natgillin/translations-raw huggingface dataset:
То не измерва ДХТ и поради това от него не се очаква да открива химикали, които потискат 5α-редуктаза, като в последния случай може да бъде използвано изследване на Hershberger (16).
The H295R cells are cultivated in an incubator at 37 °C with 5 % CO2 in air atmosphere and the medium is renewed 2-3 times per week.
Изследването на стероидогенезата в H295R клетки не открива химикали, които пречат на стероидогенезата чрез оказване на въздействие върху хипоталамус-хипофиза-гонадната ос (ос ХХГ), тъй като това може да бъде изследвано само при невредими животни.
When the cells are approximately 85-90 % confluent, they should be split.
Целта на това изследване е откриването на химикали, които въздействат върху производството на T и E2.
Splitting of the cells is necessary to ensure the health and growth of the cells and to maintain cells for performing bioassays.
Също така T e предшественик в пътя, водещ до производството на E2.
The cells are rinsed three times with phosphate-buffered saline (PBS, without Ca2+ Mg2+.) and freed from the culture flask by the addition of an appropriate detachment enzyme, e.g. trypsin, in PBS (without Ca2+ Mg2+).
Изследването може да открива химикали, които обикновено потискат или индуцират ензимите от стероидогенния път.
Immediately after the cells detach from the culture flask, the enzyme action should be stopped with the addition of supplemented medium at a ratio of 3× the volume used for the enzyme treatment.
Изпитването обикновено се провежда при стандартни условия за клетъчни култури в 24-гнездови плаки.
Cells are placed into a centrifuge tube, centrifuged at room temperature, the supernatant is removed and the pellet of cells is re-suspended in supplemented medium.
Като алтернатива, за изследването могат да бъдат използвани плаки с други размери;
The appropriate amount of cell solution is placed in the new culture flask.
Въпреки това, посяването и условията на опита следва да бъдат съответно коригирани, за да се поддържа спазването на критериите за параметрите.
The amount of cell solution should be adjusted so that the cells are confluent within 5-7 days.
След период на аклиматизация от 24 часа в многогнездови плаки, клетките се експонират за 48 часа на седем концентрации от изпитвания химикал в най-малко три повторения.
The recommended sub-cultivation ratio is 1:3 to 1:4.
Независимо се провежда изпитване с разтворител и познат инхибитор и индуктор на производството на хормони при определена концентрация, като отрицателни и положителни контроли.
The plate should be carefully labelled.
В края на периода на експозиция средата се отстранява от всяко гнездо.
The cells are now ready to be used in the assay and excess cells should be frozen in liquid nitrogen as described in paragraph 20.
Жизнеспособността на клетките във всяко гнездо се анализира незабавно след отстраняването на средата.
Freezing H295R Cells (preparing cells for liquid nitrogen storage)
Концентрациите на хормони в средата могат да бъдат измерени с помощта на различни методи, включително предлагани в търговската мрежа комплекти за измерване на хормони и/или инструментални техники, като например течна хроматография/масспектрометрия (LC-MS).
To prepare H295R cells for freezing, the procedure described above for splitting cells should be followed until the step for re-suspending the pellet of cells in the bottom of the centrifuge tube.
Данните са изразени като кратно на изменението по отношение на контролата на разтворител и най-ниската концентрация, при която се наблюдава ефект (LOEC).
Here, the pellet of cells is re-suspended in freezing medium.
Ако резултатът от изпитването е отрицателен, най-високата изпитвана концентрация се докладва като концентрация без наблюдавано въздействие (NOEC).
The solution is transferred to a cryogenic vial, labelled appropriately, and frozen at – 80 °C for 24 hours after which the cryogenic vial is transferred to liquid nitrogen for storage.
Заключенията относно способността на даден химикал да засегне стероидогенезата следва да се основават на най-малко две независими провеждания на изпитването.
Plating and Pre-incubation of Cells for Testing
Първото независимо провеждане на изпитването може да функционира като независимо провеждане за определяне на обхвата с последващи корекции на концентрациите за независими провеждания 2 и 3, ако е приложимо, ако бъдат срещнати затруднения по отношение на разтворимостта или цитотоксичността, или ако изглежда, че активността на химикала е в края на изпитвания обхват от концентрации.
The number of 24-well plates, prepared as outlined in paragraph 19, that will be needed depends on the number of chemicals to be tested and the confluency of the cells in the culture dishes.
ПРОЦЕДУРА ОТНОСНО КУЛТУРИТЕ
As a general rule, one culture flask (75 cm2) of 80-90 % confluent cells will supply sufficient cells for one to 1,5 (24-well) plates at a target density of 200000 to 300000 cells per ml of medium resulting in approximately 50-60 % confluency in the wells at 24 hours (Figure 2).
Клетъчна линия
This is typically the optimal cell density for hormone production in the assay.
NCI-H295R клетките са достъпни в търговската мрежа от American Type Culture Collections (ATCC) след подписване на Споразумение за трансфер на материал (MTA) [14].
At higher densities, T as well as E2 production patterns are altered.
Въведение
Before conducting the assay the first time, it is recommended that different seeding densities between 200000 and 300000 cells per ml be tested, and the density resulting in 50-60 % confluency in the well at 24 hours be selected for further experiments.
Поради промени в капацитета за производство на E2 с увеличаване на възрастта/броя пасажи (2) клетките следва да бъдат култивирани по специален протокол преди да бъдат използвани, и следва да бъдат отбелязани броят на пасажите от размразяването на клетките, както и номерът на пасажа, при който клетките са били замразени и поставени на съхранение в течен азот.
Photomicrograph of H295R cells at a seeding density of 50 % in a 24 well culture plate at 24 hours taken at the edge (A) and centre (B) of a well
Първото число указва текущия номер на пасажа, а второто число описва номера на пасажа, при който клетките са били замразени и поставени на съхранение.
Necropsy P animals
Например клетките, които са били замразени след петия пасаж и размразени, и след това са преминали през три разделяния (4 пасажа, като прясно размразените клетки се броят за пасаж номер 1), след като са били култивирани отново, следва да бъдат обозначени като пасаж 4.5.
Pre-mating
Пример за схема за номериране е показан в Допълнение I към доклада за валидирането (4).
Post-mating
Като основа за средата с добавки и средата за замразяване се използва изходна среда.
2 weeks
Средата с добавки е необходим компонент при култивирането на клетки.
6 weeks
Средата за замразяване е специално проектирана така, че да позволява замразяване на клетки за продължително съхранение без да се оказва въздействие върху тях.
Pregnancy
Преди употреба, Nu-Serum (или подобен серум с еднакви свойства, за който е доказано, че дава данни, които отговарят на изискванията за параметрите на изпитването и за контрол на качеството (КК)), който е съставка на средата с добавки, трябва да се анализира за фонови концентрации на T и E2.
Lactation
Изготвянето на тези разтвори е описано в Допълнение II към доклада за валидирането (4).
In-utero development
След иницииране на H295R клетъчна култура от оригинална партида от ATCC, клетките трябва да бъдат отглеждани в продължение на пет пасажа (т.е. клетките са разделяни 4 пъти).
Pre-weaning
След това клетките от петия пасаж се замразяват в течен азот за съхранение.
Post-weaning
Преди замразяване на клетките, с проба от клетки от предходния четвърти пасаж независимо се провежда изпитване в плака за КК (виж параграфи 36 и 37), за да се провери дали основното производство на хормони и отговорът на химикали от положителната контрола съответства на критериите за контрол на качеството на изследването, определени в Таблица 5.
Parental generation
H295R клетките трябва да бъдат култивирани, замразени и съхранявани в течен азот, за да се гарантира, че винаги има на разположение клетки от подходящ пасаж/възраст за култивиране и използване.
Cohort
Максималният брой пасажи след започването на култивирането на партида нови [15] или замразени [16] клетки, които са допустими за употреба в изследването на стероидогенезата в H295R клетки, не трябва да превишава 10.
Designation
Например, допустими пасажи за култури от клетки от партида, замразена при пасаж 5, биха били пасажи от 4.5 до 10.5.
Animals/cohort
За клетките, чието култивиране е започнало от тези замразени партиди, трябва да бъде следвана процедурата, описана в параграф 19.
Approximate age at necropsy (weeks)
Тези клетки следва да бъдат култивирани в продължение на най-малко четири (4) допълнителни пасажа (пасаж 4.5) преди да бъдат използвани при изпитването.Започване на култивирането на клетки от замразените количества
Target is 20 litters per group
Процедурата за започване на култивирането на клетки от замразените количества следва да бъде използвана, когато нова партида на клетките се изважда от съхранение в течен азот с цел култивиране и изпитване.
Surplus
Подробности за тази процедура са дадени в допълнение III от доклада за валидирането (4).
Reproductive
Клетките се изваждат от съхранението в течен азот, бързо се размразяват и се поставят в среда с добавки в центрофужна епруветка, центрофугират се при стайна температура, ресуспендират се в среда с добавки и се прехвърлят в колба за клетъчни култури.
Neurotoxicity
Средата трябва да бъде сменена на следващия ден.
Immunotoxicity
H295R клетките се култивират в инкубатор при 37 °C с 5 % CO2 във въздушна атмосфера и средата се подновява 2-3 пъти седмично.
Spares
Когато настъпи приблизително 85—90 % сливане на клетките, те следва да бъдат разделени.
20 M + 20 F
Разделянето на клетките е необходимо, за да се осигури здравето и растежа на клетките и да се поддържат клетки за извършване на биологични изследвания.
10 M + 10 F @
Клетките се промиват три пъти с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS, без Ca2+ и Mg2+) и се отделят от колбата за клетъчни култури чрез добавяне на подходящ ензим за отделяне, напр. трипсин, в PBS (без Ca2+ и Mg2+).
14 or 20-25 if triggered
Непосредствено след като клетките бъдат отделени от колбата за клетъчни култури, действието на ензима следва да бъде прекратено с прибавяне на среда с добавки при съотношение от 3X от обема, използван за третиране с ензима.
@ one per litter and representative of 20 litters in total where possible
Клетките се поставят в центрофужна епруветка, центрофугират се при стайна температура, надутаечната течност се отстранява и клетъчната утайка се ресуспендира в среда с добавки.
The medium is pipetted off the culture flask, and the cells are rinsed 3 times with sterile PBS (without Ca2+Mg2+).
Подходящият обем клетъчен разтвор се поставя в новата колба за клетъчни култури.
An enzyme solution (in PBS) is added to detach the cells from the culture flask.
Обемът на клетъчния разтвор следва да се приспособи така, че клетките да достигнат сливане в рамките на 5—7 дни.
Following an appropriate time for detachment of the cells, the enzyme action should be stopped with the addition of supplemented medium at a ratio of 3 × the volume used for the enzyme treatment.
Препоръчителното съотношение на субкултивиране е от 1:3 до 1:4.
Cells are placed into a centrifuge tube, centrifuged at room temperature, the supernatant is removed, and the pellet of cells is re-suspended in supplemented medium.
Плаката следва да бъде внимателно етикетирана.
The cell density is calculated using e.g. a haemocytometer or cell counter.
Клетките са вече готови за използване при изследването и излишните клетки следва да бъдат замразени в течен азот, както е описано в параграф 20.
The cell solution should be diluted to the desired plating density and thoroughly mixed to assure homogenous cell density.
Замразяване на H295R клетки (подготовка на клетки за съхраняване в течен азот)
The cells should be plated with 1 ml of the cell solution/well and the plates and wells labelled.
За подготовка на H295R клетките за замразяване трябва да бъде следвана описаната по-горе процедура за разделяне на клетките до стъпката по ресуспендиране на клетъчната утайка, образувана на дъното на центрофужната епруветка.
The seeded plates are incubated at 37 °C under 5 % CO2 in air atmosphere for 24 hours to allow the cells to attach to the wells.
На този етап клетъчната утайка се ресуспендира в среда за замразяване.
QUALITY CONTROL REQUIREMENTS
Разтворът се прехвърля в подходящо етикетирана криоепруветка и се замразява при температура – 80 °C за 24 часа, след което криоепруветката се прехвърля в течен азот за съхранение.
It is critical that exact volumes of solutions and samples are delivered into the wells during dosing because these volumes determine the concentrations used in the calculations of assay results.
Поставяне в плаки и предварителна инкубация на клетки за изпитването
Prior to the initiation of cell culture and any subsequent testing, each laboratory should demonstrate the sensitivity of its hormone measurement system (paragraphs 29-31).
Броят на 24-гнездовите плаки, приготвени както е посочено в параграф 19, които ще бъдат необходими, зависи от броя на химикалите, които ще бъдат изпитвани, и от сливането на клетките в блюдата с културите.
If antibody-based hormone measurement assays are to be used, the chemicals to be tested should be analysed for their potential to interfere with the measurement system used to quantify T and E2 as outlined in paragraph 32 prior to initiating testing.
Като общо правило, една колба за клетъчни култури (75 cm2) с 80—90 % достигнали сливане клетки осигурява достатъчно клетки за една до 1,5 (24-гнездова) плака при целева плътност от 200000 до 300000 клетки/ml от среда, водеща до сливане приблизително 50—60 % в гнездата след 24 часа (фигура 2).
DMSO is the recommended solvent for the assay.
Това обичайно е оптималната плътност на клетките за производство на хормони при изследването.
If an alternative solvent is utilised, the following should be determined:
При по-висока плътност моделите на производство на T, както и на E2, се променят.
The solubility of the test chemical, forskolin and prochloraz in the solvent;
Препоръчва се, преди провеждането на изследване за първи път, да бъдат изпитани различни посевни плътности — между 200000 и 300000 клетки/ml — и за последващи изпитвания да бъде избрана плътността, водеща до 50—60 % сливане след 24 часа в гнездото.
The cytotoxicity as a function of the concentration of solvent.
Микрофотография на H295R клетки при плътност на посяване от 50 % в 24-гнездова плака за клетъчни култури след 24 часа, направена на ръба на гнездото (А) и в центъра му (Б)
It is recommended that the maximum allowable solvent concentration should not exceed a 10 × dilution of the least cytotoxic concentration of the solvent.
Аутопсия животни от P
Prior to conducting testing for the first time, the laboratory should conduct a qualifying experiment demonstrating that the laboratory is capable of maintaining and achieving appropriate cell culture and experimental conditions required for chemical testing as described in paragraphs 33-35.
Преди чифтосването
When initiating testing using a new batch, a control plate should be run before using a new batch of cells to evaluate the performance of the cells as described in paragraphs 36 and 37.
След чифтосването
Performance of the Hormone Measurement System
2 седмици
Method sensitivity, accuracy, precision and cross-reactivity with sample matrix
6 седмици
Each laboratory may use a hormone measurement system of its choice for the analysis of the production of T and E2 by H295R cells so long as it meets performance criteria, including the Limit of Quantification (LOQ).
Бременност
Nominally these are 100 pg/ml for T and 10 pg/ml for E2, which are based on the basal hormone levels observed in the validation studies.
Кърмене
However, greater or lower levels may be appropriate depending upon the basal hormone levels achieved in the performing laboratory.
Вътрематочно развитие
Prior to initiation of QC plate and test runs, the laboratory should demonstrate that the hormone assay to be used can measure hormone concentrations in supplemented medium with sufficient accuracy and precision to meet the QC criteria specified in Tables 1 and 5 by analysing supplemented medium spiked with an internal hormone control.
Преди отбиването
Supplemented medium should be spiked with at least three concentrations of each hormone (e.g. 100, 500 and 2500 pg/ml of T; 10, 50 and 250 pg/ml of E2; or the lowest possible concentrations based upon the detection limits of the chosen hormone measurement system can be used for the lowest spike concentrations for T and E2) and analysed.
След отбиването
Measured hormone concentrations of non-extracted samples should be within 30 % of nominal concentrations, and variation between replicate measurements of the same sample should not exceed 25 % (see also Table 8 for additional QC criteria).
Родителско поколение
If these QC criteria are fulfilled it is assumed that the selected hormone measurement assay is sufficiently accurate, precise and does not cross-react with components in the medium (sample matrix) such that a significant influence on the outcome of the assay would be expected.
Кохортa
In this case, no extraction of samples prior to measurement of hormones is required.
Означение
In the case that the QC criteria in Tables 1 and 8 are not fulfilled, a significant matrix effect may be occurring, and an experiment with extracted spiked medium should be conducted.
Животни/кохорта
An example of an extraction procedure is described in Appendix II to the validation report (4).
Приблизителна възраст при аутопсия (седмици)
Measurements of the hormone concentrations in the extracted samples should be made in triplicate.
Целта е 20 котила от група
If it can be shown that after extraction the components of the medium do not interfere with the hormone detection method as defined by the QC criteria, all further experiments should be conducted using extracted samples.
Излишък
If the QC criteria cannot be met after extraction, the utilised hormone measurement system is not suitable for the purpose of the H295R Steroidogenesis Assay, and an alternative hormone detection method should be used.Standard curve
Репродуктивност
The hormone concentrations of the solvent controls (SC) should be within the linear portion of the standard curve.
Невротоксичност
Preferably, the SC values should fall close to the centre of the linear portion to ensure that induction and inhibition of hormone synthesis can be measured.
Имунотоксичност
Dilutions of medium (or extracts) to be measured are to be selected accordingly.
Резервни
The linear relationship is to be determined by a suitable statistical approach.
20 M + 20 Ж
Chemical interference test
10 M + 10 Ж @
If antibody-based assays such as Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISAs) and Radio-Immuno Assays (RIAs) are going to be used to measure hormones, each chemical should be tested for potential interference with the hormone measurement system to be utilised prior to initiation of the actual testing of chemicals (Appendix III to the validation report (4)) because some chemicals can interfere with these tests (17).
14 или 20-25 при задействане
If interference occurs that is ≥ 20 % of basal hormone production for T and/or E2 as determined by hormone analysis, the Chemical Hormone Assay Interference Test (such as described in Appendix III to the validation report (4) section 5.0) should be run on all test chemical stock solution dilutions to identify the threshold dose at which significant (≥ 20 % ) interference occurs.
@ по едно от котило и представителни за общо 20 котила където е възможно
If interference is less than 30 %, results may be corrected for the interference.
Средата се отстранява от колбата за клетъчни култури с пипета и клетките се промиват 3 пъти със стерилен PBS (без Ca2+ и Mg2+).
If interference exceeds 30 %, the data are invalid and the data at these concentrations should be discarded.
Добавя се ензимен разтвор (в PBS) за отделяне на клетките от колбата за клетъчни култури.
If significant interference of a test chemical with a hormone measurement system occurs at more than one non-cytotoxic concentration, a different hormone measurement system should be used.
След даване на достатъчно време за отделяне на клетките действието на ензима следва да бъде прекратено с прибавяне на среда с добавки при съотношение от 3× обема, използван за третиране с ензима.
In order to avoid interference from contaminating chemicals it is recommended that hormones are extracted from the medium using suitable solvent, possible methods can be found in the validation report (4).
Клетките се поставят в центрофужна епруветка, центрофугират се при стайна температура, надутаечната течност се отстранява и клетъчната утайка се ресуспендира в среда с добавки.
Performance criteria for hormone measurement systems
Плътността на клетките се изчислява, като се използва например хемоцитометър или клетъчен брояч.
Parameter
Разтворът с клетките следва да се разреди до желаната плътност в гнездата и щателно да се разбърка, за да се осигури хомогенна плътност на клетките.
Criterion
Клетките следва да бъдат поставени в гнездата с 1 ml от разтвор с клетки във всяко гнездо, и плаките и гнездата следва да бъдат етикетирани.
Measurement Method Sensitivity
Плаките с поставените разтвори с клетки се инкубират при температура 37 °С при 5 % CO2 във въздушна атмосферата в продължение на 24 часа, за да се даде възможност на клетките да се прикрепят към гнездата.
Limit of Quantification (LOQ)
ИЗИСКВАНИЯ ЗА КОНТРОЛ НА КАЧЕСТВОТО
Hormone Extraction Efficiency (only when extraction is needed)
Изключително важно е по време на дозирането в гнездата да бъдат поставени точни обеми от разтвори и проби, тъй като тези обеми определят концентрациите, използвани в изчисленията на резултатите от изследването.
The average recovery rates (based on triplicate measures) for the spiked amounts of hormone should not deviate more than 30 % from amount that was added.
Преди иницииране на клетъчната култура и всякакво последващо изпитване всяка лаборатория трябва да докаже чувствителността на своята система за измерване на хормони (параграфи 29—31).
Chemical Interference (only antibody based systems)
Ако трябва да се извършват изследвания с измерване на хормони на основата на антитела, химикалите, които ще бъдат изпитвани, следва преди започване на изпитанието да се анализират за техния потенциал да пречат на системата за измерване, използвана за количествено определяне на T и E2, както е посочено в параграф 32.
No substantial (≥ 30 % of basal hormone production of the respective hormone) cross-reactivity with any of the hormones produced by the cells should occur [19] [20]
Като разтворител за изследването се препоръчва диметилсулфоксид (DMSO).
Laboratory Proficiency Test
Ако се използва алтернативен разтворител, трябва да се определи следното:
Before testing unknown chemicals, a laboratory should demonstrate that it is capable of achieving and maintaining appropriate cell culture and test conditions required for the successful conduct of the assay by running the laboratory proficiency test.
Разтворимостта на изпитвания химикал, на форсколин и на прохлораз в разтворителя;
As the performance of an assay is directly linked to the laboratory personnel conducting the assay, these procedures should be partly repeated if a change in laboratory personnel occurs.
Цитотоксичността като функция от концентрацията на разтворителя.
This proficiency test will be conducted under the same conditions listed in paragraphs 38 through 40 by exposing cells to 7 increasing concentrations of strong, moderate and weak inducers and inhibitors as well as a negative chemical (see Table 2).
Препоръчва се максимално допустимата концентрация на разтворителя да не превишава 10× разреждане на най-ниската концентрация на разтворителя, при която се появява цитотоксичност.
Specifically, chemicals to be tested include the strong inducer forskolin (CAS No 66575-29-9);