natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Стойността на FL20 (mg/ml) се използва в модела на прогнозиране за идентифициране на химикали с корозивно и силно дразнещо действие върху очите (вж. точка 35).
However, if the chemical is found to be insoluble in HBSS at this concentration, the use of other test methods instead of FL should be considered.
Възстановяването е важна част от токсичния профил на даден изпитван химикал и то също се оценява чрез in vivo изпитването за дразнещо действие върху очите.
The use of light mineral oil as a solvent, in cases where the chemical is found to be insoluble in HBSS, should be considered with caution as there is not enough data available to conclude on the performance of the FL assay under such conditions.
Предварителни анализи показаха, че данните за възстановяването (до 72 часа след експозиция на химикали) потенциално биха могли да увеличат капацитета за предвиждане на протокол № 71 на INVITTOX, но е необходима допълнителна оценка, която може да бъде подпомогната от допълнителни данни, за предпочитане придобити чрез допълнително изпитване (6).
All chemicals to be tested are prepared in sterile calcium-containing (at a concentration of 1,0-1,8 mM), phenol red-free, HBSS from the stock solution, at five fixed concentrations diluted on a weight per volume basis: 1, 25, 100, 250 mg/ml and a neat or a saturated solution.
Приготвяне на клетъчния монослой
When testing a solid chemical, a very high concentration of 750 mg/ml should be included.
Монослоят от клетки MDCK CB997 се приготвя с отглеждане на субконфлуентни клетки в колби за клетъчни култури в среда DMEM/хранителна смес F12 (1x концентрат с L-глутамин, 15 mM HEPES, калций (с концентрация от 1,0-1,8 mM) и 10 % топлинно инактивиран FCS/FBS).
This concentration of chemical may have to be applied on the cells using a positive displacement pipette.
Важно е да се отбележи, че всички среди/разтвори, използвани по време на FL изследването, следва да съдържа калций при концентрация между 1,8 mM (200 mg/l) и 1,0 mM (111 mg/l) за да се гарантират образуването на тесни връзки и целостта.
If the toxicity is found to be between 25 and 100 mg/ml, the following additional concentrations should be tested twice: 1, 25, 50, 75, 100 mg/ml.
Обхватът на броя пасажи трябва да се контролира, за да се гарантира еднакво и възпроизводимо образуване на тесни връзки.
The FL20 value should be derived from these concentrations provided the acceptance criteria were met.
За предпочитане е броят на пасажите на клетките да бъде в рамките на обхват 3-30 след размразяването, тъй като в рамките на този обхват пасажи клетките имат сходни функционални възможности, което допринася за възпроизводимостта на резултатите от изследването.
The test chemicals are applied to the confluent cell monolayers after removal of the cell culture medium and washing twice with sterile, warm (37 °C), calcium-containing (at a concentration of 1,0-1,8 mM), phenol red-free, HBSS.
Преди извършване на метод за изпитване FL клетките се отделят от колбата чрез трипсинизация, центрофугират се и подходящ брой клетки се посява във вложките, поставени в 24-гнездни плаки (вж. допълнение 1).
Previously, the filters have been visually checked for any pre-existing damages that could be falsely attributed to potential incompatibilities with test chemicals.
За посяване на клетките следва да се използват вложки с диаметър дванадесет mm с мембрана от смесени целулозни естери, дебелина 80-150 μm и размер на порите 0,45 μm.
At least three replicates should be used for each concentration of the test chemical and for the controls in each run.
В изследването за валидиране са били използвани вложки Millicell-HA 12 mm.
After 1 min of exposure at room temperature, the test chemical should be carefully removed by aspiration, the monolayer should be washed twice with sterile, warm (37 °C), calcium-containing (at a concentration of 1,0-1,8 mM), phenol red-free, HBSS, and the fluorescein leakage should be immediately measured.
Свойствата на вложката и типа мембрана са важни, тъй като те могат да повлияят на клетъчния растеж и на свързването на химикала.
Concurrent negative (NC) and positive controls (PC) should be used in each run to demonstrate that monolayer integrity (NC) and sensitivity of the cells (PC) are within a defined historical acceptance range.
Някои типове химикали могат да се свързват с мембраната на вложката Millicell-HA, което би могло да засегне тълкуването на резултатите.
The suggested PC chemical is Brij 35 (CAS No. 9002-92-0) at 100 mg/ml.
Химикалите за изпитване на пригодност (вж. допълнение 3) следва да бъдат използвани, за да се докаже еквивалентността, ако са използвани други мембрани.
This concentration should give approximately 30 % fluorescein leakage (acceptable range 20-40 % fluorescein leakage, i.e. damage to cell layer).
Химическото свързване към мембраната на вложката е по-често срещано при катионните химикали, като бензалкониевият хлорид, които се привличат от заредената мембрана (7).
The suggested NC chemical is calcium-containing (at a concentration of 1,0-1,8 mM), phenol red-free, HBSS (untreated, blank control).
Химическото свързване към мембраната на вложката може да увеличи времето на експозиция на химикала, което води до надценяване на токсичния потенциал на химикала, но може също и физически да намали проникването на флуоресцеин през вложката чрез свързване на багрилото към катионния химикал, свързан към мембраната на вложката, което води до подценяване на токсичния потенциал на химикала.
A maximum leakage control should also be included in each run to allow for the calculation of FL20 values.
Това може лесно да се наблюдава чрез експозиция само на мембраната на най-високата концентрация на изпитвания химикал и последващо добавяне на багрило натриев флуоресцеин при нормалната концентрация за стандартното време (без клетъчни контроли).
Maximum leakage is determined using a control insert without cells.
Ако се получи свързване на багрилото натриев флуоресцеин, мембраната на вложката изглежда оцветена в жълто след промиването на изпитвания материал.
Determination of fluorescein permeability
В този контекст е от значение да се познават свойствата на свързване на изпитвания химикал, за да може да бъде тълкувано въздействието на химикалите върху клетките.
Immediately after removal of the test and control chemicals, 400 μl of 0,1 mg/ml sodium-fluorescein solution (0,01 % (w/v) in calcium-containing [at a concentration of 1,0-1,8 mM], phenol red-free, HBSS) is added to the inserts (e.g. Millicell-HA).
Посяването на клетките върху вложките следва да доведе до получаването на конфлуентен монослой в момента на експозицията на химикала.
The cultures are kept for 30 minutes at room temperature.
На вложка следва да бъдат добавени 1,6 × 105 клетки (400 μl от клетъчна суспензия с плътност 4 × 105 клетки/ml).
At the end of the incubation with fluorescein, the inserts are carefully removed from each well.
При тези условия конфлуентен монослой се получава обикновено след 96 часа отглеждане в култура.
Visual check is performed on each filter and any damage which may have occurred during handling is recorded.
Вложките следва да бъдат разгледани визуално преди посяване, така че да се гарантира, че всяко увреждане, отчетено с визуалния контрол, описан в точка 30, се дължи на боравенето.
The amount of fluorescein that leaked through the monolayer and the insert is quantified in the solution which remained in the wells after removal of the inserts.
Клетъчните култури MDCK следва да се съхраняват в инкубатори във влажна атмосфера при 5 % ± 1 % CO2 и 37 ± 1 °C.
Measurements are done in a spectrofluorometer at excitation and emission wavelengths of 485 nm and 530 nm, respectively.
Клетките следва да не са заразени с бактерии, вируси, микоплазма и гъбички.
The sensitivity of the spectrofluorometer should be set so that there is the highest numerical difference between the maximum FL (insert with no cells) and the minimum FL (insert with confluent monolayer treated with NC).
Прилагане на изпитваните и контролните химикали
Because of the differences in the used spectrofluorometer, it is suggested that a sensitivity is used which will give fluorescence intensity > 4000 at the maximum fluorescein leakage control.
За всяка опитна серия трябва да се приготви пресен изходен разтвор, който да се използва в рамките на 30 минути от приготвянето.
The maximum FL value should not be greater than 9999.
Изпитваните химикали следва да бъдат приготвени в HBSS, съдържащ калций (с концентрация от 1,0-1,8 mM) и несъдържащ фенолово червено, за да се избегне свързване със серумен белтък.
The maximum fluorescence leakage intensity should fall within the linear range of the spectrofluorometer used.
Разтворимостта на химикала при 250 mg/ml в HBSS следва да се оцени преди изпитването.
Interpretation of results and Prediction model
Ако при тази концентрация химикалът образува стабилна суспензия или емулсия (т.е. не се променя и не се утаява или разделя в повече от една фаза) за над 30 минути, HBSS все още може да се използва като разтворител.
The amount of FL is proportional to the chemical-induced damage to the tight junctions.
Независимо от това, ако за химикала е установено, че е неразтворим в HBSS при тази концентрация, трябва да бъде взето под внимание използването на други методи за изпитване вместо FL.
The percentage of FL for each tested concentration of chemical is calculated from the FL values obtained for the test chemical with reference to FL values from the NC (reading from the confluent monolayer of cells treated with the NC) and a maximum leakage control (reading for the amount of FL through an insert without cells).
Използването на леко минерално масло като разтворител в случаите, когато е установено, че химикалът е неразтворим в HBSS, следва да се разглежда предпазливо, тъй като няма достатъчно налични данни, за да се направи заключение относно характеристиките на FL изследването при такива условия.
The mean maximum leakage fluorescence intensity = x
Всички химикали, които ще бъдат изпитвани, се приготвят в стерилен HBSS, съдържащ калций (с концентрация от 1,0-1,8 mM) и несъдържащ фенолово червено, от изходния разтвор, в пет разреждания с фиксирани масови концентрации: 1, 25, 100, 250 mg/ml, както и чист или наситен разтвор.
The mean 0 % leakage fluorescence intensity (NC) = y
При изпитване на твърди химикали следва да бъде включена много висока концентрация от 750 mg/ml,.
The mean 100 % leakage is obtained by subtracting the mean 0 % leakage from the mean maximum leakage,
Тази концентрация на химикала може да трябва да се прилага върху клетките с използване на пипета с позитивно изтласкване.
i.e. x – y = z
Ако е констатирана токсичност между 25 и 100 mg/ml, следните допълнителни концентрации следва да бъдат изпитани два пъти: 1, 25, 50, 75, 100 mg/ml.
The percentage leakage for each fixed dose is obtained by subtracting the 0 % leakage to the mean fluorescence intensity of the three replicate readings (m), and dividing this value by the 100 % leakage, i.e. %FL = [(m-y) / z] × 100 %, where:
Стойността на FL20 следва да бъде получена от тези концентрации, при условие че са изпълнени критериите за приемливост.
m the mean fluorescence intensity of the three replicate measurements for the concentration involved
Изпитваните химикали се прилагат към конфлуентните клетъчни монослоеве след отстраняване на средата за отглеждане на клетки и измиване два пъти със стерилен топъл (37 °C) HBSS, съдържащ калций (с концентрация от 1,0-1,8 mM) и несъдържащ фенолово червено.
% FL the percent of the fluorescein which leaks through the cell layer
Преди това филтрите се проверяват визуално за съществуващи увреждания, които биха могли да бъдат невярно приписани на потенциални несъвместимости с изпитвани химикали.
The following equation for the calculation of the chemical concentration causing 20 % FL should be applied:
Във всяка серия трябва да се използват най-малко по три повторения за всяка концентрация на изпитвания химикал и за контролите.
FLD = [(A-B) / (C-B)] × (MC – MB) + MB
След 1 минута експозиция при стайна температура, изпитваният химикал следва да се отстранява внимателно чрез засмукване, монослоят трябва да се промие два пъти със стерилен топъл (37 °C) HBSS, съдържащ калций (с концентрация от 1,0-1,8 mM) и несъдържащ фенолово червено, и пропускането на флуоресцеин следва да бъде измерено незабавно.
Where:
Във всяка серия трябва да се използват паралелни отрицателни (ОК) и положителни контроли (ПК), за да се докаже, че целостта на монослоя (ОК) и чувствителността на клетките са в границите на определен предходно установен интервал на приемливост.
D % of inhibition
Предложеният химикал за ПК е Brij 35 (CAS № 9002-92-0) при 100 mg/ml.
A % damage (20 % fluorescein leakage)
Тази концентрация следва да дава приблизително 30 % пропускане на флуоресцеин (приемлив обхват 20-40 % пропускане на флуоресцеин, т.е. увреждане на клетъчния слой).
B % fluorescein leakage < A
Предложеният химикал за ОК е HBSS, съдържащ калций (с концентрация от 1,0-1,8 mM) и несъдържащ фенолово червено (нетретирана, празна контрола).
C % fluorescein leakage > A
Също така, във всяка серия следва да бъде включена контрола на максимално пропускане, за да се даде възможност за изчисляване на стойностите на FL20.
Concentration (mg/ml) of C
Максималното пропускане се определя с използване на контролна вложка без клетки.
Concentration (mg/ml) of B
Определяне на пропускливостта на флуоресцеин
The cut-off value of FL20 for predicting chemicals as ocular corrosives/severe irritants is given below:
Незабавно след отстраняването на изпитваните и контролните химикали, към вложките (напр.
C&L: classification and labelling.
Millicell-HA) се добавят 400 μl от 0,1 mg/ml разтвор на натриев флуоресцеин (0,01 % (w/v) в HBSS, съдържащ калций (с концентрация от 1,0-1,8 mM) и несъдържащ фенолово червено.
UN GHS C&L
Културите се съхраняват в продължение на 30 минути при стайна температура.
EU CLP C&L U.S.
В края на инкубирането с флуоресцеин вложките внимателно се отстраняват от всяко гнездо.
EPA C&L
Извършва се визуална проверка на всеки филтър и всяко увреждане, което може да се е получило при боравенето, се записва.
Category I
Флуоресцеинът, пропуснат през монослоя и вложката, се определя количествено в разтвора, останал в гнездата, след отстраняване на вложките.
The FL test method is recommended only for the identification of water soluble ocular corrosives and severe irritants (UN GHS Category 1, EU CLP Category 1, U.S. EPA Category I) (see paragraphs 1 and 10).
Измерванията се извършват в спектрофлуорометър при дължини на вълната на възбуждане и емисия съответно 485 nm и 530 nm.
In order to identify water soluble chemicals (substances and mixtures) (3) (6) (7) as “inducing serious eye damage” (UN GHS/EU CLP Category 1) or as an “ocular corrosive or severe irritant” (U.S. EPA Category I), the test chemical should induce an FL20 value of ≤ 100 mg/ml.
Чувствителността на спектрофлуорометъра се настройва така, че да има най-голяма числова разлика между максималното FL (вложка без клетки) и минималното FL (вложка с конфлуентен монослой, третирана с ОК).
Acceptance of results
Поради разликите в използвания спектрофлуорометър се предлага да се използва чувствителност, което ще даде на интензитет на флуоресценцията > 4000 при контролата на максимално пропускане на флуоресцеин.
The mean maximum fluorescein leakage value (x) should be higher than 4000 (see paragraph 31), the mean 0 % leakage (y) should be equal or lower than 300, and the mean 100 % leakage (z) should fall between 3700 and 6000.
Стойността на максималното FL не трябва да бъде по-голяма от 9999.
A test is considered acceptable if the positive control produced 20 % to 40 % damage to the cell layer (measure as % fluorescein leakage).
Интензитетът на флуоресценцията при максимално пропускане следва да попада в рамките на линейния обхват на използвания спектрофлуорометър.
Data
Тълкуване на резултатите и модел за прогнозиране
For each run, data from individual replicate wells (e.g. fluorescence intensity values and calculated percentage FL data for each test chemical, including classification) should be reported in tabular form.
Количеството FL е пропорционално на предизвиканите от химикала увреждания на тесните връзки.
In addition, means ± SD of individual replicate measurements in each run should be reported.
Процентът на FL за всяка изпитвана концентрация на химикал се изчислява въз основа на стойностите за FL, получени за изпитвания химикал, спрямо стойностите за FL от ОК (отчетена стойност от конфлуентния клетъчен монослой, третиран с ОК) и контролата на максимално пропускане (отчетена стойност за количеството FL през вложка без клетки).
Chemical CAS number, if known;
Средният интензитет на флуоресценцията при максимално пропускане = x
Purity and composition of the substance or mixture (in percentage(s) by weight), to the extent this information is available;
Средният интензитет на флуоресценцията при 0 % пропускане (ОК) = y
Physical-chemical properties relevant to the conduct of the study (e.g. physical state, volatility, pH, stability, water solubility, chemical class);
Средното 100 % пропускане се получава чрез изваждане на средното 0 % пропускане от средното максимално пропускане,
Treatment of the test/control chemical prior to testing, if applicable (e.g. warming, grinding);
т.е. x – y = z
Storage conditions;
Процентът на пропускане за всяка фиксирана доза се получава чрез изваждане на 0 %-ото пропускане от средната стойност на интензитета на флуоресценцията от отчетените стойности за трите повторения (m), и разделяне на тази стойност на 100 %-ото пропускане, т.е. % FL = [(m – y) / z] × 100 %, където:
Justification of the test method and Protocol Used
M средната стойност на интензитета на флуоресценцията от измерените стойности за трите повторения за съответната концентрация
Should include considerations regarding applicability domain and limitations of the test method;
% FL процентът на флуоресцеина, пропуснат през клетъчния слой
Description of cell system used, including certificate of authenticity and the mycoplasma status of the cell line;
Следва да се приложи следното уравнение за изчисляване на концентрацията на химикала, водеща до 20 % FL:
Details of test procedure used;
FLD = [(A – B) / (C – B)] × (MC – MB) + MB
Test chemical concentration(s) used;
където:
Duration of exposure to the test chemical;
D % на инхибиране
Duration of incubation with fluorescein;
A % увреждания (20 % пропускане на флуоресцеин)
Description of evaluation criteria used;
B % пропускане на флуоресцеин < A
Reference to historical data of the model (e.g. negative and positive controls, benchmark chemicals, if applicable);
C % пропускане на флуоресцеин > A
Information on the technical proficiency demonstrated by the laboratory;
Концентрация (mg/ml) на C
Tabulation of data from individual test chemicals and controls for each run and each replicate measurement (including individual results, means and SDs);
Концентрация (mg/ml) на B
The derived classification(s) with reference to the prediction model and/or decision criteria used;
Граничната стойност на FL20 за прогнозирането на корозивно/силно дразнещо действие на химикали върху очите е дадеа по-долу:
Should include considerations regarding a non-conclusive outcome (paragraph 35: FL20 > 100 mg/ml) and further testing;
C&L: класифициране и етикетиране
Conclusions
C&L по GHS на ООН
Available at: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev03/03files_e.html]
C&L по Регламент CLP на ЕС
Chapter B.5 of this Annex, Acute Eye Irritation/Corrosion
C&L по EPA на САЩ
Available at: [http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu
Категория I
OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, OECD Series on Testing and Assessment No. 34.
Методът за изпитване FL се препоръчва само за идентифициране на разтворими във вода химикали с корозивно и силно дразнещо действие върху очите (категория 1 по GHS на ООН и Регламент CLP на ЕС категория 1, категория I по EPA) (вж. точки 1 и 10).
DIAGRAM OF MDCK CELLS GROWN ON AN INSERT MEMBRANE FOR THE FL TEST METHOD
С цел да се идентифицират разтворими във вода химикали (вещества и смеси) (3) (6) (7), като „предизвикващи сериозно увреждане на очите“ (категория 1 по GHS на ООН/Регламент CLP на ЕС) или като „химикал с корозивно или силно дразнещо действие върху очите“ (категория I по EPA на САЩ), изпитваният химикал следва да предизвиква стойност FL20 при ≤ 100 mg/ml.
A confluent layer of MDCK cells is grown on the semi-permeable membrane of an insert.
Приемливост на резултатите
The inserts are placed into the wells of 24 well plates.
Средната стойност при максимално пропускане на флуоресцеин (х) трябва да е по-голяма от 4000 (вж. точка 31), средната стойност при 0 % пропускане (y) трябва да е равна на 300 или по-малка, а средната стойност при пропускане 100 % (z) трябва да е между 3700 и 6000.
Figure taken from: Wilkinson, P.J.
Едно изпитване се смята за приемливо, ако положителната контрола е предизвикала от 20 % до 40 % увреждане на клетъчния слой (измерване като % пропускане на флуоресцеин).
EPA Category I
Данни
Chemicals that produce corrosive (irreversible destruction of ocular tissue) or corneal involvement or irritation persisting for more than 21 days (2).
Данните от отделните гнезда с повторения (напр. стойностите за интензитета на флуоресценцията и данните за изчисления процент FL за всеки изпитван химикал, включително класифициране) следва да бъдат представени в таблична форма за всяка серия.
EU CLP (Regulation (EC) No1272/2008 on Classification, Labelling and Packaging of Substances and Mixtures)
Освен това следва да се протоколират средните стойности ± стандартното отклонение на отделните измервания на повторения във всяка серия.
Implements in the European Union (EU) the UN GHS system for the classification of chemicals (substances and mixtures).
CAS номер на химикала, ако е известен;
Can be estimated by the determination of the concentration at which the tested chemical causes 20 % of the fluorescein leakage through the cell layer.
Чистота и състав на веществото или сместа (в тегловни проценти), доколкото се разполага с такава информация;
Fluorescein leakage
Физични и химични свойства, относими към провеждането на изследването (напр. агрегатно състояние, летливост, pH, стабилност, разтворимост във вода, клас на химикала);
the amount of fluorescein which passes through the cell layer, measured spectrofluorometrically.
Обработка на изпитвания/контролния химикал преди изпитването, ако е приложимо (напр. нагряване, стриване);
GHS (Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals by the United Nation (UN))
Условия за съхранение:
A system proposing the classification of chemicals (substances and mixtures) according to standardised types and levels of physical, health and environmental hazards, and addressing corresponding communication elements, such as pictograms, signal words, hazard statements, precautionary statements and safety data sheets, so that to convey information on their adverse effects with a view to protect people (including employers, workers, transporters, consumers and emergency responders) and the environment.
Обосновка на използвания метод за изпитване и протокол
GHS Category 1
Следва да включва съображения относно областта на приложимост и ограниченията на метода за изпитване;
Used in the context of the UN GHS as a mixture or solution composed of two or more substances in which they do not react.
Описание на използваната клетъчна система, включително сертификат за автентичност и микоплазмен статус на клетъчната линия;
Not-classified
Подробни данни за използваната процедура за изпитване;
Chemicals that are not classified as UN GHS Categories 1, 2A, or 2B; EU CLP Categories 1 or 2; or U.S. EPA Categories I, II, or III ocular irritants.
Използвана концентрация (концентрации) на изпитвания химикал;
A chemical that causes irreversible tissue damage to the eye. (b) Chemicals that are classified as UN GHS Category 1; EU CLP Category 1; or U.S.
Продължителност на експозицията на изпитвания химикал:
EPA Category I ocular irritants.
Продължителност на инкубирането с флуоресцеин;
Ocular irritant