mwirth-epo/epo-nmt-datasets huggingface dataset:
아세토하이드록시산 신타제 (acetohydroxy acid synthase, AHAS) (ilvBNC)를 코딩하는 유전자를 증폭하기 위하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 hom(R407H) ilvA(F383A) 유래의 서열 (서열번호 7)에 근거하여 프로모터 부위 (개시코돈 상단 약 300bp)로부터 터미네이터 부위 (종결코돈 하단 약 100bp)까지 증폭하기 위한 프라이머(서열번호 8 및 9)의 양 말단에 BamHI (밑줄로 표시) 제한 효소 부위를 삽입하여 고안하였다.
-28Example 4: Construction of Wild-Type ilvBNC Plasmid Having Acetohydroxy Acid Synthase (AHAS) Activity In order to amplify a gene encoding acetohydroxy acid synthase (AHAS) (ilvBNC), the BamHI restriction site (underlined) was inserted at both ends of primers (SEQ ID NOS: 8 and 9) for amplifying from the promoter region (about 300 bp upstream from the initiation codon) to the terminator region (about 100 bp downstream from the termination codon), based on the sequence (SEQ ID NO: 7) derived from Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 hom(R407H) ilvA(F383A).
해당 서열은 하기 표 3에 나타내었다.
The corresponding sequences are shown in Table 3 below.
중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제 (SolGent co.,Ltd.)를 사용하였으며, PCR 증폭 조건은 95℃에서 10분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 56℃ 30초 어닐링, 72℃ 4분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다.
[Table 3] SEQ ID NO: Sequence (5'-3') 8 TCCGGATCCTGACACACCATGACCATTATTC 9 TCCGGATCCCTTATGTACAAAGTGCACAGC As a polymerase, SolgTM Pfu-X DNA polymerase (SolGent co., Ltd.) was used, and PCR conditions were as follows: denaturation at 95°C for 10 minutes; 30 cycles of denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 56°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 4 minutes; and polymerization at 72°C for 7 minutes.
그 결과 ilvBNC 유전자의 코딩 부위 4010bp의 DNA 단편을 수득하였다.
Asaresult,a4,010bp DNA fragment of the coding region of ilvBNC gene was obtained.
pECCG117 (대한민국 등록특허 제10-0057684호) 벡터와 ilvBN DNA 단편을 제한 효소 BamHⅠ으로 처리하고, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고 이를 pECCG117- ilvBNCWT라 명명하였다.
The pECCG117 vector (Korean Patent No. 10-0057684) and the ilvBN DNA fragment were treated with restriction enzyme BamHI, and ligated using a DNA ligase, and then cloned to obtain a plasmid, which was designated as pECCG117-ilvBNC WT.
실시예 5: 아세토하이드록시산 신타제 (acetohydroxy acid synthase, AHAS) 활성을 갖는 변이형 ilvBNC 플라스미드 제작
Example 5: Construction of Mutant ilvBNC Plasmid Having Acetohydroxy Acid Synthase (AHAS) Activity - 29In order to compare activity of the mutant ilvB producing a large amount of L isoleucine, a pair of primers (SEQ ID NOS: 8 and 10) for amplifying the 5'-upstream region of the mutation site, and a pair of primers (SEQ ID NOS: 11 and 9) for amplifying the 3'-downstream region of the mutation site were designed to construct a mutant introduced vector with respect to Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 hom(R407H) ilvA(F383A)-derived acetohydroxy acid synthase (HAS) (SEQ ID NO: 7) encoding ilvB gene.
L-이소류신을 과량 생산하는 변이형 ilvB의 활성을 비교하기 위해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 hom(R407H) ilvA(F383A) 유래의 아세토하이드록시산 신타제 (acetohydroxy acid synthase, AHAS) (서열번호 7)를 코딩하는 ilvB 유전자를 대상으로 변이 도입 벡터를 제작하기 위하여 변이 위치를 중심으로 5'상단 부위를 증폭하기 위한 프라이머 한쌍 (서열번호 8 및 10)과 3' 하단 부위를 증폭하기 위한 프라이머 한쌍 (서열번호 11 및 9)을 고안하였다.
BamHI restriction sites (underlined) were inserted at each end of primers of SEQ ID NOS: 8 and 9.
서열번호 8 및 9의 프라이머는 각 말단에 BamHⅠ 제한 효소 부위(밑줄로 표시)를 삽입하였고, 서열번호 10 및 11의 프라이머는 서로 교차되도록 고안한 부위에 뉴클레오티드 치환 변이(밑줄로 표시)가 위치하도록 하였다.
Primers of SEQ ID NOS: 10 and 11 were prepared such that the nucleotide substitution mutation (underlined) was located at a site designed to cross each other.
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 hom(R407H) ilvA(F383A)의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 8 및 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 9의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.
[Table 4] SEQ ID NO: Sequence (5'-3') 8 TCCGGATCCTGACACACCATGACCATTATTC CTTCgttGAAAGCGTCGGTACCCAG 11 CTTTCaacGAAGCCGATATCCGCGG 9 TCCGGATCCCTTATGTACAAAGTGCACAGC PCR was carried out using the chromosome of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 hom(R407H) ilvA(F383A) as a template and primers of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, and SEQ ID NO: 9.
중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제 (SolGent co.,Ltd.)를 사용하였으며, PCR 조건은 95℃에서 10분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 56℃ 30초 어닐링, 72℃ 3분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
As a polymerase, Solg TM Pfu-X DNA polymerase (SolGent co., Ltd.) was used, and PCR conditions were as follows: denaturation at 95°C for 10 minutes; 30 cycles of denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 56°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 3 minutes; and polymerization at 72°C for 5 minutes.
그 결과 ilvB유전자의 변이를 중심으로 5'상단 부위의 712bp DNA 단편과 3'하단 부위의 3310bp의 DNA 단편을 수득하였다.
As a result, a 712 bp DNA fragment of the 5' upstream region of the mutation of ilvBNC gene and a 3,310 bp DNA fragment of the 3' downstream region of the mutation of the ilvBNC gene were obtained.
증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 8 및 서열번호 9의 프라이머로 PCR을 수행하였다.
- 30PCR was carried out using the amplified two DNA fragments as templates and primers of SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9.
PCR 조건은 95℃에서 10분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 56℃ 30초 어닐링, 72℃ 4분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다.
PCR conditions were as follows: denaturation at 95°C for 10 minutes; 30 cycles of denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 56°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 4 minutes; and polymerization at 72°C for 7 minutes.
그 결과, 136번째 글루타민이 아스파라긴으로 치환된 아세토하이드록시산 신타제 (acetohydroxy acid synthase, AHAS) 변이체 (서열번호 12)를 코딩하는 ilvB 유전자의 변이(서열번호 2)를 포함하는 4010bp의 DNA 단편이 증폭되었다.
As a result, a 4,010 bp DNA fragment was amplified, which includes the mutant ilvB gene (SEQ ID NO: 2) encoding the acetohydroxy acid synthase (AHAS) variant (SEQ ID NO: 12), in which glutamine at position 136 was substituted with asparagine.
pECCG117 (대한민국 등록특허 제10-0057684호) 벡터와 ilvBN DNA 단편을 제한 효소 BamHⅠ으로 처리하고, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로서 플라스미드를 획득하였고 이를 pECCG117-ilvB(Q136N)NC라 명명하였다.
The pECCG117 vector (Korean Patent No. 10-0057684) and the ilvBN DNA fragment were treated with restriction enzyme BamHI and ligated using a DNA ligase, and then cloned to obtain a plasmid, which was designated as pECCG117-ilvB(Q136N)NC.
상기의 실시예 4 및 5에서 제작된 pECCG117-ilvBNC WT,pECCG117-ilvB(Q136N)NC 벡터를 실시예 3에서 제작된 WT△ilvBNC 균주에 전기펄스법으로 도입한 후 카나마이신(kanamycin) 25mg/L를 함유한 선별배지에 도말하여 각각의 형질전환주를 획득하였다.
Example 6: Comparative Experiment of Activities of Wild-Type and Mutant ilvB Having Acetohydroxy Acid Synthase (AHAS) Activity The pECCG117-ilvBNC WT and pECCG117-ilvB(Q136N)NC vectors, each prepared in Examples 4 and 5, were introduced into the WTAilvBNC strain prepared in Example 3 by an electric pulse method, and then each was plated on a selection medium containing 25 mg/L of kanamycin to obtain a transformant.
상기에 제작된 균주의 L-이소류신 생산능을 비교하고자 아래와 같은 방법으로 배양하여 배양액 중 L-이소류신 농도를 분석하였다.
In order to compare L-isoleucine productivities of the prepared strains as above, the strains were cultured by the following method, and the concentration of L-isoleucine in the culture medium was analyzed.
하기의 배지 25㎖을 함유하는 250㎖ 코너-바플 플라스크에 균주를 1백금이 접종하고, 32℃에서 50시간 동안, 200rpm으로 진탕 배양하였다.
One platinum loop of each strain was inoculated into a 250 mL corner-baffle flask containing 25 mL of the following medium and cultured in a shaking incubator at 200 rpm at 32°C for 50 hours.
HPLC를 이용하여 L-이소류신 농도를 분석하였으며, 분석된 농도는 표 5와 같다.
The concentrations of L-isoleucine were analyzed by HPLC, and the analyzed concentrations are as shown in Table 5.
포도당 100 g, (NH4)2SO4 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준).
<Medium composition (pH 7.0)> Glucose 100 g, (NH4 ) 2SO4 40 g, Soybean Protein 2.5 g, Corn Steep Solids 5 g, -31Urea 3 g, KH 2PO4 1 g, MgSO4-7H20 0.5 g, Biotin 100 pg, Thiamine HCl 1,000 pg, Calcium-Pantothenic Acid 2,000 pg, Nicotinamide 3,000 pg, CaCO3 30 g (based on 1 L of distilled water).
상기의 표 5를 참고하면, 대조군 ilvBNC WT 플라스미드가 도입된 균주 대비, ilvB(Q136N)변이 플라스미드가 도입된 균주의 경우 L-이소류신을 13배 이상 생산하는 것을 확인하였다.
[Table 5] L-Isoleucine (g/L) Strain Batch 1 Batch 2 Batch 3 ATCC 13032 hom(R407H) 0.21 0.19 0.22 ilvA(F383A) ATCC 13032 hom(R407H) 0 0 0 ilvA(F383A) AilvBNC ATCC 13032 hom(R407H) ilvA(F383A) AilvBNC/ pECCG117- 0.23 0.22 0.24 ilvBNCWT ATCC 13032 hom(R407H) ilvA(F383A) AiIvBNC/pECCGI J7- 3.12 3.24 3.21 ilvB(Q136N)NC Referring to Table 5 above, the strain introduced with the ilvB(Q136N) mutant plasmid showed an at least 13-fold increase in the L-isoleucine production, as compared with the strain introduced with the control ilvBNC WT plasmid.
즉, 상기 변이가 도입된 균주는 결과적으로 아세토하이드록시산 신타제 (acetohydroxy acid synthase, AHAS)의 활성이 좋아져, L-이소류신을 고효율 및 고수율로 생산할 수 있음을 확인할 수 있었다.
That is, the mutant introduced strain had enhanced acetohydroxy acid synthase (AHAS) activity, thereby producing L-isoleucine with high efficiency and in high yield.
상기 변이 Q136N이 도입된 균주를 CA10-3106이라 명명하였다.
The mutant Q136N intrdouced strain was designated as CA10-3106.
상기 CA10-3106은 부다페스트조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터에 2018년 12월 3일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM12415P를 부여받았다.
The CA1O-3106 was deposited to the Korean Culture Center of Microorganisms, which is an international depository authority under the Budapest Treaty, on December 3, 2018, with Accession No.
KCCM11248P 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 11040 (Corynebacterium glutamicum KFCC 11040, 대한민국특허 공개번호 제2000-0002407호)에 L-쓰레오닌 유도체인 α-아미노-β-하이드록시노르발린 (α-amino-β-hydroxynorvaline)과 L-이소류신 유도체인 4-티아이소루신 (4-thiaisoleucine) 및 이소루신-하이드록사메이트 (isoleucine-hydroxamate)의 공통내성을 나타내는 변이주(Corynebacterium glutamicum KCJI-38, KCCM11248P, 대한민국특허 등록번호 10-1335789호)로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 hom(R407H) ilvA(F383A)보다 높은 수율로 L-이소루신을 생산하는 것이 확인된 바 있다.
- 32The KCCM11248P strain is a mutant strain (Corynebacterium glutamicum KCJI 38, KCCM11248P; Korean Patent No. 10-1335789) showing common resistance to a amino-p-hydroxynorvaline, which is an L-threonine derivative, and 4-thiaisoleucine and isoleucine-hydroxamate, which are L-isoleucine derivatives, in Corynebacterium glutamicum KFCC 11040 (Korean Patent Publication No. 2000-0002407), and the strain was confirmed to produce L-isoleucine in high yield, as compared with Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 hom(R407H) ilvA(F383A).
보다 많은 양의 L-이소류신을 생산하는 균주에서의 ilvB 변이체의 효과를 확인하기 위하여, 상기의 실시예 3과 동일한 방법으로 제작하여 KCCM11248P ΔilvBNC균주를 제작하였다.
To examine the effect of the ilvB variant in the strain producing a larger amount of L-isoleucine, the KCCM11248P AilvBNC strain was prepared in the same manner as in Example 3.
또한 상기의 실시예 4와 5에서 제작된 pECCG117-ilvBNC WT, pECCG117-ilvB(Q136N)NC 벡터를 이소류신 생산능이 증대된 균주인 코리네박테리움 글루타미컴 KCJI-38 (KCCM11248P)에 전기펄스법으로 도입한 후 카나마이신(kanamycin) 25mg/L를 함유한 선별배지에 도말하여 각각의 형질전환주를 획득하였다.
Further, the pECCG117-ilvBNC WT and pECCG117-ilvB(Q136N)NC vectors, prepared in Examples 4 and 5, respectively, were introduced into Corynebacterium glutamicum KCJI-38 (KCCM11248P), which is a strain having an enhanced ability to produce isoleucine, by an electric pulse method, and then each was plated on a selection medium containing 25 mg/L of kanamycin to obtain a transformant.
상기에 제작된 균주의 L-이소류신 생산능을 비교하고자 실시예 6과 동일한 방법으로 배양하여 배양액 중 L-이소류신 농도를 분석하였으며, 분석된 농도는 표 6과 같다.
To compare L-isoleucine productivities of the prepared strains as above, the strains were cultured in the same manner as in Example 6.
상기의 표 6을 참고하면, 대조군 ilvBNC WT 플라스미드가 도입된 균주 대비, ilvB(Q136N)변이 플라스미드가 도입된 균주의 경우 L-이소류신을 약 6배 높게 생산하는 것을 확인하였다.
[Table 6] L-Isoleucine (g/L) Strain Batch 1 Batch 2 Batch 3 Corynebacterium glutamicum KC JI 0.92 0.87 0.84 38 (KCCM11248P) KCCMJ1248PAilvBNC 0 0 0 KCCM11248PAilvBNC/ 1.21 1.4 1.28 pECCG117-ilvBNC WT - 33KCCM] l248PAilvBNC/pECCG1 17- 74.677 ilvB(Q]36N)NC Referring to Table 6 above, the strain introduced with the ilvB(Q136N) mutant plasmid showed an about 6-fold increase in the L-isoleucine production as compared with the strain introduced with the control ilvBNC WT plasmid.
상기 실시예 6을 통해 L-이소류신 생산능이 높은 ilvB 변이 위치인 136번째 위치가 생산능 증가에 중요한 위치임을 확인하기 위하여 다른 아미노산이 치환된 변이형을 제작하여 그 효과를 확인하였다.
Example 7: Construction of Mutant ilvBNC Plasmid Having Acetohydroxy Acid Synthase (AHAS) Activity In order to examine that position 136, which was confirmed in Example 6 as the ilvB mutation site with high L-isoleucine productivity, is an important position for increasing productivity, mutant types having different amino acid substitutions were prepared, and the effects thereof were confirmed.
ilvB의 136번째 아미노산 위치에 다른 아미노산이 치환된 17종을 추가로 제작하였으며, 실시예 4에서 제작된 플라스미드를 주형으로 사용하였다.
17 mutants, each in which the amino acid at position 136 of ilvB was substituted with another amino acid, were additionally prepared, and the plasmid prepared in Example 4 was used as a template.
각각의 변이형, 치환된 아미노산 및 각 변이형에 사용된 프라이머 서열번호는 다음 표 7에 나타내었다.
Respective mutants, substituted amino acids, and primers used in each mutant are shown in Table 7 below.
구체적으로, 상기 표 7에서 제시한 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.
[Table 7] Mutant plasmid Substituted amino acid SEQ ID NO of primer Q136R SEQ ID NO: 8, 13 /SEQ ID NO: 14, 9 Q136F SEQ ID NO: 8, 15 /SEQ ID NO: 16, 9 136 mutation Q136S SEQ ID NO: 8, 17 /SEQ ID NO: 18, 9 Q136Y SEQ ID NO: 8, 19 /SEQ ID NO: 20, 9 - 34Q136C SEQ ID NO: 8, 21 / SEQ ID NO: 22, 9 Q136P SEQ ID NO: 8, 23 / SEQ ID NO: 24, 9 Q136H SEQ ID NO: 8, 25 / SEQ ID NO: 26, 9 Q136L SEQ ID NO: 8, 27 / SEQ ID NO: 28, 9 Q1361 SEQ ID NO: 8, 29 / SEQ ID NO: 30, 9 Q136T SEQ ID NO: 8, 31 / SEQ ID NO: 32, 9 Q136K SEQ ID NO: 8, 33 / SEQ ID NO: 34, 9 Q136V SEQ ID NO: 8, 35 / SEQ ID NO: 36, 9 Q136A SEQ ID NO: 8, 37 / SEQ ID NO: 38, 9 Q136D SEQ ID NO: 8, 39 / SEQ ID NO: 40, 9 Q136E SEQ ID NO: 8, 41 / SEQ ID NO: 42, 9 Q136G SEQ ID NO: 8, 43 / SEQ ID NO: 44, 9 Q136W SEQ ID NO: 8, 45 / SEQ ID NO: 46, 9 Specifically, PCR was carried out using the primers in Table 7.
중합효소는 SolgTM Pfu-X DNA 폴리머라제 (SolGent co.,Ltd.)를 사용하였으며, PCR 조건은 95℃에서 10분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 56℃ 30초 어닐링, 72℃ 3분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
As a polymerase, SolgTM Pfu-X DNA polymerase (SolGent co., Ltd.) was used, and PCR conditions were as follows: denaturation at 95°C for 10 minutes; 30 cycles of denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 56°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 3 minutes; and polymerization at 72°C for 5 minutes.
그 결과 ilvB유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 712bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 3310bp의 DNA 단편을 수득하였다.
As a result, a 712 bp DNA fragment of the 5' upstream region of the ilvB gene and a 3,310 bp DNA fragment of the 3'-downstream region of the ilvB gene were obtained.
증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 8 및 서열번호 9의 프라이머로 PCR을 수행하였다.
PCR was carried out using the amplified two DNA fragments as a template and primers of SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9.
그 결과, 136번째 글루타민이 표 7의 각 아미노산으로 치환된 아세토하이드록시산 신타제 (acetohydroxy acid synthase, AHAS) 변이체를 코딩하는 ilvB 유전자의 변이를 포함하는 4010bp의 DNA 단편이 증폭되었다.
As a result, 4,010bp DNA fragments were - 35amplified, each including the mutant ilvB gene encoding the acetohydroxy acid synthase (AHAS) variant in which glutamine at position 136 was substituted with each amino acid of Table 7.
pECCG117 (대한민국 등록특허 제10-0057684호) 벡터와 PCR을 통해 수득한 4010bp의 ilvBNC DNA 단편을 제한 효소 BamHⅠ으로 처리하고, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였다.
The pECCG117 vector (Korean Patent No. 10-0057684) and each of the 4,010 bp ilvBNC DNA fragments obtained by PCR were treated with restriction enzyme BamHI and ligated using a DNA ligase, and then cloned to obtain each plasmid.
이로써 136번째 글루타민이 표 7에 나타난 아미노산으로 치환된 17종의 ilvB 변이 벡터가 제작되었고, 표 8과 같이 명명하였다.
As a result, 17 ilvB mutant vectors were prepared, each having substitution of glutamine at position 136 with the amino acid of Table 7, and designated as in Table 8.
실시예 8: 아세토하이드록시산 신타제 (acetohydroxy acid synthase, AHAS) 활성을 갖는 변이형 ilvB의 L-이소류신 생산능 평가
[Table 8] Mutation site Substituted amino acid SEQ ID NO of primer Q136R pECCG117-ilvB(Q136R)NC Q136F pECCG117-ilvB(Q136F)NC Q136S pECCG117-ilvB(Q136S)NC Q136Y pECCG117-ilvB(Q136Y)NC Q136C pECCG117-ilvB(Q136C)NC Q136P pECCG117-ilvB(Q136P)NC Q136H pECCG117-ilvB(Q136H)NC ilvB 136 mutation Q136L pECCG117-ilvB(Q136L)NC Q1361 pECCG117-ilvB(Q1361)NC Q136T pECCG117-ilvB(Q136T)NC Q136K pECCG117-ilvB(Q136K)NC Q136V pECCG117-ilvB(Q136V)NC Q136A pECCG117-ilvB(Q136A)NC Q136D pECCG117-ilvB(Q136D)NC Q136E pECCG117-ilvB(Q136E)NC - 36Q136G pECCG1I17-ilvB(Q 13 6G)NC Q136W pECCG1I17-ilvB(Q136W)NC Example 8: Evaluation of L-Isoleucine Productivity of Mutant ilvB Having Acetohydroxy Acid Synthase (AHAS) Activity Each of the 17 mutant plasmids prepared in Example 7 was introduced into the WTAilvBNC strain prepared in Example 3 by an electric pulse method, and then each was plated on a selection medium containing 25 mg/L of kanamycin to obtain a transformant.
그 후, 실시예 6과 동일한 방법으로 플라스크 평가를 진행하였다.
Thereafter, a flask test was performed in the same manner as in Example 6.
그 결과는 다음 표 9과 같다.
The results are shown in Table 9 below.
상기의 표 9에서 볼 수 있듯이, ilvB의 136번째 아미노산이 변이된 변이체를 포함하는 모든 변이주에서 각각 야생형 보다 높은 수준으로 L-이소류신을 생성하는 것을 확인하였다.
[Table 9] L-Isoleucine (g/L) Strain Batch 1 Batch 2 Batch 3 ATCC 13032 hom(R407H) 0.23 0.21 0.20 ilvA(F383A) ATCC 13032 hom(R407H) 0 0 0 ilvA(F383A) AilvBNC ATCC 13032 hom(R407H) ilvA(F383A) AilvBNC/pECCG117- 0.21 0.20 0.19 ilvBNC WT ATCC 13032 hom(R407H) ilvA(F383A) AilvBNC/pECCG117- 3.01 3.12 3.20 ilvB(Q136N)NC ATCC 13032 hom(R407H) 2.87 3.00 2.95 ilvA(F383A)AilvBNC/pECCG117 -37ilvB(Q136R)NC ATCC 13032 hom(R407H) ilvA(F383A) AilvBNC/pECCG117- 3.11 3.15 3.04 ilvB(Q136F)NC ATCC 13032 hom(R407H) ilvA(F383A) AilvBNC/pECCG117- 1.89 0.86 0.91 ilvB(Q136S)NC ATCC 13032 hom(R407H) ilvA(F383A) AilvBNC/pECCG117- 2.96 2.76 2.74 ilvB(Q136Y)NC ATCC 13032 hom(R407H) ilvA(F383A) AilvBNC/pECCG117- 2.56 2.48 2.61 ilvB(Q136C)NC ATCC 13032 hom(R407H) ilvA(F383A) AilvBNC/pECCG117- 1.45 1.23 1.34 ilvB(Q136P)NC ATCC 13032 hom(R407H) ilvA(F383A) AilvBNC/pECCG117- 2.99 2.96 2.98 ilvB(Q136H)NC ATCC 13032 hom(R407H) ilvA(F383A) AilvBNC/pECCG117- 3.02 3.10 3.06 ilvB(Q136L)NC ATCC 13032 hom(R407H) ilvA(F383A) AilvBNC/pECCG117- 2.45 2.41 2.39 ilvB(Q1361)NC - 38ATCC 13032 hom(R407H) ilvA(F383A) AilvBNC/pECCG117- 0.81 0.83 0.79 ilvB(Q136T)NC ATCC 13032 hom(R407H) ilvA(F383A) AilvBNC/pECCG117- 3.01 3.05 3.00 ilvB(Q136K)NC ATCC 13032 hom(R407H) ilvA(F383A) AilvBNC/pECCG117- 1.23 1.25 1.19 ilvB(Q136V)NC ATCC 13032 hom(R407H) ilvA(F383A) AilvBNC/pECCG117- 3.00 3.01 2.94 ilvB(Q136A)NC ATCC 13032 hom(R407H) ilvA(F383A) AilvBNC/pECCG117- 2.75 2.81 2.83 ilvB(Q136D)NC ATCC 13032 hom(R407H) ilvA(F383A) AilvBNC/pECCG117- 1.01 1.01 0.99 ilvB(Q136E)NC ATCC 13032 hom(R407H) ilvA(F383A) AilvBNC/pECCG117- 1.02 0.98 1.05 ilvB(Q136G)NC ATCC 13032 hom(R407H) ilvA(F383A) AilvBNC/pECCG117- 2.65 2.67 2.63 ilvB(Q136W)NC As shown in Table 9, it was confirmed that all mutant strains, each including the mutant amino acid at position 136 of ilvB, produced a high level of L-isoleucine as - 39compared with the wild-type.
이와 같은 결과로 ilvB의 136번째 위치가 다른 아미노산으로 치환할 경우 L-이소류신의 생산능을 증가시키는 중요 위치임을 확인할 수 있었다.
These results indicate that substitution of the amino acid at position 136 of ilvB with another amino acid is important for increasing L-isoleucine productivity.
상기의 결과를 볼 때, 본 출원의 변이체가 L-이소류신의 생산을 증가시킴을 확인할 수 있었다.
The above results suggest that the variants of the present disclosure increase L isoleucine production.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
From the foregoing, a skilled person in the art to which the present disclosure pertains will be able to understand that the present disclosure may be embodied in other specific forms without modifying the technical concepts or essential characteristics of the present disclosure.
이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
In this regard, the exemplary embodiments disclosed herein are only for illustrative purposes and should not be construed as limiting the scope of the present disclosure.
본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
On the contrary, the present disclosure is intended to cover not only the exemplary embodiments but also various alternatives, modifications, equivalents, and other embodiments that may be included within the spirit and scope of the present disclosure as defined by the appended claims.
한국미생물보존센터KCCM12415P20200902
International Depositary Authority: Korean Culture Center of Microorganisms Accession No: KCCM12415P Date of deposit: 20181203 - 40
[본 발명은, 한 쌍의 사이드 프레임을 포함하는 직기(織機) 프레임 및 각 사이드 프레임에 장착되어 종광 프레임의 상하 이동을 안내하는 종광 프레임 가이드를 구비하고, 양 사이드 프레임의 사이에 가설(架設)되는 로킹 축, 주축, 복권(服卷) 롤이 지지축을 통하여 각 사이드 프레임에 지지되어 있는 직기로서, 지지축이 적어도 사이드 프레임의 내측벽에 설치된 지지부에 끼워져 장착된 베어링을 통하여 지지되는 직기에 관한 것이다.]
The present invention relates to a loom including a loom frame including a pair of side frame and heddle frame guides each attached to each of the side frames and configured to guide up-and-down movement of a heddle frame, wherein a rocking shaft, a main shaft, and a cloth winding roll bridged between both the side frames are supported on each of the side frames via support shafts and the support shafts are supported via bearings fitted in support parts provided in at least inner walls of the side frames.
[일반적인 직기는, 예를 들면 특허문헌 1에 개시되어 있는 바와 같이, 직기 프레임에서의 한 쌍의 사이드 프레임의 사이에 가설된 로킹 축(로킹 샤프트) 및 주축(主軸)(구동축)을 가지고 있다.
As disclosed in PTL 1, for example, a general loom has a rocking shaft and a main shaft (drive shaft) bridged between a pair of side frames of a loom frame.
그리고, 그 로킹 축 및 주축은, 각 사이드 프레임에 있어서 그 사이드 프레임의 내측벽 및 외측벽의 각각에 대하여 베어링을 통하여 지지된 지지축에 연결됨으로써, 양 사이드 프레임 사이에 설치되어 있다.]
The rocking shaft and the main shaft are provided between both the side frames by being connected to support shafts supported via bearings with respect to each of an inner wall and an outer wall of each of the side frames.
[또한, 직기는, 제직(製織)된 직포를 직포 밀도에 따른 속도로 권취빔 측에 보내는 권취 기구(機構)를 구비하고 있고, 그 권취 기구는, 한 쌍의 사이드 프레임의 사이에 가설된 복권 롤을 구비하고 있다.
The loom also has a winding mechanism configured to send the manufactured woven fabric toward a winding beam at a speed corresponding to a woven fabric density.
또한, 그 복권 롤도, 상기와 같은 형태로 각 사이드 프레임에 지지된 지지축에 연결됨으로써, 양 사이드 프레임 사이에 설치된 상태로 되어 있는 것이 일반적이다.]
For reference, the cloth winding roll is also generally provided between both the side frames by being connected to support shafts supported on each of the side frames in the above-described form.
[나아가서는, 직기는, 개구 장치에서의 종광 프레임의 상하 이동을 안내하기 위한 한 쌍의 종광 프레임 가이드를 구비하고 있다.
In addition, the loom has a pair of heddle frame guides for guiding up-and-down movement of a heddle frame of an opening device.
그리고, 그 종광 프레임 가이드는, 각 사이드 프레임에 지지되는 형태로 직기 상에 설치되어 있다.]
The heddle frame guides are each provided on the loom in a form of being supported on each of the side frames.
[그리고, 직기는, 제직하는 직물의 짜는 폭(織幅)을 기준으로 하여 그 사양이 정해져 있다.
Note that, the specification of the loom is defined based on a weaving width of a fabric to be woven.
그리고, 직기에 탑재되는 종광 프레임은, 그 직기에 있어서 제직할 수 있는 최대의 짜는 폭에 따른 폭으로 되어 있다.
The heddle frame mounted on the loom has a width corresponding to the greatest weaving width that can be woven in the loom.
또한, 그 직기에 있어서는, 종광 프레임은, 전술한 바와 같이 한 쌍의 종광 프레임 가이드에 의해 상하 이동을 안내하지만, 그 각 종광 프레임 가이드는, 대응하는 사이드 프레임에 장착된 브래킷(bracket) 등에 의해 지지되어 있다.]
The heddle frame guides are each supported by means of brackets and the like each attached to the corresponding side frame.
[이 때문에, 그 한 쌍의 종광 프레임 가이드의 간격은, 직기의 폭 방향에서의 양쪽 브래킷의 위치에 의해 획정(劃定)된다.
For this reason, an interval between the pair of heddle frame guides is defined by positions of both the brackets in a width direction of the loom.
따라서, 그 브래킷이 장착되는 양 사이드 프레임의 간격은, 그 각 사이드 프레임에 대하여 브래킷를 통하여 지지되는 한 쌍의 종광 프레임 가이드가 종광 프레임을 전술한 바와 같이 안내할 수 있는 간격으로 배치된 상태가 되도록 설정된다.
Therefore, an interval between both the side frames to which the brackets are attached is set such that the pair of heddle frame guides supported on each of the side frames via the brackets is arranged at an interval at which they can guide the heddle frame as described above.
즉, 직기 프레임에서의 한 쌍의 사이드 프레임의 간격은, 그 브래킷이 장착되는 위치(경사(warp threads) 방향에서의 종광 프레임 가이드를 지지하는 위치)의 간격이 상기와 같은 종광 프레임 가이드의 배치를 실현하도록 되어 있고, 종광 프레임의 폭을 고려한 그 브래킷이 장착되는 위치의 간격을 기준으로 하여 정해져 있다.]
Specifically, the interval between the pair of side frames of the loom frame is set such that the interval between positions in which the brackets are attached (positions in a warp direction, in which the heddle frame guides are supported) implements arrangement of the heddle frame guides as described above, and is determined based on the interval between the positions in which the brackets are attached taking into consideration a width of the heddle frame.
[또한, 많은 직기에서는, 그 브래킷은, 사이드 프레임의 내측면에 대하여 장착되어 있다.
For reference, in most of the looms, the brackets are attached to the inner surfaces of the side frames.