natgillin/translations-raw huggingface dataset:
За някои типове изпитвани химикали (напр. фармацевтични продукти за хуманна употреба), обхванати от специфично регулиране, тези граници могат да варират.
For the processes described in the following paragraphs (44-49) it is important that all solutions or stable suspensions should be used within their expiration date, or should be freshly prepared if needed.
Химикалите, които показват насищане по отношение на токсикокинетични свойства, или предизвикват процеси на детоксикация, които могат да доведат до намаляване на експозицията след дългосрочно прилагане, могат да представляват изключения от критериите за определяне на дозата и следва да се оценяват за всеки отделен случай.
Also in the following paragraphs, the times taken to (i) remove each tissue after necropsy, (ii) process each tissue into cell/nuclei suspensions, and (iii) process the suspension and prepare the slides are all considered critical variables (see Definitions, Appendix 1), and acceptable lengths of time for each of these steps should have been determined during establishment of the method and demonstration of proficiency.
В допълнение към максималната доза (МДД, максимално възможна доза, максимална експозиция или пределна доза) за всяко време на вземане на проби следва да бъдат избрани най-малко две допълнителни дози, на подходящо отстояние една от друга, в намаляваща последователност (за предпочитане разделени от 10), за да се докажат отклици, свързани с дозата както при острия, така и при субакутния вариант на кометното изследване.
Animals will be euthanised, consistent with effective animal welfare legislation and 3Rs principles, at the appropriate time(s) after the last treatment with a test chemical.
Нивата на доза обаче следва също така за предпочитане да обхващат от максималната до слаба токсичност или липса на токсичност.
Selected tissue(s) is removed, dissected, and a portion is collected for the comet assay, whilst at the same time a section from the same part of the tissue should be cut and placed in formaldehyde solution or appropriate fixative for possible histopathology analysis (see paragraph 55) according to standard methods (12).
Когато токсичност за прицелната тъкан се наблюдава при всички изпитвани нива на доза, препоръчително е допълнително проучване при нетоксични дози (вж. точки 54-55).
The tissue for the comet assay is placed into mincing buffer, rinsed sufficiently with cold mincing buffer to remove residual blood, and stored in ice-cold mincing buffer until processed.
За проучванията, целящи по-подробно проучване на формата на кривата доза-отклик, може да се изисква допълнителна група (групи) на определена доза.
In situ perfusion may also be performed, e.g. for liver, kidney.
Прилагане на дозите
Many published methods exist for cell/nuclei isolation.
Във всички случаи пътят следва да се избере така, че да осигури достатъчна експозиция на прицелната тъкан (или тъкани).
These include mincing of tissues such as liver and kidney, scraping mucosal surfaces in the case of the gastro-intestinal tract, homogenization and enzymic digestion.
Интраперитонеалното инжектиране обикновено не се препоръчва, тъй като то не е типичен относим път на експозиция на човека, и следва да бъде използвано само със специална обосновка (напр. някои вещества за положителни контроли, за целите на проучване, или за някои лекарства, които се прилаган по интраперитонеален път).
The JaCVAM validation trial only studied isolated cells, and therefore in terms of establishing the method and being able to refer to the JaCVAM trial data for demonstration of proficiency, isolated cells are preferred.
Обемът не следва да превишава 1 ml/100 g телесно тегло, освен в случаите, когато се прилагат водни разтвори, когато обемът може да достигне 2 ml/100 g телесно тегло.
However, it has been shown that there was no essential difference in the assay result whether isolated cells or nuclei were used (8).
Обеми, по-високи от този (ако това е позволено от законодателството за хуманно отношение към животните), следва да се обосноват.
Also different methods to isolate cells/nuclei (e.g. homogenizing, mincing, enzymic digestion and mesh filtration) gave comparable results (55).
Винаги, когато е възможно, следва да се постигат различни нива на доза чрез регулиране на концентрацията на формулировката за дозиране, за да се осигури постоянен обем във връзка с телесното тегло на всички нива на доза.
Consequently, either isolated cells or isolated nuclei can be used.
Момент на пробовземане
A laboratory should thoroughly evaluate and validate tissue-specific methods of single cell/nuclei isolation.
Моментът на пробовземане е критична променлива, защото се определя от периода, който е необходим изпитваните химикали да достигнат максимална концентрация в прицелната тъкан и да бъдат предизвикани скъсванията във веригата на ДНК, но преди тези скъсвания да бъдат отстранени, поправени или преди да доведат до смърт на клетките.
As discussed in paragraph 40, the persistence of some of the lesions that lead to the DNA strand breaks detected by the comet assay may be very short (52) (53).
Устойчивостта на някои увреждания, които водят до скъсвания във веригата на ДНК, откривани от кометното изследване, може да бъде много кратка, поне за някои химикали, изпитвани in vitro (52) (53).
Therefore, whatever method is used to prepare the single cell/nuclei suspensions, it is important that tissues are processed as soon as possible after the animals have been euthanised and placed in conditions that reduce the removal of lesions (e.g. by maintaining the tissue at low temperature).
Съответно, ако има съмнения за такива преходни ДНК, следва да се вземат мерки за смекчаване на тези загуби, като се гарантира, че тъканите се събират достатъчно рано, евентуално по-рано от моментите по подразбиране, посочени по-долу.
The cell suspensions should be kept ice-cold until ready for use, so that minimal inter-sample variation and appropriate positive and negative control responses can be demonstrated.
Оптималният момент (моменти) на вземане на проби може да бъде специфичен за химикала или за пътя, което води например до бърза експозиция на тъкан с интравенозно прилагане или експозиция при вдишване.
PREPARATION OF SLIDES
Съответно, при наличие, моментите на вземане на проби следва да бъдат определени въз основа на данни за кинетиката (напр. времето (Tmax) на достигане на пикова концентрация в плазмата или в тъканта (Cmax), или в стационарно състояние при множество прилагания).
Slide preparation should be done as soon as possible (ideally within one hour) after single cell/nuclei preparation, but the temperature and time between animal death and slide preparation should be tightly controlled and validated under the laboratory's conditions.
При липса на данни за кинетиката подходящ компромис за измерване на генотоксичността е да се вземат проби от 2 до 6 часа след последното третиране за две или повече третирания, или както в периода 2-6 часа, така и 16-26 часа след еднократно прилагане, въпреки че следва да се положат грижи за аутопсия на всички животни в същия момент след последната (или единствената) доза.
The volume of the cell suspension added to low melting point agarose (usually 0,5-1,0 %) to make the slides should not reduce the percentage of low melting point agarose to less than 0,45 %.
Информация относно появата на токсични ефекти в целеви органи (ако е налична) също може да бъде използвана за избор на подходящи моменти на вземане на проби.
The optimum cell density will be determined by the image analysis system used for scoring comets.
Общи клинични наблюдения, свързани със здравето на животните, следва да бъдат извършвани и записвани поне един път дневно, за предпочитане по едно и също време всеки ден и като се има предвид пиковият период за поява на очакваните ефекти след дозиране (54).
Lysis
Поне два пъти дневно всички животни следва да се наблюдават за заболяемост и смъртност.
Lysis conditions are also a critical variable and may interfere with the strand breaks resulting from specific types of DNA modifications (certain DNA alkylations and base adducts).
При по-дългосрочни изследвания всички животни трябва да бъдат претегляни поне веднъж седмично, както и при завършване на периода на изпитването.
It is therefore recommended that the lysis conditions be kept as constant as possible for all slides within an experiment.
Консумацията на храна трябва да се измерва при всяка смяна на храни и поне веднъж седмично.
Once prepared, the slides should be immersed in chilled lysing solution for at least one hour (or overnight) at around 2-8 °C under subdued lighting conditions e.g. yellow light (or light proof) that avoid exposure to white light that may contain UV components.
Животни, проявяващи нелетални признаци на прекомерна токсичност, следва да бъдат умъртвени преди приключването на периода на изпитване, и като цяло не се използват за кометен анализ.
After this incubation period, the slides should be rinsed to remove residual detergent and salts prior to the alkali unwinding step.
Събиране на тъкани
This can be done using purified water, neutralization buffer or phosphate buffer.
Тъй като е възможно предизвикването на скъсвания във веригата на ДНК (комети) да бъде изследвано в почти всяка тъкан, обосновката на избора на тъкан (тъкани), която трябва да бъде събрана, следва да бъде ясно определена и да се основава на причината за провеждането на изследването и на всички съществуващи данни за АРМЕ, генотоксичност, канцерогенност или други данни за токсичност на проучвания химикал.
Electrophoresis buffer can also be used.
Важни фактори за разглеждане следва да включват пътя на прилагане (въз основа на вероятния път или пътища на експозиция на човека), прогнозираните разпределение в тъканите и абсорбция, ролята на метаболизма както и възможния механизъм на действие на изпитваните химикали.
This would maintain the alkaline conditions in the electrophoresis chamber.
Черният дроб е тъканта, която е най-често изследвана и за които има най-много данни.
Unwinding and electrophoresis
Следователно, при липсата на каквато и да било съпътстваща информация и ако не са идентифицирани специфични тъкани, представляващи интерес, вземането на проба от черния дроб би било обосновано, тъй като това е първоначалното място за метаболизма на ксенобиотици и често е силно експониран както на базовото вещество (вещества), така и на метаболита (метаболитите).
Slides should be randomly placed onto the platform of a submarine-type electrophoresis unit containing sufficient electrophoresis solution such that the surfaces of the slides are completely covered (the depth of covering should also be consistent from run to run).
В някои случаи проверка на място на пряк контакт (например за химикали, прилагани орално, жлезистият стомах или дванадесетопръстникът/празното черво, или за инхалирани химикали — белият дроб) може да е относима в най-голяма степен.
In another type of comet assay electrophoresis units i.e. with active cooling, circulation and high capacity power supply a higher solution covering will result in higher electric current while the voltage is kept constant.
Допълнителни или алтернативни тъкани следва да бъдат подбрани въз основа на специфичните причини за провежданото изпитване, но може да се окаже полезно да се разгледат множество тъкани в същите животни, при условие че лабораторията е доказала пригодността си по отношение на тези тъкани и компетентността си при едновременно боравене с множество тъкани.
A balanced design should be used to place slides in the electrophoresis tank to mitigate the effects of any trends or edge effect within the tank and to minimize batch-to-batch variability, i.e., in each electrophoresis run, there should be the same number of slides from each animal in the study and samples from the different dosage groups, negative and positive controls, should be included.
Приготвяне на образците
The slides should be left for at least 20 minutes for the DNA to unwind, and then subjected to electrophoresis under controlled conditions that will maximize the sensitivity and dynamic range of the assay (i.e. lead to acceptable levels of % tail DNA for negative and positive controls that maximize sensitivity).
За процедурите, описани в следващите точки (44-49) е важно всички разтвори или стабилни суспензии да се използват до датата на изтичане на срока им на годност, или трябва да са прясно приготвени, ако е необходимо.
The level of DNA migration is linearly associated with the duration of electrophoresis, and also with the potential (V/cm).
Също така в следващите точки периодите от време, необходими за i) отстраняване на всяка тъкан след аутопсията, ii) обработване на всяка тъкан в суспензия от клетки/ядра и iii) обработване на суспензията и приготвяне на предметните стъкла, се считат за критични променливи (вж. определенията в допълнение 1), и по време на установяването на метода и доказването на пригодността следва да са определени приемливи периоди от време за всяка от тези стъпки.
Based on the JaCVAM trial this could be 0,7 V/cm for at least 20 minutes.
Животните се умъртвяват в съответствие с действащото законодателство за хуманно отношение към животните и принципите за 3-те „R“, в подходящ момент (моменти) от време след последното третиране с изпитван химикал.
The duration of electrophoresis is considered a critical variable and the electrophoresis time should be set to optimize the dynamic range.
Избраната тъкан (тъкани) се отстранява, извършва се дисекция на тъканта и част от нея се събира за кометното изследване, като в същото време част от същата част от тъканта следва да бъде нарязана и поставена във формалдехиден разтвор или подходящ фиксатор за евентуален хистопатологичен анализ (вж. точка 55) в съответствие със стандартни методи (12).
Longer electrophoresis times (e.g. 30 or 40 minutes to maximize sensitivity) usually lead to stronger positive responses with known mutagens.
Тъканта за кометното изследване се поставя в смилащ буфер, изплаква се със студен смилащ буфер в достатъчна степен, за да се отстрани остатъчната кръв, и се съхранява в леден смилащ буфер до обработката.
However longer electrophoresis times may also lead to excessive migration in control samples.
Може също да се извърши in situ перфузия, напр. за черен дроб, бъбреци.
In each experiment the voltage should be kept constant, and the variability in the other parameters should be within a narrow and specified range, for example in the JaCVAM trial 0,7 V/cm delivered a starting current of 300 mA.
Съществуват множество публикувани методи за изолиране на клетки/ядра.
The depth of buffer should be adjusted to achieve the required conditions and maintained throughout the experiment.
Те включват смилане на тъкани като черен дроб и бъбреци, натривка на мукозни повърхности в случая със стомашно-чревния тракт, хомогенизиране и ензимно разграждане.
The current at the start and end of the electrophoresis period should be recorded.
При изпитването за валидиране на JaCVAM са проучени само изолирани клетки и следователно по отношение на установяването на метода и с оглед на възможността за позоваване на данни от изпитването на JaCVAM, за доказване на пригодността се предпочитат изолирани клетки.
The optimum conditions should therefore be determined during the initial demonstration of proficiency in the laboratory concerned with each tissue studied.
Бе установено обаче, че няма съществени различия в резултата от изследването, независимо дали са използвани изолирани клетки или ядра (8).
The temperature of the electrophoresis solution through unwinding and electrophoresis should be maintained at a low temperature, usually 2-10 °C (10).
Също така различни методи за изолиране на клетки/ядра (например хомогенизиране, смилане, ензимно разграждане и филтруване през мрежа) дават сравними резултати (55).
The temperature of the electrophoresis solution at the start of unwinding, the start of electrophoresis, and the end of electrophoresis should be recorded.
Следователно могат да се използват или изолирани клетки, или изолирани ядра.
After completion of electrophoresis, the slides should be immersed/rinsed in the neutralization buffer for at least 5 minutes.
Лабораторията трябва да извърши задълбочена оценка и валидиране на тъканно-специфични методи за изолиране на единични клетки/ядра.
Gels can be stained and scored “fresh” (e.g. within 1-2 days) or can be dehydrated for later scoring (e.g. within 1-2 weeks after staining) (56).
Както е обсъдено в точка 40, устойчивостта на някои увреждания, които водят до скъсвания във веригата на ДНК, откривани от кометното изследване, може да бъде много кратка (52) (53).
However, the conditions should be validated during the demonstration of proficiency and historical data should be obtained and retained separately for each of these conditions.
Следователно, независимо от избрания метод за приготвяне на суспензии от единични клетки/ядра, важно е тъканите да се обработят във възможно най-кратък срок след умъртвяването на животните и да се поставят в условия, които намаляват отстраняването на увреждания (напр. чрез поддържане на тъканта при ниска температура).
In case of the latter, slides should be dehydrated by immersion into absolute ethanol for at least 5 minutes, allowed to air dry, and then stored, either at room temperature or in a container in a refrigerator until scored.
Клетъчните суспензии следва да се поддържат леденостудени, докато се приготвят за използване, така че да бъдат доказани минимално вариране между пробите и подходящи отклици от положителните и отрицателните контроли.
Methods of Measurement
ПРИГОТВЯНЕ НА ПРЕДМЕТНИТЕ СТЪКЛА
Comets should be scored quantitatively using an automated or semi-automated image-analysis system.
Приготвянето на предметните стъкла следва да се извърши във възможно най-кратък срок след приготвянето на единичните клетки/ядра (в идеалния случай в рамките на един час), но температурата и времето между умъртвяването и приготвянето на предметното стъкло следва да бъдат строго контролирани и валидирани съгласно условията на лабораторията.
The slides will be stained with an appropriate fluorescent stain e.g. SYBR Gold, Green I, propidium iodide or ethidium bromide and measured at a suitable magnification (e.g. 200x) on a microscope equipped with epi-fluorescence and appropriate detectors or a digital (e.g. CCD) camera.
Обемът на клетъчната суспензия, добавен към агароза с ниска температура на топене (обикновено 0,5-1,0 %) за приготвяне на предметните стъкла, следва да не води до намаляване на процента на агароза с ниска температура на топене до по-малко от 0,45 %.
Cells may be classified into three categories as described in the atlas of comet images (57), namely scorable, non-scorable and “hedgehog” (see paragraph 56 for further discussion).
Оптималната гъстота на клетките се определя чрез системата за анализ на изображения, използвана за отчитане на кометите.
Only scorable cells (clearly defined head and tail with no interference with neighbouring cells) should be scored for % tail DNA to avoid artefacts.
Лизиране
There is no need to report the frequency of non-scorable cells.
Условията на лизиране също представляват критична променлива и могат да повлияят на скъсванията на веригата, произтичащи от специфични видове модификации на ДНК (някои алкилирания на ДНК и адукти с бази).
The frequency of hedgehogs should be determined based on the visual scoring (since the absence of a clearly-defined head will mean they are not readily detected by image analysis) of at least 150 cells per sample (see paragraph 56 for further discussion) and separately documented.
Поради това се препоръчва условията на лизиране да се поддържат възможно най-постоянни за всички предметни стъкла в рамките на опита.
All slides for analysis, including those of positive and negative controls, should be independently coded and scored “blinded” so the scorer is unaware of the treatment condition.
След като бъдат приготвени, предметните стъкла се потапят в охладен лизиращ разтвор в продължение на поне един час (или от предишната вечер) при около 2-8 °С и омекотена светлина, например жълта светлина (или на място, защитено от светлина), като се избягва излагането на бяла светлина, която може да съдържа UV компоненти.
For each sample (per tissue per animal), at least 150 cells (excluding hedgehogs — see paragraph 56) should be analysed.
След този инкубационен период предметните стъкла трябва да се изплакнат, за да се отстранят остатъчните детергенти и соли преди стъпката за разплитане в алкална среда.
Scoring 150 cells per animal in at least 5 animals per dose (less in the concurrent positive control — see paragraph 29) provides adequate statistical power according to the analysis of Smith et al., 2008 (5).
Това може да се постигне чрез пречистена вода, буфер за неутрализиране или фосфатен буфер.
If slides are used, this could be from 2 or 3 slides scored per sample when five animals per group are used.
Може да се използва също и буфер за електрофореза.
Several areas of the slide should be observed at a density that ensures there is no overlapping of tails.
Това би запазило алкалните условия в камерата за електрофореза.
Scoring at the edge of slides should be avoided.
Разплитане и електрофореза
DNA strand breaks in the comet assay can be measured by independent endpoints such as % tail DNA, tail length and tail moment.
Предметните стъкла следва да се поставят на случаен принцип върху платформата на устройство за електрофореза с потопен гел, съдържаща достатъчно разтвор за електрофореза, така че повърхностите на предметните стъкла да са напълно покрити (дълбочината на покриване следва също така да бъдат съгласувана от между различните серии).
All three measurements can be made if the appropriate image software analyser system is used.
При друг тип устройства за електрофореза за кометното изследване, т.е. устройства с активно охлаждане, циркулиране и захранване за високо натоварване, по-пълното покриване с разтвор ще доведе до по-висок електрически ток при поддържане на постоянно напрежение.
However, the % tail DNA (also known as % tail intensity) is recommended for the evaluation and interpretation of results (12) (40) (41) (42), and is determined by the DNA fragment intensity in the tail expressed as a percentage of the cell's total intensity (13).
Следва да се използва балансиран план за поставяне на предметните стъкла във ваната за електрофореза за смекчаване на ефектите от евентуални трендове или от граничен ефект във ваната и за свеждане до минимум на варирането между партидите, т.е. във всяка серия на електрофореза следва да има един и същ брой предметни стъкла от всяко животно в проучването и следва да бъдат включени проби от различните групи на определена доза, отрицателните и положителните контроли.
Tissue damage and cytotoxicity
Предметните стъкла следва да бъдат оставени за най-малко 20 минути за разплитането на ДНК, след което се подлагат на електрофореза в контролирани условия, при които ще се постигне максимална чувствителност и динамичен обхват на изследването (т.е. които ще доведат до приемливи нива на % ДНК в опашката за отрицателните и положителните контроли, които осигуряват максимална чувствителност).
Positive findings in the comet assay may not be solely due to genotoxicity, target tissue toxicity may also result in increases in DNA migration (12) (41).
Нивото на миграция на ДНК е линейно свързано с продължителността на електрофорезата, както и с потенциала (V/cm).
Conversely, low or moderate cytotoxicity is often seen with known genotoxins (12), showing that it is not possible to distinguish DNA migration induced by genotoxicity versus that induced by cytotoxicity in the comet assay alone.
Въз основа на изпитването на JaCVAM това би могло да бъде 0,7 V/cm в продължение на най-малко 20 минути.
However, where increases in DNA migration are observed, it is recommended that an examination of one or more indicators of cytotoxicity is performed as this can aid in interpretation of the findings.
Продължителността на електрофорезата се смята за критична променлива и времето за електрофорезата следва да се определи с оглед оптимизиране на динамичния обхват.
Increases in DNA migration in the presence of clear evidence of cytotoxicity should be interpreted with caution.