natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Цитотоксичността следва да се определи в главния опит, със и без метаболитно активиране, като се използва подходяща индикация на клетъчната смърт и растеж (вж. точки 26 и 27).
When the test chemical is not of defined composition, e.g. a substance of unknown or variable composition, complex reaction products or biological materials (UVCB) (76), environmental extract, etc., the top concentration may need to be higher (e.g. 5 mg/ml) in the absence of sufficient cytotoxicity, to increase the concentration of each of the components.
Въпреки че оценката на цитотоксичността в първоначално предварително изпитване може да бъде полезна за по-добро определяне на концентрациите, които ще се използват в основния опит, първоначалното изпитване не е задължително.
It should be noted however that these requirements may differ for human pharmaceuticals (93).
Третирането на култури с цитоБ и измерването на относителните честоти на едноядрени, двуядрени и многоядрени клетки в културата осигурява точен метод за количествено определяне на ефекта върху пролиферацията на клетките и цитотоксичната или цитостатичната активност на дадено третиране (6) и гарантира, че се преброяват само клетки, които са преминали през делене по време на третирането или след него.
Concurrent negative controls (see paragraph 21), consisting of solvent alone in the treatment medium and processed in the same way as the treatment cultures, should be included for every harvest time.
За оценка на цитотоксичната и цитостатичната активност на дадено третиране чрез сравняване на стойностите в третираните и контролните култури се препоръчват индексът на пролиферация при блокиране на цитокинезата (CBPI) (6) (27) (68) или индексът на репликация (RI) от поне 500 клетки на култура (вж. допълнение 2 за формули).
Concurrent positive controls are needed to demonstrate the ability of the laboratory to identify clastogens and aneugens under the conditions of the test protocol used and the effectiveness of the exogenous metabolic activation system (when applicable).
Оценката на други показатели за цитотоксичност (напр. клетъчната цялост, апоптоза, некроза, метафазно преброяване, клетъчен цикъл) може да предостави полезна информация, но не следва да се използват като заместител на CBPI или RI.
Examples of positive controls are given in Table 1 below.
При изследвания без цитоБ е необходимо да се докаже, че клетките в културата са преминали през делене, така че съществена част от преброените клетки са преминали през делене по време на третирането с изпитвания химикал или след него, като в противен случай могат да се получат неверни отрицателни отклици.
At the present time, no aneugens are known that require metabolic activation for their genotoxic activity (17).
За оценка на цитотоксичната и цитостатичната активност в дадено третиране се препоръчва измерването на относителното удвояване на популации (RPD) или на относителния ръст в количеството клетки (RICC) (17) (68) (69) (70) (71) (вж. допълнение 2 за формули).
Because in vitro mammalian cell tests for genetic toxicity are sufficiently standardised for the short-term treatments done concurrently with and without metabolic activation using the same treatment duration, the use of positive controls may be confined to a clastogen requiring metabolic activation.
При удължени времена на пробовземане (напр. третиране с продължителност 1,5-2 пъти нормалната продължителност на клетъчния цикъл и събиране след още 1,5-2 пъти от нормалната продължителност на клетъчния цикъл, което води до времена на пробовземане, по-дълги от 3-4 пъти нормалната продължителност на клетъчния цикъл като цяло, както е описано в точки 38 и 39), RPD може да подцени цитотоксичността (71).
In this case a single clastogenic positive control response will demonstrate both the activity of the metabolic activation system and the responsiveness of the test system.
При тези обстоятелства по-добро измерване може да се постигне с RICC, или оценката на цитотоксичността след 1,5-2 пъти нормалната продължителност на клетъчния цикъл би представлявала полезна прогнозна оценка.
However, long term treatment (without S9) should have its own positive control, as the treatment duration will differ from the test using metabolic activation.
Оценката на други маркери за цитотоксичност или цитостаза (напр. клетъчната цялост, апоптоза, некроза, метафазно преброяване, индекс на пролиферация (PI), клетъчен цикъл, нуклеоплазмени мостове или нуклеотидни мостове) може да предостави допълнителна полезна информация, но не следва да се използва като заместител на RPD или на RICC.
If a clastogen is selected as the single positive control for short-term treatment with and without metabolic activation, an aneugen should be selected for the long-term treatment without metabolic activation.
Използването на култури без повторение е от особено значение в случаите, когато се оценяват повече от 3 концентрации (виж точки 44-45).
Positive controls for both clastogenicity and aneugenicity should be used in metabolically competent cells that do not require S9.
Резултатите, получени за културите с независими повторения при дадена концентрация, могат да бъдат обединени за анализа на данните.
Each positive control should be used at one or more concentrations expected to give reproducible and detectable increases over background in order to demonstrate the sensitivity of the test system (i.e. the effects are clear but do not immediately reveal the identity of the coded slides to the reader), and the response should not be compromised by cytotoxicity exceeding the limits specified in this test method.
Там, където се среща цитотоксичност, избраните изпитвани концентрации следва да са в обхват, в който се получава цитотоксичност, както е описано в точка 29, и да включват концентрации, при които има умерена, слаба и нулева цитотоксичност.
Reference chemicals recommended for assessing laboratory proficiency and for the selection of positive controls
Множество изпитвани химикали показват стръмни криви концентрация-отклик и за да се получат данни за слаба и умерена цитотоксичност, или за да се проучи подробно връзката доза-отклик, е необходимо да се използват по-близко разположени концентрации и/или над три концентрации (култури без повторение или с повторения), по-специално в ситуации, при които се изисква повтаряне на опита (вж. точка 60).
Aneugens
Ако максималната концентрация е базирана на цитотоксичност, най-високата концентрация следва да има за цел постигане на 55 ± 5 % цитотоксичност при използване на препоръчаните параметри за цитотоксичност (т.е. намаляване при RICC и RPD за клетъчни линии, когато не се използва цитоБ, и намаляване при CBPI или RI, когато се използва цитоБ до 45 ± 5 % от паралелната отрицателна контрола) (72).
Colchicine
Трябва да се внимава при тълкуването на положителните резултати, които се срещат само в горния край на този диапазон 55 ± 5 % цитотоксичност (71).
Vinblastine
Дори ако цитотоксичността се наблюдава над най-ниската неразтворима концентрация, препоръчително е да се извърши изпитване само при една концентрация, която предизвиква помътняване или е с видима утайка, тъй като от утайката могат да се получат изкуствено предизвикани въздействия.
Treatment Schedule
Ако не се наблюдава утайка или ограничаваща цитотоксичност, най-високата изпитвана концентрация следва да съответства на 10 mM, 2 mg/ml или 2 μl/ml, в зависимост от това коя от стойностите е най-ниска (73) (74) (75).
In order to maximise the probability of detecting an aneugen or clastogen acting at a specific stage in the cell cycle, it is important that sufficient numbers of cells representing all of the various stages of their cell cycles are treated with the test chemical.
Когато изпитваният химикал не е с определен състав, например вещество с неизвестен или променлив състав, сложни продукти от реакции или биологични материали (UVCB) (76), екстракт от околната среда и др., може да е необходимо стойността на най-високата концентрация да е по-голяма (напр.
All treatments should commence and end while the cells are growing exponentially and the cells should continue to grow up to the time of sampling.
5 mg/ml), при липсата на достатъчна цитотоксичност, за да се увеличи концентрацията на всеки от компонентите.
The treatment schedule for cell lines and primary cell cultures may, therefore, differ somewhat from that for lymphocytes which require mitogenic stimulation to begin their cell cycle (17).
Следва да се отбележи обаче, че тези изисквания могат да се различават по отношение на фармацевтични продукти за хуманна употреба (93).
For lymphocytes, the most efficient approach is to start the treatment with the test chemical at 44-48 hours after PHA stimulation, when cells will be dividing asynchronously (6).
Паралелните отрицателните контроли (вж. точка 21), състоящи се само от разтворител в средата за третиране, и третирани по същия начин като културите, които се третират, следва да се включат за всяко време на събиране.
Published data (19) indicate that most aneugens and clastogens will be detected by a short term treatment period of 3 to 6 hours in the presence and absence of S9, followed by removal of the test chemical and sampling at a time equivalent to about 1,5 - 2,0 normal cell cycle lengths after the beginning of treatment (7).
Паралелните положителни контроли са необходими за доказване на способността на лабораторията за идентифициране на кластогени и анеугени при условията на използвания протокол за изпитването и на ефективността на екзогенната система за метаболитно активиране (когато е приложимо).
However, for thorough evaluation, which would be needed to conclude a negative outcome, all three following experimental conditions should be conducted using a short term treatment with and without metabolic activation and long term treatment without metabolic activation (see paragraphs 56, 57 and 58): Cells should be exposed to the test chemical without metabolic activation for 3-6 hours, and sampled at a time equivalent to about 1,5 - 2,0 normal cell cycle lengths after the beginning of treatment (19),
Примери за положителни контроли са дадени в таблица 1 по-долу.
Cells should be exposed to the test chemical with metabolic activation for 3-6 hours, and sampled at a time equivalent to about 1,5 - 2,0 normal cell cycle lengths after the beginning of treatment (19),
Понастоящем не са известни анеугени, които изискват метаболитно активиране на тяхната генотоксична активност (17).
Cells should be continuously exposed without metabolic activation until sampling at a time equivalent to about 1,5 - 2,0 normal cell cycle lengths.
Използването на положителни контроли може да се ограничи до кластоген, изискващ метаболитно активиране, тъй като in vitro изпитванията върху клетки от бозайници са достатъчно стандартизирани за краткосрочно третиране, извършено паралелно с метаболитно активиране, или без метаболитно активиране, като се използва същата продължителност на третирането.
If it is known or suspected that the test chemical affects the cell cycling time (e.g. when testing nucleoside analogues), especially for p53 competent cells (35) (36) (77), sampling or recovery times may be extended by up to a further 1,5 - 2,0 normal cell cycle lengths (i.e. total 3,0 to 4,0 cell cycle lengths after the beginning of short-term and long-term treatments).
В този случай отклик на кластогенна положителна контрола без повторение ще докаже както активността на дадена система за метаболитно активиране, така и способността на изпитваната система за генериране на отклик.
These options address situations where there may be concern regarding possible interactions between the test chemical and cytoB.
Независимо от това, дългосрочното третиране (без S9) следва да има своя собствена положителна контрола, тъй като продължителността на третирането ще се различава от тази при изпитването, при което се използва метаболитно активиране.
When using extended sampling times (i.e. total 3,0 to 4,0 cell cycle lengths culture time), care should be taken to ensure that the cells are still actively dividing.
Ако за положителна контрола без повторение за краткотрайно третиране с метаболитно активиране и без метаболитно активиране е избран кластоген, следва да бъде избран анеуген за дългосрочното третиране без метаболитно активиране.
For example, for lymphocytes exponential growth may be declining at 96 hours following stimulation and monolayer cultures of cells may become confluent.
В клетките с капацитет за метаболизиране, които не изискват S9, следва да се използват положителни контроли както за кластогенност, така и за анеугенност.
The suggested cell treatment schedules are summarised in Table 2.
Всяка положителна контрола следва да бъде използвана при една или повече концентрации, които се очаква да породят възпроизводими и откриваеми увеличения спрямо фона, за да се докаже чувствителността на системата за изпитване (т.е. ефектите са ясни, но не разкриват непосредствено на четящото устройство идентичността на кодираните предметни стъкла), и откликът следва да не бъде накърнен от цитотоксичност, надхвърляща границите, посочени в настоящия метод за изпитване.
These general treatment schedules may be modified (and should be justified) depending on the stability or reactivity of the test chemical or the particular growth characteristics of the cells being used.
Препоръчителни референтни химикали за оценка на пригодността на лабораторията и за подбор на положителни контроли
Cell treatment and harvest times for the MNvit test
Анеугени
Lymphocytes, primary cells and cell lines treated with cytoB
Колхицин
Short treatment
Винбластин
Treat for 3-6 hours in the presence of S9;
График на третиране
remove the S9 and treatment medium;
За да се увеличи в максимална степен вероятността за откриване на анеуген или кластоген, действащ на конкретен стадий от клетъчния цикъл, е важно достатъчен брой клетки, представляващи всички различни стадии на техните клетъчни цикли, да са третирани с изпитвания химикал.
add fresh medium and cytoB;
Всички третирания следва да започват и приключват, докато клетките растат експоненциално, а клетките следва да продължат да нарастват до момента на вземането на пробата.
harvest 1,5 - 2,0 normal cell cycle lengths after the beginning of treatment.
Поради това графикът на третиране за клетъчните линии и първичните клетъчни култури може да се различава в известна степен от графика за лимфоцитите, които изискват митогенна стимулация, за да започнат своя клетъчен цикъл (17).
Treat for 3-6 hours;
За лимфоцитите най-ефикасният подход е започване на третирането с изпитвания химикал 44-48 часа след стимулиране с PHA, когато клетките ще се делят асинхронно (6).
remove the treatment medium;
Публикуваните данни (19), показват, че повечето анеугени и кластогени ще бъдат открити в рамките на краткосрочно третиране от 3 до 6 часа при наличие и в отсъствие на S9, последвано от отстраняване на изпитвания химикал и вземане на проби след време, равно на около 1,5-2 пъти от нормалната продължителност на клетъчния цикъл след началото на третирането (7).
Extended treatment
Независимо от това, за задълбочена оценка, която ще бъде необходима за заключение за отрицателни резултати, следва да са спазени всичките три от следните опитни условия с използване на краткосрочно третиране със и без метаболитно активиране и дългосрочно третиране без метаболитно активиране (вж. точки 56, 57 и 58):
Treat for 1,5 - 2 normal cell cycle lengths in the presence of cytoB;
клетките следва да бъдат подложени на експозиция на изпитвания химикал без метаболитно активиране в продължение на 3 до 6 часа, и след време, равно на около 1,5-2 пъти от нормалната продължителност на клетъчния цикъл след началото на третирането от тях следва да се вземе проба (19),
harvest at the end of the treatment period.
клетките следва да бъдат подложени на експозиция на изпитвания химикал с метаболитно активиране в продължение на 3 до 6 часа, и след време, равно на около 1,5-2 пъти от нормалната продължителност на клетъчния цикъл след началото на третирането от тях следва да се вземе проба (19),
Cell lines treated without cytoB
Ако е известно или се допуска, че изпитваният химикал засяга продължителността на клетъчния цикъл (напр. при изпитване на нуклеозидни аналози), особено за p53-компетентни клетки (35) (36) (77), периодите на вземане на проби или възстановяване могат да бъдат удължени най-много с още 1,5-2,0 пъти от нормалната продължителност на клетъчния цикъл (т.е. общо 3,0 до 4,0 пъти продължителността на клетъчния цикъл след началото на краткосрочно и дългосрочно третиране).
(Identical to the treatment schedules outlined above with the exception that no cytoB is added)
Тези варианти са насочени към ситуации, при които е възможно да има опасения, свързани с възможните взаимодействия между изпитвания химикал и цитоБ.
For monolayer cultures, mitotic cells (identifiable as being round and detaching from the surface) may be present at the end of the 3-6 hour treatment.
При използване на удължени времена на вземане на проби (т.е. време на култивиране 3,0 до 4,0 пъти продължителността на клетъчния цикъл) трябва да се вземат мерки да се гарантира, че клетките все още активно се делят.
If there is evidence for a substantial increase in the number of mitotic cells compared with controls, indicating likely mitotic arrest, then the cells should be collected by centrifugation and added back to the culture, to avoid losing cells that are in mitosis, and at risk for micronuclei/chromosome aberration, at the time of harvest.
Например, за лимфоцитите експоненциалният растеж може да намалее 96 часа след стимулацията и може да се достигне до сливане на еднослойните клетъчни култури.
Cell harvest and slide preparation
Предложените графици на третиране на клетките са обобщени в таблица 2.
Each culture should be harvested and processed separately.
Тези общи графици на третиране могат да бъдат изменяни (и следва да бъдат обосновани) в зависимост от стабилността или реакционната способност на изпитвания химикал или конкретните характеристики на използваните клетки, свързани с растежа.
Cell preparation may involve hypotonic treatment, but this step is not necessary if adequate cell spreading is otherwise achieved.
Третиране на клетки и времена за събиране за изпитването MNvit
Different techniques can be used in slide preparation provided that high-quality cell preparations for scoring are obtained.
Лимфоцити, първични клетки и клетъчни линии, третирани с цитоБ
Cells with intact cell membrane and intact cytoplasm should be retained to allow the detection of micronuclei and (in the cytokinesis-block method) reliable identification of binucleate cells.
Краткосрочно третиране
The slides can be stained using various methods, such as Giemsa or fluorescent DNA specific dyes.
Извършва се третиране за 3—6 часа при наличието на S9;
The use of appropriate fluorescent stains (e.g. acridine orange (78) or Hoechst 33258 plus pyronin-Y (79)) can eliminate some of the artifacts associated with using a non-DNA specific stain.
отстраняват се S9 и средата, в която се извършва третирането;
Anti-kinetochore antibodies, FISH with pancentromeric DNA probes, or primed in situ labelling with pancentromere-specific primers, together with appropriate DNA counterstaining, can be used to identify the contents (whole chromosomes will be stained while acentric chromosome fragments will not) of micronuclei if mechanistic information of their formation is of interest (16) (17).
добавят се прясна среда и цитоБ;
Other methods for differentiation between clastogens and aneugens may be used if they have been shown to be effective and validated.
събира се след 1,5-2,0 пъти нормалната продължителност на клетъчния цикъл след началото на третирането.
For example, for certain cell lines the measurements of sub-2N nuclei as hypodiploid events using techniques such as image analysis, laser scanning cytometry or flow cytometry could also provide useful information (80) (81) (82).
Извършва се третиране за 3—6 часа;
Morphological observations of nuclei could also give indications of possible aneuploidy.
отстранява се средата, в която се извършва третирането;
Moreover, a test for metaphase chromosome aberrations, preferably in the same cell type and protocol with comparable sensitivity, could also be a useful way to determine whether micronuclei are due to chromosome breakage (knowing that chromosome loss would not be detected in the chromosome aberration test).
Разширено третиране
All slides, including those of the solvent and the untreated (if used) and positive controls, should be independently coded before the microscopic analysis of micronucleus frequencies.
Извършва се третиране в продължение на 1,5—2 нормални цикъла при наличието на цитоБ;
Appropriate techniques should be used to control any bias or drift when using an automated scoring system, for instance, flow cytometry, laser scanning cytometry or image analysis.
събира се в края на периода на третирането.
Regardless of the automated platform is used to enumerate micronuclei, CBPI, RI, RPD, or RICC should be assessed concurrently.
Клетъчни линии третирани без цитоБ
In cytoB-treated cultures, micronucleus frequencies should be analysed in at least 2000 binucleate cells per concentration and control (83), equally divided among the replicates, if replicates are used.
(Идентични на графиците на третиране, описани по-горе, с изключение на това, че не се добавя цитоБ.)
In the case of single cultures per dose (see paragraph 28), at least 2000 binucleate cells per culture (83) should be scored in this single culture.
При еднослойните култури е възможно в края на третирането с продължителност 3—6 часа да присъстват митотични клетки (които се идентифицират като кръгли и отделящи се от повърхността).
If substantially fewer than 1000 binucleate cells per culture (for duplicate cultures), or 2000 (for single culture), are available for scoring at each concentration, and if a significant increase in micronuclei is not detected, the test should be repeated using more cells, or at less cytotoxic concentrations, whichever is appropriate.
Ако има доказателство за съществено увеличаване на броя на митотичните клетки в сравнение с контролите, вероятно указващо на блокиране на митозата, тогава клетките следва да се събират чрез центрофугиране и да се добавят обратно към културите, за да се избегне загубата на клетки, които са в митоза и са подложени на риск от микроядра/хромозомни аберации в момента на събирането.
Care should be taken not to score binucleate cells with irregular shapes or where the two nuclei differ greatly in size.
Събиране на клетки и подготовка на предметните стъкла
In addition, binucleate cells should not be confused with poorly spread multi-nucleate cells.
Всяка култура следва да се събира и обработва отделно.
Cells containing more than two main nuclei should not be analysed for micronuclei, as the baseline micronucleus frequency may be higher in these cells (84).
Подготовката на клетките може да включва хипотонично третиране, но този етап не е необходим, ако е постигнато достатъчно разстилане на клетките по друг начин.
Scoring of mononucleate cells is acceptable if the test chemical is shown to interfere with cytoB activity.
В подготовката на предметните стъкла могат да бъдат използвани различни техники, при условие че са получени висококачествени клетъчни препарати за преброяване.
A repeat test without CytoB might be useful in such cases.
Клетките с интактни клетъчна мембрана и цитоплазма следва да бъдат запазени, за да се даде възможност за откриването на микроядра и (при метода с блокиране на цитокинезата) и за надеждното идентифициране на двуядрените клетки.
Scoring mononucleate cells in addition to binucleate cells could provide useful information (85) (86), but is not mandatory.
Предметните стъкла могат да бъдат оцветявани чрез използване на различни методи, като Giemsa или флуоресцентни специфични оцветители за ДНК.
In cell lines tested without cytoB treatment, micronuclei should be scored in at least 2000 cells per test concentration and control (83), equally divided among the replicates, if replicates are used.