natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Съотношението между фиксатива и тъканта е най-малко 20:1, за да се гарантира задоволително съхранение на тъканите.
Any external or internal lesions shall be sampled and in any case samples of mid-kidney, heart, liver, pancreas, gut, gills and spleen shall be removed from individual fish using a scalpel and transferred to 8 % to 10 % (vol:vol) buffered formol saline.
За имунохистохимията се вземат проби от средната част на бъбрека и сърцето.
The ratio of fixative to tissue shall be at least 20:1 to ensure satisfactory preservation of the tissues.
От всички риби, от които са взети проби, се взема тъкан за вирусологично изследване на клетъчна култура.
For immunohistochemistry (IHC), samples from mid-kidney and heart shall be taken.
Парченца от черния дроб, предната и средната част на бъбрека, сърцето и далака се вземат от рибите с помощта на стерилен инструмент и се поставят в пластмасови епруветки, които съдържат 9 ml транспортен разтвор.
Tissues for virological examination on cell culture shall be taken from all of the fish sampled.
Тъкани, взети максимум от пет риби, могат да се поберат в една епруветка, която съдържа транспортен разтвор: те представляват обща проба.
Pieces of the liver, anterior or mid-kidney, heart and spleen shall be removed from the fish using a sterile instrument and transferred to plastic tubes containing 9 ml transport medium.
Теглото на тъканта в една проба е 1,0 ± 0,5 g.
Tissues from up to five fish may be collected in one tube containing transport solution and represent one pooled sample.
Изпращане на пробите от риби
The weight of tissue in one sample shall be 1,0 ± 0,5 g.
Цяла риба може да бъде транспортирана до лабораторията, ако могат да бъдат осигурени температурните условия по време на транспортирането, както е описано в параграф 3 от настоящата точка.
Shipment of samples from fish
Цялата риба се обвива в абсорбираща хартия и се изпраща в пластмасова торбичка, охладена, както е посочено в настоящия параграф.
Whole fish may be transported to the laboratory if the temperature requirements during transportation, as described in paragraph 3 of this point can be fulfilled.
Може да се изпраща и жива риба, но единствено под надзора на националната референтна лаборатория за болести по рибите и като се вземат под внимание допълнителните въпроси за дезинфекцията и биологичната сигурност, когато се транспортират живи риби.
Whole fish shall be wrapped in absorbent paper and shipped in a plastic bag, chilled as described in that paragraph.
Кръвните проби и епруветките, които съдържат рибните тъкани, предназначени за вирусологичното изследване или за анализ RT-PCT, се поставят в изолирани съдове, като например кутии от полистирол с дебели стени, с достатъчно количество лед или охлаждащи блокове, за да се гарантира изстудяването на пробите по време на транспортирането им до лабораторията.
Live fish may also be shipped, but only under the supervision of the National reference laboratory for fish diseases and taking into account the additional disinfection and biosecurity issues when transporting live fish.
Пълното замразяване се избягва и при получаването на пратката съдът за транспортиране все още съдържа лед, а един или няколко от тези охлаждащи блокове все още трябва да са частично или изцяло замразени при приемането.
Blood samples and tubes containing fish tissues for virological examination or RT-PCR analysis shall be placed in insulated containers, such as thick-walled polystyrene boxes, together with sufficient ice or freeze blocks to ensure chilling of the samples during transportation to the laboratory.
При изключителни обстоятелства пробите, предназначени за анализ RT-PCR, или тези, предназначени за вирусологичното изследване, могат да бъдат дълбоко замразени и транспортирани до лабораторията при – 20 °С или още по-ниска температура.
Freezing shall be avoided and ice must still be present in the transport box at receipt of the shipment or one or more of the ‘freeze blocks’ must still be partly or completely frozen.
За RT-PCR анализа на тъкани, по-късно съхранени в рибонуклеинова киселина (РНК), извличането на РНК се извършва в следните срокове в зависимост от температурата, при която се съхраняват пробите:
In exceptional circumstances, RT-PCR samples and samples for virological examination may be snap-frozen and transported to the laboratory at – 20 °C or below.
проби, съхранявани при – 20 °C: безсрочно.
For RT-PCR analysis of tissues preserved in Ribonucleic acid(RNA)later, RNA extraction shall be carried out within the following time frames depending on the temperature the samples are stored at:
Ако рибните тъкани се транспортират във фиксатив за хистологично изследване, те се изпращат в непропускливи епруветки, поставени в съдове, които издържат на удар.
samples stored at – 20 °C: indefinitely.
Замразяване на пробите обаче трябва да се избягва.
If fish tissues are transported in fixative for histological examination, they shall be shipped in leak proof tubes in impact-resistant containers.
При одобрение на лабораторията по диагностика тъкани от риби, различни от посочения в точка I.1, могат да бъдат събрани и подготвени за допълнително изследване.
Freezing of those samples shall be avoided.
Подробни диагностични методи и процедури за надзор и за потвърждение на присъствието или за отхвърляне на съмнението за ИАС
Subject to the approval of the diagnostic laboratory, fish tissues other than those referred to in point I.1 may be collected and prepared for supplementary examination.
Когато се извършва лабораторно изследване за получаване или запазване на даден здравен статус по отношение на ИАС, както е посочено в част 3, раздел I от приложение I, или за потвърждение на присъствието или за отхвърляне на съмнението за ИАС в съответствие с член 57, буква б) от Директива 2006/88/ЕО, като се използват диагностичните методи, посочени в част 3, раздел II от приложение I, се прилагат подробните методи и процедури, посочени в следните точки II.1 — II.
Detailed diagnostic methods and procedures for the surveillance and for the confirmation of the presence of or to rule out the suspicion of ISA
5.
When laboratory examination for the purpose of obtaining or maintaining a certain health status with regard to ISA as set out in Section I of Part 3 of Annex I, or for the purpose of the confirmation of the presence of or to rule out a suspicion of ISA in accordance with Article 57(b) of Directive 2006/88/EC, are carried out, using the diagnostic methods set out in Section II of Part 3 of Annex I, the detailed methods and procedures set out in the following points II.1 to II.5 shall apply.
Изследване на пробите с помощта на RT-PCR
Examination of samples by RT-PCR
Диагностичният метод, който се използва за проверка за вируса на ИАС, е RT-qPCR.
The diagnostic method to be used for the screening for ISAV shall be RT-qPCR.
Тъй като резултатите от RT-qPCR могат да се променят в зависимост от условията, при които се получават, за да се избегнат съмнения се включват съответните положителни и отрицателни контроли и ампликони.
As the results of the RT-qPCR can vary depending on the conditions under which it is performed, adequate positive and negative controls and amplicons shall be included to avoid any doubts.
Извличане на РНК
Total RNA extraction
Цялата РНК се извлича с помощта на метода фенол-хлороформ или с помощта на спин колонки за извличане на РНК в съответствие с инструкциите на производителя.
Total RNA shall be extracted using the phenol-chloroform method or RNA affinity spin columns, according to the manufacturer's instructions.
Пречистената РНК се поставя отново в суспензия в дестилирана вода без RNase (а именно вода, обработена с 0,1 % диетил пирокарбонат).
Purified RNA shall be re-suspended in distilled RNase-free water (namely water treated with 0,1 % diethyl pyrocarbonate).
Концентрацията и чистотата на извлечената РНК се оценява, като се измерва оптичната плътност при 260 nm и при 280 nm.
The concentration and purity of the extracted RNA shall be estimated by measuring the optical density at 260 nm and at 280 nm.
Друга възможност може да бъде включването на вътрешните контроли, насочени срещу вирусния геном, както е посочено в точка II.1.3.
An alternative approach may be to include internal controls targeted against the virus genome as referred to in point II.1.3.
RT-PCR за откриване на вируса на ИАС
RT-PCR for ISAV detection
Няколко RT-PCR метода могат да бъдат използвани за амплификация на генома на вируса на ИАС.
Several RT-PCR methods may be used for ISAV genome amplification.
Може да се извърши двустепенен RT-PCR, при който етапите с реакциите на RT и PCR се извършват в две отделни епруветки.
A two-step RT-PCR may be performed whereby the RT and the PCR reactions steps are run in two separate tubes.
Може обаче да се извърши също така едностепенна реакция, при която двете реакции се извършват в една епруветка.
However, a one-step reaction, where the two reactions are run in one tube, may also be performed.
Едностепенният метод се използва, когато е възможно, като анализът с една епруветка свежда до минимум риска от кръстосано замърсяване, тъй като не е необходимо да се прехвърля съдържание и чувствителността по този метод се счита за равна с тази по двустепенния метод.
The one-step method shall be used where possible, as the one tube assay minimises the risk of cross-contamination as no transfer of content have to be made and it is regarded to be as sensitive as the two-step method.
Използват се праймерите и анализът, описани в тази точка, а именно двойката праймери ILA1 или ILA2, насочени към сегмент 8 и за които е установено, че са подходящи за откриването на вируса на ИАС при огнища и при риби носители на вируса.
The primers and assay described in this point, namely the ILA1 or ILA2 primer pair that target segment 8 and which have been found suitable for detection of ISAV in outbreaks and in carrier fish, shall be used.
Обратният праймер ILA 2 не съответства на изолати от Северна Америка и в тези случаи се използва друга двойка праймери.
The ILA2 reverse primer does not match isolates from North America and an alternative primer set shall be used in those cases.
Прав праймер (ILA1): 5′-GGCTATCTACCATGAACGAATC-3′;
Forward primer (ILA1): 5′-GGCTATCTACCATGAACGAATC-3′;
Обратен праймер (ILA2): 5′-GCCAAGTGTAAGTAGCACTCC-3.′
Reverse primer (ILA2): 5′-GCCAAGTGTAAGTAGCACTCC-3′.
Условия на циклите: един цикъл при 50 °C в продължение на 30 минути, 1 цикъл при 94 °С в продължение на 15 минути, 40 цикъла при 94 °C в продължение на 30 секунди, 55 °C в продължение на 30 секунди, 72 °C в продължение на 60 секунди; един цикъл при 72 °C в продължение на 5 минути.
Cycling conditions: one cycle of 50 °C for 30 minutes, 1 cycle of 94 °C for 15 minutes, 40 cycles of 94 °C for 30 seconds, 55 °C for 30 seconds, 72 °C for 60 seconds; one cycle of 72 °C for 5 min.
Вместо това обаче могат да бъдат използвани и други варианти на RT-PCR с доказана сходна ефективност.
Product size 155 bp.
RT-qPCR за откриване на вируса на ИАС
However, other RT-PCR versions of proven similar efficacy may be used instead.
Използването на RT-qPCR може да увеличи специфичността, а вероятно и чувствителността.
RT-qPCR for ISAV detection
Методът може да се осъществи по-бързо, тъй като не се изисква етап с гел електрофореза и се намалява рискът от кръстосано замърсяване, тъй като е възможно да се направи оценка на количеството вирусни геномни РНК в епруветката с пробата.
The use of RT-qPCR may increase specificity and probably also sensitivity.
Недостатък на анализа с RT-qPCR е, че често не е възможно да се секвенират амплифицираните продукти.
The method can be performed more rapidly as no gel electrophoresis step is required and it reduces the risk of cross contamination as it is possible to estimate the amount of viral genomic RNA within the sample tube.
Ако обаче има съмнение относно спецификата на амплифицирания продукт, трябва да се проведе друг специфичен анализ на вируса на ИАС, за да се провери резултатът.
A drawback of the RT-qPCR assay is that it is often not possible to sequence amplified products.
Използва се анализът, описан в настоящата точка, който е анализ, който е насочен към сегмент 8.
However, if there is doubt on the specificity of the amplified product, another ISAV specific assay must be run to verify the result.
Този анализ обхваща изолати от Европейския съюз, Европейската асоциация за свободна търговия и Северна Америка.
The assay described in this point, which is an assay that target segment 8, shall be used.
Където е възможно, се използва едностепенният метод на етап, тъй като анализът с една епруветка свежда до минимум риска от кръстосано замърсяване.
This assay shall cover isolates from the European Union, the European Free Trade Association and North America.
Прав праймер: 5′- CTACACAGCAGGATGCAGATGT -3′;
The one-step method shall be used where possible, because the one tube assay minimises the risk of cross-contamination.
Обратен праймер: 5′- CAGGATGCCGGAAGTCGAT -3′;
Forward primer: 5′- CTACACAGCAGGATGCAGATGT -3′;
и сонда: 5′-FAM- CATCGTCGCTGCAGTTC — MGBNFQ-3′.
Reverse primer: 5′- CAGGATGCCGGAAGTCGAT -3′;
Условия на циклите: един цикъл при 50 °C в продължение на 30 минути, един цикъл при 95 °С в продължение на 15 минути, 40 цикъла при 94 °C в продължение на 15 секунди, 60 °C в продължение на 60 секунди; при необходимост се адаптира.
and probe: 5′-FAM- CATCGTCGCTGCAGTTC – MGBNFQ-3′.
Секвениране на амплифицирани PCR продукти
Cycling conditions: one cycle of 50 °C for 30 minutes, one cycle of 95 °C for 15 minutes, 40 cycles of 94 °C for 15 seconds, 60 °C for 60 seconds; it shall be adjusted if necessary.
Прав праймер (ILAs6-3F): 5′-ATGAGGGAGGTAGCATTGCA -3′;
Sequencing of amplified PCR products
Обратен праймер (ILAs6-2R): 5′-CATGCTTTCCAACCTGCTAGGA -3′.
Forward primer (ILAs6-3F): 5′-ATGAGGGAGGTAGCATTGCA -3′;
Условия на циклите (едностепенен RT-PCR): един цикъл при 50 °C в продължение на 30 минути, един цикъл при 94 °С в продължение на 15 минути, 40 цикъла при 94 °C в продължение на 30 секунди, 55 °C в продължение на 30 секунди, 72 °C в продължение на 60 секунди, един цикъл при 72 °C в продължение на 5 минути; при необходимост се адаптира.
Reverse primer (ILAs6-2R): 5′-CATGCTTTCCAACCTGCTAGGA -3′.
В противен случай може да се използва следният метод за секвениране на HPR в сегмент 6:
Cycling conditions (One-step RT-PCR): one cycle of 50 °C for 30 minutes, one cycle of 94 °C for 15 minutes, 40 cycles of 94 °C for 30 seconds, 55 °C for 30 seconds, 72 °C for 60 seconds, one cycle of 72 °C for 5 minutes; it shall be adjusted if necessary.
Прав праймер: 5′-GAC-CAG-ACA-AGC-TTA-GGT-AAC-ACA-GA-3′;
Alternatively, the following method for sequencing HPR in segment 6 may be used:
Обратен праймер: 5′-GAT-GGT-GGA-ATT-CTA-CCT-CTA-GAC-TTG-TA-3′;.
Forward primer: 5′-GAC-CAG-ACA-AGC-TTA-GGT-AAC-ACA-GA-3′;
Размер на продукта: 304 nt, ако HPR0.
Reverse primer: 5′-GAT-GGT-GGA-ATT-CTA-CCT-CTA-GAC-TTG-TA-3′;
Могат също така да бъдат използвани анализи RT-PCR със сходна чувствителност и особености като на анализите, описани в настоящата точка.
Product size: 304 nt if HPR0.
Чистотата на амплифицирания RT-PCR продукт се проверява чрез гел електрофореза преди секвениране.
RT-PCR assays with similar sensitivities and specificities to the assays described in this point may also be used.
Ако се появи само един чист фрагмент, той се пречиства директно от реакцията PCR.
The purity of the amplified RT-PCR product shall be checked by gel electrophoresis before sequencing.
Ако са налице множество амплифицирани фрагменти, фрагментът, който представлява интерес, се пречиства чрез гел електрофореза.
If only one pure fragment appears, it shall be purified directly from the PCR reaction.
Пречистването на PCR фрагментите от разтвори или агарозни гелове се прави, като се използват спин колонки за извличане с PCR фрагменти в съответствие с инструкциите на производителя.
If multiple amplified fragments are present, the fragment of interest shall be purified by gel electrophoresis.
Секвенирането се извършва, като се използват праймери за амплификация във външни специализирани дружества за секвениране.
The purification of PCR fragments from solutions or agarose gels shall be made using PCR fragment affinity spin columns, according to the manufacturer's instructions.
Резултатите се анализират посредством инструмента за търсене BLAST, като секвенциите се съпоставят с други известни секвенции в нуклеотидна база данни на Националния център за биотехническа информация (NCBI) на САЩ.
Sequencing shall be performed using amplification primers at external specialised sequencing companies.
Секвенирането трябва да премахне всички съмнения относно спецификата на амплифицирания RT-PCR продукт.
The results shall be analysed with the search tool BLAST and the sequences shall be compared with other known sequences in the US National Centre for Biotechnical Information (NCBI) nucleotide database.
Изолиране на вируса на ИАС в клетъчните култури
Sequencing must eliminate any doubt on the specificity of an amplified RT-PCR product.
Подготовка на пробите
ISAV isolation on cell cultures
Тъканите могат да бъдат съхранявани при – 80 °С.
Preparation of samples
Тъканите се замразяват и размразяват само веднъж преди тяхното изследване.
The tissue may be kept at – 80 °C.
За целите на надзора и контрола изследването се извършва възможно най-бързо.
The tissue shall only be frozen and thawed once before examination.
Всяка проба (смес от тъкани в транспортен разтвор) се хомогенизира напълно с помощта на одобрен хомогенизатор и се центрофугира при 2000 до 4000 × g в продължение на 15 минути при температура от 0 до 6 °С, а супернатантът се филтрира (0,45 μm) и се инкубира с обем, равен на избрана смес, разредена с антисеруми срещу местни серотипове на вируса на ИПН.
For surveillance and control purposes, the examination shall be undertaken as fast as possible.
Титърът на антисерума трябва да бъде най-малко 1:2000 в 50 % неутрализационен тест за утайка.
Each sample (tissue pool in transport solution) shall be completely homogenised using a validated homogeniser, centrifuged at 2000 to 4000 × g for 15 minutes at 0 to 6 °C, and the supernatant shall be filtered (0,45 μm) and incubated with an equal volume of a suitably diluted pool of antisera to the indigenous serotypes of IPNV.
Сместа се инкубира в продължение на един час при 15 °С.
The titre of the antiserum must be at least 1:2000 in a 50 % plaque neutralisation test.
Това представлява инокулума.
The mixture shall be incubated for one hour at 15 °C.
Третирането на всички инокулуми с антисерум за инфекциозната панкреатична некроза (вирус, който в някои части в Европа присъства в 50 % от пробите от риби) цели да се възпрепятства появата в инокулирани клетъчни култури на цитопатичен ефект (ЕСР) вследствие вируса на инфекциозна панкреатична некроза (ИПН).
This shall represent the inoculum.
Такова третиране може да се извърши, за да се намали времето за вирусологичните изследвания, както и броят на случаите, при които появата на цитопатичен ефект ще трябва да се разглежда като потенциална индикация за вируса на ИАС.
Treatment of all inocula with antiserum to Infectious pancreatic necrosis virus (a virus which in some parts of the Europe occurs in 50 % of fish samples) aims at preventing cytopatic effect (CPE) due to IPN virus from developing in inoculated cell cultures.
Когато пробите произхождат от производствени единици, считани за свободни от ИПН, третирането на инокулумите с антисерум за вируса на ИПН не е необходимо.
To reduce the duration of the virological examinations as well as the number of cases in which occurrence of CPE would have to be considered potentially indicative of ISAV, such treatment may be carried out.
Инокулация на клетъчните култури
When samples come from production units which are considered free from IPN, the treatment of inocula with antiserum to IPN virus may be omitted.
Клетки от бъбрек на атлантическа сьомга се използват за първоначалното изолиране на вируса на ИАС.
Inoculation on cell cultures
Могат да се използват други клетъчни линии с доказана ефикасност и чувствителност за изолиране на вируса на ИАС, като се има предвид изменчивостта на щама и способността на различните щамове да се възпроизвеждат в различни клетъчни линии.
Atlantic salmon kidney (ASK) cells shall be used for primary ISAV isolation.
Клетките от бъбрек на атлантическа сьомга изглежда подкрепят изолирането и растежа на известните до този момент изолати на вируса, стига да се използва ниско ниво на пасаж.
Other cell lines of proven efficacy and sensitivity in isolating ISAV may be used, taking into consideration strain variability and the ability of different strains to replicate in different cell lines.
В клетките от бъбрек на атлантическа сьомга може да се наблюдава по-изразен цитопатичен ефект, отколкото в други възприемчиви клетъчни линии като SHK-1 (предна част на бъбрек — 1).
The ASK cells seem to support isolation and growth of the hitherto known virus isolates, as long as a low passage level is used.
Клетки от бъбрек на атлантическа сьомга (пасаж 65 или по-малко) се култивират в среда L-15, която съдържа 10 % серум от говежди фетус, 2 % (обем/обем) 200 mM на L-глутамин и 0,08 % (обем/обем) 50 mM 2-меркаптоетанол с 50 mM върху плаки с множество клетъчни гнезда.
A more distinct cytopathic effect (CPE) may appear in ASK cells than in other susceptible cell lines like SHK-1 (Salmon head kidney-1).
Инокулира се суспензия от органи, обработени с антисерум, в млади клетъчни култури във фаза на активен растеж, за да се получи крайно разреждане на тъкания материал в среда от култура със съотношение 1:1000.
ASK (pass 65 or lower) cells shall be grown in L-15 medium containing 10 % foetal bovine serum, 2 % (vol:vol) 200 mM L-glutamine, and 0,08 % (vol:vol) 50 mM 2-mercaptoethanol in multi-well plates.
За всеки орган се прибавя суспензия 40 μL инокулум към клетъчно гнездо, което съдържа 2 ml среда от култура.
Antiserum-treated organ suspension shall be inoculated into young actively growing cell cultures to give a final dilution of tissue material to culture medium of 1:1000.
За да се намали рискът от кръстосано замърсяване, се използват отделни плаки с 12 или 24 клетъчни гнезда за пробите с произход от различни рибовъдни стопанства.
For each organ, suspension 40 μl of inoculum shall be added to one well containing 2 ml of culture medium.
Една неинокулирана плака се оставя неинокулирана, за да служи за отрицателен контрол.
To minimise the risk of cross-contamination, separate 12- or 24-well plates shall be used for samples from different fish farm sites.
Отделна плака се инокулира с референтен изолат от вируса на ИАС, за да служи за положителен контрол, както следва.
One plate shall be left uninoculated to serve as a negative control.
Сто μl от основния препарат от вируса на ИАС (минимален титър 107 заразена доза тъканна култура на 50 % крайна точка (TCID50 ml– 1)) се инокулира в първото клетъчно гнездо и се смесва.
A separate plate shall be inoculated with a reference isolate of ISAV as a positive control, as follows.
Количество от този материал се пренася от първото клетъчно гнездо във второто, за да се получи разреждане 1:10, и се смесва.
One hundred μl of a stock preparation of ISAV (minimum titre 107 Tissue culture infective dose at the 50 % end point (TCID50 ml– 1)) shall be inoculated into the first well and mixed.
Това се повтаря по цялата плака, за да се получат шест разреждания 1:10.
A volume of this material shall be transferred from the first well to the second well to make a 1:10 dilution and mixed.
Основният препарат от вируса на ИАС може да бъде съхраняван при температура – 80 °С за най-малко две години, но веднъж размразен, трябва да се използва в рамките на три дни.
This shall be repeated across the plate to make six 10-fold dilutions.
Внимава се да се възпрепятства кръстосаното замърсяване на пластинките за теста с положителния контролен материал.
Stock ISAV may be stored at – 80 °C for at least 2 years but once thawed must be used within 3 days.
За да се избегне тази опасност, пластинките за положителен контрол се установяват и обработват отделно от пластинките за теста.
Care shall be taken to prevent cross-contamination of test plates with positive control material.