natgillin/translations-raw huggingface dataset:
В този случай полът следва да бъде определен чрез наблюдение на гонадата или на вторични полови белези под стереомикроскоп.
Centrifuge the suspended liver homogenate at 13000 g for 10 min at ≤ 5 °C.
Изрязване на черния дроб
However, if the supernatants are adequately separated, centrifugal force and time may be adjusted as needed.
Изпитваните риби се прехвърлят от контейнера за пренасяне в разтвор за подлагане на анестезия с помощта на малкото кепче.
Following centrifugation, check that the supernatants are adequately separated (surface: lipid, intermediate: supernatant, bottom layer: liver tissue).
След анестезирането изпитваните риби се прехвърлят върху филтърната хартия (или хартиена кърпа) с пинсети (разпространени в търговската мрежа).
If the separation is not adequate, centrifuge the suspension again under the same conditions.
При захващането на изпитваните риби пинцетите се прилагат отстрани на главата, за да се предотврати счупването на опашката.
Remove all specimens from the refrigerated centrifuge and arrange them in the order of specimen number on the ice rack.
Водата се избърсва от повърхността на изпитваните риби върху филтърната хартия (или хартиената кърпа).
Be careful not to resuspend each separated layer after the centrifugation.
След това се прави малък напречен разрез между областта на врата вентрално и областта в средата на корема с помощта на ножици за дисекция.
Collection of the supernatant
Ножиците за дисекция се вкарват в малката инцизия и се разрязва коремът от определена точка каудално от бранхиалната мантия до краниално от ануса по средната линия на корема.
Place four 0,5 ml microtubes for storage of the supernatant into the tube rack.
Внимава се ножиците за дисекция да не се вкарват прекомерно дълбоко, за да се избегне увреждане на черния дроб и гонадата.
Collect 30 μl of each supernatant (separated as the intermediate layer) with the micropipette and dispense it to one 0,5 ml microtube.
Под стереомикроскоп се извършват следните операции.
Be careful not to collect the lipid on the surface or the liver tissue in the bottom layer.
Изпитваната риба се поставя с корема нагоре върху хартиената кърпа (стъклено блюдо на Петри или предметно стъкло също така са на разположение).
Collect the supernatant and dispense it to other two 0,5 ml microtubes in the same manner as described above.
Стените на коремната кухина се разширяват с прецизни пинсети и вътрешните органи се екстериоризират.
Collect the rest of the supernatant with the micropipette (if feasible: ≥ 100 μl).
Също така, приемливо е екстериоризирането на вътрешните органи да се извърши чрез отстраняване на едната страна от стената на коремната кухина, ако е необходимо.
Then dispense the supernatant to the remaining 0,5 ml microtube.
С помощта на друг чифт прецизни пинцети се разкрива свързаната част на черния дроб и жлъчния мехур.
Close the cap of the 0,5 ml microtube and write the volume of the supernatant on the label.
След това се захваща жлъчният канал и се прекъсва жлъчният мехур.
Then immediately cool the microtubes on the ice rack.
Внимава се да не се пробие жлъчният мехур.
Change the tip of the micropipette to the new one for each supernatant.
Захваща се хранопроводът и по същия начин стомашно-чревният тракт се изрязва от черния дроб.
If a large amount of lipid becomes attached to the tip, change it to the new one immediately to avoid contamination of the liver extract with fat.
Внимава се да не се допусне изтичане на съдържанието на стомашно-чревния тракт.
Dispense all of the centrifuged supernatant to four 0,5 ml microtubes according to the procedure described above.
Стомашно-чревният тракт се изрязва каудално от ануса и се отстранява от коремната кухина.
After dispensing the supernatant to the 0,5 ml microtubes, place all of them in the tube rack with the identification label, and then freeze them in the freezer immediately.
Отстранява се масата от мазнини и други тъкани от периферията на черния дроб.
If the VTG concentrations are measured immediately after the pre-treatment, keep one 0,5 ml microtube (containing 30 μl of supernatant) cool in the tube rack and transfer it to the workstation where the ELISA assay is conducted.
Внимава се да не се надраска черният дроб.
In such case, place the remaining microtubes in the tube racks and freeze them in the freezer.
С помощта на прецизните пинцети се захваща областта на вратата на черния дроб и черният дроб се отстранява от коремната кухина.
After the collection of the supernatant, discard the residue adequately.
Черният дроб се поставя върху предметното стъкло.
Storage of the specimen
С помощта на прецизните пинцети от повърхността на черния дроб се отстраняват всякакви допълнителни мазнини и чужди тъкани (напр. перитонеумът), ако е необходимо.
Store the 0,5 ml microtubes containing the supernatant of the liver homogenate at ≤ – 70 °C until they are used for the ELISA.
Теглото на черния дроб се измерва като тара с 1,5 ml микроепруветка, с помощта на електронна аналитична везна.
Procedure 3A:
Стойността се вписва в работния лист (точност: 0,1 mg).
Zebrafish, Blood Collection from the Caudal Vein / Artery
Потвърждава се информацията за идентифициране, намираща се върху етикета на микроепруветката.
Immediately following anaesthesia, the caudal peduncle is severed transversely, and the blood is removed from the caudal artery/vein with a heparinised microhematocrit capillary tube.
Капачката на микроепруветката, съдържаща черния дроб, се затваря.
Blood volumes range from 5 to 15 microliters depending on fish size.
Тя се съхранява в охладителен статив (или охладителен статив с лед).
An equal volume of aprotinin buffer (6 micrograms/ml in PBS) is added to the microcapillary tube, and plasma is separated from the blood via centrifugation (5 minutes at 600 g).
След изрязването на всеки черен дроб инструментите за дисекцията се почистват или се заменят с чисти.
Plasma is collected in the test tubes and stored at – 20 °C until analysed for VTG or other proteins of interest.
Отстранява се черният дроб от всички риби, намиращи се в контейнера за пренасяне, както е описано по-горе.
Procedure 3B:
След като черният дроб е изрязан от всички риби в контейнера за пренасяне (т.е. от всички мъжки или женски в дадена камера за изпитване) всички екземпляри от черен дроб се поставят на статив за епруветки с етикет за идентификация и се слагат за съхранение във фризер.
Zebrafish, Blood Collection by Cardiac Puncture
Когато черният дроб се дава за предварителна обработка непосредствено след изрязването, екземплярите се пренасят до следващото работно място в охладителен статив (или охладителен статив с лед).
To avoid coagulation of blood and degradation of protein the samples are collected within Phosphate-buffered saline (PBS) buffer containing heparin (1000 units/ml) and the protease inhibitor aprotinin (2 TIU/ml).
След изрязването на черния дроб трупът на рибата е на разположение за гонадна хистология и за измерване на вторични полови белези.
As ingredients for the buffer, heparin, ammonium-salt and lyophilised aprotinin are recommended.
Екземпляри
For blood sampling, a syringe (1ml) with a fixed thin needle (e.g. Braun Omnikan-F) is recommended.
Ако не се използват за предварителна обработка непосредствено след изрязването, екземплярите от черен дроб, взети от изпитваните риби, се съхраняват при ≤ – 70 °C.
The syringe should be prefilled with buffer (approximately 100 microliter) to completely elute the small blood volumes from each fish.
Прави се разрез с ножици точно пред гръдните перки.
The blood samples are taken by cardiac puncture.
Средната линия на корема се разрязва с ножица до точка, разположена приблизително 2 mm краниално от ануса.
At first the fish should be anesthetized with MS-222 (100 mg/l).
Коремните стени се разтварят с пинцети за разкриване на черния дроб и други вътрешни органи
The proper plane of anaesthesia allows the user to distinguish the heartbeat of the zebrafish.
(като алтернатива, коремните стени могат да се забодат латерално).
While puncturing the heart, keep the syringe piston under weak tension.
Стрелката показва черния дроб.
Collectable blood volumes range between 20 - 40 microliters.
С помощта на пинцети се прави дисекция на черния дроб и същият се изрязва.
After cardiac puncture, the blood/buffer-mixture should be filled into the test tube.
Фиг-5
Plasma is separated from the blood via centrifugation (20 min; 5000 g) and should be stored at – 80°C until required for analysis.
Червата леко се издърпват с помощта на пинцети.
Procedure 3C:
Фиг-6
SOP: Zebrafish, homogenisation of head & tail
Двата края на червата и мезентериалните връзки се отрязват с ножици.
The fish are anaesthetised and euthanised in accordance with the test description.
Фиг-7 (женски)
The head and tail are cut of the fish in accordance with Figure 1.
Процедурата е идентична като тази при мъжките.
Important: All dissection instruments, and the cutting board should be rinsed and cleaned properly (e.g. with 96 % ethanol) between handling of each single fish to prevent “vitellogenin pollution” from females or induced males to uninduced males.
Фиг-8
For gonad histology
Завършената процедура.
Cut behind
Процедура 2 B:
Cut behind dorsal fin
Японска оризия (Oryzias latipes), предварителна обработка на черен дроб за анализ на вителогенин
For Vtg analysis
Взема се бутилката с буфера за хомогенат от комплекта за ELISA и се охлажда с натрошен лед (температура на разтвора: ≤ 4 °C).
The weight of the pooled head and tail from each fish is measured to the nearest mg.
Ако се използва буфер за хомогенат от EnBio ELISA система, разтворът се размразява при стайна температура и след това бутилката се охлажда с натрошен лед.
After being weighed, the parts are placed in appropriate tubes (e.g. 1,5 ml eppendorf) and frozen at – 80 °C until homogenisation or directly homogenised on ice with two plastic pistils.
Изчислява се обемът на буфера за хомогенат за черния дроб въз основа на теглото му (добавят се 50 μl буфер за хомогенат на mg тегло на черен дроб).
(Other methods can be used if they are performed on ice and the result is a homogenous mass).
Например, ако теглото на черния дроб е 4,5 mg, обемът на буфера за хомогенат за черния дроб е 225 μl.
Important: The tubes should be numbered properly so that the head and tail from the fish can be related to their respective body-section used for gonad histology.
Изготвя се списък с обемите на буфера за хомогенат за всички екземпляри черен дроб.
When a homogenous mass is achieved, 4 x the tissue weight of ice-cold homogenisation buffer [1] is added.
Подготовка на черния дроб за предварителната обработка
Keep working with the pistils until the mixture is homogeneous.
Непосредствено преди предварителната обработка микроепруветката от 1,5 ml, съдържаща черния дроб, се взема от фризера.
Important note: New pistils are used for each fish.
Предварителна обработка на черния дроб от животни от мъжки пол следва да се извършва преди тази при женските животни, за да се предотврати замърсяване с вителогенин.
The samples are placed on ice until centrifugation at 4 °C at 50000 g for 30 min.
Освен това, предварителната обработка за изпитваните риби следва да се извършва в следния ред: контрола, контрола на разтворител (където е приложимо), най-ниска концентрация, средна концентрация, най-висока концентрация и положителна контрола.
Use a pipette to dispense portions of 20 μl supernatant into at least two tubes by dipping the tip of the pipette below the fat layer on the surface and carefully sucking up the supernatant without fat- or pellet fractions.
Броят на взетите от фризера в даден момент микроепруветки от 1,5 ml, съдържащи проби черен дроб, не следва да надвишава броя, който може да се центрофугира по това време.
The tubes are stored at – 80 °C until use.
Микроепруветките от 1,5 ml, съдържащи проби черен дроб, се подреждат на охладителния статив с лед по реда на екземпляра (няма нужда от размразяване на черния дроб).
Homogenisation buffer:(50 mM Tris-HCl pH 7,4; 1 % Protease inhibitor cocktail (Sigma)): 12 ml Tris-HCl pH 7,4 + 120 μl Protease inhibitor cocktail.TRIS: TRIS-ULTRA PURE (ICN) e.g. from Bie & Berntsen, Denmark.Protease inhibitor cocktail: From Sigma (for mammalian tissue) Product number P 8340.NOTE: The homogenisation buffer should be used the same day as manufactured.
Извършване на предварителната обработка
Place on ice during use.
Добавяне на буфера за хомогенат
VITELLOGENIN FORTIFICATION SAMPLES AND INTER-ASSAY REFERENCE STANDARD
Проверява се списъкът за обема на буфера за хомогенат, който да се използва за определена проба черен дроб и микропипетата се настройва (диапазон на обемите: 100-1000 μl) към подходящия обем.
On each day that VTG assays are performed, a fortification sample made using an inter-assay reference standard will be analysed.
Поставя се чист връх на микропипетата.
The VTG used to make the inter-assay reference standard will be from a batch different from the one used to prepare calibration standards for the assay being performed.
Буферът за хомогенат се взема от бутилката с реактива и се добавя в микроепруветката от 1,5 ml, съдържаща проба черен дроб.
The fortification sample will be made by adding a known quantity of the inter-assay standard to a sample of control male plasma.
Буферът за хомогенат се добавя във всички микроепруветки от 1,5 ml, съдържащи проба черен дроб, в съответствие с гореописаната процедура.
The sample will be fortified to achieve a VTG concentration between 10 and 100 times the expected vitellogenin concentration of control male fish.
Не е необходимо да се сменя върхът на микропипетата с нов.
The sample of control male plasma that is fortified may be from an individual fish or may be a composite from several fish.
Независимо от това, ако върхът е замърсен или се предполага, че е замърсен, той следва да бъде сменен.
A subsample of the unfortified control male plasma will be analysed in at least two duplicate wells.
Хомогенизиране на черния дроб
The fortified sample also will be analysed in at least two duplicate wells.
Поставя се нов пестик за хомогенизиране в хомогенизатора за микроепруветката.
The mean quantity of vitellogenin in the two unfortified control male plasma samples will be added to the calculated quantity of VTG added to fortification the samples to determine an expected concentration.
Пестикът се поставя в микроепруветката от 1,5 ml.
The ratio of this expected concentration to the measured concentration will be reported along with the results from each set of assays performed on that day.
Хомогенизаторът се държи за натиск върху черния дроб между повърхността на пестика и вътрешната стена на микроепруветката от 1,5 ml.
DECISION FLOWCHART FOR THE STATISTICAL ANALYSIS
Хомогенизаторът за микроепруветката се оставя да функционира в продължение на 10 до 20 секунди.
Rep means normally distributed
Микроепруветката от 1,5 ml се охлажда с натрошен лед по време на функционирането.
Stept-down Jonckheere or Williams' test
Пестикът се изважда от микроепруветката от 1,5 ml и се оставя в покой в продължение на около 10 секунди.
Normalising transform?
След това се извършва визуална проверка на състоянието на суспензията.
variance stabilising transform?
Ако в суспензията се наблюдават парченца от черен дроб, операции 3) и 4) се повтарят, за да се приготви задоволителен хомогенат.
Tamhane-Dunnett test on nested ANOVA
Суспендираният хомогенат от черен дроб се охлажда на охладителния статив с лед до центрофугирането.
Dunnett test on nested ANOVA No
Пестикът се сменя с нов за всеки хомогенат.
Yes Yes
Всички екземпляри от черен дроб се хомогенизират с буфер за хомогенат в съответствие с гореописаната процедура.
No >=4 reps per conc
Центрофугиране на суспендирания хомогенат от черен дроб
<=3 reps per conc
Потвърждава се, че температурата на охладената центрофуга е ≤ 5 °C.
Dunn or Mann-Whitney test on rep means
Микроепруветките от 1,5 ml, съдържащи суспендирания хомогенат от черен дроб, се поставят в охладената центрофуга (коригира се балансът, ако е необходимо).
Dunn test on rep means Dunn or Mann-Whitney test
Суспендираният хомогенат от черен дроб се центрофугира при 13000 g за 10 минути при ≤ 5 °C.
Dunn test <=3 reps per conc
Ако супернатантите са достатъчно разделени обаче, центробежната сила и времето могат да бъдат коригирани според необходимостта.
>=4 reps per conc Tamhane-Dunnett test
След центрофугирането се проверява дали супернатантът е достатъчно разделен (повърхностен слой: липиди, среден слой: супернатант, дънен слой: чернодробна тъкан).
Nested ANOVA normal
Ако разделянето не е достатъчно, суспензията се центрофугира отново при същите условия.
Nested ANOVA not normal
Всички екземпляри се отстраняват от охладената центрофуга и се подреждат на охладителния статив с лед по реда на екземпляра.
variance stabilising transformation
Внимава се да не се суспендира повторно някой от разделените след центрофугирането слоеве.
Variances unequal Dunnett test
Събиране на супернатанта
Variances equal
На статива за епруветки се поставят четири микроепруветки от 0,5 ml за съхранение на супернатанта.
Step-down Jonckheere test
От всеки супернатант (разделен като междинен слой) с микропипетата се вземат по 30 μl и се поставят в една микроепруветка от 0,5 ml.
Rep means normal or not homogenous
Внимава се да не се вземе от липидите в повърхностния слой, или от чернодробната тъкан в дънния слой.
Rep means normal & homogenous
Супернатантът се събира и се поставя в други микроепруветки от 0,5 ml по същия начин, както е описано по-горе.
Step-down trendtest on replicate means
Останалата част от супернатанта се събира с микропипетата (ако е осъществимо: ≥ 100 μl).
Not monotone
След това супернатантът се поставя в оставащата микроепруветка от 0,5 ml.
Monotone
Капачката на микроепруветката от 0,5 ml се затваря и върху етикета се отбелязва обемът на супернатанта.
Determine whether Dose-Response is monotone
След това микроепруветките се охлаждат незабавно върху охладителния статив с лед.
C.49 Fish Embryo Acute Toxicity (FET) Test
Върхът на пипетата се сменя с нов за всеки супернатант.
This test method (TM) is equivalent to OECD test guideline (TG) 236 (2013).
Ако към върха остава прикрепено голямо количество липиди, той се сменя незабавно с нов, за да се избегне замърсяване на екстракта от черен дроб с мазнини.
It describes a Fish Embryo Acute Toxicity (FET) test with the zebrafish (Danio rerio).
Цялото количество центрофугиран супернатант се поставя в четири микроепруветки от 0,5 ml съгласно процедурата, описана по-горе.
This test is designed to determine acute toxicity of chemicals on embryonic stages of fish.
След поставянето на супернатантата в микроепруветките от 0,5 ml, всички те се поставят на статива за епруветки с етикет за идентификация, след което се замразяват незабавно във фризера.
The FET-test is based on studies and validation activities performed on zebrafish (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12)(13)(14).
Ако концентрациите на VTG се измерват непосредствено след предварителната обработка, една микроепруветка от 0,5 ml (съдържаща 30 μl супернатант) се съхранява на хладно на статива за епруветки и се прехвърля на работното място, където се провежда изпитването с ELISA.
The FET-test has been successfully applied to a wide range of chemicals exhibiting diverse modes of action, solubilities, volatilities, and hydrophobicities (reviewed in 15 and 16).
В такъв случай оставащите микроепруветки се поставят на стативите за епруветки и се замразяват във фризера.
Newly fertilised zebrafish eggs are exposed to the test chemical for a period of 96 hrs.
След събирането на супернатанта остатъкът се отстранява по подходящ начин.
Every 24 hrs, up to four apical observations are recorded as indicators of lethality (6): (i) coagulation of fertilised eggs, (ii) lack of somite formation, (iii) lack of detachment of the tail-bud from the yolk sac, and (iv) lack of heartbeat.
Съхранение на образците
At the end of the exposure period, acute toxicity is determined based on a positive outcome in any of the four apical observations recorded, and the LC50 is calculated.
Микроепруветките от 0,5 ml, съдържащи супернатанта от хомогената от черен дроб, се съхраняват при ≤ – 70 °C до използването им за ELISA.
Useful information about substance-specific properties include the structural formula, molecular weight, purity, stability in water and light, pKa and Kow, water solubility and vapour pressure as well as results of a test for ready biodegradability (TM C.4 (17) or TM C.29 (18)).
Процедура 3А:
Solubility and vapour pressure can be used to calculate Henry's law constant, which will indicate whether losses due to evaporation of the test chemical may occur.
Вземане на кръвна проба от опашна вена/артерия от зеброво данио
A reliable analytical method for the quantification of the substance in the test solutions with known and reported accuracy and limit of detection should be available.
Непосредствено след анестезията опашното стъбло се разрязва напречно и кръвта се отстранява от опашната артерия/вена с хепаринизирана микрокапилярка за хематокрит.
If the test method is used for the testing of a mixture, its composition should, as far as possible, be characterised, e.g. by the chemical identity of its constituents, their quantitative occurrence and their substance-specific properties (see paragraph 4).
Обемът на кръвта варира от 5 до 15 μl в зависимост от размера на рибата.
Concerning substances that may be activated via metabolism, there is evidence that zebrafish embryos do have biotransformation capacities (19)(20)(21)(22).
Равен обем буфер с апротинин (6 μg/ml в PBS) се добавя към микрокапилярката и плазмата се разделя от кръвта чрез центрофугиране (5 минути при 600 g).
However, the metabolic capacity of embryonic fish is not always similar to that of juvenile or adult fish.
Плазмата се събира в епруветките за изпитването и се съхранява при температура – 20 °C до анализа за VTG или за други представляващи интерес белтъци.
For instance, the protoxicant allyl alcohol (9) has been missed in the FET.
Процедура 3B:
Therefore, if there are any indications that metabolites or other transformation products of relevance may be more toxic than the parent compound, it is also recommended to perform the test with these metabolites/transformation products and to also use these results when concluding on the toxicity of the test chemical, or alternatively perform another test which takes metabolism into further account.
Кръвна проба чрез сърдечна пункция при зеброво данио
For substances with a molecular weight ≥ 3kDa, a very bulky molecular structure, and substances causing delayed hatch which might preclude or reduce the post-hatch exposure, embryos are not expected to be sensitive because of limited bioavailability of the substance, and other toxicity tests might be more appropriate.
За да се избегне съсирването на кръвта и разграждането на белтъците, пробите се вземат във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS), съдържащ хепарин (1000 единици/ml) и протеазния инхибитор апротинин (2 TIU/ml).
For the test results to be valid, the following criteria apply:
Като съставки за буфера са препоръчителни хепарин (амониева сол) и лиофилизиран апротинин.
The overall fertilisation rate of all eggs collected should be ≥ 70 % in the batch tested.
За вземане на кръв се препоръчва спринцовка (1 ml) с фиксирана тънка игла (напр.
The water temperature should be maintained at 26 ± 1 °C in test chambers at any time during the test.
Braun Omnikan-F).
Overall survival of embryos in the negative (dilution-water) control, and, where relevant, in the solvent control should be ≥ 90 % until the end of the 96 hrs exposure.
Спринцовката трябва да се запълни предварително с буфер (около 100 μl) за пълно елуиране на малките обеми кръв от всяка риба.
Exposure to the positive control (e.g. 4,0 mg/l 3,4-dichloroaniline for zebrafish) should result in a minimum mortality of 30 % at the end of the 96 hrs exposure.
Кръвните проби се вземат чрез сърдечна пункция.
Hatching rate in the negative control (and solvent control if appropriate) should be ≥ 80 % at the end of 96 hrs exposure.
Първоначално рибата трябва да бъде анестезирана с MS-222 (100 mg/l).
At the end of the 96 hrs exposure, the dissolved oxygen concentration in the negative control and highest test concentration should be ≥ 80 % of saturation.