natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Следва да се отбележи, че химикали с определени начини на действие могат да са причина за анормална проява на вторични полови белези при животни от противоположния пол; например агонисти на андрогенните рецептори като например тренболон, метилтестостерон и дихидротестостерон, могат да предизвикат поява на подчертано развити размножителни туберкули у женски Pimephales promelas, или развитие на папиларни израстъци при оризията от женски пол (11, 20, 21).
It is important to have at least one treatment where there are no signs of toxic effects.
Протоколирано е също, че агонисти на естрогенните рецептори могат да намалят броя на размножителните туберкули и размера на дорзалните отлагания на колаген при полово зрели мъжки индивиди от Pimephales promelas (26, 27).
Signs of disease and signs of toxic effects should be thoroughly assessed and reported.
Такива макроскопски наблюдения на морфологията могат да предоставят полезна качествена и количествена информация за потенциалните бъдещи изисквания за изпитвания на риби.
For example, it is possible that production of VTG in females can also be affected by general toxicity and non-endocrine toxic modes of action, e.g. hepatotoxicity.
Броят и размерът на размножителните туберкули при Pimephales promelas и папиларните израстъци при оризията могат да бъдат количествено определени директно или, по-практично, в консервирани екземпляри.
However, interpretation of effects may be strengthened by other treatment levels that are not confounded by systemic toxicity.
Препоръчваните процедури за оценка на вторични полови белези при Pimephales promelas и при оризията са на разположение съответно в допълнение 5А и допълнение 5Б.
There are a few aspects to consider for the acceptance of test results.
Вителогенин (VTG)
As a guide, the VTG levels in control groups of males and females should be distinct and separated by about three orders of magnitude in fathead minnow and zebrafish, and about one order of magnitude for medaka.
Пробовземането на кръв се извършва от опашната артерия/вена с хепаринизирана микрокапилярка за хематокрит или, като алтернативен вариант, чрез сърдечна пункция със спринцовка.
Examples of the range of values encountered in control and treatment groups are available in the validation reports (1, 2, 3, 4).
В зависимост от размера на рибата обемът на кръвта за пробовземане обикновено варира между 5 и 60 μl на индивид за Pimephales promelas и 5-15 μl на индивид за зеброво данио.
High VTG values in control males could compromise the responsiveness of the assay and its ability to detect weak oestrogen agonists.
Плазмата се отделя от кръвта чрез центрофугиране и се съхранява с протеазни инхибитори при – 80 °C до анализа за вителогенин.
Low VTG values in control females could compromise the responsiveness of the assay and its ability to detect aromatase inhibitors and oestrogen antagonists.
Като алтернатива, при оризията се използва черният дроб, а при зебровото данио като източник на тъкан за определяне на VTG може да се използва хомогенат глава/опашка (допълнение 6).
The validation studies were used to build that guidance.
Измерването на VTG следва да се основава на валидиран хомоложен ELISA метод, като се използва хомоложен VTG стандарт и хомоложни антитела.
Concerning the quantification of egg production, this is subject to important variations [the coefficient of variation (CV) may range from 20 to 60 %] that impinge the ability of the assay to detect a significant decrease in egg production smaller than 70 % as the CV approaches 50 % or more.
Препоръчва се използването на метод, който позволява да се открият нива VTG от порядъка на няколко ng/ml плазма (или ng/mg тъкан), което е фоновото ниво при неекспонирани мъжки риби.
When the CV is confined to lower values (around 20-30 %), then the assay will have acceptable power (80 %) to detect 40-50 % decrease in egg production.
Контролът на качеството на анализа на VTG се извършва чрез използването на еталони, празни проби и анализи с най-малко две повторения.
The test design used for the fathead minnow, including four replicates per treatment level, should allow more power to the fecundity endpoint, compared to a test design with 2 replicates only.
За всеки ELISA метод следва да се проведе изпитване за матричен ефект (ефект на разреждане на пробата), за да се определи минималният коефициент на разреждане на пробата.
If a laboratory has not performed the assay before or substantial changes (e.g. change of fish strain or supplier) have been made it is advisable that a technical proficiency study is conducted.
Всяка ELISA плака, използвана за изследвания на VTG, следва да включва следните проби за контрол на качеството: най-малко 6 еталона за калибриране, покриващи диапазона от очаквани концентрации на VTG, и поне една празна проба за изследване за неспецифично свързване (анализ в две повторения). абсорбцията при тези празни проби следва да е по-малко от 5 % от максималната абсорбция на еталона за калибриране.
It is recommended that chemicals covering a range of modes of action or impacts on a number of the test endpoints are used.
Следва да се анализират най-малко две аликвотни части (две повторения в отделни гнезда) от всяко разреждане на проба.
In practice, each laboratory is encouraged to build its own historical control data for males and females and to perform a positive control chemical for estrogenic activity (e.g. 17β-estradiol at 100 ng/l, or a known weak agonist) resulting in increased VTG in male fish, a positive control chemical for aromatase inhibition (e.g. fadrozole or prochloraz at 300 μg/l) resulting in decreased VTG in female fish, and a positive control chemical for androgenic activity (e.g. 17β-trenbolone at 5 μg/l) resulting in induction of secondary sex characteristics in female fathead minnow and medaka.
Повторенията в отделни гнезда, които се различават с повече от 20 %, следва да бъдат анализирани повторно.
All these data can be compared to available data from the validation studies (1, 2, 3) to ensure laboratory proficiency.
Коефициентът на корелация (R2) за калибрационните криви трябва да бъде по-голям от 0,99.
In general, VTG measurements should be considered positive if there is a statistically significant increase in VTG in males (p < 0,05), or a statistically significant decrease in females (p < 0,05) at least at the highest dose tested compared to the control group, and in the absence of signs of general toxicity.
Независимо от това, високата корелация не е достатъчна, за да гарантира адекватна прогноза за концентрацията във всички диапазони.
A positive result is further supported by the demonstration of a biologically plausible relationship between the dose and the response curve.
В допълнение към достатъчно високата степен на корелация за калибрационната крива, концентрацията на всеки еталон, както е изчислена от калибрационната крива, следва да попада между 70 и 120 % от неговата номинална концентрация.
As mentioned earlier, the VTG decrease may not entirely be of endocrine origin; however a positive result should generally be interpreted as evidence of endocrine activity in vivo, and should normally initiate actions for further clarification.
В случай, че трендът на номиналните концентрации се отдалечава от тренда на регресионната линия (напр. при по-ниски концентрации), може да е необходимо калибрационната крива да се раздели на ниски и високи диапазони, или да се използва нелинеен модел за подходящо изглаждане на данните от абсорбцията.
Gonadal histopathology evaluation may be required by regulatory authorities to determine the reproductive fitness of the test animals and to allow a weight of evidence assessment of the test results.
Ако кривата е раздвоена, и двата линейни участъка следва да са с R2 > 0,99.
Performance of gonadal histopathology may not be necessary in cases where either, VTG or secondary sex characteristics is positive (i.e. VTG increase or decrease, or induction of secondary sex characteristics).
Границата на откриване (LOD) се определя като границата, под която концентрацията е твърде ниска за откриване на веществото, а границата на количествено определяне (LOQ) се определя като границата, под която концентрацията е твърде ниска за откриване на веществото, умножена по най-ниската кратност на разреждане.
OECD (2006b).
Всеки ден, в който се извършват изследвания за VTG, се анализира проба с внесена добавка с използване на еталон, който е референтен между различни изследвания (допълнение 7).
OECD (2007).
Отношението на очакваната концентрация към измерената концентрация се протоколира заедно с резултатите от всеки набор от изследвания от този ден.
Owens JW (2007).
Оценка на гонадната хистопатология
US EPA (2007).
Извършването на гонадна хистопатология може да се изисква от регулаторните органи за проучване на прицелния орган по оста ХХГ след експозиция на химикали.
OECD (2008).
В тази връзка гонадите се фиксират или in situ, или им се прави дисекция.
Sumpter J.P. and S. Jobling (1995).
Когато се изисква хистопатология, при оценката на ендокринна активност на изпитвания химикал се търсят специфични ендокринно-свързани отклици при гонадите.
Pawlowski S., et al.
Тези диагностични отклици по същество включват наличието на тестикулни ооцити, хиперплазия на Лайдиговите клетки, намалено образуване на жълтък, увеличени сперматогонии и перифоликуларна хиперплазия.
Andersen L., et al (2006).
Други увреждания на гонадите, като атрезия на ооцити, дегенерация на тестисите и изменения на стадии, могат да имат различни причини.
Ankley G.T., et al.
В документа с насоки за хистопатологията на гонадите за риби се определят процедури, които ще бъдат използвани в дисекцията, фиксирането, разрязването и хистопатологичната оценка на гонадите (22).
Panter G.H., et al.
Оценка на отклиците на биомаркерите чрез дисперсионен анализ (ANOVA)
Parks L.G., et al.
За идентифициране на потенциална активност на даден химикал се сравняват отклиците между третираните и контролните групи с помощта на дисперсионен анализ (ANOVA).
Part C Pharmacology, toxicology and endocrinology; 123(2):113-25.
Когато се използва контрола на разтворител, за всяка крайна точка следва да се приложи подходящ статистически тест между контролите на вода за разреждане и на разтворител.
Application of an ELISA to quantify vitellogenin concentrations in fathead minnows (Pimephales promelas) exposed to endocrine disrupting chemicals.
Насоки за работата с данните за контролите на вода за разреждане и на разтворител при последващия статистически анализ могат да се намерят в източник OECD, 2006c (28).
CEFIC-EMSG research report reference AQ001.
Всички биологични данни, свързани с отклици, следва да се анализират и протоколират отделно по пол.
CEFIC, Brussels, Belgium.
Ако изискваните допускания за използване на параметричен метод не са изпълнени — не е налице нормалност на разпределението (например тест на Шапиро-Уилк) или дисперсията е хетерогенна (тест на Бартлет или тест на Левин), преди извършването на ANOVA следва да се разгледа трансформиране на данните с оглед хомогенизиране на дисперсията, или извършване на ANOVA с претеглени средни.
Fenske M., et al.
За немонотонна зависимост доза-отклик могат да се използват тестът на Дънет (параметричен) върху множествени сравнения по двойки, или тестът на Ман-Уитни с корекция на Бонферони (непараметричен).
Development and validation of a homologous zebrafish (Danio rerio Hamilton- Buchanan) vitellogenin enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and its application for studies on estrogenic chemicals.
Ако зависимостта е приблизително монотонна, могат да се използват други статистически тестове (напр. тестът на Йонкхере-Терпстра или тестът на Уйлямс).
Comp.
За подпомагане при вземането на решение относно използването на най-подходящия статистически тест в допълнение 8 е представена статистическа блокова схема.
Biochem.
Допълнителна информация може да бъде получена също и от документа на ОИСР „Съвременни подходи за статистически анализ на данни за екотоксичност“ (28).
Phys.
Протоколиране на резултатите от изпитването
C 129 (3): 217-232.
Данните от изследването следва да включват:
Holbech H., et al.
Извършваща изпитвания лаборатория:
Development of an ELISA for vitellogenin in whole body homogenate of zebrafish (Danio rerio).
Отговорен персонал и неговите отговорности, свързани с изследването
Comparative Biochemistry and Physiology.
Всяка лаборатория трябва да е показала компетентността си чрез използване на набор от представителни химикали
Part C Pharmacology, toxicology and endocrinology; 130: 119-131 (16) Rose J., et al.
Характеризиране на изпитвания химикал
Vitellogenin induction by 17β-estradiol and 17α-ethinylestradiol in male zebrafish (Danio rerio).
Физична природа и относими физични и химични свойства
C 131: 531-539.
Метод и честота на приготвяне на изпитваните концентрации
Brion F., et al.
Информация за стабилността и биоразградимостта
Development and validation of an enzyme-linked immunosorbent assay to measure vitellogenin in the zebrafish (Danio rerio).
Характеристика на разтворителя (естество, използвана концентрация)
Environmental Toxicology and Chemistry; vol 21: 1699-1708.
Обосновка за избора на разтворителя (когато разтворителят е различен от вода)
Yokota H., et al.
Биологични видове и порода
Development of an ELISA for determination of the hepatic vitellogenin in Medaka (Oryzias latipes).
Доставчик и специални съоръжения на доставчика
Jpn J Environ Toxicol 4:87–98.
Възраст на рибите в началото на изпитването и репродуктивен статус/статус по отношение на хвърляне на хайвера
(19) Tatarazako N., et al.
Подробни данни за процедурата за аклиматизация на животните
Journal of Health Science 50:301-308.
Телесно тегло на рибите в началото на експозицията (от подпроба от рибния запас)
Effects of the androgenic growth promoter 17-beta-trenbolone on fecundity and reproductive endocrinology of the fathead minnow.
Използвана процедура на изпитване (тип изпитване, скорост на зареждане, гъстота на отглеждане и т.н.);
Environmental Toxicology and Chemistry; 22(6): 1350-60.
Метод за приготвяне на изходни разтвори и скорост на потока;
Seki M, et al (2004).
Номиналните концентрации на изпитване, измерваните седмично концентрации на разтворите за изпитването и използвания аналитичен метод, средни величини на измерените стойности и стандартни отклонения в съдовете за изпитване, и доказателство, че измерванията се отнасят за концентрациите на изпитвания химикал в истински разтвор;
Fish full life-cycle testing for androgen methyltestosterone on medaka (Oryzias latipes).
Характеристиките на водата за разреждане (включително рН, твърдост, алкалност, температура, концентрация на разтворен кислород, нива на остатъци от хлор, общо съдържание на органичен въглерод, суспендирани твърди частици и всякакви други направени измервания)
OECD (2010).
Качество на водата в съдовете за изпитване: рН, твърдост, температура и концентрация на разтворен кислород;
Guidance Document on Fish Gonadal Histopathology.
Подробна информация за храненето (например вид на храната(ите), източник, дадено количество и честота, и анализи за съдържание на относими замърсители, ако има такива (напр. полихлорирани бифенили, полициклични ароматни въглеводороди и органохлорни пестициди).
OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 123, Paris.
Доказателство, че контролите отговарят на критериите за приемане на изпитването;
OECD (2000) Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures.
Данни за смъртността при всички нива на концентрацията на изпитване и в контролите;
Paris
Използваните техники за статистически анализ, обработка на данните и обосновка за използваните техники;
Hutchinson T.H., et al.
Данни за макроскопски биологични наблюдения на морфологията, включително вторични полови белези, получени хайверни зърна и VTG;
Aquatic Toxicology, 76; pp.69–92.
Резултати от анализите на данните, за предпочитане в таблична и графична форма;
(2006b).
Проява на необичайни реакции от страна на рибите и всякакви видими въздействия, причинени от изпитвания химикал
Screening and testing for endocrine disruption in fish-biomarkers as “signposts”, not “traffic lights,” in risk assessment.
НАСОКИ ЗА ИНТЕРПРЕТИРАНЕТО И ПРИЕМАНЕТО НА РЕЗУЛТАТИТЕ ОТ ИЗПИТВАНЕТО
Environmental Health Perspectives; 114 Suppl 1:106-14.
Този раздел съдържа някои съображения, които трябва да се вземат предвид при тълкуването на резултатите от изпитването за различните измерени крайни точки.
Miles-Richardson S.R., et al.
Резултатите трябва да се интерпретират внимателно, когато изглежда, че изпитваният химикал предизвиква ясно изразено токсично действие или оказва въздействие върху общото състояние на животното.
Effects of waterborne exposure to 17β-estradiol on secondary sex characteristics and gonads of the fathead minnow (Pimephales promelas).
При задаването на обхвата на изпитваните концентрации трябва да се внимава да не се превишава максималната поносима концентрация, за да се даде възможност за съдържателно интерпретиране на данните.
Aquat.
Важно е да има поне едно третиране, при което не са налице признаци на токсично въздействие.
Toxicol.
Признаците на заболяване и на токсично въздействие следва да бъдат подробно оценявани и протоколирани.
47, 129-145.
Например, възможно е образуването на VTG в женски животни да е също така повлияно от обща токсичност и начини на токсично действие, различни от ендокринните, напр. хепатотоксичност.
Martinovic D., et al.
Независимо от това, тълкуването на въздействията може да бъде подкрепено чрез други нива на третиране, които да не водят до невъзможност за разграничаване поради системна токсичност.
Characterization of reproductive toxicity of vinclozolin in the fathead minnow and co-treatment with an androgen to confirm an anti-androgenic mode of action.
Има няколко аспекта, които трябва да бъдат взети предвид при приемането на резултатите от изпитването.
Environ.
Като насока, нивата на VTG в контролните групи мъжки и женски животни следва да бъдат разграничени и разделени от около три порядъка при Pimephales promelas и зебровото данио, и от около един порядък при оризията.
Toxicol.
Примери за диапазона на стойностите, които се срещат в контролните групи и в групите на третиране, могат да бъдат намерени в протоколите за валидиране (1, 2, 3, 4).
Chem.
Високите стойности на VTG в контролни мъжки екземпляри могат да поставят под съмнение реагирането на биологичното изследване и способността му да открива слаби естрогенни агонисти.
27, 478-488.
Ниските стойности на VTG в контролни женски екземпляри могат да поставят под съмнение реагирането на биологичното изследване и способността му да открива инхибитори на ароматазата и естрогенни антагонисти.
OECD (2006c), Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application, OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No.54, OECD, Paris.
Изследванията за валидиране са били използвани за изготвянето на тези насоки.
(29) US EPA (2008), Peer-Review Results for the Fish Short-Term Reproduction Assay, dated 30 January 2008, US Environmental Protection Agency, Washington DC.
По отношение на количественото определяне на получаването на хайверни зърна, то показва значително вариране [коефициентът на вариация (CV) може да варира от 20 до 60 %], което накърнява способността на изследването за откриване на значимо намаляване на получаването на хайверни зърна, по-малко от 70 %,когато CV наближава 50 % или повече.
OECD (2012), OECD Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupters, OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 150, OECD, Paris.
Когато CV е ограничен до по-ниски стойности (около 20-30 %), тогава изпитването ще има приемлива мощност (80 %) за откриване на 40-50 % намаляване на получаването на хайверни зърна.
ABBREVIATIONS & DEFINITIONS:
Планът на изпитването, използван за Pimephales promelas, включващ четири повторения на ниво на третиране, следва да позволява по-голяма мощност за крайната точка плодовитост в сравнение с план на изпитването само с 2 повторения.
a substance or a mixture
Ако дадена лаборатория не е извършвала изследването преди това, или са направени съществени промени (например промяна на породата на рибите или доставчика), е целесъобразно да се проведе проучване на техническата компетентност.
coefficient of variation
Препоръчва се да се използват химикали, които обхващат широк спектър от механизми на действие или въздействия върху някои от крайните точки от изпитването.
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
На практика всяка лаборатория се насърчава да изгради собствени контролни данни за предходни периоди за мъжките и женските индивиди, както и да извърши изпитване на химикал, представляващ положителна контрола за естрогенна активност (напр.
HPG axis
17β-естрадиол при 100 ng/l, или известен слаб агонист), в резултат на което се увеличава VTG в мъжките риби, на химикал, представляващ положителна контрола за потискане на ароматазата (напр. фадрозол или прохлораз при 300 μg/l), в резултат на което се намалява VTG в женския индивид, и на химикал, представляващ положителна контрола за андрогенна активност (напр.
hypothalamic-pituitary-gonadal axis
17β-тренболон при 5 μg/l), в резултат на което се индуцират вторични полови белези в женски Pimephales promelas и японска оризия.
Loading rate
Всички тези данни могат да бъдат сравнявани с наличните данни от изследванията за валидиране (1, 2, 3), за да се гарантира компетентността на лабораторията.
the wet weight of fish per volume of water.
Като цяло, измерванията на VTG следва да се считат за положителни, ако се наблюдава статистически значимо увеличаване на VTG при мъжките индивиди (p < 0,05), или статистически значимо намаление при женските индивиди (p < 0,05) най-малко при най-високата доза на изпитване, в сравнение с контролната група, и при липса на признаци за обща токсичност.
MTC
Положителният резултат се подкрепя допълнително от доказване на биологически реалистична връзка между дозата и кривата на отклика.
Maximum Tolerated Concentration, representing about 10 % of the LC50
Както беше споменато по-горе, намалението на VTG може да не е изцяло с ендокринен произход; независимо от това положителният резултат по принцип следва да се тълкува като доказателство за ендокринна активност in vivo и обичайно следва да води до предприемане на действия за допълнително изясняване.
Stocking density
Извършването на оценка на гонадна хистопатология може да се изисква от регулаторните органи за определяне на репродуктивното здраве на изпитваните животни и за даване на възможност за оценка на тежестта на доказателствата по отношение на резултатите от изпитването.
is the number of fish per volume of water.
Извършването на гонадна хистопатология може да не бъде необходимо в случаи, когато има положителен резултат или за VTG, или за вторичните полови белези (т.е.
vitellogenin is a phospholipoglycoprotein precursor to egg yolk protein that normally occurs in sexually active females of all oviparous species.
VTG се увеличава или намалява, или се индуцират вторични полови белези).
EXPERIMENTAL CONDITIONS FOR THE FISH ENDOCRINE SCREENING ASSAY
OECD (2006b).
(Pimephales promelas)
OECD (2007).
Medaka (Oryzias latipes)
Owens JW (2007).
Test type
US EPA (2007).
Flow-through
OECD (2008).
Water temperature
Sumpter J.P. and S. Jobling (1995).
Illumination quality
Pawlowski S., et al.
Fluorescent bulbs (wide spectrum)
Andersen L., et al (2006).
Light intensity
Effects of the androgenic growth promoter 17-beta-trenbolone on fecundity and reproductive endocrinology of the fathead minnow.
10-20 μE/m2/s, 540-1000 lux, or 50-100 ft-c (ambient laboratory levels)
Application of an ELISA to quantify vitellogenin concentrations in fathead minnows (Pimephales promelas) exposed to endocrine disrupting chemicals.
Photoperiod (dawn / dusk transitions are optional, however not considered necessary) 16 h light, 8 h dark
CEFIC-EMSG research report reference AQ001.
12-16 h light, 12-8 h dark
CEFIC, Brussels, Belgium.
< 5 g per l
Parks L.G., et al.
Test chamber size
Part C Pharmacology, toxicology and endocrinology; 123(2):113-25.
10 l (minimum)
(12) Panter G.H., et al.
2 l (minimum)
Fenske M., et al.
5 l (minimum)