mwirth-epo/epo-nmt-datasets huggingface dataset:
Secondo un’ulteriore forma di realizzazione, le composizioni di aminoacidi possono comprendere eccipienti farmaceuticamente accettabili, come per esempio proteine, vitamine, carboidrati, dolcificanti naturali e artificiali e/o sostanze aromatizzanti.
According to a further embodiment, the amino acid compositions may comprise pharmaceutically acceptable excipients, like for example proteins, vitamins, carbohydrates, natural and artificial sweeteners and/or flavouring substances.
In una forma di realizzazione preferita, gli eccipienti farmaceuticamente accettabili possono essere scelti tra proteine del siero del latte, maltodestrine, fruttosio, caseinato di calcio, olio di pesce, sucralosio, esteri di saccarosio, vitamina D3, vitamine del gruppo B. Per uso orale, le composizioni secondo la descrizione possono essere sotto forma di compresse, capsule, granuli, gel, polvere gelificabile o polvere.
In a preferred embodiment, the pharmaceutically acceptable excipients may be selected from whey proteins, maltodextrins, fructose, calcium caseinate, fish oil, sucralose, sucrose esters, vitamin D3, group B vitamins.
Ulteriori specificazioni, in termini di quantità e rapporti tra i vari aminoacidi previste dalle composizioni sono contenute nelle rivendicazioni allegate, che formano parte integrante dell’insegnamento tecnico qui fornito riguardo all’invenzione.
Further specifications, in terms of amounts and ratios among the various amino acids provided for by the compositions are contained in the attached claims, which form an integral part of the technical teaching provided herein in relation to the invention.
ESEMPI La Tabella 1 mostra due diverse composizioni a base di aminoacidi testate in vitro su epatociti (cellule HepG2) e in vivo su ratti a cui è stato somministrato etanolo, come descritto di seguito.
Table 1 shows two different amino acid-based compositions tested in vitroon hepatocytes (HepG2 cells) and in vivoon ethanol-consuming rats, as disclosed below.
La composizione denominata “BCAAem” comprende un agente attivo contenente gli aminoacidi leucina, lisina, isoleucina, valina, treonina, cisteina, istidina, fenilalanina, metionina, tirosina, triptofano.
The composition named "BCAAem" in the following comprises an active agent containing the amino acids leucine, lysine, isoleucine, valine, threonine, cysteine, histidine, phenylalanine, methionine, tyrosine, tryptophan.
La composizione denominata “alfa 5m (α5m)” comprende un agente attivo contenente gli stessi aminoacidi più acido citrico, acido succinico e acido malico.
The composition named "alpha 5m (α5m)" comprises an active agent containing the same amino acids plus citric acid, succinic acid, and malic acid.Table 1L-Leucine30,0131,0885L-Lysine HCl chlorhydrate19,5816,903L-Isoleucine1510,3628L-Valine1510,3628L-Threonine8,47,254L-Cysteine3,63,1089L-Histidine3,63,1089L-Phenylalanine2,42,0726L-Methionine1,21,0363L-Tyrosine0,720,6218L-Tryptophan0,482,0726OKG(ornithine L-α ketoglutarate)--Vitamin B1 (thiamine chlorhydrate)-0,004Vitamin B6 (piridoxine chlorhydrate)-0,0038Citric acid anhydrous-8,0000Malic acid-2,0000Acid L-aspartic--Succinic acid-2,0000Ratio Leucine:Isoleucine:Valine2:1:13:1:1 The compositions of Table 1 above may be prepared first by sifting all the components with a 0.8 mesh.
Per ottenere una pre-miscela, ciascun ingrediente (in una quantità <10% in peso della quantità totale) viene messo in una busta di polietilene assieme ad una porzione di L-lisina HCl in modo da ottenere il 10% del peso della composizione totale.
To obtain a pre-mixture, each ingredient (in an amount <10% by weight of the total amount) is put in a polyethylene bag together with a portion of L-lysine HCl so as to obtain 10 % of the weight of the total composition.
La busta viene quindi sbattuta manualmente per 5 minuti.
The bag is then manually shaken for 5 minutes.
La pre-miscela viene quindi caricata in un miscelatore (Planetaria) insieme al resto degli ingredienti e miscelata per un periodo di 15 minuti a 120 giri al minuto per ottenere una composizione finale omogenea.
The pre-mixture is then loaded in a mixer (Planetaria) together with the remainder of the ingredients and mixed for a period of 15 minutes at 120 rpm to obtain a homogeneous final composition.
PROCEDIMENTI Animali e trattamenti Il protocollo sperimentale è stato approvato e condotto secondo la Direttiva del Consiglio della Comunità Europea del 24 novembre 1986 (86/609/CEE), e il Ministero Italiano della Sanità, ed era conforme alle Linee Guida Nazionali sulla Protezione degli Animali.
The experimental protocol was approved and conducted in accordance with the European Communities Council Directive of November 24, 1986 (86/609/EEC), and the Italian Ministry of Heath, and complied with The National Animal Protection Guidelines.
Ratti Wistar di sesso maschile (3 mesi) dalla Charles River (Calco, Como, Italia) sono stati utilizzati per l’analisi sperimentale descritta qui di seguito.
Male Wistar rats (3 months old) from Charles River (Calco, Como, Italy) were used for the experimental analysis disclosed hereinafter.
Preparazione dei campioni Il fegato (n = 4 animali/gruppo) è stato pesato, omogeneizzato in metanolo freddo:acqua (volume/volume, 1:1) ed estratto secondo quanto descritto in Want et al. (Want et al.2013).
Liver (n = 4 animals/group) was weighted, homogenized in cold methanol:water (v/v, 1:1), and extracted according to Want et al. (Want et al. 2013).
I campioni essiccati sotto vuoto sono stati sospesi in 120 μl/50 mg di tessuto di metanolo:TDFHA 1 mM = 1:1 e centrifugati a 16.000 g per 10 minuti a 4°C. Due μl di supernatante sono stati caricati direttamente sullo spettrometro di massa-UPLC e analizzati come riportato di seguito.
The vacuum dried samples were suspended in 120 µl/50 mg tissue of methanol:1 mM TDFHA = 1:1 and centrifuged at 16,000 g for 10 minutes at 4°C. Two µl of surnatant were directly loaded onto the UPLC-mass spectrometer and analyzed as reported below.
Sono stati eseguiti quattro replicati tecnici per ciascun campione utilizzando i tre diversi procedimenti.
Four technical replicates for each sample were run using the three different methods.
Cromatografia e quantificazione degli aminoacidi nel fegato Aminoacidi standard sono stati acquistati dalla Sigma (Milano, Italia).
Standard amino acids were purchased from Sigma (Milan, Italy).
Soluzioni madre di ciascun aminoacido sono state preparate a 1 mg/ml in acqua, diluite alla concentrazione finale di 3 pmol/ μl, e direttamente infuse mediante siringa a 10 μl/min nello spettrometro di massa TripleTOF 5600+ (AB Sciex, Milano, Italia).
Each amino acid stock solutions were prepared at 1 mg/ml in water, diluted to the final concentration of 3 pmol/µl, and directly infused by syringe at 10 µl/min into the TripleTOF 5600+ mass spectrometer (AB Sciex, Milan, Italy).
Pertanto, il potenziale di declustering (PD) e l’energia di collisione (EC) sono stati ottimizzati per ciascun aminoacido.
Thus, declustering potential (DP) and collision energy (CE) were optimized for each amino acid.
Successivamente, sono state preparate tre miscele di aminoacidi sulla base dei valori di PD ed EC: MISCELA 1, contenente treonina, asparagina, tirosina e serina e analizzata con PD: 30 V, EC: 15 V; MISCELA 2, contenente glicina, alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, istidina, metionina, acido aspartico, glutammina e fenilalanina, e analizzata con PD: 40 V, EC: 15 V; e MISCELA 3, contenente acido glutammico, lisina, arginina e triptofano e analizzata con PD: 80 V, EC: 18 V. I parametri di partenza erano: gas 1: 33 psi, gas 2: 58 psi, cortina di gas: 25 psi, temperatura: 500°C e ISVF (IonSpray Voltage Floating (Fluttuazione di Tensione della Nebulizzazione Ionica)): 5500 V. Per ottenere le curve di calibrazione, i quadruplicati tecnici di diverse quantità (10, 33, 50, 100, 200, 400 pmol) delle tre miscele sono stati iniettati nello spettrometro di massa con separazione UPLC, utilizzando l’UPLC 1290 (Agilent Technologies Italia, Cernusco sul Naviglio, Milano, Italia).
Next, three mixtures of amino acids were prepared on the basis of DP and CE values: MIX 1, containing threonine, asparagine, tyrosine, and serine, and analyzed with DP: 30 V, CE: 15 V; MIX 2, containing glycine, alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, histidine, methionine, aspartic acid, glutamine, and phenylalanine, and analyzed with DP: 40 V, CE: 15 V; and MIX 3, containing glutamic acid, lysine, arginine, and tryptophan, and analyzed with DP: 80 V, CE: 18 V. The source parameters were: gas 1: 33 psi, gas 2: 58 psi, curtain gas: 25 psi, temperature: 500°C, and ISVF (IonSpray Voltage Floating): 5500 V. In order to obtain calibration curves, technical quadruplicates of different amounts (10, 33, 50, 100, 200, 400 pmol) of the three mixtures were injected into the mass spectrometer upon UPLC separation, using the UPLC 1290 (Agilent Technologies Italia, Cernusco sul Naviglio, Milan, Italy).
La colonna cromatografica era della Waters, Acquity HSS T3 C18 2,1 x 100 mm, 1,7 μm, mentre la fase mobile era A: TDFHA 1 mM (acido tridecafluoroeptanoico) in acqua; B: TDFHA 1 mM in acetonitrile.
The chromatographic column was from Waters, Acquity HSS T3 C18 2.1 x 100 mm, 1.7 µm, while the mobile phase was A: 1 mM TDFHA (tridecafluoroheptanoic acid) in water; B: 1 mM TDFHA in acetonitrile.
Un gradiente di B dal 12,5% al 26,5% in 4 min, seguito da ramping dal 26,5 al 92% in 3,5 min è stato utilizzato per separare tutti gli aminoacidi, con una portata di 0,35 ml/min e una temperatura della colonna di 65°C come descritto (Le et al., 2014).
A gradient of B from 12.5 % to 26.5 % in 4 min, followed by a ramp from 26.5 to 92 % in 3.5 min was used to separate all of the amino acids, with a flow rate of 0.35 ml/min and a column temperature of 65°C as described (Le et al., 2014).
L’autocampionatore era impostato a 4°C. Le curve di calibrazione sono state tracciate utilizzando aree di picco cromatografico e una regressione ponderata (1/x per tutti i composti ad eccezione di asparagina, tirosina, valina e acido glutammico, che sono stati interpolati a 1/x2) mediante il software MultiQuant versione 2.1 (SCIEX).
The autosampler was set at 4°C. Calibration curves were plotted using chromatographic peak areas and a weighted regression (1/x for all compounds except asparagine, tyrosine, valine, and glutamic acid, which were fit to 1/x2) by means of MultiQuant software version 2.1 (SCIEX).
I valori quantitativi per ciascun aminoacido (pmol) nei campioni di fegato di ratto sono stati ottenuti correlando le aree di picco cromatografico con quelle derivate da standard di calibrazione eseguita esternamente e sono stati normalizzati rispetto al tessuto (mg).
Quantitative values for each amino acid (pmol) in the rat liver samples were obtained by relating chromatographic peak areas to those derived from externally run calibration standards and normalized to tissue (mg).
Coltura cellulare e trattamento Cellule HepG2 HCC umane sono state acquistate dall’American Type Culture Collection (HB-8065; ATCC, Manassas, VA).
Human HCC HepG2 cells were purchased from the American Type Culture Collection (HB-8065; ATCC, Manassas, VA).
Le cellule sono state ordinariamente coltivate in terreno RPMI-1640, integrato con siero bovino fetale al 10%, penicillina (100 U/ml) e streptomicina (100 μg/ml), in un’atmosfera con il 5% di CO2a 37°C. Due milioni di cellule HepG2 sono state inseminate per pallone da 75 cm2(Corning Inc., Corning, NY).
Cells were routinely cultured in RPMI-1640 medium, supplemented with 10% fetal bovine serum, penicillin (100 U/mL), and streptomycin (100 µg/mL), in an atmosphere with 5% CO2 at 37 °C. Two million HepG2 cells were seeded per 75 cm2flask (Corning Inc., Corning, NY).
Sei ore dopo l’inseminazione, EtOH 75 mM (0,34%) e l’1% di BCAAem o α5m sono stati aggiunti, da soli o in combinazione.
Six h after seeding, 75 mM (0.34 %) EtOH and 1 % BCAAem or α5m were added, alone or in combination.
Le cellule non trattate sono state piastrate come controlli.
Untreated cells were plated as controls.
Ogni 24 h, i terreni sono stati sostituiti nei flaconi di controllo e di trattamento, con mezzi freschi, rispettivamente con o senza EtOH e BCAAem o α5m.
Every 24 h, media were replaced in both control and treatment flasks, with fresh media, with or without EtOH and BCAAem or α5m, respectively.
Quattro giorni dopo l’inseminazione, le cellule sono state tripsinizzate e inseminate in nuovi palloni, a 2 milioni di cellule vitali per pallone, con sostituzioni giornaliere dei terreni, come descritto in precedenza (Pochareddy et al. 2012).
Four days after seeding, cells were trypsinized and seeded into new flasks, at 2 million viable cells per flask, with daily media changes, as described before (Pochareddy et al. 2012).
Cinque giorni dopo il processo di suddivisione (un totale di 9 giorni con o senza EtOH, BCAAem o α5m, o EtOH più BCAAem o α5m), le cellule sono state raccolte come riportato di seguito per i diversi saggi.
Five days after the split process (a total of 9 days with or without EtOH, BCAAem or α5m, or EtOH plus BCAAem or α5m), the cells were harvested as reported below for the different assays.
Analisi RT-PCR quantitativa Le reazioni RT-PCR quantitative sono state realizzate come descritto (Tedesco et al. 2008) ed eseguite con iQ SybrGreenI SuperMix (Bio-Rad; Segrate, Italia) su un sistema di rivelazione di PCR in tempo reale iCycler iQ (Bio-Rad).
Quantitative RT-PCR reactions were performed as described (Tedesco et al. 2008) and run with the iQ SybrGreenI SuperMix (Bio-Rad; Segrate, Italy) on an iCycler iQ Real-Time PCR detection system (Bio-Rad).
In breve, l’RNA è stato isolato da tessuto utilizzando il kit RNeasy® Tissue Mini Kit (Qiagen, Milano, Italia).
Briefly, RNA was isolated from tissue using the RNeasy® Tissue Mini Kit (Qiagen, Milan, Italy). cDNA was synthesized using iScriptTM cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories, Segrate, Italy).
I primer sono stati progettati utilizzando il software Beacon Designer 2.6 della Premier Biosoft International (le sequenze sono riportate nella seguente Tabella 2).
Primers were designed using Beacon Designer 2.6 software from Premier Biosoft International (sequences are reported in Table 2 below).
Il numero di cicli al quale sono stati rilevati i vari trascritti (ciclo soglia, CT) è stato confrontato con quello di TBP, indicato come ΔCT.
The cycle number at which the various transcripts were detectable (threshold cycle, CT) was compared to that of TBP, referred to as ΔCT.
Tabella 2 Tatemperatura di annealing (°C); Numero di accesso PGC-1 α: NM_013261; Numero di accesso Tfam: NM_009360.4; Numero di accesso NRF1: NM_005011; Numero di accesso Cytc: JF919224.1; Numero di accesso TBP: NG_051572 è stato utilizzato per normalizzare l’espressione genica.
The gene relative levels were expressed as 2-(ΔΔCT), in which ΔΔCT equals ΔCT of EtOH- or BCAAem- or CAA mixture-treated rat (or treated HepG2 cells) minus ΔCT of the control rat (or untreated HepG2 cells).Table 2PGC-1αSense 5'-3'5'-GACCCCAGAGTCACCAAATGAC-3'No.160Antisense 5'-3'5'-TTGGTTGGCTTTATGAGGAGGA-3'No.2TfamSense 5'-3'5'-AGATTGGGGTCGGGTCAC-3'No.360Antisense 5'-3'5'-GACAACTTGCCAAGACAGATG-3'No.4NRF1Sense 5'-3'5'-ACTCGTGTGGGACAGCAAGC-3'No.560Antisense 5'-3'5'-ATGGTGAGAGGCGGCAGTTC-3'No.6CytcSense 5'-3'5'-CGTTGTGCCAGCGACTAAAAA-3'No.760Antisense 5'-3'5'-TTCCGCCCAAAGAGACCA-3'No.8TBPSense 5'-3'5'-AGGCACCACAGCTCTTCCAC-3'No.960Antisense 5'-3'5'-CCCAGAACTCTCCGAAGCTG-3'No.10Tatemperature of annealing (°C); Accession number PGC-1α: NM_013261; Accession number Tfam: NM_009360.4; Accession number NRF1: NM_005011; Accession number Cytc: JF919224.1; Accession number TBP: NG_051572 was used to normalize gene expression.
Analisi Western Blot Estratti di proteine sono stati ottenuti da fegato con Reagente di Estrazione di Proteine di Mammifero T-PER (Pierce, ThermoScientific, Rockford, USA) come descritto dal produttore, in presenza di cocktail di inibitori di proteasi e fosfatasi (Sigma Aldrich, Milano, Italia).
Protein extracts were obtained from liver with T-PER Mammalian Protein Extraction Reagent (Pierce, ThermoScientific, Rockford, USA) as described by the manufacturer, in the presence of protease and phosphatase inhibitor cocktail (Sigma Aldrich, Milan, Italy).
Il contenuto di proteine è stato misurato mediante il saggio su proteine all’acido bicinconinico (BCA, Pierce, Euroclone, Milano, Italia) e 50 μg di proteine sono state fatte migrare su SDS-PAGE in condizioni riducenti.
Protein content was measured by the bicinchoninic acid protein assay (BCA, Pierce, Euroclone, Milan, Italy), and 50 µg of proteins were run on SDS-PAGE under reducing conditions.
Le proteine separate sono state quindi trasferite elettroforeticamente a una membrana di nitrocellulosa (Bio-Rad Laboratories, Segrate, Italia).
The separated proteins were then electrophoretically transferred to a nitrocellulose membrane (Bio-Rad Laboratories, Segrate, Italy).
Le proteine di interesse sono state rivelate con anticorpi specifici: anti-p62 e anti- α-actina (tutti dalla Cell Signaling, Euroclone, Milano, Italia), con diluizione 1:1000 ciascuna.
Proteins of interest were revealed with specific antibodies: anti-p62 and anti-α-actin (all from Cell Signaling, Euroclone, Milan, Italy), at 1:1000 dilution each one.
L’immunocolorazione è stata rivelata usando immunoglobulina anti-coniglio o anti-topo coniugata con perossidasi di rafano per 1 h a temperatura ambiente.
The immunostaining was detected using horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit or anti-mouse immunoglobulin for 1 h at room temperature.
La quantità di proteina è stata misurata usando il substrato SuperSignal Substrate (Pierce, Euroclone, Milano, Italia) e quantificata mediante densitometria con il software analizzatore di immagini IMAGEJ.
The amount of protein was measured using SuperSignal Substrate (Pierce, Euroclone, Milan, Italy), and quantified by densitometry with IMAGEJ software image analyser.
Analisi statistica Per tutti i dati di espressione genica, sono stati utilizzati test t su campioni appaiati bilaterali per confrontare i valori tra cellule di controllo e cellule trattate.
For all gene expression data, two-sided paired-sample t tests were used to compare values between control and treated cells.
Un valore P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
A P value < 0.05 was considered statistically significant.
RISULTATI La composizione α5m è più efficace della composizione BCAAem per ripristinare la biogenesi e la funzione mitocondriale epatica compromessa dal consumo di EtOH È stata valutata la capacità delle composizioni BCAAem e α5m di migliorare la compromissione della biogenesi e della funzione mitocondriale dovuta all’esposizione a EtOH.
The capacity of BCAAem and α5m compositions to ameliorate impaired mitochondrial biogenesis and function due to EtOH exposure was evaluated.
Per studiare i meccanismi molecolari coinvolti negli effetti esercitati dalle composizioni BCAAem e α5m è stato utilizzato un modello in vitro di tossicità epatica da EtOH.
In order to investigate the molecular mechanisms involved in the effects exerted by BCAAem and α5m compositions an in vitromodel of hepatic EtOH toxicity was used.
A tal fine, cellule HepG2 epatiche sono state esposte a EtOH 75 mM, con o senza composizioni BCAAem o α5m, per 9 giorni.
To this end, hepatic HepG2 cells were exposed to 75 mM EtOH, with or without BCAAem α5m compositions, for 9 days.
I livelli di mRNA di coattivatore del recettore  attivato da proliferatore 1 α (Peroxisome Proliferator – Activated Receptor Gamma Coactivator 1 alpha, PGC-1 α), fattore respiratorio nucleare-1 (NRF-1), fattore di trascrizione di DNA mitocondriale A (Tfam), e cyt c erano invariati o leggermente inferiori nelle cellule HepG2 esposte a EtOH 75 mM per 9 giorni, rispetto alle cellule di controllo non trattate (Fig.1).
Proliferator-activated receptor γ coactivator 1α (PGC-1α), nuclear respiratory factor-1 (NRF-1), mitochondrial DNA transcription factor A (Tfam), and cyt c mRNA levels were unchanged or slightly lower in HepG2 cells exposed to 75 mM EtOH for 9 days, than in untreated control cells ( Fig. 1 ).
Tuttavia, la somministrazione di composizione BCAAem e α5m per 9 giorni ha aumentato i livelli di mRNA di PGC-1 α e Tfam rispetto alle cellule trattate con EtOH e non trattate (Figura 1).
However, BCAAem and α5m composition administration for 9 days increased PGC-1α and Tfam mRNA levels with respect to both untreated and EtOH treated cells ( Fig. 1 ).
E noto che alcune bottiglie per bevande realizzate generalmente in materiale plastico sono provviste di tappi asettici dosatori cosiddetti "push-pull", i guali sono strutturati sia per permettere ad un utilizzatore di dosare agevolmente la guantità di bevanda erogata dalla bottiglia, sia per chiudere ermeticamente la stessa al termine dell'erogazione.
The present patent application relates to a bottle push-pull aseptic dispenser cap. It is known that some beverage bottles generally made of plastic are provided with aseptic dispenser caps known as "push-pull" caps, which are structured to permit a user to easily dose the amount of beverage delivered from the bottle, and to hermetically seal the bottle upon reclosure.
Ad esempio, il brevetto EP 1 065 150 descrive un tappo asettico dosatore push-pull, che comprende un corpo cilindrico principale, il guaie presenta un asse di riferimento verticale, ed è provvisto di una ghiera internamente filettata avvitata al filetto ricavato sulla parete esterna del collo della bottiglia.
For example, patent EP 1 065 150 discloses a push-pull aseptic dispenser cap comprising a main cylindrical body, which has a vertical reference axis and is provided with an internally threaded ring that is screwed onto the thread obtained on the outside wall of the neck of the bottle.
Il corpo cilindrico principale comprende, inoltre, una prima parete piana anulare superiore, ortogonale all'asse di riferimento, che è disposta in battuta sul bordo superiore del collo, ed una seconda parete piana superiore che risulta essere al disopra dalla prima parete anulare su un piano parallelo alla stessa.
The main cylindrical body further comprises a first flat upper annular wall, orthogonal to the reference axis, which abuts against the upper edge of the neck, and a second flat upper wall that is above the first annular wall in a plane parallel thereto.
Il tappo asettico dosatore push-pull comprende, inoltre, un'appendice tubolare che si estende a sbalzo dalla detta seconda parete piana superiore, in direzione opposta al collo, così da svilupparsi completamente all'esterno e al disopra del collo stesso, ed un tappo erogatore di forma cilindrica, che presenta superiormente un'apertura passante centrale per 1'erogazione della bevanda, e inferiormente un otturatore cilindrico.
The push-pull aseptic dispenser cap further comprises a tubular projection that protrudes cantilevered from said second flat upper wall, in the opposite direction to the neck, so as to extend completely outside and above said neck, and a cylinder shaped dispenser cap, provided at the top with a central hole through which the beverage can flow out and provided at the bottom with a cylindrical stop element.