Otevírací doba Vatikánských muzeí se liší dle sezóny. V hlavní sezóně od 14. dubna 2023 do 30. dubna 2023 jsou muzea otevřená od pondělí do čtvrtka v čase 9:00-18:00 (poslední vstup 16:00), v pátek a v sobotu v čase 9:00-22:30 (poslední vstup ve 20:30) a poslední neděli v měsíci 9:00-14:00 (poslední vstup ve 12:30). Od 5. května do 28. října 2023 jsou muzea otevřená od pondělí do čtvrtka v čase 9:00-18:00 (poslední vstup 16:00), v pátek v čase 9:00-22:30 (poslední vstup ve 20:30), v sobotu 9:00-20:00 (poslední vstup v 18:00) a poslední neděli v měsíci 9:00-14:00 (poslední vstup ve 12:30). Mimo sezónu je otevírací doba o něco kratší: pondělí-sobota 9:00-18:00 (poslední vstup 16:00), poslední neděli v měsíci 9:00-14:00 (poslední vstup 12:30).