Die Erzeugung von Wasserstoff durch Dunkelfermentation wird oft mit der anaeroben Vergärung von organischen Verbindungen zu Biogas (Methan) verglichen.
Die anaerobe Vergärung ist durch vielfältige mikrobielle Prozesse zahlreicher Mikroorganismen gekennzeichnet, wobei die mikrobiellen Umwandlungen (Hydrolyse, Acidogenese, Acetogenese und Methanogenese) nebeneinander ablaufen und eng miteinander verbunden sind. Im Verlauf des Abbaus komplexer Verbindungen zu Methan und Kohlendioxid werden Zwischenprodukte wie z.B. Wasserstoff, Zucker, flüchtige Fettsäuren (VFA) und organische Säuren gebildet, die aber teilweise sofort wieder von anderen Mikroorganismen verwertet werden und daher nicht als Produkte auftreten. Methan und Kohlendioxid stellen stabile Endprodukte des anaeroben Abbaus organischer Substanzen durch komplexe Mikroorganismengemeinschaften dar.
Wasserstoff tritt als internes Nebenprodukt der anaeroben Vergärung auf, d.h. einige Mikroorganismen der komplexen Gemeinschaft sind in der Lage Wasserstoff zu bilden, welches sofort wieder von anderen z.B. für die Bildung von Methan genutzt wird und daher nicht als freies Gas auftritt. Bei der Dunkelfermentation werden diese speziellen wasserstoffbildenden Mikroorganismen durch geschickte Prozessführung (durch z.B. erhöhte Temperatur) selektiv bevorteilt und gleichzeitig die Methanbildung unterdrückt.
Dadurch kann der entstehende Wasserstoff nicht verbraucht werden und bildet zusammen mit Kohlendioxid ein nutzbares Gas.