natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Главата и опашката се изрязват от рибата в съответствие с фигура 1.
The Amphibian Metamorphosis Assay (AMA) is a screening assay intended to empirically identify chemicals which may interfere with the normal function of the hypothalamic-pituitary-thyroid (HPT) axis.
Важно:
The AMA represents a generalised vertebrate model to the extent that it is based on the conserved structures and functions of the HPT axis.
Всички инструменти за дисекция и плоскостта за разрязване трябва да се промият и почистят по подходящ начин (например с 96 % етанол) между обработването на всяка отделна риба, за да се предотврати „замърсяване с вителогенин“ от женски или индуцирани мъжки към неиндуцирани мъжки.
It is an important assay because amphibian metamorphosis provides a well-studied, thyroid-dependent process which responds to chemicals active within the HPT axis, and it is the only existing assay that detects thyroid activity in an animal undergoing morphological development.
За анализ на VТG
The general experimental design entails exposing stage 51 Xenopus laevis tadpoles to a minimum of three different concentrations of a test chemical and a dilution water control for 21 days.
За гонадна хистология
There are four replicates of each test treatment.
За анализ на VТG
Larval density at test initiation is 20 tadpoles per test tank for all treatment groups.
Срез отзад
The observational endpoints are hind limb length, snout to vent length (SVL), developmental stage, wet weight, thyroid histology, and daily observations of mortality.
Теглото на обединените глава и опашка от всяка риба се измерва с точност до един mg.
Test Species
След като се претеглят, частите се поставят в подходящи епруветки (напр.
Xenopus laevis is routinely cultured in laboratories worldwide and is easily obtainable through commercial suppliers.
1,5 ml епендорфова епруветка) и се замразяват при – 80 °С до хомогенизирането, или направо се хомогенизират върху лед с два пластмасови пестика.
Reproduction can be easily induced in this species throughout the year using human chorionic gonadotropin (hCG) injections and the resultant larvae can be routinely reared to selected developmental stages in large numbers to permit the use of stage-specific test protocols.
(Могат да се използват други методи, ако те се извършват върху лед и резултатът е хомогенна маса).
It is preferred that larvae used in the assay are derived from in-house adults.
Епруветките следва да бъдат номерирани по подходящ начин, така че главата и опашката от рибата да могат да бъдат свързани с частта от тялото, останала след изрязването им и използвана за хистология на гонадите.
As an alternative although this is not the preferred procedure, eggs or embryos may be shipped to the laboratory performing the test and allowed to acclimate;
Когато се достигне до хомогенна маса, се добавя леденостуден буфер за хомогенизиране в количество, равно на 4 пъти теглото на тъканта.
the shipping of larval stages for use in the test is unacceptable.
Продължава се работата с пестиците, докато сместа стане хомогенна.
Equipment and Supplies
Важна забележка:
The following equipment and supplies are needed for the conduct of this assay:
За всяка риба се използват нови пестици.
Exposure system (see description below);
Пробите се поставят върху лед до центрофугирането при 4 °C на 50000 × g за 30 min.
Glass or stainless steel aquaria (see description below);
Използва се пипета за поставяне на порции от 20 μl супернатант в поне две епруветки, чрез потапяне на върха на пипетата под слоя мазнини на повърхността, и внимателно изсмукване на супернатанта, без фракции от мазнини или пелети.
Breeding tanks;
Епруветките се съхраняват при – 80 °C до момента на употребата.
Temperature controlling apparatus (e.g., heaters or coolers (adjustable to 22° ± 1 °C));
Буфер за хомогенизиране:(50 mM TRIS хидрохлорид pH 7,4; 1 % смес от инхибитори на протеаза (Sigma)):
Thermometer;
12 ml TRIS хидрохлорид pH 7,4 + 120 μl смес от инхибитори на протеаза.TRIS:
Binocular dissection microscope;
TRIS-ULTRA PURE (ICN) напр. от Bie & Berntsen, Дания.Смес от инхибитори на протеаза:
Digital camera with at least 4 megapixel resolution and micro function;
От Sigma (за тъкани от бозайници) Продуктов номер P 8340.Бележка:
Image digitising software;
Буферът за хомогенизирането следва да се използва на същия ден, в който е приготвен.
Petri dish (e.g. 100 × 15 mm) or transparent plastic chamber of comparable size;
По време на употреба се поставя върху лед.
Analytical balance capable of measuring to 3 decimal places (mg);
Проби с внесена добавка вителогенин и еталон, който е референтен между различни изследвания
Dissolved oxygen meter;
Всеки ден, в който се извършват изпитвания за VTG, се анализира проба с внесена добавка с използване на еталон, който е референтен между различни изследвания.
pH meter;
Вителогенинът, използван за получаването на еталон, който е референтен между различни изследвания, ще е от партида, различна от използваната за приготвяне на еталони за калибриране за извършваното изследване.
Light intensity meter capable of measuring in lux units;
Пробата с внесена добавка се приготвя чрез добавяне на предварително известно количество от еталона, който е референтен между различни изследвания, в проба от плазма от контролен мъжки екземпляр.
Miscellaneous laboratory glassware and tools;
В пробата се внася добавка с цел постигане на концентрация на вителогенин между 10 и 100 пъти по-висока от очакваната концентрация на вителогенин в контролен мъжки екземпляр.
Adjustable pipettes (10 to 5000 μl) or assorted pipettes of equivalent sizes;
Пробата от плазма от контролен мъжки екземпляр, в която се внася добавка, може да бъде от отделна риба, или може да бъде съставена от няколко риби.
Test chemical in sufficient quantities to conduct the study, preferably of one lot;
Подпроба от плазма от контролен мъжки екземпляр, в която не е внесена добавка, се анализира най-малко в две гнезда с повторения.
Analytical instrumentation appropriate for the chemical on test or contracted analytical services.
Пробата с внесена добавка също се анализира най-малко в две гнезда с повторения.
Chemical Testability
Средното количество вителогенин в двете проби от плазма от контролен мъжки екземпляр, в които не е внесена добавка, се добавя към изчисленото количество вителогенин, внесено като добавка в пробите, за да се определи очаквана концентрация.
The AMA is based upon an aqueous exposure protocol whereby test chemical is introduced into the test chambers via a flow-through system.
Отношението на тази очаквана концентрация към измерената концентрация се протоколира заедно с резултатите от всеки набор от изследвания от този ден.
Flow-through methods however, introduce constraints on the types of chemicals that can be tested, as determined by the physicochemical properties of the chemical.
Средни от повторения не са нормални или са нехомогенни
Therefore, prior to using this protocol, baseline information about the chemical should be obtained that is relevant to determining the testability, and the OECD Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures (4) should be consulted.
ANOVA с вложен дизайн не е нормално
Characteristics which indicate that the chemical may be difficult to test in aquatic systems include:
ANOVA с вложен дизайн нормално
high octanol water partitioning coefficients (log Kow), high volatility, susceptibility to hydrolysis, and susceptibility to photolysis under ambient laboratory lighting conditions.
Тест на Дънет
Other factors may also be relevant to determining testability and should be determined on a case by case basis.
Преобразуване за стабили-зиране на дисперсията?
If a successful test is not possible for the chemical using a flow-through test system, a static renewal system may be employed.
Неравни дисперсии
If neither system is capable of accommodating the test chemical, then the default is to not test it using this protocol.
Средни от повторения не са с нормално разпределение
Exposure System
Тест на Йонкхере със стъпка назад
A flow-through diluter system is preferred, when possible, over a static renewal system.
Тест със стъпка назад върху средни от повторения
If physical and/or chemical properties of any of the test chemicals are not amenable to a flow-through diluter system, then an alternative exposure system (e.g., static-renewal) can be employed.
Трендов тест със стъпка назад върху средни повторения
The system components should have water-contact components of glass, stainless steel, and/or Polytetrafluoroethylene.
Определя се дали зависимостта доза-отклик е монотонна
However, suitable plastics can be utilised if they do not compromise the study.
Тест на Дънет върху ANOVA с вложен дизайн
Exposure tanks should be glass or stainless steel aquaria, equipped with standpipes that result in an approximate tank volume between 4,0 and 10,0 l and minimum water depth of 10 to 15 cm.
ANOVA с вложен дизайн не е нормално
The system should be capable of supporting all exposure concentrations and a control, with four replicates per treatment.
Немонотонна
The flow rate to each tank should be constant in consideration of both the maintenance of biological conditions and chemical exposure (e.g. 25 ml/min).
Тест на Дън или на Ман-Уитни върху средни от повторения
The treatment tanks should be randomly assigned to a position in the exposure system in order to reduce potential positional effects, including slight variations in temperature, light intensity, etc.
>=4 повт. на конц. <=3 повт. на конц.
Fluorescent lighting should be used to provide a photoperiod of 12 hr light:
Тест на Дън Да Не
12 hr dark at an intensity that ranges from 600 to 2000 lux (lumen/m2) at the water surface.
>=4 повт. на конц.
Water temperature should be maintained at 22° ± 1 °C, pH maintained between 6,5 to 8,5, and the dissolved oxygen (DO) concentration > 3,5 mg/l (> 40 % of the air saturation) in each test tank.
Преобразуване за нормализиране?
As a minimum water temperature, pH and dissolved oxygen should be measured weekly;
Преобраз. за стабилизир. на дисперсията?
temperature should preferably be measured continuously in at least one test vessel.
Tест на Тамхане-Дънет
Appendix 1 outlines the experimental conditions under which the protocol should be executed.
<=3 повт. на конц.
For further information on setting up flow-through exposure systems and/or static renewal systems, please refer to the ASTM Standard Guide for Conducting Acute Toxicity Tests on Test Materials with Fishes, Macroinvertebrates, and Amphibians (5) and general aquatic toxicology tests.
Не Да Не Да
Water quality
Тест на Дън >=4 повт. на конц.
Any water that is locally available (e.g. springwater or charcoal-filtered tap water) and permits normal growth and development of X. laevis tadpoles could be used.
<=3 повт. на конц.
Because local water quality can differ substantially from one area to another, analysis of water quality should be undertaken, particularly, if historical data on the utility of the water for raising Xenopus is not available.
Тест на Дън или на Ман-Уитни
Special attention should be given that the water is free of copper, chlorine and chloramines, all of which are toxic to frogs and tadpoles.
Изоставя се контролата на вода
It is further recommended to analyse the water concerning background levels of fluoride, perchlorate and chlorate (by-products of drinking water disinfection) as all of these anions are substrates of the iodine transporter of the thyroid gland and elevated levels of each of these anions may confound the study outcome.
Средни от повт. не са нормално разпределени или нихомогенни
Analysis should be performed before testing begins and the testing water should normally be free from these anions.
В.38.
Iodide Concentration in Test Water
ИЗСЛЕДВАНЕ ЗА МЕТАМОРФОЗА НА ЗЕМНОВОДНИ
In order for the thyroid gland to synthesise TH, sufficient iodide needs to be available to the larvae through a combination of aqueous and dietary sources.
Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на насоките за изпитване на ОИСР (ТG) 231 (2009).
Currently, there are no empirically derived guidelines for minimal iodide concentrations.
Необходимостта от разработване и валидиране на изследване, позволяващо откриване на химикали, активни в системата на щитовидната жлеза на гръбначни животни, произлиза от загрижеността, че нивата на химикали в околната среда могат да причинят неблагоприятни въздействия както за хората, така и за дивата флора и фауна.
However, iodide availability may affect the responsiveness of the thyroid system to thyroid active agents and is known to modulate the basal activity of the thyroid gland, an aspect that deserves attention when interpreting the results from thyroid histopathology.
През 1998 г.
Therefore, measured aqueous iodide concentrations from the test water should be reported.
ОИСР стартира с висок приоритет дейност по преразглеждане на съществуващите Насоки за изпитване и по разработване на нови Насоки за изпитване за скрининг и изпитвания за потенциални нарушители на функциите на ендокринната система (8).
Based on the available data from the validation studies, the protocol has been demonstrated to work well when test water iodide (I-) concentrations ranged between 0,5 and 10 μg/l.
Един от елементите на дейността бе да се разработи насока за изпитване за скрининг на химикали, активни в системата на щитовидната жлеза на гръбначни животни.
Ideally, the minimum iodide concentration in the test water should be 0,5 μg/l.
Бяха предложени както подобряване на „28-дневно изследване на оралната токсичност при гризачи с повтаряща се доза“ (глава Б.7 от настоящото приложение), така и изследване за метаморфоза на земноводни (ИМЗ).
If the test water is reconstituted from deionised water, iodine should be added at a minimum concentration of 0,5 μg/l.
Подобреният метод за изпитване Б.7 премина през валидиране и беше издаден преработен метод за изпитване.
Any additional supplementation of the test water with iodine or other salts should be noted in the report.
Изследването за метаморфоза на земноводни (ИМЗ) премина през обширна програма за валидиране, които включваше вътрешно- и междулабораторни изследвания, които доказват уместността и надеждността на изследването (1, 2).
Holding of animals
Впоследствие, валидирането на изследването бе подложено на партньорска оценка от група от независими експерти (3).
Adult Care and Breeding
Настоящият метод за изпитване е резултат от опита, придобит по време на изследванията за валидиране за откриване на химикали, активни по отношение на щитовидната жлеза, както и от работата на други места в държавите — членки на ОИСР.
Adult care and breeding is conducted in accordance with standard guidelines and the reader is directed to the standard guide for performing the Frog Embryo Teratogenesis Assay (FETAX) (6) for more detailed information.
Изследването за метаморфоза на земноводни (ИМЗ) е скринингово изследване, целящо емпирично определяне на химикали, които могат да пречат на нормалното функциониране на хипоталамус-хипофиза-гонадната (ХХГ) ос.
Such standard guidelines provide an example of appropriate care and breeding methods, but strict adherence is not required.
ИМЗ представлява обобщен модел за гръбначни, доколкото се основава на съхранените структури и функции на ХХГ ос.
To induce breeding, pairs (3-5) of adult females and males are injected with human chorionic gonadotropin (hCG).
Това изследване е важно, тъй като метаморфозата на земноводните предоставя добре проучен тиреоидно зависим процес, който е отклик на химикали, активни в рамките на ХХГ ос, и е единственото съществуващо изследване, което открива тиреоидна активност при животни, преминаващи през морфологично развитие.
Female and male specimens are injected with approximately 800 IU-1000 IU and 600 IU-800 IU, respectively, of hCG dissolved in 0,6-0,9 % saline solution.
Общият план за опита включва експониране на попови лъжички от Xenopus laevis на етап 51 най-малко на три различни концентрации на изпитван химикал и контрола на вода за разреждане в продължение на 21 дни.
Breeding pairs are held in large tanks, undisturbed and under static conditions in order to promote amplexus.
В изпитването за всяко третиране се правят по четири повторения.
The bottom of each breeding tank should have a false bottom of stainless steel or plastic mesh which permits the egg masses to fall to the bottom of the tank.
За всички групи за третиране при началото на изпитването гъстотата на ларвите е 20 попови лъжички на съд за изпитване.
Frogs injected in the late afternoon will usually deposit most of their eggs by mid morning of the next day.
Наблюдаваните крайни точки са дължина на задни крайници (HLL), дължина от върха на муцуната до клоачния отвор (SVL), етап на развитие, мокро тегло, тиреоидна хистология и ежедневни наблюдения на смъртността.
After a sufficient quantity of eggs are released and fertilised, adults should be removed from the breeding tanks.
Животински вид за изпитването
Larval Care and Selection
Xenopus laevis се отглежда обичайно и повсевместно в лабораторни условия и лесно може да бъде доставен от доставчици в търговската мрежа.
After the adults are removed from the breeding tanks, the eggs are collected and evaluated for viability using a representative sub-set of the embryos from all breeding tanks.
При този животински вид размножаването може лесно да бъде индуцирано през цялата година с използване на инжекции с човешки хорионен гонадотропин (hCG), като получените ларви могат да бъдат отглеждани по обичаен начин и в големи количества до избрани стадии на развитие, за да даде възможност за използване на протоколи за изпитване, специфични за съответния стадий.
The best individual spawn(s) (2-3 recommended to evaluate the quality of the spawns) should be retained based upon embryo viability and the presence of an adequate number (minimum of 1500) of embryos.
Предпочита се ларвите, използвани за изследването, да са от полово зрели индивиди, отгледани в изпитващата лаборатория.
All the organisms used in a study should originate from a single spawning event (i.e., the spawns should not be co-mixed).
Като алтернатива, въпреки че това не е предпочитаната процедура, на лабораторията, провеждаща изпитването, могат да бъдат доставени яйца и ембриони, като те се оставят да се аклиматизират;
The embryos are transferred into a large flat pan or dish and all obvious dead or abnormal eggs (see definition in (5)) are removed using a pipette or eyedropper.
доставянето на ларви за използване при изпитването е неприемливо.
The sound embryos from each of the three spawns are transferred into three separate hatching tanks.
Оборудване и материали
Four days after being placed in the hatching tanks, the best spawn, based on viability and hatching success, is selected and the larvae are transferred into an appropriate number of rearing tanks at 22° ± 1 °C.
За провеждането на това изследване са нужни следното оборудване и материали:
In addition, some additional larvae are moved into extra tanks for use as replacements in the event that mortalities occur in the rearing tanks during the first week.
система за експозицията (вж. описанието по-долу);
This procedure maintains consistent organism density and thereby reduces developmental divergence within the cohort of a single spawn.
аквариуми от стъкло или от неръждаема стомана (вж. описанието по-долу);
All rearing tanks should be siphoned clean daily.
съдове за размножаване;
As a precaution, vinyl or nitrile gloves are preferred to latex gloves.
апарати за контролиране на температурата (напр. от нагреватели или охладители (регулируеми до 22° ± 1 °C));
Mortalities should be removed daily and replacement larvae should be added back to maintain the organism density during the first week.
термометър;
Feeding should occur at least twice per day.
бинокулярен стереомикроскоп;
During the pre-exposure phase, tadpoles are acclimated to the conditions of the actual exposure phase, including the type of food, temperature, light-dark cycle and the culture medium.
цифров фотоапарат с разделителна способност най-малко 4 мегапиксела и функция за микрофотография;
Therefore, it is recommended that the same culture/dilution water be used during the pre-exposure phase and the exposure phase.
софтуер за дигитализиране на изображения;
If a static culture system is used for maintaining tadpoles during the pre-exposure phase, the culture medium should be replaced completely at least twice per week.
блюдо на Петри (напр.
Crowding, caused by high larval densities during the pre-exposure period, should be avoided because such effects could markedly affect tadpole development during the subsequent testing phase.
100 × 15 mm.) или прозрачна пластмасова камера със сравними размери;
Therefore, the rearing density should not exceed approximately four tadpoles/l culture medium (static exposure system) or 10 tadpoles/l culture medium (with e.g. 50 ml/min flow rate in the pre-exposure or culturing system).
аналитични везни, с които се измерва до 3-я знак след десетичната запетая (mg).
Under these conditions, tadpoles should develop from stages 45/46 to stage 51 within twelve days.
устройство за измерване на съдържанието на разтворения кислород:
Representative tadpoles of this stock population should be inspected daily for developmental stage in order to estimate the appropriate time point for initiation of exposure.
pH-метър;
Care should be used to minimise stress and trauma to the tadpoles, especially during movement, cleaning of aquaria, and manipulation of larvae.
измервателен уред за интензитет на светлината с възможности за измерване в lux;
Stressful conditions/activities should be avoided such as loud and/or incessant noise, tapping on aquaria, vibrations in the aquaria, excessive activity in the laboratory, and rapid changes in environmental media (light availability, temperature, pH, DO, water flow rates, etc.)
лабораторна стъклария и инструменти;
If tadpoles do not develop to stage 51 within 17 days after fertilisation, excessive stress should be considered as a potential culprit.
регулируеми пипети (от 10 до 5000 μl) или комплекти пипети с еквивалентни размери;
Larval Culture and Feeding
изпитван химикал в количество, достатъчно за провеждане на изследването, за предпочитане от една партида;
Tadpoles are fed with e.g. the commercial tadpole feed used in the validation studies (see also appendix 1) throughout the pre-exposure period (after Nieuwkoop and Faber (NF) stage 45/46 (8)) and during the entire test period of 21 days, or other diet that has demonstrated to allow equal performance of the Amphibian Metamorphosis Assay.
Аналитична апаратура, подходяща за химикала за изпитвания химикал, или договорени услуги по анализ.
The feeding regime during the pre-exposure period should be carefully adjusted to meet the demands of the developing tadpoles.
Изпитваемост на химикала
That is, small portions of food should be provided to the newly hatched tadpoles several times per day (at least twice).
ИМЗ се основава на протокол за експозиция във вода, при който изпитваният химикал се въвежда в камерите за изпитване чрез проточна система.
Excess food should be avoided in order i) to maintain water quality and ii) to prevent the clogging of gill filters with food particles and detritus.
Проточните методи обаче налагат ограничения по отношение на вида на химикалите, които могат да бъдат изпитвани, определени от физичните и химичните свойства на химикала.
For the tadpole feed used in the validation studies, the daily food rations should be increased along with tadpole growth to approximately 30 mg/animal/day shortly before test initiation.
Следователно, преди да се използва настоящият протокол, следва да бъде получена базова информация за химикала, която е от значение за определяне на изпитваемостта, и следва да бъде консултиран и документът на ОИСР с насоки за изпитване за токсичност във водна среда на трудни вещества и смеси (4).
This commercially available feed has been shown in the validation studies to support proper growth and development of X. laevis tadpoles, and is a fine particulate that stays suspended in the water column for a long period of time and is subject to washing out with the flow.