natgillin/translations-raw huggingface dataset:
V případě, že koncentrace komerčního roztoku je 30 % hm./obj. akrylamidu a 0,8 % hm./obj. BIS, pak uvedená množství (4,85g akrylamidu a 0,15g BIS) musí být nahrazena komerčním roztokem o objemu 16,2 ml.
Where such a solution contains 30 % w/v acrylamide and 0,8 % w/v BIS, a volume of 16,2 ml must be used for the formulation instead of the fixed weights.
Zásobní roztok lze skladovat nejdéle 10 dnů. Pokud je jeho vodivost vyšší než 5 μS, je nutné provést jeho deionizaci promícháváním s 2g Amberlitu MB-3 po dobu 30 minut a poté jej přefiltrovat přes 0,45μm membránu.
The shelf life of the stock solution is a maximum of 10 days; if its conductivity is more than 5 μS, de-ionize by stirring with 2 g Amberlite MB-3 for 30 minutes, then filter through a 0,45 μm membrane.
Roztok gelu
Gel solution
Připravte roztok gelu smícháním přísad a amfolytů se zásobním roztokem gelu (viz 4.1.1).
Prepare a gel solution by mixing additives and ampholytes with the stock gel solution (see 4.1.1).
9,0 ml zásobního roztoku
9,0 ml stock solution
24 mg β-alaninu
24 mg β-alanine
500 μl amfolytu pH 3,5–9,5 [1]
500 μl ampholyte pH 3,5-9,5 [1]
250 μl amfolytu pH 5–7 [1] Jako zvláště vhodné pro dosažení žádoucího rozdělení γ-kaseinů se ukázaly výrobky Ampholine® pH 3,5–9,5 (Pharmacia) a Resolyte® pH 5–7 a pH 6–8 (BDH, Merck).
250 μl ampholyte pH 5-7 [1] The produce Ampholine® pH 3,5-9,5 (Pharmacia) and Resolyte® pH 5-7 and pH 6-8 (BDH, Merck) have proved particularly suitable for obtaining the required separation of γ-caseins.
250 μl amfolytu pH 6–8 [1] Jako zvláště vhodné pro dosažení žádoucího rozdělení γ-kaseinů se ukázaly výrobky Ampholine® pH 3,5–9,5 (Pharmacia) a Resolyte® pH 5–7 a pH 6–8 (BDH, Merck).
250 μl ampholyte pH 6-8 [1] The produce Ampholine® pH 3,5-9,5 (Pharmacia) and Resolyte® pH 5-7 and pH 6-8 (BDH, Merck) have proved particularly suitable for obtaining the required separation of γ-caseins.
Gelový roztok promíchejte a odplyňujte po dobu dvou až tří minut v ultrazvukové lázni nebo ve vakuu.
Mix the gel solution and de-gas for two to three minutes in an ultrasonic bath or in vacuum.
Poznámka: Gelový roztok připravte bezprostředně před jeho naléváním (viz 6.2).
Note: Prepare the gel solution immediately prior to pouring it (see 6.2).
Roztoky katalyzátorů
Catalyst solutions
N, N, N’, N’-tetramethylendiamin (Temed)
N, N, N' N' — tetramethylethylenediamine (Temed)
40 % hm./obj. roztoku persíranu amonného (PER)
40 % w/v ammonium persulphate (PER):
800 mg PER rozpusťte ve vodě a doplňte na 2 ml.
Dissolve 800 mg PER in water and make up to 2 ml.
Poznámka: Vždy používejte čerstvě připravený roztok PER.
Note: Always use freshly prepared PER solution.
Kontaktní tekutina
Contact fluid
Kerosin nebo kapalný parafin
Kerosene or liquid paraffin
Anodový roztok
Anode solution
Rozpusťte 5,77g kyseliny fosforečné (85 % hm.) ve vodě a zřeďte na 100 ml.
Dissolve 5,77 g phosphoric acid (85 % w/w) in water and dilute to 100 ml.
Katodový roztok
Cathode solution
Rozpusťte 2,00g hydroxidu sodného ve vodě a zřeďte vodou na 100 ml.
Dissolve 2,00 g sodium hydroxide in water and dilute to 100 ml with water.
Chemikálie určené k izolaci bílkovin
Reagents for protein isolation
Zředěná kyselina octová (25,0 ml ledové kyseliny octové doplněné vodou do 100 ml)
Dilute acetic acid (25,0 ml of glacial acetic acid made up to 100 ml with water)
Tlumivý roztok pro rozpuštění bílkovin
Protein dissolving buffer
Ve vodě rozpusťte:
Dissolve
5,75g glycerolu (87 % hm.)
5,75 g glycerol (87 % w/w)
24,03g močoviny
24,03 g urea
250 mg dithiothreitolu
250 mg dithiothreitol,
a doplňte na 50 ml vodou.
in water and make up to 50 ml
Poznámka: Skladujte v chladničce; maximální doba uskladnění je jeden týden.
Note: Store in a refrigerator, maximum shelf-life one week.
Chemikálie určené k plasminovému štěpení kaseinů
Reagents for plasmin cleavage of caseins
Tlumivý roztok uhličitanu amonnného
Ammonium carbonate buffer
Titrujte molární roztok hydrogenuhličitanu amonného 0,2 mol/l (1,58 g/100 ml vody) obsahující 0,05 mol/l kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA, 1,46 g/100 ml) roztokem uhličitanu amonného (1,92 g/100 ml vody) obsahujícího 0,05 mol/l EDTA na pH 8.
Titrate a 0,2 mol/l ammonium hydrogencarbonate solution (1,58 g/100 ml water) containing 0,05 mol/l ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 1,46 g/100 ml with a 0,2 mol/l ammonium carbonate solution (1,92 g/100 ml water) containing 0,05 mol/l EDTA to ph 8.
Hovězí plasmin (EC.
Bovine plasmin (EC.
3.4.21.7), s aktivitou nejméně 5 U/ml.
3.4.21.7), activity at least 5 U/ml
Roztok kyseliny ε-aminokapronové určené k inhibici enzymu
ε-Aminocaproic acid solution for enzyme inhibition
Rozpusťte 2,624g kyseliny ε-aminokapronové (6-amino-n-hexankyseliny) ve 100 ml 40 % obj. ethanolu.
Dissolve 2,624 g ε-aminocaproic acid (6 amino-n-hexanoic acid) in 100 ml of 40 % (v/v) ethanol.
Referenční standardy
Standards
Certifikované referenční standardy směsi ovčího a kozího odstředěného mléka vysráženého pomocí syřidla a s obsahem 0 % a 1 % kravského mléka lze získat od Ústavu pro referenční materiály a měření působícího při Komisi, B-2440, Geel, Belgie.
Certified reference standards of a mixture of renneted ewes’ and goats’ skimmed milk containing 0 % and 1 % of cows’ milk are available from the Commission’s Institute for Reference Materials and Measurements, B-2440 Geel, Belgium
Příprava laboratorních prozatímních standardů buvolího mléka vysráženého pomocí syřidla a s obsahem 0 % a 1 % kravského mléka
Preparation of laboratory interim-standards of buffalos’ renneted milk containing 0 % and 1 % of cows’ milk
Odstředěné mléko se připraví odstředěním syrového buvolího nebo kravského mléka při teplotě 37 °C (2500g, 20 minut).
Skimmed milk is prepared by centrifuging of either buffalo or bovine raw bulk milk at 37 °C at 2500 g for 20 minutes.
Po rychlém ochlazení zkumavky a jejího obsahu na 6 až 8 °C se úplně odstraní horní tuková vrstva.
After cooling the tube and contents rapidly to 6 to 8 °C, the upper fat layer is removed completely.
Pro přípravu 1 % standardu přidejte 5,00 ml odstředěného kravského mléka do 495 ml odstředěného buvolího mléka v kádince o obsahu 1 l. Hodnotu pH upravte na 6,4 přídavkem zředěné kyseliny mléčné (10 %, hm./obj.).
For the preparation of the 1 % standard add 5,00 ml of bovine skimmed milk to a 495 ml of buffalos’ skimmed milk in a 1 l beaker, adjust the pH to 6,4 by the addition of dilute lactic acid (10 % w/v).
Teplotu upravte na 35 °C, přidejte 100 μl telecího syřidla (aktivita syřidla 1:10000, cca 3000 U/ml) a míchejte po dobu 1 minuty. Poté kádinku zakryjte hliníkovou fólií a nechte hodinu stát při teplotě 35 °C k utvoření sýřeniny.
Adjust the temperature to 35 °C and add 100 μl of calf rennet (rennet activity 1: 10000, c. 3000 U/ml), stir for 1 minute and then leave the beaker covered with an aluminium foil at 35 °C for one hour to allow formation of the curd.
Po utvoření sýřeniny se veškeré mléko vysrážené pomocí syřidla lyofilizuje, aniž by předtím byla provedena homogenizace nebo odebrání syrovátky.
After the curd has formed, the whole renneted milk is freeze-dried without prior homogenization or draining of the whey.
Lyofilizované mléko se jemně rozemele na homogenní prášek.
After freeze-drying it is finely ground to produce a homogeneous powder.
K přípravě referenčního standardu 0 % použijte stejný postup u čistého odstředěného buvolího mléka.
For the preparation of the 0 % standard, carry out the same procedure using genuine buffalo skimmed milk.
Referenční standardy musí být skladovány při teplotě –20 °C.
The standards must be stored at –20 °C.
Poznámka: Před přípravou referenčních standardů se doporučuje zkontrolovat čistotu buvolího mléka izoelektrickou fokusací kaseinů vystavených působení plasminu.
Note: It is advisable to check the purity of the buffalos’ milk by isoelectric focusing of the plasmin-treated caseins before preparation of the standards.
Chemikálie určené k barvení bílkovin
Reagents for protein staining
Fixativ
Fixative
Rozpusťte 150g kyseliny trichloroctové ve vodě a doplňte na 1000 ml.
Dissolve 150 g trichloroacetic acid in water and make up to 1000 ml.
Odbarvovací roztok
Destaining solution
Zřeďte 500 ml methanolu a 200 ml ledové kyseliny octové destilovanou vodou na 2000 ml.
Dilute 500 ml methanol and 200 ml glacial acetic acid to 2000 ml with distilled water.
Poznámka: Odbarvovací roztok připravte každý den čerstvý; lze jej připravit smícháním stejných objemů zásobního roztoku 50 % obj. methanolu a zásobního roztoku 20 % obj. ledové kyseliny octové.
Note: Prepare the destaining solution fresh every day; it can be prepared by mixing equal volumes of stock solutions of 50 % (v/v) methanol and 20 % (v/v) glacial acetic acid.
Barvicí roztoky
Staining solutions
Barvicí roztok (zásobní roztok 1)
Staining solution (stock solution 1)
V 1000 ml 90 % obj. methanolu rozpusťte pomocí magnetické míchačky (asi 45 minut) 3,0g brilantní modři Coomassie G-250 (C. I. 42655) a roztok přefiltrujte přes dva středně husté skládané filtry.
Dissolve 3,0 g Coomassie Brilliant Blue G-250 (C.I. 42655) in 1000 ml 90 % (v/v) methanol using a magnetic stirrer (approximately 45 minutes), filter through two medium-speed folded filters.
Barvicí roztok (zásobní roztok 2)
Staining solution (stock solution 2)
V 1000 ml 20 % obj. kyseliny octové rozpusťte 5,0g síranu měďnatého, pentahydrátu.
Dissolve 5,0 g copper sulphate pentahydrate in 1000 ml 20 % (v/v) acetic acid.
Barvicí roztok (pracovní roztok)
Staining solution (working solution)
Bezprostředně před barvením smíchejte 125 ml obou zásobních roztoků (4.11.1 a 4.11.2).
Mix together 125 ml of each of the stock solutions (4.11.1, 4.11.2) immediately prior to staining.
Poznámka: Barvicí roztok je třeba použít v den přípravy.
Note: The staining solution should be prepared on the day that it is used.
Skleněné desky (265 × 125 × 4 mm), pryžový váleček (o šířce 15 cm), nivelační stolek
Glass plates (265 × 125 × 4 mm); rubber roller (width 15 cm); levelling table
Nosná fólie gelu (265 × 125 mm)
Gel carrier sheet (265 × 125 mm)
Krycí fólie (280 × 125 mm).
Covering sheet (280 × 125 mm).
Na každý dlouhý okraj nalepte pruh lepicí pásky (280 × 6 × 0,25 mm) (viz obrázek 1).
Stick on strip of adhesive tape (280 × 6 × 0,25 mm) to each long edge (see Figure 1)
Elektrofokusační komora s chladicí deskou (např. 265 × 125 mm) a vhodný napájecí zdroj (≥ 2,5 kV) nebo automatické elektroforetické zařízení
Electrofocusing chamber with cooling plate (e.g. 265 × 125 mm) and suitable power supply (≥ 2,5 kV) or automatic electrophoresis device
Cirkulační kryostat s regulací teploty ve výši 12 ±0,5 °C
Circulation cryostat, thermostatically controlled at 12 ± 0,5 °C
Odstředivka nastavitelná na 3000g
Centrifuge, adjustable to 3000 g
Elektrodové proužky (o délce ≥ 265 mm)
Electrode strips (≥ 265 mm long)
Plastové kapací nádobky na anodový a katodový roztok
Plastic dropping bottles for the anode and cathode solutions
Aplikátory vzorku (10 × 5 mm, z viskózy nebo filtračního papíru s nízkou adsorpcí bílkovin)
Sample applicators (10 × 5 mm, viscose or low protein-adsorption filter paper)
Nůžky, skalpely a pinzety z nerezové oceli
Stainless steel scissors, scalpels and tweezers
Odbarvovací a barvicí misky (např. misky na nástroje 280 × 150 mm) z nerezové oceli nebo skleněné
Stainless steel or glass staining and destaining dishes (e.g. 280 × 150 mm instrument trays)
Nastavitelný tyčový homogenizátor s průměrem tyče 10 mm a rychlostí 8000 až 20000 ot/min
Adjustable rod homogenizer (10 mm shaft diameter), rpm range 8000 to 20000
Magnetická míchačka
Magnetic stirrer
Ultrazvuková lázeň
Ultrasonic bath
Svářečka fólií
Film welder
Mikropipety na 25 μl
25 μl micropipettes
Vakuová odstředivka nebo lyofilizátor
Vacuum concentrator or freeze-dryer
Termostatem řízená vodní lázeň, nastavitelná na 35 a 40 ± 1 °C s třepačkou
Thermostatically controlled water bath adjustable to 35 and 40 ± 1 °C with shaker
Densitometrické zařízení umožňující měření na vlnové délce λ = 634 nm
Densitometer equipment reading at λ = 634 nm
Izolace kaseinů
Isolation of caseins
Do odstředivkové kyvety na 100 ml navažte množství sýra nebo referenčního standardu odpovídající 5g sušiny, přidejte 60 ml destilované vody a obsah homogenizujte tyčovým homogenizátorem (8000 až 10000 ot/min).
Weigh the amount equivalent to 5 g dry mass of cheese or the reference standards into a 100 ml centrifuge tube, add 60 ml distilled water and homogenize with a rod homogenizer (8000 to 10000 rpm).
Upravte pH na 4,6 zředěnou kyselinou octovou (4.5.1) a odstřeďujte (5 minut, 3000g).
Adjust to pH 4,6 with dil. acetic acid (4.5.1) and centrifuge (5 minutes, 3000 g).
Dekantujte tuk a syrovátku a zbytek homogenizujte při 20000 ot/min se 40 ml destilované vody s hodnotou pH upravenou na 4,5 zředěnou kyselinou octovou (4.5.1). Přidejte 20 ml dichlormethanu (4.5.2) a znovu homogenizujte a odstřeďuje (5 minut, 3000g).
Decant the fat and whey, homogenize the residue at 20000 rpm in 40 ml distilled water adjusted to pH 4,5 with dil. acetic acid (4.5.1), add 20 ml dichloromethane (4.5.2), homogenize again and centrifuge (5 minutes, 3000 g).
Špachtlí vyjměte kaseinovou vrstvu, která se nachází mezi vodnou a organickou fází (viz obrázek 2), a obě fáze dekantujte.
Remove the casein layer that lies between the aqueous and organic phases (see Figure 2) with a spatula and decant off both phases.
Kasein znovu homogenizujte se 40 ml destilované vody (viz výše) a 20 ml dichlormethanu (4.5.2) a odstřeďte.
Rehomogenize the casein in 40 ml distilled water (see above) and 20 ml dichloromethane (4.5.2) and centrifuge.
Tento postup opakujte, dokud obě extrakční fáze nejsou bezbarvé (dvakrát až třikrát).
Repeat this procedure until both extraction phases are colourless (two to three times).
Bílkovinný zbytek homogenizujte s 50 ml acetonu (4.5.3) a přefiltrujte přes středně hustý skládaný papírový filtr.
Homogenize the protein residue with 50 ml acetone (4.5.3) and filter through a medium-speed folded filter paper.
Zbytek promyjte dvěma samostatnými 25ml dávkami acetonu a nechte vysušit na vzduchu nebo v proudu dusíku. Potom jemně rozmělněte v třecí misce.
Wash the residue on the filter with two separate 25 ml portions of acetone each time and allow to dry in the air or a stream of nitrogen, then pulverize finely in a mortar.
Poznámka: Suché bílkovinné extrakty se musí uchovávat při teplotě –20 °C.
Note: Dry casein isolates should be kept at –20 °C.
Přeměna β-kaseinů na γ-kaseiny působením plasminu
Plasmin cleavage of β-caseins to intensify γ-caseins
Rozptylte 25 mg izolovaných kaseinů (6.1.1) v 0,5 ml tlumivého roztoku uhličitanu amonného (4.7.1) a směs 20 minut homogenizujte, např. ultrazvukem.
Disperse 25 mg of isolated caseins (6.1.1) in 0,5 ml ammonium carbonate buffer (4.7.1) and homogenize for 20 minutes by e.g. using ultrasonic treatment.
Směs zahřejte na 40 °C a přidejte 10 μl plasminu (4.7.2), promíchejte a inkubujte 1 hodinu při teplotě 40 °C za stálého třepání.
Heat to 40 °C and add 10 μl plasmin (4.7.2), mix and incubate for one hour at 40 °C with continuous shaking.
Pro inhibici enzymu přidejte 20 μl roztoku kyseliny ε-aminokapronové (4.7.3). Poté přidejte 200 mg pevné močoviny a 2 mg dithiothreitolu.
To inhibit the enzyme add 20 μl ε-aminoproic acid solution (4.7.3), then add 200 mg of solid urea and 2 mg of dithiothreitol.
Poznámka: Pro získání lepší symetrie fokusovaných kaseinových pásů se doporučuje po přidání kyseliny ε-aminokapronové roztok lyofilizovat a poté zbytky rozpustit v 0,5 ml tlumivého roztoku pro rozpouštění bílkovin (4.6).
Note: To obtain more symmetry in the focused casein bands it is advisable to freeze-dry the solution after adding the ε-aminocaproic acid and then dissolving the residues in 0,5 ml protein dissolving buffer (4.6).
Příprava polyakrylamidových gelů s obsahem močoviny
Preparation of the urea containing polyacrylamide gels
Na skleněnou desku (5.1) válečkem naneste nosnou fólii gelu (5.2) s pomocí několika kapek vody a přebytečnou vodu odsajte papírovým ubrouskem nebo kapesníčkem.
With the aid of a few drops of water roll the gel carrier sheet (5.2) onto a glass plate (5.1), removing any extraneous water with paper towel or tissue.
Stejným způsobem válečkem naneste druhou, krycí fólii (5.3) s distančními vložkami (0,25 mm) na jinou skleněnou desku.
Roll the cover sheet (5.3) with spacers (0,25 mm) onto another glass plate in the same way.
Tuto druhou desku uložte vodorovně na nivelační stolek.
Lay the plate horizontally on a levelling table.
K připravenému odplyněnému roztoku gelu (4.1.2) přidejte 10 μl Temedu (4.1.3.1), protřepejte a přidejte 10 μl roztoku PER (4.1.3.2); důkladně promíchejte a okamžitě nalijte rovnoměrně na střed krycí fólie.
Add 10 μl Temed (4.1.3.1) to the prepared and de-aerated gel solution (4.1.2), stir and add 10 μl PER-solution (4.1.3.2), mix thoroughly and immediately pour out evenly onto the centre of the cover sheet.
Jeden okraj nosné desky gelu (stranou s fólií směrem dolů) přiložte k desce s krycí fólií a pomalu pokládejte tak, aby se mezi fóliemi vytvořila pravidelně rozprostřená tenká vrstva gelu bez bublin (obrázek 3).
Place one edge of the gel carrier plate (sheet side down) on the cover sheet plate and lower it slowly so that a gel film forms between the sheets and spreads out regularly and free of bubbles (Figure 3).
Pomocí tenké špachtle nosnou desku gelu opatrně přitiskněte po celé délce a položte na ni tři další skleněné desky, aby ji zatížily.
Carefully lower the gel carrier plate completely using a thin spatula and place three more glass plates on top of it to act as weights.
Po skončení polymerace (asi po 60 minutách) spolu s krycí fólií sejměte gel zpolymerovaný na nosné fólii gelu tak, že skleněné desky nakloníte.
After polymerization is complete (about 60 minutes) remove the gel polymerized onto the gel carrier sheet along with the cover sheet by tipping the glass plates.
Zadní stranu nosné fólie pečlivě očistěte, aby se odstranily zbytky gelu a močoviny.
Clean the reverse of the carrier sheet carefully to remove gel residues and urea.
„Gelový sendvič“ zavařte do tenké fólie a uložte do chladničky (nejdéle na šest týdnů).
Weld the gel sandwich into a film tube and store in a refrigerator (maximum six weeks).
Poznámka: Krycí fólii s distančními vložkami lze použít znovu.
Note: The cover sheet with the spacers can be re-used.
Polyakrylamidový gel může být rozřezán na menší části; je to vhodné v případě omezeného počtu vzorků nebo v případě použití automatického elektroforetického zařízení (dva gely o rozměrech 4,5 × 5 cm).
The polyacrylamide gel can be cut to smaller sizes, recommended when there are few samples or if an automatic electrophoresis device is used (two gels, size 4,5 × 5 cm).
Izoelektrická fokusace
lsoelectric focusing
Nastavte kryostat na 12 °C.
Set the cooling thermostat to 12 °C.
Zadní stranu nosné fólie gelu otřete kerosinem a poté na střed chladicího bloku kápněte několik kapek kerosinu (4.2).
Wipe off the reverse of the gel carrier sheet with kerosene, then drip a few drops of kerosene (4.2) onto the centre of the cooling block.
Opatrně přiložte „gelový sendvič“ nosnou fólií obrácený dolů, aby se vytlačily všechny vzduchové bubliny.
Then roll the gel sandwich, carrier side down, onto it, taking care to avoid bubbles.
Přebytečný kerosin otřete a sejměte krycí fólii.
Wipe off any excess kerosene and remove the cover sheet.
Elektrodové proužky napusťte elektrodovými roztoky (4.3, 4.4), seřízněte na délku gelu a uložte na místo (vzdálenost elektrod 9,5 cm).
Soak the electrode strips with the electrode solutions (4.3, 4.4), cut to gel length and place in the positions provided (distance of electrodes 9,5 cm).
Podmínky izoelektrické fokusace
Conditions for isoelectric focusing:
Rozměry gelu 265 × 125 × 0,25 mm
Gel size 265 × 125 × 0,25 mm
Fáze
Step
(min)
(min.)
Napětí
Voltage
Proud
Current
Příkon
Power
Volty/hodiny
Volt-hours
Předběžná fokusace
Pre-focusing
max. 2500
maximum 2500
max. 15
maximum 15
konstantní 4
constant 4
Fokusace vzorku [2]
Sample focusing [2]
Konečná fokusace
Final focusing
max. 5
maximum 5
maximální 20
maximum 20
max. 6
maximum 6
max. 7
maximum 7
maximální 25
maximum 25
Poznámka: Jestliže se změní tloušťka nebo šířka gelů, hodnoty proudu a příkonu musí být odpovídajícím způsobem upraveny (např. hodnoty proudu a příkonu se zdvojnásobí, použije-li se gel o rozměrech 265 × 125 × 0,5 mm).
Note: If thickness or width of the gels are changed, the values for current and power have to be suitably adjusted (e.g. double the values for electric current and power if a 265 × 125 × 0,5 mm gel is used).
Příklad programování napětí u automatického elektroforetického zařízení (2 gely 5,0 × 4,5 cm, elektrody bez proužků se přikládají přímo na gel.
Example of a voltage programme for an automatic electrophoresis device (2 gels of 5,0 × 4,5 cm), electrodes without strips applied directly to the gel
Teplota
Temp.
Fokusace vzorku
Sample focusing
Fokusace
Focusing
Aplikátor vzorku ve fázi 2 vložte při 0 Vh.
Place sample applicator in step 2 at 0 Vh.
Aplikátor vzorku ve fázi 2 odstraňte při 30 Vh.
Remove sample applicator in step 2 at 30 Vh.
Barvení bílkovin
Protein staining
Fixace bílkovin
Protein fixation
Okamžitě po vypnutí napájení odstraňte elektrodové proužky a gel ihned vložte do barvicí/ odbarvovací misky naplněné 200 ml fixatéru (4.9). Gel v ní ponechte 15 minut za stálého třepání.
Remove the electrode strips immediately after turning off the power and put the gel immediately into a staining/destaining dish filled with 200 ml fixative (4.9); leave for 15 minutes, shaking continuously.
Praní a barvení gelové desky
Washing and staining the gel plate
Fixatér beze zbytku dekantujte a gelovou desku dvakrát promývejte po dobu 30 sekund vždy ve 100 ml odbarvovacího roztoku (4.10).
Thoroughly drain off the fixative and wash the gel plate twice for 30 seconds each time with 100 ml destaining solution (4.10).
Odbarvovací roztok dekantujte, misku naplňte 250 ml barvicího roztoku (4.11.3) a gel nechte za mírného třepání po dobu 45 minut zbarvovat.
Pour off the destaining solution and fill the dish with 250 ml staining solution (4.11.3); allow to stain for 45 minutes with gentle shaking.
Odbarvení gelové desky
Destaining the gel plate
Barvicí roztok dekantujte a gelovou desku dvakrát promývejte po dobu 30 sekund vždy ve 100 ml odbarvovacího roztoku (4.10). Poté 15 minut protřepávejte s 200 ml odbarvovacího roztoku; fázi odbarvování opakujte nejméně dvakrát až třikrát, dokud není pozadí čiré a bezbarvé.
Pour off the staining solution, wash the gel plate twice using a 100 ml destaining solution (4.10) each time, then shake with 200 ml destaining solution for 15 minutes and repeat the destaining step at least two or three times until the background is clear and uncoloured.
Gelovou desku potom promyjte destilovanou vodou (2 × 2 minuty) a nechte uschnout na vzduchu (2 až 3 hodiny) nebo usušte vysoušečem vlasů (10 až 15 minut).
Then rinse the gel plate with distilled water (2 × 2 minutes) and dry in the air (2 to 3 hours) or with a hairdryer (10 to 15 minutes).
Poznámka 1: Fixaci, promývání, barvení a odbarvování provádějte při teplotě 20 °C.
Note 1: Carry out fixing, washing, staining and destaining at 20 °C.
Vyšší teploty nepoužívejte.
Do not use elevated temperatures.
Poznámka 2: Pokud upřednostňujete citlivější obarvení stříbrem (např. Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, kód č. 17–1150–01), musí být kaseinové vzorky ošetřené plasminem zředěny v poměru 5 mg/ml.
Note 2: If more sensitive silver staining (e.g. Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, Code No 17-1150-01) is preferred, plasmin-treated casein samples have to be diluted to 5 mg/ml.
Hodnocení se provádí porovnáním proteinových obrazců zkoumaného vzorku s obrazci referenčních standardů u stejného gelu.
Evaluation is performed by comparing the protein patterns of the unknown sample with reference standards on the same gel.