natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Изпитването на всеки шест месеца на чувствителността на клетките от бъбрек на атлантическа сьомга към изолати на вируса на ИАС може да замени употребата на включването на положителен контрол на всяка инокулация.
To avoid that risk, positive controls shall be set up and handled separately from test plates.
Пробите се инкубират при температура 15 ± 2 °С за максимум петнадесет дни.
A sensitivity test every 6 months of ASK cells towards ISAV isolates may replace the use of including a positive control at each inoculation.
Клетъчните култури се изследват два пъти под микроскоп за цитопатичен ефект между 5 и 7 дни и между 12 и 14 дни след инокулацията.
Samples shall be incubated at 15 ± 2 °C for up to 15 days.
Ако някоя обединена проба от клетки показва цитопатичен ефект, незабавно се пристъпва към процедури за идентификация на вируса в съответствие с точка II.2.4.
Using a microscope, cell cultures shall be examined for CPE twice, between 5 to 7 and 12 to 14 days following inoculation.
Ако не се наблюдава цитопатичен ефект до четиринадесетия ден, се прави индиректен имунофлуоресцентен тест (IFAT), хемадсорпция или RT-PCR.
If any pool shows CPE, virus identification procedures shall be initiated immediately in accordance with point II.2.4.
Субкултивиране се извършва между тринадесетия и петнадесетия ден.
If no CPE is observed by day 14, an Indirect fluorescent antibody test (IFAT), haemadsorption or RT-PCR shall be performed.
Супернатант от културата се прибавя към клетъчните гнезда, които съдържат клетки в активна фаза на нарастване в съответното разреждане (1/10) върху пластинките с множество клетъчни гнезда, след това се оставят да инкубират при температура 14 ± 2 °С за максимум 18 дни.
Subcultivation shall be carried out between days 13 to 15.
Клетъчните култури се изследват два пъти с микроскоп, за да се открие цитопатичен ефект между петия и седмия ден и между 14-ия и 18-ия ден след инокулацията.
Culture supernatant shall be added to wells containing fresh actively growing cells in appropriate dilution (1/10) in multi-well plates and incubated at 14 ± 2 °C for up to 18 days.
Ако не се наблюдава цитопатичен ефект между 14-ия и 18-ия ден, се прави хемадсорбционен тест или RT-PCR.
Using a microscope, cell cultures shall be examined for CPE twice, between days five to seven and days 14 to 18 following inoculation.
Ако се наблюдава цитотоксикация през първите седем дни след инкубацията, се извършва субкултивиране на този етап и клетките се инкубират за 14 до 18 дни, след което се прави ново субкултивиране за още един период инкубация за 14 до 18 дни.
If no CPE is observed by days 14 to 18, a haemadsorption or an RT-PCR test shall be performed.
Ако се наблюдава цитотоксикация след седем дни, се пристъпва към субкултивиране и клетките се оставят да инкубират, така че да се достигне период от общо 28 до 36 дена инкубация от деня на първичната инокулация.
If cytotoxicity occurs within the first 7 days of incubation, subcultivation shall be performed at that stage, and the cells shall be incubated for 14 to 18 days and sub cultivated again with a further period of 14 to 18 days incubation.
В случай на бактериално заразяване в първичната култура тестът се възобновява, като се използват хомогенатът от тъкани, съхранен при температура – 80 °С.
If cytotoxicity occurs after 7 days, subcultivation shall be performed once and the cells shall be incubated to achieve the total period of 28 to 36 days incubation from the primary inoculation.
Преди инокулацията хомогенатът от тъкани се центрофугира при 4000 × g в продължение на 15 до 30 минути при температура 0 до 6 °C, супернатантът се филтрира при 0,22 μm.
If bacterial contamination occurs in the primary culture, the test shall be set up again using the tissue homogenate stored at – 80 °C.
Ако възникне бактериално заразяване по време на етапа на субкултивирането, супернатантът се филтрира при 0,22 μm, инокулиран върху млади клетки и инкубиран за още 14 до 18 дни.
Prior to inoculation, the tissue homogenate shall be centrifuged at 4000 × g for 15 to 30 minutes at 0 to 6 °C and the supernatant shall be filtered at 0,22 μm.
Тестове за идентификация на вируса
If bacterial contamination occurs during the subcultivation step the supernatant shall be filtered at 0,22 μm, inoculated onto fresh cells and incubated for a further 14 to 18 days.
Ако в независимо кой стадий се наблюдава доказателство за цитопатичен ефект или хемадсорбционният тест е положителен, се извършва идентификация на вируса.
Virus identification tests
Методите, които могат да бъдат избрани за идентификация на вируса на ИАС, са RT-PCR в съответствие с точка II.1 и имунофлуоресценция (IF) в съответствие с точка II.2.6.
If evidence of CPE is observed at any stage, or if a haemadsorption test is positive, virus identification shall be carried out.
Ако се счита, че е възможно присъствието на други вируси, се провеждат допълнителни тестове за идентификация на вируса.
The methods of choice for the identification of ISAV shall be RT-PCR in accordance with point II.1 and Immunofluorescence (IF) in accordance with point II.2.6.
Ако тези тестове не са довели до окончателно идентифициране на вируса в срок от една седмица, супернатантът се изпраща за незабавна идентификация до:
If it is considered that other viruses may be present, supplementary virus identification tests shall be carried out.
референтната лаборатория за ИАС към Световната организация за здравеопазване на животните (OIE) или
If those tests have not resulted in a definitive identification of the virus within 1 week, the supernatant shall be forwarded for immediate identification to:
национална референтна лаборатория или референтната лаборатория на ЕС за болести по рибите, посочени в приложение VI към Директива 2006/88/ЕО.
the World Organisation for Animal Health (OIE) reference laboratory for ISA, or;
Хемадсорбция
a national reference laboratory or the EU reference laboratory for fish diseases as referred to in Annex VI to Directive 2006/88/EC.
Тъй като размножаването на вируса на ИАС в клетъчни култури не винаги води до цитопатичен ефект, всяко клетъчно гнездо се подлага на RT-PCR тест или хемадсорбционен тест в съответствие с настоящата точка, или IF тест в съответствие с точка II.
Haemadsorption
2.6.
As replication of ISAV in cell cultures does not always result in a CPE, every well shall be subject to an RT-PCR test or a haemadsorption test in accordance with this point, or an IF test in accordance with point II.2.6.
Проба от средата на клетъчната култура се отнема от всяко клетъчно гнездо, включително от онези за положителна и отрицателна контрола, и се поставя в стерилни етикетирани епруветки.
Cell culture medium shall be removed from each well, including those of positive and negative controls, and placed in labelled sterile tubes.
Към всяко клетъчно гнездо се прибавят 500 μL от суспензия 0,2 % (обем/обем) от измити червени кръвни тела от заек или кон или от суспензия с 0,05 % (обем/обем) с измити червени кръвни тела от дъгова пъстърва или атлантическа сьомга и се оставят да инкубират на стайна температура в продължение на 45 минути.
500 μl of a 0,2 % (vol:vol) suspension of washed rabbit or horse red blood cells, or a 0,05 % (vol:vol) suspension of washed rainbow trout or Atlantic salmon red blood cells, shall be added to each well and incubated at room temperature for 45 minutes.
Червените кръвни тела се премахват и всяко клетъчно гнездо се промива два пъти със среда L-15.
The red blood cells shall be removed and each well shall be washed twice with L-15 medium.
Всяко клетъчно гнездо се изследва с микроскоп.
Each well shall be examined using a microscope.
Наличието на сраствания от червени кръвни тела прикрепени към повърхността на клетките от бъбрек на атлантическа сьомга е признак за вероятно заразяване с ортомиксовирус.
The presence of clusters of red blood cells attaching to the surface of ASK cells shall be indicative of presumptive infection with an orthomyxovirus.
Ако хемадсорбционният тест от е положителен, незабавно се пристъпва към тест за идентификация на вируса в съответствие с точка II.2.4.
If a haemadsorption test is positive, a virus identification test shall be performed immediately in accordance with point II.2.4.
Имунофлуоресценция (IF)
Immunofluorescence (IF)
Клетки от бъбрек на атлантическа сьомга (пасаж 65 или по-нисък) се култивират в среда L-15, която съдържа 10 % серум от говежди фетус, 2 % (обем/обем) 200 mM L-глутамин и 0,08 % (обем/обем) 50 mM 2-меркаптоетанол в пластинки с множество клетъчни гнезда и използвани при формиран монослой над 50 %.
ASK (pass 65 or lower) shall be grown in a L-15 medium containing 10 % foetal bovine serum, 2 % (vol:vol) 200 mM L-glutamine, and 0,08 % (vol:vol) 50 mM 2-mercaptoethanol in multi-well plates and used at greater than 50 % confluence.
Могат също така да се използват други клетъчни линии или среда на култура с доказана ефективност.
Other cell lines or growth medium of proven efficacy may also be used.
225 μl от на супернатанта с евентуално заразената от вируса култура се добавя във всяко от двете клетъчни гнезда, смесват се и 225 μl се прехвърлят в други две клетъчни гнезда, а именно с разреждане 1:5.
225 μl of putative virus-infected culture supernatant shall be added to each of two wells, mixed and 225 μl transferred to two further wells, namely a 1:5 dilution.
Две други клетъчни гнезда се оставят неинокулирани, за да служат като контролни.
Two additional wells shall be left uninoculated to act as controls.
Пробите от различните рибни стопанства се обработват върху отделни пластинки, както и контролните проби за вируса.
Samples from each fish farm site shall be handled on separate plates, as shall the virus control.
Контрол за вируса се установява, като се използва референтен изолат с вируса на ИАС.
A virus control shall be established using a reference isolate of ISAV.
Плаките се инкубират при температура 14 ± 2 °С и се изследват под микроскоп за максимум седем дни.
Plates shall be incubated at 14 ± 2 °C and examined microscopically for up to 7 days.
Ако се наблюдава ранен цитопатичен ефект или не се наблюдава цитопатичен ефект в рамките на седем дни, следващият етап е фиксацията.
When early CPE is observed, or if no CPE is observed within 7 days, the next step shall be fixation.
За тази цел клетъчните гнезда се промиват с буферен разтвор с фосфат (РВS) и се фиксират чрез инкубация с 80 % ацетон в продължение на 20 минути при стайна температура.
Wells shall be washed with Phosphate buffered saline (PBS) and fixed by incubation with 80 % acetone for 20 minutes at room temperature.
Плаките се оставят да изсушат на въздух и се оцветят незабавно или се съхраняват при температура от 0 до 6 °С за не повече от 24 часа преди оцветяването.
Plates shall be air-dried and stained immediately or stored at 0 to 6 °C for no more than 24 hours prior to staining.
Дублираните клетъчните гнезда се оцветяват със смес от моноклонални антитела (MAb) 3H6F8 и 1OC9F5 срещу вируса на ИАС или с друго MAb с доказана ефективност и специфичност, разреждат се в PBS и се инкубират при температура 37 ± 4 °С в продължение на 30 минути.
Replicate wells shall be stained with a mix of monoclonal antibodies (MAb) 3H6F8 and 1OC9F5 against ISAV, or other MAb of proven efficacy and specificity, diluted in PBS and incubated at 37 ± 4 °C for 30 minutes.
MAb се отстранява и пластинките се промиват три пъти с разтвор 0,05 % в 20 Tween в PBS.
MAb shall be removed and plates washed three times with 0,05 % Tween 20 in PBS.
Конюгат на флуоресцеин изотиоцианат (FITC) от антитела срещу миши имуноглобулин, разреден в PBS, се добавя във всяко клетъчно гнездо и се инкубира при температура 37 ± 4 °С в продължение на 30 минути.
Anti-mouse IgG Fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugate diluted in PBS shall be added to each well and incubated at 37 ± 4 °C for 30 minutes.
Разтворите от различни партиди MAb и конюгат с FITC се оптимизират във всяка лаборатория.
The dilutions of different batches of MAb and FITC conjugate shall be optimised in each laboratory.
Антитялото се отстранява и плаките се промиват три пъти с 0,05 % разтвор Tween 20 в PBS.
Antibody shall be removed and plates shall be washed three times with 0,05 % Tween 20 in PBS.
Клетъчните гнезда се изследват незабавно под инвертен микроскоп, оборудван за флуоресценция с адаптиран филтър, който да възбужда FITC.
Wells shall be examined immediately using an inverted microscope set up for fluorescence microscopy with a suitable filter for excitation of FITC.
Даден тест се счита за положителен, ако се наблюдават флуоресцентни клетки.
A test shall be considered positive if fluorescent cells are observed.
За да е валиден тестът, положителните контролни плаки трябва да дадат положителен резултат, а отрицателните контролни плаки — отрицателен.
For a test to be valid, the positive controls shall score positive and the negative controls shall score negative.
Изследване на други тъкани
Examination of other tissues
Техниката, посочена в точка II.2.6, може да се прилага за други тъкани от риби, като например черен дроб, далак и сърце, при условие че достатъчно количество от ендотелиалните клетки, левкоцитите или лимфоцитите могат да бъдат депозирани върху плаката.
The technique referred to in point II.2.6 may be applied to other fish tissues such as liver, spleen and heart providing a reasonable quantity of endothelial cells, leucocytes or lymphocytes can be deposited on the slide.
Процедурата по маркиране е еднаква за всички тъкани, въпреки че за някои тъкани е за предпочитане да се премахне оцветяването с пропидиев йодид и да се разчита на осветяването във фаза, за да се идентифицират типовете клетки, които присъстват в пробата.
The staining procedure shall remain the same for each tissue, although for some tissues it may be preferable to omit the propidium iodide staining and rely on the phase illumination to identify the cell types present in the imprint.
Участъците, поставени в парафин, се изрязват на 5 μm и се оцветяват с хематоксилин и еозин.
Paraffin-embedded sections shall be cut at 5 μm and stained using haematoxylin and eosin.
Хистологичните промени в клинично заболяла атлантическа сьомга са различни, но могат да включват следното:
Histological changes in clinically diseased Atlantic salmon are variable, but may include the following:
голям брой еритроцити в централния венозен синус и ламелните капиляри на хрилете, където също могат да се образуват еритроцитни тромби;
numerous erythrocytes in the central venous sinus and lamellar capillaries of the gills, where erythrocyte thrombi also may be formed;
мултифокални до конфлуентни петехии или некроза на хепатоцитите, или и двете на известно разстояние от по-големи съдове в черния дроб; мултифокална акумулация на еритроцити в разширените чернодробни синусоиди;
multifocal to confluent petechiae or hepatocyte necrosis or both at some distance from larger vessels in the liver; multifocal accumulation of erythrocytes in dilated hepatic sinusoids;
акумулация на еритроцити в кръвоносните съдове на чревната ламина проприя и в крайна сметка кръвоизлив в ламина проприя;
accumulation of erythrocytes in blood vessels of the intestinal lamina propria and eventually haemorrhage into the lamina propria;
стромата на далака се разширява от акумулация на еритроцити;
spleen stroma distended by erythrocyte accumulation;
леки мултифокални до екстензивни дифузни интерстициална кръвоизливи с тубуларна некроза в областите с кръвоизливи, акумулация на еритроцити в гломерулите на бъбрека;
slight multifocal to extensive diffuse interstitial haemorrhage with tubular necrosis in the haemorrhagic areas, erythrocyte accumulation in the glomeruli in the kidney;
еритрофагоцитоза в далака и вторични кръвоизливи в черния дроб и бъбрека.
erythrophagocytosis in the spleen and secondary haemorrhages in liver and kidney.
Имунохистохимия (IHC)
Immunohistochemistry (IHC)
Върху участъци с парафин от тъканта, фиксирана с формалин, се използват поликлонални антитела с нуклеопротеини срещу вируса на ИАС.
Polyclonal antibody against ISAV nucleoprotein shall be used on paraffin sections from formalin-fixed tissue.
Органи, които трябва да се изследват, са средната част на бъбрека и сърцето (преходна зона, включително всички три камери и клапи).
The organs to be examined shall be mid-kidney and heart (transitional area including all three chambers and valves).
Случаите на съмнение поради патологични признаци се проверяват с положителна имунохистохимия (IHC).
Suspected cases due to pathological signs shall be verified with a positive IHC.
Хистологичните участъци се подготвят в съответствие със стандартните методи.
Histological sections shall be prepared in accordance with standard methods.
Подготовка на тъканните участъци
Preparation of tissue sections
Тъканите се фиксират в неутрален буферен разтвор с фосфат с 10 % формалин за най-малко един ден, дехидратират се в степенувана серия етанол, почистват се в ксилен и се поставят в парафин в съответствие със стандартните протоколи.
The tissues shall be fixed in neutral phosphate-buffered 10 % formalin for at least 1 day, dehydrated in a graded ethanol series, cleared in xylene and embedded in paraffin, according to standard protocols.
Участъци с дебелина приблизително 5 μm (за проби с IHC върху предметни стъкла, покрити с поли-L-лизин) се загряват до температура от 56 °C до 58 °C (максимум 60 °C) в продължение на 20 минути, депарафинирани в ксилен, рехидратирани чрез степенувана серия етанол и оцветени с хематоксилин и еозин за патоморфология и IHC в съответствие с точка 2).
Approximately 5 μm thick sections (for IHC placed on poly-L-lysine-coated slides) shall be heated at 56 °C to 58 °C (maximum 60 °C) for 20 minutes, dewaxed in xylene, rehydrated through a graded ethanol series, and stained with haematoxylin and eosin for pathomorphology and IHC in accordance with point (2).
Процедура по оцветяване при IHC
Staining procedure for IHC
Всички инкубации се извършват при стайна температура върху люлееща се платформа, освен ако в настоящото решение не е предвидено друго:
All incubations shall be carried out at room temperature on a rocking platform, unless otherwise provided for in this decision:
извличане на антигена се прави чрез кипене на участъците в 0,1 M цитратен буферен разтвор pH 6,0 в продължение на 2 × 6 минути, последвано от блокиране с 5 % обезмаслено сухо мляко и 2 % кози серум в 50 mM TBS (TBS; Tris/HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,6) в продължение на 20 минути;
antigen retrieval shall be done by boiling sections in 0,1 M citrate buffer pH 6,0 for 2 × 6 minutes followed by blocking with 5 % non-fat dry milk and 2 % goat serum in 50 mM TBS (TBS; Tris/HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,6) for 20 minutes;
участъците се инкубират за една нощ с първични антитела (моноспецифични заешки антитела с нуклеопротеини срещу вируса на ИАС), разтворени в TBS с 1 % обезмаслено сухо мляко, последвано от три промивания в разтвор TBS с 0,1 % разтвор Tween 20;
sections shall then be incubated overnight with primary antibody (monospecific rabbit antibody against ISAV nucleoprotein) diluted in TBS with 1 % non-fat dry milk, followed by three washes in TBS with 0,1 % Tween 20;
за откриване на свързани антитела участъците се инкубират с конюгирани с алкална фосфатаза антитела срещу IgG на заек в продължение на 60 минути.
for detection of bound antibodies, sections shall be incubated with Alkaline phosphatase-conjugated antibodies to rabbit IgG for 60 minutes.
След последното измиване се добавя Фаст Ред (1 mg ml– 1) и Нафтол AS-MX фосфат (0,2 mg ml– 1) с 1 mM Левамисол в 0,1 M TBS (pH 8,2), за да се развиват в продължение на 20 минути.
Following a final wash, Fast Red (1 mg ml– 1) and Naphthol AS-MX phosphate (0,2 mg ml– 1) with 1 mM Levamisole in 0,1 M TBS (pH 8,2) shall be added to develop for 20 minutes.
След това участъците се измиват с чешмяна вода преди контрастно оцветяване с Харис хематоксилин и поставят във водна среда.
Sections shall then be washed in tap water before counterstaining with Harris haematoxylin and mounted in aqueous mounting medium.
Тъканни участъци, които са с положителен резултат за вируса на ИАС и с отрицателен резултат за вируса на ИАС, се включват като контроли проби във всеки препарат.
ISAV positive and ISAV negative tissue sections shall be included as controls in every setup.
Тълкуване на резултата от IHC
Interpretation of the result of IHC
Тълкуването на резултата от изследването на IHC се извършва, както е посочено в букви а) и б):
The interpretation of the result of the IHC test shall be as set out in points (a) and (b):
контролните участъци се считат за положителни, когато се забележи, че контролните участъци имат ясно отчетливо цитоплазмено и интранюклеарно червено (червеникаво) оцветяване на ендотелиалните клетки в кръвоносните съдове на ендокарда.
control sections shall be considered as positive, when it is observed that the control sections have clearly visible red-coloured (reddish) cytoplasmic and intranuclear staining of endothelia cells in blood vessels of endocardium.
Участък от тестовата проба се счита за положителен само ако се констатира такова ясно, интранюклеарно червено оцветяване на ендотелиалните клетки;
A test sample section shall only be regarded as positive if such clear, intranuclear red staining of endothelial cells is found;
контролните участъци се считат за отрицателни, ако не са придобили значителна цветна реакция.
control sections shall be considered as negative if they don't have any significant colour reaction.
Тъй като интранюклеарната локализация е характерна за нуклеопротеина на ортомиксовируса по време на етапа на размножаване на вируса, но често доминантно е паралелното цитоплазмично оцветяване, цитоплазмени и други видове оцветяване без интрануклеарна локализация се считат за нехарактерни или неокончателни.
Since the intranuclear localisation is particular to the orthomyxovirus nucleoprotein during a stage of virus replication but concurrent cytoplasmic staining is often dominant, cytoplasmic and other staining patterns without intranuclear localisation shall be considered as nonspecific or inconclusive.
Най-силните положителни реакции на оцветяване обикновено се получават в ендотелиалните клетки на сърцето и бъбреците.
The strongest positive staining reactions are usually obtained in endothelial cells of heart and kidney.
Реакциите на ендотелиално оцветяване в големи хеморагични лезии може да са слаби или да липсват, вероятно поради лизис на заразени ендотелиални клетки.
Endothelial staining reactions within very extensive haemorrhagic lesions may be slight or absent, possibly because of lysis of infected endothelial cells.
ПОДРОБНИ ДИАГНОСТИЧНИ МЕТОДИ И ПРОЦЕДУРИ ЗА НАДЗОР И ПОТВЪРЖДЕНИЕ НА ЗАРАЗЯВАНЕ С MARTEILIA REFRINGENS
DETAILED DIAGNOSTIC METHODS AND PROCEDURES FOR THE SURVEILLANCE AND CONFIRMATION OF INFECTION WITH MARTEILIA REFRINGENS
I. Подробни методи и процедури за диагноза за заразяване с Marteilia refringens
I. Detailed diagnostic methods and procedures for the diagnosis of infection with Marteilia refringens
Когато се извършват вземане на проби и лабораторно изследване за получаване или запазване на здравен статус по отношение на заразяване с Marteilia refringens, както е посочено в част 4, раздел I от приложение I, или за потвърждение или за отхвърляне на присъствието на тази включена в списък болест в съответствие с член 57, буква б) от Директива 2006/88/ЕО, като се използват диагностичните методи, посочени в част 4, раздел II от приложение I, се прилагат подробно описаните диагностични методи и процедури, посочени в точки I.1, I.2 и I.3 от настоящата част.
When sampling and laboratory examination are carried out for the purpose of obtaining or maintaining a health status with regard to infection with Marteilia refringens as set out in Section I of Part 4 of Annex I or to confirm or rule out the presence of that listed disease in accordance with Article 57(b) of Directive 2006/88/EC, using the diagnostic methods set out in Section II of Part 4 of Annex I, the detailed diagnostic methods and procedures set out in points I.1, I.2 and I.3 of this Part shall apply.
С приоритет се вземат проби от отворени или наскоро умрели мекотели, за да се увеличат шансовете за откриване на заразени животни.
Gaping or freshly dead individual molluscs shall be sampled by priority, to increase the chances of finding infected animals.