natgillin/translations-raw huggingface dataset:
С помощта на стерилен инструмент се вземат проби от рибите в съответствие с процедурата, описана в точка I.1.1, и се поставят в стерилна пластмасова епруветка, съдържаща транспортна среда.
Samples for reversed transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR or RT-qPCR) analysis
В една епруветка може да се събира тъканта от 10 риби и представлява една обща проба.
Samples shall be taken from the fish in accordance with the procedure described in point I.1.1 using a sterile instrument and transferred to a sterile plastic tube containing transport medium.
Ако обаче количеството на инокулума е малко, може да се използва тъкан от до пет риби.
Tissue from 10 fish may be collected in one tube and shall represent one pooled sample.
Друг начин е пробите да бъдат събрани в реагенти за стабилизиране на РНК, като например реагент 0,2 g тъкан/ml в съответствие с препоръката от производителите, въпреки че всяка риба се обработва самостоятелно и не може да бъде обединявана в пробите поради малкото количество на материала, който се използва за извличането.
However, in case the amount of inoculum is small, tissue from up to five fish may be used.
Цели риби също могат да бъдат изпращани в лабораторията.
Alternatively, samples may be pooled in RNA stabilization reagents, such as 0,2 g tissue/ml reagent according to the recommendation from the manufacturers, although each fish shall be processed individually and shall not be pooled in the samples because of the small amount of material to be used for extraction.
Изпращане на пробите от риби
Whole fish may also be sent to the laboratory.
Епруветките, които съдържат тъканите от рибите в транспортната среда за клетъчно култивиране или анализ с RT-PCR/RT-qPCR, се поставят в изолирани съдове, като например кутии от полистирен с дебели стени с достатъчно количество лед или друга охлаждаща среда със сходен охлаждащ ефект, за да се гарантира изстудяването на пробите по време на транспорта до лабораторията.
Shipment of samples for fish
Замразяване на пробите обаче трябва да се избягва.
Tubes containing fish tissues in transport medium for cell cultivation or RT-PCR/RT-qPCR analysis shall be placed in insulated containers, such as thick-walled polystyrene boxes, together with sufficient ice or an alternative cooling medium with the similar cooling effect to ensure chilling of the samples during transportation to the laboratory.
Температурата на пробата по време на транспортирането ѝ не трябва в нито един момент да надвишава 10 °С, а при получаването ѝ в съда за транспортиране все още трябва да има лед или едно или няколко от охлаждащите блокчета все още да са частично или изцяло замръзнали.
However, freezing of the samples shall be avoided.
В лабораторията могат да бъдат изпращани цели риби, ако по време на транспортирането могат да бъдат спазени изискванията за температурата, посочени в първия параграф.
The temperature of a sample during transit must never exceed 10 °C and ice must still be present in the transport box at receipt or one or more freeze blocks must still be partly or completely frozen.
Цялата риба се увива в абсорбираща хартия и в крайна сметка се транспортира в найлоново пликче.
Whole fish may be sent to the laboratory if the temperature requirements referred to in the first paragraph during transportation can be fulfilled.
Жива риба също може да бъде изпращана.
Whole fish shall be wrapped up in paper with absorptive capacity and shall finally be shipped in a plastic bag.
Събиране на допълнителен материал за диагностициране
Live fish may also be shipped.
Когато това е одобрено от диагностичната лаборатория, други тъкани от риба могат също така да бъдат събирани и подготвени за допълнителни изследвания.
Collection of supplementary diagnostic material
Подготовка на пробите за изследване на клетъчна култура и RT-qPCR
When approved by the diagnostic laboratory, other fish tissues may be collected as well and prepared for supplementary examinations.
Замразяване в изключителни случаи
Preparation of samples for cell culture examination and RT-qPCR
При възникване на затруднения от практическо естество, които възпрепятстват обработката на пробите до 48 часа след събирането на рибните тъкани, може да се допусне тези тъканни проби да бъдат замразени в транспортна среда при – 20 °C или при по-ниска температура, а вирусологичното изследване да се направи до 14 дни.
Freezing in exceptional cases
Рибните тъкани обаче се замразяват и размразяват само веднъж преди изследването.
Where practical difficulties arise, which make it impossible to process the samples within 48 hours after the collection of the fish tissues, it may be acceptable to freeze the tissue specimens in transport medium at – 20 °C or below and to carry out virological examination within 14 days.
Водят се и се съхраняват записи, в които се посочват причините за всяко замразяване на тъканни проби от риба.
However, the fish tissue shall only be frozen and thawed once before examination.
Хомогенизация на органите
Records shall be kept with details on the reason for each freezing of fish tissue samples.
В лабораторията рибните тъкани, които се съдържат в епруветките, са напълно хомогенизирани или чрез торбичка Stomacher, смесител, чукче и хаванче и стерилен пясък, а в последствие поставени в суспензия в първоначалната транспортна среда.
Homogenisation of organs
Ако пробата се състои от цяла риба с дължина под 4 cm, тя се нарязва на малки парченца с помощта на стерилни ножици или със скалпел, след като се премахне частта от тялото зад коремния отвор.
In the laboratory, the fish tissue in the tubes shall be completely homogenised, either by stomacher, blender or mortar and pestle with sterile sand, and subsequently suspended in the original transport medium.
Ако пробата се състои от цели риби с дължина 4—6 cm, се събират вътрешностите, включително бъбреците.
If a sample consists of a whole fish less than 4 cm long, it shall be minced with sterile scissors or scalpel after removal of the body behind the gut opening.
Ако пробата се състои от цели риби с дължина над 6 cm, тъканните проби се събират, както е описано в точка I.I.
If a sample consists of a whole fish with body length between 4 cm and 6 cm, the viscera including kidney shall be collected.
Тъканните проби се нарязват на малки парченца с помощта на стерилни ножици или скалпел, хомогенизират се, както е описано в първия параграф от настоящата точка, и се поставят в суспензия в транспортна среда.
If a sample consists of a whole fish more than 6 cm long, the tissue specimens shall be collected as described in point I.1.
Крайното съотношение между тъканния материал и транспортната среда се нагласява в лабораторията на стойности 1:10.
The tissue specimens shall be minced with sterile scissors or scalpel and homogenised as described in the first paragraph of this point and suspended in transport medium.
Центрофугиране на хомогенат
The final ratio between tissue material and transport medium shall be adjusted in the laboratory to 1:10.
Хомогенатът се центрофугира в охладена центрофуга на температура между 2 °C и 5 °C при 2000 до 4000 × g за 15 минути, а супернатантът се събира и може да се третира с антибиотици или за четири часа при 15 °C, или за една нощ при 4 до 8 °C.
Centrifugation of homogenate
Ако пробата е изпратена в транспортна среда, третирането на супернатанта с антибиотици не е необходимо.
The homogenate shall be centrifuged in a refrigerated centrifuge at 2 °C to 5 °C at 2000 to 4000 × g for 15 minutes and the supernatant collected and may be treated for either four hours at 15 °C or overnight at 4 to 8 °C with antibiotics.
При възникване на затруднения от практическо естество, като например повреда на инкубатор или проблеми с клетъчните култури, които възпрепятстват инокулирането на клетки в рамките на 48-те часа след събирането на тъканните проби от рибите, супернатантът може да бъде замразен при – 80 °C, а вирусологичното изследване може да бъде направено до 14 дни.
If the sample has been shipped in a transport medium, the treatment of the supernatant with antibiotics may be omitted.
Ако събраният супернатант е съхранен при – 80 °C в рамките на 48-те часа след вземането на пробите, той може да се използва само още един път за вирусологично изследване.
Where practical difficulties arise, such as incubator breakdown or problems with cell cultures, which make it impossible to inoculate cells within 48 hours after the collection of the fish tissue samples, the supernatant may be frozen at – 80 °C and virological examination may be carried out within 14 days.
Преди да се инокулират клетките, супернатантът се смесва в равни части заедно с антисеруми против местните серотипове на вируса на инфекциозната панкреатична некроза (ИПН), разтворени по съответния начин, и се инкубира така най-малко един час при 15 °C или максимум 18 часа при 4 °C.
If the collected supernatant is stored at – 80 °C within 48 hours after the sampling, it may be reused only once for virological examination.
Титърът на антисерума е най-малко 1/2000 при неутрализационен тест на плаки по 50 %.
Prior to the inoculation of the cells, the supernatant shall be mixed with equal parts of a suitably diluted pool of antisera to the indigenous serotypes of Infectious pancreatic necrosis (IPN) virus and incubated with this for a minimum of one hour at 15 °C or a maximum of 18 hours at 4 °C.
Третирането на всички инокулуми с антисерум за вируса на ИПН цели предотвратяването на развитието в инокулираните клетъчни култури на цитопатичен ефект, който се дължи на вируса на ИПН.
The titre of the antiserum shall be at least 1/2000 in a 50 % plaque neutralisation test.
Това третиране позволява да се намали времето за вирусологичните изследвания, както и броят на случаите, при които появата на цитопатичен ефект ще трябва да се разглежда като потенциална индикация за вируса на ВХС или на ИХН.
Treatment of all inocula with antiserum to IPN virus aims at preventing cytopathic effect (CPE) due to IPN virus from developing in inoculated cell cultures.
Когато пробите произхождат от производствени единици, считани за свободни от ИПН, третирането на инокулумите с антисерум за вируса на ИПН не е необходимо.
This will reduce the duration of the virological examinations as well as the number of cases in which occurrence of CPE would have to be considered potentially indicative of VHSV or IHNV.
Подготовка на пробите за програми за надзор, основани на RT-PCR и RT-qPCR
When samples come from production units, which are considered free from IPN, the treatment of inocula with antiserum to IPN virus may be omitted.
Ако пробите са събрани в транспортна среда, се извършват процедурите, посочени в точки I.4.2 и I.4.3.
Sample preparation for RT-PCR and RT-qPCR based surveillance programmes
Супернатантът се събира след центрофугиране и се извлича РНК.
If samples were collected in transport medium, the procedure set out in points I.4.2 and I.4.3 shall be carried out.
Ако веднага след центрофугирането не е предприето допълнително изследване, пробите незабавно се замразяват при – 20 °С или по-малко.
After centrifugation, supernatant shall be collected and RNA extracted.
За анализа на тъкани от риби, съхранени в реагенти за стабилизиране на РНК, трябва да бъде извършена допълнителна работа в рамките на следните срокове за проби, съхранявани при различна температура:
If further examination is not to be undertaken directly after centrifugation, the samples shall be immediately frozen at – 20 °C or below.
проби, съхранявани при 37 °C: един ден;
For the analysis of fish tissues preserved in RNA stabilization reagent, subsequent work shall be carried out within the following time scales for samples stored at different temperatures:
проби, съхранявани при 25 °C: една седмица;
samples stored at 37 °C: 1 day;
проби, съхранявани при 4 °C: един месец;
samples stored at 25 °C: 1 week;
проби, съхранявани при – 20 °C: безсрочно.
samples stored at 4 °C: 1 month;
Обединени заедно проби в реагент за стабилизиране на РНК се разглеждат като единични проби в реагент за стабилизиране на РНК.
samples stored at – 20 °C: indefinitely
За проби, обединени заедно в реагент за стабилизиране на РНК, количеството на пробата не надвишава стойността, препоръчана от производителя за извличане с комплекти за РНК, като например RNeasy Mini kits (Qiagen) или други подобни.
Pooled samples in RNA stabilization reagent shall be treated like single samples in RNA stabilization reagent.
Ако се обединяват по-големи проби, в комплектите или методите за извличане това обединяване трябва да бъде отразено.
For samples pooled in RNA stabilization reagent, the sample amount shall not exceed that recommended by the manufacturer for extraction with RNA kits, such as RNeasy Mini kits (Qiagen) or similar.
Пробите, събрани в реагент за стабилизиране на РНК, не се използват за култивирането на клетки.
If larger samples are pooled, the extraction kits or methods must reflect this pooling.
Обединяване на проби за RT-qPCR
Samples collected in RNA stabilization reagents shall not be used for cell cultivation.
Тъй като протоколите за RT-qPCR са със сходна или по-висока чувствителност от методите за култивиране на клетката, може да е приемливо да се използва супернатант от материал от хомогенизирана рибна тъкан от няколко органа, обединени в едно, от до 10 риби в среда за клетъчна култура за PCR.
Pooling of samples for RT-qPCR
Поради много по-малкия инокулум, използван за PCR, в сравнение с култивирането на клетката, всички тъкани от риби се хомогенизират внимателно преди събирането на материал за извличане.
As the RT-qPCR protocols given are of similar or higher sensitivity than the cell cultivation methods, it may be acceptable to use supernatant from homogenised fish tissue material of pooled organs from up to 10 fish in cell culture medium for PCR.
Същият принцип се прилага и ако пробите са събрани в реагент за стабилизиране на РНК.
However, due to the much smaller inoculum used for PCR compared to cell cultivation, all fish tissues shall be carefully homogenised before collating material for extraction.
В този случай обаче често е трудно да събере представителен материал от до 10 риби в една епруветка, като броят на рибите в обединената проба следователно се намалява на 2 до 5.
The same principle shall also be applied if samples are collected in RNA stabilization reagents.
Вирусологично изследване на клетъчна култура
However, in that case it is often difficult to collect representative material from up to 10 fish in one tube, and the number of fish per pool shall therefore be reduced to 2 to 5.
Клетъчни култури и среди
Virological examination on cell culture
Клетъчна линия -2 (BF-2) от слънчева риба или полова жлеза от дъгова пъстърва клетъчна линия -2 (RTG-2), както и клетки от Epithelioma papulosum cyprini (EPC) или от Pimephales promelas се култивират на температура от 20 до 30 °C в подходяща среда, а именно минимална основна среда на Игъл или нейни модификации, към която е добавен 10 % серум от говежди фетус и антибиотици в стандартни концентрации.
Cell cultures and media
Когато клетките се култивират в затворени флакони, средата се буферира с бикарбонат.
Bluegill fry cell line -2 (BF-2) or Rainbow trout gonad cell line - 2 (RTG-2) and either Epithelioma papulosum cyprini (EPC) or Fathead minnow (FHM) cells shall be grown at 20 to 30 °C in suitable medium, namely Eagle's Minimum essential medium (MEM) or modifications thereof, with a supplement of 10 % foetal bovine serum and antibiotics in standard concentrations.
Средата, използвана за клетъчна култура в отворени съдове може да се буферира с трис(хидроксиметил)аминометан-HCl (Трис-HCl) (23 mM) и натриев бикарбонат (6 mM). pH трябва да бъде 7,6 ± 0,2.
When the cells are cultivated in closed vials, the medium shall be buffered with bicarbonate.
Клетъчните култури, които ще се използват за инокулацията с тъканен материал от риба, са млади риби, обикновено монослоеве от еднодневна клетъчна култура, когато това е възможно; може обаче да бъде допустима и когато е между 4 до 48 часа.
The medium used for cultivation of cells in open units may be buffered with tris(hydroxymethyl)aminomethane-HCl (Tris-HCl) (23 mM) and sodium bicarbonate (6 mM).
Клетките трябва да са във фаза на активен растеж в момента на инокулацията.
The pH must be 7,6 ± 0,2.
Инокулация на клетъчните култури
The cell cultures to be used for inoculation with fish tissue material shall be young, normally 1 day old cell culture monolayers where possible; however, a range between 4 to 48 hours old may be accepted.
Третирана с антибиотик суспенсия от орган се инокулира в клетъчни култури в две разреждания, а именно първоначалното разреждане, а след това разредено 1:10, което дава съответно крайни разреждания на тъканния материал съответно 1:100 и 1:1000, така че да се предотвратят хомологичните интерференции.
The cells must be actively growing at inoculation.
Поне две клетъчни линии се инокулират, както е посочено в точка I.5.1.
Inoculation of cell cultures
Съотношението между размера на инокулума и обема на средата на клетъчната култура е около 1:10.
Antibiotic-treated organ suspension shall be inoculated into cell cultures in two dilutions, namely the primary dilution and, in addition, a 1:10 dilution thereof, resulting in final dilutions of tissue material in cell culture medium of 1:100 and 1:1000, respectively, in order to prevent homologous interference.
За всяко разреждане и всяка клетъчна култура се използва минимум около 2 cm2 клетки, което съответства на едно клетъчно гнездо от плочка за тъканна култура с 24 гнезда.
At least two cell lines shall be inoculated as referred to in point I.5.1.
Когато е възможно, се използва гнездо от плочка за тъканна култура.
The ratio between inoculum size and volume of cell culture medium shall be about 1:10.
Инкубация на клетъчните култури
For each dilution and each cell line, a minimum of about 2 cm2 cell area, corresponding to one well in a 24-well cell culture tray, shall be utilised.
Инокулираните клетъчни култури се инкубират при 15 °C седем до десет дни.
Cell culture trays shall be used where possible.
Ако цветът на средата на клетъчната култура се промени от червено към жълто, индикация за повишаване на киселинното съдържание в средата, pH трябва да се регулира с помощта на стерилен бикарбонатов разтвор или еквивалентни субстанции, за да се осигури възприемчивостта на клетката към вирусната инфекция.
Incubation of cell cultures
Най-малко на шест месеца или когато има съмнение за намаляване на клетъчната възприемчивост, се извършва титруване на замразените запаси от вируси на ВХС и ИХН, за да се провери възприемчивостта на клетъчните култури към инфекцията.
The inoculated cell cultures shall be incubated at 15 °C for seven to 10 days.
Ако е възможно, се следва процедурата, посочена в точка III.
If the colour of the cell culture medium changes from red to yellow indicating medium acidification, pH adjustment with sterile bicarbonate solution or equivalent substances shall be performed to ensure cell susceptibility to virus infection.
Микроскопия
At least every 6 months or if decreased cell susceptibility is suspected, titration of frozen stocks of VHSV and IHNV shall be performed to verify the susceptibility of the cell cultures to infection.
Инокулираните клетъчни култури се проверяват редовно (поне три пъти седмично), за да може да се открие появата на цитопатичен ефект при увеличение от 40 до 150 пъти.
The procedure set out in Section III shall be used, if possible.
Ако отчетливо се наблюдава цитопатичен ефект, незабавно се започват процедурите за идентификация на вируса в съответствие с точка I.6.
Microscopy
Субкултивиране
Inoculated cell cultures shall be inspected regularly, at least three times a week, for the occurrence of CPE at 40 to 150 × magnification.
Ако не се наблюдава цитопатичен ефект след първата инкубация за период от 7 до 10 дни, се прави Субкултивиране от пресни клетъчни култури, като се използва клетъчна площ, подобна на тази на първичната култура.
If obvious CPE is observed, virus identification procedures in accordance with point I.6 shall be initiated immediately.
Аликвотни части от средата (супернатанта), произхождащи от всички култури или клетъчни гнезда, съставляващи първичната култура, се обединяват според клетъчната линия 7до 10 дни след инокулацията.
Subcultivation
След това обединените проби се инокулират в хомологични клетъчни култури, неразредени и разредени 1:10 (като в крайна сметка се стига до разреждания на супернатанта 1:10 и 1:100), както е описано в точка I.5.2.
If no CPE has developed after the primary incubation for 7 to 10 days, subcultivation shall be performed to fresh cell cultures utilising a cell area similar to that of the primary culture.
Десетпроцентови аликвотни части от средата, съставляваща първичната култура, също могат да бъдат директно инокулирани в клетъчно гнездо с пресни клетъчни култури (а именно субкултивиране от гнездо в гнездо).
Aliquots of medium (supernatant) from all cultures or wells constituting the primary culture shall be pooled according to cell line 7 to 10 days after inoculation.
Инокулацията може да се предшества от предварителна инкубация на разрежданията с антисерум за вируса на ИПН със съответното разреждане, както е описано в точка I.4.3.
The pools shall then be inoculated into homologous cell cultures undiluted and diluted 1:10 (resulting in final dilutions of 1:10 and 1:100, respectively, of the supernatant) as described in point I.5.2.
След това инокулираните култури се инкубират 7 до 10 дни при температура 15 °C, като се инспектират в съответствие с точка I.5.4.
Alternatively, aliquots of 10 % of the medium constituting the primary culture shall be inoculated directly into a well with fresh cell culture (namely, well to well subcultivation).
Ако се получи токсичен цитопатичен ефект през първите три дни след инкубацията, на този етап може да бъде реализирано субкултивиране, но тогава клетките се инкубират седем дни и подложени на ново субкултивиране с още седем дни инкубация.
The inoculation may be preceded by pre-incubation of the dilutions with the antiserum to IPN virus at appropriate dilution as described in point I.4.3.
Когато се появи токсичен цитопатичен ефект след три дни, клетките се пренасят един път и се инкубират, за да се получи общо 14 дни от първичната инокулация.
The inoculated cultures shall then be incubated for 7 to 10 days at 15 °C and inspected in accordance with point I.5.4.
Не трябва да има признак за токсичност през последните седем дни инкубация.
If toxic CPE occurs within the first 3 days of incubation, subcultivation shall be performed at that stage, but the cells shall then be incubated for 7 days and sub cultivated again with further 7 days incubation.
Ако се получи бактериална зараза въпреки третирането с антибиотици, субкултивирането се предшества от центрофугиране при 2000 до 4000 × g за 15 до 30 минути на температура 2 до 5 °C и от филтриране на супернатанта през филтър 0,45 μm или и двете (мембрана с нисък процент свързване с протеините).
When toxic CPE develops after 3 days, the cells shall be passed once and incubated to achieve the total of 14 days from the primary inoculation.
Освен това при субкултивирането се следват същите процедури, както е описано за токсичния цитопатичен ефект в четвъртия параграф от настоящата точка.
There must be no evidence of toxicity in the final 7 days of incubation.
Ако не се наблюдава цитопатичен ефект, изследването може да се обяви за отрицателно.
If bacterial contamination occurs despite treatment with antibiotics, subcultivation shall be preceded by centrifugation at 2000 to 4000 × g for 15 to 30 minutes at 2 to 5 °C, or filtration of the supernatant through a 0,45 μm filter or both (low protein-binding membrane).
Идентификация на вируса
In addition to this, subcultivation shall follow the same procedures as described for toxic CPE in the fourth paragraph of this point.
Ако се наблюдават данни за цитопатичен ефект в клетъчна култура, средата (супернатанта) се събира и се изследва с помощта на една или няколко от следните техники: Ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA), имунофлуоресценция (IF), неутрализация, RT-PCR или RT-qPCR.
If no CPE occurs, the test may be declared negative.