natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Плаката се връща в инкубатор при 37 °C и 5 % CO2 във въздушна атмосфера за 48 часа.
Values outside of the linear portion of the standard curve should be rejected.
Структурата на плаката с изпитвания химикал е показана в таблица 6.
Final hormone concentrations are calculated as follows:
Изходни разтвори 1—7 показват поставяне на увеличаващи се дози от изпитвания химикал.
Example:
Таблица 6
Extracted:
Схема на дозиране за експозиция на H295R клетки на изпитвани химикали в 24-гнездова плака
450 μl medium
Изходен разтвор 4
Reconstituted in:
Изходен разтвор 1
250 μl assay buffer
Изходен разтвор 1
Dilution in Assay:
Изходен разтвор 5
1:10 (to bring the sample within the linear range of the standard curve)
Изходен разтвор 2
Hormone Concentration in Assay:
Изходен разтвор 6
150 pg/ml (already adjusted to concentration per ml sample assayed)
Изходен разтвор 3
Recovery:
Изходен разтвор 7
Final hormone concentration =
След 48 часа експонираните плаки се изваждат от инкубатора и всяко гнездо се проверява под микроскоп за състоянието на клетките (прикрепване, морфология, степен на сливане) и признаци на цитотоксичност.
(Hormone concentration (per ml) ÷ recovery) (dilution factor)
Средата от всяко гнездо се разделя на два равни обема (около 490 μl всеки) и се прехвърля в два отделни флакона, етикетирани по подходящ начин (т.е. една аликвотна част за осигуряване на резервна проба за всяко гнездо).
(150 pg/ml) ÷ (0,89) × (250 μl/450 μl) × 10 = 936,3 pg/ml
За предотвратяване на изсушаването на клетките средата се отстранява (по един ред или колона наведнъж) и се заменя със средата за изследването за клетъчна жизнеспособност/цитотоксичност.
Selection of test concentrations
Ако клетъчната жизнеспособност/цитотоксичността не трябва да се измерва веднага, 200 μl PBS с Ca2+ и Mg2+ се добавят към всяко гнездо.
A minimum of two independent runs of the assay should be conducted.
Средите се замразяват при – 80 °С до по-нататъшното им обработване за анализ на концентрациите на хормони (вж. параграфи 44—46).
Unless prior information such as information on solubility limits or cytotoxicity provides a basis for selecting test concentrations, it is recommended that the test concentrations for the initial run be spaced at log10 intervals with 10–3 M being the maximum concentration.
T и E2 в среда, съхранявани при температура от – 80 °C, по принцип са стабилни за период от най-малко 3 месеца, но независимо от това стабилността на хормоните при съхранение следва да бъде документирана в рамките на всяка лаборатория.
If the chemical is soluble, and not cytotoxic at any of the tested concentrations, and the first run was negative for all concentrations, then it is to be confirmed in one more run using the same conditions as the first run was conducted (Table 7).
Веднага след отстраняването на средата, клетъчната жизнеспособност/цитотоксичността се определят за всяка плака с определена експозиция.
If the results of the first run are equivocal (i.e. the fold-change is statistically significant from the SC at only one concentration) or positive (i.e. the fold change at two or more adjacent concentrations is statistically significant), the test should be repeated as indicated in Table 7 by refining the selected test concentrations.
Определяне на клетъчната жизнеспособност
Test concentrations in runs two and three (if applicable) should be adjusted on the basis of the results of the initial run bracketing concentrations that elicited an effect using 1/2-log concentration spacing (e.g. if the original run of 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100, 1000 μM resulted in inductions at 1 and 10 μM, the concentrations tested in the second run should be 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 μM), unless lower concentrations need to be employed to achieve a LOEC.
Може да бъде извършено изследване по избор за клетъчна жизнеспособност/цитотоксичност за определяне на потенциалното въздействие на изпитвания химикал върху клетъчната жизнеспособност.
In the latter case, at least five concentrations below the lowest concentration tested in the first run should be used in the second run using a 1/2-log scale.
Изследването следва да бъде в състояние да осигурява вярно измерване на процента на жизнеспособните клетки, намиращи се в гнездото, или трябва да се докаже, че то е пряко сравнимо с (линейна функция от) изпитване Live/Dead® (вж. приложение III от доклада за валидиране (4)).
If the second run does not confirm the first run (i.e. statistical significance does not occur at the previously positively tested Live/Deadconcentration ± 1 concentration-increment), a third experiment is to be conducted using the original testing conditions.
Алтернативно изследване, за което е доказано, че е равностойно, е изпитването с MTT [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиев бромид] (18).
Equivocal results in the first run are considered negative if the observed effect could not be confirmed in any of the two subsequent runs.
Оценката на жизнеспособността на клетките по горепосочените методи е относително измерване, което не показва непременно линейни зависимости с абсолютния брой клетки в дадено гнездо.
Equivocal results are considered as positive responses (effect) when the response can be confirmed in at least one more run within a ± 1 concentration increment (see section 55 for the Data Interpretation Procedure).
Поради това анализаторът следва да извърши субективна паралелна визуална оценка на всяко гнездо и следва да бъдат заснети и архивирани цифрови изображения на контролните проби на разтворител и двете най-високи концентрации, които не са цитотоксични, за да може по-късно да се извърши оценка на истинската плътност на клетките, ако това се изисква.
Table 7
Ако от визуална инспекция или от показване с изследване за жизнеспособност/цитотоксичност изглежда, че има нарастване на броя на клетките, видимото нарастване трябва да бъде проверено.
Decision matrix for possible outcome scenarios
Ако при проверка се установи нарастване на броя на клетките, това трябва да бъде посочено в доклада от изпитването.
Run 1
Клетъчната жизнеспособност се изразява по отношение на средния отговор от контролните проби на разтворителя, за който се счита, че е за 100 % жизнеспособни клетки, и се изчислява по начин, подходящ за използваното изследване за жизнеспособност/цитотоксичност.
Run 2
За изпитването с MTT може да се използва следната формула:
Run 3
% жизнеспособни клетки = (отговор в гнездото – среден отговор в третирани с MeOH гнезда [= 100 % мъртви]) ÷ (среден отговор в гнезда със SC – среден отговор в третирани с MeOH гнезда [= 100 % мъртви])
Decision
Гнездата с жизнеспособност, по-ниска от 80 % в сравнение със средната жизнеспособност в SC (= 100 % жизнеспособност), не следва да се включват в окончателния анализ на данните.
Scenario
Потискането на стероидогенезата, протичащо в присъствието на почти 20 % цитотоксичност, следва да бъде внимателно оценявано, за да се гарантира, че цитотоксичността не е причината за потискането.
Positive
Анализ на хормони
Confirm [26]
За анализа на T и E2 всяка лаборатория може да използва система за измерване на хормони по свой избор.
Stop
Резервните аликвотни части от среда от всяка група за третиране могат да бъдат използвани при изготвянето на разреждания за привеждане на концентрацията в рамките на линейната част от стандартната крива.
Refine [27]
Както е отбелязано в параграф 29, всяка лаборатория трябва да докаже съответствието на своята система за измерване на хормони (напр.
Equivocal [28]
ELISA, RIA, LC-MS, LC-MS/MS) с критериите за КК като, преди да извърши независимо провеждане на изпитване за КК или преди изпитването на химикали, анализира белязана проба от среда с добавки с вътрешна контрола с хормон като внесена добавка.
Quality Control of the Test Plate
С цел да се гарантира, че компонентите на системата за изпитване не пречат на измерването на хормони, може да се наложи хормоните да бъдат извлечени от средите преди тяхното измерване (вж. параграф 30 за условията, при които се изисква или не се изисква извличане).
In addition to meeting the criteria for the QC plate, other quality criteria that pertain to acceptable variation between replicate wells, replicate experiments, linearity and sensitivity of hormone measurement systems, variability between replicate hormone measures of the same sample, and percentage recovery of hormone spikes after extraction of medium (if applicable; see Paragraph 30 regarding extraction requirements) should be met and are provided in Table 8.
Препоръчително е извличането да се извършва съгласно процедурите в допълнение III към доклада за валидирането (4).
Data should fall within the acceptable ranges defined for each parameter to be considered for further evaluation.
Ако за измерване на производството на хормони се използва търговски комплект за изпитване, анализът на хормони трябва да се извършва съгласно наръчниците, предоставени от производителя на комплекта за изпитване.
If these criteria are not met, the spreadsheet should note that QC criteria were not met for the sample in question, and the sample should be re-analysed or dropped from the data set.
Повечето производители имат уникална процедура, по която се извършват анализите на хормони.
Table 8
Разрежданията на пробите трябва да бъдат коригирани по такъв начин, че очакваните концентрации на хормони за контролите на разтворител да попадат в центъра на линейния обхват на стандартната крива на отделното изследване (допълнение III към доклада за валидирането (4)).
Acceptable ranges and/or variation (%) for H295R assay test plate parameters.
Стойностите извън линейната част на стандартната крива следва да бъдат отхвърлени.
(LOQ: Limit of Quantification of the hormone measurement system.
Крайните концентрации на хормони се изчисляват по следния начин:
CV: Coefficient of variation; SC: Solvent Control; DPM: Disintegrations per minute)
Пример:
Comparison Between
Извлечени:
Basal hormone production in SCs
450 μl среда
Fold-greater than LOQ
Възстановени в:
≥ 5-fold
250 μl буфер, използван при изследването
≥ 2,5-fold
Разреждане при изследването:
Exposure Experiments — Within Plate CV for SCs (Replicate Wells)
1:10 (за да може пробата да попадне в рамките на линейния обхват на стандартната крива)
Absolute Concentrations
Концентрация на хормони при изследването:
Exposure Experiments — Between Plate CV for SCs (Replicate Experiments)
150 pg/ml (вече коригирана до концентрация на ml изследвана проба)
Fold-Change
Добив:
Hormone Measurement System — Sensitivity
Крайна концентрация на хормони =
Detectable fold-decrease relative to SC
(Концентрация на хормони (на ml) ÷ добив) (коефициент на разреждане)
Hormone Measurement System — Replicate Measure CV for SCs [29]
(150 pg/ml) ÷ (0,89) × (250 μl/450 μl) × 10 = 936,3 pg/ml
Medium Extraction — Recovery of Internal 3H Standard (If Applicable)
Избор на концентрации на изпитване
DPM
Изследването трябва да бъде извършено чрез най-малко две независими провеждания.
≥ 65 % Nominal
Освен ако предварителна информация, като например информацията за границите на разтворимост или за цитотоксичността, предоставя основа за избора на концентрации на изпитване, препоръчва се концентрациите на изпитване при първоначалното независимо провеждане да бъдат разположени на интервали от log10 с максимална концентрация 10–3 M. Ако химикалът е разтворим и не е цитотоксичен при никоя от изпитваните концентрации, и първоначалното независимо провеждане е дало отрицателен резултат при всички концентрации, тогава това трябва да бъде потвърдено с още едно независимо провеждане, като се използват същите условия, както при първоначалното независимо провеждане (таблица 7).
DATA ANALYSIS AND REPORTING
Ако резултатите от първоначалното независимо провеждане са неясни (т.е. кратността на измененията е статистически значима по отношение на SC само при една концентрация) или положителни (т.е. кратността на измененията е статистически значима при две или повече съседни концентрации), изпитването следва да бъде повторено, както е посочено в таблица 7, чрез уточняване на избраните концентрации на изпитване.
Data Analysis
Концентрациите на изпитване при второто и третото независими провеждания (ако е приложимо) следва да се коригират въз основа на резултатите от концентрациите от първоначалното независимо провеждане, при които има проявен ефект, като същите се обграждат с концентрации, разположени на интервал 1/2-log (например ако в резултат на първоначалното независимо провеждане при концентрации 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100, 1000 μm има получена индукция при концентрации 1 и 10 μM, концентрациите на изпитване при второто независимо провеждане трябва да бъдат 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 μM), освен ако трябва да бъдат използвани по-ниски концентрации за постигане на LOEC.
To evaluate the relative increase/decrease in chemically altered hormone production, the results should be normalised to the mean SC value of each test plate, and results expressed as changes relative to the SC in each test plate.
В последния случай при второто независимо провеждане следва да се използват най-малко пет концентрации под най-ниската концентрация, изпитана при първоначалното независимо провеждане, с използване на скала с интервали от 1/2-log.
All data are to be expressed as mean ± 1 standard deviation (SD).
Ако при второто независимо провеждане не се потвърди първоначалното независимо провеждане (т.е. не се получи статистически значим резултат при концентрация, при която преди това е имало положителен резултат ± 1 интервал на концентрация), следва да бъде проведен трети опит, с използване на първоначалните условия на изпитване.
Only hormone data from wells where cytotoxicity was less than 20 % should be included in the data analysis.
Неясните резултати от първоначалното независимо провеждане се смятат за отрицателни, ако наблюдаваният ефект не е бил потвърден в никое от последващите независими провеждания.
Relative changes should be calculated as follows:
Неясните резултати се смятат за положителен отговор (ефект), когато отговорът може да се потвърди в най-малко още едно независимо провеждане в рамките на ± 1 интервал на концентрация (вж. раздел 55 за процедурата за тълкуване на данните).
Relative Change = (Hormone concentration in each well) ÷ (Mean hormone concentration in all solvent control well).
Таблица 7
If by visual inspection of the well or as demonstrated by the viability/cytotoxicity assay described in paragraph 42 there appears to be an increase in cell number, the apparent increase needs to be verified.
Матрица на решенията при възможни сценарии с резултати
Prior to conducting statistical analyses, the assumptions of normality and variance homogeneity should be evaluated.
Независимо провеждане 1
Normality should be evaluated using standard probability plots or other appropriate statistical method (e.g. Shapiro-Wilk's test).
Независимо провеждане 2
If the data (fold changes) are not normally distributed, transformation of the data should be attempted to approximate a normal distribution.
Независимо провеждане 3
If the data are normally distributed or approximate a normal distribution, differences between chemical concentration groups and SCs should be analysed using a parametric test (e.g. Dunnett's Test) with concentration being the independent, and response (fold-change) being the dependent variable.
Решение
If data are not normally distributed, an appropriate non-parametric test should be used (e.g. Kruskal Wallis, Steel's Many-one rank test).
Сценарий
Differences are considered significant at p ≤ 0,05.
Положителен резултат
Statistical evaluations are done based on average values for each well that represent independent replicate data points.
Потвърждаване [26]
It is anticipated that due to the large spacing of doses in the first run (log10 scale) in many cases it will not be possible to describe clear concentration-response relationships where the two greatest doses will be on the linear portion of the sigmoid curve.
Спиране
Therefore, for the first run or any other data sets where this condition occurs (e.g. where no maximum efficacy can be estimated) type I fixed variable statistics as described above will be applied.
Уточняване [27]
If more than two data points lie on the linear portion of the curve and where maximum efficacies can be calculated — as is anticipated for some of the 2nd runs that are conducted using a semi-log spacing of exposure concentrations — a probit, logit or other appropriate regression model should be utilised to calculate effective concentrations (e.g. EC50 and EC20).
Неясен резултат [28]
Results should be provided both in graphical (bar graphs representing mean ± 1 SD) and tabular (LOEC/NOEC, direction of effect, and strength of maximum response that is part of the dose-response portion of the data) formats (see Figure 3 for an example).
Контрол на качеството при плаката за изпитване
Data assessment is only considered valid if it has been based on at least two independently conducted runs.
В допълнение към критериите за плаката за КК съществуват и други критерии за качество, които трябва да бъдат спазени, и които се отнасят до приемливите колебания между гнездата за повторение, повтаряните опити, линейността и чувствителността на системите за измерване на хормони, варирането между измерванията на хормоните при повторенията в рамките на една и съща проба и процента на аналитичен добив за внесените добавки от хормони след извличането на средата (ако е приложимо; вж. параграф 30 относно изискванията за извличане) и тези критерии са дадени в Таблица 8.
An experiment or run is considered independent if it has been conducted at a different date using a new set of solutions and controls.
Данните трябва да попадат в допустимите обхвати, определени за всеки параметър, който трябва да се вземе предвид за последваща оценка.
The concentration range used in runs 2 and 3 (if necessary) may be tailored on the basis of the results of run 1 to better define the dose response range containing the LOEC (see paragraph 47).
Ако тези критерии не са спазени, електронната таблица следва да отбележи, че критериите за КК не са били спазени за въпросната проба и пробата следва да се анализира отново, или да не бъде включена в набора от данни.
Figure 3
Таблица 8
Example of the presentation and evaluation of data obtained during the conduct of the H295R Assay in graphical and tabular format.
Допустими обхвати и/или колебания (%) за параметрите в плаките за изпитване при изследване в H295R клетки
Asterisks indicate statistically significant differences from the solvent control (p < 0,05).
(LOQ: Граница на количествено определяне на системата за измерване на хормони.
Lowest observed effective concentration;
CV: Коефициент на вариация; SC: Контрола на разтворител; DPM: Разпадания за минута)
Max Change:
Сравнение между
Maximum strength of the response observed at any concentration relative to the average SC response (= 1).
Основно производство на хормони в SC
Cholesterol
Кратност спрямо LOQ, по-голяма от
Pregnenolone
≥ 5-кратна
OH Pregnenolone
≥ 2,5-кратна
Progesterone
Опити с експозиция — CV в рамките на плаката за SC (гнезда за повторение)
OH Progesterone
Абсолютни концентрации
Androstenedione
Опити с експозиция — CV между плаките за SC (повтаряни опити)
Testosterone
Кратност на измененията
estradiol
Система за измерване на хормони — Чувствителност
eoxycorticosterone
Кратност на откриваемите изменения по отношение на SC
Cortisol
Система за измерване на хормони — CV на повтаряните измервания за SC [29]
Aldosterone
Извличане на средата — добив на вътрешен 3H стандарт (ако е приложимо)
Estrone
DPM:
Deoxycortisol
≥ 65 % от номиналното
Corticosterone
АНАЛИЗ НА ДАННИ И ДОКЛАДВАНЕ
LOEC Max Change
Анализ на данни
0,15 fold
За да се оцени относителното увеличение/намаление на измененото по химичен път производство на хормони, резултатите следва да бъдат стандартизирани спрямо средната стойност на SC за всяка плака за изпитване и изразени като изменения по отношение на SC във всяка плака за изпитване.
Letrozole
Всички данни следва да бъдат изразени като средна стойност ± 1 стандартно отклонение (SD).
29 fold
Само данните за хормони от гнезда, в които цитотоксичността е била под 20 %, следва да бъдат включени в анализа на данните.
Data Interpretation Procedure
Относителните изменения следва да бъдат изчислявани по следния начин:
A test chemical is judged to be positive if the fold induction is statistically different (p ≤ 0,05) from the solvent control at two adjacent concentrations in at least two independent runs (Table 7).
Относително изменение = (Концентрация на хормони във всяка плака) ÷ (Средна концентрация на хормони във всички гнезда с контрола на разтворител).
A test chemical is judged to be negative following two independent negative runs, or in three runs, comprising two negative runs and one equivocal or positive run.
Ако от визуална инспекция на гнездото или от показване с изследване за жизнеспособност/цитотоксичност, описано в параграф 42, изглежда, че има нарастване на броя на клетките, видимото нарастване трябва да бъде проверено.
If the data generated in three independent experiments does not meet the decision criteria listed in Table 7, the experimental results are not interpretable.
Преди извършване на статистически анализи следва да бъдат оценени допусканията за нормалност и хомогенност на дисперсията.
Results at concentrations exceeding the limits of solubility or at cytotoxic concentrations should not be included in the interpretation of results.
Нормалността следва да се оценява, като се използват графики за вероятности със стандартно разпределение или друг подходящ статистически метод (например изпитване на Shapiro-Wilk).
Test Report
Ако данните (кратност на измененията) не са с нормално разпределение, следва да се направи опит за трансформация на данните с цел доближаване до нормално разпределение.
Name of facility and location;
Ако данните са с нормално разпределение или се доближават до нормално разпределение, различията между групите с концентрация на химикал и контролите на носител следва да се анализират чрез използване на параметрично изпитване (напр. изпитване на Dunnett) като концентрацията е независимата променлива, а отговорът (кратност на измененията) е зависимата променлива.
Study director and other personnel and their study responsibilities;
Ако данните не са с нормално разпределение, следва да бъде използвано подходящо непараметрично изпитване (като например изпитване на Kruskal Wallis или изпитване с рангови данни на Steel).
Dates the study began and ended;
Различията се считат за значими при p ≤ 0,05.
Test chemical, reagents and controls
Статистически оценки се правят въз основа на средни стойности за всяко гнездо, които представляват независими точки с данни от повторения.
Identity (name/CAS No as appropriate), source, lot/batch number, purity, supplier, and characterisation of test chemical, reagents, and controls;
Очаква се, че поради големия интервал между дозите при първоначалното независимо провеждане (скала log10) в много случаи няма да е възможно да се опишат ясни зависимости концентрация-отговор, при които двете най-големи дози да са в линейната част на сигмоидната крива.
Physical nature and relevant physicochemical properties of test chemical;
Следователно при първоначалното независимо провеждане или при всякакви други набори от данни, за които е изпълнено това условие (например в случаите, когато не може да бъде оценена максималната ефикасност), се използва статистика с фиксирана променлива от тип I, както е описано по-горе.
Storage conditions and the method and frequency of preparation of test chemicals, reagents and controls;
Когато повече от две точки с данни са разположени върху линейната част на кривата и когато максималните ефикасности могат да бъдат изчислени — както се очаква при някое от 2-рите независими провеждания, които са при интервали в полулогаритмичен мащаб на концентрациите на експозиция — следва за изчисляване на концентрации, при които се наблюдава ефект (напр.
Stability of test chemical;
EC50 и EC20), да се използва Probit, Logit или друг подходящ регресионен модел.
Cells
Резултатите трябва да бъдат представени както в графичен (стълбовидна диаграма, представляваща средната стойност ± 1 SD), така и в табличен вид (LOEC/NOEC, посока на ефекта и сила на максималния отговор, който е частта доза-отговор от данните) (вж. фигура 3 за пример).
Source and type of cells;