Gallensteine entstehen aus ursprünglich in der Gallenflüssigkeit gelösten Stoffen, wenn der eingedickte Gallensaft diese Stoffe nicht mehr lösen kann. Dazu kommt es, wenn sie in zu hoher Konzentration oder in gestörten Mengenverhältnissen vorkommen, aber auch, wenn die Gallenblase sich längere Zeit nicht bewegt. Beim Auskristallisieren entsteht zunächst ein feiner Griess, der sich im Folgenden zu grösseren Gallensteinen zusammenlagern kann.
Die meisten Gallensteine sind Cholesterinsteine. Aus Cholesterin werden in der Leber die für die Fettverdauung unverzichtbaren Gallensäuren synthetisiert. Neben den Gallensäuren enthält der Gallensaft deshalb auch Cholesterin. Ein weiterer häufiger Steinbildner ist der Gallenfarbstoff Bilirubin, das Abbauprodukt des roten Blutfarbstoffs Hämoglobin.