natgillin/translations-raw huggingface dataset:
При отстраняването на мъртвите индивиди се полага изключителна грижа да не се ударят и да не се наранят физически близкостоящите хайверни зърна/ларви, които са изключително деликатни и чувствителни.
Secondary sexual characteristics are under endocrine control in species like the Japanese medaka;
Критериите за смърт варират в зависимост от етапа от жизнения цикъл:
therefore observations of physical appearance of the fish should if possible be made at the end of the exposure.
за хайверни зърна:
In the Japanese medaka, the papillary formation on the posterior part of the anal fin in females is androgen sensitive.
по специално в ранните етапи това са: явна загуба на прозрачност и изменение в оцветяването, причинени от коагулация и/или утаяване на белтъци, водещи до бял непрозрачен вид,
Chapter C.37 of this Annex (38) provides relevant photographs of male secondary sex characteristics and androgenised females.
за ларвите и ювенилните екземпляри:
It is important that the strongest valid statistical test determine the endpoint.
неподвижност и/или липса на дихателни движения и/или липса на сърдечен ритъм и/или бяло непрозрачно оцветяване на централната нервна система и/или липса на реакция при механично стимулиране.
The replicate is the experimental unit but intra-replicate variability should be included in the statistical testing.
Необичаен външен вид
A decision flow-chart is available in Appendix 8 to help with the most appropriate statistical test to use based on the characteristic of the data obtained from the test.
Броя на ларвите, които показват необичайна форма на тялото, следва да се запише, а външният вид и природата на необичайността във външния вид следва да се опише.
Statistical significance level is 0,05 for all endpoints included.
Следва да се отбележи, че ембрионите и ларвите с необичаен външен вид се появяват по нормален начин и могат да бъдат от порядъка на няколко процента от контролата(ите) при някои видове.
Proportions of sex and genetic sex
Индивидите с необичаен външен вид следва да се отстраняват от камерите за изпитване само при смърт.
The proportions of sex should be analysed for significant effect (NOEC/LOEC approach) of exposure by Jonckheere-Terpstra (Trend test) if a monotone dose-response exists.
В съответствие с Директива 2010/63/ЕС на Европейския парламент и на Съвета от 22 септември 2010 г. относно защитата на животните, използвани за научни цели обаче, ако аномалии водят до болка, страдание и дистрес или трайно увреждане, и леталният изход може да бъде предвиден по надежден начин, животните следва да бъдат подложени на анестезия и евтаназия съгласно описанието в точка 44, и да се третират като смъртност при анализа на данните.
If non-monotonicity is found then a pair wise test should be applied:
Необичайно поведение
Use Dunnett's test if normality and homogenous variance can be obtained.
Аномалните състояния, като хипервентилация, некоординирано плуване, нетипично състояние на покой и нетипично поведение при хранене, следва да се записват при появяването им.
Use Tamhane-Dunnett if heterogeneous variance is present.
Тегло
Otherwise use exact Mann-Whitney test with Bonferroni-Holm adjustment.
В края на изпитването всички преживели риби следва да бъдат подложени на евтаназия (на анестезия, ако следва да се вземат кръвни проби) и следва да бъде измерено индивидуалното им мокро тегло (след попиване на водата).
A flow chart describing the statistics of the proportions of sex is placed in Appendix 8.
Дължина
The proportions of sex should be presented in tables as concentration proportions ± SD of males, females, intersex and undifferentiated.
В края на изпитването следва да се измери индивидуалната дължина (стандартната дължина).
Statistical significance should be highlighted.
В резултат от тези наблюдения, за протоколирането ще бъдат налични някои или всички от следните данни:
Examples are presented in the FSDT Phase 2 validation report (42).
кумулативна смъртност;
Genetic sex should be reported as percentage of phenotypic sex reversal of males, females, intersex and undifferentiated.
брой на здравите риби в края на изпитването;
VTG concentrations
време за започване на излюпването и приключване на излюпването;
VTG concentrations should be analysed for significant effect (NOEC/LOEC approach) of exposure.
дължина и тегло на преживелите индивиди;
The Dunnett test is preferable to the t-test with Bonferroni correction.
брой на деформираните ларви;
Where a Bonferroni correction is used, the Bonferroni-Holm correction is preferable.
брой на рибите, проявили необичайно поведение.
Allowance should be made for log-transformation of VTG to achieve normality and variance homogeneity.
Вземане на проби от риби
Next, if the concentration-response is consistent with monotonicity, then the JonckheereTerpstra test is preferable to any of the above.
Пробовземането от рибите се извършва при приключване на изпитването.
If t-tests or Dunnett's test is used, there is no need for a ANOVA significance F-test in order to proceed.
Рибите, от които се вземат проби, следва да бъдат подложени на евтаназия, напр. с MS-222 (100-500 mg на l, буфериран с 200 mg NaHCO3 на l) или FA-100 (4-алил-2-метоксифенол: евгенол) и да бъдат индивидуално измерени и претеглени като мокро тегло (след попиване на водата) или да бъдат подложени на анестезия, ако следва да се взема кръвна проба (вж. точка 49).
For details see the flow chart in Appendix 8.
Вземане на проби за анализ на VTG и определяне на пола чрез хистологична оценка
Results should be reported in tables as concentration means ± SD for males, females, intersex and undifferentiated separately.
Трябва да се извърши пробовземане на всички риби и същите да се подготвят за анализ на пола и на VTG.
Statistical significance for phenotypic females and phenotypic males should be highlighted.
Всички риби трябва да се анализират хистологично за определяне на пола.
Test chemical actual concentrations
За измерванията на VTG се допуска вземане на подпроба от най-малко 16 риби от всяко повторение.
The actual chamber concentrations of the test chemical should be analysed in frequencies described in paragraph 34.
Ако резултатите от подпробата се окажат неясни, следва повече риби да бъдат анализирани за VTG.
Results should be reported in tables as mean concentration ± SD on replicate basis as well as on concentration basis with information on number of samples and with outliers from the mean treatment concentration ± 20 % highlighted.
Процедурата за вземане на проби за определяне на пола и VTG зависи от метода за анализ на VTG:
Examples can be found in the FSDT Phase 2 validation report (42).
Метод за анализ на VTG с хомогенат глава/опашка
The test results should be interpreted with caution where measured test chemical concentrations in test solutions occur at levels near the detection limit of the analytical method.
Рибата се подлага на евтаназия.
Relevant physical-chemical properties;
Главата и опашката на всяка риба се отделят от тялото на рибата чрез направени със скалпел разрези точно зад коремните перки и точно зад гръбната перка (вж. фигура 1).
chemical identification data including purity and analytical method for quantification of the test chemical.
Частите от всяка риба, представляващи главата и опашката, се обединяват, претеглят се и индивидуално се номерират, замразяват се в течен азот и се съхраняват при температура – 70 °C или по-ниска, за анализ на VTG.
Test procedure used (e.g. flow-through semi-static/renewal);
Частта от рибата, представляваща тялото, се номерира и фиксира в подходящ фиксатор, за хистологична оценка (22).
test design including test concentrations, method of preparation of stock solutions (in an Annex), frequency of renewal (the solubilising agent and its concentration should be given, when used);
С използването на този метод VTG и хистопатологията се оценяват за всеки индивид и по този начин евентуална промяна в нивото на VTG може да бъде свързана с фенотипния пол на рибата, или с генетичния пол (японската оризия и трииглата бодливка) на рибата.
The nominal test concentrations, the means of the measured values and their standard deviations in the test chambers and the method by which these were attained (the analytical method used should be presented in an Annex);Evidence that the measurements refer to the concentrations of the test chemical in true solution;
За повече информация вж. насоки за хомогенизиране (допълнение 5) и насоки за количествено определяне на VTG (допълнение 6).
Water quality within test chambers:
Метод за анализ на VTG с хомогенат черен дроб
Detailed information on feeding (e.g. type of food(s), source, amount given and frequency and analyses for contaminants (e.g. PCBs, PAHs and organochlorine pesticides) if relevant.
Извършва се дисекция на черния дроб и същият се съхранява при температура – 70 °C или по-ниска.
Evidence that controls met the validity criteria:
Препоръчителни процедури за отрязването и предварителното обработване на черния дроб са дадени в насоки на ОИСР 229 (37) или в глава В.37 от настоящото приложение (38).
data on hatching rate should be presented in tables as percentage per replicate and per concentration.
Черният дроб се хомогенизира индивидуално, както е описано в насоки на ОИСР 229 или глава В.37 от настоящото приложение.
Outliers from the acceptance criteria (in controls) should be highlighted.
Супернатантатът се събира и се използва за измерване с VTG хомоложна ELISA техника (вж. допълнение 6 за пример за количествено определяне при зебровото данио, или насоки на ОИСР 229 (37) за японската оризия).
Survival should be presented as percentage per replicate and per concentration.
При следване на този подход също така е възможно получаването на индивидуални данни за рибите както по отношение на VTG, така и на хистологията на гонадите.
Outliers from the validity criteria (in controls) should be highlighted;
Метод за анализ на VTG с кръвна плазма
Clear indication of the results obtained on the different endpoints observed:
Кръв се взема от подложена на анестезия риба чрез сърдечна пункция, от опашната вена или чрез разрез на опашката, и се центрофугира при 4 °С за събиране на плазма.
embryo survival and hatching success;
Плазмата се съхранява при – 70 °С или още по-ниска температура, докато не бъде използвана.
external abnormalities;
Цялата риба се подлага на евтаназия и се фиксира за хистологията.
length and weight;
Пробата от плазма, както и рибата, се номерират индивидуално, за да се свържат нивата на VTG с пола на рибата.
VTG measurements (ng/g homogenate, ng/ml plasma or ng/mg liver);
Как да се направи разрез на риба за измерване на VTG в хомогенат глава/опашка и за хистологична оценка на средната част
gonadal histology, sex ratio, genetic sex data;
Определяне на генетичния пол
incidence of any unusual reactions by the fish and any visible effects produced by the test chemical.
Биологична проба за определяне на генетичния пол се взема от всяка риба, която е от биологичен вид, притежаващ подходящите маркери.
The results should be presented as mean values ± standard deviation (SD) or standard error (SE).
За японската оризия се взема аналната перка или гръбната перка.
Statistics should be reported as a minimum as NOEC and LOEC and confidence intervals.
Подробно описание е дадено в допълнение 9, включително вземане на тъканни проби и определяне на пола чрез метод с PCR.
The statistical flow chart (Appendix 8) should be followed.
Аналогично, в допълнение 10 е дадено описание на вземане на тъканни проби и определяне на пола чрез метод с PCR за трииглата бодливка.
Sumpter, 1996, “Inhibition of testicular growth in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) exposed to estrogenic alkylphenolic chemicals”, Environmental Toxicology and Chemistry 15, pp. 194-202.
Измерване на VTG
Sumpter, J.P. and S. Jobling, 1995, “Vitellogenesis As A Biomarker for Estrogenic Contamination of the Aquatic Environment”, Environmental Health Perspectives 103, pp. 173-178.
Измерването на VTG следва да се основава на валидиран за анализ количествен метод.
Hutchinson, S. Maddix, and H. Trip (1999), “An in vivo testing system for endocrine disruptors in fish early life stages using induction of vitellogenin”, Environmental Toxicology and Chemistry 18, pp. 337-347.
Следва да бъде на разположение информация за варирането на метода, използван от дадена лаборатория — в рамките на дадено изследване, както и между изследванията.
Pedersen, and P. Bjerregaard (2001a), “Development of an ELISA for vitellogenin in whole body homogenate of zebrafish (Danio rerio)”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 130, pp. 119-131.
Източникът на между- и вътрешнолабораторното вариране (най-вероятно) се основава на различните стадии от развитието на рибната популация.
Andersen, L., P. Bjerregaard, and B. Korsgaard (2003), “Vitellogenin induction and brain aromatase activity in adult male and female zebrafish exposed to endocrine disrupters”, Fish Physiology and Biochemistry 28, pp. 319-321.
Като се има предвид варирането на измерването на VTG, стойностите на NOEC въз основа единствено на тази крайна точка следва да бъдат третирани много внимателно.
Petersen (2003), “Gonad development and vitellogenin production in zebrafish (Danio rerio) exposed to ethinylestradiol and methyltestosterone”, Aquatic Toxicology 65, pp. 397-411.
За рибните видове, разглеждани в настоящото изследване, съществуват различни методи за оценка на образуването на VTG.
Tyler (2002), “Utility of a juvenile fathead minnow screening assay for detecting (anti-)estrogenic substances”, Environmental Toxicology and Chemistry 21, pp. 319-326.
Техника за измерване, която е едновременно относително чувствителна и специфична, е определянето на концентрациите на белтъци чрез ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA).
Wang (2007), “Toxicity of the aromatase inhibitor letrozole to Japanese medaka (Oryzias latipes) eggs, larvae and breeding adults”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 145, pp. 533-541.
Следва да се използват хомоложни антитела (срещу VTG от същия биологичен вид) и най-важните хомоложни стандарти.
LeBlanc, and C.V.Sullivan (1999), “Fathead minnow (Pimephales promelas) vitellogenin: purification, characterization and quantitative immunoassay for the detection of estrogenic compounds”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 123, pp. 113-125.
Определяне на пола
Porcher (2002), “Development and validation of an enzyme-linked immunosorbent assay to measure vitellogenin in the zebrafish (Danio rerio)”, Environmental Toxicology and Chemistry 21, pp. 1699-1708.
В зависимост от процедурата за вземане на проби за VTG, цяла риба или оставащата средна част от всяка риба се поставя в предварително етикетирана касета за обработка и се фиксира с подходящ фиксатор за хистологично определяне на пола (по избор и за оценка на етапите при гонадите).
Hatano, H. Mizukami, M. Yamashita, R. Sakakibara, and E. Tamiya (2002), “Development and application of a monoclonal antibody-based sandwich ELISA for quantification of Japanese medaka (Oryzias latipes) vitellogenin”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 132, pp. 161-169.
Насоки за фиксирането и включването са дадени в допълнение 7 и в Ръководството на ОИСР за диагностициране на свързана с ендокринната система хистопатология на гонадите при риби (22).
Bengtsson (2004), “The juvenile three-spined stickleback (Gasterosteus aculeatus L.) as a model organism for endocrine disruption — II — kidney hypertrophy, vitellogenin and spiggin induction”, Aquatic Toxicology 70, pp. 311-326.
След обработката рибите се включват в парафинови блокчета.
Tatarazako, N., M. Koshio, H. Hori, M. Morita, and T. Iguchi (2004), “Validation of an enzyme-linked immunosorbent assay method for vitellogenin in the medaka”, Journal of Health Science 50, pp. 301-308.
Индивидите следва да бъдат поставени надлъжно в парафиновите блокчета.
Eidem, J.K., H. Kleivdal, K. Kroll, N. Denslow, R. van Aerle, C. Tyler, G. Panter, T. Hutchinson, and A. Goksoyr (2006), “Development and validation of a direct homologous quantitative sandwich ELISA for fathead minnow (Pimephales promelas) vitellogenin.
От всеки индивид се вземат най-малко шест надлъжни среза (с дебелина 3-5 μm) във фронтална равнина, включително гонадна тъкан от двете гонади.
Aquatic Toxicology”, 78, pp. 202-206.
Разстоянието между тези срезове следва да бъде приблизително 50 μm за мъжките и 250 μm за женските индивиди.
Ankley (2006), “Evaluation of a commercial kit for measuring vitellogenin in the fathead minnow (Pimephales promelas)”, Ecotoxicology and Environmental Safety 64, pp. 101-105.
Независимо от това, тъй като всяко блокче често съдържа и мъжки, и женски (ако във всяко блокче е включен повече от един индивид), разстоянието между срезовете от тези блокчета трябва да е около 50 μm, докато бъдат получени поне шест среза от гонадите от всеки мъжки индивид.
Holbech, H., Petersen, G. I., Norman, A., Örn, S, Norrgren, L., and Bjerregaard, P (2001b), “Suitability of zebrafish as test organism for detection of endocrine disrupting chemicals.
След това разстоянието между срезовете може да бъде увеличено до 250 μm за женските.
Comparison of vitellogenin in plasma and whole body homogenate from zebrafish (Danio rerio) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)”, Nordic Council of Ministers, TemaNord 2001:597, pp. 48-51.
Срезовете се оцветяват с хематоксилин и еозин и се изследват с оптическа микроскопия с фокусиране върху пола (мъжки, женски, междинен или недиференциран).
Porcher, and A. Goksoyr (2004), “Development of quantitative vitellogenin-ELISAs for fish test species used in endocrine disruptor screening”, Analytical and Bioanalytical Chemistry 378, pp. 621-633.
Междинният пол се определя като наличие на повече от един овоцит в тестисите за шест анализирани среза, или сперматогенни клетки (да/не) в яйчниците.
Orn, S., S. Yamani, and L. Norrgren (2006), “Comparison of vitellogenin induction, sex ratio, and gonad morphology between zebrafish and Japanese medaka after exposure to 17 alpha-ethinylestradiol and 17 beta-trenbolone”, Archives of Environmental Contamination and Toxicology 51, pp. 237-243.
Хистопатологията и определянето на етапите на яйчниците и тестисите са по избор, но ако се изследват, трябва да се извърши статистически анализ на резултатите и те следва да се протоколират.
Scholz, S. and N. Kluver (2009), “Effects of Endocrine Disrupters on Sexual, Gonadal Development in Fish, Sexual Development 3”, pp. 136-151.
Следва да се отбележи, че някои видове риби не разполагат по естествен път с напълно развит чифт гонади и може да е налице само една гонада (напр. японската оризия и, понякога, зебровото данио).
Fenske, M., G. Maack, C. Schafers, and H. Segner (2005), “An environmentally relevant concentration of estrogen induces arrest of male gonad development in zebrafish, Danio rerio”, Environmental Toxicology and Chemistry 24, pp. 1088-1098.
Всички подобни наблюдения трябва да бъдат записани.
Nagahama (2004), “Two DM domain genes, DMY and DMRT1, involved in testicular differentiation and development in the medaka, Oryzias latipes”, Developmental Dynamics 231, pp. 518-526.
Определянето на генетичния пол в отделния индивид японска оризия се основава на наличието или отсъствието на определящия мъжкия пол на оризията ген DMY, разположен в Y хромозомата.
Shinomiya, A., H. Otake, K. Togashi, S. Hamaguchi, and M. Sakaizumi (2004), “Field survey of sex-reversals in the medaka, Oryzias latipes: genotypic sexing of wild populations”, Zoological Science 21, pp. 613-619.
Генотипният пол на оризията може да бъде идентифициран чрез определяне на първичната структура на гена DMY от ДНК, извлечена например от парче анална перка или гръбна перка.
Flick (2007), “Collapse of a fish population after exposure to a synthetic estrogen”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, pp. 8897-8901.
Наличието на DMY показва XY (мъжки) индивид, независимо от фенотипа, докато липсата на DMY показва XX (женски) индивид, независимо от фенотипа (23).
Kidd (2009), “Interspecies differences in biochemical, histopathological, and population responses in four wild fish species exposed to ethynylestradiol added to a whole lake”, Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 66, pp. 1920-1935.
Насоки за приготвяне на тъканите и за метода с PCR са дадени в допълнение 9.
Tyler (2006), “Development of chronic tests for endocrine active chemicals — Part 1.
Определянето на генетичния пол при трииглата бодливка също се извършва чрез метод с PCR, описан в допълнение 10.
An extended fish early-life stage test for oestrogenic active chemicals in the fathead minnow (Pimephales promelas)”, Aquatic Toxicology 77, pp. 279-290.
Проявата на междинен пол (за определение, вж. допълнение 1) следва да бъде протоколирана.
Petersen, P. Jackson, K. Hylland, L. Norrgren, and P. Bjerregaard (2006), “Detection of endocrine disrupters: Evaluation of a Fish Sexual Development Test (FSDT)”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 144, pp. 57-66.
Вторични полови белези
Andersen, L., K. Kinnberg, H. Holbech, B. Korsgaard, and P. Bjerregaard (2004), “Evaluation of a 40 day assay for testing endocrine disrupters: Effects of an anti-estrogen and an aromatase inhibitor on sex ratio and vitellogenin concentrations in juvenile zebrafish (Danio rerio)”, Fish Physiology and Biochemistry 30, pp. 257-266.
При видове риби като японската оризия вторичните полови белези са под контрола на ендокринната система;
Morthorst, J.E., H. Holbech, and P. Bjerregaard (2010), “Trenbolone causes irreversible masculinization of zebrafish at environmentally relevant concentrations”, Aquatic Toxicology 98, pp. 336-343.
поради това, ако е възможно, в края на експозицията следва да бъдат извършени наблюдения върху външния вид на рибата.
Metcalf (2003), “Effects of the antiandrogens, vinclozolin and cyproterone acetate on gonadal development in the Japanese medaka (Oryzias latipes)”, Aquatic Toxicology 63, pp. 391-403.
При японската оризия образуването на гениталната папила в задната част на аналната перка при женските е чувствително към андрогени.
Tyler (2004), “Successful detection of (anti-) androgenic and aromatase inhibitors in pre-spawning adult fathead minnows (Pimephales promelas) using easily measured endpoints of sexual development”, Aquatic Toxicology 70, pp. 11-21.
В глава В.37 от настоящото приложение (38) са предоставени съответни снимки на мъжки вторични полови белези и на андрогенизирани женски индивиди.
Petersen, and P. Bjerregaard (2007), “Effects of the fungicide prochloraz on the sexual development of zebrafish (Danio rerio)”, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 145, pp. 165-170.
Важно е крайната точка да се определя с най-силния валиден статистически тест.
Chapter C.14 of this Annex, Fish Juvenile Growth Test.
Опитната единица е повторението, но варирането вътре в повторението трябва да бъде включено в статистическото тестване.
Chapter C.4 of this Annex, Ready Biodegradability.
Блокова схема на процедурата по вземане на решения е на разположение в допълнение 8, за подпомагане при избора на най-подходящия статистически тест за използване, въз основа на характеристиките на данните, получени от изпитването.
Chapter C.37 of this Annex, 21-Day Fish Assay:
Статистическото ниво на значимост е 0,05 за всички включени крайни точки.
A Short Term Screening for Oestrogenic and Androgenic Activity, and Aromatase Inhibition.
Съотношения между половете и генетичен пол
Schäfers, C., Teigeler, M., Wenzel, A., Maack, G., Fenske, M., Segner, H (2007), “Concentration- and time-dependent effects of the synthetic estrogen, 17 alpha-ethinylestradiol, on reproductive capabilities of the zebrafish, Danio rerio” Journal of Toxicology and Environmental Health-Part A, 70, 9-10 pp 768-779.
Ако съществува монотонна зависимост доза-отклик, съотношенията между половете следва да бъдат анализирани за значимо въздействие (подход NOEC/LOEC) на експозицията с трендов тест на Йонкхере-Терпстра.
Abbreviations and definitions
Ако се установи, че зависимостта не е монотонна, следва да бъде приложен тест за сравнения по двойки:
Apical endpoint
Ако могат да бъдат получени нормалност и хомогенна дисперсия, използва се тестът на Дънет.
Causing effect at population level