mwirth-epo/epo-nmt-datasets huggingface dataset:
Nella forma di realizzazione delle figura, la seconda stazione di lavorazione 4 si sviluppa sostanzialmente in verticale rispetto al piano di riferimento P nel seguente ordine, a partire dal basso, prima unità di lucidatura 15, seconda unità di lucidatura 16 e unità di deposito 17 di contenitori (figura 6).
In the embodiment of the figures, the second processing station 4extends substantially vertically with respect to the reference plane P in the following order, starting from the bottom, first polishing unit 15, second polishing unit 16, and storage unit 17of containers (FIG. 6).
Il primo gruppo di movimentazione 5 è configurato per depositare nell'unità di deposito 17 la pluralità di contenitori 2 fatti transitare nella prima unità di lucidatura 15 e successivamente nella seconda unità di lucidatura 16.
The first moving unit 5is configured to store, in the storage unit 17, the plurality of containers 2passed in the first polishing unit 15and then in the second polishing unit 16.
In guesta forma di realizzazione, tale unità di deposito 17 comprende una pluralità di alloggiamenti, ciascuno dei guali atto ad accogliere un contenitore della pluralità di contenitori 2 depositati dal primo gruppo di movimentazione 5.
In this embodiment, such a storage unit 17comprises a plurality of housings, each of which is adapted to receive a container of the plurality of containers 2stored by the first moving unit 5.
Sempre in guesta forma di realizzazione, il secondo gruppo di movimentazione 7 del sistema 100 è altresì configurato per prelevare dall'unità di deposito 17 della seconda stazione di lavorazione 4 la pluralità di contenitori 2 depositati dal primo gruppo di movimentazione 5 e trasferire tale pluralità di contenitori 2 sui secondi mezzi di trasporto 6 di contenitori del sistema 100.
Again in this embodiment, the second moving unit 7of the system 100is also configured to pick up the plurality of containers 2stored by the first moving unit 5from the storage unit 17of the second processing station 4, and transfer such a plurality of containers 2to the second conveyor means 6of containers of the system 100.
Ritornando ai secondi mezzi di trasporto 6 di contenitori, nella forma di realizzazione delle figure, essi comprendono un ulteriore trasportatore 18, ad esempio una rulliera o un nastro trasportatore, configurato per convogliare dalla zona di sigillatura Z2 dei contenitori una pluralità di contenitori 2 suddivisi in gruppi ciascuno preferibilmente alloggiato all' interno di una rispettiva scatola o scatolone.
Returning to the second conveyor means 6of containers, in the embodiment of the figures, they comprise a further conveyor 18, for example a roller set or a conveyor belt, configured to convey a plurality of containers 2divided in groups from the sealing zone Z2of containers, each preferably accommodated within a respective box or carton.
''Procedimento di rivelazione in fluorescenza dell'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) di un acido nucleico bersaglio, relativi oligonucleotidi e kit" La presente invenzione riguarda un procedimento di rivelazione in fluorescenza dell'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) di acidi nucleici bersaglio, un set di oligonucleotidi ed un kit per attuare il procedimento dell'invenzione.
The present invention relates to a method for detecting nucleic acid amplification by means of loop-mediated isothermal amplification (LAMP), as well as to a set of oligonucleotides and a kit for carrying out the method of the invention.
L'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) è un metodo recentemente sviluppato per 1'amplificazione degli acidi nucleici per mezzo di una reazione autociclica di spiazzamento del filamento ("strand displacement") che viene attuata a temperatura costante, usualmente fra 60°C e 65°C (Notomi T. et al 2000.
Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is a recently developed method of nucleic acid amplification via an autocyclic strand displacement reaction, which is performed at a constant temperature, usually between 60° C. and 65° C. (Notomi T. et al 2000.
Questa tecnologia fa uso di una DNA polimerasi con attività di spiazzamento del filamento e di un set di quattro oligonucleotidi, chiamati primer interni ed esterni, specificamente progettati per riconoscere sei differenti siti di riconoscimento sull'acido nucleico bersaglio.
This technology employs a DNA polymerase with strand displacement activity and a set of four oligonucleotides, termed inner and outer primers, specifically designed to recognize six different recognition sites on the target nucleic acid.
I due primer esterni svolgono un ruolo solo durante la fase non ciclica nello spiazzamento del filamento, mentre i primer interni includono sia sequenze senso sia sequenze antisenso e contribuiscono alla formazione dei tipici prodotti di amplificazione LAMP aventi una struttura a stelo-ansa ("stemloop").
The two outer primers play a role in strand displacement during the non-cyclic step only whereas the inner primers include both sense and antisense sequences and contribute to formation of typical LAMP amplification products having stem-loop structures.
Oltre ai quattro primer oligonucleotidici, il saggio LAMP può comportare l'uso di due primer aggiuntivi, i cosiddetti loop primers, per migliorare l'efficienza di amplificazione, portando quindi ad un totale di sei primer per sequenza bersaglio.
In addition to the four oligonucleotide primers, the LAMP assay may involve the use of two additional primers, the so-called loop primers, to improve amplification efficiency, thereby resulting in a total of six primers per target sequence.
Tale combinazione di differenti primer, che abbracciano otto sequenze distinte sull'acido nucleico bersaglio, consente un notevole grado di specificità del saggio.
Such a combination of different primers, which span eight distinct sequences on the target nucleic acid, provides for a remarkable degree of assay specificity.
La tecnologia basata sulla LAMP possiede il vantaggio dell'elevata sensibilità, della rapidità di amplificazione e della semplicità di attuazione.
LAMP-based technology possesses the advantages of high sensitivity, rapid amplification, and simple operation.
I saggi LAMP consentono un'alta efficienza di sintesi dei prodotti di amplificazione, che è almeno 50 volte superiore a quella ottenuta per reazione PCR classica con volumi identici.
LAMP assay results in a highly efficient synthesis of amplified products, which is at least 50 times higher than the one obtained by classical PCR reactions in identical volumes.
Inoltre, la capacità di amplificare l'acido nucleico in condizioni isotermiche consente l'uso di attrezzature semplici ed economiche, senza la necessità di cicli termici.
In addition, the ability to amplify nucleic acid under isothermal conditions enables the use of simple and cost-effective equipment, without the requirement of thermal cycling.
Nei saggi LAMP, sia l'amplificazione sia la rivelazione di ampliconi specifici possono essere realizzate in un unico passaggio, diminuendo notevolmente il tempo di reazione rispetto a una RT-PCR standard.
In LAMP assays, both the amplification and detection of specific amplicons may be accomplished in a single step, thereby significantly decreasing the reaction time compared to a standard RT-PCR.
Diversi metodi sono stati impiegati per la rivelazione dei prodotti di amplificazione LAMP, compreso l'esame o il monitoraggio visivo della torbidità del pirofosfato di magnesio precipitato (Tornita N., et al. 2008.
Several methods have been employed for the detection of LAMP amplification products including visual examination or turbidity monitoring of precipitated magnesium pyrophosphate (Tomita N., et al. 2008.
3:877-882; Mori Y., et al. 2001.
3:877-882; Mori Y., et al. 2001.
289:150-154), la rivelazione della fluorescenza del DNA a doppio filamento (dsDNA) con un fluoroforo intercalante (Zhang X, et al. 2013, PLoS One 8 (12):e82841; Mair G. et al. 2013, BMC Veterinary Research 9:108.), la generazione di bioluminescenza attraverso la conversione del pirofosfato (Gandelman OA., et al. 2010, PLoS One 5(11): el4155).
289:150-154), fluorescence detection of double-stranded DNA (dsDNA) with an intercalating fluorophore (Zhang X, et al. 2013, PLoS One 8(12):e82841; Mair G. et al. 2013, BMC Veterinary Research 9:108.), bioluminescence reporting through pyrophosphate conversion (Gandelman O A., et al. 2010, PLoS One 5(11): e14155).
Le strategie note per la rivelazione indiretta dell'amplificazione LAMP si basano essenzialmente sulla formazione di pirofosfato come sottoprodotto di reazione.
Known strategies for the indirect detection of LAMP amplification rely essentially on the formation of pyrophosphate as a reaction byproduct.
Man mano che una reazione LAMP procede, ioni pirofosfato vengono rilasciati per incorporazione di deossinucleotidi trifosfati (dNTP) nel DNA durante la polimerizzazione dell'acido nucleico e questi ioni reagiscono con gli ioni metallici bivalenti, in particolare ioni magnesio, presenti nella miscela di reazione per produrre un precipitato bianco e insolubile di pirofosfato di magnesio (Mori Y., et al. 2001.
As LAMP reactions proceed, pyrophosphate ions are released by incorporation of deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) into the DNA strand during nucleic,acid polymerization and these ions react with divalent metal ions, particularly magnesium ions, present in the reaction mix to produce white, insoluble magnesium pyrophosphate precipitate (Mori Y., et al. 2001.
Questo prodotto determina un progressivo aumento della torbidità della soluzione di reazione e il pirofosfato precipitato può essere misurato quantitativamente in termini di torbidità od osservato ad occhio nudo come pellet dopo centrifugazione.
This product results in a progressive increase in the turbidity of the reaction solution and pyrophosphate precipitates can be measured quantitatively in terms of turbidity or observed by the naked eye as a pellet after centrifugation.
In un formato alternativo, la rilevazione dell'amplificazione LAMP è ottenuta attraverso l'incorporazione nella reazione di ioni manganese e calceina.
In an alternative format, the detection of LAMP amplification is achieved through the incorporation of manganese ions and calcein in the reaction.
La fluorescenza della calceina viene naturalmente spenta dal legame degli ioni manganese.
Calcein's fluorescence is naturally quenched by binding of manganese ions.
La produzione di pirofosfato come sottoprodotto della reazione LAMP rimuove gli ioni manganese dal buffer tramite precipitazione, e l'aumento della torbidità accoppiato con il ripristino della fluorescenza della calceina consente una facile lettura visiva a seguito di eccitazione con luce visibile o UV (Tornita N., et al. 2008.
Pyrophosphate production as a byproduct of LAMP reaction removes manganese ions form the buffer through precipitation, and the increased turbidity coupled with restored calcein fluorescence enables an easy visual read-out upon excitation with either visible or UV light (Tomita N., et al. 2008.
In un ulteriore formato di rivelazione, la conversione enzimatica del pirofosfato in ATP, che viene prodotto durante la sintesi del DNA, viene monitorata attraverso la bioluminescenza generata dalla luciferasi termostabile di lucciola (Gandelman OA., et al. 2010, PLoS One 5(11): el4155).
In still another detection format, the enzymatic conversion of pyrophosphate into ATP, which is produced during DNA synthesis, is monitored through the bioluminescence generated by thermostable firefly luciferase (Gandelman O A., et al. 2010, PLoS One 5(11): e14155).
I prodotti dell'amplificazione LAMP possono anche essere rivelati attraverso approcci diretti che agiscono attraverso la generazione di fluorescenza.
LAMP amplification products may also be detected through direct approaches which act via fluorescence reporting.
La maggior parte di tali approcci è basata sull'uso di coloranti intercalanti, quali bromuro di etidio, SYBR Green, EvaGreen e YO-PRO-I (Zhang X, et al. 2013, PLoS One 8(12):e82841; Mair G, et al. 2013, BMC Veterinary Research 9:108,).
The majority of such approaches are based on the use of intercalating dyes, such as ethidium bromide, SYBR Green, EvaGreen and YO-PRO-I (Zhang X, et al. 2013, PLoS One 8(12):e82841; Mair G. et al. 2013, BMC Veterinary Research 9:108.).
In genere, i coloranti intercalanti sono coloranti fluorescenti non sequenza-specifici che mostrano un forte aumento nell'emissione di fluorescenza a seguito del legame con dsDNA.
Typically, intercalating dyes are non-sequence-specific fluorescent dyes that exhibit a large increase in fluorescence emission upon binding into dsDNA.
Tale proprietà può essere utilizzata per monitorare l'amplificazione dell'acido nucleico in reai tinse misurando la fluorescenza in maniera continua nel corso della reazione LAMP.
Such property may be used to monitor the nucleic acid amplification in real time by continuously measuring the fluorescence during the LAMP reaction.
Tuttavia, dato che i coloranti intercalanti si legano a qualsiasi dsDNA, 1'impiego di questi coloranti nei metodi di amplificazione in reai time non consente di discriminare tra i prodotti dell'amplificazione specifica del bersaglio e gli artefatti che si generano come co-prodotti, come ad esempio gli ampliconi non specifici e i primer-dimeri, il che può comportare una sovrastima della concentrazione del bersaglio.
However, since intercalating dyes bind to any dsDNA, the implementation of such dyes in real-time amplification methods does not allow to discriminate between specific target amplification products and co-produced artifacts, such as non-specific amplicons and primer-dimers, which may result in an overestimation of the target concentration.
Di conseguenza, la rivelazione dell'amplificazione degli acidi nucleici con coloranti intercalanti richiede un'ottimizzazione, e solitamente per convalidare i risultati sono necessari dei saggi di controllo.
Consequently, the detection of nucleic acid amplification by intercalating dyes requires extensive optimization and follow-up assays are usually needed to validate the results.
La rivelazione dell'amplificazione LAMP basata su fluorescenza può anche fare affidamento sul meccanismo del trasferimento di energia per risonanza (FRET) (Chen Q, et ai.
Fluorescence-based detection of LAMP amplification may also rely on the mechanism of Förster resonance energy transfer (FRET) (Chen Q, et al. 1997 Biochemistry 36(15):4701-11).
La FRET è un'interazione distanzadipendente fra gli stati elettronici eccitati di due cromofori, in cui l'eccitazione viene trasferita da una molecola donatore ad una molecola accettore.
FRET is a distance-dependent interaction between the electronic excited states of two chromophores in which excitation is transferred from a donor molecule to an acceptor molecule.
Quando l'accettore stesso è un fluoroforo, lo stato eccitato dell 'accettore indotto dalla FRET può successivamente rilassarsi tramite emissione di fluorescenza dell'accettore.
When the acceptor itself is a fluorophore, the FRET-induced acceptor excited state can subsequently relax by acceptor fluorescence emission.
Il cromoforo accettore non ha bisogno di essere di per sé fluorescente e sistemi FRET con accettori scuri sono stati ampiamente implementati negli ultimi anni, Ad esempio, possono essere utilizzati quencher scuri, ossia cromofori che possono essere eccitati a stati elettronici superiori a seguito di assorbimento di fotoni e rilassamento allo stato fondamentale, preferenzialmente tramite processi non radiativi, rimanendo quindi scuri (Le Reste L. et al. 2012.
For instance, dark quenchers may be used which are chromophores that can be excited to higher electronic states upon absorption of photons and relax to the ground state preferentially by nonradiative processes, thereby remaining dark (Le Reste L. et al. 2012.
Biophysical Journal 102: 2658-2668).
Biophysical Journal 102: 2658-2668).
L'assorbimento di energia del donatore da parte di un accettore FRET richiede che lo spettro di assorbimento del cromoforo accettore abbia una zona di sovrapposizione con lo spettro di emissione del cromoforo donatore.
Acceptance of donor energy by a FRET acceptor requires that the absorbance spectrum of the acceptor chromophore overlaps the emission spectrum of the donor chromophore.
Inoltre, i cromofori donatore e accettore devono essere in stretta prossimità affinché si verifichi il trasferimento di energia e l'efficienza di tale trasferimento è fortemente dipendente dalla sesta potenza della distanza tra i due cromofori (Clegg RM.
Further, the donor and acceptor chromophores need to be in close proximity for energy transfer to occur and the efficiency of such transfer is highly dependent on the sixth power of the distance between the two chromophores (Clegg R M. 1995 Curr.
Chou et al. (Chou PH, et al. 2011 J Virol Methods.
Chou et al. (Chou P H, et al. 2011 J Virol Methods.
173 (1):67-74) descrivono un test per la diagnosi in gamberetti di infezioni da virus della sindrome della macchia bianca (WSSV), che unisce la tecnologia LAMP e la tecnologia FRET con ibridazione della sonda.
173(1):67-74) describe an assay for the diagnosis of White spot syndrome virus (WSSV) infections in shrimps, which combines LAMP and FRET hybridization probe technology.
Più in particolare, in aggiunta al set standard di primer LAMP, compresi i cosiddetti loop primers, il saggio di Chou et al. prevede l'utilizzo di due sonde fluorescenti marcate rispettivamente alle estremità 3'e 5' (Figura 1A) che si ibridano in una configurazione testa-coda sulla regione loop a singolo filamento presente nei prodotti LAMP intermedi.
More specifically, in addition to the standard set of LAMP primers, including the so-called loop-primers, the assay by Chou et al. involves the use of two fluorescent probes labeled at the 3′- and 5′-end sequence, respectively (FIG. 1A), which hybridize in a head to tail configuration to the single-stranded loop region present in the intermediate LAMP products.
Portando i due fluorofori in stretta prossimità, si verifica un trasferimento di energia e durante la reazione di amplificazione isotermica viene generato un segnale FRET reai time.
By bringing the two fluorophores in close proximity, energy transfer occurs and a real-time FRET signal is generated during the isothermal amplification reaction.
Il tubo di spinta e di aspirazione 42 è collegabile ad un condotto di aspirazione, non illustrato per semplicità, ed è atto a ricevere il manufatto 00, a partire dalla sua estremità assiale opposta rispetto all1estremità assiale impegnata con gli aghi 8.
The suck and blow tube 42can be connected to a suction conduit, not shown for the sake of simplicity, and is adapted to receive the article 80, starting from its opposite axial end with respect to the axial end engaged with the needles 8.
Il tubo di spinta e di aspirazione 42 fuoriesce, con la sua estremità inferiore, dall'estremità inferiore del cilindro degli aghi inferiore 4 e, in corrispondenza della sua porzione di estremità inferiore situata esternamente al cilindro degli aghi inferiore 4, ò supportato, in modo girevole attorno suo asse, mediante 11interposizione di una coppia di cuscinetti 43, da un blocchetto 44.
The suck and blow tube 42exits, with its lower end, from the lower end of the lower needle cylinder 4and, at its lower end portion arranged externally to the lower needle cylinder 4, it is supported, so that it can rotate about its own axis, by way of the interposition of a pair of bearings 43, by a block 44.
Questo blocchetto 44 si accoppia, mediante un accoppiamento del tipo vite-madrevite 45, con uno stelo filettato 87 che è orientato parallelamente all'asse 3 del cilindro degli aghi inferiore 4 e che è fissato all 'albero di uscita di un motore elettrico 46, ad esempio un motore passo-passo.
This block 44is coupled, by way of a coupling of the leadscrew 45type, with a threaded shank 87which is oriented parallel to the axis 3of the lower needle cylinder 4and which is fixed to the output shaft of an electric motor 46, for example a stepped motor.
In questo modo, azionando il motore elettrico 46 si provoca lo spostamento del tubo di spinta e di aspirazione 49. lungo l'asse 3 del cilindro degli aghi inferiore 4, relativamente allo stesso cilindro degli aghi inferiore 4.
In this manner, actuating the electric motor 46causes the movement of the suck and blow tube 42along the axis 3of the lower needle cylinder 4, with respect to that lower needle cylinder 4.
La lunghezza del tubo dì spinta e di aspirazione 42 in rapporto alla lunghezza del cilindro degli aghi inferiore 4 è tale per cui l'estremità superiore del tubo di spinta e di aspirazione 49. è situata in prossimità dell1estremità superiore del cilindro degli aghi inferiore 4 e cioè in prossimità della zona di lavoro degli aghi 3 della macchina.
The length of the suck and blow tube 42in relation to the length of the lower needle cylinder 4is such that the upper end of the suck and blow tube 42is arranged proximate to the upper end of the lower needle cylinder 4and that is to say proximate to the work area of the needles 8of the machine.
Mediante lo spostamento assiale del tubo dì spinta e di aspirazione 42 relativamente al cilindro degli aghi inferiore 4, è possibile portare 1'estremità superiore del tubo di spinta e di aspirazione 42 completamente all'interno del cilindro degli aghi inferiore 4 oppure portare 1'estremità superiore del tubo di spinta e di aspirazione 42 a fuoriuscire superiormente dall'estremità superiore del cilindro degli aghi inferiore 4 per spingere il manufatto 80 verso l'alto, come meglio verrà dettagliato in seguito.
By way of the axial movement of the suck and blow tube 42with respect to the lower needle cylinder 4, it is possible to bring the upper end of the suck and blow tube 42completely inside the lower needle cylinder 4or to bring the end upper of the suck and blow tube 42to protrude above from the upper end of the lower needle cylinder 4in order to push the article 80upward, as will be explained in more detail below.
Il cilindro degli aghi superiore 5 è supportato, in modo girevole attorno suo.asse, orientato verticalmente, da un braccio 47 mediante una coppia dì cuscinetti 48.
The upper needle cylinder 5is supported, so that it can rotate about its own vertically oriented axis, by an arm 47by way of a pair of bearings 48.
Il braccio Al è, a sua volta, supportato, mediante una coppia di cuscinetti 59, in modo girevole attorno ad un asse 49 che è parallelo e distanziato dall'asse 3 del cilindro degli aghi inferiore 4, da una colonna 58 che è fissata alla struttura portante 2.
The arm 47is, in turn, supported, by way of a pair of bearings 59, so that it can rotate about an axis 49which is parallel to and spaced apart from the axis 3of the lower needle cylinder 4, by a column 58which is fixed to the supporting structure 2.
Il braccio 47 è girevole a comando attorno a tale asse 49 in modo tale da consentire di portare il cilindro degli aghi superiore 5 superiormente e coassialmente al cilindro degli aghi inferiore 4 oppure in una posizione distanziata lateralmente dal cilindro degli, aghi inferiore 4.
The arm 47can rotate on command about such axis 49so as to make it possible to bring the upper needle cylinder 5above and coaxially to the lower needle cylinder 4or in a position that is laterally spaced apart from the lower needle cylinder 4.
Il cilindro degli aghi superiore 5 è cinematicamente collegato al cilindro degli aghi inferiore 4 attraverso una prima puleggia dentata 50 che è fissata coassialmente al cilindro degli aghi superiore 5 e che è col.legata, attraverso una prima cinghia dentata 51, ad una seconda puleggia dentata 52 calettata all 'estremità superiore di un albero di collegamento 53 che è disposto parallelamente all1asse 3 del cilindro degli aghi interiore 4.
The upper needle cylinder 5is kinematically connected to the lower needle cylinder 4by way of a first toothed pulley 50which is fixed coaxially to the upper needle cylinder 5and which is connected, by way of a first toothed belt 51, to a second toothed pulley 52which is keyed to the upper end of a connecting shaft 53which is arranged parallel to the axis 3of the lower needle cylinder 4.