natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Тази процедура се повтаря, докато двете фази на екстракцията останат безцветни (от два до три пъти).
Note: To obtain more symmetry in the focused casein bands it is advisable to freeze-dry the solution after adding the ε-aminocaproic acid and then dissolving the residues in 0,5 ml protein dissolving buffer (4.6).
Утайката от протеин се хомогенизира с 50 ml ацетон (4.5.3) и се филтрира през нагъната филтърна хартия със средна скорост.
Preparation of the urea containing polyacrylamide gels
Утайката върху филтъра се измива с две отделни части от 25 ml ацетон и се оставя да се изсуши на въздух или в струя азот, след което се стрива на фин прах в хаван.
With the aid of a few drops of water roll the gel carrier sheet (5.2) onto a glass plate (5.1), removing any extraneous water with paper towel or tissue.
Забележка: Сухият изолиран казеин следва да бъде съхраняван при – 20 °C.
Roll the cover sheet (5.3) with spacers (0,25 mm) onto another glass plate in the same way.
Разграждане чрез плазмин на β-казеини за интензифициране на γ-казеини
Lay the plate horizontally on a levelling table.
25 mg изолирани казеини (6.1.1) се разпръскват в 0,5 ml буфер с амониев карбонат (4.7.1) и се хомогенизират за 20 минути, например чрез обработка с ултразвук.
Add 10 μl Temed (4.1.3.1) to the prepared and de-aerated gel solution (4.1.2), stir and add 10 μl PER-solution (4.1.3.2), mix thoroughly and immediately pour out evenly onto the centre of the cover sheet.
Подгрява се до 40 °C и се добавя 10 μl плазмин (4.7.2), смесва се и се инкубира за един час при 40 °C с непрекъснато разклащане.
Place one edge of the gel carrier plate (sheet side down) on the cover sheet plate and lower it slowly so that a gel film forms between the sheets and spreads out regularly and free of bubbles (Figure 3).
За да се инхибира ензимът, се добавя 20 μl разтвор на ε-аминокапронова киселина (4.7.3), след това се добавят 200 mg твърда уреа и 2 mg дитиотрейтол.
Carefully lower the gel carrier plate completely using a thin spatula and place three more glass plates on top of it to act as weights.
Забележка: За да се получи по-голяма симетрия на фокусираните казеинови ивици е препоръчително разтворът да се изсуши чрез сублимиране след добавянето на ε-аминокапронова киселина, като след това утайките се разредят в 0,5 ml буфер за разтваряне на протеин (4.6).
After polymerization is complete (about 60 minutes) remove the gel polymerized onto the gel carrier sheet along with the cover sheet by tipping the glass plates.
Приготвяне на полиакриламидни гелове, съдържащи уреа
Clean the reverse of the carrier sheet carefully to remove gel residues and urea.
С помощта на няколко капки вода листът носител на гел (5.2) се разстила върху стъклена плоча (5.1), като излизащата навън вода се отстранява с хартиена салфетка.
Weld the gel sandwich into a film tube and store in a refrigerator (maximum six weeks).
По същия начин покривният лист (5.3) с ограничители (0,25 mm) се разстила върху друга стъклена плоча.
Note: The cover sheet with the spacers can be re-used.
Плочата се поставя хоризонтално върху нивелирна маса.
The polyacrylamide gel can be cut to smaller sizes, recommended when there are few samples or if an automatic electrophoresis device is used (two gels, size 4,5 × 5 cm).
Към приготвения и с отстранен въздух разтвор на гел (4.1.2) се добавят 10 μl Temed (4.1.3.1), разклаща се и се добавят 10 μl разтвор на PER (4.1.3.2), внимателно се смесва и веднага се излива равномерно в центъра на покривния лист.
lsoelectric focusing
Единият край на плочата с носителя на гела (с листа надолу) се поставя върху плочата с покривния лист и плочата се сваля бавно надолу, така че между листовете да се образува и разстеле равномерно филм от гел, без да се образуват мехурчета (фигура 3).
Set the cooling thermostat to 12 °C.
Плочата с носителя на гела се оставя внимателно да легне напълно с помощта на тънка шпатула и върху нея се поставят още три стъклени плочи за тежест.
Wipe off the reverse of the gel carrier sheet with kerosene, then drip a few drops of kerosene (4.2) onto the centre of the cooling block.
След завършването на полимеризацията (около 60 минути) полимеризираният гел върху плочата носител на гела и върху покривния лист се изважда чрез разделяне на стъклените плочи.
Then roll the gel sandwich, carrier side down, onto it, taking care to avoid bubbles.
Обратната страна на листа носител се почиства внимателно, за да се отстранят остатъците от гела и уреата.
Wipe off any excess kerosene and remove the cover sheet.
„Гел-сандвичът“ се навива и залепва на тръбичка и се съхранява в хладилник (максимум шест седмици).
Soak the electrode strips with the electrode solutions (4.3, 4.4), cut to gel length and place in the positions provided (distance of electrodes 9,5 cm).
Забележка: Покривният лист с ограничителите може да бъде използван повторно.
Conditions for isoelectric focusing:
Полиакриламидният гел може да бъде нарязан на по-малки части, което е препоръчително, когато има няколко проби или ако се използва автоматично устройство за електрофореза (два гела, с размер 4,5 × 5 сm).
Gel size 265 × 125 × 0,25 mm
Изоелектрическо фокусиране
Step
Охлаждащият термостат се настройва на 12 °C.
Voltage
Обратната страна на листа носител на гел се избърсва с керосин, след това в центъра на охлаждащия блок се капват няколко капки керосин (4.2.).
Current
След това „гел-сандвичът“ се разстила върху него със страната на носителя надолу, като се внимава да не се образуват мехурчета.
Power
Излишният керосин се избърсва и покривният лист се отстранява.
Volt-hours
Електродните ленти се напояват с електродните разтвори (4.3, 4.4), изрязват се до дължината на гела и се поставят на предвидените места (разстояние на електродите 9,5 cm).
Pre-focusing
Условия за изоелектрическо фокусиране:
maximum
Размер на гела 265 × 125 × 0,25 mm
constant 4
Стъпка
Sample focusing
Електрическо напрежение
Final focusing
Електрически ток
Note: If thickness or width of the gels are changed, the values for current and power have to be suitably adjusted (e.g. double the values for electric current and power if a 265 × 125 × 0,5 mm gel is used).
Мощност
Example of a voltage programme for an automatic electrophoresis device (2 gels of 5,0 × 4,5 cm), electrodes without strips applied directly to the gel
Волт-часове
Temp.
Предварително фокусиране
Focusing
максимум
Place sample applicator in step 2 at 0 Vh.
постоянна 4 ок.
Remove sample applicator in step 2 at 30 Vh.
Фокусиране на пробата
Protein staining
Окончателно фокусиране
Protein fixation
Забележка: Ако плътността или ширината на геловете се променят, стойностите за електрически ток и мощност следва да се адаптират по подходящ начин (напр. удвояване на стойностите за електрически ток и за мощност, ако се използва гел с размери 265 × 125 × 0,5 mm).
Remove the electrode strips immediately after turning off the power and put the gel immediately into a staining/destaining dish filled with 200 ml fixative (4.9); leave for 15 minutes, shaking continuously.
Пример за програмиране на автоматично устройство за електрофореза (2 гела с размери 5,0 × 4,5 cm); електродите без ленти се поставят направо върху гела
Washing and staining the gel plate
Температура
Thoroughly drain off the fixative and wash the gel plate twice for 30 seconds each time with 100 ml destaining solution (4.10).
Фокусиране
Pour off the destaining solution and fill the dish with 250 ml staining solution (4.11.3); allow to stain for 45 minutes with gentle shaking.
В стъпка 2 апликаторът на пробата се поставя на 0 Vh.
Destaining the gel plate
В стъпка 2 апликаторът на пробата се отстранява при 30 Vh.
Pour off the staining solution, wash the gel plate twice using a 100 ml destaining solution (4.10) each time, then shake with 200 ml destaining solution for 15 minutes and repeat the destaining step at least two or three times until the background is clear and uncoloured.
Оцветяване на протеин
Then rinse the gel plate with distilled water (2 × 2 minutes) and dry in the air (2 to 3 hours) or with a hairdryer (10 to 15 minutes).
Фиксиране на протеин
Note 1: Carry out fixing, washing, staining and destaining at 20 °C.
Електродните ленти се отстраняват веднага след изключване на захранването и гелът незабавно се поставя в съд за оцветяване/обезцветяване, пълен с 200 ml фиксатор (4.9); оставя се за 15 минути, като непрекъснато се разклаща.
Do not use elevated temperatures.
Измиване и оцветяване на плочата с гел
Note 2: If more sensitive silver staining (e.g. Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, Code No 17-1150-01) is preferred, plasmin-treated casein samples have to be diluted to 5 mg/ml.
Фиксаторът се отцежда внимателно и плочата с гел се измива два пъти за по 30 секунди, всеки път със 100 ml обезцветяващ разтвор (4.10).
EVALUATION
Обезцветяващият разтвор се излива и съдът се пълни с 250 ml оцветяващ разтвор (4.11.3); оставя се да се оцвети за 45 минути с леко разклащане.
Evaluation is performed by comparing the protein patterns of the unknown sample with reference standards on the same gel.
Обезцветяване на плочата с гел
Detection of cow's milk in cheeses from ewe's milk, goat's milk and buffalo milk and mixtures of ewe's, goat's and buffalo milk is done via the γ3- and γ2-caseins, whose isoelectric points range between pH 6,5 and pH 7,5 (Figures 4 a, b, Figure 5).
Оцветяващият разтвор се излива, плочата с гел се измива два пъти, като всеки път се използва по 100 ml обезцветяващ разтвор (4.10), след това се разклаща с 200 ml обезцветяващ разтвор за 15 минути и обезцветяването се повтаря най-малко два или три пъти, докато основата стане чиста и безцветна.
The detection limit is less than 0,5 %.
След това плочата с гел се изплаква с дестилирана вода (2 × 2 минути) и се изсушава на въздух (от 2 до 3 часа) или със сешоар (от 10 до 15 минути).
Visual estimation
Забележка 1: Фиксирането, измиването, оцветяването и обезцветяването се извършват при 20 °C.
For visual evaluation of the amount of bovine milk it is advisable to adjust the concentrations of samples and standards to obtain the same level of intensity of the ovine, caprine and/or buffalo γ2- and γ3-caseins (see ‘γ2 E,G,B’ and ‘γ3 E,G,B’ in Figures 4 a, b and Figure 5).
Да не се използват високи температури.
After which the amount of bovine milk (less than, equal to or greater than 1 %) in the unknown sample can be judged directly by comparing the intensity of the bovine γ3- and γ2-caseins (see ‘γ3 C’ and ‘γ2 C’ in Figures 4 a, b and Figure 5) to those of the 0 % and 1 % reference standards (ewe, goat) or, laboratory interim-standards (buffalo).
Забележка 2: Ако се предпочита по-чувствително сребърно оцветяване (напр. кит за сребърно оцветяване, протеин, Pharmacia Biotech, код No 17-1150-01), пробите от казеин, третирани с плазмин, следва да бъдат разредени до 5 mg/ml.
Densitometric estimation
ОЦЕНКА
If available, apply densitometry (5.19) for the determination of the peak area ratio of bovine to ovine, caprine and/or buffalo γ2- and γ3-caseins (see Figure 5).
Оценяването се извършва чрез сравняване на ивиците на протеините в непознатата проба с референтни проби върху същия гел.
Compare this value to γ2- and γ3-casein peak area ratio of the 1 % reference standard (ewe, goat) or laboratory interim-standard (buffalo) analysed on the same gel.
Откриването на краве мляко в сирена, произведени от овче мляко, козе мляко, биволско мляко, или смеси от овче, козе и биволско мляко, се извършва чрез γ3- и γ2-казеини, чийто обхват на изоелектрически точки е между pH 6,5 и pH 7,5 (фигури 4 a и б, фигура 5).
Note: The method is operating satisfactorily, if there is a clear positive signal for both bovine γ2- and γ3-caseins in the 1 % reference standard but not in the 0 % reference standard.
Границата на откриване е по-ниска от 0,5 %.
If not, optimize the procedure following the details of the method precisely.
Визуална оценка
A sample is judged as being positive, if both bovine γ2- and γ3-caseins or the corresponding peak area ratios are equal to or greater than the level of the 1 % reference standard.
За визуална оценка на количеството краве мляко се препоръчва да се адаптират концентрациите на пробите и стандартите за получаване на същото ниво на интензивност на овчи, кози и/или биволски γ2- и γ3-казеини (виж „γ2 E,G,B“ и „γ3 E,G,B“ на фигури 4 a и б и фигура 5).
Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I, Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins.
След това количеството на кравето мляко (по-малко от, равно на или по-голямо от 1 %) в непознатата проба може да бъде оценявано директно чрез сравняване на интензитета на крави γ3- и γ2-казеини (виж „γ3 C“ и „γ2 C“ на фигури 4 a и б и фигура 5) с тези на 0 % и 1 % референтни стандарти (овчи, кози) или вътрешнолабораторни стандарти (биволски).
Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990).
Денсиметрична оценка
Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting.
Ако е приложимо, за определянето на съотношението на площта на пика на крави спрямо овчи, кози и/или биволски γ2- и γ3-казеини (вж. фигура 5) се използва денсиметър (5.19).
Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995).
Тази стойност се сравнява със съотношението на площта на пика на γ2- и γ3-казеини от 1 % референтния стандарт (овчи, кози) или вътрешнолабораторен стандарт (биволски), анализирани върху същия гел.
Krause I., Berner I, Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte — and carrier ampholyte/immobilized pH gradient — isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier. in: Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radola, ed.) pp 389-393, Bode-Verlag, München (1989).
Забележка: Методът функционира задоволително, ако има ясен положителен сигнал за двата крави γ2- и γ3-казеина в 1 % референтния стандарт, но не и в 0 % референтния стандарт.
-käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen.
Ако няма, процедурата се оптимизира, като точно се спазват детайлите на метода.
Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films.
Пробата се оценява като положителна, ако двата крави γ2- и γ3-казеина или съответните съотношения на площта на пиковете са равни или по-големи от нивото на 1 % референтен стандарт.
Electrophoresis 1, 43-56 (1980).
Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I, Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins.
Schematic drawing of the covering sheet
(Използване на плазмин за увеличаване на чувствителността на откриване на краве мляко в овче и/или козе сирене с изоелектрическо фокусиране с гел на γ2-казеини).
Polyester sheet
Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990 г.).
Spacer tape
Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting (Контролен метод за откриване на краве мляко в овче и биволско сирене чрез използване на имуноблотинг).
Figure 2
Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995 г.).
Casein layer floating between aqueous and organic phases after centrifugation
Krause I., Berner I, Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte — and carrier ampholyte/immobilized pH gradient — isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier (Чувствително откриване на краве мляко в овче и козе мляко и сирене чрез амфолит-носител и амфолит-носител/неутрализиран pH градиент — изоелектрическо фокусиране на γ-казеини с помощта на плазмин като индикаторен фермент) в: Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radola, ed.), стр 389—393, Bode-Verlag, München (1989 г.).
H2O-Phase
-käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen (Откриване на краве мляко в овче и козе мляко и сирене чрез изоелектрическо фокусиране в полиакриламидни гелове, съдържащи уреа).
Casein
Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films (Изоелектрическо фокусиране със свръхтънък слой в 50-100 μm полиакриламидни гелове върху силанизирани стъклени съдове или полиестерни филми).
CH2Cl2-Phase
Electrophoresis 1, 43-56 (1980 г.).
Figure 3
Схематично представяне на покривния лист
Flapping technique for casting of ultrathin polyacrylamide gels
Полиестерен лист
a = spacer tape (0,25 mm); b = covering sheet (5.3); c, e = glass plates (5.1); d = gel solution (4.1.2); f = gel carrier sheet (5.2)
Разделителна лента
Figure 4a
Фигура 2
Isoelectric focusing of plasmin-treated caseins from ewe's and goat's milk cheese containing different amounts of cow's milk.
Слой казеин между водната и органичната фази след центрофугиране
% CM = percentage of cow's milk, C = cow, E = ewe, G = goat
H2O-фаза
Upper half of the IEF gel is shown.
Казеин
Figure 4b
CH2Cl2-фаза
Isoelectric focusing of plasmin treated caseins from cheese made from mixtures of ewe's, goat's and buffalo milk containing different amounts of cow's milk.
Фигура 3
% CM = percentage of cow's milk; 1 + = sample containing 1 % of cow's milk and spiked with pure bovine casein at the middle of the track.
Техника на захлупване за изливане на свръхтънки полиакриламидни гелове
C = cow, E = ewe, G = goat, B = buffalo.
a = разделителна лента (0,25 mm); b = покривен лист (5.3); c, e = стъклени плочи (5.1); d = разтвор на гел (4.1.2); f = лист носител на гел (5.2)
Total separation distance of the IEF gel is shown.
Фигура 4a
Figure 5
Изоелектрическо фокусиране на третирани с плазмин казеини от сирене, произведено от овче и от козе мляко и съдържащо различни количества краве мляко
Superposition of densitograms of standards (STD) and cheese samples made from a mixture of ewe's and goat's milk after isoelectric focusing.
% CM = процент краве мляко, C = краве, E = овче, G = козе
a,b = standards containing 0 and 1 % of cow's milk; c-g = cheese samples containing 0, 1, 2, 3 and 7 % of cow's milk.
Показана е горната половина на гел IEF.
C = cow, E = ewe, G = goat.
Фигура 4б
Upper half of the IEF gel was scanned at λ = 634 nm.
Изоелектрическо фокусиране на третирани с плазмин казеини от сирене, произведено от смеси от овче, козе и биволско мляко и съдържащо различни количества краве мляко
Sample application: After pre-focusing (step 1), pipette 18 μl of the sample and standard solutions onto the sample applicators (10 × 5 mm), place them on the gel at 1 mm intervals from each other and 5 mm longitudinally from the anode and press lightly.
% CM = процент краве мляко; 1 + = проба, съдържаща 1 % краве мляко и прибавен чист крави казеин в средата на пътеката.
Carry out focusing using the above conditions, carefully removing the sample applicators after the 60 minutes of sample focusing.
C = краве, E = овче, G = козе, B = биволско
ANNEX IX
Показано е общото разстояние на разделяне на гела IEF.
Evaluation of the analyses
Фигура 5
Quality assurance
Поредица денситограми на стандартните проби (STD) и пробите сирене, произведено от смес от овче и козе мляко, след изоелектрическо фокусиране
Analyses shall be performed by laboratories designated in accordance with Article 12 of Regulation (EC) No 882/2004 (**) or designated by the competent authorities of the Member State.
a,b = стандартни проби, съдържащи 0 и 1 % краве мляко; c-g = проби сирене, съдържащи 0, 1, 2, 3 и 7 % краве мляко.
Sampling and disputes over the results of analysis
C = краве, E = овче, G = козе.
Sampling shall be carried out in accordance with the relevant regulation for the product under consideration.
Сканирана е горната половина от гела IEF при λ = 634 nm.
If no sampling provisions are expressly provided for, then the provisions laid down in ISO 707, Milk and milk products – Guidance on sampling, shall be used.
Поставяне на пробата: след предварителното фокусиране (стъпка 1) върху апликаторите на проби (10 × 5 mm) се капват 18 μl от пробата и от стандартните разтвори, поставят се върху гела на разстояние 1 mm един от друг и на 5 mm надлъжно от анода и се притискат леко.
Laboratory reports of the results of the analysis shall contain sufficient information to allow an evaluation of the results to be carried out in accordance with the Appendix.
Извършва се фокусирането при горните условия, като апликаторите на проби се отстраняват внимателно след 60 минути фокусиране.
Duplicate samples shall be taken for analyses required under Union rules.
ПРИЛОЖЕНИЕ IX
If a dispute arises over the results, the paying agency shall have the necessary analysis on the product in question carried out again, and the cost shall be met by the losing party.
Оценка на анализите
The above mentioned analysis shall be carried out provided that sealed duplicate samples of the product are available and have been stored appropriately with the competent authority.
Осигуряване на качеството
The manufacturer shall send a request to the paying agency to conduct the analysis within 7 working days following the notification of the results of the first analysis.
Анализите се извършват от лаборатории, определени в съответствие с член 12 от Регламент (ЕО) № 882/2004 (**), или определени от компетентните органи на държавата членка.
The analysis shall be carried out by the paying agency within 21 working days following receipt of the request.
Вземане на проби и оспорвания на резултатите от анализите
The appeal result shall be the definitive one.
Вземането на проби трябва да се извършва съгласно съответната правна уредба за разглеждания продукт.
If the manufacturer can prove, within five working days of sampling, that the sampling procedure was not carried out correctly, sampling shall be repeated where possible.
Ако не са изрично предвидени разпоредби относно вземането на проби, се прилагат разпоредбите, определени в стандарта ISO 707 — Мляко и млечни продукти.
If sampling cannot be repeated, the consignment shall be accepted.
Указания за вземане на проби.
Evaluation of compliance of a consignment with the legal limit
Лабораторните отчети за резултатите от анализа трябва да съдържат достатъчно информация, за да може да се извърши оценка на резултатите в съответствие с допълнението.
Principle
За анализите, които се изискват съгласно правилата на Съюза, трябва да бъдат вземани двойни проби.
Where public intervention and private storage legislation lay down detailed sampling procedures then those procedures shall be followed.
Ако възникне спор във връзка с резултатите, разплащателната агенция трябва да изисква необходимият анализ на съответния продукт да бъде проведен отново, като разходите се поемат от губещата страна.
In all other cases a sample of at least 3 sample units taken randomly from the consignment submitted to control shall be used.
Горепосоченият анализ се извършва, при условие че са налични запечатани дублиращи проби от продукта, които се съхраняват по подходящ начин от компетентния орган.
A composite sample may be prepared.
В рамките на 7 работни дни от съобщаването на резултатите от първия анализ производителят изпраща искане до разплащателната агенция за извършване на анализ.
The result obtained shall be compared with the legal limits by calculation of a 95 % confidence interval as 2 x standard deviation, where the relevant standard deviation depends on whether (1) the method is validated through international collaboration with values for σr and σR or (2) in the case of in-house validation, an internal reproducibility has been calculated.
Разплащателната агенция извършва анализа в рамките на 21 работни дни след получаване на искането.
This confidence interval will then equate to the measurement uncertainty of the result.
Резултатът от повторния анализ е окончателен.
The method is validated through international collaboration