natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Изходни разтвори на цистеин (Ac-RFAACAA-COOH) и лизин (Ac-RFAAKAA-COOH), съдържащи синтетични пептиди с чистота над 85 % и за предпочитане в обхвата 90-95 %, трябва да бъдат прясно приготвени непосредствено преди инкубирането им с изпитвания химикал.
In addition, reference controls (i.e. samples containing only the peptide dissolved in the appropriate solvent) should also be included in the HPLC run sequence and these are used to verify the HPLC system suitability prior to the analysis (reference controls A), the stability of the reference controls over time (reference controls B) and to verify that the solvent used to dissolve the test chemical does not impact the percent peptide depletion (reference controls C) (see Appendix 3).
Крайната концентрация на цистеинсъдържащия пептид следва да бъде 0,667 mM в фосфатен буфер с pH 7,5, а крайна концентрация на лизинсъдържащия пептид следва да бъде 0,667 mM в буфер амониев ацетат с pH 10,2.
The appropriate reference control for each chemical is used to calculate the percent peptide depletion for that chemical (see paragraph 26).
Аналитичните серии на анализа с HPLC следва да се планират така, че анализът с HPLC да отнема по-малко от 30 часа.
In addition a co-elution control constituted by the test chemical alone for each of the test chemicals analysed should be included in the run sequence to detect possible co-elution of the test chemical with either the lysine or the cysteine peptide.
За планирането на HPLC, използвано в изследването за валидиране и описано в настоящия метод за изпитване, в една отделна HPLC серия могат да бъдат включени до 26 проби (които включват изпитвания химикал, положителната контрола и подходящия брой контроли на разтворител въз основа на броя на отделните разтворители, използвани в изпитването, всяко от тях изпитвано в три повторения).
Incubation of the test chemical with the cysteine and lysine peptide solutions
За всички повторения, анализирани в една и съща серия, следва да се използват идентични изходни разтвори на цистеинсъдържащи и лизинсъдържащи пептиди.
Cysteine and lysine peptide solutions should be incubated in glass autosampler vials with the test chemical at 1:10 and 1:50 ratio respectively.
Препоръчително е преди да се използват индивидуалните партиди от пептиди, да се докаже подходящата им разтворимост.
If a precipitate is observed immediately upon addition of the test chemical solution to the peptide solution, due to low aqueous solubility of the test chemical, in this case one cannot be sure how much test chemical remained in the solution to react with the peptide.
Приготвяне на изпитвания химикал
Therefore, in such a case, a positive result could still be used, but a negative result is uncertain and should be interpreted with due care (see also provisions in paragraph 11 for the testing of chemicals not soluble up to a concentration of 100 mM).
Разтворимостта на изпитвания химикал в подходящ разтворител следва да бъде определена преди извършването на изследването, като се следва процедурата по разтваряне, описана в DB-ALM протокола за DPRA (20).
The reaction solution should be left in the dark at 25 ± 2,5 °C for 24 ± 2 hours before running the HPLC analysis.
Подходящият разтворител ще разтвори изпитвания химикал напълно.
Each test chemical should be analysed in triplicate for both peptides.
Тъй като в DPRA изпитваният химикал се инкубира в голям излишък на цистеинсъдържащия или на лизинсъдържащия пептид, визуалната проверка за образуването на бистър разтвор се счита за достатъчна за гарантиране, че изпитваният химикал (и всички негови компоненти в случай на изпитване на вещество с повече съставки или на смес) е разтворен.
Samples have to be visually inspected prior to HPLC analysis.
Подходящи разтворители са ацетонитрил, вода, 1:1 смес вода:ацетонитрил, изопропанол, ацетон или смес в съотношение 1:1 ацетон:ацетонитрил.
If a precipitate or phase separation is observed, samples may be centrifuged at low speed (100-400 xg) to force precipitate to the bottom of the vial as a precaution since large amounts of precipitate may clog the HPLC tubing or columns.
Могат да бъдат използвани други разтворители, когато те не оказват влияние върху стабилността на пептида, при наблюдение с референтни контроли C (т.е. проби, състоящи се само от пептида, разтворен в подходящ разтворител; виж допълнение 3).
If a precipitation or phase separation is observed after the incubation period, peptide depletion may be underestimated and a conclusion on the lack of reactivity cannot be drawn with sufficient confidence in case of a negative result.
Като последна възможност, ако изпитваният химикал не е разтворим в никой от посочените разтворители, следва да се направи опит за разтварянето му в 300 μl DMSO и за разреждане на получения разтвор с 2700 μl ацетонитрил, и ако изпитваният химикал не е разтворим в тази смес, следва да се направят опити за разтваряне на същото количество от изпитвания химикал в 1500 μl DMSO и да се разреди полученият разтвор с 1500 μl ацетонитрил.
Preparation of the HPLC standard calibration curve
Изпитваният химикал следва да бъде предварително претеглен в стъклени флакони и разтворен непосредствено преди изпитването в подходящ разтворител, за изготвяне на 100 mM разтвор.
A standard calibration curve should be generated for both the cysteine and the lysine peptides.
За смеси и за вещества, включващи повече съставки с известен състав, една чистота следва да се определи от сбора от дяловете на нейните съставки (с изключение на вода), и едно привидно молекулно тегло трябва да се определи, като се отчетат отделните молекулни тегла на всяка съставка в сместа (с изключение на вода) и техните дялове.
Peptide standards should be prepared in a solution of 20 % or 25 % acetonitrile:buffer using phosphate buffer (pH 7,5) for the cysteine peptide and ammonium acetate buffer (pH 10,2) for the lysine peptide.
След това получените чистота и привидно молекулно тегло трябва да се използват за изчисляване на теглото на изпитвания химикал, необходимо за изготвяне на 100 mM разтвор.
Using serial dilution standards of the peptide stock solution (0,667 mM), 6 calibration solutions should be prepared to cover the range from 0,534 to 0,0167 mM.
За полимери, за които не може да бъде определено преобладаващо молекулно тегло, за изготвяне на 100 mM разтвор може да се вземе предвид молекулното тегло на мономера (или привидното молекулното тегло на различните мономери, съставляващи полимера).
A blank of the dilution buffer should also be included in the standard calibration curve.
Независимо от това, при изпитването на смеси, вещества с повече съставки или полимери с известен състав, също следва да се вземе предвид изпитване на чистия химикал.
Suitable calibration curves should have an r2 > 0,99.
За течности чистият химикал трябва да бъде изпитван като такъв, без предварително разреждане, чрез инкубирането му при моларно отношение от 1:10 и 1:50 съответно с цистеинсъдържащите и лизинсъдържащите пептиди.
HPLC preparation and analysis
За твърди вещества изпитваният химикал следва да се разтвори в максималната си концентрация на разтваряне в същия разтворител, който е използван за приготвяне на разтвора с привидна концентрация 100 mM.
The suitability of the HPLC system should be verified before conducting the analysis.
След това той трябва да бъде изпитван като такъв, без последващо разреждане, чрез инкубирането му при моларно отношение от 1:10 и 1:50 съответно с цистеинсъдържащите и лизинсъдържащите пептиди.
Peptide depletion is monitored by HPLC coupled with an UV detector (photodiode array detector or fixed wavelength absorbance detector with 220 nm signal).
Непротиворечивите резултати (наличие или отсъствие на реакция) между разтвора с привидна концентрация 100 mM и чистия химикал следва да позволят да се направи категорично заключение относно резултата.
The appropriate column is installed in the HPLC system.
Приготвяне на положителната контрола, референтните контроли и контролите за коелуиране
The HPLC set-up described in the validated protocol uses a Zorbax SB-C-18 2,1 mm × 100 mm × 3,5 micron as preferred column.
Канелен алдехид (CAS 104-55-2; ≥95 % чистота) за хранителни цели следва да бъде използван като положителна контрола (ПК) при концентрация от 100 mM в ацетонитрил.
With this reversed-phase HPLC column, the entire system should be equilibrated at 30 °C with 50 % phase A (0,1 % (v/v) trifluoroacetic acid in water) and 50 % phase B (0,085 % (v/v) trifluoroacetic acid in acetonitrile) for at least 2 hours before running.
Могат да се използват други подходящи положителни контроли, за предпочитане даващи стойности на изчерпването в средата на обхвата, ако са налични данни за предходни периоди, от които могат да се изведат сравними критерии за приемливост на серията.
The HPLC analysis should be performed using a flow rate of 0,35 ml/min and a linear gradient from 10 % to 25 % acetonitrile over 10 minutes, followed by a rapid increase to 90 % acetonitrile to remove other materials.
Освен това в аналитичната серия за анализа с HPLC следва също така да се включат референтни контроли (т.е. проби, съдържащи само пептида, разтворен в подходящия разтворител), като те се използват за проверка на пригодността на HPLC системата преди анализа (референтни контроли A), стабилността на референтните контроли във времето (референтни контроли B) и за проверка дали разтворителят, използван за разтваряне на изпитвания химикал, не оказва влияние върху процентното изчерпване на пептиди (референтни контроли C) (вж. допълнение 3).
Equal volumes of each standard, sample and control should be injected.
Подходящата референтна контрола за всеки химикал се използва, за да се изчисли процентното изчерпване на пептиди за този химикал (вж. точка 26).
The column should be re-equilibrated under initial conditions for 7 minutes between injections.
Освен това в серията трябва да бъде включена контрола за коелуиране, състояща се само от изпитвания химикал поотделно за всеки от изпитваните химикали, за откриване на евентуално коелуиране на изпитвания химикал с лизинсъдържащия или с цистеинсъдържащия пептид.
If a different reversed-phase HPLC column is used, the set-up parameters described above may need to be adjusted to guarantee an appropriate elution and integration of the cysteine and lysine peptides, including the injection volume, which may vary according to the system used (typically in the range from 3-10 μl).
Инкубиране на изпитвания химикал с разтворите на лизинсъдържащия и цистеинсъдържащия пептиди
Importantly, if an alternative HPLC set-up is used, its equivalence to the validated set-up described above should be demonstrated (e.g. by testing the proficiency substances in Appendix 2).
Разтворите на цистеинсъдържащия и лизинсъдържащия пептид трябва да бъдат инкубирани в стъклени автоматични дозатори с изпитвания химикал в съотношение 1:10 и 1:50 съответно.
Absorbance is monitored at 220 nm.
Ако се наблюдава утайка незабавно след добавяне на разтвора на изпитвания химикал в разтвор на пептида, поради малка разтворимост във вода на изпитвания химикал, в този случай не е сигурно колко от изпитвания химикал е останал в разтвора за реакция с пептида.
If a photodiode array detector is used, absorbance at 258 nm should also be recorded.
Ето защо в такъв случай положителният резултат би могъл все още да се използва, но отрицателният резултат е несигурен и следва да се тълкува внимателно (вж. също така разпоредбите в точка 11 за изпитването на химикали, които не се разтварят до концентрация от 100 mM).
It should be noted that some supplies of acetonitrile could have a negative impact on peptide stability and this has to be assessed when a new batch of acetonitrile is used.
Разтворът с реагентите следва да бъде оставен на тъмно при температура 25±2.5°C за 24±2 часа преди стартирането на HPLC анализа.
The ratio of the 220 peak area and the 258 peak area can be used as an indicator of co-elution.
Всеки изпитван химикал следва да бъде анализиран в три повторения и за двата пептида.
For each sample a ratio in the range of 90 % < mean [13] area ratio of control samples < 100 % would give a good indication that co-elution has not occurred.
Пробите трябва да се проверят визуално преди HPLC анализа.
There may be test chemicals which could promote the oxidation of the cysteine peptide.
Ако се образува утайка или се наблюдава разделяне на фази, пробите могат да се центрофугират при ниска скорост (100-400xg), за да се предизвика утаяване на дъното на флакона като предпазна мярка, тъй като големите количества утайка могат да задръстят тръбичките и колоните при HPLC.
The peak of the dimerised cysteine peptide may be visually monitored.
Ако след инкубационния период се наблюдава утаяване или разделяне на фазите, пептидното изчерпване може да бъде подценено и в случай на отрицателен резултат не може да се направи заключение с достатъчна сигурност за отсъствието на реакционна способност.
If dimerisation appears to have occurred, this should be noted as percent peptide depletion may be over-estimated leading to false positive predictions and/or assignment to a higher reactivity class (see paragraphs 29 and 30).
Построяване на стандартната калибрационна крива за HPLC
HPLC analysis for the cysteine and lysine peptides can be performed concurrently (if two HPLC systems are available) or on separate days.
Следва да бъде генерирана стандартна калибрационна крива както за цистеинсъдържащия, така и за лизинсъдържащия пептид.
If analysis is conducted on separate days then all test chemical solutions should be freshly prepared for both assays on each day.
Пептидните еталони следва да се приготвят в разтвор от 20 % или 25 % ацетонитрил: буфер, с използване на фосфатен буфер (рН 7,5) за цистеинсъдържащия пептид, и буфер амониев ацетат (pH 10,2) за лизинсъдържащия пептид.
The analysis should be timed to assure that the injection of the first sample starts 22 to 26 hours after the test chemical was mixed with the peptide solution.
Чрез еталони, получени след поредица от разреждания на пептидния изходен разтвор (0,667 mM), следва да се приготвят 6 калибрационни разтвора, които да покриват обхвата от 0,534 до 0,0167 mM.
For the HPLC set up used in the validation study and described in this test method, up to 26 analysis samples can be accommodated in a single HPLC run (see also paragraph 17).
В стандартната калибрационна крива следва също да бъде включена празна проба от буфера за разреждане.
An example of HPLC analysis sequence is provided in Appendix 3.
Подходящите калибрационни криви трябва да са с r2 > 0,99.
Data evaluation
Подготовка и анализ с HPLC
The concentration of cysteine or lysine peptide is photometrically determined at 220 nm in each sample by measuring the peak area (area under the curve, AUC) of the appropriate peaks and by calculating the concentration of peptide using the linear calibration curve derived from the standards.
Пригодността на системата за HPLC следва да се провери преди извършването на анализа.
The percent peptide depletion is determined in each sample by measuring the peak area and dividing it by the mean peak area of the relevant reference controls C (see Appendix 3) according to the formula described below.
Пептидното изчерпване се контролира чрез HPLC с UV детектор (детектор с фотодиодна матрица или абсорбционен детектор с фиксирана дължина на вълната 220 nm).
Percent peptide depletion
Съответната колона се инсталира в системата за HPLC.
Peptide peak area in replicate injection
В плана за HPLC, описан във валидирания протокол, като предпочитана колона се използва Zorbax SB-C-18 2,1 mm × 100 mm × 3,5 микрона.
ean peptide peak area in reference controls C
С тази колона за високоефективна течна хроматография с обърната фаза цялата система трябва да се уравновесява при 30 °C с 50 % фаза A (0,1 % v/v трифлуорооцетна киселина във вода) и 50 % за фаза Б (0,085 % v/v трифлуорооцетна киселина в ацетонитрил) най-малко 2 часа преди стартирането.
Acceptance criteria
HPLC анализът трябва да бъде извършен при скорост на потока 0,35 ml/min и линеен градиент от 10 % до 25 % ацетонитрил в продължение на 10 минути, последван от бързо нарастване до 90 % ацетонитрил за отстраняване на други материали.
The following criteria should be met for a run to be considered valid:
Следва да се инжектират равни обеми от всеки еталон, проба и контрола.
the standard calibration curve should have an r2 > 0,99,
Колоната трябва да бъде повторно уравновесявана на първоначалните условия в продължение на 7 минути между инжектиранията.
the mean percent peptide depletion value of the three replicates for the positive control cinnamic aldehyde should be between 60,8 % and 100 % for the cysteine peptide and between 40,2 % and 69,0 % for the lysine peptide and the maximum standard deviation (SD) for the positive control replicates should be < 14,9 % for the percent cysteine depletion and < 11,6 % for the percent lysine depletion, and
Ако се използва различна колона за HPLC с обърната фаза, може да се наложи планираните параметри, описани по-горе, да се коригират, за да се гарантира подходящо елуиране и интегриране на цистеинсъдържащите и лизинсъдържащите пептиди, а също и обема на инжектиране, който може да варира според използваната система (обикновено в интервала от 3-10 μl).
the mean peptide concentration of reference controls A should be 0,50 ± 0,05 mM and the coefficient of variation (CV) of peptide peak areas for the nine reference controls B and C in acetonitrile should be < 15,0 %.
Важно е, ако се използва алтернативен план за HPLC, да бъде доказана неговата еквивалентност с валидирания план, описан по-горе (например чрез изпитване на веществата за изпитването за пригодност, изброени в допълнение 2).
If one or more of these criteria is not met the run should be repeated.
Абсорбцията се наблюдава при 220 nm.
The following criteria should be met for a test chemical's results to be considered valid:
Ако се използва детектор с фотодиодна матрица, следва да бъде записана също и абсорбцията при 258 nm.
the maximum standard deviation for the test chemical replicates should be < 14,9 % for the percent cysteine depletion and < 11,6 % for the percent lysine depletion,
Следва да се отбележи, че някои доставки на ацетонитрил могат да окажат отрицателно въздействие върху пептидната стабилност и това трябва да бъде оценено, когато се използва нова партида ацетонитрил.
the mean peptide concentration of the three reference controls C in the appropriate solvent should be 0,50 ± 0,05 mM.
Отношението на площта на пика при 220 nm и площта на пика при 258 nm може да бъде използвано като показател за коелуиране.
If these criteria are not met the data should be rejected and the run should be repeated for that specific test chemical.
За всяка проба съотношение в интервала от 90 % < средна стойност [13] на отношението на площите за контролните проби <100 % би било добър показател за това, че не е имало коелуиране.
Prediction model
Може да има изпитвани химикали, които да подпомагат окисляването на цистеинсъдържащия пептид.
The mean percent cysteine and percent lysine depletion value is calculated for each test chemical.
Пикът на пептида, съдържащ димеризиран цистеин, може да бъде наблюдаван визуално.
Negative depletion is considered as “0” when calculating the mean.
Ако изглежда, че е настъпила димеризация, това следва да се отбележи, тъй като процентът на пептидно изчерпване може да бъде надценен, което да доведе до неверни положителни прогнози и/или класифициране в по-висок клас за реакционна способност (вж. точки 29 и 30).
By using the cysteine 1:10/lysine 1:50 prediction model shown in Table 1, the threshold of 6,38 % average peptide depletion should be used to support the discrimination between skin sensitisers and non-sensitisers in the framework of an IATA.
Анализът с HPLC за цистеинсъдържащи и лизинсъдържащи пептиди може да се извършва паралелно (ако са налични две системи за HPLC) или в различни дни.
Application of the prediction model for assigning a test chemical to a reactivity class (i.e. low, moderate and high reactivity) may perhaps prove useful to inform potency assessment within the framework of an IATA.
В случай че анализът се провежда в различни дни, всички разтвори с изпитвани химикали следва да бъдат прясно приготвени за двете изследвания през съответния ден на провеждането.
Cysteine 1:10/lysine 1:50 prediction model [14]
Графикът за анализа следва да бъде изготвен така, че да се гарантира, че инжектирането на първата проба започва от 22 до 26 часа след смесването на изпитвания химикал с пептидния разтвор.
Mean of cysteine and lysine % depletion
За планирането на HPLC, използвано в изследването за валидиране и описано в настоящия метод за изпитване, в една отделна HPLC серия могат да бъдат включени до 26 проби (вж. също точка 17).
Reactivity Class
Пример за серия за анализ с HPLC е даден в приложение 3.
DPRA Prediction [15]
Оценка на данните
0 % ≤ mean % depletion ≤ 6,38 %
Концентрацията на цистеинсъдържащия или на лизинсъдържащия пептид се определя фотометрично при 220 nm във всяка проба чрез измерване на площта на подходящите пикове (площ под кривата, AUC) и чрез изчисляване на концентрацията на пептида, като се използва линейната калибрационна крива, получена от еталоните.
No or minimal reactivity
Процентът на пептидно изчерпване се определя във всяка проба, като се измерва площта на пика и стойността на тази площ се разделя на средната пикова площ на относимата референтна контрола C (вж. допълнение 3) съгласно формулата, описана по-долу.
Negative
Процент пептидно изчерпване
6,38 % < mean % depletion ≤ 22,62 %
Пикова площ на пептида в повторението
Low reactivity
Средна пикова площ на пептида в рефер. контроли С
Positive
Критерии за приемливост
22,62 % < mean % depletion ≤ 42,47 %
Следните критерии трябва да бъдат изпълнени, за да се счита за валидна дадена серия:
Moderate reactivity
стандартната калибрационна крива трябва да е с r2 > 0,99.
42,47 % < mean % depletion ≤ 100 %
средната стойност на процента на пептидно изчерпване на трите повторения за положителната контрола канелен алдехид трябва да е между 60,8 % и 100 % за цистеинсъдържащия пептид, между 40,2 % и 69,0 % за лизинсъдържащия пептид, максималното стандартно отклонение (SD) за повторенията на положителната контрола трябва да е < 14,9 % за процента на изчерпване на цистеина и < 11,6 % за процента на изчерпване на лизина, и
High reactivity
средната пептидна концентрация на референтните контроли A следва да бъде 0,50±0,05 mM, а коефициентът на вариация (CV) на пептидните пикови площи за деветте референтни контроли B и C в ацетонитрил следва да бъде <15,0 %.
There might be cases where the test chemical (the substance or one or several of the components of a multi-constituent substance or a mixture) absorbs significantly at 220 nm and has the same retention time of the peptide (co-elution).
Ако един или повече от тези критерии не e изпълнен, серията следва да се повтори.
Co-elution may be resolved by slightly adjusting the HPLC set-up in order to further separate the elution time of the test chemical and the peptide.
Следните критерии трябва да бъдат изпълнени, за да се приемат за валидни резултатите от изпитването на даден химикал:
If an alternative HPLC set-up is used to try to resolve co-elution, its equivalence to the validated set-up should be demonstrated (e.g. by testing the proficiency substances in Appendix 2).
максималното стандартно отклонение за повторенията от изпитвания химикал следва да са <14,9 % за процента на изчерпване на цистеина и <11,6 % за процента на изчерпване на лизина,
When co-elution occurs the peak of the peptide cannot be integrated and the calculation of the percent peptide depletion is not possible.
средната пептидна концентрация на трите референтни контроли C в подходящия разтворител следва да бъде 0,50±0,05 mM.
If co-elution of such test chemicals occurs with both the cysteine and the lysine peptides then the analysis should be reported as “inconclusive”.
Ако тези критерии не са изпълнени, данните следва да бъдат отхвърлени и серията трябва да се повтори за конкретния изпитван химикал.
In cases where co-elution occurs only with the lysine peptide, then the cysteine 1:10 prediction model reported in Table 2 can be used.
Модел на прогнозиране
Cysteine 1:10 prediction model [16]
Средният процент на изчерпване на цистеина и процентът изчерпване на лизина се изчислява за всеки изпитван химикал.
Cysteine (Cys) % depletion