natgillin/translations-raw huggingface dataset:
КОНЦЕНТРАЦИЯ
Impregnate the tissue with paraffin to maintain tissue integrity and create a firm surface for microtomy.
Твърди частици
Labelled tissue cassettes are removed from formalin/ethanol storage and the cassettes are placed in the processing basket(s).
От метода на изпитване В.14/Насоки относно концентрации на изпитване
The processing basket is loaded in the tissue processor.
Колона (брой на концентраците между 100 и 10, или между 10 и 1) [1]
The processing schedule is selected.
Серия от три (или повече) последователни концентрации може да бъде избрана от една колона.
After the tissue processor has completed the processing cycle, the basket(s) may be transferred to the embedded station.
Междинните точки между концентрациите в колона (х) се намират в колона (2х + 1).
Embedding
Изброените стойности могат да представят концентрации, изразени като обемен или тегловен процент (mg/1 или μg/l).
Objective:
Стойностите могат да се умножават или делят на всички степени на 10, както е подходящо.
Properly orient the specimen in solidified paraffin for microtomy.
Колона 1 може да се използва, ако е имало значителна неопределеност по отношение на нивото на токсичност.
The basket(s) of cassettes is/are removed from the processor and immersed in the paraffin-filled front chamber of the embedding station thermal console or the cassettes are moved to a separate paraffin heater.
Насоки за хомогенизиране на главата и опашката от ювенилни екземпляри от зеброво данио, Pimephales promelas, триигла бодливка и японска оризия
The first cassette to be embedded is removed from the front chamber of the thermal console or the paraffin heater.
Целта на настоящия раздел е да се опишат процедурите преди количественото определяне на концентрацията на VTG.
The cassette lid is removed and discarded, and the cassette label is checked against the animal records to resolve potential discrepancies prior to embedding.
Могат да се използват други процедури, които водят до сравнимо количествено определяне на VTG.
An appropriately sized embedding mould is selected.
Като опция концентрацията на VTG може да се определи в кръвна плазма или черен дроб, вместо в хомогенат глава/опашка.
The mould is held under the spout of the dispensing console and filled with molten paraffin.
Главата и опашката си изрязват от рибата в съответствие с описанието на изпитването.
The specimen is removed from the cassette and placed in the molten paraffin in the mould.
Всички инструменти за дисекция и плоскостта за разрязване трябва да се промият и почистят по подходящ начин (например с 96 % етанол) между обработването на всяка отделна риба, за да се предотврати „замърсяване с VTG“ от женски или индуцирани мъжки към неиндуцирани мъжки.
This is repeated with 4-8 specimens for each paraffin mould.
Когато се достигне до хомогенна маса, се добавя леденостуден буфер за хомогенизиране в количество, равно на 4-10 пъти теглото на тъканта (отбелязва се разреждането).
The position of individual fish is marked by putting fish no 1 in 180 degrees to fish 2-4/8.
Пробите се поставят върху лед до центрофугирането при 4 °C на 50000 g за 30 min..
Additional paraffin is added to cover the specimen.
Използва се пипета за поставяне на порции от 20 до 50 μl супернатант (отбелязва се количеството) в поне две епруветки, чрез потапяне на върха на пипетата под слоя мазнини на повърхността, и внимателно изсмукване на супернатантата, без фракции от мазнини или пелети.
The mould with the cassette base is placed on the cooling plate of the cryo console.
По време на употреба се поставя върху лед
After the paraffin has solidified, the block (i.e., the hardened paraffin containing the tissues and the cassette base) is removed from the mould.
Буфер за хомогенизиране:50 mM TRIS хидрохлорид pH 7,4;
Microtomy
1 % смес от инхибитори на протеаза (Sigma):
Cut and mount histological sections for staining.
12 ml TRIS хидрохлорид pH 7,4 + 120 μl смес от инхибитори на протеаза (или равностойни смеси от инхибитори на протеаза).TRIS:
The initial phase of microtomy termed “facing” is conducted as follows:
TRIS-ULTRA PURE (ICN)Смес от инхибитори на протеаза:
The paraffin block is placed in the chuck of the microtome.
От Sigma (за тъкани от бозайници) Продуктов номер P 8340.
The chuck is advanced by rotating the microtome wheel and thick sections are cut from the paraffin surface of the block until the knife reaches the embedded tissues.
Насоки за количествено определяне на вителогенин в хомогенат глава/опашка при зеброво данио (Danio rerio) (с изменение от Holbech et al., 2001). могат да бъдат използвани други процедури, използващи хомоложни антитела и стандарти
The section thickness on the microtome is set between 3 - 5 microns.
Микротитърни плаки (сертифицирани Maxisorp F96, Nunc, Roskilde Denmark), предварително покрити с 5 μg/ml IgG срещу липовителин от зеброво данио се размразяват и се промиват 3 пъти с буфер за промиване (*).
The chuck is advanced and multiple sections are cut from the block to remove any artefacts created on the cut surface of the tissue during rough trimming.
Пречистен стандарт от вителогенин от зеброво данио [1] се разрежда в поредица до 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10 и 20 ng/ml в буфер за разреждане (**) и проби се разреждат поне 200 кратно (за предотвратяване на матричния ефект) в буфер за разреждане и се поставят на плаките.
The block can be removed from the chuck and placed facedown on ice to soak the tissue.
Контрола за изследването се извършва в две повторения.
The next phase of microtomy is final sectioning and mounting of tissue sections on slides.
Към всяко гнездо се прилагат 150 μl.
These procedures are conducted as follows:
Стандартите се прилагат в две повторения, а пробите — в три повторения.
If the block has been placed on ice, the block is removed from the ice and replaced in the chuck of the microtome.
Инкубирането се извършва през нощта при 4 °C на клатачна машина.
With the section thickness on the microtome set to 3 - 5 microns, the chuck is advanced by rotating the microtome wheel.
Плаките се промиват 5 пъти с буфер за промиван (*)
Sections are cut from the block until a “ribbon” containing at least one acceptable section including the gonads has been produced.
HRP, свързан към верига от декстран (напр.
(As necessary during sectioning, the block may be removed from the chuck, placed on ice to soak the tissue, and replaced in the chuck.)
AMDEX A/S, Denmark) и конюгираните антитела се разреждат в буфер за промиване;
The sections are floated flat on the surface of the water in the water bath.
Действителното разреждане се различава в зависимост от партидата и възрастта.
An attempt is made to obtain at least one section that contains no wrinkles and has no air bubbles trapped beneath it.
Към всяко гнездо се прилагат 150 μl и плаките се инкубират в продължение на 1 час при стайна температура върху клатачна машина.
A microscope slide is immersed beneath the best section, which is lifted out of the water using the slide.
Плаките се промиват 5 пъти с буфер за промиване (*) и дъното им се почиства внимателно с етанол.
This process is referred to as “mounting” the section on the slide.
Към всяко гнездо се прилагат 150 μl TMB plus (***).
Three sections are prepared for a set of fish.
Плаките се защитават от светлина с калаено фолио плаката и се следи за промяна на оцветяването върху клатачна машина.
The second and third sections are taken at 50 micron intervals following the first section.
Когато стандартната крива е напълно оформена, ензимната активност се прекратява с добавяне на 150 μl 0,2 M H2SO4 към всяко гнездо.
If the fish are not embedded with their gonads in the same sectioning level, more sections are to be made to ensure that at least six sections including the gonads are obtained from each fish.
Абсорбцията се измерва при 450 nm (напр. с четец за плаки Thermomax на Molecular Devices.
With a slide-marking pen, the block number from which the slide was produced is recorded on the slide.
Данните се анализират със съответния софтуер (напр.
The slide is placed in a staining rack.
Softmax).
The block is removed from the chuck and placed facedown for storage.
Буфер за промиване:
Staining, Cover slipping, and Slide Labelling
PBS-изходен (****)
Stain the sections for histopathological examination
Стойността на рН се коригира до 7,3 и се допълва до 5 l с H2O, филтрувана през микропорест филтър.
Permanently seal mounted and stained tissues.
Съхранява се при 4 °C.
Permanently identify stained sections in a manner that allows complete traceability.
Буфер за разреждане:
Staining
PBS-Изходен (****)
Slides are air-dried overnight before staining.
Стойността на рН се коригира до 7,3 и се допълва до 1 l с H2O, филтрувана през микропорест филтър.
The sections are stained by Hematoxylin-Eosin.
TMB Plus е „готов за употреба“ субстрат, произведен от KemEnTec (Дания).
Cover slipping
Той е чувствителен към светлина.
Cover slips can be applied manually or automatically.
PBS изходен
A slide is dipped in xylene or TissueClear, and the excess xylene/TissueClear is gently knocked off the slide.
HPO4.2H2O
Approximately 0,1 ml of mounting medium is applied near the end of the slide opposite to the frosted end or on the cover slip.
Стойността на рН се коригира до 6,8 и се допълва до 2 l с H2O, филтрувана през микропорест филтър.
The cover slip is tilted at a shallow angle as it is applied to the slide.
Съхранява се при стайна температура.
Labelling
Battelle AP4.6.04 (1.18 mg/ml (AAA)), пречистен по:
Each slide label should contain the following information.
Насоки за приготвяне на тъканни срезове за определяне на пола и на етапите при гонадите
Laboratory name
Целта на настоящия раздел е да се опишат процедурите преди оценката на хистологичните срезове.
Specimen No./Slide No.
Могат да бъдат използвани други процедури, които водят до подобно определяне на пола и на етапите при гонадите.
Chemical/Treatment group
С няколко изключения, тези процедури са сходни за японската оризия и зебровото данио.
Statistical Flow Chart for vitellogenin analysis
Евтаназия, аутопсия и фиксиране на тъкани
Dunnett test
Цели:
variances stabilising transform?
Гарантиране на умъртвяването на рибите по хуманен начин.
Variances unequal Variances equal No Yes
Получаване на необходимите телесно тегло и измервания.
Yes Step-down trend test on replicate means
Оценка на вторичните полови белези.
<=3 reps per conc
Извършване на дисекция на тъкани за анализ на VTG.
Normalising transform?
Фиксиране на гонадите.
Nested ANOVA not normal
Процедури:
Nested ANOVA normal Monotone
Умъртвяването на рибите трябва да се извършва непосредствено преди аутопсията.
Drop water control
Поради тази причина не трябва да се умъртвяват множество риби едновременно, освен ако не са налице множество просектори.
Dunn test
С използване на кепче рибата се отстранява от камерата за изпитване и се пренася до зоната за аутопсия в съд за транспорт.
Step-down Jonckheere or Williams' test
Рибата се поставя в разтвора за евтаназия.
Rep means not normal or not homogenous
Рибата се отстранява от разтвора когато се преустанови дишането и тя не реагира на външни дразнители.
Rep means not normally distributed
Установява се мокрото тегло на рибата.
Combine controls, retains subgroups
За приготвянето на тъканите за анализ на VTG рибата може да бъде поставена на коркова плоскост върху поставката на стереомикроскоп.
Compare controls using Wilcoxon or T-test.
а. при зебровото данио главата се разрязва непосредствено зад коремната перка, а опашката се разрязва непосредствено зад гръбната перка.
Do controls differ?
б. при японската оризия коремът се отваря чрез направена внимателно инцизия, която се простира по коремната средна линия от гръдния пояс до точка, разположена точно краниално от ануса.
Both solvent and non-solvent control are present
Черният дроб се отстранява внимателно, като се използват малки пинсети и малка ножичка.
Statistical Flow Chart for sex ratio analysis
Екземплярите за анализ на VTG се поставят в епендорфови епруветки и незабавно се замразяват в течен азот.
Apply step-down Jonckheere-Terpstra test (+) to determine NOEC
Трупът, включително гонадите, се поставя в предварително етикетирана пластмасова касета за тъкани, която се прехвърля във фиксатор на Davidson или на Bouin.
Dunn or Mann-Whitney U-test w/Bonferroni-Holm adjustment to determine NOEC
Обемът на фиксатора следва да бъде най-малко 10 пъти по-голям от приблизителния обем на тъканите.
Use Dunnett test if homogenous variances (*), Tamhane-Dunnett (T3) test otherwise, to determine NOEC
Съдът с фиксатора леко се разклаща в продължение на пет секунди за отстраняване на мехурчетата въздух от касетата.
Are data normally distributed?
а.
Are data consistent with monotone dose-response?
Всички тъкани престояват във фиксатора на Davidson през нощта, след което на следващия ден се прехвърлят в отделни съдове с 10 %-ен неутрален буфериран формалин.
(‡) Or other agreed control selection
Съдовете с касетите се разклащат леко за 5 сек, за да се осигури достатъчно проникване на формалина в касетите.
After arcsin square-root transform
б.
(+) With fewer than 5 experimental units per treatment exact J-T or M-W test should be used if available
Тъканите престояват във фиксатора на Bouin в продължение на 24 часа, след което се прехвърлят в 70 % етанол.
Combine controls
Обработка на тъканите
Drop water control (‡)
Тъканите се дехидратират с цел достатъчно проникване на парафин.
Compare controls using t-Test.
Тъканта се пропива с парафин за запазване на нейната цялост и за образуване на здрава повърхност за микротомия.
Is solvent used?
Етикетираните касети с тъкани се изваждат от съхранението във формалин/етанол и се поставят в кошница(и) за обработка.
Appendix 9
Кошницата за обработка се зарежда в тъканния процесор.
Guidance for tissue sampling for genetic sex determination and for genetic sex determination by PCR-method
Избира се график за обработката.
Tissue sampling, preparation and storage before determination of genetic sex by PCR-method in medaka (Prepared by the Laboratory for Aquatic Organisms of Bayer CropScience AG)
След приключването на цикъла на обработка от тъканния процесор тъканта обработващият лични данни е завършил цикъл за обработка, кошницата (или кошниците) може да се прехвърли към станцията за включване в парафин.
With fine scissors the anal or the dorsal fin will be cut off in each individual fish and placed into a tube filled with 100 μl of extraction-buffer 1 (details on buffer preparation see below).
Включване
The scissors will be cleaned after each single fish in a beaker filled up with distilled H2O and dried with a paper tissue.
Цел:
Now the fin-tissues will be homogenised by a micro tube teflon pistil for the lysis of cells.
Екземплярът се ориентира правилно във втвърдения парафин за микротомия.
For each tube a new pistil will be used to prevent any contaminations.
Кошницата (или кошниците) с касети се изважда от процесора и се потапя в напълнената с парафин предна камера на термичната конзола на станцията за включване в парафин или касетите се преместват в отделен апарат за подгряване за парафин.
The pistils will be placed overnight in 0,5 M NaOH, rinse for 5 minutes in distilled H2O and stored in ethanol or sterile after autoclave until use.
Първата касета, която трябва да бъде включена, се отстранява от предната камера на термичната конзола или от апарата за подгряване за парафин.
It is also possible to store the fin tissue without any extraction-buffer 1 on dry-ice and then at – 80 °C refrigerator to prevent any degeneration of the DNA.
Капакът на касетата се отстранява и изхвърля, и етикетът на касетата се проверява насрещно със записите за животинския екземпляр, за разрешаване на евентуални несъответствия преди включването.
But the extraction runs better, if you extract the DNA at the same time (handling see above; samples should be thawed on ice after storaging at – 80 °C before the buffer will be filled in the tubes).
Избира се матрица с подходящ размер за включването.
After homogenizing all tubes will be placed in a water bath and boiled for 15 minutes at 100 °C.
След това матрицата се поставя под мястото на подаване на дозиращата конзола и се запълва с разтопен парафин.
Then 100 μl of the extraction buffer 2 (details on buffer preparation see below) will be pipetted into each tube.
Екземплярът се отстранява от касетата и се поставя в разтопения парафин в матрицата.
The samples will be stored at room temperature for 15 minutes and in the meantime they will be sometimes gently shaken by hand.
Това се повтаря с 4-8 екземпляра за всяка парафинова матрица.
Afterwards all tubes will be placed in the water bath again and boiled for another 15 minutes at 100 °C.
Позициите на отделните риби се маркират чрез поставянето на риба № 1 на 180 градуса от риби 2-4/8.
Until further analysis the tubes will be frozen at – 20 °C.
Добавя се допълнително парафин за покриване на екземпляра.
Buffer preparation
Матрицата с основата на касетата се поставя върху охлаждащата плоча на крио конзолата.
PCR-buffer 1:
След втвърдяването на парафина блокчето (т.е. втвърденият парафин, съдържащ тъканите и основата на касетата) се отстранява от матрицата.
500 mg N-Lauroylsarcosine (e.g. Merck KGaA, Darmstadt, GE)
Микротомия
ad 100 ml dest.
Да се разрежат и приготвят хистологични срезове за оцветяване.
→ autoclave
Началната фаза на микротомията, наречена „facing“ се извършва, както следва:
PCR-buffer 2:
а.
20 g Chelex (e.g. Biorad, Munich, GE)
Парафиновото блокче се поставя в държача за образци на микротома.
To swell in 100 ml dest.
б.
Determination of genetic sex (by PCR-method) in medaka (Prepared by the Laboratory for Aquatic Organisms of Bayer CropScience AG and Universität Würzburg Biozentrum)
Държачът за образци се придвижва чрез въртене на колелото на микротома и от парафиновата повърхност на блока се изрязват дебели срезове докато ножът достигне включените тъкани.
The prepared and frozen tubes (described in the above section) will be thawed on ice.
в.
After that, they will be centrifuged using an Eppendorf centrifuge (30 sec at max. speed, at room temperature).
Дебелината на среза на микротома се настройва между 3-5 микрона.
For the PCR, the clear supernatant separated from the precipitate will be used.
Държачът за образци се придвижва и от блокчето се отрязват множество срезове, за да се отстранят всички артефакти, създадени върху срязаната повърхност на тъканта по време на грубото обрязване.
It has absolutely to be avoided that any traces of Chelex (localized in the precipitate) are transferred to the PCR reaction, because this will interfere with the “Taq”-polymerase activity.
г.
The supernatant will be used directly or can be stored frozen (at – 20 °C) and rethawed again in several cycles without negative impact on the DNA for later analyses.
Блокчето може да бъде отстранено от държача за образци и поставено върху лед с лицето надолу за намокряне на тъканта.
Preparation of the “Reaction Mix” (25 μl per sample):
Следващата фаза на микротомията е окончателното срязване и поставянето на тъканните срезове върху предметни стъкла.
Volume
Тези процедури се извършват, както следва:
Final Concentration
а.
Template DNA
Ако блокчето е било поставено върху лед, то се отстранява от леда и се поставя обратно в държача за образци на микротома.
0,5μl-2μl
б.
buffer with MgCl2
С дебелина на среза на микротома, настроена на 3-5 микрона, държачът за образци се придвижва чрез въртене на колелото на микротома.
2,5μl
Правят се срезове от блока до получаването на „лента“, съдържаща поне един приемлив срез, включващ гонадите.
Nucleotides (each of dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
(При необходимост, по време на срязването блокчето може да бъде отстранено от държача за образци и поставено върху лед за намокряне на тъканта, и после поставено обратно в държача за образци.)
Forward Primer (10μM) (see below 3-5)
в.
0,5μl
Срезовете се оставят за изправяне да плуват върху водната повърхност във водната баня.
Reverse Primer (10μM) (see below 3-5)
Прави се опит да се получи най-малко един срез, който не съдържа гънки и няма въздушни мехурчета, попаднали под него.
Water (PCR grade)
г.
up to 25μl
Предметно стъкло за микроскоп се потапя под най-добрия срез, който се изважда от водата чрез повдигане нагоре с предметното стъкло.
Taq E- Polymerase
Този процес се нарича „монтиране“ на среза върху предметното стъкло.
0,3μl
д.
buffer with MgCl2:
Приготвят се три среза за набор от риби.
Tris/HCl (pH8,8 at 25 °C), 160mM (NH4)2SO4, 25mM MgCl2, 0,1 %Tween 20
Вторият и третият срез се правят на интервали 50 микрона след първия.
For each PCR (see below 3-5) the special primer as a new combination of “Reaction-Mix” and the adequate needed amount of template DNA for each sample (see above) is needed.
Ако рибите не са включени с техните гонади на същото ниво на срязването, трябва да се направят повече срезове, за да се гарантира, че от всяка риба са получени най-малко шест среза, включващи гонадите.
The respective volumes will be transferred into new tubes using pipettes.
е.
After that all tubes will be closed, stirred (ca.
Със средство за надписване на преметни стъкла номерът на блокчето, от който е било приготвено предметното стъкло, се записва върху предметното стъкло.
10 sec) and centrifuged (10 sec, at room temperature).
ж.
Now the respective PCR-programmes can be started.
Предметното стъкло се поставя на поставка за оцветяване.
Additionally a positive control (exemplary DNA sample with known activity and clear results) and a negative control (1 μl dest.
з.
H2O) will be used in each PCR-programme.
Блокчето се отстранява от държача за образци и се поставя с лицето надолу за съхранение.
Preparation of the agarose gel (1 %) — During running PCR-programmes:
Оцветяване, поставяне на покривно стъкло и етикетиране на предметното стъкло
Solve 3 g agarose in 300 ml 1 × TAE-buffer (1 % agarose gel)
Оцветяват се срезовете за хистопатологично изследване
This solution should be boiled using an microwave (ca.
Постоянно се запечатват монтираните и оцветени тъкани.
2-3 min)
Постоянно се идентифицират оцветените срезове раздели по начин, който позволява пълна проследимост.
Transfer the hot solution into a special casting box, which lies on ice
Оцветяване
After ca.
а.
20 min the agarose gel is ready to use
Предметните стъкла се изсушават на въздух през нощта преди оцветяването.
Storage the agarose gel in 1 × TAE-buffer until the end of the PCR-programmes
б.
Actin-PCR-programme:
Срезовете се оцветяват с хематоксилин-еозин.
This PCR-reaction is aimed to demonstrate that the DNA in the sample is not harmed.
Поставяне на покривно стъкло
Special primer:
а.
“Mact1(upper/forward)” → TTC AAC AGC CCT GCC ATG TA
Покривното стъкло може да се поставя ръчно или автоматично.
“Mact2(lower/reverse)” → GCA GCT CAT AGC TCT TCT CCA GGG AG
б.
Programme:
Предметното стъкло се потапя в ксилен или TissueClear и излишъкът от ксилен/TissueClear леко се изхвърля от предметното стъкло.
Cycle (35-times):
в.
Denaturation
Приблизително 0,1 ml от средата за монтиране се прилага в близост до края на предметното стъкло, противоположен на матирания край, или на покривното стъкло.
→ 45 sec at 95 °C
г.
Annealing
Покривното стъкло се слага под малък ъгъл при поставянето му върху предметното стъкло.
→ 45 sec at 56 °C
Етикетиране
Elongation
a.
→ 1 min at 68 °C
Всеки етикет на предметно стъкло следва да включва следната информация.
15 min 68 °C
i.
X- and Y-Gene-PCR-programme:
Наименование на лабораторията
The samples with intact DNA will be used in this PCR-programme to detect the X- and Y-Genes.
Екземпляр №/предметно стъкло №
Male DNA should show one double-band and female DNA should show one single band (after staining and gel-electrophoresis).
Химикал/Третирана група
For this programme-run one positive control for males (XY-sample) and one for females (XX-sample) should be included.
Статистическа блокова схема при анализ на вителогенин
“PG 17,5” (upper/forward) → CCG GGT GCC CAA GTG CTC CCG CTG
ANOVA с вложен дизайн нормално
“PG 17,6” (lower/reverse) → GAT CGT CCC TCC ACA GAG AAG AGA
Тест на Тамхане-Дънет върху ANOVA с вложен дизайн
Cycle (40-times):
Тест на Дънет върху ANOVA с вложен дизайн
→ 45 sec at 55 °C
средни от повторения нормално разпределени
→ 1 min 30 sec at 68 °C
Равни дисперсии
Y-Gene-PCR-programme as “control” for X- and Y-Gene-PCR-programme:
Преобраз. за стабилизир. на дисперсията?
This PCR-programme verifies the results of the “X- and Y-Gene-PCR-programme”.