natgillin/translations-raw huggingface dataset:
OECD (2011), Guidance Document on the Current Implementation of Internal Triggers in the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study in the United States and Canada, Series on Testing and Assessment, № 117, ENV/JM/MONO(2011)21, OECD, Paris.
The OECD initiated a high-priority activity in 1998 to revise existing, and to develop new, test guidelines for the screening and testing of potential endocrine disrupting chemicals.
Extended One Generation Reproductive Toxicity Study, Series on Testing and Assessment, № 151, OECD, Paris.
The 2002 OECD Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals comprises five levels, each level corresponding to a different level of biological complexity (1).
Измервания и наблюдения, включени в батерията от функционални изпитвания (Кохорта 2А)
The in vitro H295R Steroidogenesis Assay (H295R) described in this test method utilises a human adreno-carcinoma cell line (NCI-H295R cells) and constitutes a level 2 “in vitro assay, providing mechanistic data”, to be used for screening and prioritisation purposes.
В клетка и на открито
Development and standardisation of the assay as a screen for chemical effects on steroidogenesis, specifically the production of 17β-oestradiol (E2) and testosterone (T), was carried out in a multi–step process.
Свързани с манипулиране
The H295R assay has been optimised and validated (2) (3) (4) (5).
Физиологични
The objective of the H295R Steroidogenesis Assay is to detect chemicals that affect production of E2 and T. The H295R assay is intended to identify xenobiotics that have as their target site(s) the endogenous components that comprise the intracellular biochemical pathway beginning with the sequence of reactions from cholesterol to the production of E2 and/or T. The H295R assay is not intended to identify chemicals that affect steroidogenesis due to effects on the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis.
Стойка
The goal of the assay is to provide a YES/NO answer with regard to the potential of a chemical to induce or inhibit the production of T and E2;
Трудност на изваждане
however, quantitative results may be obtained in some cases (see paragraphs 53 and 54).
Температура
The results of the assay are expressed as relative changes in hormone production compared with the solvent controls (SCs).
Неволни клонични и тонични движения
The assay does not aim to provide specific mechanistic information concerning the interaction of the test chemical with the endocrine system.
Трудност на боравене
Research has been conducted using the cell line to identify effects on specific enzymes and intermediate hormones such as progesterone (2).
Затваряне на клепачите
Definitions and abbreviations used in this test method are described in the Appendix.
Мускулен тонус
A detailed protocol including instructions on how to prepare solutions, cultivate cells and perform various aspects of the test is available as Appendix I-III to the OECD document “Multi-Laboratory Validation of the H295R Steroidogenesis Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol Production” (4).
Реакция на зениците
Five different enzymes catalysing six different reactions are involved in sex steroid hormone biosynthesis.
Пилоерекция
Enzymatic conversion of cholesterol to pregnenolone by the cytochrome P450 (CYP) cholesterol side-chain cleavage enzyme (CYP11A) constitutes the initial step in a series of biochemical reactions that culminate in synthesis of steroid end-products.
Отговор при доближаване
Depending upon the order of the next two reactions, the steroidogenic pathway splits into two paths, the Δ5-hydroxysteroid pathway and Δ4-ketosteroid pathway, which converge in the production of androstenedione (Figure 1).
Големина на зениците
Androstenedione is converted to testosterone (T) by 17β-hydroxysteroid dehydrogenase (17β-HSD).
Слюноотделяне
Testosterone is both an intermediate and end-hormone product.
Отговор при допир
In the male, T can be converted to dihydrotestosterone (DHT) by 5α-reductase, which is found in the cellular membranes, nuclear envelope, and endoplasmic reticulum of target tissues of androgenic action such as prostate and seminal vesicles.
Сълзотечение
DHT is significantly more potent as an androgen than T and is also considered an end-product hormone.
Слухов отговор
The H295R assay does not measure DHT (see paragraph 10).
Издаване на звуци
The enzyme in the steroidogenic pathway which converts androgenic chemicals into oestrogenic chemicals is aromatase (CYP19).
Отговор при ощипване на опашката
CYP19 converts T into 17β-oestradiol (E2) and androstenedione into oestrone.
Изправяне на задни крайници
E2 and T are considered end-product hormones of the steroidogenic pathway.
Рефлекс за връщане в първоначално положение след обръщане
The specificity of the lyase activity of CYP17 differs for the intermediate substrates among species.
Аномалии в походката
In the human, the enzyme favours substrates of the Δ5-hydroxysteroid pathway (pregnenolone), whereas substrates in the Δ4-ketosteroid pathway (progesterone) are favoured in the rat (19).
Разстояние между лапите след пускане от 30 cm на земята
Such differences in the CYP17 lyase activity may explain some species-dependent differences in response to chemicals that alter steroidogenesis in vivo (6).
Събуждане
The H295 cells have been shown to most closely reflect human adult adrenal enzyme expression and steroid production pattern (20), but are known to express enzymes for both the Δ5-hydroxysteroid and Δ4-ketosteroid pathways for androgen synthesis (7) (11) (13) (15).
Сила на захват на предните крайници
Steroidogenic pathway in H295R cells.
Стереотипно поведение
Enzymes are in italics, hormones are bolded and arrows indicate the direction of synthesis.
Сила на захват на задните крайници
Gray background indicates corticosteroid pathways/products.
Необичайно поведение
Sex steroid pathways/products are circled.
Петна
CYP = cytochrome P450;
Аномалии в дишането
HSD = hydroxysteroid dehydrogenase;
Химикал
DHEA = dehydroepiandrosterone.
Вещество или смес.
The human H295R adreno-carcinoma cell line is a useful in vitro model for the investigation of effects on steroid hormone synthesis (2) (7) (8) (9) (10).
Изпитван химикал
The H295R cell line expresses genes that encode for all the key enzymes for steroidogenesis noted above (11) (15) (Figure 1).
Всяко вещество или смес, изпитвано(а) чрез използването на настоящия метод за изпитване.
This is a unique property because in vivo expression of these genes is tissue and developmental stage-specific with typically no one tissue or one developmental stage expressing all of the genes involved in steroidogenesis (2).
Б.57.
H295R cells have physiological characteristics of zonally undifferentiated human foetal adrenal cells (11).
ИЗСЛЕДВАНЕ НА СТЕРОИДОГЕНЕЗАТА В H295R КЛЕТКИ
The cells represent a unique in vitro system in that they have the ability to produce all of the steroid hormones found in the adult adrenal cortex and the gonads, allowing testing for effects on both corticosteroid synthesis and the production of sex steroid hormones such as androgens and oestrogens, although the assay was validated only to detect T and E2.
Настоящият метод за изпитване е еквивалентен на насоките за изпитване на ОИСР (ТG) 456 (2011).
Changes recorded by the test system in the form of alteration in the production of T and E2 can be the result of a multitude of different interactions of test chemicals with steroidogenic functions that are expressed by the H295R cells.
През 1998 г.
These include modulation of the expression, synthesis or function of enzymes involved in the production, transformation, or elimination of steroid hormones (12) (13) (14).
ОИСР стартира с висок приоритет дейност по преразглеждане на съществуващите и по разработване на нови указания за скрининг и изпитвания за потенциално нарушаващи функциите на ендокринната система химикали (1).
Inhibition of hormone production can be due to direct competitive binding to an enzyme in the pathway, impact on co-factors such as NADPH (Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate) and cAMP (cyclic Adenosine Monophosphate), and/or increase in steroid metabolism or suppression of gene expression of certain enzymes in the steroidogenesis pathway.
Концептуалната рамка на ОИСР от 2002 г. за изпитване и оценка на химикали, нарушаващи функциите на ендокринната система, се състои от пет равнища, всяко от които съответства на различно равнище на биологична сложност (1).
While inhibition can be a function of both direct or indirect processes involved with hormone production, induction is typically of an indirect nature, such as by affecting co-factors such as NADPH and cAMP (as in the case of forskolin), decreasing steroid metabolism (13), and or up-regulating steroidogenic gene expression.
Изследването in vitro на стероидогенезата в H295R клетки (H295R), описано в настоящия метод за изпитване, при което се използва клетъчна линия от карцином на кората на надбъбреците при човека (NCI-H295R клетки), представлява равнище 2 „изследване in vitro, предоставящо механистични данни“, които да се използват за целите на скрининга и приоритизирането.
The H295R assay has several advantages:
Разработването и стандартизирането на изследването като скринингово за ефектите от химикали върху стероидогенезата, по-специално върху производството на 17β-естрадиол (E2) и тестостерон (T), беше извършено като процес, включващ няколко стъпки.
It allows for the detection of both increases and decreases in the production of both T and E2;
Изследването в H295R клетки е оптимизирано и валидирано (2)(3)(4)(5).
It permits the direct assessment of the potential impact of a chemical on cell viability/cytotoxicity.
Целта на изследването на стероидогенезата в H295R клетки е да се открият химикали, които въздействат върху производството на E2 и T. Изследването в H295R клетки цели да се идентифицират ксенобиотици, имащи за свое прицелно място или места ендогенните компоненти, които включват вътреклетъчния биохимичен път, започващ с последователността от реакции от холестерола до производството на E2 и/или T. Изследването в H295R клетки не е предназначено за определяне на химикали, които засягат стероидогенезата поради въздействие върху хипоталамус-хипофиза-гонадната ос (ос ХХГ).
This is an important feature as it allows for the discrimination between effects that are due to cytotoxicity from those due to the direct interaction of chemicals with steroidogenic pathways, which is not possible in tissue explants systems that consist of multiple cell types of varying sensitivities and functionalities;
Целта на изследването е да се предостави отговор „ДА/НЕ“ по отношение на потенциала на даден химикал да предизвиква или потиска производството на T и E2;
It does not require the use of animals;
В някои случаи обаче могат да бъдат получени количествени резултати (вж. параграфи 53 и 54).
The H295R cell line is commercially available.
Резултатите от изследването се изразяват като относителни промени в производството на хормони в сравнение с контролните проби на разтворител (КПР).
The principle limitations of the assay are as follows:
Изследването няма за цел да даде специфична механистична информация относно взаимодействието на изпитвания химикал с ендокринната система.
Its metabolic capability is unknown but probably quite limited;
Научните изследвания са проведени с използване на клетъчна линия, за да се идентифицират ефектите върху специфични ензими и хормони предшественици като прогестерон (2).
therefore, chemicals that need to be metabolically activated will probably be missed in this assay.
Определенията и съкращенията, използвани за този метод за изпитване, са описани в Допълнението.
Being derived from adrenal tissue, the H295R possesses the enzymes capable of producing the gluco-, and mineral-corticoids as well as the sex hormones;
Подробен протокол, включително инструкции за начина, по който трябва да се приготвят разтвори и клетъчни култури, и да се извършват различни аспекти на изпитването, е на разположение като допълнение I-III към документ на ОИСР „Многолабораторно валидиране на изследването на стероидогенезата в H295R клетки за идентифициране на модулатори на производството на тестостерон и естрадиол“ (4).
therefore, effects on the production of gluco-, and mineral corticoids could influence the levels of T and E2 observed in the assay.
Пет различни ензима, катализиращи шест различни реакции, са свързани с биосинтезата на полови стероидни хормони.
It does not measure DHT and, therefore, would not be expected to detect chemicals that inhibit 5α-reductase in which case the Hershberger assay (16) can be used.
Превръщането по ензимен път на холестерола в прегненолон чрез ензим (CYP11A), прекъсващ страничната верига на холестерола, от цитохром P450 (CYP), представлява първата крачка в последователност от биохимични реакции, които завършват със синтеза на стероидни крайни продукти.
The H295R assay will not detect chemicals that interfere with steroidogenesis by affecting the hypothalamic-pituitary-gonadal axis (HPG) axis as this can only be studied in intact animals.
В зависимост от порядъка на следващите две реакции, стероидогенният път се разделя на два пътя, Δ5-хидроксистероиден и Δ4-кетостероиден, които се сливат при производството на андростендион (фигура 1).
The purpose of the assay is the detection of chemicals that affect T and E2 production.
Андростендион се преобразува в тестостерон (T) от 17β-хидроксистероиддехидрогеназа (17β-HSD).
T is also an intermediate in the pathway to produce E2.
Тестостеронът е едновременно предшественик и краен продукт.
The assay can detect chemicals that typically inhibit or induce the enzymes of the steroidogenesis pathway.
В мъжкия организъм T може да се преобразува в дихидротестостерон (ДХТ) чрез 5α-редуктаза, която се намира в клетъчните мембрани, ядрената обвивка и ендоплазматичния ретикулум на прицелните за андрогенната активност тъкани, като простатата и семенните мехурчета.
The assay is usually performed under standard cell culture conditions in 24-well culture plates.
ДХТ е значително по-мощен андроген от T и също така се счита за краен продукт.
Alternatively, other plate sizes can be used for conducting the assay;
Изследването на стероидогенезата в H295R клетки не измерва ДХТ (вж. параграф 10).
however, seeding and experimental conditions should be adjusted accordingly to maintain adherence to the performance criteria.
Ензимът в стероидогенния път, който превръща андрогенни химикали в естрогенни химикали, е ароматаза (CYP19).
After an acclimation period of 24 h in multi-well plates, cells are exposed for 48 h to seven concentrations of the test chemical in at least triplicate.
CYP19 превръща T в 17β-естрадиол (E2) и андростендиона в естрон.
Solvent and a known inhibitor and inducer of hormone production are run at a fixed concentration as negative and positive controls.
E2 и T се считат за крайни продукти на стероидогенния път.
At the end of the exposure period, the medium is removed from each well.
Спецификата на лиазната активност на CYP17 е различна при различните видове по отношение на междинните субстрати.
Cell viability in each well is analysed immediately after removal of medium.
При човека ензимът благоприятства субстрати на Δ5-хидроксистероидния път (прегненолон), докато при плъховете се благоприятстват субстрати от Δ4-кетостероидния път (прогестерон) (19).
Concentrations of hormones in the medium can be measured using a variety of methods including commercially available hormone measurement kits and/or instrumental techniques such as liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS).
Тези разлики в лиазната активност на CYP17 могат да обяснят някои различия при отделните видове в отговора на химикали, които променят стероидогенезата in vivo (6).
Data are expressed as fold change relative to the solvent control and the Lowest-Observed-Effect-Concentration (LOEC).
H295R клетките са показали, че съответстват в най-голяма степен на модела на генната експресия чрез ензими и производството на стероиди в надбъбречната жлеза на полово зрели хора (20), но е известно, че при тях експресията е чрез ензими както за Δ4-хидроксистероидния, така и за Δ5-кетостероидния път за синтеза на андрогени (7)(11)(13)(15).
If the assay is negative, the highest concentration tested is reported as the No-Observed-Effect-Concentration (NOEC).
Стероидогенен път в H295R клетки.
Conclusions regarding the ability of a chemical to affect steroidogenesis should be based on at least two independent test runs.
Ензимите са в курсив, хормоните са с удебелен шрифт, а стрелките указват посоката на синтезата.
The first test run may function as a range finding run with subsequent adjustment of concentrations for runs 2 and 3, if applicable, if solubility or cytotoxicity problems are encountered or the activity of the chemical seems to be at the end of the range of concentrations tested.
Сивият фон показва кортикостероидни пътища/продукти.
CULTURE PROCEDURE
Пътищата/продуктите, свързани с половите стероидни хормони, са оградени в кръг.
Cell Line
CYP = цитохром P450;
The NCI-H295R cells are commercially available from the American Type Culture Collections (ATCC) upon signing a Material Transfer Agreement (MTA) [14].
HSD = хидроксистероиддехидрогеназа;
Introduction
DHEA = дехидроепиандростерон.
Due to changes in the E2 producing capacity of the cells with increasing age/passages (2), cells should be cultured following a specific protocol before they are used and the number of passages since the cells were defrosted as well as the passage number at which the cells were frozen and placed in liquid nitrogen storage should be noted.
Моделът in vitro с клетъчна линия (H295R клетки) от карцином на кората на надбъбреците при човека е полезен за изследване на ефектите върху синтезата на стероидни хормони (2)(7)(8)(9)(10).
The first number indicates the actual cell passage number and the second number describes the passage number at which the cells were frozen and placed in storage.
Клетъчната линия H295R експресира гени, кодиращи всички посочени по-горе ключови ензими за стероидогенезата (11)(15) (Фигура 1).
For example, cells that were frozen after passage five and defrosted and then were split three times (4 passages counting the freshly thawed cells as passage 1) after they were cultured again would be labelled passage 4.5.
Това е уникално свойство, защото експресията in vivo на тези гени е зависима от тъканите и етапа на развитие на организма, като обичайно една отделно взета тъкан или етап на развитие на организма не експресира всички гени, участващи в стероидогенезата (2).
An example of a numbering scheme is illustrated in Appendix I to the validation report (4).
H295R клетките притежават физиологични характеристики на зонално недиференцирани фетални клетки от надбъбречната жлеза при човека (11).
Stock medium is used as the base for the supplemented and freezing mediums.
Клетките представляват система in vitro, която е уникална с това, че те могат да произвеждат всички стероидни хормони, установени в кората на надбъбречната жлеза и гонадите при полово зрели хора, с което позволяват изпитване за ефектите както върху кортикостероидната синтеза, така и върху производството на полови стероидни хормони, като например андрогени и естрогени, въпреки че изследването е валидирано само за откриване на T и E2.
Supplemented medium is a necessary component for culturing cells.
Измененията, записани от системата за изпитване под формата на промяна в производството на T и E2, могат да бъдат в резултат от множество различни взаимодействия на изпитваните химикали със стероидогенни функции, които се експресират от H295R клетките.
Freezing medium is specifically designed to allow for impact-free freezing of cells for long-term storage.
Те включват модулация на експресията, синтезата или функцията на ензими, участващи в производството, преобразуването или елиминирането на стероидни хормони (12)(13)(14).
Prior to use, Nu-serum (or a comparable serum of equal properties that has been demonstrated to produce data that meets the test performance and Quality Control (QC) requirements), which is a constituent of supplemented media, should be analysed for background T and E2 concentrations.
Потискането на производството на хормони може да се дължи на пряко конкурентно свързване с ензим от метаболитния път, на въздействие върху кофактори като НАДФ (никотинамидадениндинуклеотидфосфат) и цАМФ (цикличен аденозинмонофосфат), и/или на увеличение на стероидния метаболизъм или потискане на генната експресия по отношение на някои ензими в стероидогенния път.
The preparation of these solutions is described in Appendix II to the validation report (4).
Докато потискането може да бъде функция както на преки, така и на косвени процеси, свързани с производството на хормони, индуцирането обикновено има непряк характер, като например чрез въздействие върху кофактори като НАДФ и цАМФ (както при форсколин), намаляване на стероидния метаболизъм (13), и/или положително регулиране на генната експресия при стероидогенезата.
After initiation of an H295R cell culture from an original ATCC batch, cells should be grown for five passages (i.e.the cells are split 4 times).
Изследването на стероидогенезата в H295R клетки има няколко предимства:
Passage five cells are then frozen in liquid nitrogen for storage.
Дава възможност за откриване както на увеличения, така и на намаления в производството както на T, така и на E2;
Prior to freezing the cells, a sample of the previous passage four cells is run in a QC plate (See paragraph 36 and 37) to verify whether the basal production of hormones and the response to positive control chemicals meet the assay quality control criteria as defined in Table 5.
Позволява пряка оценка на потенциалното въздействие на химикалите върху клетъчната жизнеспособност/цитотоксичността.
H295R cells need to be cultured, frozen and stored in liquid nitrogen to make sure that there are always cells of the appropriate passage/age available for culture and use.
Това е важна характеристика, тъй като позволява различаване на ефектите, които се дължат на цитотоксичността, от дължащите се на прякото взаимодействие между химикали и стероидогенни пътища, което не е възможно в системи от тъканни експланти, които се състоят от множество видове клетки с различни степени на чувствителност и функционалност;
The maximum number of passages after taking a new [15] or frozen [16] batch of cells into culture that is acceptable for use in the H295R assay should not exceed 10.
То не изисква използването на животни;
For example, acceptable passages for cultures of cells from a batch frozen at passage 5 would be 4.5 through 10.5.
Клетъчна линия H295R се предлага в търговската мрежа.
For cells started from these frozen batches, the procedure described in paragraph 19 should be followed.
Основните ограничения на изследването са, както следва:
These cells should be cultured for at least four (4) additional passages (passage 4.5) prior to their use in testing.Starting Cells from the Frozen Stock
Неговият метаболитен капацитет е неизвестен, но вероятно доста ограничен;
The procedure for starting the cells from frozen stock is to be used when a new batch of cells is removed from liquid nitrogen storage for the purpose of culture and testing.
следователно химикали, които е необходимо да бъдат метаболитно активирани, вероятно ще бъдат пропуснати при това изследване.
Details for this procedure are set forth in Appendix III to the validation report (4).
Тъй като произхожда от тъкан на надбъбречната жлеза, H295R притежава ензимите, способни да произвеждат глюкокортикоиди и минералкортикоиди, както и полови хормони;
Cells are removed from liquid nitrogen storage, thawed rapidly, placed in supplemented medium in a centrifuge tube, centrifuged at room temperature, re-suspended in supplemented medium, and transferred to a culture flask.
поради това ефектите върху производството на глюкокортикоиди и минералкортикоиди биха могли да окажат въздействие върху равнищата на T и E2, наблюдавани при изследването.
The medium should be changed the following day.