natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Събират се проби от клетките в период, равняващ се на около 1,5—2,0 пъти обичайната (т.е. при липса на третиране) продължителност на клетъчния цикъл или след началото, или в края на третирането (вж. таблица 1).
Cells are sampled at a time equivalent to about 1,5-2,0 times the normal (i.e. untreated) cell cycle length either after the beginning or at the end of treatment (See Table 1).
Периодите на вземане на проби или възстановяване могат да бъдат удължени, ако е известно или се допуска, че изпитваното вещество засяга продължителността на клетъчния цикъл (напр. при изпитване на нуклеозидни аналози).
Sampling or recovery times may be extended if it is known or suspected that the test substance affects the cell cycling time (e.g. when testing nucleoside analogues).
Поради потенциалната цитотоксичност на препаратите S9 за култивирани клетки от бозайници, третиране с удължен период на експозиция с продължителност 1,5—2,0 обичайни клетъчни цикъла се прилага само при липсата на S9.
Because of the potential cytotoxicity of S9 preparations for cultured mammalian cells, an extended exposure treatment of 1,5-2,0 normal cell cycles is used only in the absence of S9.
При удължения период на третиране се предлагат варианти, които позволяват третиране на клетките с изпитвания химикал при наличието или липсата на цитоБ.
In the extended treatment, options are offered to allow treatment of the cells with the test chemical in the absence or presence of cytoB.
Тези варианти са насочени към ситуации, при които е възможно да има опасения, свързани с възможните взаимодействия между изпитваното вещество и цитоБ.
These options address situations where there may be concern regarding possible interactions between the test substance and cytoB.
Предложените графици на третиране на клетките са представени в таблица 1.
The suggested cell treatment schedules are presented in Table 1.
Тези общи графици на третиране могат да бъдат изменяни в зависимост от стабилността или реактивността на изпитваното вещество или конкретните характеристики, свързани с растежа на използваните клетки.
These general treatment schedules may be modified depending on the stability or reactivity of the test substance or the particular growth characteristics of the cells being used.
Всички третирания следва да започват и приключват, докато клетките растат експоненциално.
All treatments should commence and end while the cells are growing exponentially.
Тези графици са представени по-подробно в точки 41—47 по-долу.
These schedules are presented in more details in paragraphs 41-47 following.
Третиране на клетки и време за събиране за изпитването MNvit
Cell treatment and harvest times for the MNvit assay
Лимфоцити, първични клетки и клетъчни линии, третирани с цитоБ
Lymphocytes, primary cells and cell lines treated with cytoB
Извършва се третиране за 3—6 часа при наличието на S9;
Treat for 3-6 hrs in the presence of S9;
премахват се S9 и средата, в която се извършва третирането;
remove the S9 and treatment medium;
добавят се чиста среда и цитоБ;
add fresh medium and cytoB;
събиране след период с продължителността на 1,5—2,0 нормални клетъчни цикъла.
harvest 1,5-2,0 normal cell cycles later.
Кратка експозиция
Short exposure
Извършва се третиране за 3—6 часа;
Treat for 3-6 hrs;
премахва се средата, в която се извършва третирането;
remove the treatment medium;
Удължена експозиция
Extended exposure
Вариант А: извършва се третиране в продължение на 1,5—2 нормални цикъла при наличието на цитоБ;
Option A: Treat for 1,5-2 normal cell cycles in the presence of cytoB;
в края на периода на експозиция се събира клетъчната реколта.
harvest at the end of the exposure period.
Вариант Б: извършва се третиране в продължение на 1,5—2,0 нормални клетъчни цикъла;
Option B: Treat for 1,5-2,0 normal cell cycles;
премахва се изпитваното вещество;
remove the test substance;
Клетъчни линии третирани без цитоБ.
Cell lines treated without cytoB
(Идентични на графиците на третиране, описани по-горе, с изключение на това, че не се добавя никакъв агент цитоБ.)
(Identical to the treatment schedules outlined above with the exception that no cytoB is added)
Лимфоцити, първични клетки и клетъчни линии, третирани с цитоБ
Lymphocytes, primary cells, and cell lines with cytoB
За лимфоцитите най-ефикасният подход е започване на експозицията на изпитваното вещество 44—48 часа след стимулация с ФХА, когато синхронизацията на циклите ще е изчезнала (5).
For lymphocytes, the most efficient approach is to start the exposure to the test substance at 44-48 hrs after PHA stimulation, when cycle synchronisation will have disappeared (5).
При първоначалното изпитване клетките се третират за период от 3 до 6 часа с изпитваното вещество при липсата и наличието на S9.
In the initial assay, cells are treated for 3 to 6 hrs with the test substance in the absence and presence of S9.
Средата, в която се извършва третирането, се премахва и се заменя с чиста среда, която съдържа цитоБ, а клетките се събират след период с продължителността на 1,5—2,0 нормални клетъчни цикъла.
The treatment medium is removed and replaced with fresh medium containing cytoB, and the cells are harvested 1,5-2,0 normal cell cycles later.
Ако и двете първоначални изпитвания на краткосрочното (3—6 часа) третиране са отрицателни или неясни, се използва последващо третиране с удължен период на експозиция без S9.
If both initial tests of the short (3-6 hrs) treatment are negative or equivocal, a subsequent, extended exposure treatment without S9 is used.
Налични са два варианта на третиране, като и двата са приемливи в еднаква степен.
Two treatment options are available and are equally acceptable.
При все това може да е по-уместно да се използва вариант А за стимулирани лимфоцити, когато е вероятно продължителността на експоненциалния растеж да намалее до 96 часа след стимулацията.
However, it might be more appropriate to follow Option A for stimulated lymphocytes where exponential growth may be declining at 96 hrs following stimulation.
Освен това клетъчните култури следва да не са достигнали до сливане към момента на окончателното взимане на проби, както е описано във вариант Б.
Also, cultures of cells should not have reached confluence by the final sampling time in Option B.
Вариант А: клетките се третират с изпитваното вещество за период от време с продължителността на 1,5—2,0 нормални клетъчни цикъла и се събират в края на периода на третиране.
Option A: The cells are treated with the test substance for 1,5-2,0 normal cell cycles, and harvested at the end of the treatment time.
Вариант Б: клетките се третират с изпитваното вещество за период от време с продължителността на 1,5—2,0 нормални клетъчни цикъла.
Option B: The cells are treated with the test substance for 1,5-2,0 normal cell cycles.
Средата, в която се извършва третирането, се премахва и се заменя с чиста среда, а клетките се събират след допълнителен период с продължителността на 1,5—2,0 нормални клетъчни цикъла.
The treatment medium is removed and replaced with fresh medium, and the cells are harvested after additional 1,5-2,0 normal cell cycles.
Първичните клетки и клетъчните линии следва да бъдат третирани по начин, подобен на начина на третиране на лимфоцитите, с изключение на това, че не е необходимо да бъдат стимулирани с ФХА за период от 44—48 часа.
Primary cells and cell lines should be treated in a similar manner to lymphocytes except that it is not necessary to stimulate them with PHA for 44-48 hrs.
Клетките, различни от лимфоцити, следва да бъдат изложени на въздействие по такъв начин, че към момента на прекратяване на изследването те все още да се намират в логаритмична фаза на растеж.
Cells other than lymphocytes should be exposed such that at the time of study termination, the cells are still in log-phase growth.
Клетъчни линии, третирани без цитоБ
Cell lines without cytoB
Клетките следва да бъдат третирани за 3—6 часа при наличие и при липса на S9.
Cells should be treated for 3-6 hrs in the presence and absence of S9.
Средата, в която се извършва третирането, се премахва и се заменя с чиста среда, а клетките се събират след период с продължителността на 1,5—2,0 нормални клетъчни цикъла.
The treatment medium is removed and replaced with fresh medium, and the cells are harvested 1,5-2,0 normal cell cycles later.
Ако и двете първоначални изпитвания на краткосрочното (3—6 часа) третиране са отрицателни или неясни, се използва последващо третиране с удължен период на експозиция (без S9).
If both initial tests of the short (3-6 hrs) treatment are negative or equivocal, a subsequent, extended exposure treatment (without S9) is used.
Налични са два варианта на третиране, като и двата са приемливи в еднаква степен:
Two treatment options are available, both of which are equally acceptable:
При еднослойните култури е възможно към края на третирането с продължителност 3—6 часа да присъстват митотични клетки (които се идентифицират като кръгли и отделящи се от повърхността).
In monolayers, mitotic cells (identifiable as being round and detaching from the surface) may be present at the end of the 3-6 hr treatment.
Тъй като тези митотични клетки се отделят лесно, те могат да се загубят при премахване на средата, съдържаща изпитваното вещество.
Because these mitotic cells are easily detached, they can be lost when the medium containing the test substance is removed.
Следва да се положат грижи те да бъдат събрани при измиване на културите и да бъдат върнати в културите, за да се избегне загубата на клетки, намиращи се в стадий на митоза, и на такива, за които е налице риск от образуване на микроядра, към момента на събиране на клетъчната реколта.
Care should be taken to collect these when cultures are washed, and to return them to the cultures, to avoid losing cells that are in mitosis, and at risk for micronuclei, at the time of harvest.
Брой на културите
Number of cultures
Следва да се използват дубликатни култури за всяка концентрация на изпитвано вещество и за културите, третирани с носителя/разтворителя и отрицателните контролни култури.
Duplicate cultures should be used for each test substance concentration and for the vehicle/solvent and NC cultures.
Когато чрез лабораторната база данни от предишни изследвания може да се докаже минимално вариране между дубликатните култури, използването на единични култури може да бъде приемлив вариант.
Where minimal variation between duplicate cultures can be demonstrated from historical laboratory data, it may be acceptable for single cultures to be used.
Ако се използват единични култури, се препоръчва анализирането на увеличен брой концентрации.
If single cultures are used, it is recommended that an increased number of concentrations be analysed.
Събиране на клетки и подготовка на предметно стъкло
Cell harvest and slide preparation
Всяка култура се събира и обработва отделно.
Each culture is harvested and processed separately.
Подготовката на клетките може да включва хипотонично третиране, но тази мярка не е необходима, ако по друг начин е постигнато адекватно разстилане на клетките.
Cell preparation may involve hypotonic treatment, but this step is not necessary if adequate cell spreading is otherwise achieved.
В подготовката на предметното стъкло могат да бъдат използвани различни техники, при условие че е постигната висококачествена подготовка на клетките за оценяване.
Different techniques can be used in slide preparation provided that high-quality cell preparations for scoring are obtained.
Цитоплазмата на клетките следва да бъде запазена, за да се даде възможност за откриването на микроядра и (в метода на блокиране на цитокинезата) надеждното идентифициране на двуядрени клетки.
Cell cytoplasm should be retained to allow the detection of micronuclei and (in the cytokinesis-block method) reliable identification of binucleate cells.
Предметните стъкла могат да бъдат оцветявани чрез използване на различни методи, като Giemsa или флуоресцентни специфични оцветители за ДНК (59).
The slides can be stained using various methods, such as Giemsa or fluorescent DNA specific dyes (59).
Използването на специфичен оцветител за ДНК (напр. акридин оранжево (61) или Хьохст 33258 плюс пиронин-Y (62) може да елиминира някои от артефактите, свързани с използването на оцветител, който не е специфичен за ДНК. Антикинетохорните антитела, FISH с панцентромерни ДНК проби или праймирано маркиране in situ с праймери, специфични за панцентромера, заедно с подходящо контрастно оцветяване на ДНК, могат да бъдат използвани за идентифициране на съдържанието (хромозоми/хромозомни фрагменти) на микроядрата, ако механистичната информация за тяхното образуване представлява интерес (15) (16). Могат да бъдат използвани и други методи за разграничаване на кластогените от анеугените, ако те са се доказали като ефективни.
The use of a DNA specific stain (e.g. acridine orange (61) or Hoechst 33258 plus pyronin-Y (62)) can eliminate some of the artefacts associated with using a non-DNA specific stain. Anti-kinetochore antibodies, FISH with pancentromeric DNA probes, or primed in situ labelling with pancentromere-specific primers, together with appropriate DNA counterstaining, can be used to identify the contents (chromosome/chromosomal fragment) of micronuclei if mechanistic information of their formation is of interest (15) (16).
Анализ
Other methods for differentiation between clastogens and aneugens may be used if they have been shown to be effective. Analysis
Всички предметни стъкла, включително тези на разтворителя/носителя и на контролите, следва да се кодират независимо едно от друго преди микроскопския анализ.
All slides, including those of the solvent/vehicle and the controls, should be independently coded before the microscopic analysis.
Алтернативно, кодираните проби могат да бъдат анализирани чрез използване на валидирана, автоматизирана система за поточна цитометрия или анализ на изображения.
Alternatively, coded samples can be analysed using a validated, automated flow cytometric or image analysis system.
При култури, третирани с цитоБ, честотата на микроядрата следва да бъде анализирана при поне 2000 двуядрени клетки на концентрация (поне 1000 двуядрени клетки на култура; две култури на концентрация).
In cytoB-treated cultures, micronucleus frequencies should be analysed in at least 2000 binucleated cells per concentration (at least 1000 binucleated cells per culture; two cultures per concentration).
Ако се използват единични култури, от тази култура следва да бъдат отчетени поне 2000 двуядрени клетки на концентрация.
If single cultures are used, at least 2000 binucleated cells per concentration should be scored from that culture.
Ако за оценяване при всяка концентрация са налични значително по-малко от 1000 двуядрени клетки на култура или по-малко от 2000 при единична култура и ако не е открито значително увеличение на микроядрата, изпитването следва да бъде повторено с използване на повече клетки или при по-малко токсични концентрации, което от двете е уместно.
If substantially fewer than 1000 binucleate cells per culture, or 2000 if a single culture is used, are available for scoring at each concentration, and if a significant increase in micronuclei is not detected, the test should be repeated using more cells, or at less toxic concentrations, whichever is appropriate.
Следва да се внимава да не се отчитат двуядрени клетки с неправилни форми или, когато двете ядра се различават в голяма степен по размер, двуядрените клетки не следва да се бъркат със слаборазстлани многоядрени клетки.
Care should be taken not to score binucleate cells with irregular shapes or where the two nuclei differ greatly in size; neither should binucleate cells be confused with poorly spread multi-nucleate cells.
Клетките, които съдържат повече от две основни ядра, не следва да бъдат анализирани за наличието на микроядра, тъй като базовата честота на микроядрата може да бъде по-висока при тези клетки (63) (64). Отчитането на едноядрените клетки е приемливо, ако е доказано, че изпитваното вещество оказва влияние върху активността на цитоБ.
Cells containing more than two main nuclei should not be analysed for micronuclei, as the baseline micronucleus frequency may be higher in these cells (63) (64) Scoring of mononucleate cells is acceptable if the test substance is shown to interfere with cytoB activity.
При клетъчни линии, изпитвани без третиране с цитоБ, микроядрата следва да бъдат отчетени при поне 2000 клетки на концентрация (поне 1000 клетки на култура; две култури на концентрация).
In cell lines assayed without cytoB treatment, micronuclei should be scored in at least 2000 cells per concentration (at least 1000 cells per culture; two cultures per concentration).
Когато се използва само една култура на концентрация, от тази култура следва да бъдат отчетени поне 2000 клетки.
Where only one culture per concentration is used, at least 2000 cells should be scored from that culture.
Когато се употребява цитоБ, CBPI или RI следва да бъдат определени за оценка на пролиферацията на клетките (вж. допълнение 2), като се използват поне 500 клетки на култура.
When cytoB is used, a CBPI or an RI should be determined to assess cell proliferation (see Appendix 2) using at least 500 cells per culture.
Когато третиранията се извършват при липсата на цитоБ, от съществено значение е да бъдат предоставени доказателства, че оценяваните клетки са пролиферирали, както е обсъдено в точки 24—27.
When treatments are performed in the absence of cytoB, it is essential to provide evidence that the cells being scored have proliferated, as discussed in Paragraphs 24-27.
Критерии за приемливост
Acceptability criteria
Лаборатория, която предлага да използва изпитването MNvit, описано в този МИ, следва да докаже своята способност надеждно и точно да открива химикали с известна анеугенна и кластогенна активност, със и без метаболитно активиране, както и известни отрицателни химикали чрез използване на референтните химикали, изброени в допълнение 3.
A laboratory proposing to use the MNvit assay described in this TM should demonstrate its ability to reliably and accurately detect chemicals of known aneugenic and clastogenic activity, with and without metabolic activation, as well as known negative chemicals, using the reference chemicals in Appendix 3.
Като доказателство за своята способност да извърши този МИ правилно, лабораторията следва да предостави доказателства, че клетките, които се оценяват за образуване на микроядра, са преминали през едно клетъчно делене, ако изпитването е проведено без използване на цитоБ.
As evidence of its ability to perform this TM correctly, the laboratory should provide evidence that the cells being scored for micronucleus formation have completed one nuclear division if the test is performed without the use of cytoB.
Химикалите, изброени в допълнение 3, се препоръчват за използване като референтни химикали.
The chemicals in Appendix 3 are recommended for use as reference chemicals.
Могат да бъдат включени химикали заместители или допълнителни химикали, ако тяхната активност е известна, ако те индуцират микроядра посредством същите механизми за действие и ако за тях е доказано, че са приложими към химикалите чрез използване на процедурата MNvit.
Substitute or additional chemicals can be included if their activity is known and if they induce micronuclei by the same mechanisms of action, and if they are shown to be relevant to the chemicals that will be tested using the MNvit procedure.
Обосновката може да включва изследване за валидиране, използващо голямо разнообразие от вещества или фокусирано върху по-тесен спектър въз основа на химичния клас на изпитваното вещество или изследвания механизъм на увреждане.
Justification could include a validation study employing a broad variety of substances or focused on a narrower spectrum based on the chemical class of the test substance or the mechanism of damage being studied.
Контролните култури, третирани с разтворителя/носителя, и нетретираните култури следва да имат възпроизводимо ниски и съгласувани честоти на микроядра (обикновено 5—25 микроядра/1000 клетки за клетъчните типове, идентифицирани в точка 11).
Solvent/vehicle control and untreated cultures should give reproducibly low and consistent micronuclei frequencies (typically 5-25 micronuclei/1000 cells for the cell types identified in paragraph 11).
Другите типове клетки могат да имат различни спектри от реакции, които следва да бъдат определени, когато те се валидират за използване в изпитването MNvit.
Other cell types may have different ranges of responses which should be determined when validating them for use in the MNvit assay.
Данните от отрицателните контроли, контролите на разтворителя и ПК следва да се използват за установяване на диапазоните от контроли от предишни изследвания.
Data from negative, solvent, and PC should be used to establish historical control ranges.
Тези стойности следва да се използват при определяне на адекватността на едновременните НК/ПК за даден експеримент.
These values should be used in deciding the adequacy of the concurrent NC/PC for an experiment.
Ако за изпитването са предложени незначителни промени на протокола (напр. използване на автоматизирани вместо ръчни техники на оценяване; използване на нов тип клетки), ефективността на промяната следва да бъде показана преди измененият протокол да може да бъде счетен за приемлив за използване.
If minor changes to the protocol (e.g. use of automated instead of manual scoring techniques; use of a new cell type) are proposed for the assay, then the effectiveness of the change should be demonstrated before the modified protocol can be considered acceptable for use.
Показването на ефективност включва демонстриране, че могат да се открият основните механизми на разкъсване и придобиване или загуба на хромозоми, както и че могат да бъдат постигнати подходящи положителни и отрицателни резултати за класа на отделните вещества или широкия спектър от вещества, които ще бъдат изпитвани.
Demonstration of effectiveness includes demonstration that the major mechanisms of chromosome breakage and gain or loss can be detected, and that appropriate positive and negative results can be achieved for the class of the individual substance, or the broad range of substances, to be tested.
Обработка на резултатите
Treatment of results
Ако се използва техниката на блокиране на цитокинезата, в оценката на индуцирането на микроядра се използват само честотите на двуядрените клетки с микроядра (независимо от броя на микроядрата в една клетка).
If the cytokinesis-block technique is used, only the frequencies of binucleate cells with micronuclei (independent of the number of micronuclei per cell) are used in the evaluation of micronucleus induction.
Отчитането на броя на клетките с едно, две или повече ядра може да предостави полезна информация, но не е задължително.
Scoring of the numbers of cells with one, two, or more micronuclei could provide useful information, but is not mandatory.
Следва да се определят съпътстващите измервания на цитотоксичността и/или цитостазата за всички третирани и контролни култури, третирани с разтворителя/носителя (58).
Concurrent measures of cytotoxicity and/or cytostasis for all treated and solvent/vehicle control cultures should be determined (58).
Следва да бъдат изчислени CBPI или RI за всички третирани и контролни култури като измервания на забавяне на клетъчния цикъл, когато се използва методът на блокиране на цитокинезата.
The CBPI or the RI should be calculated for all treated and control cultures as measurements of cell cycle delay when the cytokinesis-block method is used.
При липса на цитоБ следва да бъдат използвани RPD, RICC или PI (вж. допълнение 2).
In the absence of cytoB, the RPD or the RICC or PI should be used (see Appendix 2).
Следва да се предоставят данни за отделните култури.
Individual culture data should be provided.
В допълнение към това всички данни следва да бъдат обобщени в табличен вид.
Additionally, all data should be summarised in tabular form.
Химикалите, които индуцират микроядра в изпитването Mnvit, постигат това, като индуцират разкъсване на хромозоми, загуба на хромозоми или комбинация от двете.
Chemicals that induce micronuclei in the MNvit assay may do so because they induce chromosome breakage, chromosome loss, or a combination of the two.