natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Откриването на вируса посредством RT-qPCR следва методите и процедурите, определени в точки I.6.4.1, I.6.4.3 и I.6.4.4.
The sample preparation for the purpose of virus detection by RT-qPCR shall follow the methods and procedures laid down in point I.6.4.1.
Други диагностични техники
The virus detection by RT-qPCR shall follow the methods and procedures laid down in points I.6.4.1, I.6.4.3 and I.6.4.4.
Супернатантът, приготвен както е описано в точка I.4.3, може да бъде предаден за ELISA, индиректен имунофлуоресцентен тест (IFAT) или RT-PCR в съответствие съответно с точки I.6.1, I.6.2 или точка I.6.4.
Other diagnostic techniques
Тъканен материал може да бъде подложен на други диагностични техники като IFAT върху замразени елементи или имунохистохимия върху тъканнен материал, фиксиран с формалин.
Supernatant prepared as described in point I.4.3 may be submitted to ELISA, Indirect fluorescent antibody test (IFAT), or RT-PCR in accordance with point I.6.1, point I.6.2 or point I.6.4 respectively.
Тези бързи техники се допълват с вирусологично изследване в съответствие или с точка II, буква а), или точка II, буква б) до 48 часа след вземането на пробите:
Tissue material may be subjected to other diagnostic techniques, such as IFAT on frozen sections, immunohistochemistry on formalin fixed tissue material.
ако е получен отрицателен резултат; или
Those rapid techniques shall be supplemented with a virological examination in accordance with either point II(a) or point II(b) within 48 hours after sampling, if:
ако е получен положителен резултат от материал, представляващ първия случай на ИХН или ВХС.
a negative result is obtained; or
Титриране с цел проверка на възприемчивостта на клетъчните култури към заразяването
a positive result is obtained with material representing the first case of IHN or VHS.
Когато се извършва титриране за проверка на възприемчивостта на клетъчните култури към заразяването, както е посочено в точка I.5.3, се следват процедурите, посочени в параграфите от настоящата точка по-долу.
Procedure for titration to verify the susceptibility of the cell cultures to infection
Използват се най-малко два изолата на вируса на ВХС и един изолат на вируса на ИХН.
When titration to verify the susceptibility of the cell cultures to infection as referred to in point I.5.3 is carried out, the procedures set out in the following paragraphs of this point shall be followed.
Тези изолати са представителни за основните групи вируси в Европейския съюз, напр. вируса на ВХС, един патогенен изолат от сладководна дъгова пъстърва и един морски патогенен изолат за калкан, а по отношение на вируса на ИХН — патогенен щам от дъгова пъстърва от Европейския съюз.
At least two VHSV isolates and one isolate of IHNV shall be used.
Използват се добре дефинирани изолати от държавите членки.
The isolates shall represent the major group of viruses within the European Union, namely for VHSV one pathogenic isolate from rainbow trout in freshwater and one marine isolate pathogenic for turbot, and for IHNV one rainbow trout pathogenic strain from the European Union.
Групи вируси с ниско число на клетъчен пасаж в култури се отглеждат във флакони с клетъчни култури върху клетки BF-2 или RTG-2 за вируса на ВХС, и върху клетки ЕРС или FHM за вируса на ИХН.
Well-defined isolates from the Member States shall be used.
Използва се среда за клетъчна култура, към която е добавен минимум 10 % серум.
Batches of virus in low cell culture passage numbers shall be propagated in cell culture flasks on BF-2 or RTG-2 cells for VHSV and on EPC or FHM cells for IHNV.
За инокулация се използва ниско MOI (< 1).
Cell culture medium with at least 10 % serum shall be used.
При цялостен цитопатичен ефект вирусът се събира чрез центрофугиране на супернатанта от клетъчната култура при 2000 × g в продължение на 15 минути, стерилизиран чрез филтриране през мембрана 0,45 μm и разпределен в етикетирани криоепруветки.
Low MOI for inoculation (< 1) shall be used.
Вирусът се съхранява при – 80 °C.
At total CPE, the virus shall be harvested by centrifugation of cell culture supernatant at 2000 × g for 15 minutes, filter sterilised through 0,45 μm membrane filter and distributed in labelled cryotubes.
Седмица след замразяването три епруветки от всеки вирус се размразяват под студена вода и титрират по съответните им клетъчни линии.
The virus shall be kept at – 80 °C.
Всеки вирусен изолат се размразява и титрира минимум на шест месеца или ако има съмнение за снижаване на възприемчивостта на клетъчните линии.
1 week after freezing, three replicate vials with each virus shall be thawed under cold water and titrated on their respective cell lines.
Процедурите за титриране трябва да бъдат подробно описани и всеки път трябва да се прилага една и съща процедура.
At least every 6 months, or if it is suspected that the susceptibility of a cell line has decreased, each virus isolate shall be thawed and titrated.
Титрирането чрез гранично разреждане включва минимум шест повторения от всяка серия разреждания.
Titration procedures must be described in detail and the same procedure followed each time.
Титрите се сравняват с титрите, получени преди това.
Titration by end point dilution shall include at least six replicates at each dilution step.
Ако титърът на един от трите вирусни изолата намалее с фактор от 2 лога или повече спрямо първоначалния титър, клетъчната линия повече не следва да се използва за надзор.
The titres shall be compared with previously obtained titres.
Ако в лабораторията се съхраняват различни клетъчни линии, всяка линия се изследва поотделно.
If the titre of any of the three virus isolates drops by a factor of 2 logs or more, compared with the initial titre, the cell line shall no longer be used for surveillance purposes.
Регистрите следва да се съхраняват за период от минимум 10 години.
If different cell lines are kept in the laboratory each line shall be examined separately.
ПОДРОБНИ ДИАГНОСТИЧНИ МЕТОДИ И ПРОЦЕДУРИ ЗА НАДЗОР И ПОТВЪРЖДЕНИЕ НА КХВШ
Records shall be kept for a period of at least 10 years.
I. I. Подробните диагностични методи и процедури за потвърждение на присъствието или за отхвърляне на съмнението за КХВШ
DETAILED DIAGNOSTIC METHODS AND PROCEDURES FOR THE SURVEILLANCE AND CONFIRMATION OF KHV DISEASE (KHVD)
Когато се изисква лабораторно изследване за потвърждение на присъствието или за отхвърляне на съмнението за КХВШ в съответствие с член 57, буква б) от Директива 2006/88/ЕО, като се използват диагностичните методи, посочени в част 2, раздел III от приложение I към настоящото решение, се прилагат подробните диагностични методи и процедури, посочени в точки I.1 — I.2 от настоящата част.
I. Detailed diagnostic methods and procedures for the confirmation of the presence of or to rule out the suspicion of KHVD
Подготовка на пробите от риби
When a laboratory examination is required for the purpose of confirmation of the presence of or to rule out the suspicion of KHVD in accordance with Article 57(b) of Directive 2006/88/EC, using the diagnostic methods set out in Section III of Part 2 of Annex I, the detailed diagnostic methods and procedures set out in points I.1 – I.2 of this Part shall apply.
За диагностични цели рибите (изпращани живи или умъртвени и опаковани поотделно в запечатани асептични съдове) или замразени органи или парчета от органи, поставени за съхранение в 80 %-ов до чист етанол или вирусна транспортна среда (да се обработят в рамките на 48 часа след събирането), могат да бъдат използвани за изследване с конвенционален PCR или методи, основани на qPCR.
Preparation of samples from fish
За откриване на КХВШ се събират хрилете и бъбрекът; освен това в допълнителна отделна проба могат да се включат далакът, мозъкът и червата.
For diagnostic purposes the fish (sent alive or killed and packed separately in sealed aseptic containers) or alternatively frozen organs or organ pieces preserved in 80 % to absolute ethanol or viral transport medium (to be processed within 48 hours after collection) may be used for testing with conventional PCR or qPCR based methods.
В крайни случаи може да се обедини тъканен материал от максимум пет риби.
For the detection of KHV, gill and kidney shall be collected; in addition spleen, encephalon and intestine may be included in an additional separated sample.
Освен това в някои случаи могат да бъдат използвани проби от неумрели екземпляри, като кръв, натривки от хриле, биопсия от хриле, слуз (а именно тъй като при съмнение за присъствие на КХВШ може да се използва много ценна риба).
In acute cases, tissue material of up to five fish may be pooled.
Извличане на ДНК
Furthermore, non-lethal samples such as blood, gill swabs, gill biopsy, mucus scrape may be used in certain cases (namely very valuable fish may be used in the case of the suspicion of the presence of KHV).
ДНК се извлича в съответствие със стандартните процедури.
DNA extraction
Могат да бъдат използвани описаните в точка I.2 налични в търговската мрежа комплекти за извличане на ДНК, които ще предоставят висококачествена ДНК и са подходящи за използване с PCR протоколи.
DNA shall be extracted in accordance with standard procedures.
Откриване и идентификация на агенти посредством методи, основани на полимеразна верижна реакция (PCR)
The commercially available DNA extraction kits that produce high quality DNA suitable for use with the PCR protocols referred to in point I.2 may be used.
I.2.1. qPCR за откриване на КХВШ
Agent detection and identification by Polymerase chain reaction (PCR) based methods
За откриване с qPCR на КХВШ се използват следните анализи:
I.2.1. qPCR for KHV detection
Прав праймер (KHV-86f): 5′- GACGCCGGAGACCTTGTG -3′;
For qPCR detection of KHV, the following qPCR assay shall be used:
Обратен праймер (KHV-163r): 5′- CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT -3′;
Forward primer (KHV-86f): 5′- GACGCCGGAGACCTTGTG -3′;
и сонда (KHV-109p): 5′-FAM- CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG -3′.
Reverse primer (KHV-163r): 5′- CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT -3′;
Условия на циклите: един цикъл при 95 °C в продължение на 15 минути, последван от 40 цикъла при 94 °C в продължение на 15 секунди и 60 °C в продължение на 60 секунди.
and probe (KHV-109p): 5′-FAM- CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG -3′.
Вместо това обаче могат да бъдат използвани и други варианти на qPCR с доказана сходна ефективност.
Cycling conditions: one cycle of 95 °C at 15 minutes, followed by 40 cycles of 94 °C at 15 seconds and 60 °C for 60 seconds.
Конвенционална PCR за откриване КХВШ
However, other qPCR versions of proven similar efficacy may be used instead.
Използва се анализът, описан в настоящата точка, насочен към гена тимин киназа (Thymine kinase, TK) на КХВШ.
Conventional PCR for KHV detection
Могат обаче да се използват и други PCR анализи с доказани сходни на описаните чувствителност и характеристики.
The assay described in this point targeting the Thymine kinase (TK) gene of KHV shall be used.
Прав праймер (KHV-TKf): 5′-GGGTTACCTGTAC GAG-3′;
However, other PCR assays with demonstrated similar sensitivities and specificities to the described assay may be used instead.
Обратен праймер (KHV-TKr): 5′-CACCCAGTAGATTA TGC-3′.
Forward primer (KHV-TKf): 5′-GGGTTACCTGTAC GAG-3′;
Условия на циклите: един цикъл при 95 °C в продължение на 5 минути, последван от 35 цикъла при 95 °C в продължение на 30 секунди, при 52 °C в продължение на 30 секунди, 72 °C в продължение на една минута и един цикъл при 72 °C в продължение на 10 минути.
Reverse primer (KHV-TKr): 5′-CACCCAGTAGATTA TGC-3′.
Размерът следва да бъде 409 bp.
Cycling conditions: one cycle of 95 °C for 5 minutes followed by 35 cycles of 95 °C for 30 seconds, 52 °C for 30 seconds, 72 °C for one minute and one cycle of 72 °C for 10 minutes.
Освен това може да се появят фалшиви положителни резултати поради неправилно отгряване на праймера или замърсяване.
Product size should be 409 bp.
Вместо това обаче могат да бъдат използвани и други варианти на PCR с доказана сходна ефективност.
Furthermore, false-positive results may occur because of false primer annealing or contamination.
Първото откриване в даден район се потвърждава посредством секвениране или се препраща в национална референтна лаборатория или в референтната лаборатория на ЕС за болести по рибите, посочени в приложение VI към Директива 2006/88/ЕО, за да бъде незабавно идентифицирано.
However, other PCR versions of proven similar efficacy may be used instead.
Подробни диагностични методи и процедури за надзор на КХБШ
The first detection in an area shall be confirmed by sequencing or sent to a to a national reference laboratory or to the EU reference laboratory for fish diseases referred to in Annex VI to Directive 2006/88/EC, for immediate identification.
При вземането на пробите и лабораторното изследване с цел получаване или запазване на статут „свободен от болест“ по отношение на КХБШ, както е посочено в част 2, раздел I от приложение I, като се използват диагностичните методи, посочени в раздели II или III от част 2 от посоченото приложение, се прилагат подробните диагностични методи и процедури, посочени в следните точки II.1 и II.2 от настоящата част.
Detailed diagnostic methods and procedures for the surveillance of KHVD
Когато е възможно, проба се взема от риби, които са стояли за продължителен период от време при стойности на температурата на водата, благоприятстващи развитието на вируса, а именно две до три седмици при температура от 15 °C до 26 °C.
When sampling and laboratory examination for the purpose of obtaining or maintaining certain health statuses with regard to KHVD as set out in Section I of Part 2 of Annex I are carried out using the diagnostic methods set out in Sections II or III of Part 2 of that Annex, the detailed diagnostic methods and procedures set out in the following points II.1 and II.2 of this Part shall apply.
За да се подобри възможността за откриване на КХВШ, при възможност пробите се събират 24 часа и не по-късно от 72 часа след прилагането на практики на отглеждане, които могат да активират наново вируса в риба, която е носител, като например използване на мрежи или транспорт.
If possible, fish that have been kept for a prolonged time period at the virus permissive temperature range (namely, 2 to 3 weeks at 15 °C to 26 °C) shall be sampled.
За надзора на КХБШ рибите могат да бъдат изпращани живи или да се умъртвяват и да се пакетират поотделно в запечатани асептични съдове, или пък замразени органи или парчета от органи, поставени за съхранение в алкохол 80 % до 100 % или вирусна транспортна среда (да се обработят в рамките на 48 часа след събирането), могат да бъдат използвани за изследване с основани на PCR методи.
If possible, samples shall be collected 24 hours but not later than 72 hours after management practices that may reactivate the virus in fish with a carrier status, such as netting or transport, in order to enhance the chance of KHV detection.
За надзора на КХВШ се събира тъкан от хрилете и бъбрека.
For the purpose of the surveillance of KHVD, the fish may be sent alive or killed and packed separately in sealed aseptic containers or alternatively frozen organs or organ pieces preserved in 80 % to 100 % alcohol or viral transport medium (to be processed within 48 hours after collection) may be used for testing PCR based methods.
За целите на надзора на КХВШ, когато е възможно, обединяването се избягва.
For the surveillance of KHVD, gill and kidney tissue shall be collected.
Ако е необходимо обединяване, може да бъде обединен тъканен материал от максимум две риби.
For the purpose of surveillance of KHVD, pooling shall be avoided where possible.
По-големите проби се хомогенизират с чукче и хаванче или в торбичка Stomacher, а подпробите за извличане на ДНК — преди избистрянето.
If pooling is necessary, tissue material from a maximum of two fish may be pooled.
Друг вариант е подпробите да се събират от всяка тъкан, включена в пробата, и да се поставят в микроепруветки за лизиране.
Larger samples shall be homogenised in mortar and pestle or stomacher, and subsamples retrieved for DNA extraction before clarification.
Могат да бъдат използвани описаните в точка II.2 налични в търговската мрежа комплекти за извличане на ДНК, които ще предоставят висококачествена ДНК и са подходящи за използване с PCR протоколи.
Alternatively, subsamples may be collected from each tissue included in the sample and placed in ‘lysis-tubes’.
Приемливото съотношение на тъканната среда е 1:9 w/v.
Commercially available DNA extraction kits that produce high quality DNA suitable for use with the PCR protocols set out in point II.2 may be used.
В изследването се включват 20 до 25 mg тъканен материал.
The acceptable tissue medium ratio shall be 1:9 w/v.
Надзор на КХБШ посредством основани на PCR методи
20 to 25 mg tissue material shall be included in the tests.
За надзора на КХВШ се използва qPCR.
Surveillance of KHVD by PCR based methods
Ако има положителни проби за област, за която преди не е имало потвърдени положителни проби, резултатите от изследванията трябва да се потвърдят:
For the surveillance of KHV, a qPCR shall be used.
или чрез секвениране на продукт от пробите на полимеразна верижна реакция (PCR) или спрегната полимеразна верижна реакция,
If positive samples appear in an area not previously confirmed positive, the test results shall be confirmed either:
Получената прояснена консенсусна секвенция съвпада (с най-малко 98 %) с тези референтни секвенции;
by sequencing of a PCR or nested PCR product from the samples.
или пробите се изпращат до националната референтна лаборатория за потвърждение.
The obtained clean consensus sequence shall match (by at least 98 %) with these reference sequences.
qPCR за откриване на КХВШ
or alternatively, samples may be sent to a national reference laboratory for confirmation.
Използва се qPCR, описана, както следва:
qPCR for KHV detection
Условия на циклите: един цикъл при 95 °C в продължение на 15 минути, последван от 50 цикъла при 94 °C в продължение на 15 секунди и 60 °C в продължение на 60 секунди.
The qPCR described as follows shall be used:
Резултатите от qPCR може да се променят в зависимост от условията, при които се получават, а именно за термичните протоколи може да се наложи оптимизиране в зависимост от използвания термоциклер.
Cycling conditions: one cycle of 95 °C at 15 minutes, followed by 50 cycles of 94 °C at 15 seconds and 60 °C for 60 seconds.
Конвенционална PCR за потвърждение на откриване на КХВШ
The results of the qPCR may vary depending on the conditions under which it is performed, namely the thermal protocols might need optimisation, depending on the thermal cycler in use.
За потвърждение на присъствието на заразяване с КХВШ се използва генеричната спрегната полимеразна верижна реакция, описана в следната таблица 2.1, последвана от секвениране на амплифицирания продукт.
Conventional PCR for confirmation of KHV detection
Таблица 2.1
For confirmation of the presence of infection with KHV, the generic nested PCR described in the following Table 2.1 shall be used followed by sequencing of the amplified product.
Праймери и условия за анализа на спрегната полимеразна верижна реакция, насочени към всички херпес вируси по шарана (CyHV-1, CyHV-2 и CyHV-3)
Table 2.1
Наименование на праймера
Primers and conditions for the nested PCR assay targeting all cyprinid herpesviruses (CyHV-1, CyHV-2 and CyHV-3)
Секвенция
Primer name
Условия на циклите
Sequence
Размер на продукта
Cycling conditions
CyHVpol-прав
Product size
Първи кръг на полимеразна верижна реакция (PCR)
CyHVpol-forward
1 цикъл:
First round PCR
95 °C в продължение на 2 минути.
1 cycle:
40 цикъла:
95 °C 2 minutes
95 °C в продължение на 30 секунди
40 cycles:
55 °C в продължение на 30 секунди
95 °C for 30 seconds
72 °C в продължение на 45 секунди
55 °C for 30 seconds
72 °C в продължение на 10 минути
72 °C for 45 seconds
CyHVpol-обратен
72 °C for 10 minutes
CyHVpol-вътрешен прав
CyHVpol-reverse
Втори кръг на полимеразна верижна реакция (PCR)
CyHVpol-internal forward
95 °C в продължение на 2 минути
Second round PCR
CyHVpol-вътрешен обратен
95 °C 2 minutes,
Вместо това могат да бъдат използвани и варианти на PCR с доказана сходна ефективност.
CyHVpol-internal reverse
Секвенирането може да се извършва в лабораторията или във външни специализирани дружества за секвениране.
PCR versions of proven similar efficacy may be used instead.
Резултатите от секвенирането се анализират, като секвенциите се подравняват с известните референтни последователности на КХВШ (номера за присъединяване на GenBank AP008984, DQ657948 и DQ177346).
Sequencing may be performed by the laboratory or at external specialised sequencing companies.
Получената прояснена консенсусна секвенция трябва да съвпада с най-малко 98 % с тези референтни секвенции.
Sequencing results shall be analysed by aligning the sequences to the known reference sequences of KHV (Gen Bank accession numbers AP008984, DQ657948 and DQ177346).
ПОДРОБНИ ДИАГНОСТИЧНИ МЕТОДИ И ПРОЦЕДУРИ ЗА НАДЗОР И ПОТВЪРЖДЕНИЕ НА ИНФЕКЦИОЗНАТА АНЕМИЯ ПО СЬОМГАТА (ИАС)
The obtained clean consensus sequence must match at least to 98 % with those reference sequences.
I. I. Процедури за вземане за надзор и борба с ИАС
DETAILED DIAGNOSTIC METHODS AND PROCEDURES FOR THE SURVEILLANCE AND CONFIRMATION OF INFECTIOUS SALMON ANEMIA (ISA)
При вземането на проби и лабораторно изследване за целите на програмите за надзор или ликвидиране, посочени в част 3 от приложение I, или за потвърждение или отхвърляне на присъствието на ИАС в съответствие с член 57, буква б) от Директива 2006/88/ЕО, се прилагат подробните методи и процедури, посочени в точки I.1, I.2 и I.3 от настоящия раздел.
I. Sampling procedures for the surveillance and control of ISA
За целите на лабораторните изследвания за присъствие на ИАС по възможност пробите от риби не се групират.
When sampling and laboratory examination are carried out, for the purpose of the surveillance or eradication programmes set out in Part 3 of Annex I or to confirm or rule out the presence of ISA in accordance with Article 57(b) of Directive 2006/88/EC, the detailed methods and procedures set out in points I.1, I.2 and I.3 of this Section shall apply.
За целите на надзора на ИАС обаче се приема обединяването на 2 до 5 риби.
For the purpose of laboratory examination for the presence of ISA, fish samples shall not be pooled where possible.
Проби за обратна транскриптазна полимеразна верижна реакция в реално време (RT-PCR) се вземат от всички риби за проби.
However, for the purpose of surveillance for ISA, the pooling of 2 to be 5 fish is accepted.
Взема се парче от средната част на бъбрека на рибите с помощта на стерилен инструмент и се поставя в микроепруветка, която съдържа един ml разтвор с доказана ефикасност за съхранение на PHK.
Samples for Reverse Transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis shall be taken from all of the fish sampled.
Тъканта от максимум пет риби може да се събере в епруветка с разтвор за съхранение и това да представлява обща проба.
A piece of mid-kidney shall be removed from the fish using a sterile instrument and transferred to a microfuge tube containing one ml RNA preservative solution of proven efficacy.
Теглото на тъканта в една проба е 0,5 g.
Tissue from up to five fish may be collected in one tube of transport solution and shall represent one pooled sample.
Когато рибите са много малки, за да се получи проба с желаното тегло, могат да се вземат парченца от бъбрека, сърцето, далака, черния дроб или пилорите на сляпото черво, в този порядък, за да се получат 0,5 g.
The weight of tissue in one sample shall be 0,5 g.
Тъканта за хистологично изследване се взема само от прясно умъртвени риби с нормална структура, които показват клинични признаци или след настъпване на смъртта има находки, съвместими с присъствието на болестта.
When the fish are too small to obtain a sample of the required weight, pieces of kidney, heart, spleen, liver or pyloric caeca may be taken, in that order of preference, to make up 0,5 g.
Вземат се проби от всички външни или вътрешни лезии, а при всички случаи пробите от средната част на бъбрека, сърцето, черния дроб, панкреаса, корема и далака се вземат от всяка риба с помощта на скалпел и се поставят в 8 % до 10 % (обем:обем) солен буферен разтвор с формол.
Tissue for histological examination shall only be taken from freshly killed fish with a normal constitution, exhibiting clinical signs or post-mortem findings consistent with the presence of ISA.