De maneira específica, a técnica elaborada por Sanger consistia, originalmente, nas seguintes etapas: 1- Ao DNA molde, de fita dupla (dsDNA), adiciona-se um ácido ou uma base, a fim de quebrar as ligações de hidrogênio presentes entre cada uma das bases nitrogenadas, gerando fitas simples de DNA (ssDNA). 2- Estes ssDNAs de interesse eram adicionados à quatro tubos diferentes (um para cada base), juntamente com quantidades suficientes de: iniciadores (primers), DNA-polimerases, dNTPs (desóxinucleotideos de cada uma das bases) e ddNTPs radiomarcados. 3-Posteriormente, realizava-se uma eletroforese em gel de poliacrilamida, o qual era dividido em quatro pistas, uma para cada base, permitindo que os diferentes fragmentos, interrompidos em diferentes posições pelos ddNTPs, fossem separados. 4- Ao final da área do gel, o analito era recolocado em um novo gel para que a separação pudesse continuar ou, de maneira análoga, um novo primer era construído, iniciando o sequenciamento a partir de onde o anterior havia parado. 5- Ao término da separação, realizava-se uma auto-radiografia, de tal forma a permitir a visualização e leitura de cada um dos fragmentos.