Die für CUT&RUN verwendete MNase akzeptiert auch RNA als Substrat, so dass es möglich sein könnte, das CUT&RUN-Protokoll für die Verwendung mit RNA-bindenden Proteinen anzupassen. RNA im Zytoplasma wird von der Abbaumaschinerie angezogen, wenn ihr die 5'-Kappe und der 3'-Poly-A-Schwanz fehlen. Daher würde ich vorschlagen, mit isolierten Zellkernen zu arbeiten. Dies hat den zusätzlichen Vorteil, dass man das Digitonin in den Puffern weglassen kann, das als Cholesterinersatz und zur Permeabilisierung der Zellmembran verwendet wird. Die isolierten Zellkerne können dann mit magnetischen ConA-Beads wie bei einem CUT&RUN-Experiment immobilisiert werden. Ein Antikörper gegen das interessierende Protein wird hinzugefügt, und anschließend wird die pAG-MNase an den Antikörper gebunden, wodurch die MNase in die Nähe der interessierenden RNA gebracht wird. Die isolierte RNA kann dann durch reverse Transkription in cDNA umgeschrieben werden, um Ihre Sequenzierungsbibliothek zu erstellen. Um jegliche kontaminierte DNA zu beseitigen, sollten Sie nach der RNA-Prep und vor der Bibliotheksvorbereitung eine DNase-Behandlung in das Protokoll aufnehmen. Eine Normalisierung auf der Grundlage der mit der MNase übertragenen E. coli-DNA oder einer Spike-in-DNA ist in diesem Fall keine Option. Ziehen Sie stattdessen in Erwägung, die Gesamtlesezahlen zur Normalisierung zwischen den Proben zu verwenden oder eine Referenz-RNA mit einer bekannten Konzentration einzubeziehen.