natgillin/translations-raw huggingface dataset:
списък на ограничителните зони и взетите под внимание фактори при определянето на такива зони, включително описание на географските граници на съответната зона, създадена в съответствие с член 2, параграф 2;
a list of containment areas and the factors that have been taken into account to define such areas, including a description of the geographical boundaries of the relevant area, established in accordance with Article 2(2);
списък на отделните части, включително описание на географските граници на съответната зона:
a list of compartments including a description of the geographical boundaries of the relevant area:
за които са прилагани ограничителни мерки през 2009 г. поради повишена смъртност на стриди от вида Crassostrea gigas във връзка с OsHV-1 μvar;
which have been subject to containment measures in 2009 due to increased mortalities in Crassostrea gigas oysters in connection with OsHV-1 μvar;
когато липсата на OsHV-1 μvar е била доказана чрез изследвания на проби, взети от ограничителната зона, проведени в съответствие с части A и Б на приложение I;
where the absence of OsHV-1 μvar has been demonstrated by a testing carried out in accordance with Parts A and B of Annex I in samples taken in the containment area;
декларации за програми, посочени в член 5, параграф 2, включително описание на географските граници на съответната зона.
declarations of programmes referred to in Article 5(2), including a description of the geographical boundaries of the relevant area.
Предвидената в параграф 1 информация се поддържа актуална и е на разположение чрез информационните страници в интернет, създадени в съответствие с член 10 от Решение 2009/177/ЕО.
The information provided for in paragraph 1 shall be kept up-to-date and made available through the internet-based information pages established in accordance with Article 10 of Decision 2009/177/EC.
Не по-късно от 1 октомври 2010 г. държавите-членки представят на Комисията доклад относно програмите, които са декларирани в съответствие с член 5, параграф 2.
By 1 October 2010 at the latest, Member States shall submit a report to the Commission on programmes declared in accordance with Article 5(2).
Докладът е в съответствие с образеца, изложен в приложение VI към Решение 2009/177/ЕО.
The report shall be in conformity with the model form set out in Annex VI to Decision 2009/177/EC.
Той се прилага от 15 март 2010 г. до 31 декември 2010 г.
It shall apply from 15 March 2010 to 31 December 2010.
Вземане на проби
Sampling
Вземане на проби за целите на член 2
Sampling for the purposes of Article 2
Предвидените в член 2 проби се състоят от най-малко 12 екземпляра стриди от вида Crassostrea gigas.
Samples as provided for in Article 2 shall consist of at least 12 individuals of Crassostrea gigas oysters.
Когато се подбират тези животни, се взема проба от слаби, отворени или току-що умрели екземпляри (неразложени), като екземплярите се събират от отделната част, където се наблюдава смъртността.
When selecting those animals weak, gaping or freshly dead (not decomposed) individuals shall be sampled and they shall be collected from the compartment where the mortality is observed.
Вземане на проби за целите на член 3, параграф 2, буква б), член 5, параграф 1, буква б) и член 5, параграф 2
Sampling for the purposes of Article 3(2)(b), 5(1)(b) and 5(2)
Вземането на проби за целите на член 3, параграф 2, буква б) се състои от:
Sampling for the purposes of Article 3(2)(b) shall consist of:
за ларви — по пет пула по най-малко 50 mg от цели животни, взети в периода между 4 и 8 дни след фертилизацията, включително черупка, на пратка;
in the case of larvae, five pools of at least 50 mg of whole animals collected between 4 and 8 days after fecundation including shell per consignment;
за хайвер, по-малък от 6 mm — по 30 пула по 300 mg от цели животни, включително черупка, на пратка;
in the case of spat smaller than 6 mm, 30 pools of 300 mg of whole animals including shell per consignment;
за стриди, по-големи от 6 mm — по 150 екземпляра на пратка.
in the case of oysters bigger than 6 mm, 150 individuals per consignment.
Когато се подбират тези животни, всички части на пратката са представени пропорционално в пробата.
When selecting those animals, all parts of the consignment must be proportionally represented in the sample.
ако има налични слаби, отворени или току-що умрели (неразложени) животни, подбират се предимно такива животни.
If weak, gaping or freshly dead (not decomposed) animals are present, primarily such animals shall be selected.
Вземането на проби за целите на член 5, параграф 2 се състои от най-малко 150 екземпляра от Crassotrea gigas от точката на вземане на пробата.
Sampling for the purposes of Article 5(2) shall consist of at least 150 individuals of Crassostrea gigas per sampling points.
Проби се вземат от всички стопанства или райони за отглеждане на мекотели в държавата-членка или отделната част, която е обхваната от програмата.
All farms or mollusc farming areas in the Member State or compartment covered by the programme shall be sampled.
Вземането на проби за целите на член 5, параграф 1, буква б) се състои от поне 150 екземпляра стриди от вида Crassotrea gigas на отделна част.
Sampling for the purposes of Article 5(1)(b) shall consist of at least 150 individuals of Crassostrea gigas oysters per compartment.
Когато се подбират тези животни, се вземат под внимание следните критерии:
When selecting those animals, the following criteria shall be taken into account:
Ако няма такива животни, подбраните животни включват здрави мекотели на възраст под 12 месеца,
If such animals are not present, the animals selected shall include healthy molluscs less than 12 months old.
когато се вземат проби от стопанства, в които за производство се използва повече от един водоизточник, животни от всички водоизточници трябва да се включат за вземане на проба по такъв начин, че всички части от стопанството да бъдат представени пропорционално в пробата,
When sampling in farms in which more than one water source is utilised for production, animals representing all water sources must be included for sampling in such a way that all parts of the farm are proportionally represented in the sample.
когато се вземат проби от райони за отглеждане на мекотели, се вземат животни от достатъчен брой точки за вземане на проба, най-малко три точки, като се включват в пробата по такъв начин, че всички части на района за отглеждане на мекотели да бъдат представени пропорционално в пробата, включително наличните естествени струпвания от мекотели в района.
When sampling in mollusc farming areas, animals from a sufficient number of sampling points, at least three sampling points, shall be included in the sample in such a way that all parts of the mollusc farming area are proportionally represented in the sample, including natural beds present in the mollusc farming area.
Основните фактори, които се отчитат при подбирането на тези точки за вземане на проби, са: откриване в миналото на OsHV-1 μvar в района, гъстота на зарибяване, водни течения, батиметрични характеристики на басейна и управленски практики;
The main factors to be considered for the selection of these sampling points are: previous detection of OsHV-1 μvar in the area, stocking density, water flows, bathymetry and management practices.
вземането на проби, предвидено в член 5, параграф 2, се извършва в периода на годината, когато е известно, че разпространението на OsHV-1 μvar в държавата-членка или в отделната част е най-голямо.
The sampling provided for in Article 5(2) shall be carried out in the period of the year when prevalence of OsHV-1 μvar in the Member State or compartment is known to be maximal.
Когато такива данни не са налични, вземането на проби се извършва непосредствено след периода, когато температурата на водата надвиши 16 °C, или по това време от годината, когато температурата обикновено достига своя годишен максимум;
When such data is not available, sampling shall be carried out just after the period when the water temperature exceeds 16 °C or at the time of the year when the temperature normally reaches its yearly maximum.
вземането на проби, предвидено в член 5, параграф 1, буква б), се извършва за предпочитане в периода на годината, описан в буква в). Ако пробите се вземат извън този период на годината, преди да бъдат изследвани стридите, взети за проба, трябва да се поддържат при условия, еквивалентни на описаните в буква в), за срок, който е подходящ за откриване на OsHV-1 μvar.
The sampling provided for in Article 5(1)(b) shall preferably be carried out in the period of the year described in point c. If samples are collected outside that period of the year, the sampled oysters must be maintained under conditions equivalent to those described in point c for a period suitable for the detection of OsHV-1 μvar, before being tested.
Диагностични методи за откриване на OsHV-1 μvar
Diagnostic methods of detecting OsHV-1 μvar
Настоящата процедура обяснява стандартен диагностичен метод, използван за откриване и идентификация на OsHV-1 μvar чрез полимеразна верижна реакция (наричана по-нататък „PCR“).
This procedure explains a standard diagnostic method to be used for OsHV-1 μvar detection and identification by Polymerase Chain Reaction (hereinafter PCR).
Той позволява да се прави разлика между OsHV-1 и OsHV-1 μvar.
It allows distinguishing between OsHV-1 and OsHV-1 μvar.
Когато е целесъобразно и с цел оптимизиране на условията за реакцията, както и за да се приспособят към оборудването и условията в тяхната собствена лаборатория, лабораториите могат да прилагат модификации на методите, описани в настоящото приложение, при условие че е възможно да се докажат същата чувствителност и специфичност.
When appropriate, in order to optimise the reaction conditions and to suit the equipment and conditions in their own laboratory, the laboratories may apply modifications to the methods described in this Annex, provided that an equal sensitivity and specificity can be demonstrated.
OsHV-1 μvar е определен в член 1 от настоящия регламент.
OsHV-1 μvar is defined in Article 1 of this Regulation.
Оборудване и условия на средата
Equipment and environmental conditions
Използваният диагностичен тест за откриване и идентифициране на OsHV-1 μvar чрез PCR изисква оборудване и условия на средата, обичайно използвани за PCR анализ, както следва:
The diagnostic test used for OsHV-1 μvar detection and identification by PCR requires the equipment and environmental conditions classically used for PCR assays as follows:
затворена лабораторна камина, оборудвана със система за производство на UV за елиминиране на потенциални замърсявания при приготвяне на сместа за PCR,
A closed hood equipped with an UV producing system to eliminate potential contaminations when preparing PCR mix.
два пълни комплекта пипети (2 μl, 20 μl, 200 μl и 1000 μl), първият — за извличане на ДНК, а вторият — за приготвяне на сместа за PCR,
Two complete sets of pipettes (2 μl; 20 μl; 200 μl and 1000 μl), the first one for DNA extraction, and the second one for PCR mix preparation.
три различни пипети: една пипета (2 μl) за разпределяне на пробите в сместа за PCR, друга (20 μl) пипета за вземане на проби с етидиев бромид и трета (20 μl) пипета за нанасяне на продуктите на PCR в агарозни гелове,
Three different pipettes: one pipette (2 μl) to dispense samples in PCR mix, one pipette (20 μl) for EB sampling and another pipette (20 μl) to load PCR products in agarose gels.
накрайници за пипети с филтър (2 μl, 20 μl, 200 μl и 1000 μl) за извличане на ДНК, приготвяне на сместа за PCR и разпределяне на пробата,
Filter pipette tips (2 μl; 20 μl; 200 μl and 1000 μl) for DNA extraction, PCR mix preparation and sample dispensing.
накрайници за пипети (20 μl) за събиране на етидиев бромид и за нанасяне на амплификационни продукти върху агарозен гел,
Pipette tips (20 μl) to collect EB and to load amplification products in agarose gel.
термоциклер за извършване на амплификации,
A thermal cycler to perform amplifications.
система за хоризонтална електрофореза — за електрофореза на продукти на PCR,
A horizontal electrophoresis system for PCR products electrophoresis.
UV плот за изследване на продукти на PCR след електрофореза в агарозен гел,
An UV table to observe PCR products after agarose gel electrophoresis.
система за получаване на снимки на геловете.
A system to acquire pictures of the gels.
Операторът трябва да носи лабораторно облекло и ръкавици по време на всички описани по-долу стъпки.
The manipulator must wear a lab coat and some gloves during all the different steps described bellow.
Лабораторното облекло и ръкавиците трябва да се сменят за предпочитане след всяка основна стъпка: извличане на ДНК, приготвяне на сместа за PCR, разпределяне на пробата, амплификация и нанасяне върху гела.
Lab coat and gloves must be changed preferably after each main step: DNA extraction, preparation of PCR mix, sample dispensing, amplification and gel loading.
Препоръчително е различните стъпки да се извършват в различни помещения.
It is recommended to perform these different steps in different rooms.
По-специално амплификацията и нанасянето върху гела/електрофорезата следва да се извършват в помещение, което е отделено от това за извличане на ДНК, приготвяне на сместа за PCR и разпределянето на ДНК.
More particularly, amplification and gel loading/electrophoresis should take place in a room separate from DNA extraction, PCR mix preparation and DNA dispensing.
Подготовка на пробата
Sample preparation
Живите или току-що умрели (неразложени) стриди, които предварително може да са били замразени, се обработват за извличане на ДНК.
Live or freshly dead (not decomposed) oysters, which can be previously frozen, are processed for DNA extraction.
Пробите се обработват по различен начин в зависимост от техния размер:
Samples are processed differently according to their size:
за ларви: пулове по 50 mg от целите животни (включително черупката), към които са добавени 200 μl дестилирана вода, се смачкват и се центрофугират на 1000 g за 1 минута;
For larvae, pools of 50 mg of the whole animals (including the shell) completed with 200 μl of distilled water are crushed and centrifuged at 1000 g for 1 minute.
за хайвер с размер по-малък или равен на 6 mm: пулове по 300 mg от целите животни (включително черупката), към които са добавени 1200 μl дестилирана вода, се смачкват и се центрофугират на 1000 g за 1 минута;
For spat smaller than or of 6 mm, pools of 300 mg of the whole animals (including the shell) completed with 1200 μl of distilled water are crushed and centrifuged at 1000 g for 1 minute.
за хайвер с размер между 6 и 15 mm: всички меки тъкани на всяко животно се смачкват поотделно;
For spat between 6 and 15 mm in size, all the soft tissues of each animal are crushed individually.
за животни, по-големи от 15 mm: частите от хрилете и мантията се изолират.
For animals bigger than 15 mm, pieces of gills and mantle are isolated.
Извличането на ДНК се извършва, като се използва QIAamp® DNA Mini Kit (QIAGEN) и се следват инструкциите на Протокола за изследване на тъкани.
DNA extraction is performed using the QIAamp® DNA Mini Kit (QIAGEN) and following the instructions for Tissue Test Protocol.
По-нататъшната подготовка на пробата се извършва в следния ред:
The further sample preparation is performed in the following order:
Поставят се 100 μl от супернатанта — за проби, посочени в букви а) и б), или от 10 до 50 mg от тъканите — за проби, посочени в букви в) и г), в микроцентрофужна епруветка от 1,5 ml и се добавят 180 μl буфер ATL.
Place 100 μl of supernatant for samples referred to in (a) and (b) or 10 to 50 mg of tissues for samples referred to point (c) and (d) in a 1,5 ml microcentrifuge tube and add 180 μl of Buffer ATL.
Добавят се 20 μl протеиназа К, смесва се с помощта на лабораторен вортекс и се инкубира при 56 °C, докато тъканта се разтвори напълно (една нощ).
Add 20 μl Proteinase K, mix by vortexing and incubate at 56 °C until the tissue is completely lysed (overnight).
При инкубирането от време на време се разбърква с вортекс, за да се дисперсира пробата.
Vortex occasionally during incubation to disperse sample.
Микроцентрофужната епруветка от 1,5 ml се центрофугира за кратко, за да се отстранят капките от запушалката.
Briefly centrifuge the 1,5 ml microcentrifuge tube to remove drops from the lid.
Към пробата се добавят 200 μl буфер AL, смесват с помощта на лабораторен вортекс на режим pulse за 15 s и се инкубира при 70 °C за 10 минути.
Add 200 μl Buffer AL to the sample, mix by pulse-vortexing for 15 s and incubate at 70 °C for 10 minutes.
Към пробата се добавят 200 μl етанол (96—100 %) и се смесват с помощта на лабораторен вортекс на режим pulse за 15 s. Микроцентрофужната епруветка от 1,5 ml се центрофугира за кратко, за да се отстранят капките от запушалката.
Add 200 μl ethanol (96-100 %) to the sample, and mix by pulse-vortexing for 15 s. Briefly centrifuge the 1,5 ml microcentrifuge tube to remove drops from the lid.
Сместа от стъпка 4 се поставя внимателно върху центрофужна колонка QIAamp (в 2 ml събирателна епруветка), без да се мокри ръбът.
Carefully apply the mixture from step 4 to the QIAamp Spin Column (in a 2 ml collection tube) without wetting the rim.
Капачката се затваря и се центрофугира при 10000 rpm за 1 min. Центрофужната колонка QIAamp се поставя в чиста 2 ml събирателна епруветка (предоставена в комплекта), а епруветката, съдържаща филтрата, се изхвърля.
Close the cap and centrifuge at 10000 rpm for 1 min. Place the QIAamp Spin Column in a clean 2 ml collection tube (provided in the kit) and discard the tube containing the filtrate.
QIAamp спин колонката се отваря внимателно и се добавят 500 μl буфер AW1, без да се мокри ръбът.
Carefully open the QIAamp Spin Column and add 500 μl Buffer AW1 without wetting the rim.
Капачката се затваря и се центрофугира при 10000 rpm за 1 min. Центрофужната колонка QIAamp се поставя в чиста 2 ml събирателна епруветка (предоставена в комплекта), а епруветката, съдържаща филтрата, се изхвърля.
Close the cap and centrifuge at 10000 rpm for 1 min. Place the QIAamp Spin Column in a clean 2 ml collection tube (provided in the kit) and discard the collection tube containing the filtrate.
Центрофужната колонка QIAamp се отваря внимателно и се добавят 500 μl буфер AW2, без да се мокри ръбът.
Carefully open the QIAamp Spin Column and add 500 μl Buffer AW2 without wetting the rim.
Капачката се затваря и се центрофугира при пълна скорост (14000 rpm) за 3 min.
Close the cap and centrifuge at full speed (14000 rpm) for 3 min.
(По избор) Центрофужната колонка QIAamp се поставя в нова 2 ml събирателна епруветка (не е предоставена в комплекта), а събирателната епруветка, съдържаща филтрата, се изхвърля.
(Optional) Place the QIAamp Spin Column in a new 2ml collection tube (not provided in the kit) and discard the collection tube containing the filtrate.
Центрофугира се при пълна скорост (14000 rpm) за 1 min.
Centrifuge at full speed (14000 rpm) for 1 min.
Центрофужната колонка QIAamp се поставя в чиста микроцентрофужна епруветка от 1,5 ml (не е предоставена в комплекта), а събирателната епруветка, съдържаща филтрата, се изхвърля.
Place the QIAamp Spin Column in a clean 1,5 ml microcentrifuge tube (not provided in the kit) and discard the collection tube containing the filtrate.
Центрофужната колонка QIAamp се отваря внимателно и се добавят 100 μl дестилирана вода.
Carefully open the QIAamp Spin Column and add 100 μl of distilled water.
Инкубира се 5 минути при стайна температура и се центрофугира при 10000 rpm за 1 min.
Incubate 5 minutes at room temperature and centrifuge at 10000 rpm for 1 min.
Качеството и ефикасността на извличането се контролират (например чрез измерване на оптичната плътност (260 nm) под спектрофотометър или след електрофорезата в агарозен гел).
Control the quality and efficacy of the extraction (for example by measuring OD (260 nm) under spectrophotometer or after electrophoresis in agarose gel).
Подготвя се разреждане на пробите, така че да се получи крайна концентрация на ДНК от 50—100 ng/μl.
Prepare dilution of your samples in order to have a final DNA concentration of 50-100 ng/μl.
ДНК разтворите се съхраняват при 4 °C, докато се извършват PCR анализите.
DNA solutions are kept at 4 °C until PCR analyses are performed.
Могат да се използват и други комплекти за извличане на ДНК, които са на разположение в търговската мрежа, при условие че те доказано дават сходни резултати.
Other commercial kits may be used for the DNA extractions provided they have been demonstrated to give similar results.
Полимеразна верижна реакция (PCR)
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Реактиви
Reactives
10 X буфер (предоставен с Taq ДНК полимераза),
10 X Buffer (furnished with the Taq DNA polymerase)
MgCl2 (предоставен с ДНК полимеразата) (25 mM),
MgCl2 (furnished with the DNA polymerase) (25 mM)
Taq ДНК полимераза (Goldstar, Eurogentec) 5 U/μl,
Taq DNA Polymerase (Goldstar, Eurogentec) 5 U/μl
dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTT) Основна смес (20 mM) преди употреба трябва да се разреди 10-кратно (до 2 mM),
dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTT) Master Mix (20mM) must be diluted 10 fold (at 2 mM) before use
d H2О (дестилирана H2О без ДНК и РНК).
d H2O (distilled H2O free of DNA and RNA)
Праймери
Primers
Трябва да се използват следните праймери [1]:
The following primers [1] must be used:
CF (10 μМ)
CF (10 μM)
CR (10 μМ)
CR (10 μM)
Смес за PCR
PCR mix
Сместа за PCR за всяка епруветка е:
PCR mix for each tube is:
Обем за епруветка
Volume per tube
Буфер (10 X)
Buffer (10 X)
MgCl2 (25 mM)
MgCl2 (25 mM)
dNTP (2 mM)
dNTP (2 mM)
Taq полимераза (5 U/μl)
Taq polymérase (5U/μl)
49 μl от тази смес за PCR е разпределена във всяка епруветка за PCR,
49 μl of this PCR mix is dispensed in each PCR tube
1 μl от извлечената ДНК (50—100 ng/μl) се добавя към всяка епруветка.
1 μl of extracted DNA (50-100 ng/μl) is added to each tube
Контроли
Controls
Използват се два вида контроли:
Two types of control are used:
Отрицателни контроли — състоят се от dH2O (1 μl за 49 μl смес за PCR).
Negative controls consist of dH2O (1 μl for 49 μl of PCR mix).
Те целят откриване на потенциално замърсяване на реактива или на работната среда.
They aim at detecting potential reactive contamination or working environment.
На всеки 10 проби или след всяка партида от проби се включва една отрицателна контрола.
One negative control should be included every 10 samples or after each batch of samples.
Положителни контроли — състоят се от плазмидни ДНК, съдържащи целевия геномен диапазон CF-CR на OsHV-1.
Positive controls consist of plasmidic DNA containing the OsHV-1 target genome region CF-CR.
Те целят проверяване на ефикасността на PCR.
They aim at checking the efficacy of the PCR reaction.
За всеки PCR анализ се включва една положителна контрола.
One positive control should be included for each PCR analysis.
Положителни контроли има в референтната лаборатория на Общността.
Positive controls are available from the Community Reference Laboratory.
Амплификация
Amplification
Циклите на амплификация се извършват в термоциклер.
Amplification cycles are performed in a thermal cycle apparatus.
начална денатурация: 2 минути при 94 °C,
Initial denaturation: 2 min at 94 °C
амплификация: 35 цикъла (1 минута при 94 °C, 1 минута при 50 °C и 1 минута при 72 °C),
Amplification: 35 cycles (1 min at 94 °C, 1 min at 50 °C and 1 min at 72 °C)
крайна елонгация: 5 минути при 72 °C.
Final elongation: 5 min at 72 °C
Електрофореза
Electrophoresis
50 X TAE (може да се закупи готов за директна употреба):
50 X TAE (can be bought directly ready for use):
Трис база (40 mM) 242 g,
Tris base (40 mM) 242 g
Ледена оцетна киселина (40 mM) 57,1 ml,
Acetic glacial acid (40 mM) 57,1 ml
Na2EDTA.2H2O (1 mM) 18,61 g,
Na2EDTA.2H2O (1 mM) 18,61 g
dH2O за 1 литър,
dH2O for 1 liter
Киселинността се коригира на pH 8
Ajust at pH 8
агарозен гел 2,5 % в 1X TAE,
Agarose gel 2,5 % in 1 X TAE
етидиев бромид (0,5 μg/ml), добавен след охлаждане на гела,
Ethidium bromide (0,5 μg/ml) added after cooling the gel.
нанасяне на контрастно вещество (синьо багрило):
Loading blue dye:
бромфенолово синьо 0,25 %,
Bromophenol blue 0,25 %
ксилен цианол FF 0,25 %,
Cyanol xylene FF 0,25 %
захароза 40 %.
Sucrose 40 %
Съхранява се при 4 °C.
Keep at 4 °C.