natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Поставят се 47,5 μl в етикетирана тънкостенна епруветка за PCR от 0,5 ml.
The methods described here use natural seawater both as the aqueous phase and as the source of micro-organisms.
Добавят се 2,5 μl от пречистената ДНК към подходящо етикетираната епруветка.
In an endeavour to conform with the methods for ready biodegradability in freshwater, the use of ultra-filtered and centrifuged seawater was investigated, as was the use of marine sediments as inocula.
Повтаря се за всички проби и за отрицателната контрола.
These investigations were unsuccessful.
Покрива се с 2 капки минерално масло.
The test medium therefore is natural seawater pre-treated to remove coarse particles.
Като алтернатива се използва термоциклер със загрят капак.
In order to assess ultimate biodegradability with the Shake Flask Method, relatively high concentrations of the test substance have to be used because of the poor sensitivity of the dissolved organic carbon (DOC) analytical method.
Капаците се затварят.
This in turn necessitates the addition to the seawater of mineral nutrients (N and P), the low concentrations of which would otherwise limit the removal of DOC.
Пробите са били денатурирани в термоциклер Peltier PTC-225 при 94 ± 2 °C в продължение на 5 минути, последвани от 39 цикъла на 94 ± 2 °C в продължение на 1 минута, при 55 ± 2 °C в продължение на 1 минута, при 72 ± 2 °C в продължение на 1 минута, и окончателно удължаване при 72 ± 2 °C в продължение на 10 минути.
It is also necessary to add the nutrients in the Closed Bottle Method because of the concentration of the added test substance.
Приготвяне на агарозния гел (2 %):
Hence, the methods are not tests for ready biodegradability since no inoculum is added in addition to the micro-organisms already present in the seawater.
Традиционно PCR продуктите се разделят върху 20 % агарозен гел, съдържащ етидиев бромид.
Neither do the tests simulate the marine environment since nutrients are added and the concentration of test substance is very much higher than would be present in the sea.
Могат също да се използват капилярни системи за електрофореза.
For these reasons the methods are proposed under a new subsection “Biodegradability in Seawater”.
Претеглят се 2 g агароза в 100 ml 1 × TAE буфер
APPLICATION
Загрява се в микровълнова фурна (прибл.
The results of the tests, which would be applied because the pattern of use and disposal of the substance in question indicated a route to the sea, give a first impression of biodegradability in seawater.
2-3 мин.) за разтваряне на агарозата.
If the result is positive (> 70 % DOC removal; > 60 % ThOD — theoretical oxygen demand), it may be concluded that there is a potential for biodegradation in the marine environment.
Добавят се 2 капки етидиев бромид с крайна концентрация 0,5μg/ml
However, a negative result does not preclude such a potential but indicates that further study is necessary, for example, using as low a concentration of the test substance as possible.
Горещият разтвор се прехвърля в оборудване за наливане на гел.
In either case, if a more definitive value for the rate or degree of biodegradation in seawater at a particular site is required, other more complex and sophisticated, and hence more costly, methods would have to be applied.
Дава се възможност за втвърдяване на гела
For example, a simulation test could be applied using a concentration of test substance nearer to the likely environmental concentration.
Гелна електрофореза:
Also, non-fortified, non-pre-treated seawater taken from the location of interest could be used and primary biodegradation could be followed by specific chemical analysis.
Агарозният гел се прехвърля в уреда за електрофореза и се потапя в 1 × TAE буфер
For ultimate biodegradability, 14C-labelled substances would be necessary in order that the rates of the disappearance of soluble organic 14C and the production of 14CO2 at environmentally realistic concentrations could be measured.
Поставят се 20 μl от всяка проба в отделно гнездо, като се добавя маркер за молекулно тегло (100bp DNA ladder, Promega) в свободно гнездо.
CHOICE OF METHODS
Електрофорезата се провежда при 120 V за 30-45 минути.
The selection of which method to use depends on a number of factors;
Визуализиране на продуктите от амплификацията
the following Table is given to help the selection.
Ако, както е описано по-горе, в агарозния гел е бил включен етидиев бромид, продуктите от ДНК стават видими под източник на ултравиолетови лъчи.
While substances of water solubility below the equivalent of about 5 mg C/l cannot be tested in the Shake Flask Method, at least, in principle, poorly soluble substances may be tested in the Closed Bottle Method.
Като алтернатива агарозният гел се оцветяват чрез покриване на гела в разреден разтвор на етидиев бромид (0,5 μg/ml във вода) за 30 минути преди визуализацията.
Table
Допълнение 11
Advantages and disadvantages of the shake flask and closed bottle test
Насоки за процедура за изкуствено оплождане за триигла бодливка
METHOD
Целта на настоящия раздел е да се опишат процедурите за получаване на оплоден хайвер от триигла бодливка с оглед на използването му в ИРПР.
ADVANTAGES
Процедури
DISADVANTAGES
Получаване на сперма от мъжки индивиди
SHAKE FLASK
Подлага се на евтаназия добре оцветен мъжки индивид от желаната популация.
simple apparatus except C analyser
Извършва се дисекция на тестисите от всяка страна на рибата.
60 d duration is not a problem
Тестисите по принцип са силно пигментирани пръчковидни структури, които са лесно забележими на страничната линия на тялото.
no interference from nitrification
Използва се един от следните методи:
can be adapted for volatile substances
С използване на чифт тънки ножици се започва от клоаката и се прави 1-1,5 cm инцизия с едно срязване под ъгъл от около 45 градуса.
needs C analyser
Използва се скалпел за извършване на малка инцизия странично на рибата, леко задно от таза и точно вентрално на костните пластинки.
uses 5-40 mg DOC/1, could be inhibitory
Тестисите се отстраняват чрез тънки пинсети и се поставят в блюдо на Петри.
DOC determination is difficult at low concentrations in seawater (chloride effect)
Всеки тестис се покрива със 100 μl прясно приготвен краен разтвор на Hank.
DOC sometimes high in seawater
Тестисите се нарязват на фини кубчета с помощта на бръснарско ножче или скалпел.
CLOSED BOTTLE
Това освобождава сперматозоиди и придава на разтвора на Hank вид на мляко.
simple apparatus
Течността, съдържаща спермата, се добавя в епруветка, като същевременно се внимава да не се включват никакви парчета тъкан от тестиси при пипетирането.
simple end determination
Обем от 800 μl краен разтвор на Hank се добавят в епруветката и се смесват добре.
uses low concentration of test substance (2 mg/l) thus less chance of inhibition
Ако е необходимо, мъжкият екземпляр може да бъде съхранен чрез фиксиране в 100 % етанол или друг желан фиксатор.
easily adapted for volatile substances
Това е особено важно, ако при проучването се определят родителите на поколението.
could be difficult to maintain air-tightness of bottles
Въпреки че повечето от изискваните изходни разтвори могат да бъдат приготвени предварително, изходен разтвор 5 и впоследствие крайният разтвор следва да бъдат приготвени свежи в деня на употребата.
wall growth of bacteria can lead to false values
Изходен разтвор 1
blank O2 uptake values can be high especially after 28 days;
8,00 g
could be overcome by ageing the seawater
0,40 g
possible interference from O2 uptake by nitrification
Дестилирана вода (дест.в.)
SHAKE FLASK METHOD
100 ml
This method is a seawater variant of the Modified OECD Screening Test described in Chapter C.4B of this Annex (2).
Изходен разтвор 2
It was finalised as a result of a ring test organized for the European Commission (EC) by the Danish Water Quality Institute (3).
HPO4 (безводен)
In common with the accompanying marine Closed Bottle Method, the results from this test are not to be taken as indicators of ready biodegradability, but are to be used specifically for obtaining information about the biodegadability of substances in marine environments.
0,358 g
A pre-determined amount of the test substance is dissolved in the test medium to yield a concentration of 5-40 mg dissolved organic carbon (DOC)/l.
0,60 g
If the limits of sensitivity of organic carbon analyses are improved, the use of lower concentrations of test substance may be advantageous, particularly for inhibitory substances.
Изходен разтвор 3
The solution of the test substance in the test medium is incubated under agitation in the dark or in diffuse light under aerobic conditions at a fixed temperature (controlled to ± 2 °C) which will normally be within the range 15-20 °C.
0,72 g
In cases where the objective of the study is to simulate environmental situations, tests may be carried out beyond this normal temperature range.
50 ml
The recommended maximum test duration is about 60 days.
Изходен разтвор 4
Degradation is followed by DOC measurements (ultimate degradation) and, in some cases, by specific analysis (primary degradation).
MgSO4 · 7H2O
In order to know whether the test may be applied to a particular substance, some of its properties must be known.
1,23 g
The organic carbon content of the substance must be established, its volatility must be such that significant losses do not occur during the course of the test and its solubility in water should be greater than the equivalent of 25-40 mg C/l.
Изходен разтвор 5 (прясно приготвен)
Also, the test substance should not significantly adsorb onto glass surfaces.
0,35 g
Information on the purity or the relative proportions of major components of the test substance is required in order that the results obtained can be interpreted, especially when the result lies close to the “pass” level.
10 ml
Information on the toxicity of the test substance to bacteria, for example as measured in short-term respiration rate tests (4), may be useful when selecting appropriate test concentrations and may be essential for the correct interpretation of low biodegradation values.
Ако някои от горните соли са налични, но са с различно съдържание на вода (т.е., 2H2O вместо безводен), те все пак могат да се използват, но първо се коригира теглото въз основа на молекулното тегло).
However, such information is not always sufficient for interpreting results obtained in the biodegradation test and the procedure described in paragraph 18 is more suitable.
За крайния разтвор на Hank се комбинират в следния ред:
Suitable reference substances must be used to check the microbial activity of the seawater sample.
Изходен разтвор 1
Sodium benzoate, sodium acetate and aniline are examples of substances which may be used for this purpose.
1,0 ml
The reference substances must be degraded within a reasonably short time span, otherwise it is recommended that the test be repeated using another seawater sample.
Изходен разтвор 2
In the EC ring test where seawater samples were taken at different locations and at different times of the year (3), the lag phase (tL) and time to achieve 50 per cent degradation (t50), excluding the lag phase, were 1 to 4 days and 1 to 7 days respectively for sodium benzoate.
0,1 ml
For aniline the tL ranged from 0 to 10 days, whilst the t50 ranged from 1 to 10 days.
Изходен разтвор 3
REPRODUCIBILITY AND SENSITIVITY OF THE METHOD
8,6 ml
The reproducibility of the method was established in the ring test (3).
Изходен разтвор 4
The lowest concentration of test substance, for which this method can be used with DOC analysis, is largely determined by the detection limit of the organic carbon analysis (about 0,5 mg C/l, at present) and the concentration of dissolved organic carbon in the seawater used (usually of the order of 3-5 mg/l for water from the open sea).
Изходен разтвор 5
The background concentration of DOC should not exceed about 20 % of the total DOC concentration after addition of test substance.
Разбърква се добре преди използване.
If this is not feasible, the background concentration of DOC may sometimes be reduced by ageing the seawater prior to testing.
Оплождане
If the method is used with specific chemical analysis only (by which primary degradation is measured), the investigator must document, by supplying additional information, whether ultimate degradability can be expected.
В желаната популация се идентифицират едри женски екземпляри със зрял хайвер;
This additional information may consist of the results from other tests for ready or inherent biodegradability.
Женските индивиди са готови за манипулация с цел хвърляне на хайвер само когато се виждат хайверни зърна, издадени от клоаката.
Normal laboratory apparatus and:
Женските индивиди имат характерна поза „с главата нагоре“.
a.
Леко се прокарва пръст или палец от едната страна на рибата по продължение на тялото към опашката, за стимулиране на хвърлянето на хайвер в новоприготвено блюдо на Петри.
Shaking machine accommodating 0,5-2 litre Erlenmeyer flasks, either with automatic temperature control or used in a constant temperature room at 15-20 °C controlled to ± 2 °C;
Същото се повтаря от другата страна на рибата и тя се връща откъдето е взета.
b.
Хайверът може да бъде разпръснат (така, че да образува монослой) с използване на фина четка.
Narrow neck, 0,5-2 litre Erlenmeyer flasks;
Важно е да се направи опит за излагане на максимален брой хайверни зърна на спермата, поради което максималното увеличаване на площта им е от полза.
c.
Хайверът се съхранява във влажно състояние чрез поставяне на влажна тъкан около него (важно е хайверът да не докосва водата пряко, тъй като това може да доведе до преждевременно втвърдяване на хориона и да попречи на оплождането).
Membrane filtration apparatus, or centrifuge;
Съществува голямо вариране в броя на хайверните зърна, които могат да бъдат получени от всяка женска, но като средна стойност следва да бъде лесно от един единствен женски индивид със зрял хайвер да се получат около 150 хайверни зърна.
d.
сперма в смес на Hank се разпределя равномерно по цялата повърхност на хайвера с използване на четката.
Membrane filters, 0,2-0,45 μm;
Хайверните зърна бързо се втвърдяват и променят цвета си (в рамките на една минута) след започване на оплождането.
e.
Ако очакваният брой на хайверните зърна е над 150, процедурата се повтаря.
Carbon analyser;
По подобен начин, ако хайверните зърна не се втвърдяват в рамките на една минута, добавя се малко повече сперма.
f.
Добавянето на повече сперма не подобрява непременно процента на оплождане.
Equipment for specific analysis (optional).
Хайверните зърна и спермата следва да бъдат оставени да „взаимодействат“ в продължение най-малко на 15 минути и оплодените хайверни зърна следва да бъдат поставени в аквариумите за експозиция в рамките на 1,5 часа след оплождането.
Seawater
Процедурата се повтаря, като се използва друга женска, до събирането на желания брой хайверни зърна.
Collect a sample of seawater in a thoroughly cleansed container and transport to the laboratory, preferably within one or two days of collection.
Няколко хайверни зърна от последната партида се отделят и се фиксират в 10 % оцетна киселина.
During transport, do not allow the temperature of the sample to exceed significantly the temperature to be used in the test.
Преброяване и разпределяне на хайверните зърна в аквариумите за изпитване
Identify the sampling location precisely and describe it in terms of its pollutional and nutrient status.
Хайверните зърна трябва да бъдат равномерно разпределени между всяко ниво на третиране, за да се избегне отклонение в генетично отношение.
Especially for coastal waters, include in this characterization a heterotrophic microbial colony count and the determination of the concentrations of dissolved nitrate, ammonium and phosphate.
Всяка партида от оплодени хайверни зърна следва да се раздели на равни по численост групи (на брой колкото нивата на третиране) с помощта на тъп инструмент (т.е., ентомологични пинсети с широк край или с използването на примка за инокулиране).
Provide the following information for the seawater sample itself:
Ако целта е 4 повторения на третиране, с 20 хайверни зърна във всяко, трябва да се разпределят 80 хайверни зърна в аквариум за експозиция.
date of collection;
Препоръчително е да се добавят допълнителни 20 % (т.е., 96 хайверни зърна при всяко ниво на третиране), за да е сигурно, че е получено 100 % оплождане.
depth of collection;
Хайверът на бодливката е много податлив на гъбични инфекции извън пазеното от мъжкия гнездо.
appearance of sample — turbid, etc.;
Във връзка с това обработката на всички хайверни зърна с метиленово синьо през първите 5 дни на изпитването е от решаващо значение.
temperature at the time of collection;
Изходен разтвор на метиленово синьо се приготвя при 1 mg/ml и се добавя към аквариумите за експозиция, за достигане на максимална крайна концентрация от 2,125 mg/l.
salinity;
Бодливките не следва да бъдат обработвани с метиленово синьо след излюпването, така че системата следва да не съдържа метиленово синьо в ден 6.
delay between collection and use in the test.
Хайверните зърна се проверяват ежедневно и всички мъртви или неоплодени хайверни зърна се записват като такива.
If the DOC content of the seawater sample is found to be high (paragraph 8), it is recommended that the seawater be aged for about a week prior to use.
Хайверните зърна не трябва никога да бъдат извън водата до излюпването си, дори да се отнася за много кратки периоди.
Age by storing under aerobic conditions at the test temperature and in the dark or in diffuse light.
Буфериран физиологичен разтвор на Hank (HBSS):HBSS е необходим за съхраняване на спермата по време на подготовката за оплождането.
If necessary, maintain aerobic conditions by gentle aeration.
В.42 БИОРАЗГРАДИМОСТ В МОРСКА ВОДА
During ageing, the content of easily degradable organic material is reduced.
ОБЩО ВЪВЕДЕНИЕ
In the ring test (3), no difference was revealed between the degradation potential of aged and freshly collected seawater samples.
Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на насоките за изпитване на ОИСР (ТG) 306 (1992).
Prior to use, pre-treat the seawater to remove coarse particles, e.g. by filtration through a nylon filter or coarse paper filter (not membrane or GF-C filters), or by sedimentation and decanting.
Когато са разработвани първоначалните методи за изпитване, не е било известно до каква степен резултатите от скрининговите изпитвания за пълна биоразградимост с помощта на сладки води и отпадъчни води води или активирана утайка като инокулум биха могли да се прилагат за морската среда.
The procedure used must be reported.
По тази точка са били протоколирани променливи резултати (напр.
Carry out pre-treatment after ageing, if used.
(1)).
Stock solutions for mineral nutrients
Много промишлени отпадъчни води, съдържащи различни химикали, достигат морето или чрез директно изхвърляне, или чрез устията на реките и реките, в които времената на престой са малки в сравнение с периода от време, необходим за пълно биоразграждане на много от съдържащите се химикали.
Prepare the following stock solutions, using analytical grade reagents:
Поради нарастващото осъзнаване на необходимостта от защита на морската среда от увеличаващо се изхвърляне на химикали и необходимостта да се направи оценка на вероятната концентрация на химикали в морето са разработени методи за изпитване за биоразграждане в морска вода.
Potassium dihydrogen orthophosphate, KH2PO4
Описаните тук методи използват естествената морска вода както като водна фаза и като източник на микроорганизми.
8,50 g
В стремежа си да съответстват на методите за установяване на пълна биоразградимост в сладки води са били проучени използването на ултрафилтрувана морска вода, както и използването на морски седименти като инокулум.
Dipotassium hydrogen orthophosphate, K2HPO4
Тези проучвания са били неуспешни.
21,75 g
Поради това средата за изпитване е морска вода, предварително обработена с цел отстраняване на грубите частици.
Disodium hydrogen orthophosphate dihydrate, Na2HPO4·2H2O
За оценяване на крайната биоразградимост по метода „разклащане в стъкленица“ трябва да бъдат използвани относително високи концентрации на изпитваното вещество, поради слабата чувствителност на метода за анализ на разтворения органичен въглерод (DOC).
33,30 g
Това на свой ред налага добавяне към морската вода на неорганични хранителни вещества (N и P), ниските концентрации на които в противен случай биха ограничили отстраняването на DOC.
Ammonium chloride, NH4Cl
Освен това в метода на изолираните проби е необходимо да се добавят хранителни съставки поради концентрацията на добавеното изпитвано вещество.
0,50 g
Следователно методите не са изпитвания за пълна биоразградимост, тъй като не се прибавя инокулум в допълнение към микроорганизмите, които вече присъстват в морската вода.
Dissolve and make up to 1 litre with distilled water.
Също така, при изпитванията не се симулира морската среда, тъй като се добавят хранителни съставки и концентрацията на изпитваното вещество е много по-голяма от евентуалната концентрация в морето.
Calcium chloride, CaCl2
Поради тези причини методите са предложени в нов подраздел „Биоразградимост в морска вода“.
27,50 g
ПРИЛАГАНЕ
Magnesium sulphate heptahydrate, MgSO4·7H2O
Резултатите от изпитванията, които следва да се приложат поради това, че начинът на използване и извеждане от употреба на въпросното вещество е посочил насочване към морето, оставят първоначално впечатление за биоразграждане в морска вода.
22,50 g
Ако резултатът е положителен (> 70 % отстраняване на РОВ; > 60 % ThOD — теоретична потребност от кислород), може да се заключи, че е налице потенциал за биоразграждане в морска среда.
Iron (III) chloride hexahydrate, FeCl3·6H2O
Въпреки това, евентуален отрицателен резултат не изключва такъв потенциал, но показва, че е необходимо допълнително проучване, например, като се използва максимално ниска концентрация на изпитваното вещество.
0,25 g
Във всеки случай, ако се изисква по-определена стойност за скоростта или степента на биоразграждане в морска вода в съответния обект, би трябвало да се прилагат други по-комплексни и по-сложни, и следователно, по-скъпи методи.
Precipitation in solution (d) may be prevented by adding one drop of concentrated HCl or 0,4 g ethylenediaminetetra-acetic acid (EDTA, disodium salt) per litre.
Например, изпитването за симулиране може да се прилага, като се използва концентрация на изпитваното вещество, разположена по-близо до вероятната концентрация в околната среда.
If a precipitate forms in a stock solution, replace it with freshly made solution.
Също така, възможно е да се използва вода, взета от представляващото интерес място, която не е подсилена, нито предварително обработена, а може също първичното биоразграждане да бъде последвано от специфичен химичен анализ.
Preparation of test medium
За крайната биоразградимост биха били необходими белязани с 14C вещества, за да могат да бъдат измерени скоростите на отстраняване на разтворимия органичен 14C и на образуване на 14CO2 в концентрации, близки до условията на околната среда.
Add 1 ml of each of the above stock solutions per litre of pre-treated seawater.
ИЗБОР НА МЕТОДИ
Do not add a specific inoculum in addition to the micro-organisms already present in the seawater.
Изборът на метода за използване зависи от редица фактори;
Determine (optionally) the number of colony-forming heterotrophs in the seawater test medium (and preferably also in the original seawater samples) e.g. by plate count, using marine agar.
Следната таблица е дадена в помощ на избора.
This is particularly desirable for samples from coastal or polluted sites.
Веществата с разтворимост във вода под еквивалента на около 5 mg С/l не могат да се изпитват по метода на разклащането в стъкленица, но, поне по принцип, малко разтворимите вещества могат да се изпитват по метода на изолираните проби.
Check the heterotrophic microbial activity in the seawater by performing a test with a reference substance.
Таблица
Preparation of flasks
Предимства и недостатъци на изпитванията с разклащане в стъкленица и с изолирани проби
Ensure that all glassware is scrupulously clean, not necessarily sterile, (e.g. using alcoholic hydrochloric acid), rinsed and dried before use in order to avoid contamination with residues from previous tests.
МЕТОД
The flasks must also be cleaned before first use.