natgillin/translations-raw huggingface dataset:
Стойности на инхибиране над 50 % могат да бъдат смятани за положителни.
Inhibition values higher than 50 % may be regarded as positive.
Материали и реактиви:
Material and Reagents:
Подходящи микротитърни плаки за ELISA.
Appropriate ELISA microtitre plates.
Антиген: доставен като екстрахиран клетъчен концентрат, приготвен, както е описано по-долу, и съхраняван при температура –20 °C или –70 °C.
Antigen: supplied as a cell extracted concentrate, prepared as described below, and stored at either –20 °C or –70 °C.
Блокиращ буфер: фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS), съдържащ 0,3 % отрицателен по отношение на син език серум от възрастни говеда, 0,1 % (v/v) Tween-20 (доставен като сироп на полиоксиетилен сорбитон монолаурат) в PBS.
Blocking buffer: phosphate buffered saline (PBS) containing 0,3 % BTV negative adult bovine serum, 0,1 % (v/v) Tween-20 (supplied as polyoxyethylene sorbiton monolaurate syrup) in PBS.
Моноклонално антитяло: 3-17-A3 (доставено като супернатант от хибридомна тъканна култура), насочено срещу групово специфичния полипептид VP7, съхраняван при температура–20 °C или лиофилизиран и разреден в пропорция 1/100 с блокиращ буфер преди употреба.
Monoclonal antibody: 3-17-A3 (supplied as hybridoma tissue-culture supernatant) directed against the group-specific polypeptide VP7, stored at -20 °C or freeze-dried and diluted 1/100 with blocking buffer before use.
Конюгат: заешки антимиши глобулин (адсорбиран и елюиран), конюгиран с пероксидаза от хрян и съхраняван на тъмно при температура 4 °C.
Conjugate: rabbit anti-mouse globulin (adsorbed and eluted) conjugated to horseradish peroxidase and kept in the dark at 4 °C.
Хромоген и субстрат: Ортофенилен диамин (ОФД-хромоген) при крайна концентрация от 0,4 mg/ml в стерилна дестилирана вода.
Chromogen and substrate: Orthophenylene diamine (OPD-chromogen) at a final concentration of 0,4 mg/ml in sterile distilled water.
Водороден пероксид (30 % w/v-субстрат) 0,05 % v/v, добавени непосредствено преди употреба (5μl H2 O2 на 10 ml ОФД).
Hydrogen peroxide (30 %w/v-substrate) 0,05 % v/v added immediately before use (5μl H2 O2 per 10 ml OPD).
(да се борави внимателно с ОФД — да се носят гумени ръкавици — предполагаем мутаген).
(Handle OPD with care - wear rubber gloves - suspected mutagen).
Едномоларна сярна киселина: 26,6 ml киселина, добавена към 473,4 ml дестилирана вода. (Важно!
1 Molar sulphuric acid: 26,6 ml of acid added to 473,4 ml of distilled water.
Винаги се прибавя киселината към водата и никога — водата към киселината).
(Remember Acid must be added to water, never water to acid.)
Орбитален шейкър.
Orbital shaker.
Четец за плаки ELISA (тестът може да бъде отчитан визуално).
ELISA plate reader (the test may be read visually).
Схема на теста
Test format
Cc: Контролна проба с конюгат (без серум / без моноклонално антитяло); C++: силно положителна серумна контролна проба; C+: слабо положителна серумна контролна проба; C-: отрицателна серумна контролна проба; Cm: контролна проба с моноклонално антитяло (без серум).
Cc: conjugate control (no serum/ no monoclonal antibody); C++: strong positive serum control; C+: weak positive serum control; C-: negative serum control; Cm: monoclonal antibody control (no serum).
ДОПЪЛНЕНИЕ 1:
APPENDIX 1:
Точково разреждане(1:5) формат (40 серумни проби/плака)
Spot dilution (1:5) format (40 sera/plate)
Контролни проби
Controls
Teст-серуми
Test Sera
ДОПЪЛНЕНИЕ 2:
APPENDIX 2:
Формат на титруване на серума(10 серумни проби/плака)
Serum titration format (10 sera/plate)
Протокол на изследването:
Test protocol:
Контролна проба с конюгат (Cс) ямки 1A и 1B съдържат празна проба, състояща се от антиген на син език и конюгат.
Conjugate control (Cc) Wells 1A and 1B are a blank control consisting of BTV antigen and conjugate.
Тя може да бъде използвана за калибриране на четеца на плаки ELISA.
This may be used to blank the ELISA reader.
Контролна проба с моноклонално антитяло (Cm) Графи 1 и 2, редове Ж и З представляват контролната проба с моноклонално антитяло, съдържаща антиген на син език, моноклонално антитяло и конюгат.
Mab control (Cm) Columns 1 and 2, rows G and H are the monoclonal antibody control and contain BTV antigen, monoclonal antibody and conjugate.
В тези ямки се появява максималното оцветяване.
These wells represent maximum colour.
Средната отчетена оптическа плътност от тази контролна проба е 0 % от стойността на инхибиране.
The mean of the optical density readings from this control represents the 0 % inhibition value.
Положителна проба (C++, C+) Графи 1 и 2, редове В-Г-Д-Е.
Positive control (C++, C+) Columns 1 and 2, rows C-D-E-F.
В тези ямки има антиген на син език, съответно силно и слабо положителен антисерум, моноклонално антитяло и конюгат.
These wells contain BTV antigen, BTV strong and weak positive antiserum respectively, Mab and conjugate.
Отрицателна контролна проба (C–) Ямки 2A и 2Б са отрицателните проби, които съдържат антиген на син език, негативен по отношение на син език антисерум, моноклонално антитяло и конюгат.
Negative control (C-) Wells 2A and 2B are the negative controls, which contain BTV antigen, BTV negative antiserum, Mab and conjugate.
Тест-серуми За обширни серологични изследвания и бърз скрининг серумите могат да се изследват при единично разреждане от 1:5 (допълнение 1).
Test sera For large-scale serological surveys and rapid screening, sera may be tested at a single dilution of 1:5 (Appendix 1).
Като алтернатива, могат да бъдат изследвани 10 серума при разреждане, вариращо от 1:5 до 1:640 (допълнение 2).
Alternatively, 10 sera may be tested over a dilution range from 1:5 to 1:640 (Appendix 2).
Това ще даде определени индикации за титъра на антитела в изследваните серуми.
This will give some indication of the titre of antibody in the test sera.
Процедура:
Procedure:
Антиген на син език се разрежда до предварително титруваната концентрация в PBS, разбърква се за кратко с ултразвукова бъркалка, за да се диспергират вирусните агрегати (ако не е наличен ултразвуков апарат, се бърка енергично с пипета) и се прибавят по 50 μl към всички ямки на плаката за ELISA.
Dilute BTV antigen to pre-titrated concentration in PBS, sonicate briefly to disperse aggregated virus (if sonicator is not available, pipette vigorously) and add 50 μl to all wells of the ELISA plate.
За диспергиране на антигена се почукват страните на плаката.
Tap sides of plate to disperse antigen.
Инкубира се на 37 °C в продължение на 60 минути в орбитален шейкър.
Incubate at 37 °C for 60 minutes on an orbital shaker.
Плаките се измиват три пъти чрез напълване и изпразване на ямките с нестерилен PBS и се изсушават с помощта на попивателна хартия.
Wash plates three times by flooding and emptying the wells with non-sterile PBS and blot dry on absorbent paper.
Контролни ямки: Прибавят се 100 µl блокиращ буфер към ямките с контролна проба конюгат (Cc).
Control wells: Add 100 μl of blocking buffer to Cc wells.
Прибавят се по 50 µl положителни и отрицателни контролни серумни проби при разреждане 1:5 (10 µl серумни проби + 40 µl блокиращ буфер), към съответните ямки C–, C + и C++.
Add 50 ul of positive and negative control sera, at a dilution of 1:5 (10 μ l sera + 40 μl blocking buffer), to respective wells C-, C+ and C++.
Прибавят се 50 µl блокиращ буфер към контролните ямки с моноклонално антитяло.
Add 50μl blocking buffer to Mab control wells.
Метод на точковото титруване: добавя се от всеки тест-серум, разреден в съотношение 1:5 с блокиращ буфер, за да се дублират ямките на графи 3—12 (10 µl серум +40 µl блокиращ буфер),
Spot titration method: Add a 1:5 dilution of each test serum in blocking buffer to duplicate wells of columns 3 to 12 (10 μl sera +40 μl blocking buffer),
Метод за титруване на серума: приготвят се серии двукратни разреждания на всяка от пробите за анализ (от 1:5 до 1:640) в блокиращ буфер в осем ямки на единични графи 3—12.
Serum titration method: Prepare a two-fold dilution series of each test sample (1:5 to 1:640) in blocking buffer across eight wells of single columns 3 to 12.
Веднага след прибавянето на тест-серумите се разрежда моноклоналното антитяло в съотношение 1:100 в блокиращ буфер и се добавят 50 µl към всички ямки на плаката, освен в тази за празната проба.
Immediately after the addition of the test sera, dilute Mab 1:100 in blocking buffer and add 50 μl to all wells of the plate except for the blank control.
Плаката се измива три пъти с PBS и се изсушава с попивателна хартия.
Wash three times with PBS and blot dry.
Разрежда се заешки антимиши концентрат до съотношение 1/5000 в блокиращ буфер и се добавят 50 µl към всички ямки на плаката.
Dilute rabbit anti-mouse concentrate to 1/5000 in blocking buffer and add 50 μl to all wells of the plate.
Разтопява се О-фенилендиамин дихидрохлорид (ОФД) и непосредствено преди употреба се добавят 5 µl водороден пероксид с концентрация 30 % за всеки 10 ml ОФД.
Thaw the O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) and immediately before use add 5 μl of 30 % hydrogen peroxide to each 10 ml of OPD.
Добавят се 50 µl към всички ямки на плаката.
Add 50 μl to all wells of the plate.
Изчаква се в продължение на приблизително 10 минути оцветяването да се прояви и реакцията се спира с едномоларна сярна киселина (50 µl на ямка).
Allow colour to develop for approximately 10 minutes and stop the reaction with 1 Molar sulphuric acid (50 μl per well).
Оцветяване следва да се появи в контролните ямки, съдържащи моноклонално антитяло и в онези ямки, които съдържат серуми без антитела на син език.
Colour should develop in the Mab control wells and in those wells containing sera with no antibody to BTV.
Плаките се преглеждат и описват визуално или с използване на спектрофотометричен четец.
Examine and record the plates either visually or using a spectrophotometric reader.
Анализ на резултатите:
Analysis of results:
Като се използва софтуерният пакет се отпечатват стойностите на оптичната плътност (ОП) и изразеното в проценти инхибиране (ПИ) за тест-серумите и контролните серуми въз основа на средната регистрирана стойност от контролните ямки с антиген.
Using the software package print out the optical density (OD) values, and the percentage inhibition (PI) for test and control sera based on the mean value recorded in the antigen control wells.
Данните, изразени като стойности на ОП или ПИ, се използват за определяне дали изследването е осъществено в рамките на приемливи граници.
The date expressed as OD and PI values are used to determine whether the test has performed within acceptable limits.
Стойностите на горните контролни граници (ГКГ) и долните контролни граници (ДКГ) на ОП за контролната проба с моноклонално антитяло (антиген с добавено моноклонално антитяло, но без добавяне на тест-серум) са между 0,4 и 1,4.
The upper control limits (UCL) and lower control limits (LCL) for the Mab control (antigen plus Mab in the absence of test sera) are between OD values 0,4 and 1.4. Any plate that fails to conform to the above criteria must be rejected.
Всяка плака, която не отговаря на горните критерии, трябва да се отхвърли.
If a computer software package is not available print out the OD values using the ELISA printer.
Ако не е налице компютърен софтуерен пакет, стойностите на ОП се отпечатват, като се използва принтерът на ELISA.. Изчислява се средната стойност на ОП за контролните ямки с антиген, която се приравнява на 100 % от стойността.
Calculate the mean OD value for the antigen control wells, which is equivalent to the 100 % value.
Определят се 50 % от стойността на ОП и се пресмята за всяка проба дали е положителна или отрицателна.
Determine the 50 % OD value and manually calculate the positivity and negativity of each sample.
Процентна стойност на инхибиране (ПИ) = 100 – (ОП на всяка тестова проба/средно ОП на Cm) × 100.
Percentage inhibition (PI) value = 100 – (OD of each test control/Mean OD of Cm) × 100.
Стойностите на ПИ съответно за дублираните отрицателни контролни ямки със серум и дублираните празни ямки трябва да бъдат съответно между +25 %и –25 % и +95 % и +105 %.
The duplicate negative control serum wells and the duplicate blank wells must record PI values between +25 % and –25 %, and between +95 % and +105 %, respectively.
Ако плаката не попадне в тези граници, това не я прави невалидна, но подсказва развиването на оцветяване на заден план.
Failure to be within these limits does not invalidate the plate but does suggest that background colour is developing.
При силните и при слабите положителни контролни серуми трябва да се отчитат стойности на ПИ съответно между +81 % и +100 %, и между +51 % и + +80 %.
The strong and weak positive control sera must record PI values between +81 % and +100 %, and between +51 % and +80 %, respectively.
Диагностичният праг за тест-серумите е 50 % (50 % за ПИ или 50 % за ОП).
The diagnostic threshold for test sera is 50 % (PI 50 % or OD 50 %).
Проби, при които се отчитат по-ниски от 50 % стойности на ПИ се считат за отрицателни.
Samples recording PI values >50 % are recorded negative.
Проби, при които се отчитат стойности на ПИ над и под прага за дублиращите ямки, се считат за съмнителни; такива проби могат да се изследват повторно по метода точковия тест и/или чрез титруване.
Samples that record PI values above and below the threshold for the duplicate wells are considered doubtful; such samples may be re-tested in the spot test and/or titration.
Положителните проби могат също да се титруват, за да се получи представа доколко положителна е пробата.
Positive samples may also be titrated to provide an indication of the degree of positivity.
Визуално отчитане: Положителните и отрицателните проби се различават лесно с просто око; слабо положителните или силно отрицателните проби могат да бъдат по-трудни за интерпретиране без използване на апаратура.
Visual reading: Positive and negative samples are easily discernible by eye; weakly positive or strong negative samples may be more difficult to interpret by eye.
Приготвяне на антиген на син език за ELISA:
Preparation of BTV ELISA antigen:
40-60 плоски шишета (колби на Ру) със сливащи се бъбречни клетки на новородени хамстери BHK-21 се изплакват три пъти със среда на Eagle, която не съдържа серум, и се инфектират с вирус на син език от серотип 1 в среда на Eagle, несъдържаща серум.
Wash 40-60 roux of confluent BHK-21 cells three times with serum-free Eagle's medium and infect with bluetongue virus serotype 1 in serum-free Eagle's medium.
Инкубират се при 37 °C и се изследват ежедневно за цитопатичен ефект (ЦПЕ).
Incubate at 37 °C and examine daily for cytopathic effect (CPE).
Когато ЦПЕ обхване 90 до 100 % от слоя от клетки във всяко шише, вирусът се събира чрез разклащане на шишето, за да се отделят залепналите за стъклото клетки.
When CPE are complete in 90 % to 100 % of the cell sheet of each roux, harvest the virus by shaking any still-attached cells from the glass.
Шишетата се подлагат на центрофугиране при 2000 до 3000 об./мин., за да се раздробят клетките.
Centrifuge at 2000 to 3000 rpm to pellet the cells.
Супернатантът се отстранява и клетките се поставят отново в суспензия от приблизително 30 ml PBS, съдържащ 1 % „Sarkosyl“ и 2 ml фенилметилсулфонил флуорид (лизиращ буфер).
Discard the supernatant and re-suspend the cells in approximately 30 ml of PBS containing 1 % ‘Sarkosyl’ and 2 ml phenylmethylsulphonyl fluoride (lysis buffer).
Това може да бъде причина клетките да образуват гел, като за намаляване на този ефект може да бъде добавен повече лизиращ буфер.
This may cause the cells to form a gel and more lysis buffer may be added to reduce this effect.
(NB: фенилметилсулфонил флуоридът е опасен — с него трябва да се борави с изключителна предпазливост.)
(NB: phenylmethylsulphonyl fluoride is harmful - handle with extreme caution.)
Чрез използване на ултразвукова сонда в продължение на 60 секунди при амплитуда 30 микрона клетките се разрушават.
Disrupt the cells for 60 seconds using an ultrasonic probe at an amplitude of 30 microns.
Центрофугира се при 10000 об./мин. в продължение на 10 минути.
Centrifuge at 10000 rpm for 10 minutes.
Супернатантът се съхранява при температура +4 °C, а останалата маса от клетки се поставя в 10 до 20 ml лизиращ буфер за получаване на нова суспензия.
Store the supernatant at +4 °C and re-suspend the remaining cell pellet in 10 to 20 ml of lysis buffer.
Въздейства се с ултразвук и се избистря общо три пъти, като при всеки етап супернатантът се съхранява.
Sonicate and clarify, storing the supernatant at each stage, a total of three times.
Супернатантите се обединяват и центрофугират при 24000 об./мин. (100,000 g) в продължение на 120 минути при +4 °C върху подложка от 5 ml 40 % захароза (w/v в PBS), като се използват епруветки за центрофугиране Beckmann от 30 ml и ротор SW 28.
Pool the supernatants and centrifuge at 24000 rpm (100,000 g) for 120 minutes at +4 °C over a 5 ml cushion of 40 % sucrose (w/v in PBS) using 30 ml Beckmann centrifuge tubes and an SW 28 rotor.
Супернатантът се отстранява, епруветките се изплакват старателно и клетъчната маса отново се поставя в PBS, като чрез въздействие с ултразвук се получава суспензия.
Discard the supernatant, drain the tubes thoroughly and re-suspend the pellet in PBS by sonication.
Антигенът се съхранява като аликвотни части при температура –20 °C.
Store the antigen in aliquots at –20 °C.
Титруване на антиген на син език за ELISA:
Titration of BTV ELISA antigen:
Антиген на син език за ELISA се титрува чрез индиректен метод ELISA.
Bluetongue ELISA antigen is titrated by the indirect ELISA.
Двукратно разреденият антиген се титрува при константно разреждане (1/100) на моноклоналното антитяло 3-17-A3.
Twofold dilutions of antigen are titrated against a constant dilution (1/100) monoclonal antibody 3-17-A3.
Следва се посоченият по-долу протокол:
The protocol is as follows:
Разреден в PBS в съотношение 1:20 антиген на син език се титрува на микротитърна плака в серии от двукратно разредени проби (50 µl/ямка), като се използва многоканална пипета.
Titrate a 1:20 dilution of BTV antigen in PBS across the microtitre plate in a twofold dilution series (50 μl/well) using a multichannel pipette.
Пробите се инкубират в продължение на един час на 37 °C върху орбитален шейкър.
Incubate for one hour at 37 °C on an orbital shaker.
Плаките се измиват три пъти с PBS.
Wash plates three times with PBS.
Добавят се 50 µl моноклонално антитяло 3-17-A3 (разредено 1/100) към всяка ямка на микротитърната плака.
Add 50 μl of monoclonal antibody 3-17-A3 (diluted 1/100) to each well of the microtitre plate.
Към всяка ямка на микротитърна плака се добавят 50 µl заешки антимиши глобулин, конюгиран с пероксидаза от хрян, разредена до предварително титрувана оптимална концентрация.
Add 50 μl of rabbit anti-mouse globulin conjugated to horseradish peroxidase, diluted to a pre-titrated optimal concentration, to each well of the microtitre plate.
Добавят се субстрат и хромоген, както е описано по-горе.
Add substrate and chromogen as described previously.
Реакцията се спира след 10 минути чрез добавяне на едномоларна сярна киселина (50 µl/ямка).
Stop the reaction after 10 minutes by the addition of 1 Molar sulphuric acid (50 μl/well).
При конкурентния анализ моноклоналното антитяло трябва да е в излишък, поради това се избира разреждане на антиген, което попада в титърната крива (не в областта на платото), която дава приблизително 0,8 ОП след 10 минути.
In the competitive assay, the monoclonal antibody must be in excess, therefore a dilution of antigen is chosen which falls on the titration curve (not on the plateau region) which gives approximately 0,8 OD after 10 minutes.
Изследването с агар-гел имунодифузия се провежда в съответствие със следния протокол:
The agar gel immuno-diffusion test shall be carried out according to the following protocol:
Антиген:
Antigen:
Преципитиращият антиген се приготвя във всякаква система за клетъчна култура, която благоприятства бързото размножаване на референтен щам на вируса на син език.
Precipitating antigen is prepared in any cell culture system that supports the rapid multiplication of a reference strain of bluetongue virus.
Препоръчват се клетки от типа BHK или Vero.
BHK or Vero cells are recommended.
Антигенът е наличен в супернатанта в края на вирусния растеж, но за да бъде ефективен, се изисква 50 до 100-кратна концентрация.
Antigen is present in the supernatant fluid at the end of virus growth but requires 50 to 100-fold concentration to be effective.
Това може да бъде постигнато чрез всяка стандартна процедура за концентриране на протеин; вирусът в антигена може да бъде инактивиран чрез добавянето на 0,3 % (v/v) бета-пропиолактон.
This may be achieved by any standard protein concentration procedure; virus in the antigen may be inactivated by the addition of 0,3 % (v/v) beta-propiolactone.
Известен положителен контролен серум:
Known positive control serum:
Като се използват международните референтни серум и антиген, се произвежда национален стандартен серум, който е стандартизиран за оптимална пропорция по отношение на международния референтен серум, лиофилизиран и използван при всяко изследване като известен контролен серум.
Using the international reference serum and antigen a national standard serum is produced, standardised for optimal proportion against the international reference serum, freeze-dried and used as the known control serum in each test.
Тест-серум
Test serum
Процедура 1 % агароза, приготвена в боратен или натриев барбитолов буфер, с pH 8,5—9,0, се изсипва в блюдо на Петри до минимална дълбочина от 3,0 mm. В агара се изрязват седем сухи ямки, всяка с диаметър 5,0 mm.
Procedure 1 % agarose prepared in borate or sodium barbitol buffer, pH 8,5 to 9,0, is poured into a petri dish to a minimum depth of 3,0 mm. A test pattern of seven moisture-free wells, each 5,0 mm in diameter, is cut in the agar.
Конфигурацията се състои от една централна ямка и шест ямки, подредени около нея в кръг с радиус 3 cm.
The pattern consists of one centre well and six wells arranged round it in a circle of radius 3 cm.
Централната ямка се запълва със стандартния антиген.
The central well is filled with the standard antigen.
Периферните ямки 2, 4 и 6 се пълнят с известен положителен серум, ямки 1, 3 и 5 се пълнят с тест-серуми.
Peripheral wells 2, 4 and 6 are filled with known positive serum, wells 1, 3 and 5 are filled with test sera.
Системата се инкубира в продължение на най-много 72 часа при стайна температура в затворена влажна камера.
The system is incubated for up to 72 hours at room temperature in a closed humid chamber.
Тълкуване Тест-серумът е положителен, ако образува специфична линия на преципитация с антигена и формира непрекъсната идентификационна линия с контролния серум.
Interpretation A test serum is positive if it forms a specific precipitin line with the antigen and forms a complete line of identity with the control serum.
Тест-серумът е отрицателен, ако не формира специфична линия с антигена и ако не изкривява линията на контролния серум; блюдата на Петри трябва да се изследват на тъмен фон и при индиректно осветление.
A test serum is negative if it does not form a specific line with the antigen and it does not bend the line of the control serum. Petri dishes must be examined against a dark background and using indirect illumination.
Епизоотична хеморагична болест (ЕХБ)
Epizootic haemorrhagic disease (EHD)
Преципитиращият антиген се приготвя във всякаква система за клетъчна култура, която благоприятства бързото размножаване на подходящ серотип/ове на вируса на епизоотичната хеморагична болест.
Precipitating antigen is prepared in any cell culture system that supports the rapid multiplication of the appropriate serotype(s) of epizootic haemorrhagic disease virus.
Заразен ринотрахеит по говедата (ЗРГ)/заразен пустулозен вулвовагинит (ЗПВВ)
Infectious bovine rhinotracheitis (IBR) / infectious pustular vulvo-vaginitis (IPV)
Изследването чрез серум неутрализационния тест се извършва в съответствие със следния протокол:
The serum neutralisation test shall be carried out according to the following protocol:
Серум Всички серуми се инактивират чрез загряване до 56 °C в продължение на 30 минути преди употреба.
Serum All sera are heat-inactivated at 56 °C for 30 minutes before use.