คริสเปอร์
คริสเปอร์ (English: CRISPR) เป็นวงศ์ของลำดับดีเอ็นเอในแบคทีเรีย ซึ่งในลำดับมีส่วนของดีเอ็นเอ (DNA snippets) จากไวรัสที่เคยโจมตีแบคทีเรียนั้น แบคทีเรียใช้ส่วนเหล่านี้ในการตรวจหาและทำลายดีเอ็นเอจากไวรัสที่คล้ายกันในการโจมตีครั้งถัดไป ลำดับเหล่านี้ทำหน้าที่สำคัญในระบบภูมิคุ้มกันของแบคทีเรีย[3] และเป็นพื้นฐานของเทคโนโลยีที่เรียกว่า คริสเปอร์/แคสไนน์ (English: CRISPR/Cas9) ที่สามารถใช้เปลี่ยนยีนภายในสิ่งมีชีวิต[4]
ระบบคริสเปอร์/แคสเป็นระบบภูมิคุ้มกันโพรแคริโอตที่ช่วยในการต่อต้านส่วนประกอบทางพันธุกรรมแปลกปลอม เช่นเดียวกับที่อยู่ในพลาสมิด (plasmid) และ เฟจ (phages)[5][6][7] ซึ่งเป็นภูมิคุ้มกันที่เกิดขึ้นภายหลัง (acquired immunity) อาร์เอ็นที่มีลำดับสเปสเซอร์ (spacer sequence) ช่วยโปรตีนแคส (CRISPR-associated, Cas) ในการจำแนกและตัดดีเอ็นเอจากภายนอก ขณะที่โปรตีนแคสอื่นที่นำโดยอาร์เอ็นเอตัดอาร์เอ็นเอจากภายนอก[8] คริสเปอร์ถูกพบในประมาณ 40% ของจีโนมแบคทีเรียและใน 90% ของอาร์เคียที่ถูกหาลำดับดีเอ็นเอแล้ว[9]
CRISPR ย่อมาจาก C</b>lustered R</b>egularly I</b>nterspaced S</b>hort P</b>alindromic R</b>epeats[10] ชื่อถูกตั้งก่อนจะรู้ที่มาและหน้าที่ของลำดับย่อยอินเตอร์สเปส (interspacing subsequence) ณ ตอนนั้น คริสเปอร์ถูกมองว่าเป็นส่วนหนึ่งของดีเอ็นเอโพรแคริโอตที่มีลำดับเบสสั้น ๆ ที่เรียงตัวซ้ำ ๆ ลำดับซ้ำพาลินโดรม (palindromic repeat) เป็นลำดับนิวคลีโอไทด์ที่เหมือนกันเมื่ออ่านจากทั้งสองด้าน การซ้ำแต่ละครั้งตามด้วยดีเอ็นเอสเปสเซอร์จากการพบกับดีเอ็นเอภายนอกครั้งก่อน (เช่น ไวรัส หรือ พลาสมิด)[11] ต่อจากลำดับคริสเปอร์ก็มีกลุ่มเล็ก ๆ ของยีน<i data-parsoid='{"dsr":[5112,5119,2,2]}'>แคส (CRISPR-associated system, cas)
ระบบคริสเปอร์/แคสแบบง่ายที่เรียกว่าคริสเปอร์/แคสไนน์ถูกปรับแต่งเพื่อแก้ไขจีโนม จีโนมสามารถถูกตัดในตำแหน่งที่ต้องการ โดยการส่งแคสไนน์นิวคลีเอส (Cas9 nuclease) ประกอบกับไกด์อาร์เอ็นเอ (guide RNA, gRNA) เข้าไปในเซลล์ ทำให้สามารถกำจัดยีนที่มีอยู่หรือเพิ่มยีนใหม่เข้าไปได้[12][13][13][14] กลุ่มรวม Cas9-gRNA ทำหน้าที่เหมือน กลุ่มรวม CAS III crRNA บนแผนภาพด้านข้าง
เทคนิคการแก้ไขจีโนมคริสเปอร์/แคสมีศักยภาพในการนำไปประยุกต์ใช้ในหลายด้าน รวมถึงทางการแพทย์ และทางการปรุงแต่งเมล็ดพืชทางเกษตร การใช้กลุ่มรวม CRISPR/Cas9-gRNA เพื่อแก้ไขจีโจม[15][16] ถูกเลือกโดยสมาคมเพื่อความก้าวหน้าทางวิทยาศาสตร์อเมริกัน (AAA) ให้เป็นการค้นพบครั้งใหญ่ใน พ.ศ. 2558[17] ข้อกังวลด้านชีวจริยธรรมถูกกล่าวถึงเกี่ยวกับความเป็นไปได้ในการใช้เทคนิคนี้เพื่อแก้ไขเซลล์สืบพันธุ์[18]
การค้นพบของกลุ่มดีเอ็นเอลำดับซ้ำเกิดขึ้นโดยอิสระในสามส่วนของโลก หนึ่งในการค้นพบครั้งแรกเกิดขึ้นเมื่อ พ.ศ.​ 2530 ณ มหาวิทยาลัยโอซะกะในประเทศญี่ปุ่น นักวิจัย โยชิซุมิ อิชิโนะ (Yoshizumi Ishino) และคณะเผยแพร่ผลการทดลองเกี่ยวกับลำดับของยีนชื่อว่า "iap" และความเกี่ยวข้องกับ E. coli ความก้าวหน้าทางเทคโนโลยีในช่วงคริสต์ทศวรรษ 1990 ทำให้พวกเขาสามารถดำเนินงานวิจัยต่อและเพิ่มความเร็วของการหาลำดับด้วยเทคนิคที่เรียกว่าเมตาจีโนมิกส์ (metagenomics) พวกเขาสามารถเก็บตัวอย่างน้ำทะเลหรือดินและหาลำดับดีเอ็นเอในตัวอย่างนั้น
ภูมิคุ้มกันคริสเปอร์-แคสเป็นกระบวนการทางธรรมชาติของแบคทีเรียและอาร์เคีย คริสเปอร์-แคสป้องกันการติดเชื้อเฟจ, คอนจูเกชัน (conjugation) และการแปลงพันธุ์ทางธรรมชาติ โดยการทำลายกรดนิวคลีอิกจากภายนอกที่เข้ามาในเซลล์[19]
เมื่อจุลินทรีย์ถูกบุกรุกโดยไวรัส ขั้นแรกของการตอบสนองของภูมิคุ้มกันคือการจับดีเอ็นเอของไวรัสและใส่เข้าไปในโลคัสคริสเปอร์ในรูปแบบของสเปสเซอร์ การที่ Cas1 และ Cas2 อยู่ในระบบภูมิคุ้มกันคริสเปอร์-แคสทั้งสองแบบ ชี้ว่าพวกมันมีส่วนในการได้มาซึ่งสเปสเซอร์ งานวิจัยการกลายพันธุ์ยืนยันสมมติฐานนี้ และแสดงว่าการนำยีน cas1 หรือ cas2 ออกทำให้ไม่สามารถจัดหาสเปสเซอร์ได้ ในขณะที่ไม่ส่งผลกระทบต่อการตอบสนองของภูมิคุ้มกันคริสเปอร์[20][21][22][23][24]
โปรตีน Cas1 หลายโปรตีนถูกศึกษาลักษณะเฉพาะและหาโครงสร้าง[25][26][27] โปรตีน Cas1 มีลำดับกรดอะมิโนหลากหลาย อย่างไรก็ตาม โครงสร้างผลึกมีลักษณะคล้ายกัน และโปรตีน Cas1 ที่ถูกทำให้บริสุทธิ์ทั้งหมดเป็นนิวคลีเอส/อินทีเกรสที่ต้องพึ่งธาตุโลหะ และจับกับดีเอ็นเอโดยไม่พึ่งกับลำดับ[28] โปรตีน Cas2 ที่ถูกเลือกได้รับการศึกษาลักษณะเฉพาะ และพบว่าพวกมันแสดงกิจกรรมเอนโดริโบนิวคลีเอสเฉพาะต่อ ssRNA (สายเดี่ยว)[29] หรือ dsDNA (สายคู่)[30][31]
ในระบบไอ-อี ของ E. coli Cas1 และ Cas 2 จับกันเป็นกลุ่มรวมโดยสองส่วน (dimer) ของ Cas2 จับเข้ากับสองส่วนของ Cas1[32] ในกลุ่มรวมนี้ Cas2 มีหน้าที่เป็นโครงสร้างแบบไม่ใช้เอนไซม์[32] และจับกับชิ้นสายคู่ของดีเอ็นเอจากภายนอก ขณะที่ Cas1 จับกับด้านข้างของดีเอ็เอส่วนสายเดี่ยวและช่วยเร่งในการรวมเข้ากับแถวลำดับคริสเปอร์[33][34][35] สเปสเซอร์ใหม่ถูกเพิ่มในส่วนเริ่มของคริสเปอร์ต่อจากลำดับนำ (leader sequence) ทำให้เป็นการบันทึกการติดเชื้อไวรัสตามลำดับเวลา[36]
การวิเคราะห์ทางชีวสารสนเทศศาสตร์บริเวณจีโนมเฟจที่ถูกตัดเป็นสเปสเซอร์ (เรียกว่าโปรโตสเปสเซอร์, protospacer) ชี้ว่าไม่ได้เป็นการเลือกอย่างสุ่ม ทว่าถูกพบติดกับลำดับดีเอ็นเอสั้น ๆ (3 – 5 คู่เบส) ที่เรียกว่า protospacer adjacent motifs หรือ แพม (PAM) การวิเคราะห์ของระบบคริสเปอร์-แคสแสดงว่าลำดับแพมมีความสำคัญสำหรับระบบแบบที่ 1 (type I) และแบบที่ 2 (type II) ทว่าไม่สำคัญในแบบที่ 3 (type III) ระหว่างการได้มาซึ่งสเปสเซอร์[37][38][39][40][41][42] ในระบบแบบที่ 1 และ 2 โปรโตสเปสเซอร์ถูกตัดบนตำแหน่งติดกับลำดับแพม โดยอีกด้านหนึ่งของสเปสเซอร์ถูกตัดโดย ruler mechanism ทำให้ขนาดของสเปสเซอร์ใกล้เคียงกันในแถวลำดับคริสเปอร์[43][44] การอนุรักษ์ลำดับแพมแตกต่างกันไปในคริสเปอร์-แคสแต่ละระบบและอาจเชื่อมโยงกับ Cas1 และลำดับนำ (leader sequence)[42][45]
สเปสเซอร์ใหม่ถูกเพิ่มเข้าไปในแถวลำดับคริสเปอร์โดยมีทิศทางที่แน่นอน[46] มักเลือกที่จะ[47][38][39][48][49] แต่ไม่เพียงแต่[41][44] ติดกับลำดับนำ การวิเคราห์ของระบบไอ-อีจาก E. coli แสดงว่าลำดับซ้ำแรกติดกับลำดับนำถูกคัดลอก โดยมี สเปสเซอร์ใหม่ที่พึ่งได้มาแทรกระหว่างลำดับซ้ำแรกและสอง[23][43]
ลำดับแพมน่าจะมีความสำคัญระหว่างการแทรกสเปสเซอร์ในระบบไอ-อี ลำดับนั้นมีส่วนประกอบของนิวคลีโอไทด์ท้ายที่ถูกคงไว้ติดกับนิวคลีโอไทด์แรกของโปรโตสเปสเซอร์ นิวครีโอไทด์นี้กลายเป็นเบสสุดท้ายของลำดับซ้ำโดยตรง (direct repeat) ชิ้นแรก[24][50][51] สิ่งนี้ชี้ว่ากลไกการได้มาซึ่งสเปสเซอร์ทำให้เกิดส่วนยื่นสายเดี่ยวในตำแหน่งรองท้ายของลำดับซ้ำโดยตรงและลำดับแพมระหว่างการแทรกสเปสเซอร์ อย่างไรก็ตาม ไม่ใช่ทุกแบบของคริสเปอร์-แคสจะใช้กลไกนี้ ด้วยความที่แพมในสิ่งมีชีวิตอื่นไม่แสดงการคงไว้ของตำแหน่งสุดท้ายในระดับเท่ากัน[45] เป็นไปได้ว่าระบบเหล่านี้ทำให้เกิดปลายทู่ที่ไม่มีส่วนยื่นออกมาตรงส่วนท้ายของลำดับซ้ำโดยตรงและโปรโตสเปสเซอร์ระหว่างการได้มาซี่งสเปสเซอร์
ภายใน พ.ศ. 2557 มีงานวิจัยกว่า 1,000 งานที่กล่าวถึงคริสเปอร์ถูกตีพิมพ์[52][53] เทคโนโลยีถูกใช้เพื่อหยุดยั้งการปฏิบัติงานของยีนในเซลล์ไลน์มนุษย์และในเซลล์, เพื่อศึกษา Candida albicans, เพื่อปรับแต่งยีสต์เพื่อผลิตเชื้อเพลิงชีวภาพ และเพื่อปรับแต่งพันธุกรรมของสายพันธุ์พืช[53] คริสเปอร์ยังสามารถถูกใช้เพื่อเปลี่ยนยุงให้ไม่สามารถถ่ายทอดโรค เช่น มาลาเรีย[54]
การประเมินคำอ้างใหม่สำหรับความสัมพันธ์ระหว่างยีนกับโรคบนฐานของคริสเปอร์นำไปสู้การค้นพบความผิดปกติที่อาจมีความสำคัญ[55]
การแก้ไขจีโนมโดยคริสเปอร์/แคสไนน์ใช้ระบบคริสเปอร์แบบที่ 2 โดยใช้ Cas9, crRNA, tracrRNA และอาจใช้ร่วมกับส่วนของต้นแบบการซ่อมแซมดีเอ็นเอเพื่อช่วยในการเชื่อมต่อชิ้นส่วนโครโมโซมที่ไม่ใช่คู่ของมันเอง (non-homologous end joining, NHEJ) หรือ homology directed repair (HDR) ในการแก้ไขจีโนม
คริสเปอร์/แคสไนน์มักใช้พลาสมิดเพื่อบุกรุก (transfect) เซลล์เป้าหมาย[58] ส่วนประกอบหลักของพลาสมิดแสดงอยู่ในรูปทางขวา เริ่มจากการออกแบบ crRNA สำหรับการประยุกต์ใช้แต่ละครั้งด้วยความที่สิ่งนี้เป็นลำดับที่ Cas9 ใช้เพื่อระบุและจับโดยตรงกับดีเอ็นเอของเซลล์ crDNA ต้องจับกับที่ซึ่งต้องการแก้ไขเท่านั้น ต้นแบบการซ่อมแซมถูกออกแบบสำหรับการใช้แต่ละครั้งด้วยความที่ต้องทับซ้อนกับด้านใดด้านหนึ่งที่ถูกตัดและต้องเป็นรหัสสำหรับการแทรกลำดับ
crRNAs และ tracrRNA หลายชิ้นสามารถบรรจุเข้าด้วยกันเพื่อสร้าง single-guide RNA (sgRNA)[59] โดยสามารถนำ sgRNA นี้ไปต่อกับยีน Cas9 ในพลาสมิดเพื่อบุกรุกเข้าสู่เซลล์
หมวดหมู่:เทคโนโลยีชีวภาพ หมวดหมู่:วิศวกรรมชีวเวช หมวดหมู่:อณูชีววิทยา หมวดหมู่:พันธุวิศวกรรม