Separar l'ADN del fetus de l'ADN de la mare és una de les principals limitacions d'aquesta prova, ja que no resulta del tot senzill.
Si el fetus és home, és possible identificar les seqüències del cromosoma I exclusives del sexe masculí i, per tant, és més fàcil distingir l'ADN fetal del matern.
No obstant això, quan el fetus és una nena, el diagnòstic és més complicat. En aquest cas, els mètodes utilitzats per a separar l'ADN fetal del de la mare es basen a buscar diferències en la metilació dels gens o en la longitud dels fragments d'ADN, ja que els procedents del fetus són més curts.
Finalment, cal destacar que la forma més comuna de distingir la dotació genètica fetal de la materna és buscar característiques genètiques pròpies del pare heredades pel fetus i que, per tant, no són presents en l'ADN de la mare.