La testostérone est produite dans les testicules par les cellules de Leydig, elles-mêmes sous contrôle de l’hypothalamus et de l’hypophyse dans le cerveau.  L'hypothalamus et l’hypophyse participent à la sécrétion de nombreuses hormones : le fait que l’hypothalamus sécrète la gonadolibérine (GnRH) déclenche chez l’hypophyse la sécrétion de LH et de FSH. La FSH est connue pour son rôle dans la spermatogenèse, tandis que la LH (localisée dans les cellules de leydig) stimule la production de testostérone. Une fois dans le sérum (un liquide sanguin débarrassé de ses cellules et des protéines de coagulation), la testostérone se mélange à la SHBG (Sex hormone binding globuline) et à l'albumine (des protéines), produites par le foie.  Il subsiste une partie de la testostérone non liée à ces molécules ; on parle de testostérone libre (1 ou 2% de la testostérone totale).  La testostérone biodisponible correspond à la testostérone liée à l’albumine en plus de la testostérone libre ; il s’agit de la somme de ces deux parties. Au niveau des organes génitaux, de la prostate et des follicules pileux, la testostérone sera ensuite transformée en dihydrotestostérone, plus réceptive aux androgènes.  Enfin, le taux de testostérone fluctue durant la journée, avec un taux maximal le matin vers 7 heures.