natgillin/translations-raw huggingface dataset:
След като бъдат взети пробите, стридите или мидите се държат при температура 4 °C или върху хладилен лед за не повече от 24 часа, ако в пробите са включени отворени мекотели, а ако такива не са включени — не повече от 72 часа, в найлонова торбичка, с етикет с информация, свързана с естеството и произхода на стридите или мидите.
Once sampled, oysters or mussels shall be maintained at 4 °C or on refrigerated ice for no more than 24 hours if samples include gaping molluscs and no more than 72 hours if not, in a plastic bag including a label with details related to the nature and the origin of the oysters or mussels.
Отворените или наскоро умрели мекотели се държат отделно от други мекотели.
Gaping or freshly dead molluscs shall be maintained separately from other molluscs.
Участъци от тъкани с дебелина от 3 до 5 mm, включително хриле и тъкан от сърцето, се използват за диагностика на Marteilia refringens посредством хистология.
A 3 to 5 mm thick section of tissues including gills and heart tissue shall be used for the diagnostic of Marteilia refringens by histology.
За някои от изследванията се използва част от храносмилателната жлеза, включително проби с отпечатък и полимеразна верижна реакция (PCR).
A piece of digestive gland shall be used for some tests, including imprints and polymerase chain reaction (PCR).
Микроскопски техники
Microscopic techniques
Цитология (отпечатъчна цитология)
Cytology (imprint cytology)
След изсушаване на храносмилателната жлеза върху попивателна хартия, върху стъклено предметно стъкло се правят няколко проби с отпечатък.
After drying digestive gland tissues on absorbent paper, several imprints shall be made on a glass slide.
Предметните стъкла се оставят да се изсушат на въздух, фиксират се в метанол или в чист етанол и се оцветяват, като се използва достъпен в търговската мрежа комплект за оцветяване на кръвта, като Diff-Quik®/Hemacolor®, съобразно инструкциите на производителя.
Slides shall be air-dried, fixed in methanol or in absolute ethanol and stained using a commercially available blood-staining kit such as Diff-Quik®/Hemacolor®, in accordance with the manufacturer's instructions.
След промиване с течаща вода и изсушаване предметните стъкла се покриват с капак, като се използва подходяща синтетична смола.
After rinsing in tap water and drying, the slides shall be mounted with a cover-slip using an appropriate synthetic resin.
Предметните стъкла първо се разглеждат при увеличение × 200, а след това при маслено потопяване с увеличение × 1000.
The slides shall be observed first at × 200 magnification and then under oil immersion at × 1000 magnification.
За положителен резултат се счита, когато се наблюдават клетки с размер между 30 и 40 μm.
A positive result shall be the observation of cells ranging in size up to between 30 to 40 μm.
Цитоплазмата се оцветява базофилно, а ядрото се оцветява еозинофилно.
The cytoplasm stains basophilic, whereas the nucleus stains eosinophilic.
Наблюдава се блед ореол около големите, силно оцветени (рефрингентни) гранули, а в по-големите клетки се наблюдават клетки в клетъчните подредби.
Pale halos around large, strongly stained (refringent) granules and, in larger cells, cell within cell arrangements are observed.
Тази техника не е характерна за видовете паразити.
The technique is not parasite species specific.
Участъците от тъканите, които включват хриле, храносмилателна жлеза, мантия и полови жлези се фиксират за най-малко 24 часа във фиксатор на Дейвидсън, последвано от нормално обработване за парафинна хистология и оцветяване, например с хематоксилин и еозин.
Sections of tissue that include gills, digestive gland, mantle, and gonad shall be fixed for at least 24 hours in Davidson's fixative followed by normal processing for paraffin histology and staining, for example with haematoxylin and eosin.
Наблюденията се извършват с растящо увеличение до × 1000.
Observations shall be made at increasing magnifications up to × 1000.
За положителен резултат се счита, когато се наблюдават клетки с размер между 4 и 40 μm.
A positive result shall be the observation of cells ranging in size from 4 up to 40 μm.
Ранните етапи се състоят от многоядрени, сферични до удължени клетки.
Early stages consist of multinucleate, spheric to elongated cells.
Те се срещат основно в епитела на хранопровода и стомаха, а в някои случаи и в лабиалното пипало.
These are mainly found in the epithelium of oesophagus and stomach and sometimes of labial palps.
Спорообразуването включва разделяне на клетките вътре в клетките и се извършва в каналчетата и тръбичките на храносмилателната жлеза.
Sporulation involves divisions of cells within cells and takes place in the digestive gland tubules and ducts.
Рефрингентните гранули се образуват в хода на спорообразуването, но не се наблюдават в ранните етапи.
Refringent granules appear in the course of sporulation, but are not observed in early stages.
В последните етапи на заразяването се наблюдават спори в свободно състояние в лумена на храносмилателния тракт.
In late phases of infection, sporangia are observed free in the lumen of the digestive tract.
Гранулите може да варират от наситено оранжево до тъмночервено.
The granules can range from deep orange to deep red.
Молекулярни техники
Molecular techniques
Могат да се използват комплекти за извличане на ДНК, които могат да бъдат намерени в търговската мрежа и обикновено с тях се постига висококачествена ДНК, подходяща за използване с PCR протоколите, както е описано в точка I.3.2.
DNA extraction kits, which are available commercially and usually produce high quality DNA suitable for use with the PCR protocols as described in point I.3.2, may be used.
Полимеразна верижна реакция (PCR)
Polymerase chain reaction (PCR)
Бяха разработени и публикувани няколко PCR протокола.
Several PCR protocols have been developed and published.
Използват се PCR праймери, насочени към района на вътрешния транскрибиран спейсър (ITS1), тъй като те могат да увеличават само M. refringens.
PCR primers that target the internal transcribed spacer (ITS1) region shall be used as they are able to amplify only M. refringens.
PCR се извършва в обем 50 μl.
PCR shall be carried out in a 50 μl volume.
PCR смесите съдържат буферен разтвор (500 mM KCl, 100 mM Tris/HCl [pH 9,0 при 25 °C] и 1 % Triton® X-100), 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP смес, 1 μM прав и обратен праймер, 0,02 единици μl– 1 Taq DNA полимераза и 10 до 100 ng от извлечена ДНК.
PCR mixtures shall contain buffer (500 mM KCl, 100 mM Tris/HCl [pH 9,0 at 25 °C] and 1 % Triton® X-100), 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP mix, 1 μM forward and reverse primers, 0,02 units μl– 1 Taq DNA polymerase, and 10 to100 ng of extracted DNA.
След денатурация на ДНК при 94 °C в продължение на пет минути, се провеждат 30 цикъла, както следва: денатурация при 94 °C в продължение на една минута, отгряване при 55 °C в продължение на една минута и удължение при 72 °C в продължение на една минута за двойка на база кило.
After denaturation of DNA at 94 °C for five minutes, 30 cycles shall be run as follows: denaturation at 94 °C for one minute, annealing at 55 °C for one minute, and elongation at 72 °C for one minute per kilo-base pair.
Провежда се окончателен етап на удължаване в продължение на 10 минути при 72 °C.
A final elongation step of 10 minutes at 72 °C shall be performed.
За откриването на M. refringens се извършва PCR с праймери, които са насочени към района на ITS1 (5′-CCG-CAC-ACG-TTC-TTC-ACT-CC-3′ и 5′-CTC-GCG-AGT-TTC-GAC-AGA-CG-3′).
For the detection of M. refringens, PCR shall be performed with primers that target the ITS1 region (5′-CCG-CAC-ACG-TTC-TTC-ACT-CC-3′ and 5′-CTC-GCG-AGT-TTC-GAC-AGA-CG-3′).
Положителните контроли се състоят от геномна ДНК от силно заразен приемник или плазмидна ДНК, като се включва целевият район.
Positive controls shall consist of genomic DNA from a highly infected host or plasmidic DNA including the target region.
Отрицателните контроли се състоят от геномна ДНК от незаразен приемник и PCR реактиви без целева ДНК.
Negative controls shall consist of genomic DNA from non-infected hosts and PCR reactives without target DNA.
За положителен резултат се счита положителна PCR амплификация на очаквания размер (412bp), като всички отрицателни контроли са отрицателни, а всички положителни контроли са положителни.
A positive result shall be positive PCR amplification at the expected size (412 bp), with all negative controls being negative and all positive controls being positive.
Хибридизация in-situ (ISH)
In-situ hybridisation (ISH)
Бяха разработени и публикувани няколко PCR протокола.
Several ISH protocols have been developed and published.
Използва се сонда, насочена към SSU от rRNA генен комплекс, тъй като тя е валидирана в съответствие с хистологията.
Probe that targets the SSU of the rRNA gene complex shall be used because it has been validated against histology.
Участъците от тъканите, които включват хриле и храносмилателна жлеза, се фиксират за най-малко 24 часа във фиксатор на Дейвидсън, последвано от нормална обработка за парафинна хистология.
Sections of tissue that include gills, digestive gland, shall be fixed for at least 24 hours in Davidson's fixative followed by normal processing for paraffin histology.
Нарязват се и върху предметни стъкла, покрити с аминоалкилсилан, се поставят участъци от 5 μm, които след това се пекат за една нощ в пещ при температура 40 °C.
Sections of 5 μm shall be cut and placed on aminoalkylsilane-coated slides, which shall then be baked overnight in an oven at 40 °C.
Участъците се почистват от восъка чрез потапяне в ксилен в продължение на 10 минути.
The sections shall be dewaxed by immersing in xylene for 10 minutes.
Тази стъпка се повтаря веднъж, след което разтворителят се отстранява чрез потапяне в две последователни вани с чист етанол в продължение на 10 минути всяка.
This step shall be repeated once and then the solvent shall be eliminated by immersion in two successive absolute ethanol baths for 10 minutes each.
След това да участъците се дехидратират чрез потапяне в степенувана серия етанол.
The sections shall then be dehydrated by immersion in a graded ethanol series.
Участъците се третират с протеиназа К (100 μg ml– 1) в TE буферен разтвор (Tris [50 mM], EDTA [10 mM]), при 37 °C в продължение на 30 минути.
The sections shall be treated with proteinase K (100 μg ml– 1) in TE buffer (Tris [50 mM], EDTA [10 mM]), at 37 °C for 30 minutes.
Предметните стъкла се дехидратират чрез потапяне в степенувана серия етанол и след това се изсушават на въздух.
Slides shall be dehydrated by immersion in a graded ethanol series and then air dried.
Участъците се инкубират с 100 μl от хибридизационния буферен разтвор (4 × SSC [стандартен солен цитрат], 50 % формамид, 1 × разтвор на Денхард, 250 μg ml– 1 дрожди tRNA, 10 % декстран сулфат), съдържащи 10 ng (1 μl от PCR реакцията, подготвена, както е описано в точка I.3.2, като се използват праймери CCG-GTG-CCA-GGT-ATA-TCT-CG и TTC-GGG-TGG-TCT-TGA-AAG-GC) от означената с дигоксигенин сонда.
Sections shall be incubated with 100 μl of hybridisation buffer (4 × SSC [standard saline citrate], 50 % formamide, 1 × Denhardt's solution, 250 μg ml– 1 yeast tRNA, 10 % dextran sulphate) containing 10 ng (1 μl of the PCR reactants prepared as described in point I.3.2 using primers CCG-GTG-CCA-GGT-ATA-TCT-CG and TTC-GGG-TGG-TCT-TGA-AAG-GC) of the digoxigenin-labelled probe.
Участъците се покриват in-situ с пластмасови похлупаци и се поставят върху нагряващ блок при 95 °C в продължение на пет минути.
Sections shall be covered with in-situ plastic cover-slips and placed on a heating block at 95 °C for five minutes.
След това предметните стъкла се охлаждат върху лед в продължение на една минута преди извършването на хибридизация за една нощ при 42 °C във влажна камера.
Slides shall then be cooled on ice for one minute before overnight hybridisation at 42 °C in a humid chamber.
Участъците се промиват два пъти в продължение на пет минути в 2 × SSC при стайна температура и веднъж в продължение на 10 минути в 0,4 × SSC при 42 °C.
Sections shall be washed twice for five minutes in 2 × SSC at room temperature, and once for 10 minutes in 0,4 × SSC at 42 °C.
Етапите на откриването се провеждат съгласно инструкциите на производителя.
The detection steps shall be performed according to the manufacturer's instructions.
Предметните стъкла след това се изплакват в стерилна дестилирана вода (dH2O).
The slides shall then be rinsed in sterile distilled water (dH2O).
Участъците се оцветяват обратно с жълто-кафяво Бисмарк, изплакват се в dH2O и се поставят капаци, като се използва водна среда за поставяне.
The sections shall be counter-stained with Bismarck Brown Yellow, rinsed in dH2O, and cover-slips shall be applied using an aqueous mounting medium.
Положителните и отрицателните контроли са участъците от съответно заразени и незаразени приемници.
Positive and negative controls shall be sections from known infected and non-infected hosts respectively.
Положителният резултат се доказва с лилаво-черното означение на клетките M. refringens в рамките на познати прицелни тъкани, като всички отрицателни контроли са отрицателни, а всички положителни контроли — положителни.
A positive result shall be demonstrated by the purple-black labelling of M. refringens cells within known target tissues, with all negative controls being negative and all positive controls being positive.
Секвенирането се извършва като един от последните етапи за потвърждаване на диагнозата.
Sequencing shall be carried out as one of the final steps for confirmatory diagnostic.
Целевите региони са SSU rDNA и ITS1.
Targeted regions are the SSU rDNA and ITS1.
Подробни диагностични методи и процедури за надзор и потвърждение на заразяване с Marteilia refringens
Detailed diagnostic methods and procedures for surveillance and confirmation of infection with Marteilia refringens
За целите на програмите за надзор и за потвърждение на присъствието на Marteilia refringens или за отхвърляне на съмнението за съответната включена в списъка болест в съответствие с изискванията, определени в част 4, раздел II от приложение I, диагностичните методи и съответните процедури, които да се използват, са в съответствие с насоките, определени в таблица 4.1, както следва:
For the purpose of surveillance programmes and to confirm the presence of an infection with Marteilia refringens or to rule out a suspicion of that listed disease, in accordance with the requirements laid down in Section II of Part 4 to Annex I, the diagnostic methods and corresponding procedures to be used shall be in accordance with the guidelines laid down in Table 4.1 as follows:
Насоки за използването на диагностичните методи за програмите за надзор и за потвърждение или отхвърляне на заразяването с Marteilia refringens
Guidelines for the use of diagnostic methods for the surveillance programmes and to confirm or rule out infection with Marteilia refringens
Целенасочен надзор
Targeted surveillance
Предполагаема диагноза
Presumptive diagnosis
Потвърдителна диагноза
Confirmatory diagnosis
Проби с отпечатък от храносмилателната жлеза
Digestive gland imprints
X или
X, or
In situ хибридизация
In situ hybridisation
X и
X, and
ПОДРОБНИ ДИАГНОСТИЧНИ МЕТОДИ И ПРОЦЕДУРИ ЗА НАДЗОР И ПОТВЪРЖДЕНИЕ НА ЗАРАЗЯВАНЕ С MARTEILIA REFRINGENS
DETAILED DIAGNOSTIC METHODS AND PROCEDURES FOR THE SURVEILLANCE AND CONFIRMATION OF INFECTION WITH BONAMIA OSTREAE
I. I. Процедури за диагностика на заразяване с Bonamia ostreae
I. Procedures for diagnosis of Infection with Bonamia ostreae
Когато се извършват вземане на проби и лабораторно изследване за получаване или запазване на здравен статус по отношение на Bonamia ostreae, както е посочено в част 5, раздел I от приложение I или за потвърждение или за отхвърляне на присъствието на тази включена в списък болест в съответствие с член 57, буква б) от Директива 2006/88/ЕО, като се използват диагностичните методи, посочени в част 5, раздел II от приложение I, се прилагат подробно описаните диагностични методи и процедури, посочени в следните точки I.1, I.2 и I.3.
When sampling and laboratory examination are carried out for the purpose of obtaining or maintaining a certain health status with regard to Bonamia ostreae as set out in Section I of Part 5 of Annex I or to confirm or rule out the presence of that listed disease in accordance with Article 57(b) of Directive 2006/88/EC, using the diagnostic methods set out in Section II of Part 5 of Annex I, the detailed diagnostic methods and procedures set out in following points I.1, I.2 and I.3 shall apply.
Процес на вземане на проби
Sample process
След като бъдат взети пробите, стридите се държат при температура 4 °C или върху хладилен лед за не повече от 24 часа, ако в пробите са включени отворени мекотели, а ако такива не са включени — 72 часа, в найлонова торбичка, с етикет с информация, свързана с естеството и произхода на стридите.
Once sampled, oysters shall be maintained at 4 °C or on refrigerated ice for no more than 24 hours if samples include gaping molluscs and 72 hours if not, in a plastic bag including a label with details related to the nature and the origin of the oysters.
Участъци от тъкани с дебелина от 3 до 5 mm, включително хриле и тъкан от сърцето, се използват за диагностика на Bonamia ostreae посредством хистология.
A 3 to 5 mm thick section of tissues including gills and heart tissue shall be used for the diagnostic of Bonamia ostreae by histology.
След изсушаване на хрилете или тъканите от сърцето върху попивателна хартия, върху стъклено предметно стъкло се правят няколко проби с отпечатък.
After drying gills or heart tissues on absorbent paper, several imprints shall be made on a glass slide.
Предметните стъкла се оставят да се изсушат на въздух, фиксират се в метанол или в чист етанол и се оцветяват, като се използва достъпен в търговската мрежа комплект за оцветяване на кръвта (а именно Diff- Quik®/Hemacolor®,) съобразно инструкциите на производителя.
Slides shall be air-dried, fixed in methanol or in absolute ethanol and stained using a commercially available blood-staining kit (namely such as Diff- Quik®/Hemacolor®.), in accordance with the manufacturer's instructions.
Предметните стъкла първо се разглеждат при увеличение × 200, а след това при маслено потопяване с увеличение × 1000.
Slides shall be observed first at × 200 magnification and then under oil immersion at × 1000 magnification.
За положителен резултат се счита присъствието на малки сферични или овални организми (с ширина 2 до 5 μm) в хемоцитите.
A positive result shall be the presence of small spherical or ovoid organisms (2 to 5 μm wide) within haemocytes.
Паразитът обаче може да се наблюдава и извън клетките.
However, the parasite might also occur extracellularly.
При тези организми се наблюдава базофилна цитоплазма и езинофилно ядро (цветовете може да са различни според използваното багрило) и тъй като те се разстилат върху предметното стъкло, може да изглеждат по-широки при пробите с отпечатък отколкото при хистологичното изследване.
These organisms show a basophilic cytoplasm and an eosinophilic nucleus (colours may vary with the stain used) and, because they spread on the slide, they can appear wider on imprints than on histological examination.
Може да се наблюдават многоядрени клетки.
Multinucleated cells may be observed.
Участъците от тъканите, които включват хриле и храносмилателна жлеза, се фиксират за най-малко 24 часа във фиксатор на Дейвидсън, последвано от нормална обработка за парафинна хистология и оцветяване, например с хематоксилин и еозин.
Sections of tissue that include gills and digestive gland, shall be fixed for a period of at least 24 hours in Davidson's fixative followed by normal processing for paraffin histology and staining, for example with haematoxylin and eosin.
За положителен резултат се счита присъствието на паразити като много малки клетки с ширина от 2 до 5 μm в хемоцитите или свободно в съединителната тъкан или синуси на перките, червата и епитела на мантията, което често се свързва със силна възпалителна реакция.
A positive result shall be the presence of parasites as very small cells of 2 to 5 μm wide within the haemocytes or free in the connective tissue or sinuses of gill, gut and mantle epithelium, often associated with an intense inflammatory reaction.
За да се избегнат съмнения, паразитът се наблюдава вътре в хемоцита за диагноза с положителен резултат.
To avoid any doubt, the parasite shall be observed inside the haemocyte for a positive diagnosis.
Могат да се използват комплекти за извличане на ДНК, които са налични в търговската мрежа и обикновено с тях се постига висококачествена ДНК, подходяща за използване с PCR протоколите, както подробно е описано по-долу.
DNA extraction kits, which are available commercially and usually produce high quality DNA suitable for use with the PCR protocols as detailed below, may be used.
Могат да се използват два PCR протокола, насочени към малките подединици (SSU) rDNA:
Two PCR protocols targeting the small subunit (SSU) rDNA may be used:
първият е традиционен PCR, с който се увеличават няколко от членовете на Haplosporidia включително Bonamia spp.; праймерите, наречени Bo и Boas, са съответно 5′-CAT-TTA-ATT-GGT-CGG-GCC-GC-3′ и 5′-CTG-ATC-GTC-TTC-GAT-CCC-CC-3′, като те увеличават продукт 300 bp.
the first one is a conventional PCR that amplify several members of the Haplosporidia including Bonamia spp.
PCR смесите съдържат буферен разтвор (500 mM KCl, 100 mM Tris/HCl [pH 9,0 при 25 °C] и 1 % Triton® X-100), 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP смес, 1 μM прав и обратен праймер, 0,02 единици μl– 1 Taq DNA полимераза и 0,2 ng μl– 1 от образеца на ДНК в общ обем от 50 μl.
Primers designated Bo and Boas are 5′-CAT-TTA-ATT-GGT-CGG-GCC-GC-3′ and 5′-CTG-ATC-GTC-TTC-GAT-CCC-CC-3′ respectively, and amplify a 300 bp product.
Пробите се денатурират в термоциклер в продължение на пет минути при 94 °C, преди да бъдат предадени за 30 цикъла (94 °С в продължение на една минута, 55 °C в продължение на една минута, 72 °C в продължение на една минута), последвано от окончателно удължаване в продължение на 10 минути при 72 °C.
PCR mixtures contain buffer (500 mM KCl, 100 mM Tris/HCl [pH 9,0 at 25 °C] and 1 % Triton® X-100), 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP mix, 1 μM forward and reverse primers, 0,02 units μl– 1 Taq DNA polymerase, and 0,2 ng μl– 1 of the DNA template in a total volume of 50 μl.
За положителен резултат се счита положителна PCR амплификация на очаквания размер (а именно 300 bp), като всички отрицателни контроли са отрицателни, а всички положителни контроли са положителни;
Samples shall be denatured in a thermocycler for five minutes at 94 °C before being submitted to 30 cycles (94 °C for one minute, 55 °C for one minute, 72 °C for one minute) followed by a final extension of 10 minutes at 72 °C.
вторият PCR протокол е анализ SYBR® Green PCR в реално време.
A positive result shall be positive PCR amplification at the expected size (namely, 300 bp), with all negative controls being negative and all positive controls being positive;
Той позволява конкретно откриване на B. ostreae (описано по-долу) и може да се комбинира с анализа SYBR® Green PCR в реално време, което позволява конкретно откриване на B. exitiosa (Ramilo et al.
the second PCR protocol is a SYBR® Green Real time PCR assay.
2013).
It allows the specific detection of B. ostreae (described below) and may be combined with a SYBR® Green Real time PCR assay allowing the specific detection of B. exitiosa (Ramilo et al.
Праймерите BOSTRE-F (5′- TTACGTCCCTGCCCTTTGTA-3′) и BOSTRE-R (5′- TCGCGGTTGAATTTTATCGT-3′) увеличават продукт 208 bp.
2013).
PCR смесите съдържат SYBR® Green Master Mix (1X), 0,3 μM прави и обратни праймери и 200 ng от извлечената ДНК.
Primers BOSTRE-F (5′- TTACGTCCCTGCCCTTTGTA-3′) and BOSTRE-R (5′- TCGCGGTTGAATTTTATCGT-3′) amplify a 208 bp product.
Пробите се денатурират в система за откриване в реално време в продължение на 10 минути при 95 °C, преди да бъдат предадени за 35 цикъла (при 95 °C в продължение на 30 секунди, при 55 °C в продължение на 45 секунди и 72 °C в продължение на една минута).
PCR mixtures contain SYBR® Green Master Mix (1X), 0,3 μM forward and reverse primers, and 200 ng of extracted DNA.