natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Тъй като активирането на пътя Keap1-Nrf2-ARE разглежда само второто основно събитие от AOP, свързан с кожната сенсибилизация, малко е вероятно информацията от методи за изпитване, основана на активирането на този път, да е достатъчна, когато е използвана самостоятелно, за да се направи заключение относно потенциала за кожна сенсибилизация на химикалите.
Negative results should be interpreted with caution as substances with an exclusive reactivity towards lysine-residues can be detected as negative by the test method.
Ето защо данните, събрани с настоящия метод за изпитване, следва да се разглеждат в контекста на интегрирани подходи, като например IATA, като се комбинират с друга допълнителна информация, като например информация, получена от химични аналози от изследвания in vitro, фокусирани върху други основни събития от AOP, свързан с кожната сенсибилизация, както и от методи, различни от изпитвания, включително асоцииране (read-across).
Furthermore, because of the limited metabolic capability of the cell line used (21) and because of the experimental conditions, pro-haptens (i.e. chemicals requiring enzymatic activation for example via P450 enzymes) and pre-haptens (i.e. chemicals activated by auto-oxidation) in particular with a slow oxidation rate may also provide negative results.
Примери за това как да се използва методът за изпитване ARE-Nrf2 луцифераза в комбинация с друга информация, са описани в литературата (13) (16) (17) (18) (19).
Test chemicals that do not act as a sensitiser but are nevertheless chemical stressors may lead on the other hand to false positive results (14).
Настоящият метод за изпитване може да се използва в подкрепа на разграничаването между кожните сенсибилизатори (т.е. категория 1 по GHS на ООН/Регламент CLP) и непредизвикващите сенсибилизация вещества в контекста на IATA.
Furthermore, highly cytotoxic test chemicals cannot always be reliably assessed.
Настоящият метод за изпитване не може да се използва самостоятелно за определяне на подкатегории 1A и 1B за кожните сенсибилизатори съгласно определението по GHS на ООН/Регламент CLP, нито за прогнозиране на потенциала при решения във връзка с оценката на безопасността.
Finally, test chemicals that interfere with the luciferase enzyme can confound the activity of luciferase in cell-based assays causing either apparent inhibition or increased luminescence (22).
Независимо от това, в зависимост от регулаторната рамка, даден положителен резултат може да се използва самостоятелно за класифициране на даден химикал в категория 1 по GHS на ООН/Регламент CLP.
For example, phytoestrogen concentrations higher than 1 μM were reported to interfere with the luminescence signals in other luciferase-based reporter gene assays due to over-activation of the luciferase reporter gene (23).
Въз основа на набора от данни от изследването за валидиране и изпитване и на вътрешно извършеното изпитване, използвано за независимата партньорска проверка на метода на изпитване, бе доказано, че изследването KeratinoSensTM може да се прилага и в лаборатории с опит в клетъчните култури.
As a consequence, luciferase expression obtained at high concentrations of phytoestrogens or similar chemicals suspected of producing phytoestrogen-like over-activation of the luciferase reporter gene needs to be examined carefully (23).
Нивото на възпроизводимостта в прогнозите, които могат да се очакват от метода за изпитване, е от порядъка на 85 % вътре в самата лаборатория и между лабораториите (14).
In cases where evidence can be demonstrated on the non-applicability of the test method to other specific categories of test chemicals, the test method should not be used for those specific categories.
Точността (77 % — 155/201), чувствителността (78 % — 71/91) и специфичността (76 % — 84/110) на изследването KeratinoSensTM при разграничаването между кожните сенсибилизатори (т.е. категория 1 по GHS на ООН/Регламент CLP) и непредизвикващите сенсибилизация вещества, при сравнение с резултатите от LLNA, са изчислени, като са взети предвид всички данни, представени на EURL ECVAM за оценка и партньорска проверка на метода за изпитване (14).
In addition to supporting discrimination between skin sensitisers and non-sensitisers, the KeratinoSensTM assay also provides concentration-response information that may potentially contribute to the assessment of sensitising potency when used in integrated approaches such as IATA (19).
Тези стойности са подобни на онези, които бяха публикувани наскоро въз основа на вътрешно изпитване на около 145 вещества (77 % точност, 79 % чувствителност, 72 % специфичност) (13).
However, further work preferably based on reliable human data is required to determine how KeratinoSensTM assay results can contribute to potency assessment (24) and to sub-categorisation of sensitisers according to UN GHS/CLP.
При изследването KeratinoSensTM е по-вероятно подценяване при прогнозиране на химикали, които са с малък до умерен потенциал за кожна сенсибилизация (т.е. кожна сенсибилизация подкатегория 1B по GHS на ООН/Регламент CLP), отколкото при химикали, показващи голям потенциал за кожна сенсибилизация (т.е. подкатегория 1A по GHS на ООН/Регламент CLP) (13) (14).
The ARE-Nrf2 luciferase test method makes use of an immortalised adherent cell line derived from HaCaT human keratinocytes stably transfected with a selectable plasmid.
Взета като цяло, тази информация показва ползата от изследването KeratinoSensTM за подпомагане на определянето на опасността от кожна сенсибилизация.
The cell line contains the luciferase gene under the transcriptional control of a constitutive promoter fused with an ARE element from a gene that is known to be up-regulated by contact sensitisers (25) (26).
Независимо от това стойностите за точността, посочени тук за изследването KeratinoSensTM като самостоятелен метод за изпитване, са само ориентировъчни, тъй като методът за изпитване трябва да се разглежда в съчетание с други източници на информация в контекста на IATA и в съответствие с разпоредбите на точка 9 по-горе.
The luciferase signal reflects the activation by sensitisers of endogenous Nrf2 dependent genes, and the dependence of the luciferase signal in the recombinant cell line on Nrf2 has been demonstrated (27).
Освен това при оценяването на методи за сенсибилизация на кожата, които не използват животни, следва да се има предвид, че LLNA, както и други изпитвания върху животни, могат да не отразяват напълно положението при вида, представляващ интерес, т.е. при хората.
This allows quantitative measurement (by luminescence detection) of luciferase gene induction, using well established light producing luciferase substrates, as an indicator of the activity of the Nrf2 transcription factor in cells following exposure to electrophilic substances.
В настоящия метод за изпитване терминът „изпитван химикал“ се използва за позоваване на онова, което се изпитва, и не е свързан с приложимостта на метода за изпитване ARE-Nrf2 луцифераза за изпитване на вещества и/или смеси.
Test chemicals are considered positive in the KeratinoSens™ assay if they induce a statistically significant induction of the luciferase activity above a given threshold (i.e. > 1,5 fold or 50 % increase), below a defined concentration which does not significantly affect cell viability (i.e. below 1000 μM and at a concentration at which the cellular viability is above 70 % (9) (12)).
Въз основа на наличните понастоящем данни бе показано, че изследването KeratinoSensTM е приложимо по отношение на изпитвани химикали, които обхващат различни органични функционални групи, механизми за отговор, потенциал за кожна сенсибилизация (както е определена спроучвания in vivo ) и физични и химични свойства (9) (12) (13) (14).
For this purpose, the maximal fold induction of the luciferase activity over solvent (negative) control (Imax) is determined.
Бяха изпитвани основно вещества с една съставка, макар че съществува ограничен обем данни и за изпитването на смеси (20).
Furthermore, since cells are exposed to series of concentrations of the test chemicals, the concentration needed for a statistically significant induction of luciferase activity above the threshold (i.e. EC1,5 value) should be interpolated from the dose-response curve (see paragraph 32 for calculations).
Независимо от това методът за изпитване е технически приложим за изпитването на вещества с повече съставки и на смеси.
Finally, parallel cytotoxicity measurements should be conducted to assess whether luciferase activity induction levels occur at sub-cytotoxic concentrations.
Въпреки това, преди използването на настоящия метод за изпитване по отношение на смес с цел генериране на данни за планирана регулаторна цел, следва да се разгледа въпросът дали той може да даде адекватни резултати за тази цел и, ако е така, защо.
Prior to routine use of the ARE-Nrf2 luciferase assay that adheres to this test method, laboratories should demonstrate technical proficiency, using the ten Proficiency Substances listed in Appendix 2.
Освен това, когато се извършва изпитване на вещества с повече съставки или на смеси, следва да се обърне внимание на възможното влияние на цитотоксични съставки върху наблюдаваните отклици.
Performance standards (PS) (28) are available to facilitate the validation of new or modified in vitro ARE-Nrf2 luciferase test methods similar to the KeratinoSens™ assay and allow for timely amendment of this test method for their inclusion.
Методът за изпитване е приложим за изпитвани химикали, които са разтворими или образуват стабилна дисперсия (т.е. колоиден разтвор или суспензия, в които изпитваният химикал не се утаява или разделя от разтворителя в отделна фаза) или във вода, или в DMSO (включително всички съставки на изпитвания химикал при изпитване на вещество с повече съставки или на смес).
Mutual Acceptance of Data (MAD) according to the OECD agreement will only be guaranteed for test methods validated according to the PS, if these test methods have been reviewed and included in the corresponding test guideline by OECD.
Изпитваните химикали, които не отговарят на тези условия при изискваната най-висока крайна концентрация от 2000 μM (срв. с точка 22), все пак могат да се изпитват при по-ниски концентрации.
Currently, the only method covered by this test method is the scientifically valid KeratinoSensTM assay (9) (12) (13) (14).
В такъв случай резултатите, отговарящи на критериите за положителност, посочени в точка 39, могат да продължат да бъдат използвани за подпомагане на идентифицирането на изпитвания химикал като кожен сенсибилизатор, докато получен отрицателен резултат с концентрации < 1000 μM следва да се смята за недостатъчен за формулиране на заключение (вж. модела на прогнозиране в точка 39).
The Standard Operating Procedures (SOP) for the KeratinoSensTM assay is available and should be employed when implementing and using the test method in the laboratory (15).
По принцип веществата с LogP до 5 са преминали успешно изпитването, докато силно хидрофобни вещества с LogP над 7 са извън известната приложимост на метода за изпитване (14).
Laboratories willing to implement the test method can obtain the recombinant cell line used in the KeratinoSensTM assay by establishing a licence agreement with the test method developer.
За вещества с LogP между 5 и 7 е налична само ограничена информация.
The following paragraphs provide with a description of the main components and procedures of the ARE-Nrf2 luciferase test method.
Отрицателните резултати следва да се тълкуват внимателно, тъй като веществата с изключителна реакционна способност спрямо лизинови остатъци могат да бъдат открити като отрицателни от метода за изпитване.
Preparation of the keratinocyte cultures
Освен това, поради ограничения метаболитен капацитет на използваната клетъчна линия (21) и поради условията на опита, про-хаптените (т.е. химикалите, които изискват ензимно активиране, например чрез P450 ензими) и пре-хаптените (т.е. химикалите, активирани чрез самоокисление), по-специално тези с малка скорост на окисление, могат също да дадат отрицателни резултати.
A transgenic cell line having a stable insertion of the luciferase reporter gene under the control of the ARE-element should be used (e.g. the KeratinoSens™ cell line).
От друга страна изпитвани химикали, които не действат като сенсибилизатор, но които въпреки това са химични стресови фактори, могат да доведат до неверни положителни резултати (14).
Upon receipt, cells are propagated (e.g. 2 to 4 passages) and stored frozen as a homogeneous stock.
Освен това, силно цитотоксичните изпитвани химикали не винаги могат да бъдат надеждно оценени.
Cells from this original stock can be propagated up to a maximum passage number (i.e. 25 in the case of KeratinoSensTM) and are employed for routine testing using the appropriate maintenance medium (in the case of KeratinoSensTM this represents DMEM containing serum and Geneticin).
Накрая, изпитвани химикали, които пречат на ензима луцифераза, могат да доведат до невъзможност за разграничаване на дейността на луциферазата в изследвания, основани на клетки, причинявайки или очевидно потискане, или увеличена луминесценция (22).
For testing, cells should be 80-90 % confluent, and care should be taken to ensure that cells are never grown to full confluence.
Например за концентрации на фитоестрогени, по-високи от 1 μM, има данни, че влияят на сигналите за луминесценцията в други изпитвания с репортерни гени, основани на луциферазата, поради свръхактивиране на луциферазния репортерен ген (23).
One day prior to testing cells are harvested, and distributed into 96-well plates (10000 cells/well in the case of KeratinoSensTM).
Вследствие на това експресията на луциферазата, получена при високи концентрации на фитоестрогени или подобни химикали, за които се подозира, че предизвикват подобно на фитоестрогени свръхактивиране на луциферазния репортерен ген, трябва да бъде внимателно разгледана (23).
Attention should be paid to avoid sedimentation of the cells during seeding to ensure homogeneous cell number distribution across wells.
В случаите, в които могат да бъдат представени доказателства за неприложимостта на метода за изпитване по отношение на други специфични категории изпитвани химикали, методът за изпитване не следва да се използва за тези специфични категории.
If this is not the case, this step may give raise to high well-to-well variability.
В допълнение към подпомагането на разграничаването на кожни сенсибилизатори и непредизвикващи сенсибилизация вещества, изследването KeratinoSensTM също така предоставя информация концентрация-отклик, която потенциално може да допринесе за оценката на потенциала за сенсибилизация, когато се използва в интегрирани подходи като IATA (19).
For each repetition, three replicates are used for the luciferase activity measurements, and one parallel replicate used for the cell viability assay.
Изисква се обаче допълнителна работа, за предпочитане въз основа на надеждни данни за хора, за да се определи как резултатите от изследването KeratinoSensTM могат да допринесат за оценка на потенциала (24) и за подкатегоризиране на сенсибилизаторите в съответствие с GHS на ООН/Регламента CLP.
Preparation of the test chemical and control substances
В метода за изпитване ARE-Nrf2 луцифераза се използва безсмъртна монослойна клетъчна линия, получена от човешки кератиноцити от HaCaT, стабилно трансфектирана със селективен плазмид.
The test chemical and control substances are prepared on the day of testing.
Клетъчната линия съдържа луциферазния ген под контрола под транскрипционния контрол на конститутивен промотор с ARE-елемент от ген, за чиято експресия е известно, че се повишава от контактни сенсибилизатори (25) (26).
For the KeratinoSensTM assay, test chemicals are dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) to the final desired concentration (e.g. 200 mM).
Сигналът от луциферазата отразява активиране от сенсибилизатори на гени, зависими от ендогенен Nrf2, като зависимостта на сигнала от луциферазата от Nrf2 в рекомбинантните клетъчни линии е доказана (27).
The DMSO solutions can be considered self-sterilising, so that no sterile filtration is needed.
Това позволява количествено измерване (чрез откриване на луминесценция) на индукция на луциферазния ген, с използване добре познати луциферазни субстрати, излъчващи светлина, като показател за активността на транскрипционния фактор Nrf2 в клетки след експозиция на електрофилни вещества.
Test chemical not soluble in DMSO is dissolved in sterile water or culture medium, and the solutions sterilised by e.g. filtration.
Изпитваните химикали се считат за положителни в изследването KeratinoSensTM, ако предизвикват статистически значима индукция на луциферазна дейност над определен праг (т.е. > 1,5 пъти или увеличение от 50 %) под определената прагова концентрация, която не оказва значимо влияние върху жизнеспособността на клетките (т.е. под 1000 μM и при концентрация, при които жизнеспособността на клетките е над 70 % (9) (12)).
For a test chemical which has no defined molecular weight (MW), a stock solution is prepared to a default concentration (40 mg/mL or 4 % (w/v)) in the KeratinoSensTM assay.
За тази цел се определя максималната кратност на индукцията на луциферазна активност (Imax) по отношение на контролата на разтворител (отрицателната контрола).
In case solvents other than DMSO, water or the culture medium are used, sufficient scientific rationale should be provided.
Освен това, тъй като клетките се експонират на поредица от концентрации на изпитваните химикали, концентрацията, необходима за статистически значима индукция на луциферазна активност над прага (т.е. стойността EC1,5 ) следва да се определи чрез интерполация от кривата доза-отклик (вж. точка 32 за изчисленията).
Based on the stock DMSO solutions of the test chemical, serial dilutions are made using DMSO to obtain 12 master concentrations of the chemical to be tested (from 0,098 to 200 mM in the KeratinoSensTM assay).
На последно място, следва да се извършат паралелни измервания на цитотоксичността, за да се прецени дали равнищата на индукция на луциферазна активност се получават при субцитотоксични концентрации.
For a test chemical not soluble in DMSO, the dilutions to obtain the master concentrations are made using sterile water or sterile culture medium.
Преди рутинното използване на изследването ARE-Nrf2 луцифераза, което се придържа към настоящия метод за изпитване, лабораториите следва да докажат техническата си компетентност, като използват десетте вещества за изпитването за пригодност, изброени в допълнение 2.
Independent of the solvent used, the master concentrations, are then further diluted 25 fold into culture medium containing serum, and finally used for treatment with a further 4 fold dilution factor so that the final concentrations of the tested chemical range from 0,98 to 2000 μM in the KeratinoSensTM assay.
На разположение са стандарти за ефективност (СЕ) (28) за улесняване на валидирането на нови или модифицирани in vitro методи за изпитване ARE-Nrf2 луцифераза, подобни на изследването KeratinoSenTM, и за даване на възможност за своевременно изменение на настоящия метод за изпитване с оглед на тяхното включване.
Alternative concentrations may be used upon justification (e.g. in case of cytotoxicity or poor solubility).
Взаимното приемане на данните (MAD) според споразумението на ОИСР може да бъде гарантирано единствено за методи за изпитване, валидирани съгласно PS, ако тези методи за изпитване са преразгледани и включени в съответните насоки за изпитване на ОИСР.
The negative (solvent) control used in the KeratinoSensTM assay is DMSO (CAS No. 67-68-5, ≥ 99 % purity), for which six wells per plate are prepared.
Понастоящем единственият метод, обхванат от настоящия метод за изпитване, е научно валидното изследване KeratinoSensTM (9) (12) (13) (14).
It undergoes the same dilution as described for the master concentrations in paragraph 22, so that the final negative (solvent) control concentration is 1 %, known not to affect cell viability and corresponding to the same concentration of DMSO found in the tested chemical and in the positive control.
Стандартните работни процедури (СРП) за изследването KeratinoSensTM са на разположение и трябва да бъдат използвани при прилагане и използване на метода за изпитване в лабораторията (15).
For a test chemical not soluble in DMSO, for which the dilutions were made in water, the DMSO level in all wells of the final test solution must be adjusted to 1 % as for the other test chemicals and control substances.
Лабораториите, които желаят да прилагат метода за изпитване, могат да получат рекомбинантната клетъчна линия, използвана в изследването KeratinoSensTM, чрез лицензионно споразумение с разработилия метода за изпитване.
The positive control used in the case of the KeratinoSensTM assay is cinnamic aldehyde (CAS No. 14371-10-9, ≥ 98 % purity), for which a series of 5 master concentrations ranging from 0,4 to 6,4 mM are prepared in DMSO (from a 6,4 mM stock solution) and diluted as described for the master concentrations in paragraph 22, so that the final concentration of the positive control range from 4 to 64 μM.
В следващите точки се предоставя описание на основните компоненти и процедури на метода за изпитване ARE-Nrf2 луцифераза.
Other suitable positive controls, preferentially providing EC1,5 values in the mid-range, may be used if historical data are available to derive comparable run acceptance criteria.
Приготвяне на културите от кератиноцити
Application of the test chemical and control substances
Следва да се използва трансгенна клетъчна линия, които съдържа стабилна инсерция на луциферазния репортерен ген под контрола на ARE-елемент (например клетъчна линия KeratinoSens™).
For each test chemical and positive control substance, one experiment is needed to derive a prediction (positive or negative), consisting of at least two independent repetitions containing each three replicates (i.e. n = 6).
След получаване клетките се размножават (напр.
In case of discordant results between the two independent repetitions, a third repetition containing three replicates should be performed (i.e. n = 9).
2 до 4 пасажа) и се съхраняват замразени като хомогенни изходни култури.
Each independent repetition is performed on a different day with fresh stock solution of test chemicals and independently harvested cells.
Клетки от тези първоначални изходни култури могат да се размножават до максимален брой пасажи (т.е.
Cells may come from the same passage however.
25 при KeratinoSensTM) и се използват за рутинни изпитвания, като се използва подходящата среда за поддържане (при KeratinoSensTM това са серум, съдържащ DMEM, и генитицин).
After seeding as described in paragraph 20, cells are grown for 24 hours in the 96-wells microtiter plates.
За изпитването клетките трябва да са достигнали 80-90 % сливане, и следва да се положат грижи, за да се гарантира, че клетките никога не се отглеждат до пълно сливане.
The medium is then removed and replaced with fresh culture medium (150 μl culture medium containing serum but without Geneticin in the case of KeratinoSensTM) to which 50 μl of the 25 fold diluted test chemical and control substances are added.
Един ден преди изпитването клетките се събират и разпределят в 96-гнездни плаки (10000 клетки/гнездо при KeratinoSensTM).
At least one well per plate should be left empty (no cells and no treatment) to assess background values.
Следва да се обърне внимание да се избягва утаяване на клетките при посяването, за да се гарантира хомогенно разпределение на броя на клетките между гнездата.
The treated plates are then incubated for about 48 hours at 37 ± 1 °C in the presence of 5 % CO2 in the KeratinoSensTM assay.
Ако случаят не е такъв, тази стъпка може да породи голямо вариране между гнездата.
Care should be taken to avoid evaporation of volatile test chemicals and cross-contamination between wells by test chemicals by e.g. covering the plates with a foil prior to the incubation with the test chemicals.
При всяко извършено повтаряне, за измерване на луциферазната активност се използват три повторения и едно паралелно повторение, използвано за изследването на клетъчната жизнеспособност.
Luciferase activity measurements
Приготвяне на изпитвания химикал и веществата за контроли
Three factors are critical to ensure appropriate luminescence readings: