natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Analýza délkového polymorfismu amplifikovaných fragmentů AFLP (Van der Wolf et al., 1998).
Amplified fragment length polymorphism (AFLP) analysis (Van der Wolf et al., 1998).
Specifické primery PCR (Pastrik et al, 2002; viz dodatek 6) lze použít k diferenciaci kmenů patřících do skupiny 1 (biovary 3, 4 a 5) a skupiny 2 (biovary 1, 2A a 2T) R. solanacearum, jak bylo původně definováno analýzou RFLP (Cook et al., 1989) a sekvenováním 16S rDNA (Taghavi et al., 1996).
Specific PCR primers (Pastrik et al, 2002; see Appendix 6) can be used to differentiate strains belonging to division 1 (biovars 3, 4 and 5) and division 2 (biovars 1, 2A and 2T) of R. solanacearum, as originally defined by RFLP analysis (Cook et al., 1989) and 16S rDNA sequencing (Taghavi et al., 1996).
Jako závěrečné potvrzení diagnózy R. solanacearum a k potvrzení virulence kultur identifikovaných jako R. solanacearum musí být proveden test patogenity.
The pathogenicity test must be performed as final confirmation of a diagnosis of R. solanacearum and for assessment of virulence of cultures identified as R. solanacearum.
Připravte inokulum o hustotě přibližně 106 buněk na 1 ml ze 24 až 48 hodinových kultur k testování a příslušný kmen pozitivní kontroly R. solanacearum (např. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; viz dodatek 3).
Prepare an inoculum of approximately 106 cells per ml from a 24 to 48 hour culture of the isolate to be tested and an appropriate positive control strain of R. solanacearum (e.g. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; see Appendix 3).
Inokulujte 5 až 10 náchylných sazenic rajčete nebo lilku ve fázi 3 pravých listů (viz odst. VI.A.9).
Inoculate 5 to 10 susceptible tomato or eggplant seedlings at the third true leaf stage (see Section VI.A.9).
Nechte inkubovat až 2 týdny při teplotě 25–28 °C a vysoké relativní vzdušné vlhkosti s přiměřeným zaléváním, bez vystavení rostlin zamokření nebo vyprahlosti půdy.
Incubate for up to two weeks at 25 to 28 °C and high relative humidity with appropriate watering to avoid waterlogging or drought stress.
U čistých kultur by typické vadnutí mělo nastat během 14 dnů.
With pure cultures typical wilting should be obtained within 14 days.
Neobjeví-li se po této době příznaky, kultura nemůže být považována jako patogenní forma R. solanacearum.
If after this period symptoms are not present, the culture cannot be confirmed as being a pathogenic form of R. solanacearum.
Hledejte příznaky vadnutí a/nebo epinastie, chlorózy nebo krnění.
Observe for symptoms of wilting and/or epinasty, chlorosis and stunting.
Proveďte izolaci z rostlin vykazujících příznaky odebráním segmentu ze stonku asi 2 cm nad místem inokulace.
Isolate from symptomatic plants by removing a section of stem about 2 cm above the inoculation point.
Rozmělněte a suspendujte v malém množství sterilní destilované vody nebo 50 mM fosfátového pufru (dodatek 4).
Comminute and suspend in a small volume of sterile distilled water or 50 mM phosphate buffer (Appendix 4).
Proveďte izolaci ze suspense zřeďovacím roztěrem pokud možno na selektivní živné půdě (dodatek 2), a nechte inkubovat 48 až 72 hodin při teplotě 28 °C a vyhodnotíme na výskyt typických kolonií pro R. solanacearum.
Isolate from the suspension by dilution spreading or streaking on a suitable medium, preferably onto a selective medium (Appendix 2), incubate for 48 to 72 hours at 28 °C and observe the formation of colonies typical of R. solanacearum.
Viz Lelliott a Stead (1987).
See Lelliott and Stead (1987)
Laboratoř [201]
Laboratory [201]
Vídeň a Linec
Vienna and Linz
Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali
Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali
Boloň
Bologna
Regione Veneto Unita Periferica per i Servizi Fitosanitari
Regione Veneto Unità Periferica per i Servizi Fitosanitari
Kontakty: viz internetová stránka http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.
Contact scientists: see web site http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.
Živné půdy pro izolaci a kultivaci organismu R. solanacearum
Media for isolation and culture of R. solanacearum
živné půdy pro izolaci a kultivaci
General growth media
Živný agar (NA)
Nutrient Agar (NA)
Živný agar (Difco)
Nutrient Agar (Difco)
Destilovaná voda
Distilled water
Rozpusťte složky a sterilujte tlakem při teplotě 121 °C po dobu 15 minut. Kvasnično-pepton-glukózový agar (YPGA)
Dissolve ingredients and sterilise by autoclaving at 121 °C for 15 min.
Kvasnicový extrakt (Difco) 5,0 g
Yeast Peptone Glucose Agar (YPGA)
Bacto-Pepton (Difco)
Yeast extract (Difco)
Bacto-Pepton (Difco) 10,0 g Glycerol
Bacto-Peptone (Difco)
Bacto-Agar (Difco)
D(+) Glucose (monohydrate)
Destilovaná voda
Bacto-Agar (Difco)
Bacto-Peptone (Difco)
Sucrose Peptone Agar (SPA) Sucrose
pH 7,2–7,4
pH 7,2 – 7,4
Rozpusťte složky a sterilujte v autoklávu při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.
Dissolve ingredients and sterilise by autoclaving at 121 °C for 15 minutes.
Kelmanovo tetrazoliové médium
Kelman’s Tetrazolium Medium
Casamino kyseliny (Difco)
Casamino acids (Difco)
Bacto-Agar (Difco)
Dextrose
Destilovaná voda
15,0 g Distilled water
Ochlaďte na 50 °C a přidejte filtrem sterilizovaný roztok 2,3,5-trifenyl-tetrazoliumchloridu (Sigma), až do dosažení konečné koncentrace 50 mg na litr.
Cool to 50 °C and add a filter-sterilised solution of 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (Sigma) to obtain a final concentration of 50 mg per l.
Validované selektivní živné půdy
Validated selective growth media
Živná půda SMSA (Englebrecht, 1994 ve znění Elphinstone et al., 1996)
SMSA medium (Englebrecht, 1994 as modified by Elphinstone et al., 1996)
Základní živná půda
Basal medium
Bacto-Agar (Difco) (viz pozn.
Glycerol
15,0 g Destilovaná voda
Bacto-Agar (Difco); see Note 2.
Ochlaďte na 50 °C a přidejte filtrem sterilizovaný vodný roztok následujících složek, abyste získali stanovenou konečnou koncentraci:
Cool to 50 °C and add filter-sterilised aqueous stock solutions of the following ingredients to obtain the specified final concentrations:
Krystalová violeť (Sigma)
Crystal Violet (Sigma)
5 mg/l
5 mg per l
Polymixin-B-sulfát (Sigma P1004)
Polymixin-B-Sulphate (Sigma P-1004)
600000 U (přibližně 100 mg)/l
600000 U (approximately 100 mg) per l
1250 U (přibližně 25 mg)/l
1250 U (approximately 25 mg) per l
Chloramfenikol (Sigma C-3175)
Chloramphenicol (Sigma C-3175)
Penicilín-G (Sigma P-3032)
Penicillin-G (Sigma P-3032)
825 U (přibližně 0,5 mg)/l
825 U (approximately 0,5 mg) per l
2,3,5-trifenyltetrazolium chlorid (Sigma)
2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (Sigma)
50 mg/l
50 mg per l
Použití jiných reagencí výše uvedených může ovlivnit růst R. solanacearum.
Use of reagents other than those specified above may affect growth of R. solanacearum.
Místo Bacto-Agar (Difco) může být použit Oxoid Agar #1.
Oxoid Agar #1 can be used in place of Bacto-Agar (Difco).
V takovém případě bude růst R. solanacearum pomalejší, ale může to však také omezit růst konkurenčních saprofytů.
In this case growth of R. solanacearum will be slower, although growth of competing saprophytes may also be reduced.
Typické kolonie R. solanacearum se mohou tvořit o 1–2 dny déle a červené zbarvení může být světlejší a rozptýlenější při použití Bacto-Agar.
Typical colonies of R. solanacearum may take 1 to 2 days longer to form and the red colouration may be lighter and more diffuse than on Bacto-Agar.
Zvýšení koncentrace bacitracinu na 2500 U/l může omezit populace konkurenčních bakterií bez ovlivnění růstu Ralstonia solanacearum.
Increasing bacitracin concentration to 2500 U per l may reduce populations of competing bacteria without affecting growth of Ralstonia solanacearum.
Uchovávejte a skladujte roztoky antibiotik při teplotě 4 °C v temnu a spotřebujte do 1 měsíce.
Store media and stock solutions of antibiotics at 4 °C in the dark and use within one month.
Misky s médiem by měly být před použitím zbaveny povrchové kondenzace.
Plates should be free from surface condensation before use.
Zabraňte přílišnému sušení média.
Avoid excess drying of plates.
Každá nově připravená šarže živné půdy by měla být podrobena kontrole kvality živné půdy roztěrem suspense referenční kultury R. solanacearum na médium (viz dodatek 3) a pozorováním, zda se po 2 až 5 dnech při teplotě 28 °C objeví typické kolonie.
Quality control should be performed after preparation of each new batch of medium by plating a suspension of a reference culture of R. solanacearum (see Appendix 3) and observing formation of typical colonies after incubation at 28 °C for two to five days.
Validované obohacené živné půdy
Validated enrichment media
Živná půda SMSA (Elphinstone et al., 1996)
SMSA Broth (Elphinstone et al., 1996)
Proveďte přípravu jako pro selektivní agarovou živnou půdu SMSA, ale vynechte Bacto-Agar a 2,3,5-trifenyltetrazolium chlorid.
Prepare as for SMSA selective agar medium but omit Bacto-Agar and 2,3,5-tetrazolium chloride.
Upravená živná půda Wilbrink (Caruso et al., 2002)
Modified Wilbrink broth (Caruso et al., 2002)
Proteázový pepton
Proteose peptone
0,5 g MgSO4
K2HPO4
NaNO3
0,25 g NaNO3
Sterilujte tlakem při teplotě 121 °C po dobu 15 minut a ochlaďte na 50 °C.
Sterilise by autoclaving at 121 °C for 15 minutes and cool to 50 °C
Přidejte antibiotický zásobní roztok jako pro živnou půdu SMSA.
Add antibiotic stock solutions as for SMSA broth.
Izolované bakteriální kultury
Bacterial isolates
Následující izolované bakteriální kultury se doporučují jako standardní referenční materiál buď k pozitivní kontrole (tabulka 1) nebo během optimalizace testů, aby se zabránilo vzájemnému působení (tabulka 2).
The following bacterial isolates are recommended for use as standard reference material either as positive controls (Table 1) or during optimisation of tests to avoid cross-reactions (Table 2).
Všechny kmeny jsou komerčně dostupné a lze je získat z těchto sbírek:
All strains are commercially available from:
Národní sbírka patogenních bakterií rostlin (NCPPB), Ústřední vědecká laboratoř York, UK.
National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB), Central Science Laboratory, York, UK
Sbírka kultur sekce ochrany rostlin (PD), Wageningen, Nizozemsko.
Culture Collection of the Plant Protection Service (PD), Wageningen, the Netherlands.
Francouzská sbírka patogenních bakterií rostlin (CFBP), Ústav fytobakteriologie INRA, Angers, Francie.
Collection Française de Bactéries Phytopathogènes (CFBP), INRA Station Phytobactériologie, Angers, France.
Tabulka 1 Referenční panel izolovaných bakteriálních kultur SMT R. solanacearum
Table 1 SMT reference panel of isolates of R. solanacearum
Kód NCPPB
NCPPB code
Jiné kódy
Other codes
Pozn.: Spolehlivost výše uvedených kmenů může být zaručena pouze v případě, že pocházejí z původních sbírek kultur.
Note: Authenticity of the above strains can be guaranteed only if obtained from an authentic culture collection.
Tabulka 2 Referenční panel SMT sérologicky nebo geneticky příbuzných bakterií k optimalizaci detekčních testů
Table 2: SMT reference panel of serologically- or genetically-related bacteria for use in optimisation of detection tests
Jiné kódy
Other code
Následující standardní kontrolní materiál je možné získat ze sbírky kultur NCPPB.
The following standard control material is available from the NCPPB culture collection.
Mražené sušené pelety bramborového extraktu ze 200 zdravých hlíz bramboru k negativní kontrole všech testů.
Freeze dried pellet of potato extract from 200 healthy potato tubers as negative control for all tests.
Mražené sušené pelety bramborového extraktu ze 200 zdravých hlíz bramboru obsahující 103 až 104 a 104 až 106 buněk biovaru 2 R. solanacearum (kmen NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) jako pozitivní kontroly serologických a PCR testů.
Freeze dried pellet of potato extract from 200 healthy potato tubers containing 103 to 104 and 104 to 106 cells R. solanacearum biovar 2 (strain NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) as positive controls for serological and PCR tests.
Protože životaschopnost buňky je ovlivněna lyofilizací, nejsou tyto vhodné jako standardy v testech izolace a testech patogenity.
Since cell viability is affected during freeze-drying, these are not suitable as standard controls for isolation or bioassay tests.
Ve formaldehydu fixované suspense biovaru 2 R. solanacearum (kmen NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) s 106 buňkami na 1 ml k pozitivní kontrole sérologických testů.
Formalin-fixed suspensions of R. solanacearum biovar 2 (strain NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) at 106 cells per ml as positive controls for serological tests.
Příprava pozitivních a negativních kontrol pro screeningové testy vodivých pletiv PCR/IF a FISH
Preparation of positive and negative controls for the core screening tests PCR/IF and FISH
Kultivujte 48hodinovou kulturu virulentního kmene R. solanacearum rasy 3/biovaru 2 (např. kmen NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) na SMSA živné půdě a suspendujte v 10 mM fosfátovém pufru, abyste získali buněčnou hustotu přibližně 2 × 108 cfu na 1 ml.
Produce a 48 hour culture of a virulent strain of R. solanacearum race3/biovar2 (e.g. strain NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) on basal SMSA medium and suspend in 10 mM phosphate buffer to obtain a cell density of approximately 2 × 108 cfu per ml.
Obvykle se jí dosáhne jemně zakalenou suspenzí rovnající se optické hustotě 0,15 při 600 nm.
This is usually obtained by a faintly turbid suspension equivalent to an optical density of 0,15 at 600 nm.
Odeberte dřeň z pupkových konců 200 hlíz z produkce odrůdy s bílou slupkou, o které víte, že je prosta R. solanacearum.
Remove the heel end cores of 200 tubers taken from a white skin variety production known to be free from R. solanacearum.
Zpracujte pupkové konce výše uvedeným postupem a resuspendujte peletu v 10 ml.
Process the heel ends as usual and resuspend the pellet in 10 ml.
Připravte 10 sterilních 1,5 ml mikrozkumavek s 900 µl resuspendované pelety.
Prepare 10 sterile 1,5 ml microvials with 900 µl of the resuspended pellet.
Přeneste 100 µl suspenze R. solanacearum do první mikrozkumavky.
Transfer 100 µl of the suspension of R. solanacearum to the first microvial.
Protřepejte.
Vortex.
Proveďte desetinásobné ředění v dalších pěti mikrozkumavkách.
Establish decimal levels of contamination by further diluting in the next five microvials.
Těchto šest kontaminovaných mikrozkumavek bude použito jako kontrolní pozitivní vzorky.
The six contaminated microvials will be used as positive controls.
Čtyři nekontaminované mikrozkumavky budou použity jako kontrolní negativní vzorky.
The four non-contaminated microvials will be used as negative controls.
Mikrozkumavky řádně označte.
Label the microvials accordingly.
Připravte poměrné díly 100 µl ve sterilních 1,5 ml mikrozkumavkách, čímž získáte 9 kopií téhož kontrolního vzorku.
Prepare aliquots of 100 µl in sterile 1,5 ml microvials thus obtaining nine replicas of each control sample.
Uskladněte při teplotě –16 až –24 °C do dalšího použití.
Store at –16 to –24 °C until use.
Přítomnost a množství organismu R. solanacearum v kontrolních vzorcích by měly být nejdříve potvrzeny testem IF.
The presence and quantification of R. solanacearum in the control samples should be first confirmed by IF.
Pro účely testu PCR proveďte extrakci DNA z pozitivních a negativních kontrolních vzorků u každé série testovacích vzorků.
For the PCR test perform DNA extraction from positive and negative control samples with each series of test samples.
Pro účely testů IF a FISH proveďte test patogenity na pozitivních a negativních kontrolních vzorcích u každé série testovacích vzorků.
For IF and FISH tests perform assays on positive and negative control samples with each series of test samples.
Co se týče testů IF, FISH a PCR, organismus R. solanacearum musí být detekován nejméně v počtu 106 a 104 buněk/ml u pozitivních kontrolních vzorků a u žádných vzorků negativní kontroly.
For IF, FISH and PCR assays R. solanacearum must be detected in at least the 106 and 104 cells/ml of the positive controls and not in any of the negative controls.
Použijte jako standardní referenční kmen R. solanacearum biovar 2 (rod 3).
Use as standard reference strain of R. solanacearum biovar 2 (race 3).
Potencionální křížově reagující kmen v sérologických testech (IF a/nebo ELISA) s polyklonálním antisérem.
Potential cross-reacting strain in serological tests (IF and/or ELISA) with polyclonal antisera.
Kmen, ze kterého lze v některých laboratořích amplifikovat produkt PCR na podobnou velikost, jako je očekávaná velikost při použití specifických primerů OLI-1 a Y-2 (viz dodatek 6).
Strain from which PCR product can be amplified in some laboratories of a similar size to that expected using specific primers OLI-1 and Y-2 (see Appendix 6).
Pravděpodobnost křížové reakce ve většině testů, ale výskyt znám pouze u banánů v Indonésii.
Likely to cross-react in most tests but known to occur only on banana in Indonesia.
OBECNĚ: Neotevřené sterilizované pufry mohou být uchovány až jeden rok.
General: Unopened sterilised buffers can be stored for up to one year
Pufry pro účely extrakce
Buffers for extraction procedure
Extrakční pufr (50 mM fosfátový pufr, pH 7,0)
Extraction buffer (50 mM phosphate buffer, pH 7,0)
Tento pufr se používá k extrakci bakterií z rostlinných pletiv homogenizací nebo třepáním.
This buffer is used for extraction of the bacterium from plant tissues by homogenisation or shaking.
(bezvodý)
(anhydrous)
Rozpusťte složky, zkontrolujte pH a sterilizujte v autoklávu při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.
Dissolve ingredients, check pH and sterilise by autoclaving at 121 °C for 15 min.
Užitečné mohou být následující pomocné složky:
Additional components may be useful as follows:
Množství (/l)
Quantity (per l)
Vločky Lubrol
Lubrol flakes
protisrážlivý prostředek [501]
Deflocculant [501]
Silikonový odpěňovací prostředek DC
DC silicone antifoam
Odpěňovací prostředek [501]
Anti-foam agent [501]
Tetrasodiumpyrofosfát
Tetrasodium pyrophosphate
Antioxidační prostředek
Anti-oxidant
Váže inhibitory PCR
Binding of PCR inhibitors
Peletový pufr (10 mM fosfátový pufr, pH 7,2)
Pellet buffer (10 mM phosphate buffer, pH 7,2)
Tento pufr se používá k resuspenzi a ředění extraktů z výkrojků pupkových konců hlíz bramboru po jejich zahuštění do formy pelety odstředěním.
This buffer is used for resuspension and dilution of potato tuber heel-end core extracts following concentration to a pellet by centrifugation.
Rozpusťte složky, zkontrolujte pH a autoklávujte při teplotě 121 °C po dobu 15 minut.
Dissolve ingredients, check pH and sterilise by autoclaving at 121 °C for 15 minutes.
Pufry pro IF test
Buffers for the IF test
Pufr IF (10 mM roztok chloridu sodného pufrovaný fosfátem (PBS), pH 7,2)
IF-Buffer (10 mM phosphate buffered saline (PBS), pH 7.2)
Tento pufr se používá k ředění protilátek
This buffer is used for dilution of antibodies
Pufr IF-Tween
IF-buffer-Tween
Tento pufr se používá k oplachování podložních sklíček.
This buffer is used to wash slides.
Přidejte 0,1 % Tween 20 do pufru IF.
Add 0,1 % Tween 20 to the IF buffer.
Fosfátový pufr s glycerolem, pH 7,6
Phosphate buffered glycerol, pH 7,6
Tento pufr se používá jako krycí tekutina/roztok na podložní sklíčko ke zvýšení fluorescence.
This buffer is used as a mountant fluid on the windows of IF slides to enhance fluorescence.
Krycí roztoky např Vectashield® (laboratoře Vector Laboratories) nebo Citifluor® (Leica) jsou dostupné na trhu.
Anti-fading mountant solutions are commercially available e.g. Vectashield® (Vector Laboratories) or Citifluor® (Leica).
Pufry pro účely nepřímého testu ELISA
Buffers for the Indirect ELISA test
Dvojnásobný uhličitanový potahovací pufr, pH 9,6.
Double strength coating buffer, pH 9,6.
Pokud extrakt obsahuje vysoký podíl aromatických molekul, je možné jako antioxidant přidat siřičitan sodný (0,2 %).
Sodium sulphite (0.2 %) may be added as antioxidant if required to prevent build up of oxidised aromatic compounds.
Desetinásobný roztok chloridu sodného pufrovaný fosfátem (10X PBS), pH 7,4
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7,4
PBS-Tween
PBS-Tween
Blokační pufr (musí být čerstvě připraven).
Blocking (antibody) buffer (must be freshly prepared).
Polyvinylpyrrolidin-44000 (PVP-44)
Polyvinylpyrrolidone-44000 (PVP-44)
Sušené mléko
Milk powder
doplnit do 100 ml
make up to 100 ml
Roztok pro substrát alkalické fosfatázy, pH 9,8
Alkaline phosphatase substrate solution, pH 9,8
Smíchejte a nastavte hodnotu pH 9,8 koncentrovanou HCl.
Mix and adjust to pH 9,8 with concentrated HCl.
Doplňte do 1 l destilovanou vodou.
Make up to 1 L with distilled water.
Přidejte 0,2 g MgCl2.
Add 0,2 g MgCl2.
Rozpusťte dvě 5 mg tabletky fosfatázového substrátu (Sigma) v 15 ml roztoku.
Dissolve 2 phosphatase substrate 5 mg tablets (Sigma) per 15 ml of solution.
Pufry pro účely testu DASI ELISA
Buffers for DASI ELISA test
Potahovací pufr, pH 9,6.
Coating buffer, pH 9,6
Rozpusťte složky a zkontrolujte pH 9,6.
Dissolve ingredients and check pH 9,6
fosfátosolný pufr (PBS) pH 7,2– 7,4
Phosphate saline buffer(PBS) pH 7,2 to 7,4
Substrátový pufr, pH 9,8
Substrate buffer, pH 9,8
Pro účely homogenizační extrakční metody.
For use with homogenisation extraction method
Spočítejte průměrný počet typických fluoreskujících buněk v jednom pozorovacím poli (c).
Count the mean number of typical fluorescent cells per field of view (c).
Spočítejte počet typických fluoreskujících buněk v 1 okénku mikroskopického sklíčka (C).
Calculate the number of typical fluorescent cells per microscope slide window (C).
C = c × S/s
C = c × S/s
plocha 1 pole na sklíčku s více okénky
surface area of window of multispot slide
povrch pole objektivu
surface area of objective field
koeficient pole (liší se v rozmezí 8–24 v závislosti na typu okuláru)
field coefficient (varies from 8 to 24 depending upon ocular type)
koeficient tubusu (1 nebo 1,25)
tube coefficient (1 or 1,25)
zvětšení objektivu (100×, 40× atd.)
magnification of objective (100 ×, 40 × etc.).
Vypočtěte počet typických fluorescenčních buněk na 1 ml resuspendované pelety (N).
Calculate the number of typical fluorescent cells per ml of re-suspended pellet (N).
N = C × 1000/y × F
N = C × 1000/y × F
objem resuspendované pelety v každém okénku
volume of re-suspended pellet on each window
faktor ředění resuspendované pelety.
dilution factor of re-suspended pellet.
Pozn.: Předběžné testování by mělo umožnit reprodukovatelnou detekci asi 103 až 104 buněk R. solanacearum na 1 ml vzorkového extraktu.
Preliminary testing should permit reproducible detection of 103 to 104 cells of R. solanacearum per ml of sample extract.
Předběžné testování by rovněž nemělo ukázat žádné falešně pozitivní výsledky na panelu vybraných bakteriálních kmenů (viz dodatek 3).
Preliminary testing should also show no false positive results with a panel of selected bacterial strains (see Appendix 3).
Protokol PCR Seal et al.
PCR protocol of Seal et al.
Oligonukleotidové primery
Oligonucleotide primers
Přímý primer OLI-1
Forward primer OLI-1
Reverzní primer Y-2
Reverse primer Y-2
Očekávaná velikost amplikonu templátové DNA R. solanacearum = 288 bp
Expected amplicon size from R. solanacearum template DNA = 288 bp
Reakční směs PCR
PCR reaction mix
Reagencie
Reagent
Množství v reakci
Quantity per reaction
Sterilní ultra čistá voda
Sterile UPW
pufr PCR [701] (15 mM MgCl2)
PCR buffer [701] (15 mM MgCl2)
Směs dNTP (20mM)
dNTP mix (20 mM)
Taq polymerasa (5U/µl) [701]
Taq polymerase (5U/µl) [701]
Množství vzorku
Sample volume
Celkové množství:
Total volume
Reakční podmínky PCR
PCR reaction conditions
Proveďte následující cyklický proces:
Run the following programme:
1 cyklus:
1 cycle of:
2 minuty při 96 °C (denaturace templátové DNA)
2 minutes at 96 °C (denaturation of template DNA)
35 cyklů:
35 cycles of:
20 sekund při 94 °C (denaturace templátové DNA)
20 seconds at 94 °C (denaturation of template DNA)
20 sekund při 68 °C (hybridizace primerů s templátovou DNA)
20 seconds at 68 °C (annealing of primers)
30 sekund při 72 °C (syntéza kopie)
30 seconds at 72 °C (extension of copy)
10 minut při 72 °C (závěrečná syntéza)
10 minutes at 72 °C (final extension)
ponechte při teplotě 4 °C.
hold at 4 °C.
Pozn.: Tento program byl optimalizován pro použití termocykleru Perkin Elmer 9600.
This programme was optimised for use with a Perkin Elmer 9600 thermal cycler.
Použití jiných přístrojů může vyžadovat úpravu jednotlivých kroků cyklu ii), iii) a iv).
Modification of the duration steps of cycles (ii), (iii) and (iv) may be required for use with other models.