natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Преди провеждане на изпитването за първи път, лабораторията следва да проведе опит за определяне дали отговаря на условията, доказващ, че е в състояние да поддържа и постигне подходящи условия за клетъчните култури и условия на изпитването, изисквани за изпитване на химикала, както е описано в параграфи 33—35.
the strong inhibitor prochloraz (CAS No 67747-09-5);
При започване на изпитване с използване на нова партида, преди да се използва новата партида от клетки, независимо се провежда изпитване в контролна плака, за да се направи оценка на параметрите на клетките, както е описано в параграфи 36 и 37.
the moderate inducer atrazine (CAS No 1912-24-9);
Параметри на системата за измерване на хормони
the moderate inhibitor aminoglutethimide (CAS No 125-84-8);
Чувствителност на метода, точност, прецизност и кръстосана реактивност с матричната проба
the weak inducer (E2 production) and weak inhibitor (T production) bisphenol A (CAS No 80-05-7);
За анализа на производството на T и E2 от H295R клетки всяка лаборатория може да използва система за измерване на хормони по свой избор, при условие че тази система отговаря на критериите за параметрите, включително границата на количествено определяне (LOQ).
and the negative chemical human chorionic gonadotropin (HCG) (CAS No 9002-61-3) as shown in Table 2.
Номинално те са 100 pg/ml за T и 10 pg/ml за E2 и се основават на основните хормонални равнища, наблюдавани при изследванията за валидиране.
Separate plates are run for all chemicals using the format as shown in Table 6.
Въпреки това могат да бъдат подходящи по-високи или по-ниски равнища, в зависимост от базисните хормонални равнища, достигнати в изпитващата лаборатория.
One QC plate (Table 4, paragraphs 36-37) should be included with each daily run for the proficiency chemicals.
Преди инициирането на плаката за КК и независимите провеждания на изпитването, лабораторията следва да докаже, че с изследването за хормони, което ще се използва, концентрациите в средата с добавки могат да бъдат измерени с достатъчна точност и прецизност, за да отговорят на критериите за КК, посочени в таблици 1 и 5, като анализира белязана проба от среда с добавки с вътрешна контрола с хормон като внесена добавка.
Proficiency chemicals and exposure concentrations
Пробата със средата с добавки следва да бъде белязана с прибавяне на най-малко три концентрации за всеки хормон (напр.
Proficiency chemical
100, 500, и 2500 pg/ml от T; 10, 50 и 250 pg/ml от E2; или възможно най-ниските концентрации, които се основават на границите на откриване на избраната система за измерване на хормони могат да се използват за най-ниските концентрации на внесена добавка за T и E2) и тази среда с добавки следва да бъде анализирана.
Test Concentrations [μM]
Измерените концентрации на хормони в неизвлечени проби трябва да бъдат в рамките на 30 % от номиналните концентрации и колебанията при повторните измервания на една и съща проба не трябва да надвишават 25 % (вж. също таблица 8 за допълнителни критерии за КК).
Prochloraz
Ако тези критерии за КК са изпълнени, приема се, че избраното изследване за измерване на хормони е достатъчно точно и прецизно и при него не се наблюдава кръстосана реактивност с компонентите от средата (матрична проба), в резултат на която би могло да се очаква значително влияние върху резултата от изследването.
Forskolin
В този случай не се изисква извличане на проби преди измерването на хормони.
Atrazine
В случай че критериите за КК в таблици 1 и 8 не са изпълнени, може да е налице значителен матричен ефект и следва да се извърши опит с извлечена белязана проба от среда.
Aminoglutethimide
Пример за схема за извличане е описан в допълнение II към доклада за валидирането (4).
Bisphenol A
Измерванията на концентрациите на хормони в извлечените проби трябва да бъдат направени трикратно.
Exposure of H295R to proficiency chemicals should be conducted in 24 well plates during the laboratory proficiency test.
Ако може да се докаже, че след извличането компонентите на средата не пречат на метода за откриване на хормон, както е определено от критериите за КК, всички по-нататъшни опити следва да се извършват с използване на извлечени проби.
Dosing is in μM for all test chemical doses.
Ако критериите за КК не могат да бъдат изпълнени след извличането, използваната система за измерване на хормони не е подходяща за целта на изследването на стероидогенезата в H295R клетки, и следва да бъде използван алтернативен метод за откриване на хормони.Стандартна крива
Doses should be administered in DMSO at 0,1 % v/v per well.
Хормоналните концентрации в контролните проби на разтворител (SC) следва да бъдат в линейната част на стандартната крива.
All test concentrations should be tested in triplicate wells (Table 6).
За предпочитане е стойностите на SC да са близо до центъра на линейната част, за да се гарантира, че индуцирането/потискането на синтезата на хормони може да бъде измерено.
Separate plates are run for each chemical.
Разрежданията на средата (или екстрактите) за измерване трябва да бъдат съответно избрани.
One QC plate is included with each daily run.
Линейната зависимост следва да се определя чрез подходящ статистически подход.
Cell viability and hormone analyses should be conducted as provided in paragraphs 42 through 46.
Изпитване за пречене на химикала
The threshold value (lowest observed effect concentration, LOEC) and classification decision should be reported and compared with the values in Table 3.
Ако трябва да се извършват изследвания с измерване на хормони на основата на антитела, като ензимно-свързани имуносорбентни анализи (ELISA) и радиоимунни изследвания (RIA), всеки химикал следва, преди започване на действителното изпитване на химикалите, да се анализира за потенциал да пречи на системата за измерване на хормони (Допълнение III от доклада за валидирането (4)), защото някои химикали могат да пречат на тези изпитвания (17).
The data are considered acceptable if they meet the LOEC and decision classification in Table 3.
Ако се наблюдава пречене ≥ 20 % от основното производство на хормони за T и/или E2, както е определено от анализа на хормони, върху всички разреждания на изходния разтвор на изпитвания химикал независимо се провежда изпитването за влияние на химикали върху изследването за хормони (като описаното в раздел 5.0 от Допълнение III към доклада за валидирането (4)) за определяне на праговата доза, при която се наблюдава значително пречене (≥ 20 %).
Threshold values (LOECs) and decision classifications for Proficiency Chemicals
Ако влиянието е по-малко от 30 %, резултатите могат да бъдат коригирани с влиянието.
n/a:
Ако преченето превишава 30 %, данните са невалидни и данните при тези концентрации трябва да се игнорират.
not applicable as no changes should occur after exposure to non-cytotoxic concentrations of negative control.
Ако значително пречене на даден изпитван химикал върху системата за измерване на хормони се наблюдава при повече от една концентрация, която не е цитотоксична, следва да се използва различна система за измерване на хормони.
CAS No
С цел да се избегнат пречения от замърсяване с химикали се препоръчва хормоните да се извличат от средата, като се използва подходящ разтворител — възможни методи могат да бъдат намерени в доклада за валидирането (4).
Decision Classification
Критерии за параметрите за системата за измерване на хормони
+ [22] (Inhibition)
Параметър
+ (Inhibition)
Критерий
+ (Induction)
Чувствителност на метода за измерване
n/a
Граница на количествено определяне (LOQ)
Negative
Ефикасност на извличане на хормоните (само когато е необходимо извличане)
Quality Control Plate
Средният процент на аналитичен добив (въз основа на трикратно повторение на измерването) за внесените добавки от хормони следва да не се отклонява с повече от 30 % от внесеното количество.
The quality control (QC) plate is used to verify the performance of the H295R cells under standard culture conditions, and to establish a historical database for hormone concentrations in solvent controls, positive and negative controls, as well as other QC measures over time.
Пречене на химикала (само системи за измерване на основата на антитела)
H295R cell performance should be assessed using a QC plate for each new ATCC batch or after using a previously frozen stock of cells for the first time unless the laboratory proficiency test (paragraphs 32-34) has been run with that batch of cells.
Не следва да се наблюдава съществена кръстосана реактивност с някой от хормоните, произвеждани от клетките (≥ 30 % от основното производство на хормони за съответния хормон) [19] [20]
A QC plate provides a complete assessment of the assay conditions (e.g. cell viability, solvent controls, negative and positive controls, as well as intra- and inter-assay variability) when testing chemicals and should be part of each test run.
Изпитване за пригодност на лабораторията
The QC test is conducted in a 24-well plate and follows the same incubation, dosing, cell viability/cytotoxicity, hormone extraction and hormone analysis procedures described in paragraphs 38 through 46 for testing chemicals.
Преди изпитването на неизвестни химикали, лабораторията трябва да докаже, че е в състояние да постигне и поддържа подходящи условия за клетъчните култури и условия на изпитването, изисквани за успешното провеждане на изследването, чрез независимо провеждане на изпитването за пригодност на лабораторията.
The QC plate contains blanks, solvent controls, and two concentrations of a known inducer (forskolin, 1, 10 μM) and inhibitor (prochloraz, 0,1, 1 μM) of E2 and T synthesis.
Тъй като извършването на дадено изследване е пряко свързано с персонала на лабораторията, извършващ изследването, тези процедури следва да бъдат частично повтаряни, ако настъпи промяна в персонала на лабораторията.
In addition, MeOH is used in select wells as a positive control for the viability/cytotoxicity assay.
Това изпитване за пригодност се провежда при същите условия, изброени в параграфи 38—40, чрез експозиция на клетки на 7 нарастващи концентрации на силни, умерено силни и слаби индуктори и инхибитори, както и на отрицателен химикал (вж. таблица 2).
A detailed description of the plate layout is provided in Table 4.
По-конкретно, химикалите, които ще бъдат изпитвани, включват силния индуктор форсколин (CAS № 66575-29-9);
The criteria to be met on the QC plate are listed in Table 5.
силния инхибитор прохлораз (CAS № 67747-09-5);
The minimum basal hormone production for T and E2 should be met in both the solvent control and blank wells.
умерено силния индуктор атразин (CAS № 1912-24-9);
Table 4 Quality control plate layout for testing performance of unexposed H295R cells and cells exposed to known inhibitors (PRO = prochloraz) and stimulators (FOR = forskolin) of E2 and T production.
умерено силния инхибитор аминоглутетимид (CAS № 125-84-8);
After termination of the exposure experiment and removal of medium, a 70 % methanol solution will be added to all MeOH wells to serve as a positive control for cytotoxicity (see cytotoxicity assay in Appendix III to the validation report (4))
слабия индуктор (производство на E2) и слабия инхибитор (производство на T) бисфенол А (CAS № 80-05-7);
Blank [23]
и отрицателния химикал човешки хорионен гонадотропин (HCG) (CAS № 9002-61-3), както е показано в таблица 2.
Blank [23](+ MeOH) [24]
Независимо се провеждат изпитвания с отделни плаки за всички химикали, като за целта се използва форматът, показан в таблица 6.
(+ MeOH) [24]
Една плака за КК (таблица 4, параграфи 36—37) следва да бъде включена във всяко ежедневно независимо провеждане на изпитване с химикалите за изпитването за пригодност.
Table 5
Химикали за изпитването за пригодност и концентрации на експозиция
Performance criteria for the Quality Control Plate
Химикал за изпитването за пригодност
Basal Production of hormone in the solvent control (SC)
Концентрации на изпитване [μΜ]
≥ 5 times the LOQ
Прохлораз
≥ 2,5 times the LOQ
Форсколин
Induction (10 μM forskolin)
Атразин
≥ 1,5 times the SC
Аминоглутетимид
≥ 7,5 times the SC
Бисфенол A
Inhibition (1μM prochloraz)
Експозицията на H295R на химикали за изпитването за пригодност следва да се извърши в 24-гнездови плаки по време на изпитването за пригодност на лабораторията.
≤ 0,5 times the SC
Дозирането е в μΜ, за всички дози на изпитвания химикал.
CHEMICAL EXPOSURE PROCEDURE
Дозите следва да бъдат прилагани в DMSO при 0,1 % v/v на гнездо.
The pre-incubated cells are removed from the incubator (paragraph 21) and checked under a microscope to assure that they are in good condition (attachment, morphology) prior to dosing.
Изпитването за всички изпитвани концентрации следва да бъде провеждано трикратно (таблица 6).
The cells are placed in a bio-safety cabinet and the supplemented medium removed and replaced with new supplemented medium (1 ml/well).
Независимо се провеждат изпитвания с отделни плаки за всеки химикал.
DMSO is the preferred solvent for this test method.
Една плака за КК се включва във всяко ежедневно независимо провеждане на изпитване.
However, if there are reasons for using other solvents the scientific rationale should be described.
Анализите на жизнеспособността на клетките и на хормоните следва да се извършват както е предвидено в параграфи 42 до 46.
Cells are exposed to the test chemical by adding 1 μl of the appropriate stock solution in DMSO (see Appendix II to the validation report (4)) per 1 ml supplemented medium (well volume).
Праговата стойност (най-ниската концентрация, при която се наблюдава ефект, LOEC) и решението за класифициране следва да бъдат докладвани и сравнени със стойностите в таблица 3.
This results in a final concentration of 0,1 % DMSO in the wells.
Данните се считат за приемливи, ако отговарят на LOEC и решенията за класифициране в таблица 3.
To assure adequate mixing it is generally preferred that the appropriate stock solution of the test chemical in DMSO is mixed with supplemented medium to yield the desired final concentration for each dose, and the mixture added to each well immediately after removal of old medium.
Прагови стойности (LOEC) и решения за класифициране за химикалите за изпитването за пригодност
If this option is used, the concentration of DMSO (0,1 %) should remain consistent among all wells.
не е приложимо:
The wells containing the greatest two concentrations are visually assessed for formation of precipitates or cloudiness as an indication of incomplete solubility of the test chemical by using a stereo microscope.
не е приложимо, тъй като не следва да настъпват изменения след експозиция на концентрации на отрицателен контрол, които не са цитотоксични.
If such conditions (cloudiness, formation precipitates) are observed, wells containing the next lesser concentrations are examined as well (and so forth) and concentrations that did not completely go into solution are to be excluded from further evaluation and analysis.
CAS №
The plate is returned to the incubator at 37 °C under a 5 % CO2 in air atmosphere for 48 hours.
Решение за класифициране
The test chemical plate layout is shown in Table 6.
+ [22] (Потискане)
Stocks 1 -7 show placement of increasing doses of test chemical.
+ (Потискане)
Table 6
+ (Индукция)
Dosing schematic for the exposure of H295R cells to test chemicals in a 24 well plate
не е приложимо
Stock 4
Отрицателен резултат
Stock 1
Плака за контрол на качеството
Stock1
Плаката за контрол на качеството (КК) се използва за проверка на параметрите на H295R клетките при стандартни условия за отглеждане на културата и за създаване на база данни от предходни изследвания за концентрации на хормони в контроли на разтворител, положителни и отрицателни контроли, както и други мерки за КК във времето.
Stock 5
Параметрите на H295R клетките следва да се оценяват с използване на плака за КК за всяка нова партида от ATCC или след използването на предварително замразени количества клетки за първи път, освен ако независимото провеждане на изпитването за пригодност на лабораторията (параграфи 32—34) е било с тази партида клетки.
Stock 2
Плаката за КК осигурява цялостна оценка на условията на изследването (напр. клетъчна жизнеспособност, контроли на разтворител, положителни и отрицателни контроли, както и вариране в рамките на дадено изследване и между различните изследвания) при изпитване на химикали и следва да бъде част от всяко независимо провеждане на изпитването.
Stock 6
Изпитването за КК се извършва в 24-гнездова плака и следва същите процедури за инкубация, дозиране, клетъчна жизнеспособност/цитотоксичност, извличане на хормони и анализ на хормони, описани в параграфи 38—46 за изпитването на химикали.
Stock 3
Плаката за КК съдържа празни проби, контролни проби на разтворител и две концентрации на известен индуктор (форсколин, 10, 1 μM) и инхибитор (прохлораз, 0,1, 1 μM) на синтезата на E2 и T. В допълнение, в избрани гнезда се използва MeOH като положителна контрола за изследването за жизнеспособност/цитотоксичност.
Stock 7
Подробно описание на структурата на плаката е представено в таблица 4.
After 48 hours the exposure plates are removed from the incubator and every well is checked under the microscope for cell condition (attachment, morphology, degree of confluence) and signs of cytotoxicity.
Критериите, на които трябва да отговаря плаката за КК, са изброени в таблица 5.
The medium from each well is split into two equal amounts (approximately 490 μl each) and transferred to two separate vials appropriately labelled (i.e. one aliquot to provide a spare sample for each well).
Изискването за минимално основно производство на хормони за T и Е2 следва да бъде изпълнено както за гнездата с контролните проби на разтворител, така и в тези с празните проби.
To prevent cells from drying out, medium is removed a row or column at a time and replaced with the medium for the cell viability/cytotoxicity assay.
Таблица 4
If cell viability/cytotoxicity is not to be measured immediately, 200 μl PBS with Ca2+ and Mg2+ is added to each well.
Структура на плаката за контрол на качеството за изпитване на параметрите на неекспонирани H295R клетки и H295R клетки, експонирани на известни инхибитори (PRO = прохлораз) и стимулатори (FOR = форсколин) на производството наE2 и T. След прекратяването на опита с експозицията и отстраняването на средата се добавя 70 % разтвор на метанол към всички гнезда с MeOH, за да служи като положителна контрола за цитотоксичност (вж. изследването за цитотоксичност в допълнение III към доклада за валидирането (4)
The media are frozen at – 80 °C until further processing to analyse hormone concentrations (see paragraphs 44-46).
Празна проба [23]
While T and E2 in medium kept at – 80 °C are generally stable for at least 3 months, hormone stability during storage should be documented within each laboratory.
Празна проба [23](+ MeOH) [24]
Immediately after removing the medium, cell viability/cytotoxicity is determined for each exposure plate.
(+ MeOH) [24]
Cell Viability Determination
Таблица 5
A cell viability/cytotoxicity assay of choice can be used to determine the potential impact of the test chemical on cell viability.
Критерии за параметрите за плаката за контрол на качеството
The assay should be able to provide a true measure of the percentage of viable cells present in a well, or it should be demonstrated that it is directly comparable to (a linear function of) the Live/Dead® Assay (see Appendix III to the validation report (4)).
Основно производство на хормони в контролата на разтворител (SC)
An alternative assay that has been shown to work equally well is the MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] test (18).
≥ 5 пъти LOQ
The assessment of cell viability using the above methods is a relative measurement that does not necessarily exhibit linear relationships with the absolute number of cells in a well.
≥ 2,5 пъти LOQ
Therefore, a subjective parallel visual assessment of each well by the analyst should be conducted, and digital pictures of the SCs and the two greatest non-cytotoxic concentrations are to be taken and archived to enable later assessment of true cell density if this should be required.
Индукция (10 μΜ форсколин)
If by visual inspection or as demonstrated by the viability/cytotoxicity assay there appears to be an increase in cell number, the apparent increase needs to be verified.
≥ 1,5 пъти SC
If an increase in cell numbers is verified, this should be stated in the test report.
≥ 7,5 пъти SC
Cell viability will be expressed relative to the average response in the SCs, which is considered 100 % viable cells, and is calculated as appropriate for the cell viability/cytotoxicity assay that is used.
Потискане (1μM прохлораз)
For the MTT assay, the following formula may be used:
≤ 0,5 пъти SC
% viable cells = (response in well – average response in MeOH treated [= 100 % dead] wells) ÷ (average response in SC wells – average response in MeOH treated [= 100 % dead] wells)
ПРОЦЕДУРА ЗА ЕКСПОЗИЦИЯ НА ХИМИКАЛ
Wells with viability lower than 80 %, relative to the average viability in the SCs (= 100 % viability), should not be included in the final data analysis.
Предварително инкубираните клетки се изваждат от инкубатора (параграф 21) и се проверяват под микроскоп, за да се гарантира, че са в добро състояние (прикрепване, морфология) преди дозирането.
Inhibition of steroidogenesis occurring in the presence of almost 20 % cytotoxicity should be carefully evaluated to ensure that cytotoxicity is not the cause for the inhibition.
Клетките се поставят в камера за биологична безопасност, средата с добавки се отстранява и се заменя с нова среда с добавки (1 ml/гнездо).
Hormone Analysis
DMSO е предпочитаният разтворител за настоящия метод за изпитване.
Each laboratory can use a hormone measurement system of its choice for the analysis of T and E2.
Въпреки това, ако съществуват причини за използване на други разтворители, следва да бъде дадена научна обосновка.
Spare aliquots of medium from each treatment group may be used to prepare dilutions to bring the concentration within the linear part of the standard curve.
Клетките се експонират на изпитвания химикал чрез прибавяне на 1 μl от подходящия изходен разтвор в DMSO (виж допълнение II към доклада за валидирането (4)) в 1 ml среда с добавки (обем на гнездото).
As noted in paragraph 29, each laboratory should demonstrate the conformance of their hormone measurement system (e.g. ELISA, RIA, LC-MS, LC-MS/MS) with the QC criteria by analysing supplemented medium spiked with an internal hormone control prior to conducting QC runs or testing of chemicals.
Това води до крайна концентрация от 0,1 % DMSO в гнездата.
In order to ensure that the components of the test system do not interfere with measurement of hormones, the hormones may need to be extracted from the media prior to their measurement (see paragraph 30 for the conditions under which an extraction is or is not required).
За да се осигури подходящо смесване, като цяло е за предпочитане подходящият изходен разтвор на изпитвания химикал в DMSO да се смесва със средата с добавки за получаване на желаната крайна концентрация за всяка доза, и сместа да се добавя към всяко гнездо веднага след отстраняването на старата среда.
It is recommended to conduct extraction following the procedures in Appendix III to the validation report (4).
Ако се използва този вариант, концентрацията на DMSO (0,1 %) следва да остане еднаква във всички гнезда.
If a commercial test kit is being used to measure the hormone production, the hormone analysis should be conducted as specified in the manuals provided by the test kit manufacturer.
Гнездата, съдържащи двете най-високи концентрации, се проверяват визуално, чрез използване на стереоскопичен микроскоп, за образуване на утайки или за помътняване като показател за непълна разтворимост на изпитвания химикал.
Most manufacturers have a unique procedure by which the hormone analyses are conducted.
Ако се наблюдават такива обстоятелства (помътняване, образуване на утайки), съдържащите следващите по-ниски концентрации гнезда също се преглеждат (и т.н.) и концентрациите, които не са напълно разтворени, трябва да бъдат изключени от по-нататъшна оценка и анализ.
Dilutions of samples need to be adjusted such that expected hormone concentrations for the solvent controls fall within the centre of the linear range of the standard curve of the individual assay (Appendix III to the validation report (4)).