natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Допълнение 5А и допълнение 5Б посочват препоръчваните процедури, които трябва да се спазват при оценката на половите белези съответно при Pimephales promelas и оризията.
mortalities of less than 5 % of population in seven days:
Определенията, използвани за този метод за изпитване, са дадени в Допълнение 1.
accept the batch
В рамките на изследването мъжки и женски риби, способни на размножаване, се експонират заедно в съдове за изпитване.
Fish should not receive treatment for disease during the acclimation period, in the pre-exposure period, or during the exposure period.
Техният статус на полово зрели и способни на размножаване индивиди позволява ясното разграничаване на половете и следователно дава възможност за свързан с пола анализ на всяка крайна точка, и гарантира тяхната чувствителност към външни химикали.
Pre-exposure and selection of fish
При завършване на изпитването полът се потвърждава с макроскопско изследване на гонадите след отваряне на корема с ножици.
A one-week pre-exposure period is recommended, with animals placed in vessels similar to the actual test.
Преглед на съответните условия на биологичното изследване е даден в допълнение 2.
Fish should be fed ad libitum throughout the holding period and during the exposure phase.
Изследването обикновено започва с риби, пробовзети от популация, която е в състояние на хвърляне на хайвер;
The exposure phase is started with sexually dimorphic adult fish from a laboratory supply of reproductively mature animals (e.g. with clear secondary sexual characteristics visible as far as fathead minnow and medaka are concerned), and actively spawning.
застаряващи индивиди не следва да се използват.
For general guidance only (and not to be considered in isolation from observing the actual reproductive status of a given batch of fish), fathead minnows should be approximately 20 (± 2) weeks of age, assuming they have been cultured at 25 ± 2 °C throughout their lifespan.
Указания относно възрастта на рибите и репродуктивния им статус са дадени в раздела за подбора на риби.
Japanese medaka should be approximately 16 (± 2) weeks of age, assuming they have been cultured at 25 ± 2 °C throughout their lifespan.
Изпитването се провежда, като се използват три концентрации на експозиция на химикал, както и контрола на вода и, ако е необходимо, контрола на разтворител.
Zebrafish should be approximately 16 (± 2) weeks of age, assuming they have been cultured at 26 ± 2 °C throughout their lifespan.
При оризията и зебровото данио се използват два съда или повторения на третиране (всеки съд съдържа 5 мъжки и 5 женски), а при Pimephales promelas се използват четири съда или повторения на третиране (всеки съд съдържащ 2 мъжки и 4 женски).
TEST DESIGN
Това е така с цел приспособяване към териториалното поведение на мъжките при Pimephales promelas, като се поддържа достатъчна мощност на изследването.
Three concentrations of the test chemical, one control (water) and, if needed, one solvent control are used.
Експозицията се провежда в продължение на 21 дни и вземане на проби от риби се извършва на 21-ия ден от експозицията.
The data may be analysed in order to determine statistically significant differences between treatment and control responses.
При вземането на проби на 21-ия ден от експозицията животните се умъртвяват по хуманен начин.
These analyses will inform whether further longer term testing for adverse effects (namely, survival, development, growth and reproduction) is required for the chemical, rather than for use in risk assessment (24).
Вторичните полови белези се измерват при Pimephales promelas и японската оризия (виж допълнение 5А и допълнение 5Б);
For zebrafish and medaka, on day 21 of the experiment, males and females from each treatment level (5 males and 5 females in each of the two replicates) and from the control(s) are sampled for the measurement of vitellogenin and secondary sex characteristics, where applicable.
кръвни проби за определяне на VTG се вземат от зебровото данио и Pimephales promelas, като алтернатива хомогенат глава/опашка може да се вземе от зебровото данио за определяне на VTG (допълнение 6);
For fathead minnow, on day 21 of exposure, males and females (2 males and 4 females in each of the four replicates) and from the control(s) are sampled for the measurement of vitellogenin and secondary sex characteristics.
черен дроб за анализа на VTG се взема от оризията (допълнение 6).
For the purposes of this test, the highest test concentration should be set by the maximum tolerated concentration (MTC) determined from a range finder or from other toxicity data, or 10 mg/l, or the maximum solubility in water, whichever is lowest.
КРИТЕРИИ ЗА ПРИЕМАНЕ НА ИЗПИТВАНЕТО
The MTC is defined as the highest test concentration of the chemical which results in less than 10 % mortality.
За да са приемливи резултатите от изпитването, се прилагат следните условия:
Using this approach assumes that there are existing empirical acute toxicity data or other toxicity data from which the MTC can be estimated.
Смъртността в контролите на вода (или на разтворител) не трябва да надвишава 10 % в края на периода на експозиция;
Estimating the MTC can be inexact and typically requires some professional judgment.
концентрацията на разтворен кислород трябва да бъде най-малко 60 % от стойността на насищане при равновесие с атмосферния въздух (ASV) по време на периода на експозиция;
Three test concentrations, spaced by a constant factor not exceeding 10, and a dilution-water control (and solvent control if necessary) are required.
температурата на водата трябва да се различава с не повече от ± 1,5 °C между съдовете за изпитване по всяко време на периода на експозиция, и се поддържа в диапазон от 2 °C в рамките на температурните диапазони, посочени за изпитваните видове (допълнение 2).
A range of spacing factors between 3,2 and 10 is recommended.
следва да бъдат на разположение доказателства, че концентрацията на изпитвания химикал в разтвора е била задоволително поддържана в рамките на ± 20 % от усреднените измерени стойности. chemical
Selection and weighing of test fish
Обикновено лабораторно оборудване и специално следното:
It is important to minimise variation in weight of the fish at the beginning of the assay.
устройства за измерване на съдържанието на кислород и рН-метри;
Suitable size ranges for the different species recommended for use in this test are given in Appendix 2.
оборудване за определяне твърдост и алкалност на водата;
For the whole batch of fish used in the test, the range in individual weights for male and female fish at the start of the test should be kept, if possible, within ± 20 % of the arithmetic mean weight of the same sex.
подходяща апаратура за контрол на температурата и за предпочитане продължителен мониторинг;
It is recommended to weigh a subsample of the fish stock before the test in order to estimate the mean weight.
съдове, направени от химични инертни материали и с подходящ капацитет по отношение на препоръчителната гъстота на зареждане и отглеждане (вж. допълнение 2);
Conditions of exposure
субстрат за хвърляне на хайвер за Pimephales promelas и зебровото данио, допълнение 4 съдържа необходимите подробности;
The test duration is 21 days, following a pre-exposure period.
подходящи точни везни (т.е. точност до ± 0,5 mg).
The recommended pre-exposure period is one week.
Всяка вода, в която изпитваният вид показва съответните признаци за дългосрочно преживяване и растеж, може да се използва като вода за изпитването.
Fish should be fed ad libitum with an appropriate food (Appendix 2) at a sufficient rate to maintain body condition.
Необходимо е постоянно качество на водата по време на изпитването.
Care should be taken to avoid microbial growth and water turbidity.
Стойността на рН на водата следва да е от 6,5 до 8,5, но по време на дадено изпитване трябва да е в диапазон ± 0,5 рН единици.
As a general guidance, the daily ration may be divided into two or three equal portions for multiple feeds per day, separated by at least three hours between each feed.
За да се гарантира, че водата за разреждане няма да повлияе неправилно върху резултата от изпитването (например чрез образуване на комплекс с изпитвания химикал), пробите за анализ следва да се вземат на интервали.
A single larger ration is acceptable particularly for weekends.
Правят се измервания на тежки метали (например Cu, Pb, Zn, Hg, Cd и Ni), основни аниони и катиони (например Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl–, и SO42–), пестициди (например общо органофосфорни и общо органохлорни пестициди), общ органичен въглерод и суспендирани твърди частици, например на всеки три месеца, когато се знае, че водата за разреждане има относително постоянно качество.
Food should be withheld from the fish for 12 hours prior to sampling/necropsy.
Ако е показано, че качеството на водата е постоянно поне за период, по-голям от една година, определянията могат да се правят по-рядко и да се увеличат интервалите (например на всеки шест месеца).
Fish food should be evaluated for the presence of contaminants such as organochlorine pesticides, polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), polychlorinated biphenyls (PCBs).
Някои от химичните характеристики на водата за разреждане са изброени в допълнение 3.
Food with an elevated level of phytoestrogens that would compromise the response of the assay to known oestrogen agonist (e.g. 17-beta estradiol) should be avoided.
Разтворите за изпитване при избраните концентрации се приготвят чрез разреждане на изходен разтвор.
Uneaten food and faecal material should be removed from the test vessels at least twice weekly, e.g. by carefully cleaning the bottom of each tank using a siphon.
Изходният разтвор се приготвя за предпочитане чрез просто смесване и разбъркване на изпитвания химикал във водата за разреждане с помощта на механични средства (например разклащане или ултрасонификация).
The photoperiod and water temperature should be appropriate for the test species (see Appendix 2).
За постигане на подходящо концентриран изходен разтвор могат да се използват колони за насищане (колони за разтворимост).
Frequency of analytical determinations and measurements
Използването на разтворител за носител не е препоръчително.
Prior to initiation of the exposure period, proper function of the chemical delivery system should be ensured.
Независимо от това, в случай че е необходим разтворител, успоредно следва да се проведе изпитване на контрола на разтворител, при същата концентрация на разтворител, като тази при третиранията с химикала.
All analytical methods needed should be established, including sufficient knowledge on the chemical stability in the test system.
За трудно разтворими изпитвани химикали е възможно разтворителят да бъде технически най-доброто решение;
During the test, the concentrations of the test chemical are determined at regular intervals, as follows:
Следва да се консултира Ръководството на ОИСР с насоки за изпитване за токсичност във водна среда на трудни вещества и смеси (22).
the flow rates of diluent and toxicant stock solution should be checked preferably daily but as a minimum twice per week, and should not vary by more than 10 % throughout the test.
Изборът на разтворител се определя в зависимост от химичните свойства на химикала.
It is recommended that the actual test chemical concentrations be measured in all vessels at the start of the test and at weekly intervals thereafter.
Ръководството на ОИСР препоръчва максимум от 100μl/l, което следва да се спазва;
It is recommended that results be based on measured concentrations.
Независимо от това неотдавнашен преглед (23) подчерта допълнителни проблеми при използването на разтворители за изпитване на ендокринна активност.
However, if concentration of the test chemical in solution has been satisfactorily maintained within ± 20 % of the nominal concentration throughout the test, then the results can either be based on nominal or measured values.
Поради това се препоръчва концентрацията на разтворителя, ако е необходим, да бъде сведена до минимум, когато това е технически осъществимо (в зависимост от физичните и химичните свойства на изпитвания химикал).
Samples may need to be filtered (e.g., using a 0,45 μm pore size) or centrifuged.
Използва се проточна система за изпитване.
If needed, then centrifugation is the recommended procedure.
Такава система постоянно подава и разрежда изходен разтвор на изпитвания химикал (например система с измерваща помпа, пропорционално разреждащо устройство, сатуратор), за да се подават серии от концентрации към камерите за изпитване.
However, if the test material does not adsorb to filters, filtration may also be acceptable.
Параметрите на потока на изходния разтвор и водата за разреждане следва да се проверяват на интервали, за предпочитане всеки ден по време на извършването на изпитването, и през това време не следва да се променят с повече от 10 %.
During the test, dissolved oxygen, temperature, and pH should be measured in all test vessels at least once per week.
Трябва внимателно да се избягва използването на нискокачествени пластмасови тръби или други материали, които могат да съдържат биологично активни химикали.
Total hardness and alkalinity should be measured in the controls and one vessel at the highest concentration at least once per week.
При избора на материали за проточната система трябва да бъде взета под внимание възможна адсорбция на изпитвания химикал в този материал.
Temperature should preferably be monitored continuously in at least one test vessel.
Отглеждане на рибата
A number of general (e.g. survival) and core biological responses (e.g. vitellogenin levels) are assessed over the course of the assay or at termination of the assay.
Рибата за изпитването следва да се избира от лабораторна популация, за предпочитане от едно и също потомство, която е била аклиматизирана в продължение на поне две седмици преди изпитването, при условия, свързани с качеството на водата и осветлението, подобни на тези, използвани при изпитването.
Measurement and evaluation of these endpoints and their utility are described below.
Важно е скоростта на зареждане и гъстотата на отглеждане (за определения, виж допълнение 1) да са подходящи за използваните за изпитването видове (вж. допълнение 2).
Survival
След 48-часов период на свикване се отчита смъртността и се прилагат следните критерии:
Fish should be examined daily during the test period and any mortality should be recorded and the dead fish removed as soon as possible.
при смъртност, по-голяма от 10 % от популацията за седем дни:
Dead fish should not be replaced in either the control or treatment vessels.
отхвърля се цялата партида;
Sex of fish that die during the test should be determined by macroscopic evaluation of the gonads.
при смъртност между 5 % и 10 % от популацията:
Behaviour and appearance
аклиматизация за нови седем дни;
Any abnormal behaviour (relative to controls) should be noted;
ако смъртността е повече от 5 % през вторите седем дни, се отхвърля цялата партида;
this might include signs of general toxicity including hyperventilation, uncoordinated swimming, loss of equilibrium, and atypical quiescence or feeding.
при смъртност по-малко от 5 % от популацията за седем дни:
Additionally external abnormalities (such as haemorrhage, discoloration) should be noted.
партидата се приема
Such signs of toxicity should be considered carefully during data interpretation since they may indicate concentrations at which biomarkers of endocrine activity are not reliable.
По време на аклиматизационния период, в периода преди експозицията или по време на периода на експозиция рибата не следва да бъде лекувана от заболявания.
Such behavioural observations may also provide useful qualitative information to inform potential future fish testing requirements.
Период преди експозицията и подбор на риби
For example, territorial aggressiveness in normal males or masculinised females has been observed in fathead minnows under androgenic exposure;
Препоръчва се едноседмичен период преди експозицията, в който животните се поставят в съдове, подобни на съдовете при действителното изпитване.
in zebrafish, the characteristic mating and spawning behaviour after the dawn onset of light is reduced or hindered by oestrogenic or anti-androgenic exposure.
Рибите следва да бъдат хранени ad libitum през време на периода на отглеждане и по време на фазата на експозиция.
Because some aspects of appearance (primarily colour) can change quickly with handling, it is important that qualitative observations be made prior to removal of animals from the test system.
Фазата на експозиция започва с полово диморфни възрастни риби от лабораторна доставка на зрели животни, способни на размножение (напр. с ясно видими вторични полови белези що се отнася до Pimephales promelas и японската оризия) и активно хвърлящи хайвер.
Experience to date with fathead minnows suggests that some endocrine active chemicals may initially induce changes in the following external characteristics:
Само за общ ориентир (и без да се разглежда изолирано от наблюдаването на настоящия репродуктивен статус на дадена партида от риби), Pimephales promelas трябва да бъде на възраст приблизително 20 (± 2) седмици, като се приема, че рибите от този вид са били отглеждани при 25 ± 2 °C през жизнения им цикъл.
body colour (light or dark), coloration patterns (presence of vertical bands), and body shape (head and pectoral region).
Японската оризия трябва да бъде на възраст приблизително 16 (± 2) седмици, като се приема, че рибите от този вид са били отглеждани при 25 ± 2 °C през жизнения им цикъл.
Therefore observations of physical appearance of the fish should be made over the course of the test, and at conclusion of the study
Зебровото данио трябва да бъде на възраст приблизително 16 (± 2) седмици, като се приема, че рибите от този вид са били отглеждани при 26 ± 2 °C през жизнения им цикъл.
Humane killing of fish
ПЛАНИРАНЕ НА ИЗПИТВАНЕТО
At day 21, i.e. at termination of the exposure, the fish should be euthanized with appropriate amounts of Tricaine (Tricaine methane sulfonate, Metacain, MS-222 (CAS 886-86-2), 100-500 mg/l buffered with 300 mg/l NaHCO3 (sodium bicarbonate, CAS 144-55-8) to reduce mucous membrane irritation; blood or tissue is then sampled for vitellogenin determination, as explained in the Vitellogenin section.
Използват се три концентрации на изпитвания химикал, една контрола (вода) и, ако е необходимо, една контрола на разтворител.
Observation of secondary sex characteristics
Данните могат да бъдат анализирани, за да се определят статистически значими разлики между отклиците в третиранията и контролите.
Some endocrine active chemicals may induce changes in specialised secondary sex characteristics (number of nuptial tubercles in male fathead minnow, papillary processes in male medaka).
Тези анализи ще дадат информация дали, вместо за употреба при оценка на риска, не се изисква по-нататъшно по-дългосрочно изпитване за неблагоприятни последици (а именно преживяване, развитие, растеж и размножение) (24).
Notably, chemicals with certain modes of action may cause abnormal occurrence of secondary sex characteristic in animals of the opposite sex;
За зебровото данио и оризията, в ден 21 на опита се пробовземат мъжки и женски животни от всяко ниво на третиране (5 мъжки и 5 женски животни във всяко от двете повторения) и от контролата(ите), за измерване на VTG и вторични полови белези, където е приложимо.
for example, androgen receptor agonists, such as trenbolone, methyltestosterone and dihydrotestosterone, can cause female fathead minnows to develop pronounced nuptial tubercles or female medaka to develop papillary processes (11, 20, 21).
За Pimephales promelas в ден 21 на опита се пробовземат мъжки и женски животни (2 мъжки и 4 женски животни във всяко от четирите повторения) и от контролата(ите), за измерване на VTG и вторични полови белези.
It also has been reported that oestrogen receptor agonists can decrease nuptial tubercle numbers and size of the dorsal nape pad in adult males (25, 26).
За целите на това изпитване най-високата изпитвана концентрация трябва да се определя от максимално поносимата концентрация (МПК), определена при изпитване за определяне на обхвата, или от други данни за токсичност, или 10 mg/l, или максималната разтворимост във вода, в зависимост от това коя е най-ниска.
Such gross morphological observations may provide useful qualitative and quantitative information to inform potential future fish testing requirements.
МПК се определя като най-високата изпитвана концентрация на химикала, която води до по-малко от 10 % смъртност.
The number and size of nuptial tubercles in fathead minnow and papillary processes in medaka can be quantified directly or more practically in preserved specimens.
При използването на този подход се допуска, че са налице емпирични данни за смъртността от остра и друга токсичност, от които може да се оцени МПК.
Recommended procedures for the evaluation of secondary sex characteristics in fathead minnow and medaka are available from Appendix 5A and Appendix 5B, respectively.
Оценката на МПК може да бъде неточна и обикновено се изисква определена професионална преценка.
Vitellogenin (VTG)
Изискват се три изпитвани концентрации, раздалечени на равни интервали една от друга с кратност, която не надвишава 10, и контрола на вода за разреждане (както и контрола на разтворител, ако е необходимо).
Blood is collected from the caudal artery/vein with a heparinised microhematocrit capillary tubule, or alternatively by cardiac puncture with a syringe.
Препоръчва се раздалечаване с кратност между 3,2 и 10.
Depending upon the size of the fish, collectable blood volumes generally range from 5 to 60 μl per individual for fathead minnows and 5-15 μl per individual for zebrafish.
Подбор и измерване теглото на изпитваните риби
Plasma is separated from the blood via centrifugation, and stored with protease inhibitors at – 80 °C, until analysed for vitellogenin.
Важно е варирането в теглото на рибите в началото на изпитването да се сведе до минимум.
Alternatively, in medaka the liver will be used, and in zebrafish the head/tail homogenate can be used as tissue-source for vitellogenin determination (Appendix 6).
Подходящи диапазони на размерите за различните видове, които се препоръчват за използване в настоящото изпитване, са дадени в допълнение 2.
The measurement of VTG should be based upon a validated homologous ELISA method, using homologous VTG standard and homologous antibodies.
За цялата партида от риби, използвани в изпитването, стойностите на индивидуалните тегла в началото на изпитването следва да се запазят в ± 20 % от средноаритметичното тегло на рибите от същия пол.
It is recommended to use a method capable to detect VTG levels as low as few ng/ml plasma (or ng/mg tissue), which is the background level in unexposed male fish.
Препоръчва се да се измерва и теглото на подпроба от рибното потомство преди изпитването с цел да се оцени средното тегло.
Quality control of vitellogenin analysis will be accomplished through the use of standards, blanks and at least duplicate analyses.
Условия на експозиция
For each ELISA method, a test for matrix effect (effect of sample dilution) should be run to determine the minimum sample dilution factor.
Продължителността на теста е 21 дни, след период преди експозицията.
Each ELISA plate used for VTG assays should include the following quality control samples:
Препоръчаният период преди експозицията е една седмица.
at least 6 calibration standards covering the range of expected vitellogenin concentrations, and at least one non-specific binding assay blank (analysed in duplicate).
Рибите следва да бъдат хранени ad libitum с подходяща храна (приложение 2) в достатъчно количество за поддържане на телесното състояние.
Absorbance of these blanks should be less than 5 % of the maximum calibration standard absorbance.
Следва да се полагат грижи за избягване на развитието на микроби и на мътност на водата.
At least two aliquots (well-duplicates) of each sample dilution will be analysed.
Като обща насока дневната порция може да бъде разделена на две или три равни части за многократно ежедневно хранене, с поне три часа между всяко хранене.
Well-duplicates that differ by more than 20 % should be re-analysed.