natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Приложение IV към Директива 2009/156/ЕО следва да бъде съответно изменено посредством заличаване на теста конкурентна ELISA и посредством актуализиране на процедурите за тестовете индиректна ELISA и блокадна ELISA в съответствие с глава 2.5.1. от Ръководството за диагностични тестове и ваксини за сухоземни животни на OIE, издание 2016 г., въз основа на изданието, прието от Световната асамблея на делегатите на OIE през май 2012 г.
Annex IV to Directive 2009/156/EC should be therefore amended by deletion of the competitive ELISA test and by an updating the procedures for the indirect and blocking ELISA tests in accordance with Chapter 2.5.1. of the Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals of the OIE, Edition 2016 based on the Version adopted by the World Assembly of Delegates of the OIE in May 2012 [7].
[7].
At the same time, real-time RT-PCR procedures as described by Agüero et al.
Същевременно процедурите за RT-PCR в реално време, описани от Agüero et al.
as well as by Guthrie et al.
, както и от Guthrie et al.
should be included in that Annex to make those agent identification tests available for the purpose of pre-movement testing.
, следва да бъдат включени в посоченото приложение, за да може тестовете за идентификация на агента да бъдат на разположение за целите на изследванията преди движението на животните.
Directive 2009/156/EC should therefore be amended accordingly.
Поради това Директива 2009/156/ЕО следва да бъде съответно изменена.
The measures provided for in this Decision are in accordance with the opinion of the Standing Committee on Plants, Animals, Food and Feed,
Член 1
Annex IV to Directive 2009/156/EC is replaced by the text set out in the Annex to this Decision.
Приложение IV към Директива 2009/156/ЕО се заменя с текста в приложението към настоящата директива.
Article 2
Адресати на настоящото решение са държавите членки.
Done at Brussels, 14 October 2016.
Съставено в Брюксел на 14 октомври 2016 година.
For the Commission
ОВ L 192, 23.7.2010 г., стр. 1.
Council Directive 92/35/EEC of 29 April 1992 laying down control rules and measures to combat African horse sickness (OJ L 157, 10.6.1992, p. 19).
Директива 92/35/ЕИО на Съвета от 29 април 1992 г. за определяне на правила за контрол и мерките за борба с болестта африканска чума по конете (ОВ L 157, 10.6.1992 г., стр. 19).
Invest., 20, 325-328.
Invest., 20, 325–328.
Journal of Virological Methods.
Journal of Virological Methods (Бюлетин за вирусологичните методи).
2013;189(1):30-35.
2013;189(1):30—35.
http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahc/current/chapitre_ahs.pdf
http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahc/current/chapitre_ahs.pdf.
See footnote 2.
Вж. бележка под линия 2.
ANNEX
ПРИЛОЖЕНИЕ
‘ANNEX IV
„ПРИЛОЖЕНИЕ IV
AFRICAN HORSE SICKNESS
АФРИКАНСКА ЧУМА ПО КОНЕТЕ
DIAGNOSIS
ДИАГНОЗА
PART A
ЧАСТ A
Serological tests
Серологични тестове
The serological method described hereinafter are enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) based on point 2 of Section B in Chapter 2.5.1 of the Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, Edition 2016 as adopted by the World Assembly of Delegates of the OIE in May 2012.
Серологичният метод, описан по-долу, е ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) и се основава на глава 2.5.1, раздел В, точка 2 от Ръководството за диагностични тестове и ваксини за сухоземни животни, издание 2016 г., прието от Световната асамблея на делегатите на OIE през май 2012 г.
The VP7 viral protein is an immuno-dominant major antigen of the African horse sickness virus (AHSV) and is conserved across the nine AHSV serotypes.
Вирусният протеин VP7 е имунодоминантен основен антиген на вируса на африканската чума по конете (АЧК) и присъства в деветте серотипа на вируса на АЧК.
Recombinant AHSV-VP7 proteins have been shown to be stable and innocuous and suitable to be used as antigens in ELISA procedures for determination of AHSV antibodies with a high degree of sensitivity and specificity (Laviada et al., 1992b [1]; Maree and Paweska, 2005).
Рекомбинантните протеини на вируса на АЧК и VP7 са се доказали като стабилни и безвредни и са подходящи за използване като антигени в процедурите ELISA за определяне на антителата на вируса на АЧК с висока степен на чувствителност и специфичност (Laviada et al., 1992b [1]; Maree and Paweska, 2005).
The indirect ELISA and the blocking ELISA are the two AHS-VP7 ELISA tests suitable for serological diagnosis of African horse sickness (AHS).
Тестовете индиректна ELISA и блокадна ELISA са двата теста ELISA за АЧК-VP7, подходящи за серологично диагностициране на африканската чума по конете.
Indirect ELISA for the detection of antibodies to African horse sickness virus (AHSV)
Тест индиректна ELISA за откриване на антитела на вируса на африканската чума по конете (АЧК)
The conjugate used in this method is a horseradish peroxidase anti-horse gamma-globulin reacting with the serum of horses, mules and donkeys.
Конюгатът, използван в този метод, е пероксидаза от хрян, антиконски гама-глобулин, който реагира със серума от коне, мулета и магарета.
The method described by Maree & Paweska (2005) [2] uses protein G as conjugate that also reacts with zebra serum.
За метода, описан от Maree & Paweska (2005) [2], се използва протеин G като конюгат, който също реагира със серум от зебра.
The antigen may be provided by the Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA), Spain, within 4 to 6 months of request.
Антигенът може да бъде предоставен от центъра за изследване на животните Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA), Испания, в срок от 4 до 6 месеца от искането.
Test procedure
Тестова процедура
Solid phase
Твърда фаза
Coat ELISA plates with recombinant AHSV-4 VP7 diluted in carbonate/bicarbonate buffer, pH 9,6.
Натоварете плаките ELISA с рекомбиниран вирус на АЧК-4 VP7, разреден в карбонатно-бикарбонатен буфер с pH 9,6.
Incubate plates overnight at 4 °C.
Инкубирайте плаките в продължение на една нощ при 4 °C.
Wash the plates five times with distilled water containing 0,01 % (v/v) Tween 20 (washing solution).
Промийте петкратно плаките с дестилирана вода, съдържаща 0,01 % (v/v) Tween 20 (измиващ разтвор).
Gently tap the plates onto absorbent material to remove any residual wash.
Внимателно оставете плаките върху абсорбиращ материал, за да премахнете остатъчен измиващ разтвор.
Block the plates with phosphate buffered saline (PBS) pH 7,2 + 5 % (w/v) skimmed milk (Nestlé Dry Skim MilkTM), 200 μl/well, for 1 hour at 37 °C.
Накапете плаките с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) с pH 7,2 + 5 % (w/v) обезмаслено мляко (обезмаслено сухо мляко Nestlé Dry Skim MilkTM), 200 μl/ямка за 1 час при 37 °C.
Remove the blocking solution and gently tap the plates onto absorbent material.
Отстранете блокиращия разтвор и подсушете внимателно плаките с абсорбиращ материал.
Test samples
Тестови проби
Serum samples to be tested, and positive and negative control sera, are diluted 1 in 25 in PBS + 5 % (w/v) skimmed milk + 0,05 % (v/v) Tween 20, 100 μl per well.
Серумните проби за тестване, положителните и отрицателните контролни серуми се разреждат 1 към 25 във фосфатно буфериран физиологичен разтвор + 5 % (w/v) обезмаслено мляко + 0,05 % (v/v) Tween 20, 100 μl за ямка.
Incubate for 1 hour at 37 °C.
Инкубирайте в продължение на 1 час при температура 37 °C.
For titration, make a twofold dilution series from 1 in 25 (100 μl/well), one serum per plate column, and do the same with positive and negative controls.
За титруване направете двойна серия разреждане от 1 към 25 (100 μl/ямка), един серум на колонка от плаки, и направете същото с положителните и с отрицателните контроли.
Conjugate
Конюгат
Dispense 100 μl/well of horseradish-peroxidase (HRP) -conjugated anti-horse gamma-globulin diluted in PBS + 5 % milk + 0,05 % Tween 20, pH 7,2.
Смесете 100 μl/ямка от пероксидаза от хрян — смесена с антиконски гама-глобулин, разреден във фосфатно буфериран физиологичен разтвор + 5 % мляко + 0,05 % Tween 20 с pH 7,2.
Chromogen/Substrate
Хромоген/Субстрат
Add 200 μl/well of chromogen/substrate solution (10 ml of 80,6 mM DMAB (dimethyl aminobenzaldehyde) + 10 ml of 1,56 mM MBTH (3-methyl-2-benzo-thiazoline hydrazone hydrochlorid) + 5 μl H2O2).
Добавете 200 μl/ямка от разтвор хромоген/субстрат (10 ml от 80,6 mM DMAB (диметил аминобензалдехид) + 10 ml от 1,56 mM MBTH (3-метил-2-бензо-тиазолин хидразон хидрохлорид) + 5 μl H2O2).
Colour development is stopped by adding 50 μl of 3N H2SO4 after approximately 5 to 10 minutes (before the negative control begins to be coloured).
Цветната реакция се спира чрез прибавяне на 50 μl 3N H2SO4 след около 5—10 минути (преди отрицателната контрола да започне да се оцветява).
Other chromogens such as ABTS (2,2′-Azino-bis-[3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid]), TMB (tetramethyl benzidine), or OPD (ortho-phenyldiamine) can also be used.
Други хромогени като ABTS (2,2′-Азино-бис-[3-етилбензоатиазолин-6-сулфонова киселина]), TMB (тетраметил бензидин) или OPD (орто-фетилдиамин) могат също да се използват.
Read the plates at 600 nm (or 620 nm).
Отчетете плаките при 600 nm (или 620 nm).
Interpretation of the results
Разчитане на резултатите
Calculate the cut-off value by adding 0,06 to the value of the negative control (0,06 is the standard deviation derived with a group of 30 negative sera).
Изчислете праговата стойност чрез добавяне на 0,06 към стойността на отрицателната контрола (0,06 е стандартното отклонение, получено от група от 30 отрицателни серума).
Test samples giving absorbance values lower than the cut-off are regarded as negative.
Тестови проби, даващи стойности на поглъщане под праговата стойност, се считат за отрицателни.
Test samples giving absorbance values greater than the cut-off + 0,15 are regarded as positive.
Тестови проби, даващи стойности на поглъщане над праговата стойност + 0,15 се считат за положителни.
Test samples giving intermediate absorbance values are considered to be inconclusive and a second technique must be employed to confirm the result.
Тестови проби, даващи усреднени стойности на поглъщане, се считат за недостатъчни за формулиране на заключение и трябва да се приложи втора техника за потвърждаване на резултата.
Blocking ELISA for the detection of antibodies to African horse sickness virus (AHSV)
Тест блокадна ELISA за откриване на антитела на вируса на африканската чума по конете (АЧК)
The competitive blocking ELISA is designed to detect specific AHSV antibodies in sera from animals of any equine species, i.e. horses, donkeys, zebra and their crosses, preventing the problem of specificity experienced occasionally using the indirect ELISAs.
Тестът конкурентна блокадна ELISA е предназначен за откриване на специфични антитела на вируса на АЧК в серум от еднокопитни животни, т. е. коне, магарета, зебри и техните кръстоски, като се избягва проблемът със специфичността, който понякога възниква при използването на тестовете индиректна ELISA.
The principle of the test is the blocking of the reaction between the recombinant VP7 protein absorbed to the ELISA plate and a conjugated AHS-VP7 specific monoclonal antibody (Mab).
Принципът на теста е блокиране на реакцията между рекомбинантния протеин VP7, погълнат в плаката на ELISA, и конюгираното моноклонално антитяло, специфично за АЧК-VP7 (Mab).
Antibody in the test sera will block the reaction between the antigen and the Mab resulting in a reduction in colour.
Антителата в тестовия серум ще блокират взаимодействието между антигена и Mab, в резултат на което ще се намали оцветяването.
Because the Mab is directed against the VP7, the assay will give a high level of sensitivity and specificity.
Поради това, че Маb също е насочено срещу VP7, анализът ще даде висока степен на чувствителност и определеност.
The competitive blocking ELISA is commercially available.
Тестът конкурентна блокадна ELISA се предлага в търговската мрежа.
Solid Phase
Твърда фаза
Coat ELISA plates with 50-100 ng of recombinant AHSV-4 VP7 diluted in carbonate/bicarbonate buffer, pH 9,6.
Плаките ELISA се покриват с 50-100 ng рекомбинант AHSV-4 VP7, разреден с карбонатен/бикарбонатен буфер, pH 9,6.
Incubate overnight at 4 °C.
Инкубирайте плаките за една нощ при 4 °C.
Wash the plates three times with phosphate buffered saline (PBS) 0,1× containing 0,135 M NaCl and 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST).
Измийте плаките три пъти с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) 0,1x, съдържащ 0,135 M NaCl и 0,05 % (v/v) Tween 20.
Gently tap the plates on to absorbent material to remove any residual wash.
Внимателно оставете плаките върху абсорбиращ материал, за да премахнете остатъчен измиващ разтвор.
Test samples and controls
Тестови проби и контроли
Serum samples to be tested, and positive and negative control sera, are diluted 1 in 5 in diluent containing 0,35 M NaCl, 0,05 % (v/v) Tween 20 and 0,1 % Kathon, 100 μl per well.
Серумните проби за тестване, положителните и отрицателните контролни серуми се разреждат 1 към 5 в разредител, съдържащ 0,35 M NaCl, 0,05 % (v/v) Tween 20 и 0,1 % Kathon, 100 μl за ямка.
For titration, make a twofold dilution series of the test sera from 1 in 10 to 1 in 280 across 8 wells (100 μl/well), one serum per plate column, and do the same with positive and negative controls.
За титруване направете двойна серия разреждане на тестовите серуми от 1 към 10 до 1 към 280 в 8 ямки (100 μl/ямка), един серум на колонка от плаки, и направете същото с положителните и с отрицателните контроли.
Incubate for 1 hour at 37 °C.
Инкубирайте в продължение на 1 час при температура 37 °C.
Wash the plates five times with phosphate buffered saline (PBS) 0,1× containing 0,135 M NaCl and 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST).
Измийте плаките пет пъти с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) 0,1×, съдържащ 0,135 M NaCl и 0,05 % (v/v) Tween 20.
Dispense 100 μl/well of horseradish peroxidase-conjugated Mab anti-VP7.
Смесете 100 μl/ямка от пероксидаза от хрян — конюгиран Mab анти-VP7.
In advance, this Mab has been diluted 1/5000-1/15000 in a 1/1 solution of StabiliZyme Select® Stabilizer (SurModics.
Преди това този Mab е бил разреден 1/5000–1/15000 в 1/1 разтвор на StabiliZyme Select® Stabilizer (SurModics.
Reference: SZ03) in distilled water.
Reference: SZ03) в дестилирана вода.
Incubate for 30 minutes at 37 °C.
Инкубирайте 30 минути при температура 37 °C.
Add 100 μl/well chromogen/substrate solution, i.e. 1 ml of ABTS (2,2′-Azino-bis-[3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid]) 5 mg/ml + 9 ml of substrate buffer (0,1 M Phosphate-Citrate buffer of pH 4 containing 0,03 % H2O2), and incubate for 10 minutes at room temperature.
Добавете 100 μl/ямка разтвор хромоген/субстрат, т.е.
Colour development is stopped by adding 100 μl/well of 2 % (w/v) SDS (sodium dodecyl sulphate).
1 ml ABTS (2,2′-Азино-бис-[3-етилбензотиазолин-6-сулфонова киселина]) 5 mg/ml + 9 ml субстратен буфер (0,1 М фосфатно-цитратен буфер pH 4, съдържащ 0,03 % H2O2) и инкубирайте 10 минути при стайна температура.
Reading
Оцветяването се спира с добавяне 100 μl/ямка на 2 % (w/v) натриев додецил сулфат.
Read at 405 nm in an ELISA reader.
Отчитане
Determine the blocking percentage (BP) of each sample by applying the following formula, where “Abs” stands for antibodies:
Отчетете при 405 nm в четец на ELISA.
Abscontrol
Определете процента на блокиране (BP) на всяка проба, като прилагате следната формула, в която съкращението Abs означава антитела:
Abssample
Absконтрол
Samples showing a BP value higher than 50 % should be considered as positive for AHSV antibodies.
Absпроба
Samples showing a BP value lower than 45 % should be considered as negative for AHSV antibodies.
Проби, чиято BP стойност е по-висока от 50 %, следва да се считат за положителни за антитела на вируса на АЧК.
Samples showing a BP value between 45 % and 50 % should be considered as inconclusive and must be retested.
Проби, чиято BP стойност е по-ниска от 45 %, следва да се считат за отрицателни за антитела на вируса на АЧК.
If the result is again inconclusive, the animals should be retested on samples taken not earlier than two weeks after the sample which was considered to be inconclusive was taken.
Проби, чиято BP стойност е между 45 % и 50 %, следва да се считат за недостатъчни за формулиране на заключение и трябва повторно да бъдат подложени на тест.
PART B
Ако резултатът отново е недостатъчен за формулиране на заключение, животните следва отново да бъдат изследвани не по-рано от две седмици след вземането на пробата, която е счетена за недостатъчна за формулиране на заключение.
Identification of the agent
ЧАСТ Б
Real-time Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction (rRT-PCR)
Идентификация на агента
Agent identification tests based on nucleic acid methods must detect reference strains from the nine virus serotypes of the AHSV.
Обратно транскриптазна полимеразна верижна реакция в реално време (rRT-PCR)
The method described in point 2.1 is based on point 1.2 of Section B in Chapter 2.5.1 of the Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, Edition 2016 as adopted by the World Assembly of Delegates of the OIE in May 2012.
Тестовете за идентификация на агента, базирани на методите, свързани с нуклеиновата киселина, трябва да откриват референтни щамове от девет вирусни серотипа на вируса на АЧК.
Any RT-PCR detection method used for the testing of samples, either blood or spleen, in the context of Directive 2009/156/EC must perform equal to or exceed the sensitivity of the methodologies described in point 2.
Методът, описан в точка 2.1, се основава на глава 2.5.1, раздел В, точка 1.2 от Ръководството за диагностични тестове и ваксини за сухоземни животни, издание 2016 г., прието от Световната асамблея на делегатите на OIE през май 2012 г.
Inactivated virus of serotypes 1 to 9 reference strains may be obtained from the European Union Reference Laboratory or the OIE Reference Laboratory for African horse sickness, Algete, Spain.
Всеки RT-PCR метод за откриване, използван за изследване на проби (кръв или далак) в контекста на Директива 2009/156/ЕО, трябва да е с чувствителност, еквивалентна или по-голяма от тази на методологиите, описани в точка 2.
Extraction of viral RNA
Инактивиран вирус на референтни щамове на серотипове 1—9 може да бъде получен от референтната лаборатория на Европейския съюз или от референтната лаборатория на OIE за африканска чума по конете, Алхете, Испания.
To assure a good reaction it is necessary to extract from the sample an AHSV RNA of high quality.
Извличане на вирусна РНК
The extraction of nucleic acids from clinical samples can be performed by a variety of in-house and commercially available methods.
За да се гарантира добра реакция, е необходимо от пробата да се извлече РНК с високо качество на вируса на АЧК.
Commercial kits use different approaches for RNA isolation.
Извличането на нуклеинови киселини от клиничните проби може да бъде извършено по няколко вътрешни метода или методи, достъпни в търговската мрежа.
Most are based on one of the following procedures:
Комплектите, предлагани в търговската мрежа, използват различни подходи за изолиране на РНК.
Phenol-chloroform extraction of nucleic acids;
Повечето от тях се основават на една от следните процедури:
Adsorption of nucleic acids to filter system;
фенол-хлороформно извличане на нуклеинови киселини;
Adsorption of nucleic acids to magnetic beads system.
адсорбция на нуклеинови киселини върху филтърна система;
An example of an in-house RNA extraction is given below:
адсорбция на нуклеинови киселини върху система от магнитни топчета.
1 g of tissue sample is homogenised in 1 ml of denaturing solution (4 M guanidium thiocyanate, 25 mM sodium citrate, 0,1 M 2-mercaptoethanol, 0,5 % sarcosyl).
По-долу е представен пример за вътрешен метод за извличане на РНК:
After centrifugation, 1 μg of yeast RNA, 0,1 ml of 2 M sodium acetate pH 4, 1 ml of phenol and 0,2 ml of chloroform/isoamyl alcohol mixture (49/1) are added to the supernatant.
1 g тъканна проба се хомогенизира с 1 ml денатуриран разтвор (4 M гуанидиум тиоцианат, 25 mM натриев цитрат, 0,1 М 2-меркаптоетанол, 0,5 % саркозил).
The suspension is vigorously shaken and cooled on ice for 15 minutes.
След центрофугирането към супернатанта се добавят 1 μg от РНК от дрожди, 0,1 ml от 2 M натриев ацетат, pH 4, 1 ml от фенол и 0,2 ml смес хлороформ/изоамилов алкохол (49/1).
After centrifugation, the RNA present in the aqueous phase is phenol extracted, ethanol precipitated and resuspended in sterile water.
Суспензията се разклаща енергично и се охлажда върху лед за 15 минути.
Real-time RT-PCR Procedure
След центрофугирането РНК, присъстваща във водната фаза, се извлича във фенол, утаява се в етанол и повторно се суспендира в стерилна вода.
Group-specific real-time RT-PCR by Agüero et al., 2008 [3]
Процедура полимеразна верижна реакция в реално време
This group-specific real-time RT-PCR targets VP7 of the AHSV and is able to detect all known AHSV serotypes and strains currently circulating.
Специфична за дадена група RT-PCR в реално време от Agüero et al., 2008 [3]
It has been employed with very good results by the participating national reference laboratories of the European Union Member States in the proficiency tests annually organised by the European Union Reference Laboratory for the period 2009-2015.
Тази специфична за дадена група RT-PCR в реално време е насочена към VP7 на вируса на АЧК и може да открива всички познати серотипове и щамове на вируса на АЧК, които циркулират в момента.
Moreover, in an international ring trial organised in 2015 in the framework of the OIE reference laboratories network this protocol was ranked very high amongst others.
Тя е използвана с много добри резултати от националните референтни лаборатории на държавите — членки на Европейския съюз, участващи в изпитванията за пригодност, организирани ежегодно от референтната лаборатория на Европейския съюз за периода 2009—2015 г.
Primer and probe sequences for the detection of AHSV species viruses:
Освен това в международно междулабораторно изпитване, организирано през 2015 г. в рамките на мрежата от референтните лаборатории на OIE, този протокол беше оценен много високо в сравнение с останалите.
forward Primer 5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′
Праймерите и секвенциите за откриване на вируса на АЧК:
reverse Primer 5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′
прав праймер 5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′
MGB-TaqMan probe 5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′
обратен праймер 5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′
Primer stock concentration is diluted to a working concentration of 8 μM (“primer working stock 8 μM”) whereas probe is diluted to a working concentration of 50 μM (“probe working stock 50 μM”).
сонда MGB-TaqMan 5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′
A test plate layout should be designed and loaded into the real time PCR machine software.
Концентрацията на праймерите се разрежда до работна концентрация от 8 μM („8 μM работен запас (сток) от праймер“), а сондата се разрежда до работна концентрация 50 μM („50 μM работен запас от сонда“).
Using the layout as a guide, 2,5 μl of each primer working stock 8 μM is added to each well that will contain RNA samples, positive and/or negative controls (final concentration of the primer will be 1 μM in the 20 μl RT-PCR mix).
Формулата на тестовата плака следва да бъде проектирана и въведена в софтуера на машината за PCR в реално време.
The plate is held on ice.
Като за ориентир се използва формулата, 2,5 μl от всеки работен запас от праймера от 8 μM се добавя към всяка ямка, която съдържа проби от РНК, положителни и/или отрицателни контроли (окончателната концентрация на праймера е 1 μM в 20 μl смес RT-PCR).
2 μl of isolated RNA (test samples and positive control), or 2 μl of RNAse-free water in negative reaction controls, is mixed with forward and reverse primers.
Плаката се държи върху лед.
This mixture is denatured by heating at 95 °C for 5 minutes, followed by rapid cooling on ice for at least 5 minutes.
2 μl от изолирана РНК (тестови проби и положителни контроли) или 2 μl вода без РНКаза в контролна проба с отрицателна реакция се смесва с прав и обратен праймер.
An appropriate volume of real time one-step RT-PCR master mix for the number of samples to be tested is prepared following manufacturer's instructions.