الرجل العنكبوت 2 يعرض الفيلم في البداية عن معاناة بيتر باركر في التوفيق بين مسئوليات سبايدر مان في مكافحة الجريمة وأداء متطلبات حياته الشخصية حيث يكتشف تراجع في مستواه الدراسي وعلاقته العاطفية مع ماري جين واتسون منا أن أفضل صديق له هاري أوسبورن ينوي الإنتقام من الرجل العنكبوت لإعتقادة بأنه قتل والده نورمان، بالإضافة إلى ذلك، يكتشف أن عمته مايو معرضة للإفالس.
يصبح هاري رئيس قسم أبحاث Oscorp، ويرعى عالم نووي لامع يدعى أوتو أوكتافيوس الذي يحلم بإحداث تفاعلات إندماج نووي ليتمكن من الإستفادة من طاقتها المتجددة، يرتدي أذرع آلية ذات ذكاء صناعي ليسخرها في عمل تجربته.
بالرغم من نجاح عمل التجربة في البداية، لكن تزداد الطاقة مما يؤدي إلى إختلال توازن الأمور بسرعة، وبعناد يرفض أوكتافيوس إنهاء التجربة ، مما يؤدي إلى مقتل زوجته، وتدمير الرقاقة العصبية التي تحمي اوكتافيوس من تأثير الأذرع على عقله، وتلتحم الأذرع مع عموده الفقري. يصل الرجل العنكبوت وينهي التجربة قبل حدوث المزيد من الضرر.
يفقد أوكتافيوس وعيه، ويتم إرساله إلى المستشفى، وأثناء أجراء فريق طبي لإزالة الأذرع الآلية جراحياً ، كانت الأذرع حينها قد بدأت السيطرة وإدراك أهمية بقائها فهاجمت بوحشية الطاقم الطبي، وقتلت معظم الفريق، يستعيد أوكتافيوس وعيه وعندما يرى ما قامت الأذرع من مذابح يهرب من المستشفى، ويختبئ في مختبرة المطل على نهر هدسون ، ويفكر في مصيره، ولكن تقنعه الأذرع بإعادة المحاولة في تجربته، ولكن لتمويل التجربة لابد من المال فيقرر سرقة أحد البنوك، وسمي الدكتور أوكتافيوس بالدكتور الأخطبوط أو "دوك أوك" على أحد الصحف.
يحاول بيتر أن يستعيد علاقته مع ماري جين ويحضر لأول مرة مسرحية لها ، ولكنها تخبره ، بأنها مخطوبة لرائد الفضاء الشهير جون جيمسون نجل جونا جيمسون، بيتر يفقد قواه الخارقة لتعرضة لتلك الصدمة العاطفية، فيقرر أن يتخلى عن كونه سبايدر مان تماماً ويعود إلى حياته الطبيعية.
يلقى بيتر بزي الرجل العنكبوت في سلة القمامة، يخبر بيتر عمته مايو أن وفاة عمه بن في كان نتيجة خطأه، وفي نهاية الأمر تسامحه عمته، ولكن عندما يعلم من جاره البالغ من العمر تسع سنوات عن إختفاء الرجل العنكبوت وإرتفاع معدل الجريمة في مدينة نيويورك، يقرر بيتر أن يصبح الرجل العنكبوت مرة أخرى.
يكتشف الدكتور أخطبوط أنه يحتاج إلى التريتيوم الذي تعتبر وقود المفاعل الإندماجي، ويذهب إلى هاري ليطلبه منه. هاري يرفض في البداية لأن هذه التجربة تهدد سلامة المدينة، لكنه يوافق في نهاية المطاف في مقابل أن يسلمه الرجل العنكبوت ويخبرة أن بيتر، الذي له علاقة جيدة بالرجل العنكبوت، هو مفتاح العثور عليه. ومع ذلك، يشترط هاري على الدكتور أخطبوط ألا يضر بيتر. الدكتور أخطبوط يجد بيتر ويسأله عن مكان الرجل العنكبوت، ويخطف ماري جين. بيتر يدرك أن عليه أن يستجمع قواه ويرتدي زيه مرة آخرى .
يلتقى كل الرجل العنكبوت والدكتور أخطبوط ويتقاتلا، حيث يقعون فوق قطار مدينة نيويورك السريع. يثبت الدكتور أخطبوط دواسة وقود القطار، ويعطل عناصر التحكم، ويقفز منها، الرجل العنكبوت يوقف القطار قبل انتهاء الطريق، ويغمى عليه من شدة الإرهاق، يحمله الركاب في واحدة من السيارات، ويزيلون قناعة ليكتشفوا أنه شاب في مقتبل العمر، وعندما يستقيظ يتعهد له الركاب بعدم الكشف عن هويته يعود الدكتور أخطبوط ليخطف الرجل العنكبوت، ولكن يحاول الركاب التصدي له وبالطبع بسهولة يهزم الركاب، ويخطف الرجل العنكبوت، ويسلمه لهاري.
وبناءً على الإتفاق يعطي هاري التريتيوم للدكتور أخطبوط ، وبينما هاري يستعد لقتل الرجل العنكبوت، إلا أنه يُصدم عندما أن صديقة بيتر هو الرجل العنكبوت. بيتر يقنع هتري مزيد من الكوارث على وشك الوقوع، وهاري يكشف موقع الدكتور أخطبوط للرجل العنكبوت الذي يصل إلى مختبره المطل على النهر ويحاول إنقاذ ماري جين سراً. إلا أن أحد أذرع الدكتور أخطبوط تشعر به، ويقاتلون. الرجل العنكبوت في نهاية المطاف يهزم الدكتور أخطبوط ، ويقنعه عن التخلي عن حلمه الذي سيبب دماراً للبشرية. وينجح الدكتور أوكتافيوس في التغلب على الأذرع الآلية وأن يسخرها لتنفيذ أوامره ويغرق نفسه مع مفاعل الإندماج في قاع نهر هدسون. ماري جين تكتشف حقيقة مشاعر الرجل العنكبوت، وأخبرها لماذا لا يمكن أن يكونا معاً.
وفي الوقت نفسه، يأتي لهاري شبح والده في المرآة، الذي يحرضه على الإنتقام له من بيتر، ولكن يرفض هاري إيذاء بيتر ويحطم المرآة، فيكتشف غرفة سرية تحتوي على معدات العفريت الأخضر، ويقرر الإنتقام من بيتر، ماري جين تقرر أن أن تهرب يوم زفافها وأن تعود إلى بيتر لتخبره بأنها ستكمل حياتها معه، ثم يسمعون مطاردة الشرطة، فتشجع بيتر على العودة ليكون الرجل العنكبوت.