk.
Changes in cell morphology and effects on cell growth should be recorded.
Zkouška příjmu neutrální červeně
Neutral Red uptake test
Buňky se promyjí 150 μl předehřátého roztoku pufru.
Wash the cells with 150 μL of the pre-warmed buffer.
Promývací roztok se opatrně odstraní poklepem.
Remove the washing solution by gentle tapping.
Přidá se 100 μl média bez séra (16) s koncentrací 50 μg/ml neutrální červeně (NR) (3-amino-7-dimethylamino-2-methylphenazin hydrochlorid; N8,N8,3-trimethylfenazin-2,8-diamin-hydrochlorid; č. EINECS 209-035-8; č. CAS 553-24-2; C.I.
Add 100 μL of a 50 μg/mL Neutral Red (NR) (3-amino-7-dimethylamino-2-methylphenazine hydrochloride, EINECS number 209-035-8; CAS number 553-24-2; C.I.
a inkubuje se 3 hodiny dle popisu v bod 1.4.1.2. Po inkubaci se médium NR odstraní a buňky se promyjí 150 μl pufru.
in medium without serum (16) and incubate as described in paragraph 1.4.1.2., for 3 h. After incubation, remove the NR medium, and wash cells with 150 μL of the buffer.
Ten se dekantuje a zcela odstraní odsátím nebo odstředěním.
Decant and remove excess buffer by blotting or centrifugation.
Přidá se přesně 150 μl čerstvě připraveného roztoku (49 dílů vody + 50 dílů ethanolu + 1 díl kyseliny octové) k odstranění NR.
Add exactly 150 μL NR desorb solution (freshly prepared 49 parts water + 50 parts ethanol + 1 part acetic acid).