natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Изпитваният химикал и веществата за контроли се приготвят в деня на изпитването.
the choice of a sensitive luminometer,
За изследването KeratinoSensTM изпитваните химикали се разтварят в диметилсулфоксид (DMSO) до крайната желана концентрация (напр.
the use of a plate format with sufficient height to avoid light-cross-contamination; and
200 mM).
the use of a luciferase substrate with sufficient light output to ensure sufficient sensitivity and low variability.
Разтворите на DMSO могат да се смятат за самостоятелно стерилизиращи се, поради което не е необходимо стерилно филтруване.
Prior to testing, a control experiment setup as described in Appendix 3 should be carried out to ensure that these three points are met.
Неразтворимият в DMSO изпитван химикал се разтваря в стерилна вода или среда за отглеждане, и разтворите се стерилизират, напр. чрез филтруване.
After the 48 hour exposure time with the test chemical and control substances in the KeratinoSensTM assay, cells are washed with a phosphate buffered saline, and the relevant lysis buffer for luminescence readings added to each well for 20 min at room temperature.
За изпитването на даден химикал, който няма определено молекулно тегло (MW), се приготвя изходен разтвор с концентрация по подразбиране (40 mg/ml или в 4 % (w/v)) в изследването KeratinoSensTM.
Plates with the cell lysate are then placed in the luminometer for reading which in the KeratinoSensTM assay is programmed to: (i) add the luciferase substrate to each well (i.e. 50 μl), (ii) wait for 1 second, and (iii) integrate the luciferase activity for 2 seconds.
При разтворители, различни от диметилсулфоксид, вода или среда за отглеждане, следва да се предостави достатъчна научна обосновка.
In case alternative settings are used, e.g. depending on the model of luminometer used, these should be justified.
Въз основа на изходните разтвори на изпитвания химикал в DMSO се приготвят серийни разреждания с DMSO до получаване на 12 концентрации за разреждане на химикала за изпитване (от 0,098 до 200 mM в изследването KeratinoSensTM).
Furthermore, a glow substrate may also be used provided that the quality control experiment of Appendix 3 is successfully fulfilled.
За изпитван химикал, неразтворим в DMSO, разрежданията за получаване на концентрациите за разреждане се извършват с помощта на стерилна вода или на стерилна среда за отглеждане.
Cytotoxicity Assessment
Независимо от използвания разтворител, по-нататък концентрациите за разреждане се разреждат 25-кратно в среда за отглеждане, съдържаща серум, и накрая се използват за третиране с допълнително 4-кратно разреждане, така че крайните концентрации на изпитвания химикал да са в обхват от 0,98 до 2000 μM в изследването KeratinoSensTM.
For the KeratinoSensTM cell viability assay, medium is replaced after the 48 hour exposure time with fresh medium containing MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Thiazolyl blue tetrazolium bromide; CAS No. 298-93-1) and cells incubated for 4 hours at 37 °C in the presence of 5 % CO2.
Алтернативни концентрации могат да бъдат използвани при наличие на обосновка (напр. в случай на цитотоксичност или малка разтворимост).
The MTT medium is then removed and cells are lysed (e.g. by adding 10 % SDS solution to each well) overnight.
Отрицателната контрола (на разтворител), използвана в изследването KeratinoSensTM, е DMSO (CAS No. 67-68-5, ≥ 99 % чистота), за която се приготвят шест гнезда на плака.
After shaking, the absorption is measured at i.e. 600 nm with a photometer.
Тя преминава през същото разреждане, както е описано в точка 22 за концентрациите за разреждане, така че окончателната концентрация на отрицателната контрола (на разтворител) да е 1 %, за която е известно, че не оказва влияние върху жизнеспособността на клетките и съответства на същата концентрация на DMSO, каквато е при изпитвания химикал и положителната контрола.
The following parameters are calculated in the KeratinoSensTM assay:
За изпитван химикал, неразтворим в DMSO, разрежданията за който са направени във вода, равнището на DMSO във всички гнезда на крайния разтвор за изпитване трябва да се коригира на 1 %, както и за другите изпитвани химикали и вещества за контроли.
the maximal average fold induction of luciferase activity (Imax) value observed at any concentration of the tested chemical and positive control;
Положителната контрола, използвана при изследването KeratinoSensTM, е канелен алдехид (CAS No. 14371-10-9, ≥ 98 % чистота), за който се приготвя поредица от 5 концентрации за разреждане в обхват от 0,4 до 6,4 mM в DMSO (от 6,4 mM изходен разтвор) и се разрежда, както е описано за концентрациите за разреждане в точна 22, така че крайната концентрация на положителната контрола да е в обхват от 4 до 64 μM.
the EC1,5 value representing the concentration for which induction of luciferase activity is above the 1,5 fold threshold (i.e. 50 % enhanced luciferase activity) was obtained; and
Може да се използват други подходящи положителни контроли, за предпочитане генериращи EC1,5 стойности в средата на обхвата, ако има налични данни за предходни периоди за получаване на сравними критерии за приемливост на серията.
the IC50 and IC30 concentration values for 50 % and 30 % reduction of cellular viability.
Прилагане на изпитвания химикал и веществата за контроли
Fold luciferase activity induction is calculated by Equation 1, and the overall maximal fold induction (Imax) is calculated as the average of the individual repetitions.
За всеки изпитван химикал и вещество за положителна контрола е необходим един опит за извеждане на прогноза (положителна или отрицателна), състоящ се от най-малко две независимо извършени повтаряния, всяко от които съдържа по три повторения (т.е. n=6).
Equation 1:
В случай на наличие на несъответстващи резултати между двете независимо извършени повтаряния, следва да се извърши трето повтаряне, съдържащо три повторения (т.е. n = 9).
Fold induction
Всяко независимо извършено повтаряне се извършва в различен ден с пресен изходен разтвор на изпитваните химикали и независимо събрани клетки.
Lsample
Клетките обаче могат да произхождат от един и същ пасаж.
Lblank
След посяване, както е описано в точка 20, клетките се отглеждат в продължение на 24 часа в 96-гнездните микротитърни плаки.
Lsolvent
След това средата се отстранява и се заменя с прясна среда за отглеждане (150 μl среда за отглеждане, съдържаща серум, но без генетицин KeratinoSensTM), към която се добавят 50 μl от 25-кратно разреден изпитван химикал и вещества за контроли.
where
Поне едно гнездо от плака следва да бъде оставено празно (без клетки и без третиране), за да се оценят фоновите стойности.
L sample
След това третираните плаки се инкубират за около 48 часа при 37 ± 1°C в присъствието на 5 % CO2 в изследването KeratinoSensTM.
is the luminescence reading in the test chemical well
Следва да се вземат мерки за избягване на изпаряването на летливи изпитвани химикали и на кръстосаното замърсяване с изпитвани химикали между гнездата, като напр. плаките се покрият с фолио преди инкубирането с изпитвания химикал.
L blank
Измервания на луциферазната активност
is the luminescence reading in the blank well containing no cells and no treatment
Три фактора са от решаващо значение, за да се гарантира подходящи показания за луминесценцията:
L solvent
изборът на чувствителен луминометър,
is the average luminescence reading in the wells containing cells and solvent (negative) control
използването на формат на плака с достатъчна височина, за да се избегне светлинно кръстосано замърсяване; както и
,5 is calculated by linear interpolation according to Equation 2, and the overall EC1,5 is calculated as the geometric mean of the individual repetitions.
използването на луциферазен субстрат, излъчващ достатъчно светлина, за да се гарантира достатъчна чувствителност и слабо вариране.
Equation 2:
Преди изпитването трябва да се извърши контролен опит по план, описан в допълнение 3, за да се гарантира, че тези три точки са изпълнени.
is the lowest concentration in μM with > 1,5 fold induction
След 48-часова експозиция с изпитвания химикал и веществата за контроли при изпитването KeratinoSensTM, клетките се измиват с фосфатно буфериран физиологичен разтвор, и към всяко гнездо се добавя съответният лизиращ буфер за показанията за луминесценцията за 20 минути при стайна температура.
is the highest concentration in μM with < 1,5 fold induction
След това плаки с клетъчния лизат се слагат в луминометъра за отчитане на стойностите, което при изпитването KeratinoSensTM е програмирано: i) да се добави луциферазен субстрат към всяко гнездо на (т.е.
is the fold induction measured at the lowest concentration with > 1,5 fold induction (mean of three replicate wells)
50 μl), ii) да се изчака 1 секунда, и iii) да се интегрира луциферазната активност в продължение на 2 секунди.
is the fold induction at the highest concentration with < 1,5 fold induction (mean of three replicate wells)
В случай че се използват алтернативни настройки, напр. в зависимост от модела на използвания луминометър, те трябва да бъдат обосновани.
Viability is calculated by Equation 3:
Освен това също може да бъде използван субстрат, излъчващ светлина, при условие, че опитът за контрол на качеството от допълнение 3 е проведен успешно.
Equation 3:
Оценка на цитотоксичността
Viability
При изследването KeratinoSensTM за жизнеспособността на клетките средата се заменя след 48-часовата време на експозиция с прясна среда, която съдържа MTT [3-(4,5-диметилтиазол- 2-ил)-2,5-дифенилтетразолиев бромид, тиазолил син тетразолиев бромид; CAS № 298-93-1) и клетките се инкубират в продължение на 4 часа при 337°C в присъствието на 5 % CO2.
Vsample
След това средата с MTT се отстранява и клетките се лизират (напр. чрез добавяне към всяко гнездо на 10 % разтвор на SDS) в продължение на една нощ.
Vblank
След разклащане абсорбцията се измерва при 600 nm с фотометър.
Vsolvent
Следните параметри се изчисляват в изследването KeratinoSensTM:
V sample
максималната средна стойност на кратността на индукцията на луциферазна активност (Imax), наблюдавана при която и да е концентрация на изпитвания химикал и положителната контрола;
is the MTT-absorbance reading in the test chemical well
получена е стойността на EC1,5, представляваща концентрацията, при която индукцията на луциферазна активност е над прага от 1,5 пъти (т.е.
V blank
50 % увеличение на луциферазната активност); както и
is the MTT-absorbance reading in the blank well containing no cells and no treatment
стойностите на концентрацията IC50 and IC30 за 50 % и 30 % намаляване на клетъчната жизнеспособност.
V solvent
Кратността на индукцията на луциферазна активност се изчислява по формула 1, а общата максимална кратност на индукцията (Imax) се изчислява като средната стойност на отделно извършените повтаряния.
is the average MTT-absorbance reading in the wells containing cells and solvent (negative) control
Уравнение 1:
and IC30 are calculated by linear interpolation according to Equation 4, and the overall IC50 and IC30 are calculated as the geometric mean of the individual repetitions.
Кратност на индукция
Equation 4:
Lпроба
X is the % reduction at the concentration to be calculated (50 and 30 for IC50 and IC30)
Lпразна проба
is the lowest concentration in μM with > x % reduction in viability
Lразтворител
is the highest concentration in μM with < x % reduction in viability
където
is the % viability at the lowest concentration with > x % reduction in viability
L проба
is the % viability at the highest concentration with < x % reduction in viability
е отчетената стойност за луминесценцията в гнездото с изпитвания химикал
For each concentration showing > 1,5 fold luciferase activity induction, statistical significance is calculated (e.g. by a two-tailed Student's t-test), comparing the luminescence values for the three replicate samples with the luminescence values in the solvent (negative) control wells to determine whether the luciferase activity induction is statistically significant (p < 0,05).
L празна проба
The lowest concentration with > 1,5 fold luciferase activity induction is the value determining the EC1,5 value.
е отчетената стойност за луминесценцията в гнездото с празната проба, без клетки и без третиране
It is checked in each case whether this value is below the IC30 value, indicating that there is less than 30 % reduction in cellular viability at the EC1,5 determining concentration.
L разтворител
It is recommended that data are visually checked with the help of graphs.
е отчетената средна стойност за луминесценцията в гнездата, съдържащи клетки и контрола (отрицателна) на разтворител
If no clear dose-response curve is observed, or if the dose-response curve obtained is biphasic (i.e. crossing the threshold of 1,5 twice), the experiment should be repeated to verify whether this is specific to the test chemical or due to an experimental artefact.
,5 се изчислява чрез линейна интерполация в съответствие с формула 2, а общата EC1,5 се изчислява като средно геометрично на отделно извършените повтаряния.
In case the biphasic response is reproducible in an independent experiment, the lower EC1,5 value (the concentration when the threshold of 1,5 is crossed the first time) should be reported.
Уравнение 2:
In the rare cases where a statistically non-significant induction above 1,5 fold is observed followed by a higher concentration with a statistically significant induction, results from this repetition are only considered as valid and positive if the statistically significant induction above the threshold of 1,5 was obtained for a non-cytotoxic concentration.
е най-ниската концентрация в μM с индукция > 1,5 пъти
Finally, for test chemicals generating a 1,5 fold or higher induction already at the lowest test concentration of 0,98 μM, the EC1,5 value of < 0,98 is set based on visual inspection of the dose-response curve.
е най-високата концентрация в μM с индукция < 1,5 пъти
The following acceptance criteria should be met when using the KeratinoSensTM assay.
е кратността на индукцията, измерена при най-ниската концентрация с индукция > 1.5 пъти (средна стойност от три гнезда с повторения)
First, the luciferase activity induction obtained with the positive control, cinnamic aldehyde, should be statistically significant above the threshold of 1,5 (e.g. using a T-test) in at least one of the tested concentrations (from 4 to 64 μM).
е кратността на индукцията, измерена при най-високата концентрация в с индукция < 1,5 пъти (средна стойност от три гнезда с повторения)
Second, the EC1,5 value should be within two standard deviations of the historical mean of the testing facility (e.g. between 7 μM and 30 μM based on the validation dataset) which should be regularly updated.
Жизнеспособността се изчислява по уравнение 3:
In addition, the average induction in the three replicates for cinnamic aldehyde at 64 μM should be between 2 and 8.
Уравнение 3:
If the latter criterion is not fulfilled, the dose-response of cinnamic aldehyde should be carefully checked, and tests may be accepted only if there is a clear dose-response with increasing luciferase activity induction at increasing concentrations for the positive control.
Жизнеспособност
Finally, the average coefficient of variation of the luminescence reading for the negative (solvent) control DMSO should be below 20 % in each repetition which consists of 6 wells tested in triplicate.
Vпроба
If the variability is higher, results should be discarded.
Vпразна проба
Interpretation of results and prediction model
Vразтворител
A KeratinoSensTM prediction is considered positive if the following 4 conditions are all met in 2 of 2 or in the same 2 of 3 repetitions, otherwise the KeratinoSensTM prediction is considered negative (Figure 1):
V проба
the Imax is higher than (>) 1,5 fold and statistically significantly different as compared to the solvent (negative) control (as determined by a two-tailed, unpaired Student's t-test);
е отчетената стойност на абсорбцията на MTT в гнездото с изпитвания химикал
the cellular viability is higher than (>) 70 % at the lowest concentration with induction of luciferase activity above 1,5 fold (i.e. at the EC1,5 determining concentration);
V празна проба
the EC1,5 value is less than (<) 1000 μM (or < 200 μg/ml for test chemicals with no defined MW);
е отчетената стойност на абсорбцията на MTT в гнездото с празната проба, без клетки и без третиране
there is an apparent overall dose-response for luciferase induction (or a biphasic response as mentioned under paragraph 33).
V разтворител
If in a given repetition, all of the three first conditions are met but a clear dose-response for the luciferase induction cannot be observed, then the result of that repetition should be considered inconclusive and further testing may be required (Figure 1).
е отчетената средна стойност на абсорбцията на MTT в гнездата, съдържащи клетки и контрола (отрицателна) на разтворител
In addition, a negative result obtained with concentrations < 1000 μM (or < 200 μg/ml for test chemicals with no defined MW) should also be considered as inconclusive (see paragraph 11).
и IC30 се изчисляват чрез линейна интерполация в съответствие с формула 4, а общите IC50 и IC30 се изчисляват като средно геометрично на отделно извършените повтаряния.
Figure 1
Уравнение 4:
Prediction model used in the KeratinoSensTM assay.
X е процентното намаление на концентрацията, което трябва да бъде изчислено (50 и 30 за IC50 и IC30)
A KeratinoSensTM prediction should be considered in the framework of an IATA and in accordance with the provision of paragraphs 9 and 11
е най-ниската концентрация в μM с > x % намаление на жизнеспособността
In rare cases, test chemicals which induce the luciferase activity very close to the cytotoxic levels can be positive in some repetitions at non-cytotoxic levels (i.e. EC1,5 determining concentration below (<) the IC30), and in other repetitions only at cytotoxic levels (i.e. EC1,5 determining concentration above (>) the IC30).
е най-високата концентрация в μM с < x % намаление на жизнеспособността
Such test chemicals shall be retested with more narrow dose-response analysis using a lower dilution factor (e.g. 1,33 or √2 (= 1,41) fold dilution between wells), to determine if induction has occurred at cytotoxic levels or not (9).
е процентът жизнеспособност при най-ниската концентрация в с > x % намаление на жизнеспособността
Physical appearance, water solubility, DMSO solubility, molecular weight, and additional relevant physicochemical properties, to the extent available;
е процентът жизнеспособност при най-високата концентрация с < x % намаление на жизнеспособността
Physical appearance, water solubility, DMSO solubility and additional relevant physicochemical properties, to the extent available;
За всяка концентрация, показваща > 1,5 кратна индукция на луциферазна активност, се изчислява статистическата значимост (напр. чрез двустранен t-тест на Стюдънт), чрез сравняване на стойностите на луминесценцията за трите повторения със стойностите на луминесценцията в гнездата с контролата (отрицателна) на разтворител, за да се определи дали индукцията на луциферазна активност е статистически значима (p < 0,05).
Physical appearance, water solubility, DMSO solubility, molecular weight, and additional relevant physicochemical properties, to the extent available and where applicable;
Най-ниската концентрация с > 1,5 кратна индукция на луциферазна активност е стойността, определяща стойността на EC1,5.
Negative (vehicle) control
Във всеки отделен случай се проверява дали тази стойност е под стойността на IC30, което показва, че има по-малко от 30 % намаление на клетъчната жизнеспособност при концентрацията, определяща EC1,5.
Chemical identification, such as IUPAC or CAS name(s), CAS number(s), and/or other identifiers;
Препоръчва се данните да се проверяват визуално с помощта на графики.
Physical appearance, molecular weight, and additional relevant physicochemical properties in the case other negative controls / vehicles than those mentioned in this test method are used and to the extent available;
Ако не се наблюдава ясна крива доза-отклик, или ако получената крива доза-отклик е двуфазна (т.е. преминава два пъти през прага от 1,5), следва да се извърши повтаряне на опита, за да се провери дали това е специфично за изпитвания химикал, или се дължи на артефакт от опита.
Justification for choice of solvent for each test chemical.
В случай че двуфазният отклик е възпроизводим в независим опит, следва да бъде отчетена долната стойност на EC1,5 (концентрацията, при която прагът от 1,5 е преминат за първи път).
Test method conditions
В редките случаи, когато се наблюдава индукция над 1,5 пъти, която не е статистически значима, последвана от по-висока концентрация със статистически значима индукция, резултатите от това извършено повтаряне се смятат за валидни и положителни само ако статистически значимата индукция над прага от 1,5 е била получена при концентрация, която не е цитотоксична.
Description of test method used;
И накрая, за изпитвани химикали, водещи до 1,5 кратна или по-голяма индукция още при най-ниската изпитвана концентрация от 0,98 μM, стойността на EC1,5 < 0.98 се определя въз основа на визуалната проверка на кривата доза-отклик.
Cell line used, its storage conditions and source (e.g. the facility from which they were obtained);
Когато се използва изследване KeratinoSensTM трябва да се спазват следните критерии.
Passage number and level of confluence of cells used for testing;
Първо, индукцията на луциферазна активност, получена при положителната контрола, канелен алдехид, следва да бъде статистически значима над прага от 1,5 (например чрез използване на T-тест) при най-малко една от изпитаните концентрации (от 4 до 64 μM).
Cell counting method used for seeding prior to testing and measures taken to ensure homogeneous cell number distribution (cf. paragraph 20);
Второ, стойността на EC1,5 трябва да бъде в рамките на две стандартни отклонения от средната стойност за изпитващата лаборатория за предходни периоди (напр. между 7 μM и 30 μM въз основа на набора от данни от валидирането), която следва да се актуализира редовно.
Luminometer used (e.g. model), including instrument settings, luciferase substrate used, and demonstration of appropriate luminescence measurements based on the control test described in Appendix 3;
Освен това средната индукция в трите повторения за канелен алдехид при 64 μM следва да бъде между 2 и 8.
The procedure used to demonstrate proficiency of the laboratory in performing the test method (e.g. by testing of proficiency substances) or to demonstrate reproducible performance of the test method over time.
Ако последният критерий не е изпълнен, зависимостта доза-отклик за канеления алдехид следва да бъде проверена внимателно и изпитванията могат да бъдат приети само ако е налице ясна зависимост доза-отклик, с увеличаваща се индукция на луциферазна активност при нарастване на концентрациите на положителната контрола.
Test procedure
Накрая, средният коефициент на вариация при отчетената стойност на луминесценцията за отрицателната контрола (на разтворител) DMSO следва да бъде под 20 % при всяко извършено повтаряне, което се състои от 6 гнезда, изпитвани в три повторения.
Number of repetitions and replicates used;
Ако варирането е по-голямо, резултатите следва да бъдат отхвърлени.
Test chemical concentrations, application procedure and exposure time used (if different than the one recommended)
Тълкуване на резултатите и модел за прогнозиране
Tabulation of Imax, EC1,5 and viability values (i.e. IC50, IC30) obtained for the test chemical and for the positive control for each repetition as well as the mean values (Imax: average; EC1,5 and viability values: geometric mean) and SD calculated using data from all individual repetitions and an indication of the rating of the test chemical according to the prediction model;
Прогнозата по KeratinoSensTM се счита за положителна, ако всички от посочените по-долу 4 условия са изпълнени във всичките 2 от 2 извършени повтаряния, или в същите 2 от 3 извършени повтаряния, в противен случай прогнозата по KeratinoSensTM се счита за отрицателна (фигура 1):
Coefficient of variation obtained with the luminescence readings for the negative control for each experiment;