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Según la presente invención, se proporciona un método parallevar a cabo la centrifugación por gradiente de densidad parala recuperación de al menos un componente de materia sólidade una dispersión líquida, que comprende la carga de un cuerpode fluido operante dentro de la parte inferior y de un cuerpode dicha dispersión líquida dentro de la parte superior de unrecipiente de centrifugación, sellando el recipiente ysometiéndolo a centrifugación donde se establece un gradientede densidad, y extrayendo del mismo al menos un componente demateria sólida, caracterizado porque la provisión dentro dedicho recipiente de centrifugación de una inserciónestratificada perfectamente ajustadas, es capaz de soportardicho cuerpo de dispersión líquida en condiciones de gravedadregular y de permitir una circulación cruzada bidireccionaldurante la centrifugación, donde la inserción estratificadacomprende un disco que posee uno o varios cortes o rayasestrechas de atenuación por lo que el disco está dividido ensegmentos que ceden bajo la acción de fuerzas centrífugas yque vuelven a la configuración de salida cuando cesan lasfuerzas de centrifugación.
In accordance with the present invention there is provided a method of performing density gradient centrifugation for the recovery of at least one solid matter component from a liquid dispersion, comprising charging a body of working fluid into the lower part and a body of said liquid dispersion into the upper part of a centrifugation vessel, sealing the vessel and subjecting it to centrifugation whereby a density gradient is established, and withdrawing said at least one solid matter component, characterised by the provision within said centrifugation vessel of a snugly fitting layering insert capable of supporting said body of liquid dispersion under regular gravity conditions and of enabling bi-directional cross-flow during centrifugation wherein the layering insert comprises a disk having one or more narrow cuts or lines of weakness whereby the disk is divided into segments which yield under the action of centrifugal forces and which return to the starting configuration when the centrifugation forces cease.
El recipiente de centrifugación está hecho de cualquiermaterial adecuado para la esterilización por radiación otratamiento con óxido de etileno, siendo los ejemplos típicosel vidrio, materia plástica como la poliamida, polietileno dealta densidad, poliestireno, policarbonato, etc.
The centrifugation vessel is made of any suitable material that lends itself to sterilization by irradiation or treatment with ethylene oxide, typical examples being glass, plastic material such as polyamide, high density polyethylene, polystyrene, polycarbonate, etc.
En funcionamiento, se tapa u obtura el recipiente decentrifugación.
In operation the centrifugation vessel is preferably capped or stoppered.
Antes de la operación, el interior del recipiente decentrifugación se esteriliza preferentemente, por ejemplomediante exposición a una radiación ionizante o portratamiento con un agente esterilizante como el óxido deetileno.
Prior to operation the inside of the centrifugation vessel is preferably rendered sterile, e.g. by exposure to ionizing radiation or by treatment with a sterilizing agent such as ethylene oxide.
Se diseña la inserción estratificada para que se ajuste dentrode un tubo normal de centrifugación.
The layering insert is designed to fit into an ordinary centrifugation tube.
Para la operación, primero se carga un cuerpo de fluidooperante dentro de la parte inferior de un recipiente decentrifugación donde se introduce la insercición de capas.
For operation a body of working fluid is first charged into the bottom portion of a centrifugation vessel whereupon the layering insert is introduced.
Luego se vierte la dispersión líquida a centrifugar en laparte superior de la inserción sin tener que adoptarprecauciones para evitar la mezcla.
This is followed by pouring the liquid dispersion to be centrifuged on top of the insert with no need for any precaution in order to avoid mixing.
Según la naturaleza de lainserción estratificada, alguna dispersión puede asentarse endicho cuerpo de fluido operante sin perturbar, sin embargo,la superficie del mismo.
Depending on the nature of the layering insert, some dispersion may slowly sink across onto said body of working fluid without, however, disturbing the surface thereof.
Las proporciones relativas del fluido operante y de ladispersión líquida pueden seleccionarse con criterio sin quese ejerza fuerza alguna sobre la parte inferior o superior delcompartimiento, lo que significa una mejora significante conrespecto a las enseñanzas de la 4.824.560 de los EstadosUnidos.
The relative proportions of working fluid and liquid dispersion can be judiciously selected without any lower or upper compartment constraints, which is a significant improvement over the teachings of U.S. 4,824,560.
Se introduce preferentemente en dicha inserciónestratificada de la parte superior del recipiente decentrifugación un anticoagulante, siendo los ejemplos típicosel citrato sódico, el ácido etilén-diamín-tetraacético(EDTA) y la heparina.
Preferably an anticoagulant is introduced into the upper part of the centrifugation vessel above said layering insert, typical examples being sodium citrate, ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA) and heparin.
La inserción estratificada proporcionada de acuerdo con lapresente invención puede ser en forma de un disco, una copao una copa invertida y puede ser de cualquier material como,por ejemplo, una materia plástica, aluminio y similar.
The layering insert provided in accordance with the present invention may be in the form of a disk, a cup or an inverted cup and may be made of any suitable material such as, for example, a plastic material, aluminum and the like.
Según una realización de la invención, la inserciónestratificada tiene una pluralidad de agujeros capilares y/omuescas circunferenciales.
In accordance with one embodiment of the invention the layering insert has a plurality of capillary holes and/or circumferential indentations.
Típicamente, el diámetro de losagujeros capilares se encuentra en el rango de 0,6-0,8 mm ylas muescas circunferenciales tienen un perfil semicircularcuyos radios se encuentran entre 0,2 y 0,3 mm.
Typically the diameter of the capillary holes is within the range of 0.6-0.8 mm and the circumferential indentations have a hemi-circular profile with radii ranging from 0.2 to 0.3 mm.
Los cortes o rayas de atenuación en el disco son, por regla,bastante estrechas y pueden realizarse mediante trazado pormedio de una herramienta afilada como, por ejemplo, unaherramienta de corte o trazado de tipo lámina de afeitar.
The cuts or lines of weakness on the disk are, as a rule quite narrow and can be made by scribing with the aid of a sharp tool such as, for example, a razor blade-type scribing or cutting tool.
Si se desea, se puede colocar sobre la inserción estratificadauna placa filtrante de malla pequeña para impedir de mejormanera toda mezcla posterior de la materia sólida separada,placa filtrante que puede ser, por ejemplo, una tela tejidade fibras sintéticas.
If desired, a small-mesh filter plate may be super-positioned on the layering insert for better preventing any back-mixing of separated solid matter, which filter plate may, for example, be a cloth woven from synthetic fibers.
Si se desea, los recipientes de centrifugación que retenganuna cantidad determinada de fluido operante y equipados de unainserción estratificada según la invención, pueden ser tapadosy almacenados de esta forma, preferentemente en condicionesestériles.
If desired, centrifugation vessels holding a given amount of working fluid and fitted with a layering insert according to the invention, may be capped and stored in this form, preferably under sterile conditions.
De esta manera, todo lo requerido para lacentrifugación consiste en destapar el recipiente, diluiropcionalmente el fluido operante dentro del recipiente, verterla cantidad deseada de dispersión líquida, si se desearaañadir algún anticoagulante, tapar de nuevo el recipiente ysometerlo a centrifugación.
In this way all that is required for centrifugation is to decap the vessel, optionally dilute the working fluid inside the vessel, pour in the desired amount of liquid dispersion, if desired add some anticoagulant, again cap the vessel and subject it to centrifugation.
Según una realización de la invención se utiliza un recipienteesterilizado equipado de una inserción estratificada yopcionalmente una placa filtrante de malla pequeñasuperpuesta, manteniendo bajo presión reducida una cantidadde fluido operante y, si se deseara, también unanticoagulante, y estando sellado con un elemento tal como untapón o tapa de goma o similar, capaz de mantener el vacíodentro del recipiente y en el que pueda penetrar una aguja.La sangre para la centrifugación puede ser inyectadadirectamente desde un vaso sanguíneo de un paciente dentro deun recipiente de centrifugación así preparado sin exponerlaa la atmósfera ambiente.
In accordance with one embodiment of the invention there is used a sterilized vessel fitted with a layering insert and optionally also an overlaying small-mesh filter plate, holding under reduced pressure an amount of working fluid and, if desired, also anti-coagulant and sealed with a member such as a stopper or cap of rubber or the like, capable of holding a vacuum inside the vessel and being penetrable by a needle.
La presión reducida dentro del recipiente según la realizaciónanterior se selecciona de tal modo que la cantidad requeridade sangre sea inmediatamente aspirada, siendo un ejemplotípico 440 tor (0,58 atm).
The reduced pressure within the vessel in accordance with the above embodiment is so selected that the required amount of blood is readily sucked in, a typical example being 440 torr (0.58 atm).
Se puede observar entonces que, según la invención, seproporciona un método fiable y versátil de centrifugación porgradiente de densidad apto para operaciones en serie.
It is thus seen that in accordance with the invention there is provided a reliable and versatile method of density gradient centrifugation suitable for serial operation.
Al terminar la centrifugación de acuerdo con la invención, laspequeñas fracciones que se acumulan por encima de la inserciónestratificada pueden ser retiradas de cualquier maneraadecuada, por ejemplo por aspiración con una pipeta o pordecantación.
Upon completion of the centrifugation according to the invention, light fractions accumulating above the layering insert may be withdrawn in any suitable way, e.g. by aspiration with a pipette or by decantation.
Si se deseara, el sedimento que se acumula pordebajo de la inserción estratificada puede ser recuperadotambién de cualquier manera adecuada.
If desired, the sediment accumulating underneath the layering insert can also be recovered in any suitable way.
La invención proporciona además una inserción del tipoespecificado para su empleo en centrifugación.
The invention further provides an insert of the kind specified for use in centrifugation.
En estos dos juegos, el colector de los transistores Q42 y Q43, cada uno de los cuales tiene una resistencia de emisor, y el de los transistores Q41 y Q44, cada uno de los cuales no tiene una resistencia de emisor, están conectados en común respectivamente, la base del transistor Q41 que no tiene una resistencia de emisor y la del transistor Q43 que tiene una resistencia de emisor están conectadas a un terminal de entrada 31 de la primera pareja de terminales de entrada, y la base del transistor Q42 que tiene una resistencia de emisor y la del transistor Q44 que no tiene una resistencia de emisor están conectadas en común al otro terminal de entrada 32 de la primera pareja de terminales de entrada.
Here, supposing as Is41 = Is42, Eq.
VCC es una tensión de fuente de alimentación, RL es una resistencia de carga, y 38 es un terminal de salida desde el que se extrae la salida mezcladora (tensión VO).
(51) can be shown as follows; VLO + VT·1n(Ic41/Ic42) + (Ic42/α )RE = 0
En el primer amplificador diferencial, entre las tensiones de base VB41 y VB42 de la pareja de transistores diferenciales Q41 y Q42 respectivos, la corriente de colector Ic42 del transistor Q42 y el factor de amplificación de corriente a, se establece la siguiente relación:
Also, there exists the following relation between the constant current source I0 and the collector currents Ic41 and Ic42 as; α·I0 = Ic41 + Ic42 Hence, Eq.
VLO + VB41 + (Ic42/ Además, VB41 >> VT y VB42 >> VT, de modo que si la corriente de colector del transistor Q41 se expresa como Ic41 y las corrientes de saturación de la pareja de transistores diferenciales Q41 y Q42 se expresan respectivamente como Is41 e Is42, existe la siguiente relación entre VB41, VB42 y VT: VB41 = VT·ln(Ic41/Is41)...
(54) can be made as follows; VLO+VT·1n[(α·I0/Ic42)+1]+(Ic42/α)RE = 0
(52) VB42 = VT·ln(Ic42/Is42)...
Here, in order to obtain the gradient of the collector current Ic42 with respect to the local signal (voltage VLO) as a signal to be doubled, Ic42 is differentiated with respect to VLO as follows; d Ic42 d VLO = 1 VT Ic42 (α·I0-Ic42) α·I0 + RE α
Aquí, suponiendo que Is41 = Is42, la ecuación (51) se puede mostrar como sigue:
The point where the differentiating value (absolute value) is maximized is obtained when the following is satisfied as; Ic42 = Ic41 = (α·I0/2) Thus, the value of such point can be shown by the following equation; d Ic42 d VLO Ic42=(α·I0/2) = α·I0 4VT + RE·I0
VLO + VT·ln(Ic41/Ic42) + (Ic42/ Además, existe la siguiente relación entre la fuente de corriente constante IO y las corrientes de colector Ic41 e Ic42: Por tanto, la ecuación (54) se puede transformar como sigue: VLO + VT·ln[( Aquí, al objeto de obtener el gradiente de la corriente de colector Ic42 con respecto a la señal local (tensión VLO) como una señal a duplicar, Ic42 es diferenciada con respecto a VLO como sigue: [d Ic42/d VLO] = [1/(VT[(Ic42 ( El punto en el que el valor diferencial (valor absoluto) se hace máximo se obtiene cuando se cumple la siguiente ecuación: Ic42 = Ic41 = ( Por tanto el valor de dicho punto se puede mostrar mediante la siguiente ecuación: La tensión de entrada VLO se puede obtener en este caso como: VLO = -(1/2) RE·Ic45...
The input voltage VLO in this case can be obtained as; VLO = -(1/2) RE·Ic45
En la pareja de transistores diferenciales formada por los transistores Q43 y Q44, las determinaciones se pueden hacer de la misma manera mostrada más arriba.
In the differential transistor-pair consisting of the transistors Q43 and Q44, the determinations can be made in the same manner as shown above.
La derivación se puede efectuar invirtiendo la polaridad de la tensión de entrada VLO, por lo que se omite aquí.
The derivation can be achieved by inverting the polarity of the input voltage VLO, thus being omitted here.
Entre las corrientes de colector Ic41, Ic42, Ic43 e Ic44 de transistores respectivos determinadas según se indica más arriba y la tensión de entrada VLO existen las relaciones mostradas en Fig. 11.
Between the collector currents Ic41, Ic42, Ic43 and Ic44 of respective transistors determined as above and the input voltage VLO, there exist the relations as shown in Fig. 11.
Fig. 11 muestra el caso de ser RE·IO = 16 VT.
Fig. 11 shows the case of being RE.IO = 16 VT.
Tal como se ve en Fig. 11, la tangente en el punto en el que el gradiente se hace máximo tiene un punto en el que VLO = 4 VT como punto inicial y pasa a través de puntos en los que VLO = -(1/2) RE·IO e Ic42 = (1/2) a ·IO.
As seen from Fig. 11, the tangent at the point where the gradient is maximized has a point of being VLO = 4 VT as the starting point and passes through points of being VLO = -(1/2) RE·I0 and Ic42 = (1/2) α·I0.
En este caso, el punto inicial de 4 VT se hace constante independientemente del valor de la resistencia de emisor RE y del de la fuente de corriente constante IO.
In this case, the starting point of 4 VT is made constant independently of the value of emitter resistor RE and that of constant current source I0.
Aquí, I5 e I6 se definen como sigue:
Here, I5 and I6 are defined as follows; I5 = Ic41 + Ic44 I6 = Ic42 + Ic43
Se encuentra entonces que cada una de las corrientes I5 e I6 es una corriente diferencial y tiene una propiedad de rectificación de ambas ondas para la tensión de entrada VLO.
Then, it is found that each of the currents I5 and I6 is a differential current and has a both wave rectification property for the input voltage VLO.
Como resultado, mediante la optimización del valor de la resistencia de emisor y del de la fuente de corriente constante IO, cada una de las corrientes I5 e I6 se puede aproximar considerablemente en su curva característica a la curva característica cuadrada de la tensión de entrada VLO.
As a result, by optimizing the value of the emitter resistance and that of the constant current source I0, each of the currents I5 and I6 can be considerably approximated in characteristic to the square characteristic of the input voltage VLO.
Es decir, este primer amplificador diferencial constituye un circuito duplicador de frecuencia, y cada una de las corrientes I5 e I6 es una función uniforme con respecto a la tensión de entrada VLO, de modo que incluso si se hace una aproximación hasta el cuarto término de la tensión de entrada VLO como la aproximación principal de cada una de las corrientes I5 e I6, se puede esperar que el error generado sea pequeño.
That is, this first differential amplifier constitutes a frequency doubling circuit, and each of the currents I5 and I6 is an even function with respect to the input voltage VLO, so that even if approximation is made up to the fourth term of the input voltage VLO as the primary approximation of each of the currents I5 and I6, it can be expected that an error to be generated is small.
La diferencia de corriente D I5,6 entre las corrientes I5 e I6 se puede aproximar por tanto, siendo a, b y c constantes, como sigue:
Therefore, the current difference ΔI5,6 between the currents I5 and I6 can be approximated with a, b and c each as a constant as follows; ΔI5,6 = I5 - I6 ≒ α·I0·(a-b·VLO 2 -c·VLO 4 )
Esta diferencia de corriente D I5,6 es generada por los primero y segundo circuitos simétricos de corriente formados respectivamente por los transistores Q45 y Q46 y los transistores Q47 y Q48.
This current difference ΔI5,6 is generated by the first and second current mirror circuits respectively consisting of the transistors Q45 and Q46 and the transistors Q47 and Q48.
Y una corriente eléctrica sustancialmente igual a esta diferencia de corriente D I5,6 circula al colector del transistor Q48, y esta corriente eléctrica resulta una corriente de control del tercer circuito simétrico de corriente formado por los transistores Q49 y Q50.
And, an electric current substantially equal to this current difference ΔI5,6 flows to the collector of the transistor Q48, and this electric current becomes a control current of the third current mirror circuit consisting of the transistors Q49 and Q50.
Si las corrientes de colector de los transistores Q51 y Q52 se expresan como Ic51 e Ic52 respectivamente, la diferencia entre ellas, o la corriente de salida IOUT del segundo amplificador diferencial, se puede mostrar como sigue: IOUT = Ic51 - Ic52 = Aquí, siendo VIN << 2VT, tanh(VIN/2VT) se desarrolla en serie según la ecuación (13) y además, según la ecuación (63), se sustituye D I5,6.
If the collector currents of the transistors Q51 and Q52 are expressed as Ic51 and Ic52, respectively, the difference therebetween, or the output current IOUT of the second differential amplifier can be shown as follows; IOUT = Ic51 - Ic52 = α·I5,6 ·tanh(VIN/2VT)
Así pues, la corriente de salida IOUT se puede aproximar como sigue: IOUT \rightleftharpoons x {(VIN/2VT) - (1/3)(VIN/2VT)3}
Thus, the output current IOUT can be approximated as follows; IOUT ≒ α 2 ·I0 (a-b·VLO 2 -c·VLO 4 ) × {(VIN/2VT)-(1/3)(VIN/2VT) 3 }
La ecuación (65) se puede desarrollar además como sigue:
(65) can be further expanded as follows; IOUT = [(α 2 ·I0·a)/(2VT)]VIN - [(α 2 ·I0·a)(24VT 3 )]VIN 3 - [(α 2 ·I0·b)/(2VT)]VIN·VLO 2 + [(α 2 ·I0·b)/(24VT 3 )]VLO 2 ·VIN 3 - [(α 2 ·I0·c)/(2VT)]VIN·VLO 4 + [(α 2 ·I0·c)/(24VT 3 )]VIN 3 ·VLO 4
IOUT = [( - [( - [ + [( - [ + [( La ecuación (66) contiene el producto (VLO)2·VIN o VLO2 y VIN, de modo que se encuentra que la corriente de salida IOUT contiene componentes de frecuencia de (2fLO + fIN) y (2fLO - fIN) o (fIN - 2fLO).
(66) contains the product (VLO)2·VIN of (VLO)2 and VIN, so that it is found that the output current IOUT contains frequency components of (2fLO + fIN) and(2fLO -fIN) or (fIN- 2fLO).
De hecho, si a << b y c << b, estos componentes de frecuencia resultan predominantes.
In fact, if a<<b, and c<<b, these frequency components become predominant.
Como resultado, desde el terminal de salida 35 se proporciona como salida una señal mediante mezcla de la doble frecuencia de la señal de entrada VLO con la señal de entrada VIN, lo que significa que este segundo amplificador diferencial resulta un circuito mezclador.
As a result, from the output terminal 35 a signal is outputted by mixing the double frequency of the input signal VLO with the input signal VIN, which means that this second differential amplifier becomes a mixing circuit.
Como se ha explicado más arriba, el circuito mostrado en Fig. 10 hace posible efectuar la operación de duplicación de frecuencia de la señal de entrada VLO y la operación de mezclado de la señal así multiplicada en frecuencia con la señal de entrada VIN mediante una unidad de circuito.
As explained above, the circuit shown in Fig. 10 makes it possible to effect the frequency doubling operation of the input signal VLO and the mixing operation of the signal thus frequency-multiplied with the input signal VIN by one unit of circuit.
Además, el circuito duplicador de frecuencia y el circuito mezclador de frecuencia están conectados directamente uno con otro a través de un circuito simétrico de corriente, y una corriente de salida del circuito duplicador de frecuencia se usa como corriente de accionamiento del circuito mezclador, de modo que se puede eliminar un circuito de polarización del circuito mezclador, estando adaptado el mismo para ser formado como circuito integrado semiconductor.
In addition, the frequency doubling circuit and the mixing circuit are connected directly with each other through a current mirror circuit, and an output current of the frequency doubling circuit is used as the driving current of the mixing circuit, so that a bias circuit of the mixing circuit can be eliminated, being adapted to be formed into semiconductor integrated circuit.
No es necesario decir que no se necesita un filtro a equipar exteriormente, lo que hace posible ampliar la banda de frecuencia.
It is needless to say that a filter to be equipped outside is not needed making possible to widen the frequency band.
Séptima realización Fig. 12 tiene por objeto explicar una séptima realización de esta invención.
Fig. 12 is for explaining a seventh embodiment of this invention.
En esta realización, una fuente de corriente constante IOO está insertada en paralelo en el transistor Q49 del tercer circuito simétrico de corriente como fuente de accionamiento del segundo amplificador diferencial mostrado en la sexta realización, para aumentar así la ganancia de conversión del circuito mezclador.
In this embodiment, a constant current source I00 is inserted in parallel in the transistor Q49 of the third current mirror circuit as the driving source of the second differential amplifier shown in the sixth embodiment thereby to enhance the conversion gain of the mixing circuit.