natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Тъканите (или тъканните хомогенати) следва да се съхраняват при температура – 70 °С или по-ниска, и да се използват за изолиране на ДНК в рамките на 5 години.
stability of the test chemical, if known;
Изолираната ДНК, съхранявана в охладено състояние при 4 °С в подходящ буфер, следва да се използва оптимално за анализ на мутации в рамките на 1 година.
Solvent/vehicle:
Селекция на тъкани за анализ на мутанти
justification for choice of vehicle;
Изборът на тъкани трябва да бъде основан на съображения като:
solubility and stability of the test chemical in the solvent/vehicle, if known;
пътя на прилагане или мястото на първия контакт (напр. жлезист стомах при прилагане по орален път, бял дроб при прилагане чрез инхалация, или кожа при локално прилагане);
preparation of dietary, drinking water or inhalation formulations;
и 2) наблюдаваните фармакокинетични параметри в изследвания за обща токсичност, които показват свързаното с тъканта елиминиране, задържане или натрупване, или прицелните органи за токсичността.
analytical determinations on formulations (e.g. stability, homogeneity, nominal concentrations);
Ако са извършени последващи изследвания за канцерогенност, трябва да бъдат взети под внимание прицелните тъкани за канцерогенност.
species/strain used and justification for the choice;
Изборът на тъкани за анализ следва да увеличи до максимум откриването на химикали, които са мутагени с пряко действие in vitro, бързо метаболизират, имат висока реактивоспособност или се абсорбират слабо, или онези, за които прицелната тъкан се определя от пътя на прилагане (6).
number, age and sex of animals;
При липсата на съпътстваща информация и като се вземе предвид мястото на контакт, дължащо се на пътя на прилагане, черният дроб и още поне една тъкан с висока скорост на протичане на деленето (напр. жлезист стомах, костен мозък) следва да бъдат оценени за мутагенност.
source, housing conditions, diet, etc.;
В повечето случаи горепосочените изисквания могат да се постигнат от анализи на две внимателно подбрани тъкани, но в някои случаи ще са необходими три или повече.
individual weight of the animals at the start of the test, including body weight range, mean and standard deviation for each group;
Ако има причини за конкретна загриженост относно ефектите върху зародишните клетки, включително положителни отговори при соматични клетки, следва тъкани от зародишни клетки да бъдат оценени за мутации.
positive and negative (vehicle/solvent) control data;
Методи за измерване
data from the range-finding study;
Стандартни лабораторни или публикувани методи за откриване на мутанти са на разположение за препоръчваните трансгенни модели:
details of test chemical preparation;
ламбда бактериофаги и плазмиди, носещи lacZ (30);
rationale for route of administration;
мишки, носещи lacI (2)(18);
methods for measurement of animal toxicity, including, where available, histopathological or haematological analyses and the frequency with which animal observations and body weights were taken;
мишки, носещи gpt delta (22);
methods for verifying that the test chemical reached the target tissue, or general circulation, if negative results are obtained;
плъхове, носещи gpt delta (28);
actual dose (mg/kg body weight/day) calculated from diet/drinking water test chemical concentration (ppm) and consumption, if applicable;
Измененията следва да бъдат обосновани и надлежно документирани.
details of food and water quality;
Данните от множество опакования могат да бъдат обобщени и използвани за постигане на достатъчен брой плаки или колонии.
detailed description of treatment and sampling schedules and justifications for the choices;
Независимо от това, необходимостта от голям брой реакции по опаковане за постигане на достатъчен брой плаки може да е показател за наличието на ниско качество на ДНК.
method of euthanasia;
В такива случаи към данните трябва да се подхожда предпазливо, тъй като те могат да са ненадеждни.
procedures for isolating and preserving tissues;
Оптималният общ брой плаки или колонии от проба ДНК се регулира от статистическата вероятност за откриване на достатъчен брой мутанти при дадена честота на мутанти при спонтанна мутация.
methods for isolation of rodent genomic DNA, rescuing the transgene from genomic DNA, and transferring transgenic DNA to a bacterial host;
Като цяло се изискват най-малко 125000 до 300000 плаки, ако честотата на мутанти при спонтанна мутация е от порядъка на 3 × 10–5 (15).
source and lot numbers of all cells, kits and reagents (where applicable);
За изследването с Big Blue®, носещи lacI, е важно да се докаже, че целият набор от фенотипове на мутанти с определен цвят може да бъде открит посредством включването на подходящи контроли с определен цвят паралелно с всяко поставяне в гнезда.
methods for enumeration of mutants;
Тъканите и получените проби (единици) следва да бъдат обработени и анализирани с използването на блокова схема, в която елементите от контролната група на разтворител/носител, положителната контролна група (ако се използва) или положителната контролна ДНК (където е уместно) и всяка една от третираните групи се обработват заедно.
methods for molecular analysis of mutants and use in correcting for clonality and/or calculating mutation frequencies, if applicable;
Обработка на резултатите
Results:
Индивидуалните данни за животните следва да се представят в таблица.
animal condition prior to and throughout the test period, including signs of toxicity;
Опитната единица е животното.
body and organ weights at sacrifice;
Докладът следва да включва общия брой образуващи плака единици (pfu) или образуващи колония единици (cfu), броя на мутантите, и честотата на мутантите за всяка тъкан от всяко животно.
for each tissue/animal, the number of mutants, number of plaques or colonies evaluated, mutant frequency;
Ако има множество реакции на опаковане/изолиране, следва да се докладва броят на реакциите на проба от ДНК.
for each tissue/animal group, number of packaging reactions per DNA sample, total number of mutants, mean mutant frequency, standard deviation;
Макар че данните за всяка отделна реакция трябва да бъдат съхранени, само общите pfu или cfu трябва да бъдат докладвани.
dose-response relationship, where possible;
Трябва да бъдат докладвани данните за токсичност и клиничните признаци, както е посочено в параграф 34.
for each tissue/animal, the number of independent mutants and mean mutation frequency, where molecular analysis of mutations was performed;
Трябва да бъдат представени всички резултати от определянето на първичната структура за всеки анализиран мутант, и да бъдат посочени изчисленията на честотата на мутация в резултат от тях за всяко животно и тъкан.
concurrent and historical negative control data with ranges, means and standard deviations;
Статистическа оценка и тълкуване на резултатите
concurrent positive control (or non-concurrent DNA positive control) data;
Има няколко критерия за определяне на положителен резултат, като например свързано с дозата увеличение на честотата на мутантите или явно увеличение на честотата на мутантите в група с еднократна доза в сравнение с контролната група на разтворител/носител.
analytical determinations, if available (e.g. DNA concentrations used in packaging, DNA sequencing data);
Най-малко три третирани с определена доза групи трябва да бъдат анализирани, за да бъдат получени достатъчно данни за анализ доза-отговор.
statistical analyses and methods applied;
Независимо от това, че първостепенното съображение следва да е биологичната относимост, могат да се използват подходящи статистически методи като помощно средство за оценката на резултатите от изпитването (4)(14)(15)(25)(26).
Conclusion
При използваните статистически изпитвания за опитна единица следва да се счита животното.
Skopek (1987), “Statistical Test for the Comparison of Samples from Mutational Spectra”, J. Mol.
Изпитван химикал, за който резултатите не удовлетворяват горните критерии, се смята за немутагенен в настоящото изследване.
, “A more Efficient Big Blue® Protocol Improves Transgene Rescue and Accuracy in an Adduct and Mutation Measurement”, Mutation Res., 518:
За биологичната относимост на даден отрицателен резултат следва да бъде потвърдена експозицията на тъканта.
Gossen and J. Vijg (1995), “Plasmid-based Transgenic Mouse Model for Studying in vivo Mutations”Nature, 377(6550):
За подпомагане при тълкуването на резултатите от анализите за определяне на първичната структура на ДНК на разположение са редица статистически подходи (1)(5)(9)(19).
Gorelick (1995), “Statistical Design and Analysis of Mutation Studies in Transgenic Mice”, Environ.
Проучването дали наблюдаваните стойности са в рамките на контролния обхват от предходни изследвания, или извън него, може да осигури насоки при оценката на биологичната значимост на отговора (32).
Gorelick (1996), “Mutational Spectra in Transgenic Animal Research: Data Analysis and Study Design Based upon the Mutant or Mutation Frequency”, Environ.
данни за идентификация и CAS №, ако са известни;
Brooks, B. Burlinson, J. Mirsalis, B. Myhr, L. Recio and V. Thybaud (1999), “Transgenic Mouse Mutation Assay Systems can Play an important Role in Regulatory Mutagenicity Testing in vivo for the Detection of Site-of-contact Mutagens”, Mutagenesis, 14(1):
източник, номер на партидата, при наличност;
Soper(1995), “Temporal and Molecular Characteristics of Mutations Induced by Ethylnitrosourea in Germ Cells Isolated from Seminiferous Tubules and in Spermatozoa of lacZ Transgenic Mice”, Proc.
физическа природа и чистота;
Soper and J. Jiao (1997), “Toward an Understanding of the Use of Transgenic Mice for the Detection of Gene Mutations in Germ Cells”, Mutation Res., 388(2-3):
физични и химични свойства, относими към провеждането на изследването;
Tindall (2000), “Bayesian Analysis of Mutational Spectra”, Genetics, 156:
стабилност на изпитвания химикал, ако е известна;
Knook and J. Vijg(1989), “Efficient Rescue of Integrated Shuttle Vectors from Transgenic Mice: a Model for Studying Mutations in vivo”, Proc.
Разтворител/носител:
Gossen, J.A. and J. Vijg (1993), “A Selective System for lacZ-Phage using a Galactose-sensitive E. coli Host”, Biotechniques, 14(3):
обосновка за изборa на носител;
, “Somatic Gene Mutation and Human Disease other than Cancer”, Mutation Res., 543:
разтворимост и стабилност на изпитвания химикал в разтворител/носител, ако са известни;
, “Somatic Gene Mutation and Human Disease other than Cancer: an Update”, Mutation Res., 705:
изготвяне на рецептурите за хранителен режим, питейна вода или инхалация;
Douglas and D. Krewski (1998), “Statistical Analysis of lacZ Mutant Frequency Data from Muta™Mouse Mutagenicity Assays”, Mutagenesis, 13(3):
аналитични определяния, свързани с рецептурите (напр. устойчивост, хомогенност, номинални концентрации);
Skopek, V. Thybaud, K.R.Tindall and N. Yajima (2000), “In vivo Transgenic Mutation Assays”, Environ.
използван вид/порода и обосновка за избора;
Douglas (2003), “Treatment and Sampling Protocols for Transgenic Mutation Assays”, Environ.
брой, възраст и пол на животните;
Muller, B. Paul, S. Adhya and S. Garges (1996), “Analysis of Genetic Instability during Mammary Tumor Progression using a novel Selection-based Assay for in vivo Mutations in a Bacteriophage λ Transgene Target”, Proc.
източник, условия на отглеждане, хранителен режим и т.н.;
Short (1990), “The Use of Transgenic Mice for Short-term, in vivo Mutagenicity Testing”, Genet.
индивидуално тегло на животните в началото на изпитването, в т.ч. обхват на телесното тегло, средни стойности и стандартно отклонение за всяка група;
Burns (2008), “Comparison of Induced and Cancer-associated Mutational Spectra using Multivariate Data Analysis”, Carcinogenesis, 29(4):
положителни и отрицателни (носител/разтворител) контролни данни;
Nohmi, T., M. Katoh, H. Suzuki, M. Matsui, M. Yamada, M. Watanabe, M. Suzuki, N. Horiya, O. Ueda, T. Shibuya, H. Ikeda and T. Sofuni (1996), “A new Transgenic Mouse Mutagenesis Test System using Spi– and 6-thioguanine Selections”, Environ.
данни от изследването за установяване на обхвата;
Nohmi, T., M. Suzuki, K. Masumura, M. Yamada, K. Matsui, O. Ueda, H. Suzuki, M. Katoh, H. Ikeda and T. Sofuni (1999), “Spi– Selection: an Efficient Method to Detect γ-ray-induced Deletions in Transgenic Mice”, Environ.
подробности за приготвянето на изпитвания химикал;
Masumura (2000), “Recent Advances in the Protocols of Transgenic Mouse Mutation Assays”, Mutation Res., 455(1–2):
обосновка на пътя на прилагане;
OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, No 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
методи за измерване на токсичността за животните, включително, когато е необходимо, хистопатологични или хематологични анализи и честота, с която са правени наблюдения върху животните или е измервано телесното тегло;
OECD (2009), Detailed Review Paper on Transgenic Rodent Mutation Assays, Series on Testing and Assessment, No 103, ENV/JM/MONO(2009)7, OECD, Paris.
методи за проверка дали изпитваният химикал е достигнал до прицелната тъкан, или до общото кръвообращение, ако са получени отрицателни резултати;
Tindall (1995), “Study Design and Sample Sizes for a lacI Transgenic Mouse Mutation Assay”, Environ.
действителна доза (mg/kg телесно тегло дневно), изчислена от концентрацията на изпитвания химикал в хранителния режим/питейната вода (ppm), и консумация, ако е приложимо;
Gorelick (1997), “Sources of Variability in Data from a Positive Selection lacZ Transgenic Mouse Mutation Assay: an Interlaboratory Study”, Mutation.
подробности относно качество на храната и водата;
Yauk (2006), “Detection of Induced Male Germline Mutation: Correlations and Comparisons between Traditional Germline Mutation Assays, Transgenic Rodent Assays and Expanded Simple Tandem Repeat Instability Assays”, Mutation.
подробно описание на графиците на третиране и вземане на проби и обосновки за направения избор;
Kurata, M. Takamune, M. Yamada, H. Sanada, T. Umemura, A. Nishikawa and T. Nohmi (2010), “Integration of in vivo Genotoxicity and Short-term Carcinogenicity Assays using F344 gpt delta Transgenic Rats: in vivo Mutagenicity of 2,4-diaminotoluene and 2,6-diaminotoluene Structural Isomers”, Toxicol.
метод за умъртвяване;
Martus, J.C. Mirsalis, T. Suzuki and N. Yajima (2003), “In vivo Transgenic Mutation Assays”, Mutation Res., 540:
процедури за изолиране и съхраняване на тъкани;
Douglas (1996), “Bacteriophage λ and Plasmid lacZ Transgenic Mice for studying Mutations in vivo” in:
методи за изолиране на геномна ДНК на гризачи, отделяне на трансгена от геномната ДНК и включване на трансгенна ДНК в бактерия гостоприемник;
Douglas (2005), “A lacZ Transgenic Mouse Assay for the Detection of Mutations in Follicular Granulosa Cells”, Mutation Res., 578(1-2):
източник и номера на партиди за всички клетки, комплекти и реагенти (когато е приложимо);
Martus, V. Thybaud (2011), “Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data”, Mutation Res., doi:10.1016/j.mrgentox.2010.09.007.
методи за изброяване на мутантите;
OECD (2011), Retrospective Performance Assessment of OECD Test Guideline on Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays, Series on Testing and Assessment, No 145, ENV/JM/MONO(2011)20, OECD, Paris.
методи за молекулярен анализ на мутанти и използване при корекция за клоналност и/или изчисляване на честоти на мутация, ако е приложимо;
, “Kinetics of spermatogenesis in mammals seminiferous epithelium cycle and spermatogonial renewal”.
Резултати:
, “The Epididymis”, in Neil, J.D., Pfaff, D.W., Chalis, J.R.G., de Kretser, D.M., Richards, J.S., and P. M, Wassarman (eds.), Physiology of Reproduction, Elsevier, the Netherlands, pp. 1071-1148.
състояние на животните преди и през целия период на изпитване, включително признаци на токсичност;
, “Effects of male germ-cell stage on the frequency, nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse”, Genetica, 122:
телесно тегло и тегло на органи при умъртвяването;
Administration period
за всяка тъкан/животно — брой на мутантите, брой на оценените плаки или колонии, честота на мутантите;
the total period during which an animal is dosed.
за всяка тъкан/група животни — брой на реакциите на опаковане на проба от ДНК, общ брой на мутантите, средна честота на мутантите, стандартно отклонение;
Base pair substitution
взаимоотношение доза-отговор, където е възможно;
a type of mutation that causes the replacement of a single DNA nucleotide base with another DNA nucleotide base.
за всяка тъкан/животно — брой на независимите мутанти и средна честота на мутация, където е бил извършен молекулярен анализ;
Capsid
паралелни отрицателни контролни данни и отрицателни контролни данни от предишни изследвания, с обхвати, средни стойности и стандартни отклонения;
the protein shell that surrounds a virus particle.
паралелни положителни контролни данни (или ДНК от предходно третирани като положителни контроли животни);
a substance or a mixture.
аналитични определения, ако има такива (например концентрации на ДНК, използвани при пакетиране, данни за определяне на първичната структура на ДНК);
Clonal expansion
статистически анализи и използвани методи;
the production of many cells from a single (mutant) cell.
Заключение
Colony-forming unit (cfu)
Skopek (1987), „Statistical Test for the Comparison of Samples from Mutational Spectra“, J. Mol.
a measure of viable bacterial numbers.
, „A more Efficient Big Blue® Protocol Improves Transgene Rescue and Accuracy in an Adduct and Mutation Measurement“, Mutation Res., 518:
Concatamer
Gossen and J. Vijg (1995), „Plasmid-based Transgenic Mouse Model for Studying in vivo Mutations“Nature, 377(6550):
a long continuous biomolecule composed of multiple identical copies linked in series.
Gorelick (1995), „Statistical Design and Analysis of Mutation Studies in Transgenic Mice“, Environ.
Cos site
Gorelick (1996), „Mutational Spectra in Transgenic Animal Research: Data Analysis and Study Design Based upon the Mutant or Mutation Frequency“, Environ.
a 12-nucleotide segment of single-stranded DNA that exists at both ends of the bacteriophage lambda's double-stranded genome.
Brooks, B. Burlinson, J. Mirsalis, B. Myhr, L. Recio and V. Thybaud (1999), „Transgenic Mouse Mutation Assay Systems can Play an important Role in Regulatory Mutagenicity Testing in vivo for the Detection of Site-of-contact Mutagens“, Mutagenesis, 14(1):
Deletion
Soper(1995), „Temporal and Molecular Characteristics of Mutations Induced by Ethylnitrosourea in Germ Cells Isolated from Seminiferous Tubules and in Spermatozoa of lacZ Transgenic Mice“, Proc.
a mutation in which one or more (sequential) nucleotides is lost by the genome.
Soper and J. Jiao (1997), „Toward an Understanding of the Use of Transgenic Mice for the Detection of Gene Mutations in Germ Cells“, Mutation Res., 388(2-3):
Electroporation
Tindall (2000), „Bayesian Analysis of Mutational Spectra“, Genetics, 156:
the application of electric pulses to increase the permeability of cell membranes.
Knook and J. Vijg(1989), „Efficient Rescue of Integrated Shuttle Vectors from Transgenic Mice: a Model for Studying Mutations in vivo“, Proc.
Endogenous gene
Gossen, J.A. and J. Vijg (1993), „A Selective System for lacZ-Phage using a Galactose-sensitive E. coli Host“, Biotechniques, 14(3):
a gene native to the genome.
, „Somatic Gene Mutation and Human Disease other than Cancer“, Mutation Res., 543:
Extrabinomial variation
, „Somatic Gene Mutation and Human Disease other than Cancer: an Update“, Mutation Res., 705:
greater variability in repeat estimates of a population proportion than would be expected if the population had a binomial distribution.
Douglas and D. Krewski (1998), „Statistical Analysis of lacZ Mutant Frequency Data from Muta™Mouse Mutagenicity Assays“, Mutagenesis, 13(3):
Frameshift mutation
Skopek, V. Thybaud, K.R.Tindall and N. Yajima (2000), „In vivo Transgenic Mutation Assays“, Environ.
a genetic mutation caused by insertions or deletions of a number of nucleotides that is not evenly divisible by three within a DNA sequence that codes for a protein/peptide.
Douglas (2003), „Treatment and Sampling Protocols for Transgenic Mutation Assays“, Environ.
Insertion
Muller, B. Paul, S. Adhya and S. Garges (1996), „Analysis of Genetic Instability during Mammary Tumor Progression using a novel Selection-based Assay for in vivo Mutations in a Bacteriophage λ Transgene Target“, Proc.
the addition of one or more nucleotide base pairs into a DNA sequence.
Short (1990), „The Use of Transgenic Mice for Short-term, in vivo Mutagenicity Testing“, Genet.
Jackpot
Burns (2008), „Comparison of Induced and Cancer-associated Mutational Spectra using Multivariate Data Analysis“, Carcinogenesis, 29(4):
a large number of mutants that arose through clonal expansion from a single mutation.
Nohmi, T., M. Katoh, H. Suzuki, M. Matsui, M. Yamada, M. Watanabe, M. Suzuki, N. Horiya, O. Ueda, T. Shibuya, H. Ikeda and T. Sofuni (1996), „A new Transgenic Mouse Mutagenesis Test System using Spi– — and 6-thioguanine Selections“, Environ.
Large deletions
Nohmi, T., M. Suzuki, K. Masumura, M. Yamada, K. Matsui, O. Ueda, H. Suzuki, M. Katoh, H. Ikeda and T. Sofuni (1999), „Spi– Selection: an Efficient Method to Detect γ-ray-induced Deletions in Transgenic Mice“, Environ.
deletions in DNA of more than several kilobases (which are effectively detected with the Spi- selection and the lacZ plasmid assays).
Masumura (2000), „Recent Advances in the Protocols of Transgenic Mouse Mutation Assays“, Mutation Res., 455(1–2):
Ligation
OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, № 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
the covalent linking of two ends of DNA molecules using DNA ligase.
OECD (2009), Detailed Review Paper on Transgenic Rodent Mutation Assays, Series on Testing and Assessment, № 103, ENV/JM/MONO(2009)7, OECD, Paris.
Mitogen
Tindall (1995), „Study Design and Sample Sizes for a lacI Transgenic Mouse Mutation Assay“, Environ.
a chemical that stimulates a cell to commence cell division, triggering mitosis (i.e. cell division).
Gorelick (1997), „Sources of Variability in Data from a Positive Selection lacZ Transgenic Mouse Mutation Assay: an Interlaboratory Study“, Mutation.
Neutral gene
Yauk (2006), „Detection of Induced Male Germline Mutation: Correlations and Comparisons between Traditional Germline Mutation Assays, Transgenic Rodent Assays and Expanded Simple Tandem Repeat Instability Assays“, Mutation.
a gene that is not affected by positive or negative selective pressures.
Kurata, M. Takamune, M. Yamada, H. Sanada, T. Umemura, A. Nishikawa and T. Nohmi (2010), „Integration of in vivo Genotoxicity and Short-term Carcinogenicity Assays using F344 gpt delta Transgenic Rats: in vivo Mutagenicity of 2,4-diaminotoluene and 2,6-diaminotoluene Structural Isomers“, Toxicol.
Packaging
Martus, J.C. Mirsalis, T. Suzuki and N. Yajima (2003), „In vivo Transgenic Mutation Assays“, Mutation Res., 540:
the synthesis of infective phage particles from a preparation of phage capsid and tail proteins and a concatamer of phage DNA molecules.
Douglas (1996), „Bacteriophage λ and Plasmid lacZ Transgenic Mice for studying Mutations in vivo“ in:
Commonly used to package DNA cloned onto a lambda vector (separated by cos sites) into infectious lambda particles.
Douglas (2005), „A lacZ Transgenic Mouse Assay for the Detection of Mutations in Follicular Granulosa Cells“, Mutation Res., 578(1-2):
Packaging efficiency
Martus, V. Thybaud (2011), „Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data“, Mutation Res., doi:10.1016/j.mrgentox.2010.09.007.
the efficiency with which packaged bacteriophages are recovered in host bacteria.
OECD (2011), Retrospective Performance Assessment of OECD Test Guideline on Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays, Series on Testing and Assessment, № 145, ENV/JM/MONO(2011)20, OECD, Paris.
Plaque forming unit (pfu)
, „Kinetics of spermatogenesis in mammals seminiferous epithelium cycle and spermatogonial renewal“.
a measure of viable bacteriophage numbers.