natgillin/translations-raw huggingface dataset:
За точност и за потвърждаване, че броят на рибите, които са отстранени от камерата за изпитване и броят на рибите, останали в камерата за изпитване, са в съответствие с очакванията, се проверяват етикетите на камерата за изпитване и на контейнера за пренасяне.
Attach a clean tip to the micropipette.
Ако полът не може да бъде определен по външния вид на рибата, от камерата за изпитване се отстраняват всички риби.
Take the homogenate buffer from the reagent bottle and add the buffer to the 1,5 ml microtube containing the liver.
В този случай полът следва да бъде определен чрез наблюдение на гонадата или на вторични полови белези под стереомикроскоп.
Add the homogenate buffer to all of 1,5 ml microtubes containing the liver according to the procedure described above.
Изрязване на черния дроб
There is no need to change the micropipette tip to a new one.
Изпитваните риби се прехвърлят от контейнера за пренасяне в разтвор за подлагане на анестезия с помощта на малкото кепче.
However, if the tip is contaminated or suspected to be contaminated, the tip should be changed.
След анестезирането изпитваните риби се прехвърлят върху филтърната хартия (или хартиена кърпа) с пинсети (разпространени в търговската мрежа).
Homogenisation of the liver
При захващането на изпитваните риби пинцетите се прилагат отстрани на главата, за да се предотврати счупването на опашката.
Attach a new pestle for homogenisation to the microtube homogeniser.
Водата се избърсва от повърхността на изпитваните риби върху филтърната хартия (или хартиената кърпа).
Insert the pestle into the 1,5 ml microtube.
След това се прави малък напречен разрез между областта на врата вентрално и областта в средата на корема с помощта на ножици за дисекция.
Hold the microtube homogeniser to press the liver between the surface of the pestle and the inner wall of the 1,5 ml microtube.
Ножиците за дисекция се вкарват в малката инцизия и се разрязва коремът от определена точка каудално от бранхиалната мантия до краниално от ануса по средната линия на корема.
Operate the microtube homogeniser for 10 to 20 seconds.
Внимава се ножиците за дисекция да не се вкарват прекомерно дълбоко, за да се избегне увреждане на черния дроб и гонадата.
Cool the 1,5 ml microtube with crushed ice during the operation.
Под стереомикроскоп се извършват следните операции.
Lift up the pestle from the 1,5 ml microtube and leave it at rest for about 10 seconds.
Изпитваната риба се поставя с корема нагоре върху хартиената кърпа (стъклено блюдо на Петри или предметно стъкло също така са на разположение).
Then conduct a visual check of the state of the suspension.
Стените на коремната кухина се разширяват с прецизни пинсети и вътрешните органи се екстериоризират.
If pieces of liver are observed in the suspension, repeat the operations (3) and (4) to prepare satisfactory liver homogenate.
Също така, приемливо е екстериоризирането на външните органи да се извърши чрез отстраняване на едната страна от стената на коремната кухина, ако е необходимо.
Cool the suspended liver homogenate on the ice rack until centrifugation.
С помощта на друг чифт прецизни пинцети се разкрива свързаната част на черния дроб и жлъчния мехур.
Change the pestle to the new one for each homogenate.
След това се захваща жлъчният канал и се прекъсва жлъчният мехур.
Homogenise all livers with homogenate buffer according to the procedure described above.
Внимава се да не се пробие жлъчният мехур.
Centrifugation of the suspended liver homogenate
Захваща се хранопроводът и по същия начин стомашно-чревният тракт се изрязва от черния дроб.
Confirm the temperature of the refrigerated centrifuge chamber at ≤ 5 °C.
Внимава се да не се допусне изтичане на съдържанието на стомашно-чревния тракт.
Insert the 1,5 ml microtubes containing the suspended liver homogenate in refrigerated centrifuge (adjust the balance if necessary).
Стомашно-чревният тракт се изрязва каудално от ануса и се отстранява от коремната кухина.
Centrifuge the suspended liver homogenate at 13000 g for 10 min at ≤ 5 °C.
Отстранява се масата от мазнини и други тъкани от периферията на черния дроб.
However, if the supernatants are adequately separated, centrifugal force and time may be adjusted as needed.
Внимава се да не се надраска черният дроб.
Following centrifugation, check that the supernatants are adequately separated (surface: lipid, intermediate: supernatant, bottom layer: liver tissue).
С помощта на прецизните пинцети се захваща областта на вратата на черния дроб и черният дроб се отстранява от коремната кухина.
If the separation is not adequate, centrifuge the suspension again under the same conditions.
Черният дроб се поставя върху предметното стъкло.
Remove all specimens from the refrigerated centrifuge and arrange them in the order of specimen number on the ice rack.
С помощта на прецизните пинцети от повърхността на черния дроб се отстраняват всякакви допълнителни мазнини и чужди тъкани (напр. перитонеумът), ако е необходимо.
Be careful not to resuspend each separated layer after the centrifugation.
Теглото на черния дроб се измерва като тара с 1,5 ml микроепруветка, с помощта на електронна аналитична везна.
Collection of the supernatant
Стойността се вписва в работния лист (точност: 0,1 mg).
Place four 0,5 ml microtubes for storage of the supernatant into the tube rack.
Потвърждава се информацията за идентифициране, намираща се върху етикета на микроепруветката.
Collect 30 μl of each supernatant (separated as the intermediate layer) with the micropipette and dispense it to one 0,5 ml microtube.
Капачката на микроепруветката, съдържаща черния дроб, се затваря.
Be careful not to collect the lipid on the surface or the liver tissue in the bottom layer.
Тя се съхранява в охладителен статив (или охладителен статив с лед).
Collect the supernatant and dispense it to other two 0,5 ml microtubes in the same manner as described above.
След изрязването на всеки черен дроб инструментите за дисекцията се почистват или се заменят с чисти.
Collect the rest of the supernatant with the micropipette (if feasible: ≥ 100 μl).
Отстранява се черният дроб от всички риби, намиращи се в контейнера за пренасяне, както е описано по-горе.
Then dispense the supernatant to the remaining 0,5 ml microtube.
След като черен дроб е изрязан от всички риби в контейнера за пренасяне (т.е. от всички мъжки или женски в дадена изпитвателна камера) всички екземпляри от черен дроб се поставят на статив за епруветки с етикет за идентификация и слагат за съхранение във фризер.
Close the cap of the 0,5 ml microtube and write the volume of the supernatant on the label.
Когато черният дроб се дава за предварителна обработка непосредствено след изрязването, екземплярите се пренасят до следващото работно място в охладителен статив (или охладителен статив с лед).
Then immediately cool the microtubes on the ice rack.
След изрязването на черния дроб трупът на рибата е на разположение за измерване на вторични полови белези.
Change the tip of the micropipette to the new one for each supernatant.
Екземпляри
If a large amount of lipid becomes attached to the tip, change it to the new one immediately to avoid contamination of the liver extract with fat.
Ако не се използват за предварителна обработка непосредствено след изрязването, екземплярите от черен дроб, взети от изпитваните риби, се съхраняват при ≤ – 70 °C.
Dispense all of the centrifuged supernatant to four 0,5 ml microtubes according to the procedure described above.
Прави се разрез с ножици точно пред гръдните перки.
After dispensing the supernatant to the 0,5 ml microtubes, place all of them in the tube rack with the identification label, and then freeze them in the freezer immediately.
Фигура 2
If the VTG concentrations are measured immediately after the pre-treatment, keep one 0,5 ml microtube (containing 30 μl of supernatant) cool in the tube rack and transfer it to the workstation where the ELISA assay is conducted.
Средната линия на корема се разрязва с ножица до точка, разположена приблизително 2 mm краниално от ануса.
In such case, place the remaining microtubes in the tube racks and freeze them in the freezer.
Фигура 3.
After the collection of the supernatant, discard the residue adequately.
Коремните стени се разтварят с пинцети за разкриване на черния дроб и други вътрешни органи.
Storage of the specimen
(като алтернатива, коремните стени могат да се забодат латерално).
Store the 0,5 ml microtubes containing the supernatant of the liver homogenate at ≤ – 70 °C until they are used for the ELISA.
Фигура 4.
Procedure 3A:
С помощта на пинцети се прави дисекция на черния дроб и същият се изрязва.
Zebrafish, Blood Collection from the Caudal Vein / Artery
Фиг-5
Immediately following anaesthesia, the caudal peduncle is severed transversely, and the blood is removed from the caudal artery/vein with a heparinised microhematocrit capillary tube.
Червата леко се издърпват с помощта на пинцети.
Blood volumes range from 5 to 15 μl depending on fish size.
Фиг-6
An equal volume of aprotinin buffer (6 μgml in PBS) is added to the microcapillary tube, and plasma is separated from the blood via centrifugation (5 minutes at 600 g).
Двата края на червата и мезентериалните връзки се отрязват с ножици.
Plasma is collected in the test tubes and stored at – 20 °C until analyzed for vitellogenin or other proteins of interest.
Фиг-7 (женски)
Procedure 3B:
Процедурата е идентична като тази при мъжките.
Zebrafish, Blood Collection by Cardiac Puncture
Фиг-8
To avoid coagulation of blood and degradation of protein the samples are collected within Phosphate-buffered saline (PBS) buffer containing heparin (1000 units/ml) and the protease inhibitor aprotinin (2 TIU/ml).
Завършената процедура.
As ingredients for the buffer, heparin ammonium salt and lyophilised aprotinin are recommended.
Процедура 2Б:
For blood sampling, a syringe (1 ml) with a fixed thin needle (e.g. Braun Omnikan-F) is recommended.
Японска оризия (Oryzias latipes), предварителна обработка на черен дроб за анализ на вителогенин
The syringe should be prefilled with buffer (approximately 100 μl) to completely elute the small blood volumes from each fish.
взема се бутилката с буфера за хомогенат от комплекта за ELISA и се охлажда с натрошен лед (температура на разтвора: ≤ 4 °C).
The blood samples are taken by cardiac puncture.
Ако се използва буфер за хомогенат от EnBio система за ELISA система се използва, разтворът се размразява при стайна температура и след това бутилката се охлажда с натрошен лед.
At first the fish should be anesthetized with MS-222 (100 mg/l).
Изчислява се обемът на буфера за хомогенат за черния дроб въз основа на теглото му (добавят се 50 μl буфер за хомогенат на mg тегло на черен дроб за хомогенат).
The proper plane of anaesthesia allows the user to distinguish the heartbeat of the zebrafish.
Например, ако теглото на черния дроб е 4,5 mg, обемът на буфера за хомогенат за черния дроб е 225 μl.
While puncturing the heart, keep the syringe piston under weak tension.
Изготвя се списък с обемите на буфера за хомогенат за всички екземпляри черен дроб.
Collectable blood volumes range between 20 - 40 microliters.
Подготовка на черния дроб за предварителната обработка
After cardiac puncture, the blood/buffer-mixture should be filled into the test tube.
Непосредствено преди предварителната обработка микроепруветката от 1,5 ml, съдържаща черния дроб, се взема от фризера.
Plasma is separated from the blood via centrifugation (20 min; 5000 g) and should be stored at – 80 °C until required for analysis.
Предварителна обработка на черния дроб от животни от мъжки пол следва да се извършва преди тази при женските животни, за да се предотврати замърсяване с вителогенин.
Procedure 3C:
Освен това, предварителната обработка за изпитваните риби следва да се извършва в следния ред:
SOP:
Броят на взетите от фризера в даден момент микроепруветки от 1,5 ml, съдържащи проби черен дроб, не следва да надвишава броя, който може да се центрофугира по това време.
Zebrafish, homogenisation of head & tail
Микроепруветките от 1,5 ml, съдържащи проби черен дроб, се подреждат на охладителния статив с лед по реда на екземпляра (няма нужда от размразяване на черния дроб).
The fish are anaesthetised and euthanised in accordance with the test description.
Извършване на предварителната обработка
The head and tail are cut of the fish in accordance with Figure 1.
Добавяне на буфера за хомогенизиране
Important:
Проверява се списъкът за обема на буфера за хомогенат, който да се използва за определена проба черен дроб и микропипетата се настройва (диапазон на обемите: 100-1000 μl) към подходящия обем.
All dissection instruments, and the cutting board should be rinsed and cleaned properly (e.g. with 96 % ethanol) between handling of each single fish to prevent “vitellogenin pollution” from females or induced males to uninduced males.
Поставя се чист връх на микропипетата.
Cut behind
Буферът за хомогенат се взема от бутилката с реактива и се добавя в микроепруветката от 1,5 ml, съдържаща проба черен дроб.
Cut behind dorsal fin
Буферът за хомогенат се добавя във всички микроепруветки от 1,5 ml, съдържащи проба черен дроб, в съответствие с гореописаната процедура.
For Vtg analysis
Не е необходимо да се сменя върхът на микропипетата с нов.
For gonad histology
Независимо от това, ако върхът е замърсен или се предполага, че е замърсен, той следва да бъде сменен.
The weight of the pooled head and tail from each fish is measured to the nearest mg.
Хомогенизиране на черния дроб
After being weighed, the parts are placed in appropriate tubes (e.g. 1,5 ml eppendorf) and frozen at – 80 °C until homogenisation or directly homogenised on ice with two plastic pistils.
Поставя се нов пестик за хомогенизиране в хомогенизатора за микроепруветката.
(Other methods can be used if they are performed on ice and the result is a homogenous mass).
Пестикът се въвежда в микроепруветката от 1,5 ml.
The tubes should be numbered properly so that the head and tail from the fish can be related to their respective body-section used for gonad histology.
Хомогенизаторът се държи за натиск върху черния дроб между повърхността на пестика и вътрешната стена на микроепруветката от 1,5 ml.
When a homogenous mass is achieved, 4 x the tissue weight of ice-cold homogenisation buffer is added.
Хомогенизаторът за микроепруветката се оставя да функционира в продължение на 10 до 20 секунди.
Keep working with the pistils until the mixture is homogeneous.
Микроепруветката от 1,5 ml се охлажда с натрошен лед по време на функционирането.
Important note:
Пестикът се изважда от микроепруветката от 1,5 ml и се оставя в покой в продължение на около 10 секунди.
New pistils are used for each fish.
След това се извършва визуална проверка на състоянието на суспензията.
The samples are placed on ice until centrifugation at 4 °C at 50000 × g for 30 min.
Ако в суспензията се наблюдават парченца от черен дроб, операции 3) и 4) се повтарят, за да се приготви задоволителен хомогенат.
Use a pipette to dispense portions of 20 μl supernatant into at least two tubes by dipping the tip of the pipette below the fat layer on the surface and carefully sucking up the supernatant without fat- or pellet fractions.
Суспендираният хомогенат от черен дроб се охлажда на охладителен статив с лед до центрофугирането.
The tubes are stored at – 80 °C until use.
Пестикът се сменя с нов за всеки хомогенат.
Homogenisation buffer:(50 mM Tris-HCl pH 7,4; 1 % Protease inhibitor cocktail (Sigma)):
Всички екземпляри от черен дроб се хомогенизират с буфер за хомогенат в съответствие с гореописаната процедура.
12 ml Tris-HCl pH 7,4 + 120 μl Protease inhibitor cocktail.TRIS:
Центрофугиране на суспендирания хомогенат от черен дроб
TRIS-ULTRA PURE (ICN) e.g. from Bie & Berntsen, Denmark.Protease inhibitor cocktail:
Потвърждава се температурата на охладителната центрофуга на ≤ 5 °C.
From Sigma (for mammalian tissue) Product number P 8340.Note:
Микроепруветките от 1,5 ml, съдържащи суспендирания хомогенат от черен дроб, се поставят в охладената центрофуга (коригира се балансът, ако е необходимо).
The homogenisation buffer should be used the same day as manufactured.
Суспендираният хомогенат от черен дроб се центрофугира при 13000 g за 10 минути при ≤ 5 °C.
Place on ice during use.
Ако супернатантът е разделен по подходящ начин обаче, центробежната сила и времето могат да бъдат коригирани според необходимостта.
Vitellogenin fortification samples and inter-assay reference standard
След центрофугирането се проверява дали супернатантът е разделен по подходящ начин (повърхностен слой: липиди, среден слой: супернатант, дънен слой: чернодробна тъкан).
On each day that vitellogenin assays are performed, a fortification sample made using an inter-assay reference standard will be analysed.
Ако разделянето не е достатъчно, суспензията се центрофугира отново при същите условия.
The vitellogenin used to make the inter-assay reference standard will be from a batch different from the one used to prepare calibration standards for the assay being performed.
Всички екземпляри се отстраняват от охладената центрофуга и се подреждат на охладителния статив с лед по реда на екземпляра.
The fortification sample will be made by adding a known quantity of the inter-assay standard to a sample of control male plasma.
Внимава се да не се суспендира повторно някой от разделените след центрофугирането слоеве.
The sample will be fortified to achieve a vitellogenin concentration between 10 and 100 times the expected vitellogenin concentration of control male fish.
Вземане на супернатанта
The sample of control male plasma that is fortified may be from an individual fish or may be a composite from several fish.
На статива за епруветки се поставят четири микроепруветки от 0,5 ml за съхранение на супернатанта.
A subsample of the unfortified control male plasma will be analysed in at least two duplicate wells.
От всеки супернатант (разделен като междинен слой) с микропипетата се вземат по 30 μl и се поставят в една микроепруветка от 0,5 ml.
The fortified sample also will be analysed in at least two duplicate wells.
Внимава се да не се вземе от липидите върху повърхността, или от дънния слой с чернодробната тъкан.
The mean quantity of vitellogenin in the two unfortified control male plasma samples will be added to the calculated quantity of vitellogenin added to fortification the samples to determine an expected concentration.
Супернатантът се взема и се поставя в други микроепруветки от 0,5 ml по същия начин, както е описано по-горе.
The ratio of this expected concentration to the measured concentration will be reported along with the results from each set of assays performed on that day.
Останалата част от супернатанта се взема с микропипетата (ако е осъществимо: ≥ 100 μl).
Decision flowchart for the statistical analysis
След това супернатантът се поставя в оставащата микроепруветка от 0,5 ml.
Dunnett test on nested ANOVA
Капачката на микроепруветката от 0,5 ml се затваря и върху етикета се отбелязва обемът на супернатанта.
No Yes
След това микроепруветките се охлаждат незабавно върху охладителния статив с лед.
Dunn or Mann-Whitney test on rep means
Върхът на пипетата се сменя с нов за всеки супернатант.
variance stabilising transform
Ако към върха остава прикрепено голямо количество липиди, той се сменя незабавно с нов, за да се избегне замърсяване на екстракта от черен дроб с мазнини.
>=4 reps per conc
Цялото количество центрофугиран супернатант се поставя в четири микроепруветки от 0,5 ml съгласно процедурата, описана по-горе.
<=3 reps per conc Dunn test Yes
След поставянето на супернатантата в микроепруветките от 0,5 ml, всички те се поставят на статива за епруветки с етикет за идентификация, след което се замразяват незабавно във фризера.
No Normalising transform?
Ако концентрациите на VTG се измерват непосредствено след предварителната обработка, една микроепруветка от 0,5 ml (съдържаща 30 μl супернатант) се съхранява на хладно на статива за епруветки и се прехвърля на работното място, където се провежда изпитването с ELISA.
Tamhane-Dunnett test >=4 reps per conc
В такъв случай оставащите микроепруветки се поставят на стативите за епруветки и се замразяват във фризера.
<=3 reps per conc Nested ANOVA not normal No Yes No
След вземането на супернатанта остатъкът се изхвърля по подходящ начин.
Yes variance stabilising transformation
Съхранение на пробите
Dunnett test Variances unequal
Микроепруветките от 0,5 ml, съдържащи супернатанта от хомогената от черен дроб, се съхраняват при ≤ – 70 °C до използването им за ELISA.
Variances equal
Процедура 3А:
Not monotone
Вземане на кръвна проба от опашна вена/артерия от зеброво данио
Stept-down Jonckheere or Williams' test
Непосредствено след анестезията опашното стъбло се разрязва напречно и кръвта се отстранява от опашната артерия/вена с хепаринизирана микрокапилярка за хематокрит.
Step-down trendtest on replicate means
Обемът на кръвта варира от 5 до 15 μl в зависимост от размера на рибата.
Monotone
Равен обем буфер с апротинин (6 μg/ml в PBS) се добавя към микрокапилярката и плазмата се разделя от кръвта чрез центрофугиране (5 минути при 600 g).
Tamhane-Dunnett test on nested ANOVA
Плазмата се събира в епруветките за изпитването и се съхранява при температура – 20 °C до анализа за вителогенин или за други представляващи интерес белтъци.
Dunn test on rep means
Процедура 3Б:
Dunn or Mann-Whitney test
Кръвна проба чрез сърдечна пункция при зеброво данио
Nested ANOVA normal
За да се избегне съсирването на кръвта и разграждането на белтъците, пробите се вземат във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS), съдържащ хепарин (1000 единици/ml) и протеазен инхибитор апротинин (2 TIU/ml).
Rep means normally distributed
Като съставки за буфера са препоръчителни хепарин (амониева сол) и лиофилизиран апротинин.
Step-down Jonckheere test
За вземане на кръв се препоръчва спринцовка (1 ml) с фиксирана тънка игла (напр.
Rep means normal or not homogenous
Braun Omnikan-F).
Rep means normal & homogenous
Спринцовката трябва да се запълни с буфер (около 100 μl) за пълно елуиране на малките обеми кръв от всяка риба.
Determine whether Dose-Response is monotone
Кръвните проби се вземат чрез сърдечна пункция.
C.38.
Първоначално рибата трябва да бъде анестезирана с MS-222 (100 mg/l).
THE AMPHIBIAN METAMORPHOSIS ASSAY
Правилното извършване на анестезията позволява на ползвателя да различава пулсирането на сърцето на зебровото данио.
This test method is equivalent to OECD test guideline (TG) 231 (2009).
При извършването на сърдечната пункция буталото на спринцовката се държи под слаб натиск.
The need to develop and validate an assay capable of detecting chemicals active in the thyroid system of vertebrate species originates from concerns that environmental levels of chemicals may cause adverse effects in both humans and wildlife.
Обемът на кръвната проба, който може да бъде взет, варира между 20 и 40 микролитра.
In 1998, the OECD initiated a high-priority activity to revise existing TGs and to develop new TGs for the screening and testing of potential endocrine disrupters.
След сърдечната пункция сместа от кръвта и буфера следва да бъде поставена в епруветката за изпитване.
One element of the activity was to develop a TG for the screening of chemicals active on the thyroid system of vertebrate species.
Плазмата се отделя от кръвта чрез центрофугиране (20 мин.; 5000 g) и следва да се съхранява при – 80 °C докато стане необходима за анализ.
Both an enhancement of the Repeated dose 28-day oral toxicity study in rodents (Chapter B.7 of this Annex) and the Amphibian Metamorphosis Assay (AMA) were proposed.
Процедура 3В:
The enhanced test method B.7 underwent validation and a revised test method has been issued.
СОП:
The Amphibian Metamorphosis Assay (AMA) underwent an extensive validation programme which included intra- and inter-laboratory studies demonstrating the relevance and reliability of the assay (1, 2).
Зеброво данио, хомогенизиране на главата и опашката
Subsequently, the validation of the assay was subject to peer-review by a panel of independent experts (3).
Рибите се подлагат на анестезия и евтаназия в съответствие с описанието на изпитването.
This test method is the outcome of the experience gained during the validation studies for the detection of thyroid active chemicals, and of work conducted elsewhere in OECD member countries.