照射した光（励起光）の波長に応じて蛍光たんぱく質または標本そのものが発する蛍光（後者は自家蛍光）により像を観察する点では同様ですが、光源が蛍光顕微鏡は白色光源であるのに対し、共焦点顕微鏡はレーザー光であるという点が異なります。この2種類の顕微鏡の主な相違点を以下に挙げます。 蛍光顕微鏡： ・光源には水銀ランプ（超高圧水銀ランプ、メタルハライドランプなど）やLEDを用いる。 ・一般には面で光を照射し、励起された蛍光を撮像素子で観察、撮影する。 ・焦点面以外からの光（ボケ像）も撮像してしまう。最新の蛍光顕微鏡では、構造化照明を用いることでボケ像を排除することが可能。 ・紫外から近赤外波長まで広い波長をもつ白色光源のため、一つの光源でさまざまな波長の蛍光が撮影可能。(適切なフィルタが必要) 共焦点顕微鏡： ・光源にレーザー光を用いる。 ・点状に照射したレーザーを走査させ、励起された蛍光を光電子増倍管でデータ化し、像を作ることで観察、撮影する。 ・対物レンズの焦点面と共役の位置にピンホールを配置することで、焦点面以外からのボケ像を除去し、焦点面のみを撮影できる。 ・通常は一つのレーザー管につき単波長の励起光が発せられ、複数の蛍光を検出する場合はその分のレーザー管を増設する。